Cultivo de tejidos vegetales (Manual de prácticas)

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTNOMA DE MXICOFACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLN

Cultivo de tejidos vegetales(Manual de prcticas)

Ingeniera Agrcola

M. en C. Francisco Cruz Pizarro


DEPARTAMENTO DE CIENCIAS AGRCOLASSECCIN DE PRODUCCIN AGRCOLA


Asignatura: Cultivo de tejidos vegetalesClave: 171

Carrera: Ingeniera AgrcolaClave: 11825

Autores: M. C. Francisco Cruz Pizarro

Revisin: 25 de marzo de 2012

ndice

Introduccin. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 Objetivo general de la asignatura. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 Objetivo del curso experimental. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 Vinculacin teora-prctica. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 Reglamento de laboratorio. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 PRCTICA 1Organizacin, equipamiento y funcionalidad del laboratorio de cultivo de tejidos vegetales

PRCTICA 2Elaboracin de soluciones concentradas y medios de cultivo PRCTICA 3Desinfectacin y establecimiento de dos tejidos in vitro

PRCTICA 4Efecto de tipo y niveles de citocininas en la proliferacin de brotes

PRCTICA 5Cultivo de callos - induccin

PRCTICA 6Cultivo de races

PRCTICA 7Organognesis a partir de tejido de hoja y pecolo

Introduccin

El cultivo de tejidos en su acepcin amplia puede ser denido como un conjunto muy heterogneo de tcnicas que presentan en comn el hecho de que un explante (una parte separada del vegetal que pueden ser protoplastos clulas desprovistas de pared celular clulas, tejidos u rganos), se cultiva aspticamente en un medio articial de composicin qumica denida y se incuba en condiciones ambien-tales controladas.

El presente manual tiene como objetivo mostrar la informacin recopilada relativa a los conocimientos de la infraestructura bsica para el cultivo de tejidos y rganos, as como la descripcin de las metodologas para promover la regeneracin de plantas.

La vinculacin entre los profesionales de la Agronoma como es el caso del Ingeniero Agrcola y las aplica-ciones Biotecnolgicas como es lo relativo al cultivo de tejidos vegetales.

En el caso especco de la asignatura Cultivo de Tejidos Vegetales es nica en su tipo a nivel licenciatura dentro la carrera de Ingeniero Agrcola. Forma parte de las cuatro asignaturas que corresponden a un paquete terminal en Biotecnologa, debido a que en algunas otras instituciones slo se imparte a nivel de posgrado. En nuestra institucin, especcamente dentro del Departamento Ciencias Agrcolas, se cuenta con laboratorio para la imparticin de la enseanza experimental para tal n.

El laboratorio cuenta con los espacios adecuados que permiten aislar y cultivar tejidos y rganos vegetales bajo condiciones aspticas, adems de que se ha planeado para el manejo de los diferentes elementos y factores involucrados en los diversos procedimientos y metodologas que permitan promover la respuesta morfognica in vitro.

Una de las limitantes para el desarrollo de la mayora de las respuestas in vitro es la contaminacin provo-cada por hongos y bacterias. Otro factor de sumo inters es contar con un adecuado funcionamiento de los equipos que son de vital importancia en las actividades del laboratorio (autoclaves, destiladores, potencimetro).

Para llevar a cabo las tcnicas del cultivo in vitro en los laboratorios de enseanza, tanto en los comerciales como los de investigacin, se tienen que seguir una serie de procedimientos a n de hacer uso eciente de equipo, instrumental y reactivos, en particular los reguladores del crecimiento vegetal.

En general se estima que el establecimiento, equipamiento y funcionalidad de un laboratorio de cultivo de tejidos vegetales se considera como costoso, por lo que se deber poner atencin en este sentido, a n de no deteriorar el equipo y reactivos contenidos en el mismo.

Objetivo general de la asignatura

Ofrecer una visin general del cultivo de tejidos, sus mtodos, aplicaciones y problemtica actual. Conocer las etapas de desarrollo del cultivo in vitro, desde la inoculacin hasta la obtencin de plantas completas para invernadero. Manejar las diferentes tcnicas que se emplean en el cultivo de tejidos. Tener una visin general de la problemtica que enfrenta la biotecnologa, sus benecios y consecuencias socioeconmi-cas.

Objetivo del curso experimental

Desarrollar habilidades y competencias en el mbito de la enseanza experimental de la asignatura de cultivo de tejidos.

Vinculacin Teora-Prctica

Reglamento de Laboratorio

Existe un reglamento general aplicable a todos los laboratorios de enseanza experimental del Departa-mento de Ciencias Agrcolas.

REGLAMENTO INTERNO DE LABORATORIOS DEL DEPARTAMENTO DE CIENCIAS AGRCOLAS

CAPTULO PRIMERO. DISPOSICIONES GENERALES

Artculo 1. El presente reglamento tiene por objeto establecer las normas relativas a la organizacin y funcionamiento de los laboratorios pertenecientes al Departamento de Ciencias Agrcolas.

Artculo 2. Para los efectos del presente reglamento, se entender por usuarios:

I. Los alumnos de la carrera de Ingeniera Agrcola que ocialmente se encuentren inscritos y cursando alguna asignatura que requiera la realizacin de prcticas en los laboratorios, algn trabajo de investigacin o servicio social.II. Los acadmicos de la facultad que estn impartiendo alguna de las asignaturas adscritas a alguno de los laboratorios o que requieran el uso de ese espacio, previa autorizacin del responsable del laboratorio.III. Los estudiantes que al haber concluido con sus estudios y que se encuentren desarrollando alguna de las opciones sealadas en el Reglamento de Evaluaciones de la Facultad de Estudios Superiores Cuautitln para obtener su titulacin, previa solicitud al responsable del rea en la que se est desarrollando la opcin por titulacin y que demuestre que se necesita el laboratorio para su trabajo.IV. Personal administrativo adscrito al laboratorio.

Artculo 3. Las disposiciones de este reglamento son de orden general y se aplicarn sin perjuicio de las particularidades que cada laboratorio tenga, de acuerdo a las actividades propias de cada asignatura prc-tica que se imparta en ellos.

CAPTULO SEGUNDO. DE LA ESTRUCTURA

Artculo 4. La administracin, vigilancia y operacin de equipo especializado depende directamente del departamento de Ciencias Agrcolas a travs del responsable del laboratorio, el cual se auxiliar, para ejer-cer sus funciones, del personal administrativo adscrito al laboratorio.

Artculo 5. El responsable de laboratorio tiene como funciones las siguientes:

I. Dirigir el laboratorio de acuerdo a su reglamento.II. Velar por el buen funcionamiento del equipo a su cargo. III. Coordinar las actividades acadmicas del laboratorio.IV. Coordinar las actividades del laboratorista y del auxiliar de laboratorio.V. Las dems funciones que le sean asignadas por el Jefe de Departamento de Ciencias Agrco-las.

Artculo 6. El jefe de laboratorio tiene como funciones las siguientes:

I. Supervisar y controlar el funcionamiento del laboratorio.II. Elaborar y presentar informes peridicos del laboratorio.III. Realizar todas aquellas actividades inherentes al puesto que apruebe la comisin mixta de tabuladores.

Artculo 7. Son funciones del laboratorista:

I. Mantener el material y equipo en condiciones de higiene y limpieza.II. Llevar el inventario de material, equipo y reactivos del laboratorio, reportando al responsa-ble de laboratorio cualquier inexistencia.III. Reportar fallas en equipo y en el suministro elctrico, de agua, gas y vaco.IV. Suministrar el material a los usuarios del laboratorio.V. Cumplir el horario que se le asigne para atender las necesidades que se tengan en el labora-torio.VI. Realizar todas aquellas actividades inherentes al puesto que apruebe la comisin mixta de tabuladores.

Artculo 8. Son funciones del auxiliar de laboratorio:

I. Asear, lavar, esterilizar, secar y guardar el material, instrumental, equipo y mobiliario. II. Apoyar en el levantamiento del inventario del laboratorio.III. Proporcionar, recuperar y controlar el material, substancias, equipo e instrumental del labo-ratorio, reportando faltantes, desperfectos y anomalas al responsable del laboratorio.IV. Asear, lavar y mantener ordenada el rea del laboratorio.V. Trasladar mobiliario y equipo de laboratorio, instrumental y substancias a los lugares que le sean indicados.VI. Realizar todas aquellas actividades inherentes al puesto que apruebe la comisin mixta de tabuladores.

CAPTULO TERCERO. DE LAS RESTRICCIONES

Artculo 9. Queda prohibido dentro de los laboratorios:

I. Ingresar y consumir cualquier tipo de alimento o bebida.II. Fumar.III. Usar telfono celular o localizador.IV. Cometer desorden, bullicio o cualquier acto de indisciplina que vaya en contra de la Legis-lacin Universitaria.V. Realizar acciones que pongan en peligro la integridad fsica de los dems usuarios del laboratorio.VI. Utilizar y manipular cualquier instrumento, equipo o reactivo sin autorizacin del pro-fesor responsable de la prctica o del responsable del laboratorio.VII. El ingreso a toda persona ajena que interera con el desarrollo de las actividades que se realizan en estos.VIII. El almacenaje de cualquier material ajeno a las labores propias del laboratorio.

Artculo 10. Se deber respetar el horario asignado para el desarrollo de cada prctica. Los usuarios que estn desarrollando trabajos de investigacin, servicio social u otros, no podrn realizar trabajos durante el horario asignado a las prcticas de las materias que se impartan en alguno de los laboratorios.

CAPTULO CUARTO. DEL USO Y LOS USUARIOS DEL LABORATORIO

Artculo 11. Todos los usuarios de los laboratorios tienen los mismos derechos y obligaciones.

Artculo 12. El usuario tiene la obligacin de conocer las normas del presente reglamento para ejercer sus derechos y cumplir con las obligaciones y responsabilidades derivadas del uso del laboratorio.

Artculo 13. Los usuarios del laboratorio tendrn derecho a utilizar el material y equipo necesario para la realizacin de sus prcticas curriculares.

Artculo 14. Los usuarios tienen el derecho de ser atendidos con eciencia para el desarrollo de las prcti-cas programadas.

Artculo 15. Los profesores que tengan programado realizar prcticas de laboratorio debern elaborar una lista de los requerimientos al inicio del semestre para que el responsable o laboratorista proporcione el material solicitado en tiempo y forma.

Artculo 16. Para el uso de los equipos de laboratorio debe revisarse el manual de uso de cada equipo y registrar el tiempo de uso.

Artculo 17. Para el uso del equipo de laboratorio, el usuario deber llenar el formato correspondiente y dejar credencial de la universidad. El formato deber ser autorizado por el responsable de la prctica o responsable del laboratorio y quedar como garanta en caso de deterioro o descompostura del equipo.

Artculo 18. Los materiales y equipos debern ser entregados a los laboratoristas en las mismas condi-ciones en que los recibieron. En los casos en que el manual indique algn procedimiento previo, ste deber seguirse.

Artculo 19. El usuario conservar y mantendr el orden y limpieza de las instalaciones y equipo del labo-ratorio.

Artculo 20. El usuario deber reportar cualquier falla del equipo ante el profesor titular del grupo o respon-sable del laboratorio o laboratorista, inmediatamente para deslindar responsabilidades

Artculo 21. Est prohibido a los alumnos el paso al interior de los anexos.

Artculo 22. Cuando el manual de prcticas lo indique los usuarios debern usar: bata, lentes de proteccin, guantes o ropa especial.

Artculo 23. El tiempo de tolerancia para llegar y entrar al laboratorio ser jado por el responsable de la prctica.

Artculo 24. Al trmino de la prctica, cerciorarse que las llaves de gas, vaco y agua queden cerradas; y que

el equipo elctrico quede desconectado.

Artculo 25. A los residuos generados durante la realizacin del trabajo experimental, deber de drsele el manejo indicado en el procedimiento especco para el desarrollo de la enseanza experimental en el nivel licenciatura de los laboratorios de Ciencias Agrcolas.

Artculo 26. En caso de accidente, se debe avisar inmediatamente al profesor o a los laboratoristas.

CAPTULO QUINTO. DE LAS SANCIONES

Artculo 27. Toda persona ajena que ingrese sin la autorizacin correspondiente se har responsable de los daos que se ocasionen a los experimentos o prcticas que se realizan y se ncar responsabilidad de acuerdo a la legislacin universitaria vigente.

Artculo 28. El material consumible que sea extraviado o deteriorado por el usuario deber se repuesto por l.

Artculo 29. Cualquier uso indebido del laboratorio, equipo u otros recursos dar lugar, segn la gravedad y circunstancias del caso, a cualquiera de las sanciones que aplican en la legislacin universitaria.

ARTCULOS TRANSITORIOS

Primero. Todo lo no previsto en el presente reglamento ser turnado para su solucin al H. Consejo Tcnico de la Facultad de Estudios Superiores Cuautitln.

PRCTICA 1

ORGANIZACIN, EQUPAMIENTO Y FUNCIONALIDAD DEL LABORATORIO DE CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES

Introduccin

En la planeacin y organizacin de un ltaboratorio de cultivo de tejidos vegetales se deben de tomar en cuenta, principalmente, las condiciones de asepsia en las que se debe de trabajar, as como su funcionali-dad.

En general, un laboratorio de cultivo de tejidos no es muy distinto de cualquier otro laboratorio, quiz la diferencia principal es lo relativo a la cuestin de la asepsia ya sealada con antelacin.

En el laboratorio encontramos diferentes reas como las mencionadas a continuacin:

rea de lavado: se lleva a cabo el lavado de cristalera en general; tambin se puede emplear para el lavado del material vegetativo (explantes).

rea de preparacin de medio y del material vegetativo: en esta zona se preparan los medios de cultivo que sern utilizados en las diferentes fases de desarrollo de los explantes, al igual que el material vegetal que ser el explante a utilizar, en ella se encuentra lo siguiente: mesas de trabajo, gabinetes para guardar reactivos, cristalera, charolas de plstico para transportar soluciones concentradas, gradillas, tapones, agitadores magnticos con control de temperatura, balanza granataria, balanza analtica, potencimetro, dosicadores automtico de medio (jeringa de ujo continuo o repipeteo automtico), autoclave, destila-dor de agua, horno de microondas.

rea de siembra y diseccin: en esta zona se deben de tener los mximos cuidados de asepsia, para lo cual se emplea una campana de aire de ujo horizontal a ltracin sub-micrnica, instrumental (bistures, pinzas y navajas), cristalera y agua en condiciones estriles; adems de microscopios estereoscpicos.

rea de incubacin: llamada tambin cuarto de cultivo, en el cual existe un control de luminosidad, tempe-ratura. Deben tomarse en cuenta principalmente las conexiones elctricas, existen anaqueles para incuba-cin con iluminacin individual para cada uno de ellos, se facilita su manejo con controles automticos (Timers) para luz, pudiendo establecer fotoperiodos especcos, de preferencia el tipo de luz blanco fro, adems de papel (kleen-pack o ega-pack) en cinta de tamao apropiado para el sellado de tubos o frascos tipo gerber.

rea de invernadero: es muy importante contar con un rea donde se puedan transferir las plantas prove-nientes del laboratorio buscando un buen control de temperatura y humedad, elementos crticos durante la fase de aclimatacin del material generado. Es recomendable contar con nebulizacin.

Objetivos

Conocer la infraestructura del laboratorio, las instalaciones, reas, equipos, materiales y suministros nece-sarios para la realizacin de actividades del cultivo in vitro de tejidos vegetales.

Ubicar dentro de cada una de las reas los procedimientos que permitan la elaboracin de medios de culti-vo, el aislamiento y cultivo in vitro de tejidos y rganos vegetales, as como su incubacin.

Conocer las normas y procedimientos para utilizar adecuadamente los reactivos, materiales, instrumental y equipos en cada una de las reas del laboratorio.

Actividades previas a la prctica

Realizar la revisin de la bibliografa sobre los tpicos relativos a la prctica.

Procedimiento experimental

El profesor responsable del grupo proporcionar informacin sobre el diseo de diferentes clases de labo-ratorios de enseanza, investigacin y de tipo comercial.Se proporcionarn los elementos necesarios para operar los equipos y suministros con las condiciones mnimas que garanticen los procedimientos para aislar y cultivar tejidos y rganos vegetales in vitro.Los alumnos identicarn los diferentes equipos, suministros, instrumental y reas del laboratorio de culti-vo de tejidos vegetales, para lo cual el profesor explicar su manejo y precauciones, as como su manteni-miento y las principales actividades y procedimientos que ah se desarrollan.Se proporcionar toda la informacin necesaria e indispensable para el funcionamiento y operacin de todo los equipos, al igual que el uso eciente de cada uno de los insumos y reactivos.

Instrucciones para la entrega del reporte

Esta prctica se evaluar con la entrega de un glosario indicado por el profesor, actividades desarrolladas en el laboratorio y entrega de un cuestionario sobre unidades de conversin lumnicas y de presin.

A partir de la siguiente prctica el reporte deber contener los siguientes aspectos:

I. TtuloII. IntroduccinIII. ObjetivosIV. Revisin de la literaturaV. Materiales y MtodosVI. ResultadosVII. DiscusinVIII. ConclusionesXI. Bibliografa

Se deber utilizar letra arial 12 con interlineado 1.5 y se recomienda buscar contenido diferente al del manual de prcticas entregado por el profesor en lo relativo a introduccin y revisin de la literatura.

Los nombres cientcos debern incluirse con letra cursiva.En caso de existir alguna variacin en lo relativo a materiales y mtodos, sta deber indicarse en el reporte (por ejemplo, tiempo de inmersin, agente esterilizante, especie a utilizar, entre otros).

En el apartado de resultados, deber considerar el utilizar tablas, grcas, esquemas, fotografas que permitan denir con claridad los resultados obtenidos.

Se puede enviar en forma previa su contenido va electrnica para su revisin, una vez hecha la correccin se deber entregar el mismo en forma impresa por equipo.

Las fechas indicadas para la entrega de cada prctica no necesariamente corresponden a la siguiente de su realizacin: se maneja un modelo de prcticas secuenciadas, es decir, que no concluyen en una sola sesin. Adems del tiempo de respuesta del material vegetal utilizado, las fechas sern jadas por el profesor, sta es improrrogable y fuera de la fecha indicada no se recibir ninguna prctica.

Para la bibliografa se utiliza el formato del temario del curso y manual de prcticas que consiste en lo siguiente:

Autor(es) (apellido paterno, coma, inicial del segundo apellido, punto e inicial del nombre); punto y coma; ao; ttulo del libro, artculo, etc.; editorial; lugar; pginas (p -pginas totales-, pp -pginas parciales-). En sangra francesa o de primera lnea.

Bibliografa PRCTICA 2

ELABORACIN DE SOLUCIONES CONCENTRADASY MEDIOS DE CULTIVO

Introduccin

Un medio de cultivo es denido como una formulacin de sales inorgnicas y compuestos orgnicos requeridos para la nutricin y manipulacin de los cultivos in vitro. Existen numerosas formulaciones, cada una de las cuales comprende entre seis y 40 compuestos. Existen en reportes cerca de dos mil medios de cultivo, de los cuales los ms usados son 16, adems de considerar que algunos de ellos presentan particu-laridades en la induccin de una va especca en la morfognesis vegetal.El medio de cultivo es una solucin acuosa que est formada por compuestos inorgnicos, compuestos orgnicos, complejos naturales y agentes de soporte y gelicacin.

Los medios de cultivo se encuentran constituidos por los siguientes componentes:

I.- Sales inorgnicas

a) Macronutrimentos: los tejidos en cultivo requieren de una fuente continua de compuestos inorgni-cos; adems de carbono, hidrgeno y oxgeno. Los elementos ms utilizados son principalmente N, P, K, Ca, Mg y S. El nitrgeno se adiciona en grandes cantidades y se encuentra en el medio en forma de nitrato o iones de amonio, o la combinacin de ambos iones. El fsforo se puede adicionar en cualquiera de las formas NaH2PO4.H2O o KH2PO4. El potasio se encuentra en grandes cantidades en la naturaleza; es un catin que se agrega en forma de KCl, KNO3, KH2PO4. El calcio se adiciona con CaCl2.2H2O o Ca(NO3)2.4H2O o en la forma anhidra de cualquier sal. El magnesio y azufre satisfacen sus requerimientos con MgSO4.7H2O. El sodio no es requerido en grandes cantidades por las plantas superiores; sin embargo, puede ser un elemento esencial para cultivos de haltas y plantas C4. El cloro est presente en forma de KCl o CaCl2.

b) Micronutrimentos: para una adecuada actividad metablica, las clulas vegetales requieren de micro-nutrimentos, los ms esenciales son Fe, Mn, Zn, B, Cu, Co y Mo. Los ltimos cinco elementos son fundamen-tales para la sntesis de clorola y la funcin de cloroplastos.

El Fe es requerido para la formacin de precursores de la clorola. El Mn es necesario para el mantenimiento de la ultraestructura y el proceso fotosinttico (la actividad del fotosistema II es proporcional al contenido de este catin). El Cu y Zn son requeridos para la oxidacin e hidroxilacin de compuestos fenlicos. El Mo y Fe forman parte de las enzimas nitrato-reductasa y nitrogenasa. El boro es necesario para el mantenimiento de la actividad meristemtica, est involucrado en la snte-sis de bases nitrogenadas, en particular de uracilo.

Agentes quelatos: son compuestos cuyas molculas son capaces de detener un in de un metal con varias uniones qumicas formando un anillo complejo (quelato-EDTA cido etilendinitrotetracetato) en bajas concentraciones estimulan el crecimiento haciendo que el Fe est disponible en bajas concentracio-nes.

Las concentraciones tradicionalmente se expresaban en mg.l-1, es preferente en mM, meq.l-1 y mol.l-1

II.- Vitaminas

Son necesarias para llevar a cabo una serie de reacciones catalticas del metabolismo y son requeridas en pequeas cantidades. Las ms empleadas son las siguientes: Tiamina (Vit. B1): se aade como tiamina-HCl. Es considerada como la nica, imprescindible o esencial para el crecimiento de las clulas vegetales. cido nicotnico (Niacina). Piridoxina (Vit. B6): se aada como piridixina-HCl. Mio-inositol: no es propiamente una vitamina, es una azcar-alcohol que tiene un efecto estimulante sobre la morfognesis, participando quiz en la va biosinttica del cido galacturnico. cido pantotnico: ayuda al crecimiento de ciertos tejidos.

III.- Hormonas del desarrollo vegetal

Existen tres grupos principales:

a) Auxinas: vinculadas al alargamiento celular, induccin de callo, neoformacin de meristemos radicales. (AIA, AIB, 2,4D y ANA).b) Citocininas: promueven la divisin celular y organizacin y diferenciacin de callos, estimulan la prolife racin. Las mas utilizadas con BA, Kin, 2ip, Zeatina, Thidiazurn).c) Giberelinas: promueven el alargamiento celular, adems de utilizar cido abscsico, poliaminas, entre otros.

IV.- Aminocidos

Son una fuente adicional e inmediata de nitrgeno, su asimilacin puede ser ms rpida que el nitrge-no inorgnico aportado el medio, pueden actuar como agentes quelantes. La L-glutamina y la L-asparagi-na son transportadores de nitrgen o, L-arginina estimula las races y L-cistena es un agente reductor.

V.- Carbohidratos

Son utilizados como fuente de energa y osmo-reguladores. La sacarosa es el azcar empleado univer-salmente, la siguen en importancia la glucosa, fructosa, maltosa, ranosa, galactosa, manosa, lactosa. La concentracin a la que se emplea la sacarosa es de 20 a 45 g.l-1.

VI.- Agua

El agua para preparar medios de cultivo deber ser destilada, bidestilada, tridestilada, desionizada o desminarizada, el agua potable contiene sales en solucin que pueden modicar la respuesta de los tejidos en cultivo.

VII.- Agentes gelicantes o solidicantes

Se emplean en el caso de medios semislidos, se ha utilizado el agar como un sistema de soporte para la preparacin de medios slidos o semislidos. Las ventajas que representa el agar es que con el agua forma geles que se derriten a 100 C, se solidican a 45 C, por lo que es estable a las temperaturas de incu-bacin, adems no es alterado por enzimas vegetales, ni reacciona con los constituyentes del medio y no interere con la movilizacin de los componentes del medio de cultivo.

VIII.- Otros compuestos

Muchos compuestos o suplementos no denidos de composicin qumica variable como albumen de coco, endospermo de maz, extracto de levadura, jugos y extractos de frutas (pltano, tomate, papaya), casena hidrolizada (como fuente protenica), antioxidantes (cido ascrbico, ctrico) y adsorventes como el carbn activado.

Objetivos

Conocer la secuencia y los procedimientos necesarios para preparar las soluciones concentradas a partir de las cuales se tomarn alcuotas para elaborar un medio de cultivo. Que el estudiante identique los factores asociados a la solubilidad de hormonas del desarrollo vegetal.


Determinar el peso atmico de cada uno de los reactivos que componen el medio de cultivo a utilizar.Revisar lo relativo a la forma de expresar la concentracin de los mismos mg.L-1, milimoles (mM) y micro-moles (M).

Equipo, reactivos y materiales

Balanza digitalBalanza granatariaEsptulasAgitador magntico con control de temperaturaReactivos (tipo y cantidad) para elaboracin del medio de cultivo Cruz-Pizarro, 2000Tabla peridicaPotencimetroHidrxido de Sodio 0.1 Ncido clorhdrico 0.1 NAgar BacteriolgicoHorno de MicroondasJeringa de Flujo continuo o de repipeteo automticoTubos de ensaye (25x145 mm)Frascos de vidrio tipo gerberTapones para tubo de ensayeTapones para frasco tipo gerberAutoclaveGradillasLigas de hule gruesas (No. 45)

MEDIO DE CULTIVO CRUZ-PIZARRO 2000

pH: 5.7 0.1


Por lo general, la preparacin del medio de cultivo se realiza elaborando soluciones madre o concentradas, a partir de la dilucin o extraccin de alcuotas se desarrollan medios de cultivo. Recientemente existen en el mercado medios de cultivo preparados en forma individual (los ingredientes necesarios para una formu-lacin de un litro), son costosos, la elaboracin por dilucin es ms econmica.

Para reducir pasos en la preparacin de un medio de cultivo se combinan varias sustancias en una solucin concentrada, siendo importante la calidad de los reactivos qumicos (generalmente de grado analtico) Se debe considerar que algunos compuestos son incompatibles con otros a ciertas concentraciones: el calcio no puede mezclarse con fosfato o sulfato, ni el magnesio con el fosfato, para nes prcticos la solucin puede ser 25, 50 o 100 veces la concentracin nal del medio. Las soluciones de sales orgnicas se pueden conservar a temperatura ambiente, se recomienda en refrigeracin igual que las hormonas.

Se utilizarn soluciones madre o concentradas, extrayendo de ellas las alcuotas sealadas por el profesor responsable.

La solubilidad de los componentes como el agar y sacarosa se realiza por separado en ese orden con ayuda de esptulas, agitacin y calentamiento en horno de microondas, con cuidado con el hervor.

El pH se ajustar con ayuda del potencimetro a 5.7 0.1, este ajuste es importante, puesto que afecta el tejido. Con la consistencia del medio en pH < 4.8, el gel pierde rmeza, se hace blando y pH > 6.0 adquiere una consistencia ms dura, el pH se ajusta con NaOH o HCl 0.1 N.Con la jeringa de ujo continuo se depositan 10 ml de medio en cada tubo o frasco gerber esterilizado con antelacin.Con amarres de 10-12 tubos bajo la ayuda de ligas de hule, los frascos gerber se manejan en forma indivi-dual.

El proceso de esterilizacin inicia una vez llenado y tapado el tubo o el frasco en la autoclave a una tempe-ratura de 120 C (20 lb.in2) durante 30 minutos, vericando el nivel de agua en condiciones de seguridad del mismo.

Instrucciones para la elaboracin del reporte

Aparte de las consideradas previas, en esta prctica se deber entregar el balance inico del medio elabo-rado, expresado en milimoles (mM) por cada in especco, indicando el total de aniones y cationes en el mismo, expresado en forma de tabla o cuadro.

BibliografaPRCTICA 3

DESINFESTACIN Y ESTABLECIMIENTO DE TEJIDOS IN VITRO

Introduccin

La primera condicin para la realizacin de cultivo de tejidos vegetales es lo relativo a la asepsia, debido a que los medios de cultivo ofrecen condiciones favorables tambin para el desarrollo de patgenos (hon-gos y bacterias). Las causas de contaminacin de los cultivos establecidos in vitro son las siguientes: 1) El aire o ambiente, el cual puede contener en suspensin diversos microorganismos (esporas). 2) Los tejidos vegetales, en su exterior o interior (tejido vascular) pueden contener microorganismos que pueden o no ser patgenos, bajo condiciones normales; sin embargo, cuando el tejido o el rgano es cultivado in vitro, el crecimiento de los microorganismos limita el desarrollo de las clulas. 3) El medio de cultivo con un proceso de esterilizacin poco efectivo (desde el lavado de la cristalera, condicin de los reactivos, esterili-zacin en el autoclave). 4) El cuerpo humano, limpieza de manos, en el pelo, respiracin, trabajo de poca precisin durante la exposicin al fuego de bistures, pinzas, cajas etc.

Quiz la causa ms importante de contaminacin es lo relativo a la planta misma, el material vegetal deber ser bien esterilizado antes de su aislamiento in vitro.Es importante considerar el origen del material a esterilizar, aqullos que provienen de campo, con porcio-nes de suelo (races o tallo), pueden presentar ms problema durante este proceso que los que provienen de invernadero y condiciones controladas.

Uno de los principales problemas que se presentan cuando se trata de establecer los cultivos in vitro, es la contaminacin de los mismos con diversos microorganismos (hongos, levaduras, bacterias, toplasmas, entre otros). El ambiente generado por explante-medio de cultivo-condiciones fsicas de incubacin es altamente propicio para la proliferacin de muchos de estos microorganismos, pueden provocar la destruccin de los explantes. Es difcil cuanticar el impacto de estas prdidas, laboratorios dedicados a la micropropagacin lo estiman en alrededor del 10%

El primer paso para la desinfestacin del tejido es su lavado con agua potable y en algunos casos un poco de detergente, de preferencia anti-bacterial, esto se realiza con la nalidad de eliminar algunos contami-nantes localizados en la supercie del mismo. Enseguida se emplea una inmersin en algn fungicida (Benomil o Captan 0.1-0.2%), despus un enjuague con etanol al 70% en tiempos variables de uno a tres minutos, ms tarde el tejido se pasa por una solucin de hipoclorito de sodio, hipoclorito de calcio o clora-lex en concentraciones que van del 3 hasta el 30% y en diferentes tiempos de exposicin (desde uno a 30 minutos), esto depende del tejido utilizado.

En algunos casos, desde el etanol se le pueden agregar unas gotas de un agente humectante o surfactante, para romper la tensin supercial y que los agentes esterilizantes tengan mayor contacto con la supercie del tejido. Los ms utilizados son Tween 20, Tween 89, Triton, Teepol a una concentracin de 0.01%.

Como se mencion con antelacin, los tiempos de esterilizacin del tejido varan de acuerdo a la especie, edad, consistencia, etc. Para esto, la revisin de literatura hecha antes de iniciar el cultivo de tejidos nos

sirve para darnos una idea de los tiempos y concentraciones de los agentes esterilizantes. Debemos tomar en cuenta que los tiempos de exposicin prolongados daan al tejido, en algunos casos en forma irreversi-ble y, por el contrario, tiempos de exposicin breves no destruyen a los microorganismos presentes en tejido.Desde luego es importante que el material vegetal seleccionado para el establecimiento del tejido tenga un buen control tosanitario previo a su corte.

ltimamente han aparecido soluciones biosidas que eliminan bacterias y hongos, previenen la germina-cin de esporas y en altas concentraciones pueden eliminar la contaminacin de microorganismos end-tos. Uno de estos compuestos es el PPM (Plant Preservative Mixture); otro ejemplo es el G-1, un compuesto derivado de furfurales de caa de azcar (qumicamente es 1-(5bromofur-2-il)-2-bromo-2-nitroeteno, desarrollado en la Universidad de las Villas, Cuba).

En algunos materiales es aconsejable la preincubacin de los explantes mediante lo cual estos son desin-fectados en forma ligera y precultivados durante 24 horas en un medio conteniendo sacarosa y, por ltimo, son desinfectados de nueva cuenta y cultivados.

Objetivo

Que el estudiante aprenda las metodologas para establecer tejidos vegetales en condiciones aspticas, adems de determinar el efecto de soluciones desinfectantes y tiempos de exposicin a las que son some-tidos los tejidos.Que el alumno aprenda a localizar, disectar y sembrar in vitro diferentes tipos de explantes.


Se debe tener disponible previamente un medio de cultivo fresco (esta condicin por lo general una semana despus de elaborado), asptico (libre de contaminantes) para poder establecer los explantes.

Equipos, reactivos y materiales

Material vegetal (varetas) de diversas especies frutales, ornamentales y/o forestales.Medio de cultivoJabn anti-bacterialCepillo dental de cerdas medianasCloro comercial (cloralex)Fungicidas (benomil, captan)Agitador magntico con control de temperaturaBisturNavajas para bistures estriles del nmero 11 y 22Campana de aire de ujo laminar (limpia y funcional)Lmpara de alcoholPinzas de diseccinCinta de papel klen-pack de 1 de anchoAlcohol contenido en frasco de boca ancha para amear bistures y pinzas.

Cajas de Petri estriles


Se tomarn varetas de vid proveniente de campo e invernadero del crecimiento de la estacin; adems de otras especies como suculentas, forestales y ornamentales, sern lavados con agua corriente con ayuda del cepillo y detergente anti-bacterial, se cortarn en secciones de tallo con una yema, en seguida de sumer-gen en benomil (1-2 g.l-1) y despus se colocarn en soluciones de cloralex a diferentes concentraciones, de acuerdo a los siguientes tratamientos:

1.- Testigo2.- Cloralex 10 %+ tween 203.- Cloralex 20 %+ tween 204.- Cloralex 30 %+ tween 20

Los tiempos de exposicin sern de 5, 10, 15, 20 minutos (sujeto al nmero de equipos presentes). Con un total de 13 tratamientos incluyendo el testigo.

Al trmino de este tiempo, el material se enjuaga cuatro veces con agua destilada-esterilizada dentro de la campana de ujo laminar. Una vez realizado este proceso, se procede a separar el tejido de inters con bistur (explante) y en su caso con microscopio estereoscpico, para su establecimiento en el medio de cultivo. Se tapa y se sella con klen-pack. Se utilizarn 10 tubos por tratamiento.

Instrucciones para la elaboracin del reporte El material ser evaluado en porcentaje de contaminacin y tipo de contaminacin (hongos, bacterias) a los 3, 8 y 12 das despus de establecidos. Es importante la integracin de resultados entre todos los equi-pos del grupo.

El tiempo de entrega ser de siete das despus de concluida la ltima toma de resultados.


EFECTO DE TIPO Y NIVELES DE CITOCININAS EN LA

PROLIFERACIN DE BROTES

Introduccin

La regeneracin de plantas in vitro presenta cuatro fases o etapas principales: 1) establecimiento del culti-vo, 2) desarrollo y multiplicacin de vstagos o brotes (proliferacin), 3) enraizamiento, 4) aclimatacin de las plntulas. Generalmente las etapas de enraizamiento y aclimatacin pueden combinarse en condicio-nes ex vitro. En algunos casos tiene importancia considerar una etapa previa (Etapa 0), que es la de prepa-racin y acondicionamiento de los explantes para el establecimiento.

El objetivo de la proliferacin es el de mantener y aumentar la cantidad de brotes para los nuevos ciclos de multiplicacin sucesivos (subcultivos) y poder destinar parte de ellos a la siguiente etapa de produccin (enraizamiento, tuberizacin, bulbicacin, entre otros). En este proceso de organognesis estn involu-crados una serie de factor tales como los compuestos que forman parte del medio de cultivo, compuestos hormonales endgenos (umbral de concentracin de los mismos) y sustancias propias de planta. Algunos progresos se han obtenido en la comprensin de la organognesis mediante la regulacin en las concen-traciones de hormonas exgenas adicionadas al medio de cultivo. Se ha observado que a concentraciones altas de auxinas con respecto a las citocininas se induce la formacin de races, mientras que el desarrollo de yemas en varias especies depende de la concentracin de citocininas en el medio de cultivo.

La induccin de yemas in vitro se ha logrado con base en una proporcin mayor de citocininas con respec-to a auxinas, la llamada relacin citocinina-auxina. En el cultivo estas yemas no se inhiben de manera recproca en su desarrollo, debido a que la dominancia apical puede ser limitada, las citocininas aplicadas en forma exgena en general activan el crecimiento de yemas laterales.

Es importante sealar que en esta etapa (cualquiera que sea la va de regeneracin empleada), es conve-niente evitar la formacin de callo como forma indirecta de produccin de brotes, para disminuir el riesgo de variacin somaclonal. En esta etapa, los medios de cultivo, los reguladores del crecimiento (citocininas, auxinas) y las condiciones de cultivo tienen un papel crtico sobre la multiplicacin clonal de los explantes.

Entre los efectos de las citocininas estn la formacin de rganos en los tejidos cultivados in vitro, a travs de la induccin de yemas axilares o adventicias, la divisin y el alargamiento celular.

Es importante sealar que la organognesis depende de dos tipos bsicos de reguladores del crecimiento: citocininas y auxinas, parecen actuar no slo por su concentracin en valor absoluto, sino principalmente por la relacin que se establece entre sus concentraciones, generalizando el desarrollo de vstagos o caulognesis depender de una relacin ptima entre las concentraciones totales de auxinas y citocininas, de naturaleza exgenas y endgenas.

Objetivo

Observar y determinar el efecto que tienen el tipo y concentracin de las citocininas sobre la proliferacin de brotes de especies vegetales.Determinar el potencial en proliferacin mediante el desarrollo de rganos y el tipo de brote (axilar o adventicios).


Se deber contar con medio de cultivo fresco y asptico, adems de tener disponibles brotes cultivados in vitro con antelacin, ya sean los procedentes de la prctica 3 (Desinfestacin y establecimiento de tejidos in vitro), o bien de aquellos provenientes del Laboratorio de Cultivo de Tejidos Vegetales de la FES-Cuautit-ln.


Medio de cultivo fresco contenido en tubos o frascos gerberMaterial vegetal (brotes cultivados de manera previa in vitro en forma asptica)Campana de aire de ujo laminar horizontal limpia y funcionalCajas de Petri limpias y estriles BisturesPinzas de diseccinNavajas del nmero 11 y 22Frasco de boca ancha para amear bistures y pinzasPapel Klen-pack


El desarrollo de esta prctica es en forma secuencial, es decir, en una sesin se elaborar el medio y en otra se desarrollar el establecimiento o siembra del material vegetal.

Se utilizarn brotes establecidos previamente de cactceas (Mammillaria spp., Wilcoxia spp.), como papa, vid, violeta africana, crisantemo, entre otros.

Se utilizar el medio base Cruz-Pizarro al 100% y se utilizarn la benciladenina (BA) y kinetina (Kin) con cuatro diferentes concentraciones:

La auxina se establecer en un nivel constante de 0.1 mg.l-1 de cido indol butrico (AIB).

La transferencia de los brotes se realizar en la campana de aire de ujo laminar horizontal, bajo condicio-nes aspticas.

El material vegetal se saca de los tubos de ensaye, colocndolos en una caja de Petri donde se proceder a separar o seccionar los brotes (los de mayor longitud), eliminando si existe callo y/o porciones oxidadas. Los brotes sern colocados en frascos gerber o tubos de ensaye que contengan el medio especco para la proliferacin, pudiendo colocar de uno a tres brotes por tubo o frasco, los mismos se tapan y sellan en el cuarto de cultivo.

Instrucciones para la elaboracin de reporte

La toma de datos ser secuencialmente a partir del tercer da a intervalos del mismo tiempo, llegando al nal de 30 das, evalundose el nmero de brotes producidos por tratamiento, origen de los mismos (axilar o adventicio), longitud de los mismos, presencia de races, porcentaje de oxidacin y contaminacin.Se debern elaborar grcas de barras en las que se establezcan la relacin entre la concentracin y las variables a evaluar.


CULTIVO DE CALLOS-INDUCCIN

Introduccin

Se puede denir el callo como un tejido obtenido por medio del aislamiento de rganos o tejidos diferen-ciados, los cuales posteriormente son llevados a una desdiferenciacin celular, presentado estas clulas una proliferacin continua, acelerada y de apariencia desorganizada, queda origen a una masa amorfa de tejido. Esta masa celular puede presentar diferentes tipos morfolgicos, los cuales varan segn su aparien-cia externa, textura y composicin celular.

Algunos callos son masas celulares compactas y slidas, con clulas con espacios intercelulares limitados, mientras otras forman tejidos esponjosos y con una gran cantidad de espacios intercelulares.

La coloracin del tejido tambin vara, aun derivado de la misma especie (se pueden presentar callos que carecen de pigmentacin, mientras que otros pueden ser de diferentes tonos de verde, amarillo, caf o rojo). El tipo y grado de pigmentacin estn inuenciados por factores nutrimentales, ambientales y se maniesta por la presencia de clorola, carotenos, antocianinas, etc.

Algunos estudios microscpicos han demostrado que los tejidos de callo por lo general son heterogneos en su composicin celular; es decir, un mismo callo puede presentar varios tipos de celulares, la diversidad celular depende de varios factores como el origen del tejido, edad, composicin de los medios.

El callo est constituido por una alta proporcin de clulas en las que las vacuolas son predominantes, similares a las clulas de parnquima. Su caracterstica ms importante es el carcter de totipotencia de las clulas, pues mediante un proceso particular de diferenciacin se puede inducir la organognesis (caulo y rizognesis) y la embriognesis somtica para el desarrollo de plantas completas.

Un problema asociado con este tipo de tejido es el dao o modicacin de la citologa nuclear de las clu-las durante su cultivo, se pueden presentar alteraciones cromosmicas, mutaciones y diferentes tipos de ploidas, as como irregularidades cariocinticas.

El cultivo in vitro per puede ser estresante para las clulas vegetales e involucra procesos mutagnicos, durante la induccin de callo y la regeneracin de las plantas. Por esta va es posible obtener variacin de origen nuclear y/o citoplsmica que podra ser utilizada para el mejoramiento vegetal; este proceso deno-minado variacin somaclonal involucra cambios en las plantas regeneradas que son trasmitidos a la proge-nie.

As mismo, cabe citar la ocurrencia in vitro de alteraciones no especcas que no generan variacin estable y transmisible, pero conducen a cambios en la expresin gnica. Dichos cambios denominados son tambin considerados por algunos autores como variacin somaclonal, mientras que otros slo incluyen en la misma a los cambios estables.

Objetivo

Que el alumno conozca la metodologa para la obtencin de callo como una va indirecta en la morfogne-sis vegetal.


Contar con medio fresco y asptico. El medio utilizado ser el Cruz-Pizarro (2000) variando la adicin de hormonas con 0.5 mg.l-1 de cido 2,4 diclorofenoxiactico y 0.1 mg.l-1 de kinetina.La colecta de material reviste particular importancia, el conseguir zanahorias de calidad aceptable para su establecimiento.

Equipos, reactivos y materiales

Material vegetal (zanahorias) y callos provenientes de cactceas cultivados in vitro previamenteMedio de cultivo fresco y asptico contenido en tubos o frascos gerberBisturNavajas para bistures del nmero 11 y 22 estrilesJabn antibacterialAgua destiladaCloro comercial (Cloralex)Agitador magntico con control de temperaturaVasos de precipitadosCajas de PetriCampana de aire de ujo laminar horizontal, limpia y funcional


Se utilizarn como fuente de explante zanahorias con una longitud de 10 a 20 cm: seleccionadas, que sean jvenes, turgentes no deshidratadas, de preferencia recin cosechadas, sin daos fsicos (roturas entre otras), tampoco se deben usar aqullas que se sospeche tengan algn patgeno o insectos, no se deben utilizar zanahorias provenientes de centros comerciales que han sido peladas con antelacin.Otra fuente de explante puede ser tejido de cactceas previamente establecidos. Las zanahorias son lavadas con jabn y agua potable, se cortan segmentos de 6 a 7 cm de longitud y se descartan los extremos.Se colocan los segmentos en una solucin de cloro comercial (cloralex) al 10% durante 10 minutos en agitacin constante.Despus se lavan y enjuagan de dos a tres veces con agua destilada estril, en la campana de aire de ujo laminar.En una caja de Petri estril es transferido un segmento de la zanahoria esterilizada con anterioridad, con ayuda de pinzas y un bistur previamente ameados, se cortan los extremos por la penetracin del agente esterilizante y se cortan discos de 0.5 a 1.0 cm. de grosor.A estos discos se deben extraer los fragmentos de cambium (0.5 cm aproximadamente), los cuales se colo-carn en medio contenido en el tubo de ensaye o frasco gerber.Se tapan y se sellan los frascos o tubos y se colocan el cuarto de cultivo.


Aproximadamente a las tres semanas despus de iniciado el cultivo se puede observar el desarrollo de callo, se recomienda su observacin a travs del tubo con ayuda del microscopio estereoscpico sin la apertura del tubo. Se debe cuanticar el volumen respecto al inicial, adems de observar las coloraciones presentes en el tejido durante este proceso, despus es necesario subcultivar el tejido en un medio nuevo pasados 25 das para estimular el proceso de organognesis. El reporte se entregar una semana ms tarde de concluida la prctica.


CULTIVO DE RACES

Introduccin

El cultivo de races fue una de las primeras y prolcas aplicaciones de los cultivos aspticos, puesto que se lograron mantener con xito por largos periodos a travs de varios subcultivos.

Los primeros trabajos fueron desarrollados teniendo como explantes pices de races provenientes de plntulas de trigo obtenidas mediante la germinacin asptica de semillas del mismo, creciendo los pices de manera vertiginosa. Posteriormente se lograron cultivar pices de races de tomate por un periodo indenido.

Se ha determinado que en funcin de la respuesta que tienen las races en el cultivo in vitro, stas pueden ser de tres tipos:

1) Aqullas que pueden desarrollarse de modo indenido en cultivo (como tomate, clavo y el gnero Datura).

2) Las que pueden crecer por periodos prolongados en el medio de cultivo, pero no de forma peren-ne (chcharo, trigo) limitndose la velocidad de crecimiento, as como la formacin de races laterales dbiles e insucientes.

3) Las races que difcilmente crecen debido a que requieren condiciones hasta ahora poco estudia-das (especies leosas).

Las aplicaciones del cultivo de raz han contribuido a descubrimientos y aplicaciones en la siologa vege-tal, metabolismo de carbohidratos, nutricin, hormonas, induccin de ndulos por Rhizobium, induccin de formacin de tejido vascular secundario (en ausencia de componentes de la parte area), adems de la posibilidad del cultivo de nemtodos toparsitos, sobre lesiones especcas en el sistema radical.

Objetivo

Que el alumno conozca la metodologa y aplicacin del cultivo in vitro de races como una tcnica de orga-nognesis para la obtencin de plantas.


Se debern establecer almcigos de tomate y trigo en semilleros de unicel utilizando como sustrato cual-quier material inerte (agrolita o vermiculita), con un intervalo de 15 das previos a la realizacin de la prcti

ca, a n de contar con plntulas con un sistema radicular vigoroso que ser utilizado en el establecimiento de explantes.


Para la obtencin de explantes de raz se utilizarn plntulas de tomate, las cuales se desarrollarn a partir de semillas que se esterilizan y se puedan colocar en semilleros con sustrato inerte o bien establecer cajas de Petri estril, con papel ltro hmedo en condiciones de oscuridad a 25 C. Cuando las races hayan emergido y tengan entre 2 y 4 cm de longitud, se cortan pices de 1 cm y cada uno de ellos se establece en el medio lquido de Cruz-Pizarro-2000 o de White sin reguladores del crecimiento. Se puede utilizar como material de soporte, hule espuma o segmentos de estropajo vegetal lavado y esterilizado con anticipacin.Los explantes por lo general otan sobre la supercie del medio y al incubarlos a 27 C en oscuridad se alargan y crecen las races laterales del eje principal, pudiendo as establecer un clon de races aisladas repetitivamente por tiempo indenido.

El nmero de semillas a germinar ser de 60 a 100 semillas, las cuales se esterilizarn con etanol al 80 % por 90 segundos, despus son sumergidas en la solucin de cloro comercial (cloralex) al 2% mantenindolas en agitacin durante 10 minutos y se enjuagan de dos a tres veces en agua destilada esterilizada.

Una vez desinfectadas las semillas se siembran en las cajas de Petri (10 semillas en cada caja) y se mantie-nen en oscuridad por siete das o hasta que las races alcancen 3 o 4 cm de longitud aproximadamente.Cuando las races alcancen esta longitud, con ayuda de un bistur y en condiciones aspticas, se corta 1 cm de pice de las races y se coloca en tubos de ensaye un pice por tubo en condiciones de incubacin, se observa y se cuantica el crecimiento de las races.

A partir del crecimiento posterior, se puede lograr la iniciacin de clones a partir de las races principales y las laterales ya desarrolladas.


Se determinar la longitud inicial al establecer la raz a travs del vidrio del tubo, se realizarn observacio-nes cada tercer da con el objetivo de evaluar contaminacin, crecimiento o alargamiento de las races, ramicacin y formacin de races de orden sucesivo. El reporte se entregar una semana despus de concluir las observaciones a realizar.

PRCTICA 7

ORGANOGNESIS A PARTIR DE TEJIDO DE HOJA Y PECOLO

Introduccin

La morfognesis vegetal es el conjunto de fenmenos que estn involucrados, paso a paso, durante la ontognesis, evolucin de la estructura y forma de un estado no diferenciado y diferenciado. A partir de la morfognesis vegetal se puede explicar la regeneracin de las plantas de los tejidos cultivados in vitro. La morfognesis de manera general comprende dos vas de regeneracin: 1) Organognesis, que comprende la iniciacin en un tejido no diferenciado, de la estructura y funcin de un rgano, la produccin de una plntula in vitro por una secuencia no organizada; sta puede ser directa o indirecta (por una fase interme-dia o de transicin de callo), 2) Embriognesis asexual o somtica, que comprende la formacin de un embrin a partir de clulas de tejido adulto, dando lugar a un embriode en una serie de pasos que aseme-jan la formacin de un embrin cigtico, tambin ocurre de forma directa o indirecta.

La organgenesis conduce a la produccin de vstagos unipolares (brotes) que se pueden enraizar en etapas sucesivas, mientras que en la embriognesis somtica se forman embriones con caractersticas bipolares.

La organognesis puede darse por la induccin de yemas axilares o adventicias, la base de la multiplica-cin in vitro es la totipotencia vegetal. La organognesis vegetal se ve afecta por cuatro factores principa-les:

1) Estudios del desarrollo.2) Niveles y relacin establecida en los reguladores del crecimiento.3) Estudios metablicos y osmorregulacin.4) Competencia y determinacin celular.

El utilizar hojas como estructuras donadoras de explantes se basa en el desarrollo de los meristemos primarios situados en las lminas foliares, base de la hoja y pecolo de la misma como es el caso de la viole-ta africana. As mismo, existen meristemos secundarios en el margen de la hoja como es el caso del Kalan-choe que, al estimular su crecimiento, da origen a una brotacin denominada epila.

Objetivo

Que el estudiante conozca la metodologa para la obtencin de plantas va organognesis, a partir del cultivo de tejidos de hojas y pecolo.

En el caso del Kalancho se utilizarn los bordes marginales del limbo de la hoja.

El medio de cultivo a utilizar para esta prctica se deber preparar de manera anticipada con las siguientes caractersticas:

Medio de cultivo para el establecimiento de explantes de Saintpaulia sp. y Kalancho sp.


Una vez establecidos se determinar el porcentaje de cultivos aspticos a las 72 horas. A intervalos sema-nales y con lmite de 4 a 6 semanas se observarn y cuanticarn los principales eventos organognicos como el desarrollo de brotes, su nmero, crecimiento de los mismos y lugar de ocurrencia de eventos orga-ngenicos.La entrega de la prctica ser despus de una semana, concluidas las observaciones y toma de datos de la misma.

Bibliografa


Se deber contar con plantas madres o donadoras de hojas con pecolo de violeta africana y de Kalanchoe que provengan de ambientes controlados, con regmenes adecuados de humedad y nutricin y libres de patgenos. Preparacin de medio de cultivo indicado (fresco y estril), dispuesto con una semana de antelacin.

Equipos, reactivo y materiales

Material vegetal (plantas de violeta africana y Kalancho)Jabn antibacterialTijerasAtomizador con alcohol etlicoCloro comercial (cloralex)Agua destilada-esterilizadaVasos de precipitados previamente esterilizadosBisturesNavajas para bistur nmero 11 y 22Medio de cultivo indicado, fresco y estril


Se utilizarn como explantes hojas con pecolo de violeta africana Saintpaulia ionantha y hojas de Kalan-cho bossfeldiana.En el primer caso el explante es una hoja desprovista de puntos o estructuras vegetativas para la neofor-macin de meristemos de raz y tallo, debido a que en su base se desarrollan meristemos adventicios cauli-nares y radicales.En el caso de Kalancho es a partir de brotaciones eplas en la supercie del borde del limbo, la cual es considerada una aptitud potencial amplia de las hojas en la neoformacin de yemas adventicias asociadas a meristemos primarios.

Se lavan las hojas de violeta africana (con pecolo) y las de Kalancho con detergente y agua corriente (potable), posteriormente hay que enjuagarlas.Ya en la campana de aire de ojo laminar horizontal. Dentro de un vaso de precipitados estril se adiciona cloro comercial (hipoclorito de sodio al 10 % v/v) durante 10 a 15 minutos y se enjuaga por cinco veces con agua destilada estril.Para la obtencin de explantes se eliminan la base y los mrgenes u orillas de la hoja y se segmenta de ocho a 12 partes de la hoja a partir de cortes paralelos y perpendiculares a la vena principal de la hoja en forma cuadrada, de preferencia.Se siembran en el medio con el envs o regin abaxial en contacto con el medio.Se pueden subcultivar a intervalos de un mes, en el primero con la concentracin del medio al 100 % y despus puede reducirse al 50 % de su concentracin.

Para las hojas de violeta los pecolos son segmentados, el explante consistir en 1 cm2 aproximadamente, pudindose emplear el pecolo y segmentos de hojas.


DEPARTAMENTO DE CIENCIAS AGRCOLASSECCIN DE PRODUCCIN AGRCOLA


Asignatura: Cultivo de tejidos vegetalesClave: 171

Carrera: Ingeniera AgrcolaClave: 11825

Autores: M. C. Francisco Cruz Pizarro

Revisin: 25 de marzo de 2012

ndice

Introduccin. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 Objetivo general de la asignatura. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 Objetivo del curso experimental. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 Vinculacin teora-prctica. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 Reglamento de laboratorio. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 PRCTICA 1Organizacin, equipamiento y funcionalidad del laboratorio de cultivo de tejidos vegetales

PRCTICA 2Elaboracin de soluciones concentradas y medios de cultivo PRCTICA 3Desinfectacin y establecimiento de dos tejidos in vitro

PRCTICA 4Efecto de tipo y niveles de citocininas en la proliferacin de brotes

PRCTICA 5Cultivo de callos - induccin

PRCTICA 6Cultivo de races

PRCTICA 7Organognesis a partir de tejido de hoja y pecolo

Introduccin

El cultivo de tejidos en su acepcin amplia puede ser denido como un conjunto muy heterogneo de tcnicas que presentan en comn el hecho de que un explante (una parte separada del vegetal que pueden ser protoplastos clulas desprovistas de pared celular clulas, tejidos u rganos), se cultiva aspticamente en un medio articial de composicin qumica denida y se incuba en condiciones ambien-tales controladas.

El presente manual tiene como objetivo mostrar la informacin recopilada relativa a los conocimientos de la infraestructura bsica para el cultivo de tejidos y rganos, as como la descripcin de las metodologas para promover la regeneracin de plantas.

La vinculacin entre los profesionales de la Agronoma como es el caso del Ingeniero Agrcola y las aplica-ciones Biotecnolgicas como es lo relativo al cultivo de tejidos vegetales.

En el caso especco de la asignatura Cultivo de Tejidos Vegetales es nica en su tipo a nivel licenciatura dentro la carrera de Ingeniero Agrcola. Forma parte de las cuatro asignaturas que corresponden a un paquete terminal en Biotecnologa, debido a que en algunas otras instituciones slo se imparte a nivel de posgrado. En nuestra institucin, especcamente dentro del Departamento Ciencias Agrcolas, se cuenta con laboratorio para la imparticin de la enseanza experimental para tal n.

El laboratorio cuenta con los espacios adecuados que permiten aislar y cultivar tejidos y rganos vegetales bajo condiciones aspticas, adems de que se ha planeado para el manejo de los diferentes elementos y factores involucrados en los diversos procedimientos y metodologas que permitan promover la respuesta morfognica in vitro.

Una de las limitantes para el desarrollo de la mayora de las respuestas in vitro es la contaminacin provo-cada por hongos y bacterias. Otro factor de sumo inters es contar con un adecuado funcionamiento de los equipos que son de vital importancia en las actividades del laboratorio (autoclaves, destiladores, potencimetro).

Para llevar a cabo las tcnicas del cultivo in vitro en los laboratorios de enseanza, tanto en los comerciales como los de investigacin, se tienen que seguir una serie de procedimientos a n de hacer uso eciente de equipo, instrumental y reactivos, en particular los reguladores del crecimiento vegetal.

En general se estima que el establecimiento, equipamiento y funcionalidad de un laboratorio de cultivo de tejidos vegetales se considera como costoso, por lo que se deber poner atencin en este sentido, a n de no deteriorar el equipo y reactivos contenidos en el mismo.

Objetivo general de la asignatura

Ofrecer una visin general del cultivo de tejidos, sus mtodos, aplicaciones y problemtica actual. Conocer las etapas de desarrollo del cultivo in vitro, desde la inoculacin hasta la obtencin de plantas completas para invernadero. Manejar las diferentes tcnicas que se emplean en el cultivo de tejidos. Tener una visin general de la problemtica que enfrenta la biotecnologa, sus benecios y consecuencias socioeconmi-cas.

Objetivo del curso experimental

Desarrollar habilidades y competencias en el mbito de la enseanza experimental de la asignatura de cultivo de tejidos.

Vinculacin Teora-Prctica

Reglamento de Laboratorio

Existe un reglamento general aplicable a todos los laboratorios de enseanza experimental del Departa-mento de Ciencias Agrcolas.

REGLAMENTO INTERNO DE LABORATORIOS DEL DEPARTAMENTO DE CIENCIAS AGRCOLAS

CAPTULO PRIMERO. DISPOSICIONES GENERALES

Artculo 1. El presente reglamento tiene por objeto establecer las normas relativas a la organizacin y funcionamiento de los laboratorios pertenecientes al Departamento de Ciencias Agrcolas.

Artculo 2. Para los efectos del presente reglamento, se entender por usuarios:

I. Los alumnos de la carrera de Ingeniera Agrcola que ocialmente se encuentren inscritos y cursando alguna asignatura que requiera la realizacin de prcticas en los laboratorios, algn trabajo de investigacin o servicio social.II. Los acadmicos de la facultad que estn impartiendo alguna de las asignaturas adscritas a alguno de los laboratorios o que requieran el uso de ese espacio, previa autorizacin del responsable del laboratorio.III. Los estudiantes que al haber concluido con sus estudios y que se encuentren desarrollando alguna de las opciones sealadas en el Reglamento de Evaluaciones de la Facultad de Estudios Superiores Cuautitln para obtener su titulacin, previa solicitud al responsable del rea en la que se est desarrollando la opcin por titulacin y que demuestre que se necesita el laboratorio para su trabajo.IV. Personal administrativo adscrito al laboratorio.

Artculo 3. Las disposiciones de este reglamento son de orden general y se aplicarn sin perjuicio de las particularidades que cada laboratorio tenga, de acuerdo a las actividades propias de cada asignatura prc-tica que se imparta en ellos.

CAPTULO SEGUNDO. DE LA ESTRUCTURA

Artculo 4. La administracin, vigilancia y operacin de equipo especializado depende directamente del departamento de Ciencias Agrcolas a travs del responsable del laboratorio, el cual se auxiliar, para ejer-cer sus funciones, del personal administrativo adscrito al laboratorio.

Artculo 5. El responsable de laboratorio tiene como funciones las siguientes:

I. Dirigir el laboratorio de acuerdo a su reglamento.II. Velar por el buen funcionamiento del equipo a su cargo. III. Coordinar las actividades acadmicas del laboratorio.IV. Coordinar las actividades del laboratorista y del auxiliar de laboratorio.V. Las dems funciones que le sean asignadas por el Jefe de Departamento de Ciencias Agrco-las.

Artculo 6. El jefe de laboratorio tiene como funciones las siguientes:

I. Supervisar y controlar el funcionamiento del laboratorio.II. Elaborar y presentar informes peridicos del laboratorio.III. Realizar todas aquellas actividades inherentes al puesto que apruebe la comisin mixta de tabuladores.

Artculo 7. Son funciones del laboratorista:

I. Mantener el material y equipo en condiciones de higiene y limpieza.II. Llevar el inventario de material, equipo y reactivos del laboratorio, reportando al responsa-ble de laboratorio cualquier inexistencia.III. Reportar fallas en equipo y en el suministro elctrico, de agua, gas y vaco.IV. Suministrar el material a los usuarios del laboratorio.V. Cumplir el horario que se le asigne para atender las necesidades que se tengan en el labora-torio.VI. Realizar todas aquellas actividades inherentes al puesto que apruebe la comisin mixta de tabuladores.

Artculo 8. Son funciones del auxiliar de laboratorio:

I. Asear, lavar, esterilizar, secar y guardar el material, instrumental, equipo y mobiliario. II. Apoyar en el levantamiento del inventario del laboratorio.III. Proporcionar, recuperar y controlar el material, substancias, equipo e instrumental del labo-ratorio, reportando faltantes, desperfectos y anomalas al responsable del laboratorio.IV. Asear, lavar y mantener ordenada el rea del laboratorio.V. Trasladar mobiliario y equipo de laboratorio, instrumental y substancias a los lugares que le sean indicados.VI. Realizar todas aquellas actividades inherentes al puesto que apruebe la comisin mixta de tabuladores.

CAPTULO TERCERO. DE LAS RESTRICCIONES

Artculo 9. Queda prohibido dentro de los laboratorios:

I. Ingresar y consumir cualquier tipo de alimento o bebida.II. Fumar.III. Usar telfono celular o localizador.IV. Cometer desorden, bullicio o cualquier acto de indisciplina que vaya en contra de la Legis-lacin Universitaria.V. Realizar acciones que pongan en peligro la integridad fsica de los dems usuarios del laboratorio.VI. Utilizar y manipular cualquier instrumento, equipo o reactivo sin autorizacin del pro-fesor responsable de la prctica o del responsable del laboratorio.VII. El ingreso a toda persona ajena que interera con el desarrollo de las actividades que se realizan en estos.VIII. El almacenaje de cualquier material ajeno a las labores propias del laboratorio.

Artculo 10. Se deber respetar el horario asignado para el desarrollo de cada prctica. Los usuarios que estn desarrollando trabajos de investigacin, servicio social u otros, no podrn realizar trabajos durante el horario asignado a las prcticas de las materias que se impartan en alguno de los laboratorios.

CAPTULO CUARTO. DEL USO Y LOS USUARIOS DEL LABORATORIO

Artculo 11. Todos los usuarios de los laboratorios tienen los mismos derechos y obligaciones.

Artculo 12. El usuario tiene la obligacin de conocer las normas del presente reglamento para ejercer sus derechos y cumplir con las obligaciones y responsabilidades derivadas del uso del laboratorio.

Artculo 13. Los usuarios del laboratorio tendrn derecho a utilizar el material y equipo necesario para la realizacin de sus prcticas curriculares.

Artculo 14. Los usuarios tienen el derecho de ser atendidos con eciencia para el desarrollo de las prcti-cas programadas.

Artculo 15. Los profesores que tengan programado realizar prcticas de laboratorio debern elaborar una lista de los requerimientos al inicio del semestre para que el responsable o laboratorista proporcione el material solicitado en tiempo y forma.

Artculo 16. Para el uso de los equipos de laboratorio debe revisarse el manual de uso de cada equipo y registrar el tiempo de uso.

Artculo 17. Para el uso del equipo de laboratorio, el usuario deber llenar el formato correspondiente y dejar credencial de la universidad. El formato deber ser autorizado por el responsable de la prctica o responsable del laboratorio y quedar como garanta en caso de deterioro o descompostura del equipo.

Artculo 18. Los materiales y equipos debern ser entregados a los laboratoristas en las mismas condi-ciones en que los recibieron. En los casos en que el manual indique algn procedimiento previo, ste deber seguirse.

Artculo 19. El usuario conservar y mantendr el orden y limpieza de las instalaciones y equipo del labo-ratorio.

Artculo 20. El usuario deber reportar cualquier falla del equipo ante el profesor titular del grupo o respon-sable del laboratorio o laboratorista, inmediatamente para deslindar responsabilidades

Artculo 21. Est prohibido a los alumnos el paso al interior de los anexos.

Artculo 22. Cuando el manual de prcticas lo indique los usuarios debern usar: bata, lentes de proteccin, guantes o ropa especial.

Artculo 23. El tiempo de tolerancia para llegar y entrar al laboratorio ser jado por el responsable de la prctica.

Artculo 24. Al trmino de la prctica, cerciorarse que las llaves de gas, vaco y agua queden cerradas; y que

el equipo elctrico quede desconectado.

Artculo 25. A los residuos generados durante la realizacin del trabajo experimental, deber de drsele el manejo indicado en el procedimiento especco para el desarrollo de la enseanza experimental en el nivel licenciatura de los laboratorios de Ciencias Agrcolas.

Artculo 26. En caso de accidente, se debe avisar inmediatamente al profesor o a los laboratoristas.

CAPTULO QUINTO. DE LAS SANCIONES

Artculo 27. Toda persona ajena que ingrese sin la autorizacin correspondiente se har responsable de los daos que se ocasionen a los experimentos o prcticas que se realizan y se ncar responsabilidad de acuerdo a la legislacin universitaria vigente.

Artculo 28. El material consumible que sea extraviado o deteriorado por el usuario deber se repuesto por l.

Artculo 29. Cualquier uso indebido del laboratorio, equipo u otros recursos dar lugar, segn la gravedad y circunstancias del caso, a cualquiera de las sanciones que aplican en la legislacin universitaria.

ARTCULOS TRANSITORIOS

Primero. Todo lo no previsto en el presente reglamento ser turnado para su solucin al H. Consejo Tcnico de la Facultad de Estudios Superiores Cuautitln.

PRCTICA 1

ORGANIZACIN, EQUPAMIENTO Y FUNCIONALIDAD DEL LABORATORIO DE CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES

Introduccin

En la planeacin y organizacin de un ltaboratorio de cultivo de tejidos vegetales se deben de tomar en cuenta, principalmente, las condiciones de asepsia en las que se debe de trabajar, as como su funcionali-dad.

En general, un laboratorio de cultivo de tejidos no es muy distinto de cualquier otro laboratorio, quiz la diferencia principal es lo relativo a la cuestin de la asepsia ya sealada con antelacin.

En el laboratorio encontramos diferentes reas como las mencionadas a continuacin:

rea de lavado: se lleva a cabo el lavado de cristalera en general; tambin se puede emplear para el lavado del material vegetativo (explantes).

rea de preparacin de medio y del material vegetativo: en esta zona se preparan los medios de cultivo que sern utilizados en las diferentes fases de desarrollo de los explantes, al igual que el material vegetal que ser el explante a utilizar, en ella se encuentra lo siguiente: mesas de trabajo, gabinetes para guardar reactivos, cristalera, charolas de plstico para transportar soluciones concentradas, gradillas, tapones, agitadores magnticos con control de temperatura, balanza granataria, balanza analtica, potencimetro, dosicadores automtico de medio (jeringa de ujo continuo o repipeteo automtico), autoclave, destila-dor de agua, horno de microondas.

rea de siembra y diseccin: en esta zona se deben de tener los mximos cuidados de asepsia, para lo cual se emplea una campana de aire de ujo horizontal a ltracin sub-micrnica, instrumental (bistures, pinzas y navajas), cristalera y agua en condiciones estriles; adems de microscopios estereoscpicos.

rea de incubacin: llamada tambin cuarto de cultivo, en el cual existe un control de luminosidad, tempe-ratura. Deben tomarse en cuenta principalmente las conexiones elctricas, existen anaqueles para incuba-cin con iluminacin individual para cada uno de ellos, se facilita su manejo con controles automticos (Timers) para luz, pudiendo establecer fotoperiodos especcos, de preferencia el tipo de luz blanco fro, adems de papel (kleen-pack o ega-pack) en cinta de tamao apropiado para el sellado de tubos o frascos tipo gerber.

rea de invernadero: es muy importante contar con un rea donde se puedan transferir las plantas prove-nientes del laboratorio buscando un buen control de temperatura y humedad, elementos crticos durante la fase de aclimatacin del material generado. Es recomendable contar con nebulizacin.

Objetivos

Conocer la infraestructura del laboratorio, las instalaciones, reas, equipos, materiales y suministros nece-sarios para la realizacin de actividades del cultivo in vitro de tejidos vegetales.

Ubicar dentro de cada una de las reas los procedimientos que permitan la elaboracin de medios de culti-vo, el aislamiento y cultivo in vitro de tejidos y rganos vegetales, as como su incubacin.

Conocer las normas y procedimientos para utilizar adecuadamente los reactivos, materiales, instrumental y equipos en cada una de las reas del laboratorio.


Realizar la revisin de la bibliografa sobre los tpicos relativos a la prctica.


El profesor responsable del grupo proporcionar informacin sobre el diseo de diferentes clases de labo-ratorios de enseanza, investigacin y de tipo comercial.Se proporcionarn los elementos necesarios para operar los equipos y suministros con las condiciones mnimas que garanticen los procedimientos para aislar y cultivar tejidos y rganos vegetales in vitro.Los alumnos identicarn los diferentes equipos, suministros, instrumental y reas del laboratorio de culti-vo de tejidos vegetales, para lo cual el profesor explicar su manejo y precauciones, as como su manteni-miento y las principales actividades y procedimientos que ah se desarrollan.Se proporcionar toda la informacin necesaria e indispensable para el funcionamiento y operacin de todo los equipos, al igual que el uso eciente de cada uno de los insumos y reactivos.

Instrucciones para la entrega del reporte

Esta prctica se evaluar con la entrega de un glosario indicado por el profesor, actividades desarrolladas en el laboratorio y entrega de un cuestionario sobre unidades de conversin lumnicas y de presin.

A partir de la siguiente prctica el reporte deber contener los siguientes aspectos:

I. TtuloII. IntroduccinIII. ObjetivosIV. Revisin de la literaturaV. Materiales y MtodosVI. ResultadosVII. DiscusinVIII. ConclusionesXI. Bibliografa

Se deber utilizar letra arial 12 con interlineado 1.5 y se recomienda buscar contenido diferente al del manual de prcticas entregado por el profesor en lo relativo a introduccin y revisin de la literatura.

Los nombres cientcos debern incluirse con letra cursiva.En caso de existir alguna variacin en lo relativo a materiales y mtodos, sta deber indicarse en el reporte (por ejemplo, tiempo de inmersin, agente esterilizante, especie a utilizar, entre otros).

En el apartado de resultados, deber considerar el utilizar tablas, grcas, esquemas, fotografas que permitan denir con claridad los resultados obtenidos.

Se puede enviar en forma previa su contenido va electrnica para su revisin, una vez hecha la correccin se deber entregar el mismo en forma impresa por equipo.

Las fechas indicadas para la entrega de cada prctica no necesariamente corresponden a la siguiente de su realizacin: se maneja un modelo de prcticas secuenciadas, es decir, que no concluyen en una sola sesin. Adems del tiempo de respuesta del material vegetal utilizado, las fechas sern jadas por el profesor, sta es improrrogable y fuera de la fecha indicada no se recibir ninguna prctica.

Para la bibliografa se utiliza el formato del temario del curso y manual de prcticas que consiste en lo siguiente:

Autor(es) (apellido paterno, coma, inicial del segundo apellido, punto e inicial del nombre); punto y coma; ao; ttulo del libro, artculo, etc.; editorial; lugar; pginas (p -pginas totales-, pp -pginas parciales-). En sangra francesa o de primera lnea.

Bibliografa PRCTICA 2

ELABORACIN DE SOLUCIONES CONCENTRADASY MEDIOS DE CULTIVO

Introduccin

Un medio de cultivo es denido como una formulacin de sales inorgnicas y compuestos orgnicos requeridos para la nutricin y manipulacin de los cultivos in vitro. Existen numerosas formulaciones, cada una de las cuales comprende entre seis y 40 compuestos. Existen en reportes cerca de dos mil medios de cultivo, de los cuales los ms usados son 16, adems de considerar que algunos de ellos presentan particu-laridades en la induccin de una va especca en la morfognesis vegetal.El medio de cultivo es una solucin acuosa que est formada por compuestos inorgnicos, compuestos orgnicos, complejos naturales y agentes de soporte y gelicacin.

Los medios de cultivo se encuentran constituidos por los siguientes componentes:

I.- Sales inorgnicas

a) Macronutrimentos: los tejidos en cultivo requieren de una fuente continua de compuestos inorgni-cos; adems de carbono, hidrgeno y oxgeno. Los elementos ms utilizados son principalmente N, P, K, Ca, Mg y S. El nitrgeno se adiciona en grandes cantidades y se encuentra en el medio en forma de nitrato o iones de amonio, o la combinacin de ambos iones. El fsforo se puede adicionar en cualquiera de las formas NaH2PO4.H2O o KH2PO4. El potasio se encuentra en grandes cantidades en la naturaleza; es un catin que se agrega en forma de KCl, KNO3, KH2PO4. El calcio se adiciona con CaCl2.2H2O o Ca(NO3)2.4H2O o en la forma anhidra de cualquier sal. El magnesio y azufre satisfacen sus requerimientos con MgSO4.7H2O. El sodio no es requerido en grandes cantidades por las plantas superiores; sin embargo, puede ser un elemento esencial para cultivos de haltas y plantas C4. El cloro est presente en forma de KCl o CaCl2.

b) Micronutrimentos: para una adecuada actividad metablica, las clulas vegetales requieren de micro-nutrimentos, los ms esenciales son Fe, Mn, Zn, B, Cu, Co y Mo. Los ltimos cinco elementos son fundamen-tales para la sntesis de clorola y la funcin de cloroplastos.

El Fe es requerido para la formacin de precursores de la clorola. El Mn es necesario para el mantenimiento de la ultraestructura y el proceso fotosinttico (la actividad del fotosistema II es proporcional al contenido de este catin). El Cu y Zn son requeridos para la oxidacin e hidroxilacin de compuestos fenlicos. El Mo y Fe forman parte de las enzimas nitrato-reductasa y nitrogenasa. El boro es necesario para el mantenimiento de la actividad meristemtica, est involucrado en la snte-sis de bases nitrogenadas, en particular de uracilo.

Agentes quelatos: son compuestos cuyas molculas son capaces de detener un in de un metal con varias uniones qumicas formando un anillo complejo (quelato-EDTA cido etilendinitrotetracetato) en bajas concentraciones estimulan el crecimiento haciendo que el Fe est disponible en bajas concentracio-nes.

Las concentraciones tradicionalmente se expresaban en mg.l-1, es preferente en mM, meq.l-1 y mol.l-1

II.- Vitaminas

Son necesarias para llevar a cabo una serie de reacciones catalticas del metabolismo y son requeridas en pequeas cantidades. Las ms empleadas son las siguientes: Tiamina (Vit. B1): se aade como tiamina-HCl. Es considerada como la nica, imprescindible o esencial para el crecimiento de las clulas vegetales. cido nicotnico (Niacina). Piridoxina (Vit. B6): se aada como piridixina-HCl. Mio-inositol: no es propiamente una vitamina, es una azcar-alcohol que tiene un efecto estimulante sobre la morfognesis, participando quiz en la va biosinttica del cido galacturnico. cido pantotnico: ayuda al crecimiento de ciertos tejidos.

III.- Hormonas del desarrollo vegetal

Existen tres grupos principales:

a) Auxinas: vinculadas al alargamiento celular, induccin de callo, neoformacin de meristemos radicales. (AIA, AIB, 2,4D y ANA).b) Citocininas: promueven la divisin celular y organizacin y diferenciacin de callos, estimulan la prolife racin. Las mas utilizadas con BA, Kin, 2ip, Zeatina, Thidiazurn).c) Giberelinas: promueven el alargamiento celular, adems de utilizar cido abscsico, poliaminas, entre otros.

IV.- Aminocidos

Son una fuente adicional e inmediata de nitrgeno, su asimilacin puede ser ms rpida que el nitrge-no inorgnico aportado el medio, pueden actuar como agentes quelantes. La L-glutamina y la L-asparagi-na son transportadores de nitrgen o, L-arginina estimula las races y L-cistena es un agente reductor.

V.- Carbohidratos

Son utilizados como fuente de energa y osmo-reguladores. La sacarosa es el azcar empleado univer-salmente, la siguen en importancia la glucosa, fructosa, maltosa, ranosa, galactosa, manosa, lactosa. La concentracin a la que se emplea la sacarosa es de 20 a 45 g.l-1.

VI.- Agua

El agua para preparar medios de cultivo deber ser destilada, bidestilada, tridestilada, desionizada o desminarizada, el agua potable contiene sales en solucin que pueden modicar la respuesta de los tejidos en cultivo.

VII.- Agentes gelicantes o solidicantes

Se emplean en el caso de medios semislidos, se ha utilizado el agar como un sistema de soporte para la preparacin de medios slidos o semislidos. Las ventajas que representa el agar es que con el agua forma geles que se derriten a 100 C, se solidican a 45 C, por lo que es estable a las temperaturas de incu-bacin, adems no es alterado por enzimas vegetales, ni reacciona con los constituyentes del medio y no interere con la movilizacin de los componentes del medio de cultivo.

VIII.- Otros compuestos

Muchos compuestos o suplementos no denidos de composicin qumica variable como albumen de coco, endospermo de maz, extracto de levadura, jugos y extractos de frutas (pltano, tomate, papaya), casena hidrolizada (como fuente protenica), antioxidantes (cido ascrbico, ctrico) y adsorventes como el carbn activado.

Objetivos

Conocer la secuencia y los procedimientos necesarios para preparar las soluciones concentradas a partir de las cuales se tomarn alcuotas para elaborar un medio de cultivo. Que el estudiante identique los factores asociados a la solubilidad de hormonas del desarrollo vegetal.


Determinar el peso atmico de cada uno de los reactivos que componen el medio de cultivo a utilizar.Revisar lo relativo a la forma de expresar la concentracin de los mismos mg.L-1, milimoles (mM) y micro-moles (M).


Balanza digitalBalanza granatariaEsptulasAgitador magntico con control de temperaturaReactivos (tipo y cantidad) para elaboracin del medio de cultivo Cruz-Pizarro, 2000Tabla peridicaPotencimetroHidrxido de Sodio 0.1 Ncido clorhdrico 0.1 NAgar BacteriolgicoHorno de MicroondasJeringa de Flujo continuo o de repipeteo automticoTubos de ensaye (25x145 mm)Frascos de vidrio tipo gerberTapones para tubo de ensayeTapones para frasco tipo gerberAutoclaveGradillasLigas de hule gruesas (No. 45)

MEDIO DE CULTIVO CRUZ-PIZARRO 2000

pH: 5.7 0.1


Por lo general, la preparacin del medio de cultivo se realiza elaborando soluciones madre o concentradas, a partir de la dilucin o extraccin de alcuotas se desarrollan medios de cultivo. Recientemente existen en el mercado medios de cultivo preparados en forma individual (los ingredientes necesarios para una formu-lacin de un litro), son costosos, la elaboracin por dilucin es ms econmica.

Para reducir pasos en la preparacin de un medio de cultivo se combinan varias sustancias en una solucin concentrada, siendo importante la calidad de los reactivos qumicos (generalmente de grado analtico) Se debe considerar que algunos compuestos son incompatibles con otros a ciertas concentraciones: el calcio no puede mezclarse con fosfato o sulfato, ni el magnesio con el fosfato, para nes prcticos la solucin puede ser 25, 50 o 100 veces la concentracin nal del medio. Las soluciones de sales orgnicas se pueden conservar a temperatura ambiente, se recomienda en refrigeracin igual que las hormonas.

Se utilizarn soluciones madre o concentradas, extrayendo de ellas las alcuotas sealadas por el profesor responsable.

La solubilidad de los componentes como el agar y sacarosa se realiza por separado en ese orden con ayuda de esptulas, agitacin y calentamiento en horno de microondas, con cuidado con el hervor.

El pH se ajustar con ayuda del potencimetro a 5.7 0.1, este ajuste es importante, puesto que afecta el tejido. Con la consistencia del medio en pH < 4.8, el gel pierde rmeza, se hace blando y pH > 6.0 adquiere una consistencia ms dura, el pH se ajusta con NaOH o HCl 0.1 N.Con la jeringa de ujo continuo se depositan 10 ml de medio en cada tubo o frasco gerber esterilizado con antelacin.Con amarres de 10-12 tubos bajo la ayuda de ligas de hule, los frascos gerber se manejan en forma indivi-dual.

El proceso de esterilizacin inicia una vez llenado y tapado el tubo o el frasco en la autoclave a una tempe-ratura de 120 C (20 lb.in2) durante 30 minutos, vericando el nivel de agua en condiciones de seguridad del mismo.


Aparte de las consideradas previas, en esta prctica se deber entregar el balance inico del medio elabo-rado, expresado en milimoles (mM) por cada in especco, indicando el total de aniones y cationes en el mismo, expresado en forma de tabla o cuadro.


DESINFESTACIN Y ESTABLECIMIENTO DE TEJIDOS IN VITRO

Introduccin

La primera condicin para la realizacin de cultivo de tejidos vegetales es lo relativo a la asepsia, debido a que los medios de cultivo ofrecen condiciones favorables tambin para el desarrollo de patgenos (hon-gos y bacterias). Las causas de contaminacin de los cultivos establecidos in vitro son las siguientes: 1) El aire o ambiente, el cual puede contener en suspensin diversos microorganismos (esporas). 2) Los tejidos vegetales, en su exterior o interior (tejido vascular) pueden contener microorganismos que pueden o no ser patgenos, bajo condiciones normales; sin embargo, cuando el tejido o el rgano es cultivado in vitro, el crecimiento de los microorganismos limita el desarrollo de las clulas. 3) El medio de cultivo con un proceso de esterilizacin poco efectivo (desde el lavado de la cristalera, condicin de los reactivos, esterili-zacin en el autoclave). 4) El cuerpo humano, limpieza de manos, en el pelo, respiracin, trabajo de poca precisin durante la exposicin al fuego de bistures, pinzas, cajas etc.

Quiz la causa ms importante de contaminacin es lo relativo a la planta misma, el material vegetal deber ser bien esterilizado antes de su aislamiento in vitro.Es importante considerar el origen del material a esterilizar, aqullos que provienen de campo, con porcio-nes de suelo (races o tallo), pueden presentar ms problema durante este proceso que los que provienen de invernadero y condiciones controladas.

Uno de los principales problemas que se presentan cuando se trata de

Cultivo de tejidos vegetales (Manual de prácticas)

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