Cultivo in vitro de tejidos...
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Totipotencialidad
Es la capacidad de una célula vegetal de dar lugar al desarrollo de una planta completa.
Las células totipotentes son células somáticas que han retenido su capacidad de dividirse y
diferenciarse en una planta madura si se colocan en el medio adecuado.
Propiedades de las células vegetales
Meristema: conjunto de células no diferenciadas para su última función. Se encuentran localizados en los ápices de los tallos y raíces, en las axilas de las hojas, en el cambium de tallos, en los márgenes de las hojas y en callos.
Desdiferenciación / Rediferenciación:
Consiste en la transformación y pérdida de las características de especialización de un tipo
celular para dar lugar a células de tipo meristemático.
El segundo paso involucrado en la regeneración de una planta es la rediferenciación de las
células previamente desdiferenciadas.
Plasticidad o Transdiferenciación
Propiedades de las células vegetales
Balance de reguladores del crecimiento vegetal
Las propiedades de totipotencia y desdiferenciación son el punto de
partida del cultivo de células y tejidos vegetales
Las células meristemáticas se encuentran localizadas en los ápices de los tallos
y raíces. en las axilas de las hojas. en el cambium de tallos, en los márgenes de las
hojas y en callos, así, estas células dependiendo de su base genética y localización
e influenciadas por la luz. temperatura, hormonas y probablemente otros factores,
se diferencian en hojas. tallos, raíces y otros órganos y tejidos de una manera
organizada.
La relación auxina/citocinina regula la morfogénesis en cultivos de tejidos
(Skoog & Miller
1965)
Todo proceso de diferenciación está regulado por el balance entre diferentes tipos de reguladores del crecimiento
Qué es el Cultivo in vitro?
Puede definirse como el conjunto de técnicas que permiten
el cultivo en condiciones asépticas de órganos, tejidos,
células y protoplastos.
También se dice que es el cultivo aséptico in vitro
de cualquier parte de una planta en un medio nutritivo.
Como resultado se observa el desarrollo de una masa celular que deriva de un explante de
origen vegetal que ha crecido en condiciones de asepsia en un medio de cultivo líquido o
sólido, bajo condiciones controladas de luz y temperatura para que continúen su desarrollo,
tal y como lo hacía en la planta “madre”.
explante es aquella parte separada del vegetal (protoplastos, células, tejidos u órganos)
Cultivo in vitro
La capacidad de regenerar tejidos, órganos y aún una planta completa es única de
las plantas. No ocurre un fenómeno similar en animales superiores.
Cada fragmento origina una planta idéntica a la que se le tomó el fragmento,
denominadas clones. Son copias genéticamente idénticas entre ellas e idénticas a la
planta madre.
El cultivo de tejidos comprende un conjunto de técnicas con las cuales
podemos ejercer un control relativo sobre los procesos morfogenéticos,
fisiológicos y bioquímicos que se llevan a cabo en los tejidos bajo estudio
La respuesta morfogenética puede manifestarse siguiendo dos rutas alternativas:
Embriogénesis Somática Organogénesis
Formación de un primordio unipolar ydesarrollo de un brote que tiene conexión conel tejido materno
Proceso a través del cual se obtiene unaestructura bipolar similar al embrión cigóticosin que medie la fertilización de gametas
La morfogénesis se define como la formación o génesis de órganos, y comprende el crecimiento y la diferenciación celular
Organogénesis (formación de órganos)
Formación de tallos, raíces, flores, etc.
¡¡Regeneración de una planta completa!!
Explanto
Organogénesis
Formación de tallos Formación de raíces
Enraizamiento Tallos
Planta completa
Embriogénesis (formación de embriones)
Proceso mediante el cual se desarrolla un embrión a partir de una célula huevo
fertilizada o asexualmente desde un grupo de células somáticas (embriogénesis
somática).
Procedimiento para la regeneración vía embriogénesis somática
1. Iniciación: callos embriogénicos
2. Proliferación: callos embriogénicos, masas proembriogénicas (PEM)
3. Desarrollo y maduración de embriones: embriones
4. Germinación de embriones (Regeneración)
Masas proembriogénicas
Estadíos de desarrollo en dicotiledóneas: Estadío globularTorpedoEmbrión somático
Cultivo de tejidos
Metodología de saneamiento y diagnóstico
Aplicaciones del Cultivo de tejidos
Factores que afectan la micropropagación:
1.Relacionados con la planta:
1.1 Inoculo ó Explante1.2 Genotipo1.3 Fisiología1.4 Condiciones de crecimiento de la planta madre1.5 Tipo de explante1.6 Producto final
2. Relacionados con el medio de cultivo
2.1.Agentes gelificantes2.2.Factores nutricionales2.3 Bioreguladores y productoscon actividad hormonal
3. Relacionados con el ambiente3.1 Intercambio gaseoso3.2 Etileno3.4 Condiciones de luz (intensidad/calidad)3.6 Fotoperiodo3.9 Humedad3.10 pH
Etapas implicadas en el protocolo de micropropagaciónde una especie vegetal
Aclimatación FASE 4
FASE 2
Elección de una planta
madre selecta
Explantes
Desinfección superficial
Establecimiento en medio
de cultivo apropiado
Transferencia a medio de multiplicación.
(Subcultivos)
Formación de brotes
Transferencia a un medio
para el enraizamiento de los
brotes
FASE 1
FASE 3
FASE 0
Extracción de
Meristemos
PARÁMETROS IMPORTANTES PARA LA MICROPROPAGACIÓN
• Plantas élite seleccionadas por características fenotípicas especiales que corresponden con el clon o la variedad a propagar
• Caracterizadas morfológicamente, bioquímicamente o molecularmente
• Con estado de crecimiento activo
• Sanas
(Perez Ponce et al, 1998)
Selección de las plantas donadoras
Pretratamiento de las plantas donadoras
• Crecimiento en condiciones higiénicas y controladas (luz,
temperatura y humedad relativa)
• Diagnóstico (síntomas y pruebas)
• Tratamiento (aplicación de desinfectantes o mezclas de
fungicidas y bactericidas)
(Pérez Ponce et al, 1998)
La escogencia del explante dependerá de:
• Objetivo perseguido
• Especie vegetal/Variedad
• Disponibilidad
• Facilidad de manipulación
• Homogeneidad
• Baja contaminación con microorganismos
• Rápida respuesta in vitro
(Roca y Mroginski, 1991)
Tipos de explantes
• Cualquier explante que contenga células nucleadas vivas,
preferiblemente de plantas jóvenes in vivo o in vitro
• Ápices o meristemas caulinares, hojas, entrenudos,
cotiledones, raíces, anteras, inflorescencias, microsporas,
ovarios, tejidos diferenciados, células, protoplastos
(Roca y Mroginski, 1991)
Tamaño del explante
• Cuanto más grande sea, mayores son las
posibilidades de obtener proliferación
callosa, cultivos heterogéneos y
contaminación con microorganismos.
• Existe un tamaño mínimo del explante,
variable según el material vegetal, por
debajo del cual no se obtienen
proliferación callosa u otras respuestas
deseables.
(Roca y Mroginski, 1991)
Esterilización o asepsia
• La esterilización es el proceso mediante el
cual cualquier material, sitio o superficie se
libera completamente de cualquier
microorganismo vivo o espora.
• Se utiliza la palabra asepsia para designar la
condición en la que están ausentes los
microorganismos.
• La palabra aséptico es sinónimo de estéril.
Asepsia
Para establecer cultivos asépticos es conveniente:
• a) trabajar en ambientes adecuados
• b) esterilizar los medios de cultivo
• c) desinfectar superficialmente los explantes, liberándolos
de bacterias y hongos exógenos
• d) realizar los cultivos respetando las normas de asepsia.
Desinfección de los explantesExiste una vasta gama de compuestos químicos que se pueden utilizar como
desinfectantes para los explantes:
• Etanol (70% v/v)
• Hipoclorito de sodio (NaOCl) del 1 al 3% de i.a.
• Hipoclorito de calcio (Ca(OCl)2 6% a 12%
• Cloruro de mercurio (HgCl2, 0,1 al 1,5%) (tóxico)
• Aditivos: Tween-20 (0,01 al 0,1%)
• En algunos casos se usa una doble desinfección o preincubación
(Roca y Mroginski, 1991)
Desinfección de los explantes
Microorganismos que colonizan la superficie o el interior del explante (endófiticos)
Fallas en los procedimientos de laboratorio.
Fuentes de Contaminación microbiana
Los contaminantes másfrecuentes in vitro son los Hongos, Bacterias y Levaduras, que en muchos casos no son patógenos en condiciones de campo.
Reducen la eficiencia de los cultivos y pueden ocasionar la muerte de la planta.
Fuentes de Contaminación microbiana
• Neurospora sp
• Aspergillus sp
• Microsporium sp
• Cladosporium sp
• Phialospora sp
• Alternaria sp
• Botryodiplodia sp
• Helminthosporium sp
• Nigrospora sp
• Cephalosporium sp
• Rhinocladiella sp
• Fusarium sp
• Curvularia sp
• Gloeosporium sp
• Dreschlera sp
• Diplodia sp
• Pestalotia sp
Géneros identificados en explantes iniciales de caoba, teca, eucalipto, majagua y cedro (Lab. Fitopatología IBP)
Alternaria sp
Aspergillus niger
Curvularia sp Helminthosporium sp
HONGOS FILAMENTOSOS CONTAMINANTES DE LA FASE DE ESTABLECIMIENTO DE FORESTALES
Equipos e instrumental
RESUMEN PRINCIPALES FUENTES DE CONTAMINACIÓN
Insectos Hombre
Ambiente
Explante inicial
EsterilizaciónPrecauciones durante las tareas que se llevan a cado en la cámara de transferencia
para mantener la asepsia de los cultivos:
•1. Desinfectar la cámara de aislamiento con etanol 70%. Desinfectar la parte externa de los
recipientes que contienen los medios de cultivo o el agua estéril, antes de introducirlos en la cámara
•2. Es necesario que las manos y los antebrazos del cultivador sean desinfectados con etanol 70%. El
uso de máscaras y gorros no es imprescindible, pero reduce la contaminación si se opera en flujos
laminares de aire estéril
•3. Los instrumentos metálicos empleados se deben flamear previamente con etanol 95%.El material
de vidrio utilizado como soporte para las disecciones (cápsulas de Petri) debe estar esterilizado, al
igual que las pipetas que comúnmente se usan en trabajos con suspensiones celulares y protoplastos.
Procedimiento de esterilización
La esterilidad en cualquier preparación depende de muchos factores:
Naturaleza de la sustancia que se esteriliza,
El volumen contenido en cada unidad
El tamaño del recipiente y el numero de unidades que se pueden manejar en una sola
operación
Tipos de esterilización
• Calor seco
Estufa de aire caliente a una temperatura mínima de 170oC,
durante dos horas o mas (recipientes de vidrio, algodón)
• Vapor bajo presión (autoclave)
Eficiente para destruir todas las formas de contaminación
(15 lb de presión, 121,5 oC durante 20 minutos)
• Filtración
La esterilización de líquidos termolábiles se realiza a
través de filtros especiales (Millipore) a prueba de hongos y
bacterias.
Medio de cultivo
Mezcla de sustancias en los que las células, tejidos y órganos
pueden dividirse y crecer.
• Sustancias inorgánicas: (Sales mayores y menores) N, P, K,
Ca, Mg, Cl, Na, Cu, Zn, Mn, Fe, Bo, Mo, Co, I
• Suplementos orgánicos complejos: leche de coco, extracto
de levadura, reguladores de crecimiento; fuente de carbono
(sacarosa); vitaminas; aminoácidos.
• Con o sin agar: medio semi -sólido o líquido.
(Roca y Mroginski, 1991)
MEDIOS DE CULTIVO
• El medio de cultivo permite que de forma artificial y bajo condiciones estériles puedan vivir y
multiplicarse células, tejidos y órganos separados del tejido que les dio origen
• En términos generales, la mayor parte de los tejidos se pueden cultivar exitosamente en un medio
que contenga cualquiera de varias mezclas de sales minerales diseñadas para mantener el
crecimiento de tejidos y órganos
• Algunos tejidos se pueden cultivar exitosamente en un medio completamente definido, mientras
muchos otros no presentan crecimiento en soluciones salinas relativamente simples, a menos que
se complementen con ciertos microelementos, vitaminas y otras sustancias promotoras del
crecimiento de naturaleza completamente indefinida
Fuentes de carbono
• La sacarosa (del 2 al 5%) es el azúcar que más se utiliza
• Glucosa y en menor medida por fructosa
• Maltosa y la galactosa son menos efectivas
• La incorporación de mioinositol al medio (100 mg/L) da como
resultado un mejor crecimiento de los callos y suspensiones
celulares.
Vitaminas
• Las plantas verdes se consideran normalmente autótrofas para las
vitaminas
• Los aditivos mínimos usuales son la tiamina, el ácido nicotínico y la
piridoxina
• Otras vitaminas como ácido pantotenico, biotina, riboflavina y colina
Agentes gelificantes
Medios semisólidos
• Agar (0,6 al 1,0%) bajo en impurezas:
la marca comercial y las concentraciones del agar utilizado pueden alterar las respuestas in vitro de los cultivos
Se recomienda lavar el agar con agua destilada (tres lavados consecutivos)
• Gelrite (0,15%), alginato o agarosa
Medios líquidos
con soporte de algodón, papel de filtro, otros
El crecimiento y desarrollo de las plantas está regulado por el equilibrio
entre los fitorreguladores estimuladores del crecimiento (auxinas,
giberelinas y citocininas) y los inhibidores del crecimiento (ácido abscísico
y jasmonatos).
Los 5 primeros grupos de fitorreguladores naturales descubiertos fueron:
giberelinas, ácido abscísico, citocininas, auxinas y etileno.
Otros descritos que tienen un papel regulatorio en el desarrollo de las plantas: el
óxido nítrico, brasinoesteroides, poliaminas y jasmonatos
FITOHORMONAS
Gaspar et al, 2003
Reguladores de crecimiento
Hormonas/ Fitohormonas:
• Auxinas: grupo de hormonas vegetales (naturales o sintéticas) que inducen la elongación, o en
algunos casos la división celular.
• Frecuentemente inducen raíces adventicias e inhiben la formación de tallos adventicios.
• Citoquininas: grupo de hormonas vegetales (naturales o sintéticas) que inducen división celular y
frecuentemente tallos adventicios y en muchos casos inhiben la formación de raíces adventicias.
Reglas generales para la acción hormonal:
• • Auxina = ~1 Cytokinina Callo
• • Auxina < 1 Cytokinina Tallo
• • Auxina > 1 Cytokinina Raíces
A diferencia de hormonas animales, no son
producidas en glándulas u órganos
especializados, sino en diversas partes de la
planta.
Son transportadas de diversas formas,
principalmente por sistema vascular (floema,
xilema).
La respuesta dependerá de la condición del
tejido sobre la cual actúe (sensibilidad) y su
efecto dependerá de la concentración de la
hormona en el sitio activo.
CARACTERÍSTICAS DE LAS FITOHORMONAS
Gaspar et al, 2003
Sólo activas en un rango deconcentraciones.Concentraciones muy altaspueden ser inhibitorias.
Normalmente actúan encombinación con otrashormonas y su síntesis estácontrolada por:Otras hormonasCondiciones ambientalesEstado de desarrollo de la
Planta.
INTERACCIÓN EN FITOHORMONASINTERACCIÓN EN FITOHORMONAS
Gaspar et al, 2003
AuxinasComprenden una gran familia de sustancias que tienen la capacidad de producir
agrandamiento y alargamiento celular, y promueve la división celular. Fueron descubiertas
hace unos 80 años
Naturales• Ácido Indol acético (AIA)• Ácido indol butírico (AIB)
Sintéticas• Ácido naftalenoacetico (ANA)• Ácido 2,4-diclorofenoxiacetico (2,4-D)• Ácido 2,4,5-tricloroacetico (2,4,5-T)• Picloram• Dicamba• Ácido p-clorofenoxiacetico (CPA)
AUXINAS
Efectos en cultivo de tejidos
• Formación de raíces adventicias (en altas concentraciones)• Formación de brotes adventicios
(en bajas concentraciones)• Inducción de embriones somáticos (en particular 2,4-D)• División celular
• Formación y crecimiento del callo• Inhibición de brotación de yemas axilares• Inhibición del crecimiento de las raíces
Formación de raíces adventicias en microtallos de Nothofagus glauca. A. T0 = testigo; B. T1 = 1,0 mg l-1 AIB; C. T2 = 3,0 mgl-1 AIB; D. T3 = 5,0 mgl-1 AIB; E. T4 = 1,0 mgl-1 ANA; F. T5 = 3,0 mgl-1 ANA; G. T6 = 5,0 mgl-1 ANA
Se sintetizan en el embrión y las raíces; se encuentran en todos los tejidos.
La concentración endógena en plantas varía entre 0,1 y 500 g/Kg.
Las citoquininas naturales son derivadas de la adenina
Su transporte es no polar (Transporte como glucósidos).
Las citoquininas junto con el AIA regulan la división celular, permitiendo
iniciar la mitosis.
Citoquininas
CITOCININASEfectos en cultivo de tejidos
• Formación de brotes adventicios
(en altas concentraciones)
• Inhibición de la formación de la raíz
• Promueve la división celular
• Formación y crecimiento del callo
• Estimulación de brotación de yemas axilares
• Inhibición de la elongación de los brotes
• Inhibición de la senescencia de la hoja
Giberelinas
El acido giberélico fue aislado a partir del hongo Gibberella fujikuroi
• Se conocen más de 90 giberelinas:
Ácido giberélico 3 (GA3)
Ácido giberélico 1 (GA1)
Ácido giberélico 4 (GA4)
Ácido giberélico 7 (GA7)
• Las giberelinas a niveles superiores de 1 mg/L son tóxicas y termolábiles,
por lo cual deben esterilizarse con filtros.
Giberelinas
Efectos en cultivo de tejidos
• Elongación de los brotes
• Rompe la latencia en semillas,
embriones somáticos, yemas
apicales y bulbos
• Inhibe la formación de raíces adventicias
las GAs estimulan el alargamiento y la división celular
Regula la transición entre crecimiento vegetativo y floral
La actividad de la molécula se pierde con cualquier cambio
Inhibe la germinación y el cierre estomático.
La concentración en las plantas 0,01 y 1 mg/L, sin embargo,
en plantas marchitas puede incrementarse hasta 40 veces.
Traslado tanto por xilema como por floema
Se sintetiza en el tejidos de los plastos
Se acumula en vacuolas (almacenamiento).
ÁCIDO ABSCÍSICO
El ABA se aisló hace 30 años
• Mantiene la latencia porque inhibe la producción de enzimas inducibles por
las giberelinas. Este efecto es el opuesto al producido por las giberelinas,
por lo tanto estamos frente a un balance hormonal responsable de una
regulación.
• Inhibe la transcripción del ARNm de la α-amilasa, por lo tanto la síntesis
ÁCIDO ABSCÍSICO
Ácido Abscísico
Efectos en cultivo de tejidos
• Maduración de los embriones somáticos
(sincronización)
• Facilita la aclimatización
• Induce la formación de tubérculos
• Favorece la latencia
ETILENO
Es una sustancia de crecimiento de naturaleza gaseosa
Efecto en cultivo de tejidos
• Favorece la senescencia en hojas
• Favorece la maduración de los frutos
• Inhibe la regeneración adventicia de brotes
• La adición de inhibidores de etileno (AVG y AgNO3) al medio de cultivo promueve la regeneración de brotes
El etileno no es usado en cultivo de tejidos, pero se acumula en los frascos de cultivos y es detrimental
Poliaminas
Son compuestos que se encuentran en bajas concentraciones en plantas y
tienen que ser añadidas en altas concentraciones (10-1000 uM)
Putrecina, espermidina, espermina
Efectos en los cultivos de tejidos
• Promueven la formación de raíces adventicias
• Promueven la formación de brotes
• Promueven la embriogenesis somática
Jasmonatos (ácido jasmónico, metiljasmonato - Meja)
Se sintetizan cuando las plantas son heridas y activan la síntesis de proteínas de estrés
Efectos en cultivo de tejidos
• Promueven la formación de tubérculos y bulbos
• Promueven la regeneración de brotes y raíces
OTROS COMPUESTOS
• AMINOACIDOS:
Son suministrados como extracto de levadura, caseína hidrolizada, L-
glutamina, agua de coco. Pueden promover el crecimiento de ciertos
cultivos.
La glicina, en ocasiones se incorpora al medio, así como otros aminoácidos
como asparagina, cisteína y L-tirosina
En general no son constituyentes esenciales de los medios de cultivo
AGUA DE COCO
• Utilizada desde 1942 para el desarrollo de embriones de zanahoria (van
Overbeek et al, 1942)
• La composición del agua de coco es muy compleja, contiene una amplia gama de
componentes orgánicos e inorgánicos (aminoácidos, otros compuestos
nitrogenados, ácidos orgánicos, azucares, alcoholes de azúcar, vitaminas,
sustancias de crecimiento, otros).
• Tiene una buena capacidad de amortiguación (buffer) , promueve el
crecimiento y tiene bajo costo
(Roca y Mroginski, 1991)
AGUA DE COCO
Ventajas de los medios líquidos
• Mayor facilidad en la preparación, esterilización y manipulación.
• Más rapidez en la absorción de nutrientes y la difusión de sustancias tóxicas producidas por el propio metabolismo de las plantas.
• Incremento en el número de plantas que se obtienen, ya que se ha observado una disminución en el tiempo entre subcultivos lo cual permite producir una mayor cantidad de plantas por unidad de tiempo y disminución en los plazos de propagación.
• Aumento de la productividad de los operarios debido a que los explantes solo deben ser colocados en contacto con el medio.
• Disminución en los costos, ya que los agentes solidificantes representan cerca del 90% de los costos del medio de cultivo.
• El cambio en la composición del medio de cultivo puede efectuarse por simple transferencia.
• Facilidad de automatización.
Desventajas de los medios líquidos • Hiperhidricidad (Vitrificación)
•Trastornos anatómicos, morfológicos y fisiológicos producidos en las plantas cultivadas in vitro ligado a un conjunto de características físicas, que describen
cambios en las hojas, tallos y raíces que les dan una apariencia cristalina, acuosa, húmeda y translúcida como resultado de varias alteraciones en determinadas rutas metabólicas. Así los cambios en la síntesis de proteínas, afectan a varias enzimas implicadas en la fotosíntesis (Rubisco), a la síntesis de celulosa y lignina (glucano sintetasa), y a procesos asociados a la producción de etileno (peroxidasas)
• Apariencia acuosa de los tejidos por exceso de agua en
la célula
• Deterioro de los cultivos
pH y otras condiciones del cultivo
• Steward et al (1952) encontraron que un medio levemente ácido (pH 6,25 era óptimo para los cultivos de zanahorias
• Condiciones óptimas:
Fuente luminosa compuesta de lámparas fluorescentes y lámparas incandescentes que brinden entre 1000 y 4000 lux de iluminación. Comúnmente se utiliza un ciclo de fotoperíodo/oscuridad de 16/8 h
• En general, las temperaturas entre 25 y 28oC son adecuadas para el establecimiento de los cultivos
Oxidación fenólica• Cuando los tejidos son dañados, por ejemplo durante la preparación del explante, los
compuestos fenólicos que están en grandes cantidades en las vacuolas, se mezclan con el
contenido de los plastidios y otros organelos donde están confinadas las polifenoloxidasas
y aparece la coloración negra o marrón como consecuencia del proceso de oxidación
(Preece y Compton, 1991)
• Estos compuestos son altamente reactivos e inhiben la actividad enzimática, lo cual puede
resultar en un oscurecimiento letal de los explantes
• Los antioxidantes más empleados han sido:
Ácido ascórbico, Polivinilpirolidona (PVP), L-Cisteina,
Dithiotreitol, Ácido Cítrico, Tiourea, Carbón activado.
(Perez Ponce et al, 1998)
1. Pre o post tratamientos con antioxidantes en la disección de explantes2. Incorporación de antioxidantes o carbón activado al medio de cultivo3. Subcultivo frecuente a medio fresco4. Inmersión en agua destilada estéril algunas horas antes de la siembra in vitro5. Iniciar los cultivos en oscuridad o a bajas temperaturas6. Disminuir la intensidad de la luz en etapas iniciales7. Incrementar las sales de calcio8. Reducir el nivel de nitrato en el medio9.Empleo de medios líquidos en sustitución de medios gelificados o adicionar una capafina de medio liquido en la superficie del medio semisólido para diluir los metabolitostóxicos10. Modificación del pH y del potencial redox del medio (agentes reductores)
Métodos para reducir la oxidación fenólica en cultivo in vitro
Etapas de la Micropropagación
En la micropropagación pueden identificarse cinco etapas bien definidas con sus objetivos específicos:
• Fase 0 : Preparativa . En esta etapa se incluye la selección de la planta donadora y una serie de pretratamientos en condiciones higiénicas controladas, cuyo objetivo es mejorar la eficiencia en la implantación y el desarrollo posterior de los cultivos in vitro.
• Fase I : Establecimiento o Iniciación de los cultivos. El objetivo de esta fase es establecer cultivos axénicos y viables con los cuales iniciar el proceso de propagación.
• Fase II : Multiplicación. Es considerada la etapa más importante del proceso donde se debe garantizar la propagación de los brotes/embriones y la estabilidad genética de las plantas producidas.
Etapas de la Micropropagación (cont.)
• Fase III : Enraizamiento. Su objetivo es preparar las plántulas para su reestablecimiento en condiciones de suelo.
• Fase IV : Aclimatización. Es la fase final del proceso y por tanto su meta es lograr plantas listas para su trasplante definitivo a campos comerciales de producción, invernaderos o umbráculos.
Fase II : Multiplicación.
Su objetivo es lograr la producción del mayor número posible de propágulos a partir de los brotes establecidos, garantizando la estabilidad genética de las plantas producidas.
Se induce la proliferación de brotes, los cuales son separados en condiciones estériles y cultivados nuevamente en medio fresco para inducir nuevos brotes, operación que se repite hasta lograr la cantidad de plantas deseadas.
Etapas de la Micropropagación
Etapas de la Micropropagación
• Fase III : Enraizamiento in vitro
En esta fase los brotes obtenidos durante la etapa de
multiplicación crecen hasta formar plantas completas y
desarrollan un sistema radical que les permite ser
trasplantadas a un sustrato en condiciones de vivero o
invernadero.
Fase III : Enraizamiento in vitro
1. Reguladores del crecimiento
2. Concentración de sacarosa
3. Concentración de sales minerales
4. Estado físico del medio de cultivo
5. Enraizamiento ex vitro
Factores que favorecen el enraizamiento in vitro
•El incremento de la concentración de sacarosa en el medio de cultivo induce un
crecimiento vigoroso de las raíces.
•Las plantas procedentes de medios de cultivo con mayores concentraciones de
sacarosa presentan además una mayor sobrevivencia al ser trasplantadas a
suelo
•La reducción de la concentración de las sales a la mitad, un tercio o un cuarto
de la concentración de los medios empleados para la propagación.
•Aproximadamente el 12% de los medios de cultivo utilizados durante esta
fase se emplean en estado líquido
Etapas de la Micropropagación
Fase IV : Aclimatización.
Es la fase final del proceso y por tanto su meta es lograr plantas listas para su trasplante definitivo a campos comerciales de producción, invernaderos o umbráculos.
¿Por qué gradual?
El ambiente in vitro (alta humedad relativa, baja intensidad luminosa, temperatura constante, bajo o nulo intercambio gaseoso en el frasco), condiciona cambios en la morfología de las plantas que influyen en la capacidad de sobrevivencia y crecimiento como son :
1. Hojas: anatomía interna mal estructurada, estomas que no cierran normalmente ydesarrollo deficiente de la cutícula (falta de cera epicuticular). Esto hace que lasplantas sean más susceptibles al estrés por pérdida de agua y por tanto debendesarrollar nuevas hojas adaptadas a las nuevas condiciones.
2.Tallos: menor contenido de tejido de soporte (colénquima y esclerénquima).
3.Raíces: raíces poco funcionales, ausencia de raíces secundarias, paredes celularesfinas. Conexión vascular incompleta entre tallo y raíces que impide el transporteeficiente de agua y nutrientes. Como resultado de esto prácticamente las plantasdeben desarrollar todo el sistema radical nuevo durante la etapa de aclimatización.
Fase IV : Aclimatización
• Condiciones favorables:
Alta humedad, baja luminosidad
Reducir gradualmente humedad
Aumentar intensidad lumínica
• Condiciones de campo
SustratoEl sustrato es el soporte físico de la planta, donde se desarrollan las raíces, y estasdeben tener disponibles el agua y los elementos necesarios para su crecimiento
Mezclas de Aserrín, fibra de coco, compost, turba-musgo, perlita, vermiculita, arena, uoasis. Sustrato importado
Características que debe cumplir un sustrato:
• Estabilidad física. No debe perder sus cualidades físicas hasta transcurrido un tiempo razonable.
• Densidad. El sustrato debe ser ligero para facilitar el manejo y transporte de los contenedores.
• Aireación-porosidad. Las raíces para desarrollarse necesitan una buena aireación. Cuando se riega, unaparte del agua drena dejando un espacio que ocupa el aire. Este espacio debe ser como mínimo un 20 % delvolumen total y a veces más.
• Acidez. Para la gran mayoría de las plantas el pH óptimo se sitúa entre 5.5 y 6.5.
Sustrato
Características que debe cumplir un sustrato: (continuación)
• Sanidad. Debe estar libre de semillas de malezas y patógenos decualquier tipo que puedan dañar las plantas.
• Capacidad de retención de nutrientes. Los nutrientes se aportangeneralmente por el agua de riego. La medida de la capacidad deretención es la Capacidad de Intercambio iónico, que indica la facilidadcon que el sustrato retiene y cede iones. Un sustrato óptimo debetener entre 15 y 50 meq/100 cm3.
• Capacidad de retención de agua. El sustrato debe retener la mayorcantidad de agua posible sin poner en peligro la aireación.
