Curso de Biología Molecular y Genómica para profesores de ... · 5’ 3’ Shine Dalgarno +1...

CursodeBiologíaMolecularyGenómicaparaprofesoresdeEnseñanzaMedia2018

Dr.MarceloAntonelliProgramadeBiologíaCelularyMolecularICBMFacultaddeMedicinaUniversidaddeChile

ENERO2018

TemariodelaClaseParte1-Elcódigogenético-SíntesisdeproteínasParte2-Ingenieríagenética-Genotecas-Vectoresdeexpresión-Animalestransgénicos

Parte1:Elcódigogenéticoylabiosíntesisdeproteínas

Flujodelainformación

Síntesisdeproteínas

• mRNA

• Ribosomas

• aatRNA

• energía

• enzimasyfactores

HipótesisdelAdaptador

EstructuradelRNAdetransferencia(tRNA)

EstructuradeltRNA

ElCódigoGenético

CÓDIGOGENÉTICO20aa64codones

•  Nosesuperpone

•  Notienepuntuación

•  Seleedecorrido

•  Noesambiguo

•  Esdegeneradooredundante

•  Esuniversal

Característicasdelcódigogenético

Elcódigogenéticonoesambiguoyesdegenerado

•  Nosesuperpone

•  Notienepuntuación

•  Seleedecorrido

•  Noesambiguo

•  Esdegeneradooredundante

•  Esuniversal

Característicasdelcódigogenético

EnrealidadelCódigoGenéticonoesUniversal

Cisteina

Selenocisteina

¿CuántostRNAssenecesitanparalasintesisdelasproteínas?

LateoríadelbalanceodeterminaelnúmerodecodonesquepuedereconoceruntRNA

Serequiereunminimode32tRNAsparatraducirlos61codones(31codonesparalosaminoácidosyunoparalainiciación).

Aminoacil-tRNAsintetasas

•  EnzimasquecatalizanlaunióndeunaminoácidoauntRNA(activacióndelosaminoácidos)

•  Sonespecíficasparacadaaminoácido

Gln-tRNAsintetasa

Formacióndelenlacepeptídico

Reaccióndeactivacióndelaminoácido

ReaccióndeaminoacilaciónocargadeltRNA

ReaccióndeaminoacilaciónocargadeltRNA

•  Fidelidaddelatraducción

•  Conservacióndelaenergía

Aminoacil-tRNA

Latraducciónrequierelaparticipacióndeestructurascomplejasvisiblesaniveldelmicroscopioelectrónico……..

RibosomasESTRUCTURASDE

RNAyPROTEÍNA

Ribosomasbacterianos

versus

Ribosomaseucarióticos

Síntesisdeproteínasenprocarióntes

VisualizaciónsubunidadesribosomalesporMET

Acoplamientotranscripción-traducciónenbacterias

LecturadelmRNA5’3’

SíntesisNH3

+COO-

Reconocimientodelsitiodeiniciodelatraducciónenbacterias

SecuenciadeShineDalgarno

OtrosCodonesdeinicio:-Bacterias(E.coli)GUGyUUG-Eucariotes muyraroquenoseaATG

Arquitecturadelribosomabacteriano:

rRNA16S

ShineDalgarno

Iniciodelasíntesisdeproteínas

§ Subunidadribosomalmenor

§ factoresdeiniciación

§ mRNA

§ formilmetionil-tRNA

Subunidad30SdelRibosomadeE.coli

zonadecontactoconelmRNArRNA

Proteínasribosomales

SUBUNIDAD50SDELRIBOSOMA

Elongación

Formacióndelenlacepeptídicoenelribosoma

PeptidiltransferasarRNA23S

rRNA23S:estructurasecundaria

Traslocación

Términodelasíntesisdeproteínas

actividadpeptidilhidrolasa

RF=releasingfactor

Elongación

Bacterias Eucariontes

EF-Tu eEF1α

EF-Ts eEF1βγ

EF-G eEF-2

Término

Bacterias Eucariontes

RF1 RF

RF2

RF3

LastresfuncionesdelRNAenlasíntesisdeproteínas

GENPROCARIONTE

Transcripción

mRNA

Términodelatranscripción+1

Iniciodelatranscripción

regiónreguladora

Traducción

proteína

regióncodificante

AUG Codóndetérmino

3’5’

ShineDalgarno

+1

promotor

5’UTR3’UTR

ATG

DNA

EstructuradelosGenesydelmRNAenEucariontes

+1

EUCARIONTE

Ensamblajedelosribosomasencélulaseucariontes

eIF4FisoftenusedtorefertothecomplexofeIF4A,eIF4E,andeIF4G.

Regulatingcap-dependenttranslationinitiation.Therecruitmentofthe40Sribosomalsubunittothe5ʹendofmRNAisacrucialandrate-limitingstepduringcap-dependenttranslation.

IniciodelatraducciónenEucariontes

Síntesisdeproteínaseneucariontes

Síntesis de proteínas en eucariontes

Parte2:DNARECOMBINANTEEINGENIERÍAGENÉTICA

EstructuradelosGenesydelmRNAenEucariontes

+1

INGENIERÍAGENÉTICA

MANIPULACIÓNDELDNADELOSORGANISMOSVIVOS

1) INVESTIGACIÓNBÁSICA(ESTUDIODELAORGANIZACIÓN,EXPRESIÓNYFUNCIÓNDEGENESENLOSORGANISMOSVIVOS).2) APLICACIÓN DE ESTE CONOCIMIENTO EN LA MANIPULACIÓNCONSCIENTEDELOSGENESENSALUD,ENLAINDUSTRIADEALIMENTOS,ENLAAGRICULTURA,ETC.

PIEDRASANGULARESDELAINGIENIERÍAGENÉTICA

1.  ENDONUCLEASASDERESTRICCIÓN(ENZIMASDERESTRICCIÓN)

2.  REACCIÓNDEPOLIMERIZACIÓNDECADENAOPCR(POLYMERASECHAINREACCTION)

3.  GENOTECASGENÓMICASYDEcDNA

TécnicasdeDNARecombinante

ELOBJETIVODELATECNOLOGIADELDNARECOMBINANTEes…………………

AislarsecuenciasdeDNAquecontengangenesyobtenermúltiplescopiasdeellos

para…………..

1.  Conocersuestructuramolecular

2.  Estudiarsufunciónbiológica

3. Manipularlos

4.  Transferirlosdeunorganismoaotro⇒IngienieríaGenética

TÉCNICAS§ CLONAMIENTOMOLECULAR

§ PCR(reacciónencadenadelapolimerasa)

CLONAMIENTODEUNGEN

ETAPAS1)  ObtencióndelfragmentodeDNAdeinterésmediantePCR(Gen).

2)  Uniónaunvector(DNAvehículo):ObtencióndeDNArecombinante.

3)  Introducciónenunacélulahospedera(Objetivo:perpetuarloyamplificarlo).

4)Rastreo(screening):Identificacióndecoloniasquecontienenel

DNArecombinantedeinterés.

ClonamientodeunGen

DNAVector FragmentodeDNA

AmplificacióndelDNAencélulahospedera

IdentificaciónyaislamientodelfragmentodeDNA

DNArecombinante

ClonamientoporPCR

ReaccióndePolimerasaenCadena(PCR)

u Técnica utilizada en la detección yclonamientodegenesdeinterés.

u DiagnósticoClínico.

u MedicinaForense.

CLONAMIENTODEUNPRODUCTODEPCR

HERRAMIENTASBÁSICAS•  Enzimasderestricción

CLONAMIENTOMOLECULAR

Enzimasde

Restricción

DIGESTIONDELDNAPORENZIMASDERESTRICCION

Sitiodecorteenzimasderestricción

HERRAMIENTASBÁSICAS

•  Vectores


PLASMIDIODECLONAMIENTO

*Origendereplicaciónautónomo*Marcadordeselección*Sitiosúnicosderestricción


•  DNAligasa


Ligacióndefragmentosderestricciónconextremoscohesivos

ClonamientoDirigido

Ligacióndeextremoromo

Ligacióndeextremocohesivo


• Célulashospederas


PROPAGACIONENCELULAHUESPED

¡Sepuedencomprar¡

Recordarsiemprecolocarlesitiosderestricciónalospartidoresparapoderclonarelfragmentoenunplasmidio

fragmentodePCR

EstudiodelaFuncióndeunGen

HerramientasdeEstudio:

u Análisiscomputacionalenbancodedatos:homologíadesecuenciaconungendeotroorganismocuyafunciónseconoce.

u Animalestransgénicos.

u Expresiónenbacteriasycélulaseucariontes.

u Mutagenesis

Vectordeexpresiónenbacterias

u AmplificacióndelgendeinterésporPCR.

u Clonamientoenvectordeexpresión.

u Induccióndelaexpresióndelgendeinterésenbacterias.

Intervenciónenlabiologíaanimal:

Transgénesis

¿Quéesunanimaltransgénico?

Unanimal transgénicoesunoqueportaun genquehasidodeliberadamenteinsertadoensugenoma.

El gen extraño es construído e insertado utilizandometodologíadeDNArecombinante.

Además el DNA del gen a ser incorporado debe incluirotrassecuenciasquelocapacitenpara:

-Serincorpordoenelgenomadelhospedante-Ser expresado correctamente por las células delhospedante.

¿CómogenerarunanimaltransgénicoenelLaboratorio?

Método1:Inyecciónalpronúcleomasculino

Laconstrucciónlinearizadaesinyectadaenelpronúcleomasculino

TransgénicosdelgenSry(TDFenhumanos)

RATONES TRANSGENICOS El gen de la hormona de crecimiento se ha modificado geneticamente para que

se exprese en gran cantidad .

El promotor de metallothionein es regulado

por metales Ratones alimentados con metales

Conclusiones:

-Integraciónmuytempranaeneldesarrollo.

-Antesdeladivisióndelaprimeracéluladelcigoto.

-Antes de que la población de células germinalessegregadelascélulassomáticasprimordiales.

-Integración estable en las celulas somáticas ygerminales.-TransmiciónMendelianadelgentransgénico.

Método2:Transferencianuclear

Animalestransgénicosproducidosportransferencianuclear

GeneX

X

transfección

transducción

GeneXX

x

Transgénicosdelactoferrinaenbovino

u Utilizarlalechedelganadobovinocomo“reactor”paragenerargrandescantidadesdeunaproteínahumanadeinterésbiológico

Promotordecaseina

u Interésglobaldelaindustriaalimenticia

Ej:Transgénicosdelactoferrinahumana

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