De 081-03DE677-02-Revision 23 de Mayo

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ANTEPROYECTO DENORMA TÉCNICA COLOMBIANA NTC DE 081/03 (DE 677/02)

Grupo de trabajo del 22 abrilRevisón 6 de mayo -

MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS Y ALIMENTO PARA ANIMALESMETODO HORIZONTAL DE TÈCNICAS DE MUESTREO DE SUPERFICIESUSANDO CAJAS DE CONTACTO Y METODO DE ESCOBILLÒN

0. INTRODUCCIÒN

Esta norma especifica un método horizontal para la determinación del número demicroorganismos viables en las superficies de utensilios, superficies de trabajo y otros equiposen contacto con alimentos para conocer el nivel de contaminación durante la producción o laefectividad de los protocolos efectivos de limpieza y desinfección.

Este método horizontal describe ambos, el método de contacto de superficies usando contactocon caja o el método de láminas de inmersión o de escobillón o enjuague. El método decontacto de cajas es solo aplicable a superficies planas, mientras que el método de escobillón

(humedo y seco) puede ser usado para cualquier tipo de superficies. Para una muestra desuperficies extensas largas (> 100 cm2) paños o esponjas ) pueden ser utilizadas paños oesponjas. Los métodos alternativos prescritos en este estándar son métodos útiles para laestimación de la carga microbiana de las superficies.

Los resultados son muchas veces presentados como puntajes de calificación de higiene,basados en el número de UFC ( Unidad Formadora de Colonias) x cm2 presentado en un testde superficies.

1. OBJETO

Esta norma específica un método horizontal para la enumeración de microorganismos viablesen superficies con contacto de placas, láminas de inmersión y escobillones (trapo o esponja).

2. REFERENCIAS NORMATIVAS

Los siguientes documentos referenciados son indispensables para la aplicación de esta norma.Para referencias fechadas, se aplica únicamente la edición citada. Para referencias nofechadas, se aplica l última edición del documento referenciado (incluida cualquier corrección) .

NTC 4092: (ISO 7218:1996), Microbiología de Alimentos y de Alimentos para Animales.Reglas Generales para el Análisis Microbiológico.

ISO 4832:1991, Microbiology -- General guidance for the enumeration of coliforms - Colony

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count technique

ISO 4833 : 1991, Microbiology -- General guidance for the enumeration of micro-organisms --Colony count technique at 30 °C

ISO 6887-1:1999, Microbiology of food and animal feeding stuffs- Preparation of test samples,initial suspension and decimal dilutions for microbiological examination.

ISO 6888-1:1999, Microbiology of food and animal feeding stuffs -- Horizontal method for theenumeration of coagulase-positive staphylococci (Staphylococcus aureus and other species) --Part 1: Technique using Baird-Parker agar medium

ISO 6888-2: 1999, Microbiology of food and animal feeding stuffs -- Horizontal method for theenumeration of coagulase-positive staphylococci (Staphylococcus aureus and other species) --Part 2: Technique using rabbit plasma fibrinogen agar medium

ISO 7402 Microbiology -- General guidance for the enumeration of Enterobacteriaceae without

resuscitation -- MPN technique and colony-count technique

ISO 7218: 1996, Microbiology of food and animal feeding stuffs -- General rules for microbiological examinations

ISO 7954:1987, Microbiology -- General guidance for enumeration of yeasts and moulds --Colony count technique at 25 °C

3. TÉRMINOS Y DEFINICIONES

3.1cajas de contactocajas plásticas servidas con un volumen de agar controlado especialmente elaborados paramuestras de superficies, las cajas varían en diámetro acorde al producto.

3.2láminas de inmersiónláminas sintéticas, uno o ambos lados (7 cm2 x 10 cm2 ) cubiertas con una capa de un medio decrecimiento sólido. Varios medios de crecimiento están disponibles acorde al microorganismobuscado.

3.3escobillónbarra delgada (estéril) con algodón o material sintético (alginato), escobillón contenido en untubo o envuelto.

3.4tela o pañohúmedo, es de material estéril entretejido, libre se sustancias antimicrobianas, empacadoindividualmente en bolsas plásticas estériles, usado para toma de muestras de superficieslargas (> 100 cm2).

3.5esponjahúmeda, cuadro estéril de esponja plana, libre de sustancias antimicrobianas, también

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empacado individualmente en bolsa plástica estéril, usado para toma de muestras desuperficies largas (> 100 cm2).

4. PRINCIPIO

4.1 Para obtener un estimativo de contaminación microbiana de una superficie usandocajas de contacto o método de escobillón se requiere seguir los siguientes pasos:

4.2 Una caja de contacto (o lámina de inmersión) con el medio agar apropiado, espresionado contra la superficie a analizar. Después de la incubación una estimación decontaminación de la superficie puede ser obtenida por el conteo del número de coloniasdesarrolladas. Debido a que estos métodos no son cuantitativamente dignos de confianza o deresultados reproducibles, podrían solo ser usados en un análisis de tendencia.

4.3 Usando el método del escobillón para examinar un área específica marcada desuperficie (por ejemplo usando una plantilla) y después de frotar para tomar la muestra. Las

barras de los escobillones se rompen dentro de un tubo o botella que contiene un fluido endilución estéril o líquido neutralizante y luego se mezcla manualmente.

Si la superficie es enjuagada con un paño o esponja estéril, el dispositivo de muestreo esalmacenado en un líquido de volumen de dilución conocida, (100 ml x 100 cm2).

En el laboratorio, se utiliza la suspensión inicial y si es necesario, diluciones decimales (1ml,5ml y 10 ml de diluyente), para determinar el número de microorganismos, usando losprocedimientos descritos en los métodos para la enumeración de (grupos) microorganismos aser investigados.

4.4 El tiempo y temperatura de incubación depende del tipo de microorganismo a ser detectado.

4.5 Para medios selectivos, se pueden realizar las pruebas de confirmación apropiadas. Elnúmero de Unidades Formadoras de Colonia (UFC) de un microorganismo específico por cm2 opor objeto, es calculado del número de colonias (confirmadas).

Nota : Estos métodos no son cuantitativamente confiables o reproducibles y sus resultados solo pueden ser usadosen n análisis de tendencias

4.6 Luego de tomar la muestra de la superficie, puede hacerse la limpieza y desinfecciónpara prevenir el aumento de la contaminación cómo resultado del procedimiento de muestreo.

5. MEDIOS DE CULTIVO Y LIQUIDOS DE DILUCIÓN

5.1 Agar Plate Count, ISO 4833 y si es requerido.

5.2 Agar Rojo Violeta Bilis Dextrosa, ISO 7402 y si es requerido.

5.3 Agar Rojo Bilis Violeta, ISO 4832 y si es requerido.

5.4 Agar Oxitetraciclina Huevo Glucosa (OGY), ISO 7954 y si es requerido.

5.5 Agar Baird Parker, ISO 6888-1 y 6888-2.

O cualquier otro medio de cultivo conocido para enumeración o enriquecimiento de (grupos) microorganismos.

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5.6 Líquidos de dilución, ISO 6887-1

5.7 Líquidos neutralizantes, véase punto 7.

6. APARATOS Y CRISTALERIA

6.1 Para los requerimientos generales. Véase ISO 7218

Aparatos disponibles son una alternativa aceptable a cristalería reutilizable si este tieneespecificaciones similares. Los aparatos usuales del laboratorio de microbiología y, enparticular, los siguientes:

6.2 Aparatos para esterilización en seco (horno) o esterilización húmeda (autoclave)

Véase ISO 7218.

6.3 Incubadoras, capaces de operar en la temperatura de incubación para los (grupos de)microorganismos a ser investigados (25 ° C ± 1 ° C, 30 ° C ± 1 ° C, 37 ° C ± 1° C).

6.4 Baños de agua, o aparatos similares, una capacidad de operar entre 44 ° C a 47 ° C yotro capaz de hervir agua.

6.5 Ph -metro, capaz de ser leído a la unidad cerca de 0,01 pH a 25 ° C ± 1 ° C,posibilitando la medición a ser hecha, la cual es precisa a ± 0,1 unidad pH.

6.6 Stomacher ® o Pulsifier ®, usando bolsas plásticas estériles para preparar las

suspensiones iniciales por movimiento peristáltico ( Stomacher ®) o vibración (Pulsifier ®).

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6.7 Mezclador vortex®, para mezclar líquidos en tubos de cultivo.

6.8 Pipetas graduadas, con amplia capacidad de abertura y una capacidad nominal de 1 ml,graduadas en divisiones de 0,1 ml, o pipetas automáticas de 100 µl o 1 000 µl.

6.9 Contenedores, como botellas, tubos, frascos, disponible para esterilización yalmacenamiento de medios de cultivo.

6.10 Cajas de petri, elaboradas en plástico de 90 mm a 100 mm.

6.11 Láminas de inmersión, cubiertas con medio ya descrito (numerales 5.1 a 5.5).

6.12 Cajas de contacto, de plástico y con medio ya descrito (numerales 5.1 a 5.5).

6.13 Escobillones, paños o esponjas, individualmente envueltas y estériles.

6.14 Plantilla, con material resistente a corrosión (por ejemplo un marco en aceroinoxidable de 20 cm2 a 100 cm2), las cuales son fáciles de limpiar y pueden esterilizarse.

6.15 Nevera o caja con aislamiento, capaz de mantener las muestras entre 1 ° C y 4 ° Cdurante el transporte al laboratorio.

7. MUESTREO

7.1 GENERAL

Es importante que le laboratorio reciba una muestra representativa de la superficie a analizar y

que esta muestra no haya sido cambiada por residuos de desinfectantes o durante eltransporte o almacenamiento.

Los desinfectantes son generalmente formulados para una desinfección en un tiempo decontacto de 5 min a 15 min, esperar 15 min antes de investigar la superficie con escobillón ocajas de contacto, para avaluar el desempeño del programa de limpieza y desinfección (o deotro modo, acorde a las especificaciones del desinfectante).

En todos los casos donde se esperan residuos de desinfectantes, pueden añadirseneutralizantes apropiados al líquido de dilución y al medio usado en las cajas de contacto, paraprevenir cualquier efecto inhibitorio del desinfectante en el crecimiento del microorganismo.

Un neutralizante apropiado para toda situación puede no ser descrito. Generalmente, el Tween 80(30 g/l) y la Lecitina (3g/l) son usados para neutralizar residuos de desinfectantes absorbidos(componentes de amonio cuaternario, anfotericidas).

El tiosulfato de sodio (5 g/l) es un buen neutralizante de productos con base halógena. En elcaso del peróxido usado en desinfectantes, la catalasa o peroxidasa pueden ser usados comoneutralizantes. Una unidad de estas enzimas cataliza la descomposición de 1 µmol de peróxidode hidrogeno por un minuto a 25 ° C y a un pH de 7.

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La fórmula para neutralizantes universal es:

Tween 80 (Polisorbato 80) 30 g/lLecitina 3 g/l

Tiosulfato de sodio 5 g/lL-histidina 1 g/l

Saponina 30 g/l

Preparar en líquido de dilución ( peptona 1g/l, NaCl 8,5 g/l), distribuir en tubos o botellas yesterilizar 15 minutos a 121 ° C.

7.2 MÉTODO DE CAJA DE CONTACTO

Después de remover de los contenedores de transporte, presionar la superficie del agar de la

caja de contacto o de la lámina firmemente y sin cualquier movimiento lateral contra lasuperficie analizada. La literatura dice que resultados óptimos de las cajas de contacto son

obtenidos con un tiempo de contacto de 10 s y una presión de 500 g. (para cajas RODAC® deun diámetro de 55 mm tienen un aplicador comercialmente disponible). Cerrar la caja decontacto o láminas inmediatamente después de la inoculación y poner en el contenedor detransporte.

7.3 MÉTODO DE ESCOBILLÓN

Remover un escobillón de la envoltura y humedecer la punta por inmersión en el tubo quecontiene el líquido de dilución. Presionar la punta del escobillón contra la pared del tubo pararemover el exceso de agua. Ubicar la punta del escobillón en la superficie para ser investigada

y una línea del área estimada de 20 cm2 a 100 cm2, mientras que se rota el escobillón entre elpulgar y el dedo índice en dos direcciones en sentido derecho uno al otro.

Poner el escobillón en el tubo con el líquido de dilución y romper o cortar el límite indicado delpalo de madera asépticamente. En caso de paños o esponjas, abrir el paquete plástico quecontiene la esponja o paño.

Remover el paño o esponja con pinzas estériles o guantes estériles y enjuagar como sedescribió antes. Devolver al paquete plástico y cerrar de manera que quede sin agujeros.

Otra alternativa es abrir el paquete que contiene la esponja o paño; apretar la esponja o paño através de la bolsa sobre la mano. Use la esponja para recoger la muestra y transferir al paño oesponja en una bolsa plástica estéril, cerrar la bolsa de manera que no queden agujeros.

Frotis con siembra direct a

Utilizar aplicadores o hisopos de algodón estériles para realizar el frotis o toma de muestra enla superficie. [2]

Una vez tomada la muestra, sembrar con el hisopo o aplicador en la superficie del agar, segúnel tipo de microorganismo o analito objetivo de la búsqueda.

Para el transporte de los aplicadores es importante tener en cuenta el numeral 8.

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8. TRANSPORTE

La siembra El transporte de las muestras obtenidas por el método de escobillón debe realizarsepreferiblemente dentro de las con

4 h siguientes a la toma de muestra.

Se debe igualmente transportar en una caja o nevera de icopor a una temperatura entre de 1 °C a 4 ° C. Examinar en el laboratorio tan pronto como sea posible y no después de 24 h.

El transporte de cajas de contacto y/o láminas preferiblemente con 4 h en una vía donde noocurra contaminación.

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9. PROCEDIMIENTO


Incubar las placas o láminas de acuerdo al tipo de microorganismo a ser detectado.

9.2 MÉTODO DE ESCOBILLÓN (INCLUYENDO ESPONJA O PAÑO)

Mezclar el contenido del tubo que tiene los escobillones en el mezclador vortex® por 30 s,ajustando la velocidad para que la pared del tubo quede humedecida arriba a una altura de 2cm a 3 cm debajo de la tapa.

Esto representa la suspensión inicial.

Añadir a la bolsa plástica que contienen los paños o esponjas, una cantidad de líquido dedilución o líquido neutralizante, dependiendo del tamaño del área a investigar (100 ml x 100 cm2).Después de esto, tratar al contenido de la bolsa en un stomacher por 1 min o pulsifier por 30 s,esto representa la suspensión inicial.

Si se presume de números altos elevados de microorganismos son esperados, ppreparar otrasdiluciones decimales en diluyente agua peptonada para obtener un número de coloniascontables.

De acuerdo a la enumeración de métodos utilizados (ver normas ISO apropiadas), inocular por duplicado en las cajas con medio la dilución inicial, usando un 1 ml de inoculo para servir lascajas y 0,1 ml de inoculo para técnicas de difusión. Tratar cualquiera de las otras diluciones dela misma manera; Invertir las cajas e incubarlas a una temperatura y tiempo adecuado paracada medio.

Otro método utilizado puede ser el método de Goteo (DIN 10113-2). Comenzando con ladilución más alta, usar pipetas estériles para transferir alicuotas de 0,05 ml de la suspensióninicial (escobillones, esponjas o paños) y de las otras diluciones a sectores apropiados delmedio de cultivo marcado en el centro de la placa de agar ( por duplicado, usando las mismasdiluciones pero en diferente placa de agar) cada pre-secado de la placa de agar puede ser usado por goteo de no más de 6 diluciones diferentes. Cuando el goteo es aplicado, esconveniente tocar la punta de la pipeta en la superficie del agar en orden de transferencia deuna cantidad completa de la dilución al medio de cultivo. Guardar las placas de agar horizontalmente (tapa arriba) bajo una superficie húmeda.

Si el método de escobillón es usado para demostrar la presencia de microorganismosespecíficos (Lysteria monocytogenes o Salmonella spp), el área investigada podría ser preferiblemente de no menos de 1 000 cm2. Transferir el escobillón, paño o esponja a un mediode enriquecimiento y mezclar bien.

9.3 SELECCIÓN Y CONTEO DE COLONIAS

9.3.1 Método de placa de contacto

Contar el número de (específico) colonias en las placas de contacto o láminas directamentedespués del periodo de incubación especificado y confirmar este, si es necesario, acorde a elmicroorganismo(s).

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9.3.2 Método de escobillón (esponja o paño)

Contar las colonias de cada caja y confirmar si es necesario, acorde al microorganismo(s).

9.3.3 Método de goteo en placa

Contar el número de colonias (blanco) a las diluciones producidas de 5 colonias a 50 colonias.

9.3.4 En el caso de procedimientos de enriquecimiento, seguir las instrucciones después depre- enriquecimiento acorde al microorganismo(s).

10. CÁLCULO Y EXPRESIÓN DE RESULTADOS


Dividir el número de (blanco) colonias por el área de la superficie de la placa, Reportar el

recuento como UFC x cm2 de superficie.

10.2 MÉTODO DE ESCOBILLÓN (ESPONJA O PAÑO)

10.2.1 Calcular el número de UFC x ml de suspensión inicial, como se describe en ISOestándar. (Véase punto 5).

10.2.2 Calcular el número de UFC por cm2 de superficie investigada con la fórmula:

D

A

F Nx

x

en donde

N es el número de UFC en 1 ml de líquido de dilución (líquido de inactivación)

F es la suma (ml) de líquido de dilución (liquido de inactivación) en el tubo o bolsa.

A es la superficie investigada (cm2)

D es el reciproco de la dilución usada.

10.2.3 Para el método de goteo, calcular el número de N de UFC/ml del líquido de suspensiónusando la fórmula.

( )d nnV

CN

21 1,0 x+=

∑

en donde

∑C

es la suma de colonias contadas en todas las gotas retenidas de dos dilucionessucesivas de 1 de la menor que contenga cinco colonias.

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V volumen de inoculo aplicado en cada gota ( en este caso 50 µl).

1n número de gotas retenidas en la primera dilución.

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2n número de gotas retenidas en la segunda dilución.

d factor de dilución correspondiente a la primera dilución.

Para obtener el conteo/cm2 de superficie, usar la fórmula:

A

F N x

en donde

F es el volumen del líquido de dilución ( o líquido neutralizante) en el tubo o bolsa.

A es el área de muestreo / cm2

10.2.4 Si el área analizada no es definida, usar la fórmula N x F x D para calcular el número deUFC / escobillón.

Cuando los métodos semicuantitativos son usados, el resultado obtenido en UFC/cm2 desuperficie puede ser llamado también número higiénico. Estos pueden variar dependiendo delas superficies examinadas es recomendable que estos sean designados y agregados entre laspartes interesadas.

10.2.5 En el caso de procedimientos de enriquecimiento, reportar el organismo blanco tanto

detectado como no detectado en el área muestreada.

Expresión de resultados para el método de Frotis con siembra directa

Se reporta como ausencia / presencia del microorganismo patógeno objeto de la búsqueda por elemento evaluado (ejemplo cuchara, cuchillo, etc) o área de la superficie evaluada.

Cuando se presume de recuentos inferiores a 10 UFC para los casos de aislamiento demicroorganismos mesófilos ,coliformes totales , mohos y levaduras, se debe reportar lasunidades encontradas por elemento o área de la superficie evaluada.

Si el objeto de la búsqueda lo requiere posteriormente realizar la identificación correspondiente.

BIBLIOGRAFÍA

[1] EN 1276, Chemical desinfectans and antiseptics- Quantitatice suspensión tests for rheevaluation of bactericidal activity of chemical desinfectants and antiseptics used in the food,industrial, domestic and institutional areas- test methods and requirements phase 2, step 1.

[2] Manual operativo de análisis microbiológicos para limentos , Cortes Luna Gilma Janeth

M.Sc. Laboratorio de Control de Calidad de Alimentos, edición 91 pag 124 y 125.

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DOCUMENTO DE REFERENCIA

INTERNATIONA ORGANIZATION FOR STANDARIZATION. Microbiology of food and Animalfeeding stuffs- horizontal method for sampling techniques from surfaces using contact plates

and swab methods. Geneve: ISO, 2002 8 p, (ISO/DIS 18593).

Preparado por:________________________________ GLORIA ISABEL OSPINA C.

Revisado por: _________________________________

grr.

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