Desarrollo de un procedimiento analítico para...

PROGRAMA DE BECAS “CONVOCATORIA ABIERTA

2011

VICENTE APOLONIO DELGADO RODRIGUEZ

UNIVERSIDAD DE LA HABANA

FACULTAD DE QUÍMICA

Máster en Química

Desarrollo de un procedimiento analítico para cuantificar trazas de plaguicidas

órganoclorados en muestras de hortalizas en Ecuador.

La Habana 2014

DEDICATORIA

A mi Esposa Margoth y a mi hija Lucia Micaela por apoyarme, por estar en mí ser cada día,

compartiendo desde el primer minuto de este proceso todas las experiencias.

Agradecimiento

Agradezco al Presidente Constitucional de la República del Ecuador, Rafael Correa Delgado y a la

SENESCYT por otorgar por concurso becas de postgrado a los profesionales y docentes para

mejorar el nivel Académico de la educación superior.

Dejo constancia de mi gratitud a la Universidad de la Habana, Alma Mater de la educación cubana,

Al Sr. Decano y profesores de la Facultad de Química, también a los compañeros de la Maestría V

Edición.

Agradezco a mis tutores Dra. Yoanna María Álvarez Ginarte, Dr. Mario Basterrechea Rey ,

MSc. Paulina Valeria Guevara García por confiar en mi persona, por la paciencia en la dirección de

la Tesis y por sus acertadas correcciones en todo el proceso de elaboración, quienes durante este

arduo trabajo teórico practico estuvieron orientándome, gracias por su tiempo invertido, por su

cordialidad y su apoyo.

Gracias al Dr. Gonzalo Dierksmeier Corcuera, Director del Instituto de Investigaciónes de Sanidad Vegetal de Cuba, a la Lic. Lissette Orta Arrazcaeta, Jefe del Laboratorio de esta Institución.

Mi agradecimiento al Sr. General Carlos Rodríguez Arrieta, Rector de la Universidad de las

Fuerzas Armadas ESPE.

Al Sr. Director del Departamento de Ciencias de la Tierra y La Construcción, Coronel Rodolfo

Salazar.

A los compañeros docentes por el apoyo.

A mis hermanos y amigos que me acompañaron en esta jornada científica que significó la maestría

y que de forma incondicional, entendieron mi ausencia. A mis padres, que están en el cielo.

A pesar del Espacio-Tiempo, siempre estuvieron en mi corazón y atentos para saber cómo se

desarrolla el proceso desde un principio hasta el día de hoy que siguen dándome ánimo para

concluir los estudios.

No eres el Último, más bien eres el Primero A ti DIOS… manifestación Universal.

Gracias.

GLOSARIO DE ACRONIMOS ABREVIATURAS

ASTM: Sociedad Americana para Ensayos de Materiales µg: micro gramo µL: micro litro Ataxia: Signo clínico que se caracteriza por provocar la descoordinación Avicida: plaguicida utilizada para eliminar pájaros BAF: Factor de Bio Acumulación BHC: Hexacloruro de benceno °C: Grados Celsius CAE: Corporación Aduanera Ecuatoriana CAS: Servicio de resúmenes de química (Chemestry Abstracts Service) CFP: Consentimiento Fundamentado Previo (Convenio de Rotterdam) CGP: Cromatografía de permeación sobre gel CIPAC: Colaboración Analítica Internacional del consejo de plaguicidas Clúster: conjunto , "grupo" COP: Compuestos Orgánicos Persistentes CV: Coeficiente De Variación DMFS: Dispersión de Matriz en Fase Sólida ECD: Detector de Captura de Electrones EEG: Electroencefalograma EFS: Extracción en Fase Sólida EPA: Environmental Protection Agency, Agencia de Protección Ambiental ESBM: Extracción en fase sólida sobre barras magnéticas ESPE: Escuela Superior Politécnica del Ejercito FAO: Organización de Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación FBA: Agencia Internacional de Investigación sobre el Cáncer g : Gramos GC: Cromatografía de gases h : horas ha : Hectáreas HCH: hexaclorociclohexano IARC: Agencia Internacional de Investigación sobre el Cáncer IASA Instituto Agropecuario Superior Andino ICH : Conferencia Internacional de Armonización INIAP: Instituto Nacional de Investigaciones Agropecuarias Kg: Kilogramo LMA: Laboratorio de Medio Ambiente LMR: Límite Máximo de Residuo LMRP: Límites Máximos de Residuos de Plaguicidas LOC: Límite de Cuantificación LOD: Límite de Detección MEFS: Micro Extracción en Fase Sólida min: minuto mL: mililitro

ng: nano gramo NOEL : Level without observed effect, Nivel sin efecto observable OAE: Organismo de Acreditación Ecuatoriano OMS: Organización Mundial de la Salud POCL: Plaguicidas órganoclorados ppm: Partes por millón RD: Real Decreto RSD: Desviación estándar relativa SNEM: Servicio Nacional de Erradicación de la Malaria T.C.A. : Tasa de Crecimiento promedio Anual TCNAV: Total Chrom Navigator t: Tonelada métrica UFAE ESPE Universidad de las Fuerzas Armadas de Ecuador ESPE USP : Farmacopea Americana

SÍNTESIS

El uso intensivo de plaguicidas órganoclorados ha generado un gran impacto medioambiental en la

producción agrícola. La Universidad de las Fuerzas Armadas de Ecuador y sus huertos aledaños

disponen de extensas áreas de cultivos de hortalizas y no están exentos a estos problemas

medioambientales. En este trabajo se aplicaron métodos de extracción líquido-líquido y de

purificación con fase sólida utilizando una columna pre empacada con florisil que permitió separar

concentrar y recuperar los plaguicidas órganoclorados (Lindano, Aldrín, Dieldrín, Endrin, Isodrín y

pp’DDT) de las muestras de hortalizas (tomate, col, brócoli, zanahoria y espinaca). Se desarrolló

además, un procedimiento por cromatografía de gases capaz de separar, identificar y cuantificar

estos plaguicidas empleando para ello una columna Elite de última generación con un mayor

contenido de metil-fenil polisiloxano con la que se obtiene una buena resolución en las señales

cromatográficas. El procedimiento de análisis fue validado y adecuado a las condiciones del

Laboratorio de Medio Ambiente de la Universidad. La innovación y aplicación de este

procedimiento permitirá auto gestionar recursos económicos a través de la prestación de servicios

a la comunidad y a las asociaciones de productores de hortalizas, contribuyendo a la seguridad y a

la calidad alimentaria en Ecuador.

Palabras claves: plaguicidas órganoclorados, extracción líquido-líquido, extracción en fase sólida,

cromatografía de gases, validación

ÍNDICE

CAPÍTULO 1. INTRODUCCIÓN 1

CAPÍTULO 2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 5

2.1. Generalidades de plaguicidas 5

2.1.2 Propiedades y aspectos toxicológicos de los plaguicidas órganoclorados 7

Lindano (CAS: 58-89-9) 7

Aldrín (CAS: 309-00-2) 8

Dieldrín (CAS: 60-57-1) 9

Isodrín (CAS: 465-73-6) 10

Endrin (CAS: 72-20-8) 11

Dicloro Difenil Tricloroetano, DDT (CAS: 50-29-3) 12

2.2 Métodos de extracción para plaguicidas 13

2.3 Cromatografía de gases 16

2.4 Validación de la metodología de determinación analítica 18

CAPÍTULO 3. MATERIALES Y MÉTODOS 25

3.1. Reactivos, materiales y equipos de laboratorio 25

3.2. Métodos 27

3.2.1. Muestreo de las hortalizas 27

3.2.2. Técnica de extracción de los residuos de plaguicidas órganoclorados 27

3.2.3. Optimización de los parámetros cromatográficos 28

3.2.4. Procedimiento de dopaje a las muestras de hortalizas certificadas 30

3.2.5. Estimación de los parámetros de desempeño del procedimiento analítico 31

CAPÍTULO 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 35

4.1. Optimización de las condiciones cromatográficas 36

4.2. Estudio de los parámetros de desempeño del procedimiento analítico 40

Linealidad 40

Precisión 45

Exactitud 48

Especificidad 50

Límite de detección y cuantificación 52

4.3. Aplicación del procedimiento propuesto en muestras de hortalizas en Ecuador 54

CAPÍTULO 5. CONCLUSIONES 59

CAPÍTULO 6. RECOMENDACIONES 60

CAPÍTULO 7. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 61

CAPÍTULO 1

INTRODUCCIÓN

Introducción

_____________________________________________________________________________________

1

CAPÍTULO 1. INTRODUCCIÓN

En los últimos 20 años, el uso intensivo de agroquímicos ha generado un gran impacto ambiental en

las producciones agrícolas de Ecuador1. Desde su aparición en los años 40, los plaguicidas han

sido ampliamente usados en la agricultura, la veterinaria y la salud pública en muchos países.

Además son resultado del antiguo anhelo del ser humano por librarse de plagas que invaden su

modo de vida. En la actualidad es conocido que estos compuestos son venenos peligrosos para la

salud y para el medio ambiente.

Siendo conscientes del perjuicio que causan los agroquímicos en los sistemas bióticos es apropiado

proponer soluciones a este problema, con la finalidad de tomar conciencia para sustituir, disminuir y

controlar el consumo de productos químicos sin reducir la productividad y la calidad de los productos

agropecuarios. La agricultura orgánica propone reducir la incidencia de agroquímicos, que actúan

inhibiendo, repeliendo, disuadiendo o eliminando plagas y enfermedades de distintos tipos2, sin

embargo, sigue siendo un grave problema los residuos que aún quedan en la tierra o el agua

después de su aplicación.

El uso de los agroquímicos en los cultivos se inicia desde el tratamiento del suelo hasta el empacado

para su libre comercialización. Para prevenir y controlar la propagación de enfermedades y plagas

que amenazan la productividad agrícola, se requiere utilizar un promedio de 80 clases de

compuestos químicos, entre fungicidas, insecticidas, herbicidas, fertilizantes, etc. El uso repetido de

estos productos origina formas de dependencia y alteración en el equilibrio biológico3.

El empleo de los plaguicidas órganoclorados ha despertado una gran preocupación ya que estas

sustancias poseen las características de ser muy resistentes al agua, a las altas temperaturas y al

tiempo, además su proceso de degradación en muchas ocasiones desencadena otros metabolitos

que también resultan perjudiciales, por lo que es de vital importancia la cuantificación de los residuos

peligrosos en los productos agrícolas para el consumo humano. Es por esto que se ha establecido la

estricta observación en el cumplimiento de los Límites Máximos de Residuos de Plaguicidas

(LMRP), parámetro que es exigido internacionalmente por la comisión del Codex Alimentarius 4 del

Introducción

_____________________________________________________________________________________

2

programa conjunto de la Organización de Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación y la

Organización Mundial de la Salud (FAO/OMS) y establece las normas que los regulan 5.

La Universidad de las Fuerzas Armadas de Ecuador (UFA ESPE) y sus huertos aledaños disponen

de extensas áreas de cultivos tanto de hortalizas como de frutales y no están exentos a estos

problemas medioambientales, ocasionados por el uso indiscriminado de plaguicidas órganoclorados.

Por todo lo anterior, se plantea el siguiente problema científico:

La Universidad de las Fuerzas Armadas de Ecuador (UFA ESPE) y los huertos aledaños, disponen

de extensas áreas de cultivos de hortalizas para el consumo local y la exportación. Por lo que es

necesario disponer de un procedimiento analítico que en las condiciones de trabajo del Laboratorio

de Medio Ambiente (LME) de la UFA ESPE, permita cuantificar en las muestras de hortalizas, el

contenido de residuos de los siguientes plaguicidas órganoclorados: Lindano (CAS, Chemestry

Abstracts Service: 58-89-9), Aldrin (CAS: 309-00-2), Isodrin (CAS: 465-73-6), Endrin (CAS: 72-20-8),

pp'DDT (CAS: 50-29-3), Dieldrin (CAS: 60-57-1) para que los productores puedan vender y exportar

productos seguros para el consumo humano y garantizar la calidad alimentaria en sus

consumidores.

Como método o procedimiento para solucionar el anterior problema científico se formula la siguiente

hipótesis:

Es posible identificar y cuantificar la concentración de plaguicidas órganoclorados en las hortalizas

cosechadas en la UFA de Ecuador y sus huertos aledaños, aplicando un procedimiento interno de

validación por cromatografía de gases con detector de captura de electrones (ECD).

Para demostrar la anterior hipótesis y dar respuesta al problema científico planteado, se propone el

siguiente objetivo general:

Desarrollar y validar un procedimiento de análisis para cuantificar residuos de plaguicidas

órganoclorados (Lindano, Aldrín, Dieldrín, Endrin, Isodrín y pp’ DDT) en hortalizas ecuatorianas

empleando cromatografía de gases.

Introducción

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3

Objetivos específicos:

1. Separar y concentrar analitos órganoclorados de una matriz de hortalizas utilizando el método de

extracción líquido –líquido y la purificación con fase sólida.

2. Desarrollar un procedimiento cromatográfico capaz de separar, identificar y cuantificar el analito

aplicando la cromatografía de gases.

3. Validar el procedimiento de cromatografía de gases para la cuantificación de plaguicidas

órganoclorados en hortalizas, adecuándolo a las condiciones específicas del Laboratorio de Medio

Ambiente (LMA) de la Universidad de las Fuerzas Armadas de Ecuador (UFA ESPE).

La novedad científica de esta investigación es la implementación, adecuado a las condiciones del

laboratorio de medio ambiente de la Universidad de las Fuerzas Armadas de Ecuador, de un

procedimiento analítico interno que permitió cuantificar residuos de plaguicidas órganoclorados en

hortalizas ecuatorianas. Durante la etapa de purificación de los analitos se utilizaron cartuchos de

florisil para realizar el tratamiento simultáneo de varias muestras. Además durante la separación por

cromatografía de gases con detector de captura de electrones (ECD), se empleó por vez primera

una columna capilar (Elite) de última generación con un mayor contenido de metil-fenil polisiloxano

que permitió una mejor resolución en las señales cromatográficas. Ambos resultados permitieron

disminuir el tiempo de análisis para los plaguicidas objetos de estudio, comparando el procedimiento

descrito con el método 1 de referencia implementado por el Instituto de Investigaciones de Sanidad

Vegetal, La Habana, Cuba. El procedimiento analítico propuesto además fue validado según los

requerimientos de la norma ISO/IEC 17025:2005 6.

Impacto económico y medio ambiental

Con esta investigación la Universidad de las Fuerzas Armadas ESPE a través del Laboratorio de

Medio Ambiente podrá disponer de un procedimiento analítico para cuantificar el contenido de trazas

de plaguicidas órganoclorados en muestras de hortalizas. La innovación y aplicación de este

procedimiento contribuirá a la seguridad y a la calidad alimentaria en Ecuador. Además se dispondrá

de información confiable sobre los niveles de residuos de plaguicidas en productos agrícolas y los

impactos que pueden tener en la salud humana. Esta metodología analítica permitirá a la

Universidad auto gestionar recursos económicos a través de la prestación de servicios a la

Introducción

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4

comunidad y a las asociaciones de productores de hortalizas, lo cual contribuirá a comercializar los

productos agrícolas, según lo establecido en las regulaciones sanitarias y que la producción sea

segura para el consumo de la población. En caso contrario originaría pérdidas económicas

considerables, así como daños a la salud y al medio ambiente en Ecuador.

CAPÍTULO 2

REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA

Revisión Bibliográfica

_____________________________________________________________________________________

5

CAPÍTULO 2. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA

2.1. Generalidades de plaguicidas

Los plaguicidas o agroquímicos son sustancias químicas o mezclas de sustancias, destinadas a matar,

repeler, atraer, regular o interrumpir el crecimiento de seres vivos considerados plagas (Cualquier

especie, raza o biotipo vegetal o animal o agente patógeno dañino para las plantas o productos

vegetales)7.

Según el diccionario de la Real Academia de la Lengua Española, el término pesticida es un adjetivo

(usado también como sustantivo) cuyo significado es "que se destina a combatir plagas". Por tanto, en

español, el término "pesticida" se refiere a una modalidad de "plaguicida". El término plaguicida está

más ampliamente difundido que el nombre genérico exacto: biocida (literalmente: matador de la vida).

Los plaguicidas pueden ahorrar dinero a los agricultores al prevenir las pérdidas de cosechas por

insectos y otras plagas. En un estudio se calculó que los agricultores en los Estados Unidos ahorraron

el equivalente de cuatro veces el costo de los plaguicidas. Otro estudio demostró que el no usar

plaguicidas resultaba en una pérdida del 10% del valor de las cosechas. Estudio realizado en 1999

encontró que una prohibición de plaguicidas en los Estados Unidos puede resultar en un aumento del

coste de los alimentos, pérdidas de empleos y aumento del hambre mundial.

El uso de plaguicidas crea una serie de problemas para el medio ambiente. Más del 98% de los

insecticidas fumigados y del 95% de los herbicidas llegan a un destino diferente del buscado,

incluyendo especies vegetales y animales, aire, agua, sedimentos de ríos, mares y alimentos. La deriva

de plaguicidas ocurre cuando las partículas de plaguicidas suspendidas en el aire son llevadas por el

viento a otras áreas, pudiendo llegar a contaminarlas. Los plaguicidas son una de las causas principales

de la contaminación del agua y ciertos plaguicidas son contaminantes orgánicos persistentes que

contribuyen a la contaminación atmosférica.


_____________________________________________________________________________________

6

En adición, el uso de plaguicida reduce la biodiversidad, reduce la fijación de nitrógeno, contribuye al

declive de polinizadores (reducción de los polinizadores en muchos ecosistemas, desde finales del siglo

20), destruye hábitats (especialmente para aves), y amenaza a especies en peligro de extinción.

Los plaguicidas representan un gran riesgo para los obreros que manufacturan las sustancias, para el

personal que transporta, para los consumidores que aplican el producto como para el público en

general. Por estas razones la Asociación Médica de Estados Unidos recomienda limitar la exposición a

los seres humanos a los plaguicidas y el uso de alternativas menos peligrosas.

Existe incertidumbre acerca de los efectos de la exposición prolongada de dosis bajas de plaguicidas.

Los sistemas de supervisión actuales son inadecuados para definir los riesgos potenciales relacionados

con el uso de plaguicidas y con enfermedades relacionadas. Teniendo en cuenta esta falta de datos, es

prudente limitar la exposición a plaguicidas y usar los menos tóxicos o recurrir a alternativas no

químicas.

Hay alternativas al uso de plaguicidas que incluyen métodos de cultivo usando controles biológicos,

tales como feromonas y plaguicidas microbianos, ingeniería genética, métodos de disrupción de la

reproducción de insectos. Estos métodos están ganando popularidad por ser más saludables y a veces

también más efectivos.

Según su acción específica los plaguicidas pueden clasificarse como: insecticida, acaricida fungicidas,

desinfectante, bactericida, herbicida, fitorregulador y productos afines, entre otros.

Según su grado de peligrosidad para las personas, los plaguicidas se clasifican:

De baja peligrosidad: los que por inhalación, ingestión o penetración cutánea no entrañan

riesgos apreciables.

Tóxicos: los que por inhalación, ingestión o penetración cutánea puedan entrañar riesgos de

gravedad limitada.

Nocivos: los que por inhalación, ingestión o penetración cutánea puedan entrañar riesgos

graves, agudos o crónicos, e incluso la muerte.


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7

Cl

Cl

Cl

Cl

Cl

Cl

Muy tóxicos: los que por inhalación, ingestión o penetración cutánea puedan entrañar riesgos

extremadamente graves, agudos o crónicos y la muerte.

La clasificación toxicológica8 de los plaguicidas en las categorías de baja peligrosidad, nocivos, tóxicos

o muy tóxicos se realiza atendiendo básicamente a su toxicidad aguda, expresada en DL50 (dosis letal al

50 %) por vía oral o dérmica para la rata, o en CL50 (concentración letal al 50 %) por vía respiratoria

para la rata, de acuerdo con una serie de criterios que se especifican en las normas y leyes

competentes, atendiendo principalmente a las vías de acción más importantes de cada compuesto.

Atendiendo a su naturaleza química se clasifican como9: órganoclorados, órganofosforados,

carbamatos, piretroides, órganomercuriales, quinonas, anilinas, bencimidazoles, triazinas, entre otros.

En el presente trabajo de tesis se estudiaran específicamente seis plaguicidas órganoclorados: Lindano

(CAS, Chemestry Abstracts Service: 58-89-9), Aldrin (CAS: 309-00-2), Isodrin (CAS: 465-73-6), Endrin

(CAS: 72-20-8), pp'DDT (CAS: 50-29-3), Dieldrin (CAS: 60-57-1).

2.1.2 Propiedades y aspectos toxicológicos de los plaguicidas órganoclorados

Lindano (CAS: 58-89-9)

Fue excluido de la lista de sustancias activas autorizadas para el uso en

productos de protección de plantas en 1991 bajo la Ley para protección de

plantas contra plagas y pestes en muchos países10.

Este plaguicida está designado como un producto químico CFP (Consentimiento Fundamentado Previo

del Convenio de Rotterdam) y está permitida su importación y uso como producto químico para la

investigación o propósitos de laboratorio en cantidades menores de 10 kg.11.

Por sus características, una vez liberado, persiste por muchos años en el ambiente, se transporta a

largas distancias y se bioacumula fácilmente en la cadena de la alimentación por su elevada

liposolubilidad o capacidad de disolverse en grasas. Se bioconcentra en forma muy rápida en

microorganismos, invertebrados, peces, aves y mamíferos, contaminando los alimentos y la leche

materna. De esta manera los seres humanos y los animales se ven expuestos al lindano tal como lo

demuestran los niveles detectables en sangre, tejido adiposo y leche materna humanos. En particular

http://es.wikipedia.org/wiki/Laboratorio


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8

es preocupante la exposición en niños y mujeres embarazadas. Por lo que es un plaguicida prohibido

en todas sus formulaciones en el medio ambiente12. La siguiente tabla muestra las propiedades

químicas y físicas del Lindano.

Tabla 1. Propiedades físicas y químicas del Lindano11, 13.

Nombre químico: 1α,2α,3β,4α,5α,6β-hexaclorociclohexano

Sinónimos y nombres comerciales: Gamma Hexacloruro de benceno; Isómero Gamma del hexacloruro de benceno; BHC; Gamma-BHC; Ciclohexano, entre otros.

Fórmula y Peso molecular (PM): C 6H 6Cl6; PM = 290, 83 g/mol

Presión de vapor: 4,4 mPA (24°C)

Densidad g/mL 20°C: 1,88

Solubilidad g/L: 8,52 (25°C) en agua, mayor que 200 (25°C) en acetona, (10-14) (25°C) en n-heptano.

Estabilidad: Estable a la luz, al aire, a temperaturas superiores a 180°C y a los ácidos, en álcalis sufre deshidroclorinación.

Aldrín (CAS: 309-00-2)

Es un producto químico de síntesis14 utilizado como insecticida. Se

relaciona con otros compuestos similares químicamente como el

Endrin, Dieldrin e Isodrin, que se encuentran prohibidos en la Unión

Europea. Es un compuesto orgánico persistente (COP) en el medio

ambiente y puede acumularse en los organismos vivos.

Es también altamente tóxico para la mayoría de formas de vida existentes. Esta sustancia se incorpora

al medio ambiente como resultado de su uso como plaguicida en las cosechas y en el suelo. A nivel

global, se pueden encontrar concentraciones significativas de Aldrín a grandes distancias respecto al

punto donde se aplicó, debido a que este compuesto es extremadamente volátil, por lo que se evapora

y se incorpora rápidamente a la atmósfera. El Aldrín se encuentra principalmente adherido a

determinadas cosechas, lo que provoca el envenenamiento de las aves acuáticas, como consecuencia

de la ingesta de la flora autóctona o de animales de la cadena trófica que estén contaminados. Esta

sustancia puede absorberse a través de la piel y por ingestión, provocando alteraciones del sistema

nervioso central si la exposición es de corta duración. Si el intervalo de exposición es prolongado puede


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provocar daños sustanciales en el cerebro, el hígado y el plasma sanguíneo15. Los umbrales de emisión

establecidos por el Real Decreto (RD) 508/2012 (kg/año)16, son los siguientes: umbral de emisión a la

atmósfera: 1 kg/año, umbral de emisión al agua: 1 kg/año, umbral de emisión al suelo: 1 kg/año. La

siguiente tabla muestra las propiedades químicas y físicas del Aldrín.

Tabla 2. Propiedades físicas y químicas del Aldrín.

Nombre químico: 1,2,3,4,10,10-hexacloro-1,4,4a,5,8,8a-hexahidro-1,4:5,8-dimetanonaftaleno

Sinónimos y nombres comerciales:

Aldrine, Aldrec, Aldrex, Aldrex 30, Aldrite, Aldrosol, Altox, Bangald, Compuesto 118, Drinox, ENT 15949,HHDN, Octalene, Rasayaldrin, Seedrin, OMS 194.

Fórmula y Peso molecular (PM): C 12H 8Cl 6; PM = 364.92 g/mol

Presión de vapor: 8,6 mP (20°C)


Solubilidad g/L 27°C: 0,027mg/L en agua, mayor que 600 en Acetona, Benceno y Xileno.

Estabilidad: Estable hasta 200°C reacciona con ácidos concentrados y fenoles, en presencia de agentes oxidantes da dieldrin

Dieldrín (CAS: 60-57-1)

El Aldrín se transforma en Dieldrín cuando entra al ambiente.

Es un polvo blanco cuando está puro, mientras que en calidad

técnica es un polvo de color canela. En comparación con el

Aldrín, se evapora más lentamente al aire.

Se puede encontrar también, en el suelo, el agua o en viviendas donde se usaron estos compuestos

para matar termitas (insectos pequeños que se alimentan de la madera). La Agencia Internacional de

Investigación sobre el Cáncer (IARC) indica que sólo existe una evidencia muy limitada para la

carcinogenicidad del dieldrin en animales (IARC, 1987). En el ser humano produce hiperexcitabilidad,

hiperactividad y convulsiones, acompañados de náuseas, vómitos y dolor de cabeza17. La intoxicación

crónica puede causar desmayos, espasmos musculares, temblores y pérdidas de peso18.


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10

Tabla 3. Propiedades físicas y químicas del Dieldrín.

Nombre químico: (IR,4S,5S,8R)-1,2,3,4,10,10-hexacloro-6,7,-epoxi-1,4,4,5,6,7,8,8-

octahidro-endo-1,4-exo-5,8-dimetanonaftaleno

Sinónimos y nombres comerciales: Alvit, D-31, Dieldrite, Dieldrix, ENT 16,225, Heod, Octalox

Fórmula y Peso molecular (PM): C 12H 8 OCl 6; PM = 380,92 g/mol



Solubilidad g/L 20°C: 0,186mg/L en agua, soluble solventes orgánicos

Estabilidad: Estable en medio alcalino, moderadamente estable en medio ácido y a la luz.

Isodrín (CAS: 465-73-6)

Es un plaguicida órganoclorado prohibido y descontinuado,

estructuralmente, está estrechamente relacionado con el Aldrin.

En el pasado, fue utilizado como insecticida. Es inestable y

puede reaccionar con la luz o ácidos.19

El Isodrín puede sufrir una transformación microbiana muy lenta a Endrin, es persistente en el medio

ambiente y se adsorbe fuertemente a los sólidos en suspensión y en los sedimentos. Se acumula en el

tejido adiposo del cuerpo y biomagnifica particularmente en los organismos acuáticos. El Isodrín todavía

no ha sido clasificado de acuerdo a su capacidad cancerígena por la Agencia de Protección Ambiental

(EPA). Aunque otros plaguicidas órganoclorados si han sido identificados como disruptores endocrinos

y estudios recientes mostraron que los plaguicidas órganoclorados son factores importantes en la causa

de los cambios patológicos y fracasos reproductivos, así como la supresión de la inmunidad y los

cambios en la estabilidad del desarrollo en muchos mamíferos marinos. Este compuesto es también,

extremadamente sensible al estímulo, causa sensación de picadura al contacto con la piel, dolor de

cabeza, vértigo, náuseas, vómitos, incoordinación del movimiento, temblor, confusión mental y estado

híper excitabilidad20. En casos severos: produce convulsiones, estado de coma y depresión

respiratoria21. Los umbrales de emisión establecidos en kg/año son: umbral de emisión a la atmósfera 1

kg/año, umbral de emisión al agua 1 kg/año, umbral de emisión al suelo 1 kg/año. La siguiente tabla

muestra las propiedades químicas y físicas del Isodrín.


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11

Tabla 4. Propiedades físicas y químicas del Isodrín.

Nombre químico: (1R,4S,5R,8S)-1,2,3,4,10,10-hexachloro-1,4,4,5,8,8-hexahidro-

1,4:5,8-dimetanonaftaleno

Sinónimos y nombres comerciales:

ENT19,244, Experimental Insecticide 711, OMS 198, SD-3418.

Fórmula y Peso molecular (PM): C 12H 8Cl 6 ; PM=364.92 g/mol



Solubilidad g/L 20°C: Insoluble en agua, es muy liposoluble.

Estabilidad: Alta estabilidad química.

Endrin (CAS: 72-20-8)

Es un insecticida ciclodieno, proveniente del endrino,

actualmente su uso es prohibido por el Convenio de Rotterdam.

La mayor parte de su uso (80 %) era en aerosol para el control

de plagas de insectos en las producciones de algodón.

También se usó en el cultivo del arroz y la caña de azúcar, así como en granos y remolacha22. Este

plaguicida puede ser adsorbido por los sedimentos del agua y bioacumularse en los tejidos de los

organismos vivientes en este medio. Por lo tanto, es muy tóxico para los organismos acuáticos como:

peces, invertebrados y el fitoplancton. Los alimentos contaminados con Endrin causan severos daños

por envenenamiento en la vida silvestre. Este compuesto es rápidamente absorbido y tóxico por la

boca, por contacto con la piel y por inhalación. Actúa como un estimulante del sistema nervioso central.

Se ha reportado que una dosis oral de 0,25 mg/kg peso corpóreo, causa convulsiones en los seres

humanos. Los síntomas pueden aparecer entre 20 min. y 12 h sucesivamente a la ingestión accidental o

exagerada sobre exposición y pueden incluir dolor de cabeza, mareo, náusea, vómito, debilidad en las

piernas y convulsiones, conduciendo a veces a la muerte23. Algunas estimaciones indican que su vida

media en el suelo es de más de 10 años y puede haber lixiviación a las aguas subterráneas bajo ciertas

condiciones. Pueden volatilizarse pequeñas cantidades del suelo y/o terminar en el aire con partículas

de polvo. La siguiente tabla muestra las propiedades químicas y físicas del Endrin.


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12

Tabla 5. Propiedades físicas y químicas del Endrin.

Nombre químico: 1,2,3,4,10,10-Hexacloro-6,7-epoxy-1,4,4,5,6,7,8,8-octahidro- endo-5,8-dimetanonaftaleno

Sinónimos y nombres comerciales: Endrex, Endricol, Hexadrin, Mendrin, Isodrin Epoxide, Nendrin

Fórmula y Peso molecular (PM): C 12H 8Cl 6O; PM = 380.92 g/mol

Presión de vapor: 2x10 -5 mP (20°C)


Solubilidad g/L 27°C: Escasa solubilidad en agua,moderadamente soluble en acetona,benceno; poco soluble en alcoholes e hidrocarburos del petróleo.

Estabilidad: El producto técnico se descompone a temperaturas mayores de 200°C.

Dicloro Difenil Tricloroetano, DDT (CAS: 50-29-3)

Es un sólido blanco cristalino sin olor o sabor. Es un plaguicida

que ha sido usado extensamente en el pasado para controlar

insectos en la agricultura e insectos que transmiten

enfermedades como la malaria24.

Su usó en los EE.UU, se prohibió en 1972 por el daño causado a la vida silvestre. El 15 de septiembre

de 2006 la Organización Mundial de la Salud (OMS) anunció que el plaguicida vuelve a ser parte de su

programa para erradicar la malaria y se aplicará en la fumigación en el interior de las residencias para

matar a los mosquitos que transmiten esta enfermedad. Debido a que estudios científicos25 mostraron

que su utilización para este fin no representa peligro para la vida. El Gobierno realizó la última

importación de pp’ DDT en 1994. El Servicio Nacional de Erradicación de la Malaria (SNEM) fue el

responsable de su aplicación 2 veces por año, habiéndose utilizado en su totalidad hasta el año 1999.

Su aplicación programada fue de 534 g de DDT por casa en 150 000 casas26. Los efectos adversos

para la salud de los animales del DDT incluyen fallos en la reproducción y en el desarrollo, posibles

efectos en el sistema inmunitario y muertes difundidas de aves salvajes después de rociar el DDT. Los

peces marinos parecieron ser muy sensibles al DDT: su dosis letal (DL50, dosis que causa la muerte en

el 50 % de la población) a 96 horas varía de 0,4 a 0,89 microgramos/L para muchos teleósteos. Los

moluscos bivalvos, concentran plaguicidas órganoclorados, sin llegar a ser un peligro para ellos tienen

una DL50 a 96 horas mayor de 10 mg/L. Debido a su transporte atmosférico el DDT ha sido detectado


_____________________________________________________________________________________

13

en el aire, la tierra, el hielo, la nieve y virtualmente en todos los niveles de la cadena alimentaria del

Ártico.

Muchos estudios indican que los sedimentos del fondo en lagos y ríos actúan como reservas para el

DDT y sus metabolitos. Estudios en ratones mostraron que el Level without observed effect (NOEL,

Nivel sin efecto observable) es 0,25 mg/kg/día27. La siguiente tabla muestra las propiedades químicas y

físicas del DDT.

Tabla 6. Propiedades físicas y químicas del DDT.

Nombre químico: 1,1,1-tricloro-2,2-bis(4-clorofenil)-etano

Sinónimos y nombres comerciales: DDT, Agritan, Anofex, Arkotine, Azotox, Bosan Supra, Bovidermol,

entre otros.

Fórmula y Peso molecular (PM): C 14H 9Cl 5; PM = 354,49 g/mol

Presión de vapor: 0,025 mP (20°C;pp´DDT)


Solubilidad g/L 27°C: Soluble en la mayor parte de los disolventes orgánicos.

Estabilidad: Es altamente persistente en el suelo: 50% desaparece entre los 2 a 15 años. Es un contaminante de aguas superficiales.

2.2 Métodos de extracción para plaguicidas

Cuando se va a aplicar una técnica o procedimiento analítico, es imprescindible discernir claramente

cuál es la muestra, cuales son las características de su matriz y cuál es el analito. Usualmente, el

procedimiento de preparación de la muestra aparece descrito en normas que regulan e indican cómo

debe realizarse esta sub-etapa en función de las características de la matriz.

La extracción es la primera etapa de una técnica analítica. El objetivo es aislar el analito de la matriz de

la forma más completa posible evitando la presencia de interferencias. Por lo tanto, hay que evaluar la

naturaleza no sólo del analito sino también de la matriz, para que esta etapa sea lo más eficiente

posible.

Existen diferentes tipos de extracción atendiendo a las características de la muestra en estudio. En el

caso de muestras sólidas se lleva a cabo la extracción sólido-líquido en la que los analitos se

transfieren desde la matriz al solvente seleccionado. La eficiencia de la extracción depende de tres

factores relacionados entre sí como son la solubilidad, la transferencia de masa y el efecto de la matriz.

La solubilidad de un analito depende del tipo de solvente y está influenciada por la temperatura y la

presión. La transferencia de masa depende del tamaño de partícula de la matriz y se ve favorecida por

el uso de solventes de baja viscosidad, la agitación, temperatura, presión elevada y un tamaño de


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14

partícula pequeño, el efecto matriz se produce, por la influencia de todos los componentes de la

muestra distintos al analito28. En este trabajo se extraen de muestras solidas o semi sólidas y se utiliza

el acetonitrilo como solvente de extracción previa29.

La extracción líquido-líquido se basa en el reparto del analito entre dos líquidos inmiscibles. La

eficiencia del proceso depende de factores como la afinidad del analito por el disolvente y el número de

extracciones sucesivas que se lleven a cabo. Consiste en separar una o varias sustancias disueltas en

un solvente mediante su transferencia a otro solvente inmiscible, o parcialmente inmiscible en el

primero. La transferencia de materia se consigue mediante el contacto directo entre las dos fases

líquidas. Entre los solventes más usados tenemos por ejemplo el n-hexano.

La extracción con disolventes orgánicos y la purificación proporcionan excelentes resultados, aunque es

un proceso largo y tedioso que presenta inconvenientes como, la necesidad de emplear grandes

cantidades de disolventes cuyo costo es muy elevado30,31,31b. En la extracción de los plaguicidas

órganoclorados (POCL) en alimentos se ha empleado un amplio número de disolventes orgánicos.

Existen directrices generales con carácter internacional sobre las características que debe reunir un

método de extracción, permitiendo al analista combinar distintos solventes. Se basan en una primera

homogenización con disolventes miscibles con el agua32,33,34 o en la extracción directa con disolventes

inmiscibles35,36. En la siguiente tabla se muestran las técnicas de extracción que generalmente se

emplean para los plaguicidas.

Tabla 7. Técnicas de extracción de plaguicidas

Técnica de extracción

Disolvente Pasos de limpieza Plaguicidas identificados

QuEChERS Extracción dispersiva en fase sólida

Isocarbofos, Metil isofenfos

Acetonitrilo De 31 a 130 plaguicidas multiclase

Acetato de Etilo Extracción dispersiva en fase sólida

78 plaguicidas multiclase

Sólido - Líquido Extracción dispersiva en fase sólida


Acetonitrilo 72 plaguicidas multiclase

Endosulfán Metamidofos

Metalaxil


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Diclorometano Plaguicidas órganoclorados

Acetona Clorpirifos

Líquido - Líquido Acetona, éter y diclorometano

Extracción en fase solida


Fluidos supercríticos C02 Plaguicidas multiclase Asistida por microondas Micro extracción en

fase sólida Bifentrin, acrinatrin, deltametrin y ּג- cihalotrin

Específicamente, para la extracción de plaguicidas órganoclorados existen varios métodos

multirresiduales que se aplican en dependencia del sustrato que se va a analizar o de forma opcional.

El primer método37 es aplicable a la determinación de residuos de los plaguicidas: aldrín, beta-ciflutrina

y metabolitos, captan, clordano, ciflutrina, cipermetrina, pp’ DDT y metabolitos, deltametrina, dicofol,

dieldrín, endosulfán y metabolitos, fenvalerato, lambda-cialotrina, lindano, nitralín, oxadiazón,

permetrina y propanil en diferentes sustratos: muestras frescas (70 % de humedad y menos de 10 % de

grasas), muestras secas, muestras con alto contenido de grasas (más de 10 %), agua, suelo,

sedimento, aire y granos tratados en la etapa de almacenamiento37.

El segundo método es aplicable a la determinación de residuos de: bifenilos policlorados (PCB),

heptacloro, aldrín, DDT, y metabolitos HCB, HCH, lindano, entre otros en muestras de miel de abeja.38

El tercer método se adapta a la determinación de residuos de los plaguicidas Aldrín, Captafol, Captán,

Clordano, Clorotalonilo, DDT y sus metabolitos, Dicofol, Dieldrín, Endrín, Endosulfán, Folpet, entre otros

en materiales no grasos y vegetales38.

El cuarto método es aplicable a la determinación de residuos de: Bifenilos Policlorados (PCB),

Heptacloro, Aldrin, DDT y metabolitos, Lindano, Dieldrín, Endrin, entre otros, en muestras de suelo y

sedimentos utilizando el procedimiento de extracción por Soxhlet38.

El quinto método es aplicable a la determinación de residuos de: PCB, Heptacloro, Aldrín, DDT y

metabolitos, Lindano, Dieldrín, Endrin, Endosulfan, entre otros, en muestras de biota por el método de

extracción por Soxhlet38.


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16

En nuestro trabajo realizaremos la extracción de los siguientes plaguicidas órganoclorados: Lindano,

Aldrín, Dieldrín, Endrin, Isodrín y DDT en muestras de hortalizas (zanahoria, tomate, col, brócoli y

espinaca), por lo que el primer método de extracción será el utilizado38

La extracción en fase sólida convencional (EFS) es también una técnica muy utilizada para la

purificación de plaguicidas órganoclorados (POCL), pues evita los inconvenientes asociados a la

extracción con disolventes con elevado consumo de los mismos, separación incompleta de las fases, e

interferencias de la matriz, y se obtienen ventajas como reducción de la cantidad de muestra y de

tiempo de extracción38.

El Florisil suele emplearse para la purificación de extractos que contienen plaguicidas, es una forma

activada del silicato de magnesio. Tiene un carácter más ácido que la alúmina y el gel de sílice pero aún

puede considerarse como fase de carácter anfótero es un adsorbente más suave que el gel de sílice y

la alúmina en relación a la descomposición de los compuestos. La extracción en fase sólida

convencional consiste en extraer los POCL disueltos inicialmente en una matriz acuosa, luego se

reparte en n-hexano, al atravesar un soporte sólido de florisil quedan retenidos y posteriormente se

eluyen con una cantidad mínima de disolvente. Como fase de adsorción se usan cartuchos de Florisil.

Luego se eluyen los plaguicidas empleando hexano /éter etílico. La elección de la fase sólida depende

de la polaridad de los plaguicidas y del tipo de matriz utilizada38.

2.3 Cromatografía de gases

La cromatografía de gases (CG) es un procedimiento analítico para la separación de compuestos

volátiles, que fluyen en una corriente gaseosa a través de una fase estacionaria. El Gas Portador (GP)

es la fase móvil en CG. Su misión es la de llevar la mezcla de los solutos desde que se introduce en el

sistema cromatográfico hasta la salida del detector, pasando a través de la columna donde se produce

la separación. El GP es inerte, como ejemplo tenemos: el nitrógeno, el helio, el hidrógeno y el argón39.


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17

La cromatografía de gases es muy utilizada en la separación de plaguicidas que se vaporizan

fácilmente sin degradarse, con puntos de ebullición por debajo de los 250°C y polaridades bajas o

intermedias40.

Las partes esenciales de un cromatógrafo de gases son representadas en la Figura 1:

Figura 1. Partes del cromatógrafo de gases.

1. Fuente de gas portador

2. Sistema de inyección de las muestras

3. Columna cromatográfica

4. Sistema de detección

5. Sistema de registro de datos

El sistema de introducción de muestra, cuya configuración varía según el estado físico de la misma y el

tipo y capacidad de la columna utilizada. Este sistema pone en contacto a la muestra con la corriente de

gas portador. Para la inyección de la muestra se utiliza un inyector de tipo Split con un sistema de

división de flujo el cual se emplea con frecuencia para introducir muestras concentradas y evitar la

saturación de la columna capilar. En tanto que en una inyeccion Splitless la totalidad de la muestra es

inyectada a la columna.

La columna es la parte esencial del equipo cromatográfico y de la que depende el fracaso o el éxito del

análisis. Las columnas más utilizadas son las capilares porque presentan mayor flexibilidad, durabilidad,

sensibilidad y resolución de las señales cromatográficas.


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18

El sistema de termostatación, también denominado horno, controla la temperatura del sistema de

introducción de la muestra y de la columna, ya que ésta es una variable decisiva para conseguir una

separación y reproducibilidad adecuadas.

El detector de captura de electrones ha llegado a ser uno de los detectores más utilizado para el

análisis de muestras medioambientales, debido a su selectividad para detectar compuestos que

contienen halógenos, tal es el caso de los plaguicidas y de los bifenilos policlorados.

La separación, la identificación y la cuantificación de los plaguicidas órganoclorados objetos de estudio

en este trabajo, se realiza por un método de cromatografía de gases con detector de captura de

electrones acoplado al equipo.

2.4 Validación de la metodología de determinación analítica

El procedimiento de validación es una metodología en la determinación analítica consiste para el

establecimiento de una evidencia documentada que demuestre alto grado de probabilidad, que el

método de control es lo suficientemente fiable para reproducir el resultado previsto dentro de los

intervalos definidos41. Para confirmar que los métodos son aptos para el fin previsto la NTC-ISO/IEC

17025:2005 propone requisitos técnicos para las normas de ensayo de calibración, validación y el

aseguramiento de la calidad de los resultados42.

Para llevar a cabo la validación de un método se hace necesario tener en cuenta una serie de parámetros

de desempeño que proporcionan, en gran medida, llegar a conclusiones significativas sobre el

comportamiento del todo.

Cada uno de los parámetros a considerar en la validación, variarán de acuerdo a las exigencias legales

y del método seleccionado. Por tanto, en dependencia de la categoría del ensayo, los requisitos necesarios,

son los correspondientes a la categoría II43, por lo que abordamos los siguientes parámetros: linealidad,

precisión, exactitud, especificidad, límite de detección, límite de cuantificación, rango.44.

La linealidad es la capacidad de un método analítico de obtener resultados proporcionales a la


_____________________________________________________________________________________

19

concentración del analito en la muestra, dentro de un intervalo determinado. Su determinación se

realiza a través de una curva de calibración45 que relaciona la respuesta con la concentración o

cantidad del analito, esta varía en un rango, dependiente de la muestra analizada, si se trata de materia

prima, se evalúa entre 80-120%, empleando de tres a cinco concentraciones y si es producto terminado,

de un 50-150%, utilizando de 5-7 concentraciones, haciendo cada análisis por duplicado como mínimo.

La determinación de los parámetros de la recta de regresión se determina por medio de un programa de

cálculo estadístico (Stat graphics plus 5.0)46.

Al determinar la linealidad se demuestra la proporcionalidad entre la respuesta analítica y la

concentración del analito. Se realiza una curva de calibración que comprende las concentraciones en

los intervalos:

0,005; 0,008; 0,01; 0,015; 0,020 µg/mL para Lindano e Isodrin,

0,025; 0,04; 0,05; 0,075; 0,1 µg/mL para Aldrin, Dieldrin, Endrin,

0,1; 0,16; 0,2; 0,3; 0,4 µg/mL para pp’ DDT.

Se prepararan muestras con diferentes concentraciones de plaguicidas órganoclorados y representan

el 50, 80, 100, 150 y 200 % de la concentración teórica del analito activo. Se determinará la ecuación

de la recta, el coeficiente de correlación r, superior o igual a 0,998, el coeficiente de determinación (r2) y

el coeficiente de variación de los factores de respuesta inferior o igual al 5%

Para el análisis de linealidad se define entonces y = mx + b

donde x es la concentración teórica, y es respuesta del equipo, m el valor de la pendiente y b es la

intersección con el eje y o término independiente.

La pendiente (m) está asociada a la sensibilidad del método, mayor pendiente significa mayor

sensibilidad, por otro lado el término independiente (b) está relacionado con el error sistemático del

método, su significancia debe ser evaluada para determinar si el error sistemático es representativo.

El coeficiente de correlación (r) nos indica el grado de relación entre la concentración y la respuesta,

además es un estimado indirecto de la dispersión de los datos con relación a la estimación lineal.


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20

Cuando este parámetro se acerca a un valor de 1, indica una alta relación lineal entre ambas variables.

Se recomienda un valor del coeficiente de correlación mayor a 0,99, aunque en el caso de impurezas

este podría ser mayor a 0,990. El coeficiente de determinación (r2) aporta una mayor significancia

estadística ya que este expresa como tal la variación total del modelo lineal.

La precisión expresa el grado de dispersión de los resultados obtenidos a partir de múltiples muestras

provenientes de una muestra homogénea47. La precisión puede ser una medida del grado de

repetibilidad en condiciones intermedias y de reproducibilidad del método analítico bajo condiciones

operacionales normales, esta puede expresarse en varios niveles:

La repetibilidad es la medida de la precisión de un método en las mismas condiciones de operación

en un intervalo de tiempo corto, por un mismo analista, en el mismo laboratorio, con los mismos

aparatos y reactivos.

La reproducibilidad expresa la precisión entre laboratorios, resultados obtenidos a través de estudios

colaborativos buscando la estandarización de una técnica.

La precisión está relacionada con la dispersión de una serie de mediciones, pero no brinda ninguna

idea de lo cerca o lejos que están del valor verdadero.

Para comprobar la precisión intermedia del método, se aplicaron las pruebas de Fisher y de la t Student

para determinar si existen diferencias significativas entre los resultados al variar las condiciones de

análisis. Además expresa la variación que ocurre en el laboratorio al realizar las determinaciones en

diferentes días, diferentes analistas, diferentes equipos, etc.

La exactitud conocida también como veracidad indica la capacidad del método analítico de ofrecer

resultados lo más próximos posibles al valor verdadero. Se recomienda que la exactitud se calcule

después de que la precisión, linealidad y especifidad hayan sido establecidas. Existen dos

procedimientos en general para determinar la exactitud de un método. El primero y más común es


_____________________________________________________________________________________

21

realizar la comparación contra un material de referencia, que puede ser un estándar trazable, un

placebo o una muestra con una cantidad de analito conocida.

El segundo método es comparar los resultados con otra técnica aún más exacta o que por consenso

común es referencia, este caso se usa cuando no existen materiales de referencia certificados o

trazables.

Homogeneidad de las varianzas: después de verificar la homoscedasticidad, es necesario corroborar

la homogeneidad de las varianzas aplicando un método estadístico. La prueba más usada es la

propuesta por Cochran que indicará si el factor de concentración tiene alguna influencia en la

variabilidad de las respuestas.

El valor del estadístico experimental se calcula de la siguiente forma:

GExp = S2 max (1)

Donde:

GEXP, es el estadístico de Cochran,

S 2 max es la máxima varianza de todos los conjuntos de datos,

Si2 son las varianzas calculadas para cada conjunto de datos (réplicas de una misma concentración).

El valor crítico del estadístico de Cochran G lo determinan:

G= G (k,v,α) (2)

Dónde:

k es el número de grupos de datos o grupo de réplicas,

v el grado de libertad definido como n max – 1 , donde n max es el mayor de los tamaños demuestra.

α es el nivel de significancia, usualmente 0,05.

La especificidad es la capacidad del método analítico para evaluar inequívocamente al analito en

presencia de otros compuestos que puedan estar presentes en la matriz, sin interferencias en las

respuestas. La especificidad o selectividad es una condición esencial para conseguir una buena exactitud.


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22

La falta de especificidad de un método analítico puede compensarse por otro método auxiliar que pruebe

la ausencia de las sustancias interferentes.

De modo general se determina, comparando el resultado obtenido con una cantidad conocida del analito

solo, con el resultado obtenido al analizar muestras del analito más los posibles compuestos interferentes.

Se presentaran las pruebas que indiquen que los posibles compuestos interferentes no afectan la

determinación como por ejemplo, cromatogramas, donde cada señal este bien identificada.

En ocasiones se emplea el término selectividad como sinónimo de especificidad.

La diferencia entre estos términos, desde el punto de vista operativo es casi inapreciable no obstante,

selectividad es la capacidad del método de medir el analito sin interferencias de impurezas, productos de

degradación, metabolitos excipientes, o compuestos químicos relacionados. Para demostrar el

cumplimiento de este parámetro lo más frecuente es: la demostración de no interferencias de la matriz con

el analito.

El límite de detección representa la mínima concentración de analito que se puede detectar siguiendo

el proceso completo del método con un nivel aceptable de confianza la cual produce una señal con el

99% de probabilidad de ser diferente y cuya concentración es mayor que el blanco47. Esto se verifica

realizando réplicas, las cuales deben tener una media por arriba de 3.14 S, donde “S” es la desviación

estándar de las réplicas48.

El límite de cuantificación es la concentración mínima de analito que puede determinarse con un nivel

aceptable de exactitud y precisión. Se establece utilizando una muestra o material de referencia

apropiado. Normalmente corresponde al punto inferior de la curva de calibración (excluido el blanco).

Los métodos utilizados para determinar están basado en la relación señal ruido mediante la

comparación de las señales obtenidas con la muestra de blancos. Se considera aceptable una relación

señal ruido correspondiente es 10 veces la cantidad mínima del analito confiablemente cuantificada.

Otro método es basado en la desviación estándar de respuesta y la sensibilidad, este criterio es válido

si la desviación estándar del blanco es mucho mayor que las desviaciones estándar de los parámetros


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23

de la recta. La desviación estándar y el promedio de respuesta de un blanco pueden estimarse a través

del análisis repetido del blanco de la muestra y por la extrapolación a cero de una curva de calibración a

bajas concentraciones.

El intervalo analítico de aplicación (rango) se define como el mínimo y el máximo valor de

plaguicida que se puede cuantificar con la precisión y exactitud, cuyo valor se encuentra dentro de

lo especificado en los criterios de aceptación.

Si el intervalo de trabajo del método es muy amplio, es razonable esperar que las desviaciones

estándar(s) sean significativamente diferentes para cada punto de la función de respuesta del método,

lo que obligaría a tomar decisiones relativas a la definición de su uso por tramos. (En algunos casos

podría ser conveniente tratar de establecer si existe alguna relación funcional entre los respectivos

niveles de ensayo).

Para evaluar el intervalo analítico de aplicación se procede de igual forma que en el análisis de

linealidad, se calcula, la precisión y la recuperación en cada nivel de concentración. Para el cálculo de

rango de trabajo se recomienda usar el definido por el mínimo valor y el máximo valor aportados por los

análisis usuales que se realicen dentro del laboratorio y efectuar el ensayo en el rango donde los

valores de precisión y exactitud están dentro de lo especificado en los criterios de aceptación.

Aunque algunos materiales incluyen la robustez dentro de la precisión del método en la USP 23 y en la

ICH (International Conference on Harmonization)41 la sitúan como un parámetro aparte de la validación.

En el estudio de robustez aporta con la influencia de pequeños cambios en las condiciones analíticas

sobre la fiabilidad del método analítico. Una consecuencia de la evaluación de la robustez es que la

validación de la técnica se mantiene aunque se introduzcan cambios en las condiciones antes

evaluados.

Los criterios de aceptación de los parámetros de validación del método se resumen en la Tabla 8.


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24

Tabla 8. Criterios de aceptación para los ensayos de validación de residuos (guias técnicas)*

Parámetro Límites de aceptación.

Linealidad

r >0,99, R2 >0,98, intercepto no significativo pendiente significativo,

cumplimiento del test, de proporcionalidad.

Precisión

a) Repetibilidad

b)Precisión

Intermedia

CV ≤ 5% para determinación de residuos en muestras de alimentos y

ambientales.

Exactitud No existen diferencias significativas entre las medias de los resultados

obtenidos y el valor real adicionado.

Recobrados entre CV total ≤ 5%

Límite de

cuantificación

CV debe ser < 1,5%

Especificidad Posibilidad de cuantificar única y exclusivamente los compuestos

órganoclorados del residuo presente en la matriz, sin interferencia del

resto de los componentes presentes en la muestra

Recobrado 70 % ≥Recobrado ≤110 %

*Sección Metrología Ambiental y de Alimentos, Departamento de Salud Ambiental, Santiago, Chile ,2010

*Secretaria de Salud, Comisión de Control Analítico, Criterios para la validación de Metodos Físico-Quimicos

Mexico ,2011

CAPÍTULO 3

PARTE EXPERIMENTAL

Parte Experimental

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25

CAPÍTULO 3. MATERIALES Y MÉTODOS

3.1. Reactivos, materiales y equipos de laboratorio

Reactivos

n- hexano Merck 1.043744000

Acetonitrilo JT Baker 9012-03

Éter etílico MercK 1.009215000

Sodio Sulfato Anhidro Merck 106639

Sodio Cloruro Merck 1.06406, Solución saturada

Florisil, Strata (SPE) FL-PR Florisil (170 µm, 80 Å) 500 mg / 3 mL, 8B-S013-HBJ

Nitrógeno gas 99, 99 % de pureza

Estándares primarios

Lindano 99, 0 % +/- 0,5% Sigma Aldrich, USA

Aldrin 99, 5 % +/- 0,5% Supelco, USA

pp’DDT 99,0 % +/- 0,5% Sigma Aldrich, USA

Endrin 99, 5 % +/- 0,5% Supelco, USA

Isodrin 101, 4 % +/- 0,5% Sigma Aldrich, USA

Dieldrin 99, 2% +/- 0,5% Supelco, USA

Todos los reactivos empleados fueron de pureza analítica o superior. Se trabajó siempre con agua

desionizada con conductividad menor que 0,05 S.

Materiales

Pipetas automáticas de volumen variable (100μl a 10 ml)

Pipetas automáticas de volumen variable (10μl a 1ml)

Matraces aforados con tapa de 10, 50, 100, 250 ml

Vasos de precipitación de 25, 50, 100, 250 ml

Papel filtro cualitativo Whatman 125mm diámetro

Embudos de vidrio de 60º

Parte Experimental

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26

Embudo de separación de 500 mL

Tubos de ensayo 20 mL

Probetas de vidrio de 10, 25, 250, 500 ml

Varillas de agitación

Viales para cromatografía color ámbar de 2 ml

Cuchillo con mango de plástico

Frascos con tapa para muestras 500 mL -1000 mL

Material para rotular

Papel absorbente

Equipos

Cromatógrafo de gas (GC), Perkin-Elmer, Auto sistem. - Clarus 500 que incluye:

Pantalla

Control electrónico de presión (PPC)

Sistema de detección DCE

Auto inyector

Inyector de columnas capilares con control electrónico de presión split/splitless

Columna cromatográfica Elite (35% Fenil – Metilpolisiloxano)

Software Total Chrom Navigator

Rota evaporador BUCHI R-210 con temperaturas de 20 °C hasta 180°C

Balanza analítica de apreciación: 0,1 mg

Estufa con control de temperatura

Licuadora de cinco velocidades

Manifold de vidrio para cartuchos con fase solida

Bomba de vacío

Cortador para vegetales

Congelador -10°C

Refrigerador

Parte Experimental

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27

3.2. Métodos

3.2.1. Muestreo de las hortalizas

Las hortalizas empleadas en este estudio fueron: zanahoria (Daucus carota), tomate (Lycopersicon

lycopersicum), col (Brassica oleracea), brócoli (Brassica oleracea var. italica)) y espinaca (Talinum

triangulare). El muestreo fue realizado de manera aleatoria no probabilística. Las muestras fueron

colectadas en el almacén de venta en la UFA ESPE, IASA 1, Sangolquí- Rumiñahui –Ecuador.

Las muestras se colocan en fundas plásticas selladas, se rotulan y se someten a congelación durante

24 horas. Seguidamente, las muestras se cortan por separado en un cortador de vegetales a 600 rpm y

se dividen en porciones de 50 gramos para su posterior análisis37.

3.2.2. Técnica de extracción de los residuos de plaguicidas órganoclorados

El procedimiento analítico (método 1) que se usa en el Laboratorio de Análisis de Residuos de

Plaguicidas y Contaminación Ambiental del Instituto de Investigaciónes de Sanidad Vegetal (ISV) de la

Habana, Cuba38 sirvió como referencia y fue adecuado a las condiciones del LMA en la UFA ESPE para

desarrollar un procedimiento de extracción de los plaguicidas órganoclorados objetos de estudio en

nuestro trabajo.

Procedimiento general de trabajo 38.

A una muestra de 50 g de hortaliza previamente triturada, se le adicionó 150 mL de acetonitrilo. Luego

se mantuvo con agitación a alta velocidad durante 2 minutos en una licuadora. Seguidamente se

separó el residuo acuoso por decantación y se colocó en una probeta una alícuota equivalente a 10 g

de muestra (43 mL para una muestra de sustrato con 70% de humedad). A continuación se trasvasó a

un embudo de separación de 500 mL y se le adicionó 100 mL de n-hexano. Se agitó manualmente por

2 minutos y luego se le adicionó 3mL de solución saturada de cloruro de sodio y 120 mL de agua lavada

con n-hexano. Se continúa agitando manualmente por un minuto y se desechó la fase acuosa. A la

fase orgánica se le adicionó 100 mL de agua lavada con n hexano y se desecha la fase acuosa. El

solvente orgánico se filtró a través de papel filtro que contiene sodio sulfato anhidro. Se recogió la

http://www.plantasparacurar.com/categoria/plantas-medicinales/002-plantas-medicinales-por-nombre-cientifico/plantas-b-1020/brassica-oleracea/

Parte Experimental

_____________________________________________________________________________________

28

solución en un balón de evaporación de 500 mL. Se lavó el sodio sulfato anhidro con 15 mL de n-

hexano y los restos del lavado se adicionaron al balón de evaporación. Se concentró en un rota

evaporador a 40 °C hasta 2 mL. El extracto obtenido fue sometido a un proceso de purificación.

Procedimiento de purificación por elución 38 ,10

1. Se ubicó en el manifold (colector de fracciones) una columna de Florisil (500 mg/3 ml, 8B-S)13-

HBJ) de 180 mm de diámetro interno (d.i)

2. Se desactivo el Florisil utilizando 0,5 mL de una mezcla de n-hexano-agua al 1%.

3. Se añadió sulfato de sodio anhidro sobre el adsorbente, hasta una altura de 1cm.

4. Se le adicionaron 3mL de n-hexano al Florisil hasta una altura de 1 cm.

5. Se drenó el disolvente hasta el borde superior del adsorbente.

6. Se adicionó la muestra a la columna y se drena a una velocidad de flujo de 5 mL/min.

7. El recipiente que contiene el extracto se lavó con 20 mL de n-hexano en porciones de 5 mL y se

pasan los lavados a través de la columna.

8. Se eluyeron con 10 mL de una mezcla de n-hexano-éter etílico (94:6).

9. Se concentró hasta 2 mL, en un rota evaporador en un balón de 100 mL a 40 °C.

10. Se lavó el recipiente con dos porciones de 3 mL de n-hexano y se adicionó en un Erlenmeyer

de 25 mL.

11. Se evaporó el disolvente en corriente de nitrógeno hasta sequedad.

12. Se adicionó 2 mL de n-hexano al residuo, se transfirió a un vial y se selló.

3.2.3. Optimización de los parámetros cromatográficos

Selección de la fase estacionaria de la columna cromatográfica

Se realizó un estudio bibliográfico sobre las diferentes columnas cromatográficas, se analizaron las

características físicas como espesor, longitud, diámetro, temperatura y químicas como polaridad con la

finalidad de escoger la columna más adecuada.

Parte Experimental

_____________________________________________________________________________________

29

Selección de la columna:

El primer método38 propone para la determinación de los plaguicidas órganoclorados objeto de estudio

en nuestro trabajo el empleo de una columna capilar de sílice fundida de 30 m x 0,53 mm d.i recubierta

con una composición 5% Fenil y 95% Dimetilpolisiloxano (DB-5). El LMA de la UFA ESPE no dispone

de este tipo de columna por lo que fue necesario probar las corridas en dos tipos de columnas: una Elite

de composición 35 % Fenil – Metilpolisiloxano (35 MS) de 30 m x 0,32 mm d.i., 0,25 µm de espesor de

película y otra DB-608 de 30 m x 0,53 mm d.i., DF 0,83 µm de espesor de película. Para lo cual se

inyectó 1 μL de cada una de las soluciones de los patrones analíticos de plaguicidas y posteriormente

se analiza la corrida cromatográfica.

Determinación de la velocidad de flujo

En la columna seleccionada, se programaron dos velocidades de flujo, (1,0 y 1,5 mL/min,

respectivamente). Se inyectó 1 μL de la mezcla de los patrones analíticos de plaguicidas y se registran

los cromatogramas.

Programación de la temperatura del horno

Con los parámetros cromatográficos encontrados, se diseñó un grupo de programas de temperatura

con diferentes gradientes e isotermas como se presenta en la siguiente tabla.

Tabla 9. Diseño de programa de temperaturas para el estudio de optimización. Programa Rampa 1 Rampa 2 Rampa 3

Isoterma minutos

Gradiente °C/minuto

Isoterma minutos

Gradiente °C/minuto

Isoterma minutos

1 6.0 (150°C) 5 5 (280°C) 2 5 (250°C)

2 7.0 (150°C) 5 5 (200°C) 2 5 (270°C)

3 5.50 (150°C) 5 5 (190°C) 2 3 (270°C)

4 5.50 (150°C) 5 5 (190°C) 2 9 (255°C)

5 5.50 (150°C) 5 5 (190°C) 2 5.5 (258°C)

Procedimiento cromatográfico

Fundamentado en los ensayos cromatográficos para la optimización de los parámetros se presenta en

la siguiente tabla las mejores condiciones seleccionada para el ensayo de los plaguicidas

órganoclorados en el LMA de la UFA ESPE.

Parte Experimental

_____________________________________________________________________________________

30

Tabla 10. Condiciones cromatográficas para la determinación de los plaguicidas órganoclorados por cromatografía de gases. Columna Elite 35-MS, 30m de longitud, DI 0,32 mm, DF 0,25 µm composición Fenil –

metilpolisiloxano.

Volumen de Inyección 1μL

Flujo del Gas Portador 1,0 mL/minuto

Detector Captura Electrónica Temperatura 280 °C, Sensibilidad 1,0 mV

Inyector Temperatura 200 °C, modo splitless.

Horno 150 °C x 5,50 minutos, rampa de calentamiento 5°C/min. hasta 190 °C x 5 min., rampa de calentamiento 2 °C/min. hasta 258 °C x 5,50 minutos.

3.2.4. Procedimiento de dopaje a las muestras de hortalizas certificadas

Con la finalidad de disponer de un material de referencias que no contenga plaguicidas órganoclorados

se recurrió a la adquisición de muestras de zanahoria, tomate, col, brócoli y espinaca del huerto

orgánico y ecológico de la comunidad Agrícola Cotocchoa Sangolquí – Ecuador.

Estas muestras fueron divididas en dos grupos que incluían a las muestras de los blancos sin dopar y

las muestras de los blancos dopados con los patrones analíticos de plaguicidas órganoclorados

(Lindano, Aldrin, Isodrin, pp’ DDT, Endrin y Dieldrin).

Los pasos del procedimiento de dopaje se describe a continuación:

1. Se molieron y luego se pesaron 50 g de muestra de cada hortaliza.

2. Cada muestra se homogenizó por separado en una licuadora durante 2 minutos a alta

velocidad.

3. A cada muestra se le adiciona una mezcla de estándares de plaguicidas órganoclorados en

solución de n-hexano, en tres concentraciones: 0,01; 0,1 y 0,5 μg/mL, respectivamente.

4. Se etiquetó cada muestra con los nombres y la concentración.

5. Se almacenaron las muestras a 4 °C protegidas de la luz.

6. Deben ser analizadas antes de los siete días pues en un tiempo mayor la muestra pierde

estabilidad.

Parte Experimental

_____________________________________________________________________________________

31

3.2.5. Estimación de los parámetros de desempeño del procedimiento analítico

Se realizó la validación intralaboratorio del procedimiento analítico, desarrollado por cromatografía de

gases, de acuerdo al Procedimiento Normalizado de Trabajo del LMA de la UFA ESPE; el cual está

comprendido dentro del alcance de las normas internacionales de la calidad ISO/IEC 17025:2005 y en

armonía con las tendencias actuales relacionadas con la validación de métodos analíticos.

En este trabajo se estimaron los siguientes parámetros de desempeño: linealidad, precisión, exactitud,

especificidad, límite de cuantificación, límite de detección y rango 49, 50

Linealidad

Se procedió a realizar una curva de calibración con muestras de concentraciones de patrones analíticos

de plaguicidas en un intervalo de (50-200) % de concentración teórica tomando como referencia el

Límite Máximo de Residuos (LMR) establecido por el Codex Alimentarius51 de los plaguicida

órganoclorados. Se realizó el análisis por triplicado para cada nivel de concentración. Para evaluar la

linealidad se utilizó la prueba de falta de ajuste implementada en la aplicación Statgraphics 5.0 52

Precisión

La precisión se evaluó en términos de repetibilidad y precisión intermedia en diferentes días a tres

niveles de concentración. Para ello se llevó a cabo un experimento en donde un analista en tres días no

consecutivos realizó seis determinaciones del contenido de plaguicida en cada nivel de concentración.

Con los resultados de este experimento se utilizó el análisis de la varianza implementado en la

aplicación Statgraphics 5.0 y se obtuvieron los estimados de precisión en condiciones intermedias:

diferente día y en condiciones de repetibilidad. Los detalles relacionados con los cálculos y formulas

necesarios se presentan en el anexo1.

Los niveles de concentración en cada plaguicida se prepararon según el procedimiento descrito en el

epígrafe 3.2.4 y se reportan en la tabla 11.

Parte Experimental

_____________________________________________________________________________________

32

Tabla 11. Concentraciones de los patrones de referencia utilizados en el estudio de repetibilidad.

Patrones analíticos de plaguicidas órganoclorados Niveles de concentración (g/mL)

Lindano 0,05; 0,10; 0,50

Aldrín 0,05; 0,10; 0,50

Isodrín 0,05; 0,10; 0,50

DDT 0,05; 0,10; 0,50

Dieldrín 0,05; 0,10; 0,50

Endrin 0,05; 0,10; 0,50

Exactitud

La exactitud se estimó a tres niveles de concentración añadiendo cantidades conocidas de estándar,

cada muestra se analizan por triplicado.

A las muestras de concentración desconocida se le añadieron alícuotas de concentración conocida y

creciente del compuesto de referencia. La diferencia del resultado muestra y analito menos la muestra

corresponde a la concentración adicionada. Por interpolación en la recta obtenida al graficar el área

versus la concentración de la muestra se obtuvieron los valores experimentales. Seguidamente se

estimaron los parámetros estadísticos: la desviación estándar (S) y el coeficiente de variación (CV). Se

realizó el ensayo de Cochran con vistas a comprobar si la variación de la concentración producía

diferencias significativas en los resultados y la prueba test de Student para determinar si existen

diferencias significativas entre el recobrado y el valor añadido de estándar.

Los niveles de concentración en cada muestra se prepararon según el procedimiento descrito en el epígrafe

3.2.4.

Las ecuaciones para aplicar la prueba de t de Student (test) y la prueba de Cochran (G) se muestran a

continuación:

t exp = (3)

Parte Experimental

_____________________________________________________________________________________

33

G exp = (4)

Criterio de aceptación:

Si texperimental es menor que ttabulado (P= 0,05, g/l n-1), no existen diferencias significativas en la

recuperación.

Si Gexperimental es menor que G tabulado (P= 0,05, k=3, n=5-1), las varianzas de las tres

concentraciones son equivalentes o lo que es lo mismo que el factor concentración no influye

en la variabilidad de los resultados.

Especificidad

Para evaluar la especificidad se compararon los cromatogramas obtenidos en las siguientes muestras:

todos los disolventes orgánicos que se utilizan en el método; cada uno de los patrones analíticos de

plaguicidas órganoclorados; mezcla de los patrones analíticos de plaguicidas órganoclorados; muestra

libre de residuos de plaguicidas; muestra dopada con los patrones analíticos de plaguicidas

órganoclorados y muestras desconocidas.

Para que el método cumpla con la especificidad se tomaron como criterios: el tiempo de retención de

cada uno de los patrones de referencia debe ser diferente, el tiempo de retención de los componentes

órganoclorados en las muestras debe coincidir con el estándar de referencia correspondiente en

condiciones normalizadas, en caso de degradación total no deben existir señales que interfiera en el

tiempo de retención determinado previamente para cada analito.

Parte Experimental

_____________________________________________________________________________________

34

Límite de cuantificación

El límite de cuantificación es la concentración mínima de analito que puede determinarse con un nivel

aceptable de exactitud y precisión. Se estableció utilizando los patrones de referencia apropiados y se

correspondió con el punto inferior en cada una de las curvas de calibración (excluido el blanco).

Límite de detección

El límite de detección fue la mínima concentración de analito que se pudo detectar siguiendo el proceso

completo del método con un nivel aceptable de confianza de que dicha concentración es mayor que el

blanco.

El intervalo analítico de aplicación (rango)

Se procede de igual forma que en el análisis de linealidad, a diferencia de este se calcula, la precisión y

la recuperación en cada nivel de concentración. Para el cálculo de rango de trabajo se usa el criterio el

definido por el mínimo valor y el máximo valor aportados por los análisis que se realicen dentro del

laboratorio. Donde los valores de precisión y exactitud están dentro de lo especificado en los criterios de

aceptación.

35

CAPÍTULO 4

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Resultados y Discusión _____________________________________________________________________________________

35

CAPÍTULO 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

En la literatura se reportan diversos métodos para la determinación de plaguicidas órganoclorados por

cromatografía de gases, empleando diferentes tipos de detectores. En nuestro trabajo tomamos como

referencia el procedimiento analítico de extracción y determinación (primer método) usado en el

Laboratorio de Análisis de Residuos de Plaguicidas y Contaminación Ambiental del Instituto de

Investigaciones de Sanidad Vegetal de la Habana, Cuba. El cual es un procedimiento validado acorde a

las normas internacionales de la calidad ISO/IEC 17025:2005 y en armonía con las tendencias actuales

relacionadas con la validación de métodos analíticos.

La Universidad de las Fuerzas Armadas de Ecuador, dispone de extensas áreas de cultivos de

hortalizas y frutales por lo que se hace necesario disponer de un método analítico propio que en las

condiciones de trabajo del Laboratorio de Medio Ambiente de esta universidad que permita cuantificar

el contenido de residuos clorados en hortalizas cosechadas tanto en los huertos de la Universidad como

en las cooperativas agrícolas aledañas, para que los productos puedan ser vendidos como productos

agrícolas seguros para el consumo humano, según lo establecido en las regulaciones sanitarias.

En el presente trabajo se desarrolló y validó por vez primera un nuevo método para cuantificar residuos

de plaguicidas órganoclorados (Lindano, Aldrín, Dieldrín, Endrin, Isodrín y DDT) en muestras de

hortalizas ecuatorianas (zanahoria, tomate, col, brócoli y espinaca), adaptado a las condiciones del

laboratorio de medio ambiente de la UFA ESPE para lo cual se empleó la cromatografía de gases con

detector de captura de electrones.


36

4.1. Optimización de las condiciones cromatográficas

Resolución de la columna cromatográfica

La columna es la parte esencial del equipo cromatográfico y de ella depende el éxito del análisis; según

la bibliografía consultada si la resolución (RS) es mayor que 1,5 las señales están completamente

separados,53. La tabla 12 muestra el resultado de la prueba de resolución realizada en el LMA de la

UFA ESPE, donde se demostró la capacidad de las columnas cromatográficas (DB-6 y Elite) para

separar a dos solutos con tiempos de retención semejantes.

Tabla 12. Resolución de las columnas cromatográficas.

COLUMNA ELITE

Lindano Aldrín Isodrín DDT Dieldrín Endrin

TIEMPO( minutos) 29,3 40,6 45 52,2 53 56

ANCHO W( mm) 4 3 2 1 2 0,5

RESOLUCIÓN (Rs) 8,7 4,9 8,2 3,6 3,5 COLUMNA DB-608

TIEMPO (minutos) 28 29,3 40 44,9 52,7 54,2

ANCHO W( mm) 2 3 3 2 3 1

RESOLUCIÓN (Rs) 4,3 10,1 5,3 10,8 2,0

El LMA de la UFA ESPE dispone de las columnas cromatográficas DB-608 y Elite (35% Fenil-

Metilpolisiloxano) que según reporta la literatura54 pudieran ser empleadas para separar plaguicidas

órganoclorados debido a su baja polaridad. La columna Elite, de última generación, con un DI 0,32 mm

con DF 0,25 µm tiene en su composición una fase ligada con 35 % de grupos fenilo, que le confieren

una afinidad característica hacia los compuestos con anillos aromáticos, garantiza gran estabilidad


37

térmica e inercia química y es a su vez, muy útil en la separación de analitos medioambientales,

compuestos poliaromáticos, plaguicidas órganoclorados, órgano fosforados, disolventes y esencias 54.

Durante el desarrollo cromatográfico al utilizar la columna DB-608, se observaba un solapamiento entre

las señales de lindano y aldrín. Sin embargo este inconveniente se resolvió al utilizar la columna Elite

(Tabla 12, Figuras 1 y 2).

Por lo que la columna Elite fue la seleccionada para el desarrollo del procedimiento analítico.

Las Figuras 1 y 2 muestran los resultados de las corridas cromatográficas de la mezcla de 6 plaguicidas

órganoclorados objetos de estudio, utilizando idénticas condiciones que las empleadas en las muestras.

Figura 1. Corrida cromatográfica empleando la columna Elite.


38

Figura 2. Corrida cromatográfica empleando la columna DB-608.

En el procedimiento implementado en el Instituto de Investigaciones de Sanidad Vegetal, La Habana,

Cuba 38, tomado como referencia en este estudio, utilizan una columna DB-5 para el análisis de los

plaguicidas órganoclorados, obteniendo resoluciones similares a las reportadas en la Figura 2, para la

columna DB-608. Como se observa no se logra una buena resolución cuando son analizados todos los

plaguicidas en una misma corrida cromatográfica.

Velocidad de flujo

Se estudia la velocidad de flujo en la columna Elite para obtener la mejor separación de los

componentes. Los cromatogramas de las Figuras 3 y 4, corresponden a las velocidades de flujo de 1,0

y 1,5 mL/min, respectivamente. En la Figura 3 se observó, una separación completa de todos los

componentes mientras que en la Figura 4 no se observa una buena separación y se superponen las


39

señales de los plaguicidas Endrin y Dieldrín. Por lo que se tomó como velocidad de flujo el valor de 1

mL/mi

Figura 3. Cromatograma con flujo de 1,0 mL/ minuto.

Figura 4. Cromatograma con flujo de 1,5 mL/ minuto.


40

Gradiente de temperatura

Como se sustenta en la bibliografía, la programación de la temperatura por gradiente en el horno del

cromatógrafo de gases con la finalidad de separar los plaguicidas órganoclorados, debe ser capaz de

sostener temperaturas superiores a los 280 °C54 . Además es importante cuidar que la temperatura

límite de la columna no llegue a los 350 °C. Por tal motivo, la programación de la temperatura a régimen

de gradiente fue desde los 150 °C hasta 258 °C, como se explica en las Tabla 9 y 10 en materiales y

métodos.

Las condiciones cromatográficas empleadas para la determinación de los plaguicidas órganoclorados

estudiados se reportaron en la Tabla 10.

4.2. Estudio de los parámetros de desempeño del procedimiento analítico

Linealidad

Para determinar la proporcionalidad entre la concentración de plaguicida clorado y su respuesta analítica es

necesario determinar la linealidad. Además, conjuntamente se determinó el rango lineal, es decir, el intervalo

comprendido entre la concentración mínima y máxima del analito para el cual el método ha sido probado y

dentro del cual se efectúa el dosaje por interpolación en una curva estándar. Los estimadores estadísticos de

la regresión se evaluaron en un intervalo de confianza de p=0,05.

Las curvas de calibración correspondiente a cada uno de los plaguicidas organoclorados estudiados se

muestran a continuación en las Figuras (5-10), respectivamente.


41

Figura 5. Curva de Calibración del Lindano.

Figura 6. Curva de Calibración de Aldrín.

Datos experimentales

Regresión lineal


Regresión lineal


42

Figura 7. Curva de Calibración de Isodrín.

Figura 8. Curva de Calibración de pp’ DDT.


Regresión lineal


Regresión lineal


43

Figura 9. Curva de Calibración de Dieldrín.

Figura 10. Curva de Calibración de Endrin.


Regresión lineal


Regresión lineal


44

Tabla 13. Parámetros estadísticos de linealidad.

Parámetros Criterios: r 0,998; R2 0,98; S<2%; intercepto no significativo.

Plaguicida Lindano Aldrin Isodrin

Ecuación de la recta X= 1E+09x+259320

X=5E+08x-804813

X=3E+07x+6351,5

Coeficiente de correlación (r> 0,99)

0.999 0,999 0,999

Coeficiente de determinación (R2)

0,9986 0,9987 0,998

Coeficiente de variación (CV)

1,9 2,6 1,86

Desviación estándar relativo (S)

1,32 1,71 1,23

Significación del intercepto

No significativo No significativo No significativo

Plaguicida DDT Endrin Dieldrin

Ecuación de la recta X=762601x+1178,4 X=638592x+2494,3 X=2E+06x+4436,5

Coeficiente de correlación (r> 0,99)

0,999 0,999 0,999

Coeficiente de determinación (R2>0,98)

0,9993 0,999 0,9997

Coeficiente de variación < 5%

3,06 4,42 3,08

Desviación estándar relativo <2%

1,85 1.88 1.83

Significación del intercepto

No significativo No significativo No significativo

Se observó que los coeficientes de correlación y determinación obtenidos en la evaluación de la

linealidad del procedimiento, se encuentran entre los valores aceptados, además los interceptos fueron

no son significativos en cada uno de los casos estudiados. Por lo que se infiere que existe una

correlación lineal entre los niveles de concentración de cada uno de los plaguicidas estudiados y las

áreas correspondientes a las señales obtenidas.


45

Precisión

Se analizó la dispersión de las medidas alrededor de su valor medio o central la cual se correspondió al

grado de concordancia entre los ensayos individuales al aplicar el método repetidamente a múltiples

alícuotas de una muestra homogénea.

Los resultados del estudio de precisión en sus dos formas, repetibilidad y precisión intermedia, se

resumen en las Tablas 14 y 15.

Tabla 14. Resultados del estudio de repetibilidad (para n = 6).

Plaguicida LMR mg/Kg Media mg/Kg Varianza CV (%)

Lindano 0,01 0,0088 0,0001 1,6132

Aldrín 0,05 0,0460 0,0003 0,7193

Isodrín 0,01 0,0086 0,0001 1,2518

DDT 0,2 0,1596 0,0024 1,4831

Dieldrín 0,05 0,0424 0,0001 0,3343

Endrin 0,05 0,0406 0,0005 1,1253

CV: coeficiente de variación.

Tabla 15. Resultados del estudio de precisión intermedia. Lindano día 1 Lindano día 2 Lindano día 3

Concentración µg/mL 0.005 0.1 0.5 0.005 0.1 0.5 0.005 0.1 0.5

Media 85.73 84.78 86.50 85.44 85.34 86.10 85.69 85.02 86.22

S 0.51 1.31 0.84 0.34 1.32 0.69 0.82 1.32 0.77

CV 0.60 1.55 0.97 0.40 1.55 0.81 0.96 1.55 0.89

Aldrín día 1 Aldrín día 2 Aldrín día 3


Media 90.52 90.70 92.12 91.70 90.40 91.02 91.77 91.52 91.28

S 1.53 1.04 1.75 0.75 1.17 1.31 1.10 0.91 1.94

CV 1.69 1.15 1.90 0.82 1.30 1.44 1.20 0.99 1,98

Isodrín día 1 Isodrín día 2 Isodrín día 3


Media 85.73 84.78 86.50 85.44 85.34 86.10 85.69 85.02 86.24

S 0.51 1.31 0.84 0.34 1.32 0.69 0.82 1.32 0.77

CV 0.60 1.55 0.97 0.40 1.55 0.81 0.96 1.55 0.89


46

Tabla 15. Continuación. Resultados del estudio de precisión intermedia. pp’ DDT día 1 pp’DDT día 2 pp’DDT día 3


Media 78.80 78.76 78.84 78.80 79.35 79.52 78.68 79.03 79.40

S 0.79 0.42 0.75 0.76 0.58 0.23 0.80 0.68 0.81

CV 1.00 0.54 0.95 0.96 0.73 0.29 1.01 0.86 1.02

Dieldrín día 1 Dieldrín día 2 Dieldrín día 3


Media 87.43 85.99 84.95 85.43 84.28 85.36 84.81 85.33 85.31

S 1.81 0.72 1.50 1.19 1.09 1.23 1.02 0.85 1.53

CV 1,97 0.83 1.76 1.39 1.30 1.44 1.20 0.99 1.80

Endrin día 1 Endrin día 2 Endrin día 3


Media 79.64 80.41 79.35 80.11 81.38 80.38 80.84 81.89 79.94

S 1.35 1.42 1.53 1.12 1.05 1.16 0.97 0.81 1.44

CV 1.70 1.77 1.93 1.39 1.30 1.44 1.20 0.99 1.80

Como se observa el ensayo de repetibilidad cumple con lo establecido en la estimación de los

parámetros de desempeño de los procedimientos analíticos. En el cual, el CV debe ser menor del 2 %

en todas las sustancias químicas de referencia y en nuestro estudio osciló entre 0,33 para el Dieldrín y

1, 61 para el Lindano.

El ensayo de precisión intermedia mostró, para todos los métodos, que no existen diferencias

significativas entre las precisiones alcanzadas por un analista en tres días diferentes. De la misma

forma no existieron diferencias significativas entre las medias obtenidas. (Tabla 16.)

Tabla 16. Estadígrafos.

Estadígrafo Plaguicida órganoclorado Lindano

F de Fisher F exp= 0,32 Ftab=2.79 (Para P=0.05)

Fexp < Ftab

No existen diferencias significativas entre las dispersiones alcanzadas en los diferentes días.

t de Student texp=0,2 ttab= 2.07 (Para P=0.05, n-2 g.l) No existen diferencias significativas en los valores medios obtenidas de las tres concentraciones en los tres días.


47

Estadígrafo Plaguicida órganoclorado Aldrín


Fexp < Ftab



Estadígrafo Plaguicida órganoclorado Isodrín


Fexp < Ftab


t de Student texp=0,8 ttab= 2.07 (Para P=0.05, n-2 g.l) No existen diferencias significativas en los Valores medios obtenidas de las tres concentraciones en los tres días.

Estadígrafo Plaguicida órganoclorado pp’ DDT


Fexp < Ftab



Estadígrafo Plaguicida órganoclorado Dieldrin


Fexp < Ftab




48

Estadígrafo Plaguicida órganoclorado Endrin


Fexp < Ftab



Estos resultados permitieron concluir que el procedimiento es preciso y puede emplearse para la

determinación de los plaguicidas órganoclorados en muestras de hortalizas.

Exactitud

La exactitud de un método, también conocida como error sistemático o tendencia, corresponde a la

diferencia entre el valor obtenido (media) y el valor verdadero. De hecho la norma NTC-ISO/IEC

17025:2005, al referirse a la exactitud de un método analítico habla de la concordancia entre el valor

medido y el valor aceptado como referencia. De esta manera, es posible independizarse del término

“valor verdadero” usado en estadística cuyo significado es diferente. La exactitud debe ser tan pequeña

como sea posible para que el valor medido se aproxime al de referencia. O sea, la recuperación del

analito debe acercarse al 100 %.

Tabla 17. Porcentaje de recuperación de los plaguicida órganoclorados.

LINDANO

CA µg/mL

CR µg/mL

% R S CV

0, 05 0,0393 85,54 0,27 0,32

0, 1 0,082 85,04 1,32 1,55

0, 5 0,407 86,28 0,69 0,80

CA: Concentración añadida, CR: Concentración recobrada, % R: Porcentaje de recuperación, S: desviación estándar.


49

ALDRÍN

CA µg/mL

CR µg/mL

% R S CV

0, 05 0,0397

91,30 0,904 0,990

0, 1 0,0793

90,87 0,814 0,896

0, 5 0,3982

91,49 1,010 1,103

ISODRÍN

CA µg/mL

CR µg/mL

% R S CV

0, 05 0,039

85,62 0,242 0,282

0, 1 0,082

85,04 1,224 1,467

0, 5 0,407

86,28 0,686 0,795

pp’ DDT

CA µg/mL

CR µg/mL

% R S CV

0, 05 0,030

78,76 0,740 0,939

0, 1 0,061

78,82 0,592 0,753

0, 5 0,303

79,01 0,225 0,285

DIELDRÍN

CA µg/mL

CR µg/mL

% R S CV

0, 05 0,046

85,64 1,059 1,236

0, 1 0,092

85,12 0,316 0,373

0, 5 0,457

85,19 0,747 0,876


50

ENDRÍN

CA µg/mL

CR µg/mL

% R S CV

0, 05 0,054

80,08 0,676 0,844

0, 1 0,106

80,92 0,622 0,778

0, 5 0,529

79,78 0,662 0,829

Tabla 18. Resultados de las pruebas de t de Student y de Cochran. Recobrado (%)

(n=15) CVR (%) Gexp < Gtab

(0,05:3:15) texp < ttab (0,05:3)

Lindano 85,62 0,59 0,4026 < 0,546 t exp= 0,86 t tab= 2,35

Aldrín 91,22 0,28 0,4520 < 0,546 t exp= 0,96 t tab= 2,35

Isodrín 85,64 0,59 0,4379 < 0,546 t exp= 0,76 t tab= 2,35

pp’ DDT 78,86 0,13 0,4034 < 0,546 t exp= 0,91 t tab= 2,35

Dieldrin 85,31 0,26 0,4532 < 0,546 t exp= 0,44 t tab= 2,35

Endrin 80,26 0,59 0,4864 < 0,546 t exp= 0,80 t tab= 2,35

CVR: coeficiente de variación del recobrado, Gexp: prueba de Cochran experimental, Gtab: prueba de Cochran tabulado.

Se demostró que para cada plaguicida órganoclorado el recobrado se encontró entre (70-110) %

acorde con lo establecido en la norma ISO/IEC 17025:2005 para este tipo de ensayos; con coeficientes

de variación del recobrado menor que el 2 % en todos los casos. Las pruebas de t de Student (P= 0,05,

g/l n-2) y de Cochran (P=0,05, k=3, n=15) demostraron que no hubo diferencias significativas entre el

recobrado medio y el valor aceptado como referencia. Estos resultados indicaron que el procedimiento

es exacto y se puede emplear para la cuantificación de estos plaguicidas órganoclorados en muestras

de hortalizas.

Especificidad

Este parámetro se refiere a la propiedad del método de producir una señal medible debida solo a la

presencia del analito, libre de interferencias de otros componentes, en la matriz de la muestra. En las

Figura 11, se representan los cromatogramas que resultaron del análisis de las muestras para el estudio

de la especificidad, en el procedimiento analítico para el análisis de los plaguicidas órganoclorados.


51

En los cromatogramas se observó que no existen señales de interferencias en los tiempos de retención

correspondientes a cada muestra de referencia analizada. Esto nos permitió plantear que el método es

específico para el análisis de estas sustancias.

Aire

A

n-hexano

B

Lindano

C

Aldrín

D

Figura 11. Cromatogramas del estudio de especificidad correspondiente a las muestras: A (aire), B (n-hexano), C (Lindano), D (Aldrín), E (Isodrín), F (pp’ DDT), G (Dieldrín) y H (Endrin).


52

Isodrin

E

pp’DDT

F

Dieldrin

G

Endrin

H

Figura 11. Continuación. Cromatogramas del estudio de especificidad correspondiente a las

muestras: A (aire), B (n-hexano), C (Lindano), D (Aldrín), E (Isodrín), F (pp’ DDT), G (Dieldrín) y H (Endrin).

Límite de detección y cuantificación

Los parámetros a definir al evaluar la sensibilidad de un método son los límites de detección y de

cuantificación.


53

Tabla 19. Límite de detección y cuantificación de los plaguicidas órganoclorados de referencia.

PLAGUICIDA

LMR (mg/Kg)4

LD (mg/Kg)

LC (mg/kg)

LINDANO 0,010 0,001 0,005

ALDRIN 0,050 0,010

0,025

ISODRIN 0,010 0,001

0,005

pp’ DDT 0,200 0,010

0,100

DIELDRIN 0,050 0,010

0,025

ENDRIN 0,050 0,020

0,025

LMR: Límite Máximo de Residuo, LD: Límite de Detección, LC: Límite de Cuantificación

Los valores de los límites de detección de todas las sustancias de referencia en el procedimiento

analítico en general oscilan entre 0,001 mg/kg para el Lindano y 0,01 mg/kg para el pp’ DDT, mientras

que los límites de cuantificación fluctuaron entre 0,005 mg/kg para el Lindano y 0,5 mg/kg para el resto

de las sustancias de referencia.

El intervalo analítico de aplicación (rango)

El rango de análisis para el método se presenta en la tabla 20.

Tabla 20. Rango de análisis para residuos órganoclorados en muestras de hortalizas.

PLAGUICIDAS LMR

(mg/Kg) Menor Conc. (mg/Kg) Mayor Conc. (mg/kg)

LINDANO 0,01 0,005 0,500

ALDRIN 0,05 0,025 0,500

ISODRIN 0,01 0,005 0,500

pp’ DDT 0,2 0,1 0,500

DIELDRIN 0,05 0,025 0,500

ENDRIN 0,05 0,025 0,500

LMR: Límite Máximo de Residuo


54

4.3. Aplicación del procedimiento propuesto en muestras de hortalizas en Ecuador

Se usó el método validado en muestras de hortalizas (zanahoria, tomate, col, brócoli y espinaca)

colectadas en el almacén de venta en la UFA ESPE, IASA 1, Sangolquí- Rumiñahui –Ecuador y se

cuantificó el contenido de plaguicidas órganoclorados expresando el resultado en mg/ Kg. Los

cromatogramas correspondientes a cada muestra, así como los resultados de la cuantificación de los

plaguicidas órganoclorados se presentan en la Figura 12 y la Tabla 20, respectivamente.

Se pudo observar que en todas las muestras analizadas la concentración de plaguicida órganoclorado

identificado se encuentran por debajo del límite máximo de residuo permitido4.

Figura 12. Cromatogramas correspondiente a la aplicación del procedimiento en las siguientes

muestras de hortalizas: A (zanahoria ), B (col ), C (brocolis), D (tomate ) y E (espinaca ).

A Zanahoria


55

B

Col

C

Brócoli


56

Tomate

C Espinaca

Figura 12. Continuación. Cromatogramas correspondiente a la aplicación del procedimiento en las

siguientes muestras de hortalizas: A (zanahoria ), B (col ), C (brocolis), D (tomate ) y E (espinaca ).


57

Tabla 20. Cuantificación de plaguicidas órganoclorados en muestras de hortalizas de la Hacienda el

Prado IASA 1 UFA ESPE.

PLAGUICIDA Zanahoria, mg/Kg Col, mg/Kg Brocoli, mg/Kg Tomate, mg/Kg Espinaca, mg/Kg

LINDANO 9,5 x 10 -6 1,0 x 10 -7

N/D 3,4 x 10 -7

N/D

ALDRIN N/D N/D N/D N/D N/D

ISODRIN N/D 8,2 x 10 -6 N/D N/D N/D

pp’DDT N/D 4,6 x 10 -5 8,5 x 10 -4 N/D N/D

DIELDRIN N/D 1,2 x 10 -4 N/D N/D N/D

ENDRIN N/D N/D N/D N/D 2,5 x 10 -4

N/D = No detectado

Dadas las características de la elevada liposolubilidad, persistencia por muchos años en el ambiente, el

uso indiscriminado por parte de algunos productores agrícolas irresponsables. En casos de intoxicación

u otra afectación a la salud humana y el medio ambiente, el LMA de la UFA ESPE dispone a partir de

los resultados de la presente tesis; de un procedimiento validado para la identificación y cuantificación

de plaguicidas órganoclorados (Lindano, Aldrín, Isodrín, pp’ DDT, Dieldrín y Endrin) en muestras de

hortalizas.

Costos

Se realizó una comparación en relación a los costos entre el método 1 empleado para la determinación

de residuos plaguicidas órganoclorados y el propuesto en este trabajo, los valores estimados en

dólares se presenta en la Tabla 21

Cabe resaltar que el método propuesto presenta ventajas en los costos por análisis, se emplea un

menor tiempo en el ensayo total de seis plaguicidas, esto sustenta el servicio analítico en el laboratorio

disminuyendo el impacto de inversión anual.

El costo promedio por el análisis de plaguicidas en laboratorios acreditados es de $200,00


58

Tabla 21. Comparación de los costos al aplicar los métodos 1 y el propuesto para la determinación de

residuos plaguicidas organoclorados en hortalizas.

Indicadores Materiales Método 1

Costo por

ensayo(dólares)

Método

(propuesto)

Costo por

ensayo(dólares)

Cantidad de

muestra

Hortalizas 50g 50 g

Acetonitrilo 150mL 35,4 150mL 35,4

n-hexano 620mL 50,0 200mL 16,0

Cloruro de

Sodio

8g 4,0 8g 4,0

Sulfato de

Sodio anhidro

50g 6,0 25gramos 3,0

Éter-Etílico 6mL 0,90 6 mL 0,90

Florisil 30g 30,0 3gramos 3,0

Tiempo de

ensayo

Salario del

analista

10 horas 75,0 4 horas 30,0

Total - - 201,3 - 92,3


59

CAPÍTULO 5

CONCLUSIONES

Conclusiones

__________________________________________________________________________________________

59

CAPÍTULO 5. CONCLUSIONES

1. Los métodos de extracción líquido-líquido y de purificación con fase sólida utilizando una

columna empacada con florisil, permitieron separar y concentrar los plaguicidas órganoclorados

(Lindano, Aldrín, Dieldrín, Endrin, Isodrín y pp’ DDT) de las muestras de hortalizas (tomate, col,

brócoli, zanahoria y espinaca) dopadas y sin dopar; en un período de tiempo menor que el

reportado en el método 1 de referencia, implementado en el Instituto de Investigaciones de

Sanidad Vegetal, La Habana, Cuba.

2. Se desarrolló un método de cromatografía de gases capaz de separar, identificar y cuantificar

los plaguicidas órganoclorados: Lindano, Aldrín, Dieldrín, Endrin, Isodrín y pp’DDT, en el que se

utilizó una columna Elite de última generación con un mayor contenido de metil-fenil

polisiloxano y se obtuvo una mejor resolución en las señales cromatográficas al comparar el

procedimiento con el método 1 de referencia.

3. La Universidad de las Fuerzas Armadas de Ecuador (UFA ESPE) dispone de un procedimiento

de cromatografía de gases validado (específico, lineal, preciso y exacto) y adecuado a las

condiciones del Laboratorio de Medio Ambiente de la UFA ESPE para la cuantificación de

plaguicidas órganoclorados en muestras de hortalizas. Permitiendo a la universidad auto

gestionar recursos económicos a través de la prestación de servicios a la comunidad y a las

asociaciones de productores de hortalizas, contribuyendo a la comercialización de productos

agrícolas seguros para el consumo de la población.

4. El procedimiento analítico desarrollado se aplicó en muestras de hortalizas (zanahoria, tomate,

col, brócoli y espinaca) colectadas en el almacén de venta en la UFA ESPE, IASA 1, Sangolquí-

Rumiñahui –Ecuador para cuantificar el contenido de plaguicidas órganoclorados, obteniendo

en todas las muestras analizadas un valor de concentración de plaguicidas por debajo del límite

máximo de residuo permitido.

CAPÍTULO 6

RECOMENDACIONES

Recomendaciones

__________________________________________________________________________________________

60

CAPÍTULO 6. RECOMENDACIONES

Extender el estudio del método, para la determinación de estos plaguicidas en otras matrices y

contribuir al plan del Programa de Vigilancia y Control de Residuos de Plaguicidas en

Productos Agrícolas para la exportación y el consumo.

Estimar la incertidumbre de la medición.

CAPÍTULO 7

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Referencias Bibliográficas

__________________________________________________________________________________________

61

CAPÍTULO 7. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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ANEXOS

ANEXO 1

Fundamentos estadísticos

La desviación estándar es el promedio de desviación de las puntuaciones con respecto a la media. Esta medida es expresada en las unidades originales de medición de la distribución. Se interpreta en relación a la media. Cuanto mayor es la dispersión de los datos alrededor de la media, mayor es la desviación estándar. Se simboliza como: “s” o la letra minúscula griega sigma (σ) y su fórmula esencial es:

La varianza La varianza es la desviación estándar elevada al cuadrado y se simboliza como: S2. Es un concepto estadístico sumamente importante, ya que muchas de las pruebas cuantitativas se fundamentan en él. Diversos métodos estadísticos parten de la descomposición de la varianza. Sin embargo, para fines descriptivos se utiliza preferentemente la desviación estándar.

Regresión lineal Definición: Es un modelo matemático para estimar el efecto de una variable sobre otra. Está asociado con el coeficiente r de Pearson. Hipótesis a probar: Correlacionales y causales. Variables involucradas: Dos. Una se considera como independiente y otra como dependiente. Pero para poder hacerlo debe tenerse un sólido sustento teórico. Nivel de medición de las variables: Intervalos o razón. Procedimiento e interpretación: La regresión lineal se determina en base al diagrama de dispersión. Éste consiste en una gráfica donde se relacionan las puntuaciones de una muestra en dos variables.

Prueba “t” Definición: Es una prueba estadística para evaluar si dos grupos difieren entre sí de manera significativa respecto a sus medias. Se simboliza: t Hipótesis a probar De diferencia entre dos grupos. La hipótesis de investigación propone que los grupos difieren significativamente entre sí y la hipótesis nula propone que los grupos no difieren significativamente. Variable involucrada: La comparación se realiza sobre una variable. Si hay diferentes variables, se efectuarán varias pruebas “t” (una por cada variable). Aunque la razón que motiva la creación de los grupos puede ser una variable independiente. Por ejemplo: un experimento con dos grupos, uno al cual se le aplica el estímulo experimental y el otro grupo el de control. Nivel de medición de la variable: Intervalos o razón.

Interpretación: El valor “t’ se obtiene en muestras grandes mediante la fórmula:

Donde 1 es la media de un grupo, 2 es la media del otro grupo, es la desviación estándar del primer grupo elevada al cuadrado, N1 es el tamaño del primer grupo, es la desviación estándar del segundo grupo elevada al cuadrado y N2 es el tamaño del segundo grupo. En realidad, el denominador es el error estándar de la distribución muestral de la diferencia entre medias. Para saber si el valor “t” es significativo, se aplica la fórmula y se calculan los grados de libertad. Análisis de varianza unidireccional Definición: Es una prueba estadística para analizar si más de dos grupos difieren significativamente entre sí en cuanto a sus medias y varianzas. La prueba “t” es utilizada para dos grupos y el análisis de varianza unidireccional se usa para tres, cuatro o más grupos. Y aunque con dos grupos, el análisis de varianza unidireccional se puede utilizar, no es una práctica común. Hipótesis a probar: De diferencia entre más de dos grupos. La hipótesis de investigación propone que los grupos difieren significativamente entre sí y la hipótesis nula propone que los grupos no difieren significativamente. Variables involucradas: Una variable independiente y una variable dependiente.

FOTOGRAFIAS DEL TRABAJO

Granja de la Universidad de las Fuerzas Armadas - IASA 1 - ( 2013)

Se pesa 50 g de Muestra (la fotografía corresponde a una muestra de zanahoria)

Extracción Líquido -Líquido

Proceso de extracción con n-Hexano

Proceso de separación

Concentración de los extractos de plaguicidas, empleando el rota evaporador

Purificación del Extracto empleando columnas empacadas de fase Solida (Florisil)

Línea base en la cromatografía de gases

Desarrollo de un procedimiento analítico para...

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