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DETECCIÓN DE ELEMENTOS GENÉTICOS QUE LE CONFIEREN

RESISTENCIA A ANTIBIÓTICOS A CEPAS DE Aeromonas spp.

PROYECTO SIP 20070736

RESUMEN

El presente trabajo tuvo como objetivo determinar la presencia de elementos

genéticos relacionados con la adquisición de resistencias antimicrobianas en cepas

de Aeromonas spp. aisladas de pacientes con cuadros diarreicos. Las especies

identificadas fueron A. caviae, A. hydrophila, A. veronii y A. media, siendo la más

frecuente A. caviae. Todas las cepas ensayadas fueron resistentes a ampicilina,

característica de la mayoría de las especies de este género. Se encontraron cepas

resistentes a cloranfenicol, tetraciclina, trimetoprim sulfametoxazol, ácido

nalidíxico y estreptomicina, entre otros. Además de la resistencia a antibióticos

todas las cepas soportaron una concentración de 10µg/mL HgCl2, mientras que el

50% (22/41) de las cepas fueron capaces de crecer en presencia de 50 µg/mL. Se

encontró DNA plasmídico en el 32% (13/41) de las cepas, A. caviae es la especie

donde la frecuencia de plásmidos fue mayor. Se detectaron integrones clase 1, con

diferentes genes cassette, que confieren resistencia a trimetoprim (dhfr12, dhfr15,

dfr2d), estreptomicina/espectinomicina (aadA2, aadA1), oxacilina (oxa2),

cloranfenicol (catB3, cmlA4) y un marco de lectura abierto (orfD). En este trabajo se

detectaron los genes tet A, E, y B; la especie que presentó la mayor incidencia de

genes tet es A. caviae, seguida de A. hydrophila y A. veronii. Adicionalmente se

detectó el Tn1721 en 4 cepas. No se encontró Tn5393 completo, en ninguna de las

cepas estudiadas, ya que sólo se detectó el gen de la transposasa, y no se

amplificaron los genes strA-B comúnmente asociados a este transposón.

Empleando el amplicón de los genes strA-B como sonda en una hibridación de alta

astringencia, se detectó una cepa que contenía un gen homólogo, mientras que se

encontraron dos cepas con genes de alta homología. La presencia de elementos de

resistencia con características similares a los encontrados en una gran variedad de

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bacterias de diferentes orígenes, sugiere la movilidad horizontal de estos

elementos.

INTRODUCCIÓN

Durante los últimos años ha aumentado la resistencia en diferentes especies

bacterianas a los antimicrobianos, y el género Aeromonas no es caso excepcional,

observándose un auge en su resistencia en diferentes partes del mundo. En

Aeromonas spp. algunos genes de resistencia están codificados en diferentes

elementos genéticos. Entre la resistencia a antibióticos relacionados con elementos

genéticos en Aeromonas spp. se encuentran: cloranfenicol,

trimetoprim/sulfametoxasol, tetraciclina, estreptomicina, ácido nalidíxico y sulfas.

Sin embargo, la resistencia a los diferentes antibióticos está claramente

influenciada por factores geográficos y socioeconómicos (Schmidt y cols., 2001a;

Goñi-Urriza y cols., 2000; Casas y cols., 2005; Sørum y cols., 2003; L´Abbed y

Sørum, 2000).

Las especies reportadas en diversos trabajos las cuales presentan elementos

genéticos son A. hydrophila, A. salmonicida, A. encheleia, A. icthiosmia, A. sobria, A.

media, A. veronii, A. bestiarum y A. caviae todas aisladas de muestras ambientales,

sin embargo no hay reportes de dichos elementos en cepas de origen clínico. Las

cepas de A. hydrophila, A. caviae, A. veronii y A. bestiarium causan mas infecciones en

el hombre lo cual sugiere que en cepas de origen clínico se podrían encontrar

también elementos genético. Aguilera-Arreola y cols., (2005) reporta que las cepas

de Aeromonas se pueden agrupar con base en su origen de aislamiento, lo cual

sugiere que las diferentes poblaciones pueden ocupar un nicho diferente y se

observa una distribución diferente de los genes de virulencia según el origen de la

bacteria, con ello podríamos encontrar diferencias en los elementos genéticos y los

genes de resistencia con respecto de las cepas de origen ambiental.

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De hecho la transferencia “in vivo” e “in vitro” de marcadores de resistencia entre

diferentes especies de Aeromonas se ha demostrado. Trabajos realizados

recientemente en México demuestran la conjugación in vitro de A. hydrophila y A.

salmonicida aisladas de pescado (Vázquez-Ocampo, 2005). Bello-López, (2007)

demostró la conjugación in vivo de A. hydrophila y A. salmonicida, esta transferencia

de material genético se llevó a cabo en peces.

Por lo que hay suficiente evidencia para indicar que Aeromonas representa un

problema de salud pública: 1) la aparición de cepas resistentes a múltiples

antibióticos, que son capaces de transferir o capturar genes que le confieren

ventajas para el establecimiento en diferentes nichos, 2) la existencia de reservorios

en diferentes nichos donde pueda darse intercambio de material genético, 3)

diseminación para que estas bacterias resistentes se transmitan del humano vía el

medio ambiente; es necesario monitorear si las cepas aisladas de muestra clínicas

poseen elementos genéticos con genes de resistencia.

JUSTIFICACIÓN:

Las Aeromonas son consideradas actualmente patógenos emergentes y se han

aislado como agentes etiológicos de varios procesos infecciosos siendo el más

frecuente la gastroenteritis. Los cuadros diarreicos causados por Aeromonas son

autolimitados, por lo que de manera habitual el tratamiento no requiere el uso de

antibióticos. Sin embargo, durante los últimos años ha aumentado la resistencia en

diferentes especies bacterianas y el género Aeromonas no es caso excepcional,

observándose un auge en su resistencia en diferentes partes del mundo.

En Aeromonas algunos genes de resistencia pueden estar localizados en elementos

genéticos tales como plásmidos, transposones o integrones por ello la evolución y

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diseminación tanto de las bacterias como de los elementos genéticos relacionados

con la transferencia de resistencia es un aspecto importante a estudiar,

especialmente porque no se tiene este tipo de información en cepas asociadas a

cuadros diarreicos en humanos.

HIPÓTESIS Si las especies del género Aeromonas spp. aisladas de origen clínico poseen

elementos genéticos que codifican para resistencias a diversos antibióticos se

explicaría la constante aparición de cepas resistentes a una amplia variedad de

antibióticos. Además, la transferencia de dichos elementos entre una misma

especie y entre especies diferentes facilitaría la diseminación de éstos y por

consiguiente las resistencias codificadas en los elementos

OBJETIVOS

• Objetivo general Detectar y caracterizar los elementos genéticos de resistencia a antibióticos

encontrados en cepas de Aeromonas spp. provenientes de pacientes con diarrea.

• Objetivos particulares

Identificar bioquímicamente las cepas a nivel de género.

Identificar genéticamente cepas de Aeromonas spp. provenientes de muestras

clínicas con base al protocolo del análisis de los patrones RFLPs del gen 16S

rDNA para determinar la especie.

Obtener el perfil plasmídico de las cepas.

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Detectar elementos genéticos que codifican para resistencias a antibióticos

mediante la reacción en cadena de la polimerasa.

Determinar si existe correlación de los resultados obtenidos entre las

resistencias antimicrobianas y la presencia de los elementos genéticos.

MATERIAL Y MÉTODOS

Se analizaron 45 cepas de Aeromonas spp. de origen clínico aisladas de pacientes

que presentaban cuadros diarreicos en el estado de Hidalgo, México aisladas en el

transcurso de los meses julio-octubre del 2005.

En este trabajo se emplearon las siguientes cepas de referencia y cepas tipo:

A. hydrophila ATCC 7966 (839 CECT) a

A. salmonicida subsp. salmonicida 718 con el plásmido pRAS1 (integrón clase 1,

transposón 1721) b

E. coli C600 con tn5393 transposado en el plásmido pGEM-3ZF(+) c

E. coli K-12 NC 50078-02 [gen tet(A)] e

E. coli K-12 NC 50019 [gen tet(B)] e

E. coli K-12 NC 50270-01 [gen tet(C)] e

E. coli K-12 J53-1 RA1 NC 50073-02 [gen tet(D)] e

E. coli HB 101 pSL 1456 NC 50273-01 [gen tet(E)] e

E. coli V517 (diferentes plásmidos) f

E. coli con el plásmido pSa (integrón clase 1) f

Cepas proporcionadas por los doctores: a Graciela Castro Escarpulli, Escuela

Nacional de Ciencias Biológicas. b Glen Rhodes Centre for Ecology & Hydrology

Lancaster, Reino Unido. c Trine L´Abee-Lund, Noruegan School of Veterinary

Medicine . e Nahid Karami, Goteborg University, Suecia. f Everardo Curiel

Quesada, Escuela Nacional de Ciencias Biológicas.

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MANEJO Y CONSERVACIÓN DE CEPAS Las cepas de trabajo se conservaron a largo plazo a -70°C en criotubos que

contenían glicerol al 40%. Para recuperar las cepas se tomó un inóculo de cada

criotubo, y se sembró por estría cruzada en cajas de medio Luria con ampicilina

(100 µg/mL) y se incubaron a 37ºC durante 24 h.

IDENTIFICACIÓN BIOQUÍMICA

Antes de llevar a cabo la identificación genética se confirmó su pertenencia al

género Aeromonas con base en las siguientes pruebas:

Gram, Oxidasa, Crecimiento a 3 y 6% de NaCl, producción de ácido del inositol y

utilización de la glucosa por vía oxidativa o fermentativa.

IDENTIFICACIÓN GENÉTICA

La identificación genética se realizó con base en el análisis de los patrones RFLPs

del gen 16S rDNA propuesto por Borrel y cols., 1997 y Figueras y cols., 2000 (Fig 4).

EXTRACCIÓN DE DNA TOTAL.

1. Se obtuvo un cultivo líquido de 18 a 24 h de la bacteria deseada.

2. En un tubo para microcentrífuga, se colocó 1.5 mL de cultivo, se centrifugó 1

min, se descartó el sobrenadante.

3. Se adicionaron 500 µl de TE (50/20), se resuspendieron las bacterias, se

centrifugó 1 min, se descartó el sobrenadante.

4. Se adicionaron 175 µl de TE (50/20), se resuspendieron las bacterias.

5. Se agregaron 5 µl de proteinasa K (20 mg/mL) y 20 µl de SDS al 10%, se

agitaron cuidadosamente para mezclar e incubar a 56º C por 1 ó 2 h.

6. Se adicionaron 500 µl de TE (10/1) y 20 µl de NaCl 5M, se agitó

cuidadosamente.

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7. Se realizaron dos extracciones con fenol, agregando 500 µl al tubo, agitando

con cuidado (15 min de preferencia en un dispositivo rotatorio) para

mezclar lo mejor posible y centrifugar por 10 min.

8. Se realizó una extracción con 500 µl de cloroformo: alcohol isoamílico (24:1),

agitando cuidadosamente y centrifugando 2 min. Se separó la fase acuosa.

9. Se agregó un volumen de 500 µl de isopropanol, se agitó por inversión y se

centrifugó por 30 seg. Descartar el sobrenadante.

10. El DNA se enjuagó con 1mL de etanol al 70%, se centrifugó 30 segundos y se

descartó el sobrenadante para posteriormente secarlo a 65º C y disolverlo en 200 ó

400 µl de agua destilada, desionizada estéril.

AMPLIFICACIÓN MEDIANTE PCR DEL GEN 16S rDNA.

Para la amplificación mediante PCR del gen 16S rDNA, se sometieron a la

amplificación aproximadamente 200-300 ng del DNA genómico, en un volumen

final de 50 µl. La mezcla de reacción contenía: Tris-HCl 20 mM (pH8.4), KCl 50

mM, MgCl2 1.5 mM, desoxirribonucleósidos trifosfato dNTP´s (dATP, dCTP, dGTP

y dTTP ) 0.3 mM de cada uno, iniciadores 0.3 µM de cada uno y 2.5 U de Taq

polimerasa. Las condiciones para cada ciclo de reacción fueron: 96°C durante 5 min

(desnaturalización), 94°C durante 1 min (desnaturalización), 56°C durante 1 min

(hibridación), 72°C durante 1.30 min (extensión), estas condiciones se repitiero n

por 35 ciclos y al finalizar se efectuó una última extensión a 72°C durante 5 min.

Las secuencias de los iniciadores empleados para este propósito se muestran en el

siguiente cuadro.

Iniciadores empleados para la amplificación del gen 16S rDNA.

Tomado de Borrel y cols., 1997; Figueras y cols., 2000

Región Amplificada

Secuencia 5 -́3´ Tamaño del amplicón

16S rDNA FW: 5´ AGA GTT TGA TCA TGG CTC A 3 RV:5´ GGT TAC CTT GTT ACG ACT T 3 1502 pb

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RESTRICCIÓN DEL AMPLICÓN DEL GEN 16S rDNA.

Previamente a la digestión se procedió a la purificación del amplificado empleando

el kit de purificación “High Pure PCR Product” (ROCHE). El producto resultante

de la limpieza se sometió a la digestión enzimática doble (AluI y MboI), se preparó

una mezcla la cual contiene 12 µl del fragmento amplificado, 1 µl del regulador de

digestión (10x), 5U Alu I y 5U de la enzima Mbo I, adicionando agua para un

volumen final de 20 µl, la mezcla se incubó a 37°C durante toda la noche.

Los fragmentos polimórficos, se separaron mediante electroforesis en geles de

poliacrilamida al 17% a 80 V durante 6 horas. Al término del tiempo se tiñeron los

geles durante 30 min con bromuro de etidio (0.5 µg/mL) y se visualizaron en un

documentador de geles con luz ultravioleta. Las fotografías de los PCR-RFLP

obtenidas de las digestiones dobles con las enzimas Alu I y Mbo I fueron

comparadas con los patrones para las cepas ti po de cada una de las especies

DETERMINACIÓN DE LA SENSIBILIDAD A ANTIMICROBIANOS

Se determinó el grado de resistencia de las cepas de Aeromonas spp. a diversos

agentes antimicrobianos, por el método de difusión en agar siguiendo las

indicaciones del CLSI 2007 ( antes NCCLS).

1. Al menos 3 a 5 colonias bien aisladas se seleccionaron de un medio de cultivo.

El crecimiento se transfirió a un tubo con 4 a 5 mL de caldo Mueller-Hinton. El

caldo de cultivo se incubó a 37ºC hasta que alcanzó la turbidez del estándar de

0.5 McFarland (usualmente 2 a 6 h). Esto resulta en una suspensión que

contiene aproximadamente 1 a 2 x 108 UCF/mL.

2. Se sembraron placas de agar Mueller-Hinton usando un hisopo a partir de la

suspensión ajustada en varias direcciones.

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3. Se dejaron reposar las placas cinco min a temperatura ambiente para que secara

el inóculo.

4. Los sensidiscos se dispensaron sobre la superficie del agar. Cada disco debe ser

presionado para asegurar contacto pleno con la superficie del agar. Ya sea que

el disco se ponga individualmente o con un dispensador, deben ser distribuidos

en forma uniforme y no deben quedar a menos de 24 mm de distancia entre

centros. No más de 12 discos se deben poner por placa de 150 mm o no más de

5 en placas de 100 mm. Debido a que algunas drogas difunden casi

instantáneamente, un disco no debe ser relocalizado una vez que haya tomado

contacto con la superficie del agar.

5. Las placas se incubaron a 37ºC durante 24 h.

6. Se midieron los halos de inhibición en mm por el fondo de la placa y se

interpretaron los diámetros de las zonas de inhibición de las cepas para

determinar las categorías de susceptibles, intermedio y resistente según los

estándares de interpretación.

EXTRACCIÓN DE DNA PLASMÍDICO (TÉCNICA DE BIRNBOIM Y DOLY

MODIFICADA).

La técnica consiste en una lisis alcalina y se basa en el intervalo de pH estrecho que

existe de 12.0 a 12.5, dentro del cual hay ruptura y desnaturalización del DNA

cromosomal generándose al renaturalizarse, una masa de DNA lineal la cual se

puede separar por centrifugación (Birnboim y Doly, 1979). El procedimiento se

desarrolló como sigue (Sambrook, 1989):

1. De un cultivo puro de 24 h de crecimiento se seleccionaron de 4 ó 5 colonias,

se sembraron en 10 mL de caldo Luria y se incubaron a 37°C en agitación

durante 18 h.

2. Se pasaron 1.5 mL del cultivo a tubos de 2 mL y se centrifugó a 12 000 rpm

durante 5 min, posteriormente se eliminó el sobrenadante.

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3. Se resuspendió el paquete celular con 100 µl de solución TEG (trisma - HCl

25 mM pH 8, EDTA 10 mM, glucosa 50 mM).

4. Se mezcló y se dejó 5 min a temperatura ambiente.

5. Se adicionó un volumen de 200 µl de la solución de lisis (NaOH 0.2N - SDS

1%) y se colocaron inmediatamente en hielo durante 5 min.

6. Se precipitó el DNA cromosomal y las proteínas con 150 µl de acetato de

potasio 3 M, pH 4.8 y se colocaron en hielo durante 5 min.

7. El tubo se centrifugó a 12 000 rpm durante 5 min.

8. Se tomaron 400 µl del sobrenadante y se transfirieron cuidadosamente a un

tubo limpio.

9. Se adicionaron 200 µl de cloroformo-fenol saturado con Tris pH 7.8.

10. Se centrifugó a 12 000 rpm durante 5 min, se separó la fase acuosa en un

tubo limpio.

11. Se precipitó el DNA de la fase acuosa con un volumen igual de isopropanol

y se mezcló en un Vortex.

12. Se centrifugó a 12 000 rpm por 5 min.

13. Se decantó e invirtió el tubo sobre un papel secante y se dejo secar a

temperatura ambiente.

14. El botón se resuspendió en 50 µl de solución reguladora TE (Tris-HCL 50

mM - EDTA 10 mM, pH 8).

DETECCIÓN DE GENES ASOCIADOS A INTEGRONES

La presencia de integrones de clase 1 se puso de manifiesto mediante la detección

de los genes que forman parte de dichos elementos por la técnica de PCR, bajo las

condiciones descritas previamente por Zhang y cols., 2004. Para la detección de la

región variable se empleó un par adicional de iniciadores, diseñados en este

trabajo.

Para la reacción de PCR se sometieron a la amplificación 5µl (200-300 ng) del DNA,

25 µl de Master Mix (eppendorff), 5 µl (10 pmol/µl) de cada iniciador, en un

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volumen final de 50 µl. Las condiciones para cada ciclo de reacción programada

para el gen int1 fueron: 94°C durante 5 min, 94°C durante 30 seg

(desnaturalización), 50°C durante 30 seg (alineamiento), 72°C durante 1.5 min

(extensión), estas condiciones se repitieron por 30 ciclos y al finalizar se efectuó

una última extensión a 72°C durante 7 min. Para el gen variable I y qacEA1/Sul1 se

modificó la temperatura de alineación y el tiempo de la polimerización entre 52-

56ºC y 1-2 min respectivamente. Para la amplificación de la región variable II, la

temperatura de alineamiento fue de 68°C y se empleo la enzima Vent polimerasa

(New England).

Iniciadores utilizados para la detección de genes asociados a integrones.

Gen Iniciadores

(5´? 3´) No de Acceso

(GenBank) Amplicón (pb)

Int FW: GTTCGGTCAAGGTTCTG RV: GCCAACTTTCAGCACATG Y18050 923

Var I FW: GGCATACAAGCAGCAAGC RV: AAGCAGACTTGACCTGAT U12338 Variable

Var II FW: GCA ACT GGT CCA GAA CCT TG RV: GAT TAT GAC AAC GGC GGA AG AJ517790 Variable

qacEA1 Sul1

FW: ATC GCA ATA GTT GGC GAA GT RV: GCA AGG CGG AAA CCC GCG CC

X15370 X12869

800

CARACTERIZACIÓN DE INTEGRONES

Determinar el tamaño de la región variable y secuenciar los fragmentos de interés

para conocer que genes de resistencia se encuentran integrados.

Restricción del amplicón de la región variable

Previamente a la digestión se procedió a la purificación del amplificado empleando

el sistema de purificación “High Pure PCR Product” (ROCHE).

El producto resultante de la limpieza se sometió a la digestión enzimática con cinco

ezimas (AluI, MboI, HindIII, HinfI, MspI), se preparó una mezcla la cual contiene 10

µl del fragmento amplificado, 2.5 µl del regulador de digestión (10x), 5U de la

enzima, adicionando agua para un volumen final de 25 µl, la mezcla se incubó a

37°C durante toda la noche. Los fragmentos polimórficos, se separaron mediante

12

electroforesis en geles de poliacrilamida al 17% a 70 V durante 8 h. Al término del

tiempo se tiñeron los geles durante 30 min con bromuro de etidio (0.5 µg/mL) y se

visualizaron en un documentador de geles con luz ultravioleta.

Los patrones de los PCR-RFLP obtenidos de las digestiones fueron comparados

para saber si los fragmentos de la región variable son iguales. Se eligió un

amplificado de cada perfil de restricción para la secuenciación.

Secuenciación Los amplificados de la región variable se purificaron empleando la enzima agarasa

(Fermentans). El fragmento se corrió en un gel de agarosa de bajo punto de fusión,

se cortó la banda, la cual se incubó junto con la enzima ß-Agarasa I (1U/ 200 µl de

agarosa fundida) a 42°C, por 1 h. Posteriormente se centrifugó por 15 min a 12,000

rpm, para eliminar cualquier fragmento remanente, el sobrenadante se transfirió a

un tubo limpio y se precipitó con isopropanol. El DNA se lavó con etanol al 70%,

se centrifugó y se secó para luego resuspenderlo en 50 µl de agua.

El amplificado de la región variable se envió al servicio de secuenciación para

obtener dos diferentes secuencias una con el iniciador forward y otra con el reverse.

Las secuencias fueron visualizadas en el programa “Chromas”, cada una de las

secuencias obtenidas se sometió a una búsqueda de secuencias similares en la base

de datos del “GenBank” mediante un análisis BLAST

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/), para encontrar las secuencias

emparentadas, posteriormente se realizó un alineamiento de secuencias en el

programa Vector NTI V9.

DETECCIÓN DE GENES ASOCIADOS A TRANSPOSONES

La detección de genes asociados a transposones se realizó empleando la técnica de

PCR. Los iniciadores empleados para la detección de estos elementos se diseñaron

en el presente estudio por medio de un análisis de secuencias empleando el

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programa Vector NTI y utilizando iniciadores reportados en la literatura por Han y

cols. 2004.

Las condiciones de reacción programadas fueron: 94°C durante 2 min, 94°C

durante 30 seg (desnaturalización), 58°C durante 30 seg (alineamiento), 72°C

durante 30 seg (extensión), estas condiciones se repitieron por 30 ciclos y al

finalizar se efectuó una última extensión a 72°C durante 10 min. Para la reacción de

PCR se sometieron a la amplificación 5 µl (200-300 ng) del DNA, 25 µl de Master

Mix, 5µl (10 pmol/µl) de cada iniciador, en un volumen final de 50 µl.

Iniciadores utilizados para la detección de genes asociados a transposones.

tnp A= gen que codifica para la transposasa

DETECCIÓN DE DETERMINANTES tet (para las cepas resistentes a

tetraciclina).

Los genes que codifican la resistencia a tetraciclina (tet A-E) fueron detectados por

medio de la PCR utilizando condiciones e iniciadores establecidos por Schmidt y

cols., 2001; Guardabasi y cols. 2000. Para la reacción de PCR se sometieron a la

amplificación 5 µl (200-300 ng) del DNA, 25 µl de Master Mix (eppendorf), 5 µl (10

pmol/µl) de cada iniciador, en un volumen final de 50µl.

Iniciadores empleados en la detección de determinantes tet clases A, B, C, D y E.

Clase Iniciadores (5´? 3´)

Amplicón (pb)

A FW: GTA ATT CTG AGC ACT GCT GC RV: CTG CCT GGA CAA CAT TGC TT 937

Gen Iniciadores (5´? 3´) Amplicón (pb) Transposon

tnpA FW: GGA ACG ATG ACG GAT TTC AA RV: ATC CCT TGA TCG TGG CAT AG 607 Tn1721

tetA FW: GTA ATT CTG AGC ACT GCT GC RV: CTG CCT GGA CAA CAT TGC TT 937 Tn1721

tnpA

FW: CCAGAAGGTGTGGGTGTTTGT RV: GCTCGTCTCGCTGTGCCATT

339 Tn5393

str A-B FW: GGAACTGCGTGGGCTACA RV: GCTAGATCGCGTTGCTCCTCT 303 Tn5393

14

B FW: CTC AGT ATT CCA AGC CTT TG RV: CTA AGC ACT TGT CTC CTG TT 416

C FW: TCT ACC AAT GCG CTC ATC GT RV: GGT TGA AGG CTC TCA AGG GC 588

D FW: ATT ACA CTG CTG GAC GCG AT RV: CTG ATC AGC AGA CAG ATT GC 1123

E FW: GTG ATG ATG GCA CTG CTG AT RV: CTC TGC TGT ACA TCG CTC TT 1199

Schmidt y cols., 2001; Guardabasi y cols., 2000

Condiciones para la amplificación de los genes tet

tet A,B,C,D, E

Etapa Temperatura (oC)

Tiempo Ciclos

Desnaturalización inicial 95 5 min

Desnaturalización 95 30 seg Alineamiento 56-62 30 seg

Extensión 72 45 seg

30

Extensión final 72 7 min

Todos los productos de PCR obtenidos fueron analizados por electroforesis en

geles de agarosa teñidos posteriormente con bromuro de etidio.

HIBRIDACIÓN SOUTHERN PARA LA DETECCIÓN DE LOS GENES strA-B.

Se empleo la técnica de hibridación para descartar falsos negativos en la detección

de los genes strA-B mediante PCR. La hibridación se llevo acabo en cepas donde se

detectó la transposasa del Tn5393.

Preparación de la membrana de Nylon para la hibridación

La membrana de nylon (sin carga) fue sumergida en agua desionizada y

posteriormente en el regulador de transferencia (10X SSC) por 10 minutos. En la

membrana se colocaron 2 µl de la muestra del DNA previamente desnaturalizado.

Posteriormente se fijo con luz U.V por 2 minutos y se procedió a la prehibridación.

Hibridación

Para llevara acabo el marcaje de la sonda y la hibridación se empleo el Ki t Dig

High Prime DNA Labeling And Detection Starker Kit II (ROCHE):

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1. El marcaje de la sonda (producto de PCR str A-B) fue con Digoxigenina-11-

dUTP (DIG-High Prime).

2. Se llevó acabo la prehibridación a 42º C por 30 min (DIG Easy Hyb).

3. Posteriormente se hibrido a 68º C por 4 h (DIG Easy Hyb + sonda).

4. Se realizaron 2 lavados de baja astringencia con SDS 0.1 % - SSC 2X por 5

min a temperatura ambiente y 2 de alta astringencia con SDS 0.1 % - SSC

0.5X por 15 min a 68º C.

5. La membrana se incubó por 30 min en solución de bloqueo y

posteriormente se adicionó el anticuerpo.

6. Se realizaron 2 lavados con el regulador de lavado

7. Se equilibro la membrana con el regulador de detección y se adicionó CSPD

para revelar, posteriormente la membrana fue expuesta a una placa

radiográfica para evidenciar la hibridación por quimioluminiscencia.

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RESULTADOS Meta 1.- Demostración de la presencia de integrotes tipo I

La presencia de integrones de tipo 1 se puso de manifiesto mediante la detección

de los genes que forman parte de dichos elementos por la técnica de PCR. Todo el

elemento se amplificó en tres partes, primero se amplificó la región 5´del gen de la

integrasa, en segundo lugar se amplificó parte de los genes sul 1 y qacEA 1 que

forman la región 3´CS y por último se amplificó la región variable de aquellas

cepas que presentaron únicamente la región 5 y 3´CS.

El gen de la integrasa fue detectado en 16 cepas de las 41 cepas que fueron

sometidas a la búsqueda, el resultado de esta amplificación fue un fragmento de

923 pb como se observa en la siguiente figura.

De estas 16 cepas sólo 10 presentaron la región 3´CS donde se amplificó un

fragmento de 800 pb como lo muestra la figura siguiente.

1 2 3 4

923 pb 1000

500

100

Producto de amplificación del gen de la integrasa clase 1. Carril 1 Marcador de peso molecular Roche IX. Carril 2 A. hydrophila 839 testigo negativo Carril 3. A. salmonicida 718 (pRAS1) testigo positivo. Carril 4 E. coli (pSa) 185 testigo positivo. Carriles 5-7 cepas problema de Aeromonas spp.

1 2 3 4 5 6 7

17

La búsqueda de la región variable se realizó con los iniciadores var I, en las 9 cepas

que presentaron ambas regiones conservadas. Sin embargo, sólo 3 cepas

presentaron un fragmento de tamaño variable, se obtuvieron bandas de

aproximadamente 800 y 1500.

En las cepas restantes se emplearon los iniciadores var II, que amplifican un

fragmento ligeramente mayor de la región variable, se logró amplificar a las 6

Producto de amplificación de la región 3´CS del integrón clase 1. Carril 1 Marcador de peso molecular Roche IX. Carril 2 A. hydrophila 839 testigo negativo Carril 3. A. salmonicida 718 (pRAS1) testigo positivo. Carril 4 E. coli 185 (pSa) testigo positivo. Carriles 5-14 cepas problema de Aeromonas spp.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

1353 1078 872 603 310

800 pb

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

1 2 3 4 5 6 7 8 9

1353 1078 872 603 310 pb

Productos de amplificación de la región variable con los iniciadores var I. Carril 1 Marcador de peso molecular Roche IX. Carril 2 A. hydrophila 839 testigo negativo Carril 3. A. salmonicida 718 (pRAS1) testigo positivo. Carril 4 E. coli 185 (pSa) testigo positivo. Carriles 5-9 cepas problema de Aeromonas spp.

750 1510 1810 1147 1810 Tamaño de la banda (pb)

718 185 6479 3539 3430 Número de cepa

18

cepas restantes donde se obtuvieron bandas entre 1200 y 3200 pb, excepto en una

cepas donde se observó una banda de 300 pb (siguiente figura) lo que indica que el

integrón esta descargado, es decir, que no hay “cassettes” insertados, en una cepa

donde no se obtuvo amplificado.

Los amplificados de la región variable muestran bandas de mismo tamaño, estos

amplificados se sometieron a una restricción para verificar si esta región es igual en

las diferentes cepas.

Las cepas presentaron patrones característicos con las restricciones como se

observan en las tres siguientes figuras por lo que se dedujo que la región variable

en las cepas que presentaron un amplificado del mismo tamaño fue la misma.

Para conocer que “cassettes” estaban integrados, se seleccionaron clonas de cada

uno de los patrones de restricción. Se secuenciaron los amplificados de la región

variable, para cada cepa se obtuvieron dos secuencias, una secuencia con el

iniciador forward y otra con el reverse. A partir de las secuencias nucleotídicas

Productos de amplificación de la región variable con los iniciadores var II. Carri1 1 y 12 Marcador de peso molecular Roche II. Carril 2-11 cepas problema de Aeromonas spp. (S/A sin amplificado)

6597 6479 3430 6689 3539 3591 5933 6587 3817 6661 Número de cepa

23130 9416 6555 4361 2322 2027 564 pb

3342 2115 2115 S/A 1447 3342 300 2360 3379 3379 Tamaño de la banda (pb)

19

generadas se realizó un BLAST, que arrojó como resultado diferentes secuencias de

ges de resistencia, posteriormente se realizó un alineamiento entre la secuencias

problemas y las secuencias reportadas en el Gen Bank.

En el siguiente cuadro se muestran las cepas donde se encontraron integrones, así

como los arreglos de genes de la región variable, los cuales confieren resiste ncia a

diversos antibióticos.

Caracterización de la región variable del integrón en las cepas de Aeromonas spp. Cepa Especie Amplicón

(pb) Cassettes insertados Resistencia

3817 A. caviae 3379 oxa2- aadA1-oxa2-orfD Oxacilina, Estreptomicina/Espectinomicina

3591 A. caviae 3342 dhfr15- cmlA4- aadA2 Trimetoprim, cloranfenicol Estreptomicina/Espectinomicina

3430-1 A. caviae 2115 dhfr12/ aadA2 Trimetoprim, Estreptomicina/Espectinomicina

5933 A. caviae 300 - Sin inserto 6597 A. caviae 3342 dhfr15-cmlA4- aadA2 Trimetoprim, cloranfenicol

Estreptomicina/Espectinomicina 6661 A. caviae 3379 oxa2- aadA1-oxa2-orfD Oxacilina

Estreptomicina/Espectinomicina 6479 A. hydrophila 2115 dhfr12/ aadA2 Trimetoprim

Estreptomicina/Espectinomicina

6587 A. hydrophila 2360 Dfr2d-cat3-aadA1 Trimetoprim, cloranfenicol, Estreptomicina/Espectinomicina

3539 A. veronii 1447 aadA2 Estreptomicina/Espectinomicina

La secuencia parcial forward y reverse proporcionaron la suficiente información

para armar el arreglo de genes de la región variable, las secuencias dieron a

conocer genes completos y parte de los genes adyacentes en un arreglo, suficiente

para caracterizarlo. Excepto para la cepa 6661, donde fue necesario utilizar un

iniciador interno para conocer la zona central de la región variable.

En la siguiente figura se observa la estructura completa de los integrones en las

cepas de Aeromonas spp. en donde se observa las regiones conservadas y la región

20

variable formada por diferentes genes de resistencia, excepto en un integrón. En

todos los casos los arreglos encontrados correspondieron a los publicados en otras

bacterias.

DETECCIÓN DE GENES QUE CODIFICAN RESISTENCIA A TETRACICLINA

El criterio de selección para la detección de estos genes fueron aquellas cepas

resistentes a tetraciclina (n=16).

Se llevó a cabo la amplificación de los genes que codifican para la resistencia a

tetraciclina tet A, tet C, tet D y tet E. De las 16 cepas resistentes a tetraciclina en 5

cepas se detectó en gen tet A, en 5 cepas tet E y en 3 cepas se detectó el gen tet B

como se muestra en la siguiente figura. En ninguna cepa se detectaron los genes C

y D. Cabe mencionar que en tres cepas resistentes a tetraciclina no se detectó

ninguno de estos genes.

Productos de amplificación de los genes tet: tet A Carril 1 Marcador de peso molecular Roche IX. Carril 2 A. hydrophila 839 testigo negativo Carril 3. E. coli tet A testigo positivo. Carriles 4-8 cepas problema de Aeromonas spp. tet E Carriles 1-4 cepas problema de Aeromonas spp. Carril 5 E. coli tet E testigo positivo Carril 6. A. salmonicida 718 testigo negativo. Carril 7 Marcador de peso molecular Roche IX. tet B Carri1 1 Marcador de peso molecular Roche IX. Carril 2 E. coli tet B testigo positivo. Carriles 3-5 cepas problema de Aeromonas spp. Carril 6. A. salmonicida 718 testigo negativo.

1 2 3 4 5 6 7 8

1323 1078 872 603 310

937 pb

tet A

1 2 3 4 5 6 7

1199 pb

tet E

1323 1078 872 603 310

21

Meta 2.- Detección de transposonones tipo Tn5393

Las cepas (n=41) que fueron seleccionadas para la búsqueda de este elemento

fueron cepas resistentes a estreptomicina.

El gen de la transposasa del elemento Tn5393 se detectó en 27 cepas (ver figura),

posteriormente se llevó a cabo la detección del gen de estreptomicina el cual no se

detectó en ninguna.

Meta 2 .- Detección de transposones tipo Tn1721

El criterio de selección para la detección de este transposón fueron aquellas cepas

resistentes a tetraciclina con el gen tet A (n=5).

Se amplificó el gen que codifica la transposasa (600 pb) y esté se presentó en 4

cepas (ver figura). Por lo tanto el elemento Tn1721 se encontró en 4 cepas de

Aeromonas spp.

Fig. 24 Producto de amplificación del gen de la transposasa del Tn1721 (600 pb). Carril 1 A. hydrophila 839 testigo negativo Carril 2 E. coli C600 Tn5393 testigo negativo. Carril 3 A. salmonicida 718 (pRAS1) testigo positivo. Carriles 4-8 cepas problema de Aeromonas spp. Carril 9 Marcador de peso molecular Roche IX.

1323 1078 872 603 310

Fig. 25 Producto de amplificación del gen de la transposasa del Tn5393. Carri1 1 Marcador de peso molecular Roche IX. Carril 2 A. hydrophila 839 testigo negativo Carril 3. E. coli C600 Tn5393 testigo positivo. Carriles 4-15 cepas problema de Aeromonas spp.

1353 1078 872 603 310

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

340 pb

22

Meta 3 Obtención de amplicones de la región variable del integron. Los resultados obtenidos de la aplicación de la sonda derivada de los genes str A-B

EN cepas de Aeromonas spp. las cuales contenían el gen del la transposasa del

elemento Tn5393 y cepas resistentes a estreptomicina..

Se detectaron 3 cepas que hibridaron con la sonda del gen strA-B, una cepa

muestra una señal intensa en la hibridación (carril 15, cepa 6661) lo que indica que

esta cepa contiene el gen strA-B, por lo que podemos decir que el transposón

Tn5393 fue detectado en una cepa de origen clínico. Cabe mencionar que dos cepas

mostraron una señal menor (carriles 3 y 11 cepas 6336 y 6376 respectivamente),

esto se pudo deber que son genes similares u homólogos a dicho gen.

Mediante esta técnica se comprobó que la mayoría de las cepas no contienen el gen

(strA-B) asociado al transposón Tn5393, además de que se evidenciaron falsos

negativos mediante la técnica de PCR.

En el siguiente cuadro se muestran el número de genes y elementos genéticos de

resistencia encontrados en las cepas de Aeromonas spp. aisladas de heces diarreicas.

23

Resultados de los elementos identificados en las 41 cepas de Aeromonas spp.

# CEPA ESPECIE PLÀSMIDOS (n=13)

GENES tet (n=13)

Tn1721 (n=4)

Tn5393 (n=27)

GEN str A-B (n=1)

Región variable (n=9)

6640 A. caviae + A + - - - 6597 A. caviae - - - + - +

6626 A. caviae - ND - + - -

6429 A. caviae - - - + - - 6425 A. caviae + - - + - -

6436 A. caviae - B - + - -

6643 A. caviae - - - + - - 6661 A. caviae - - - + + +

6594 A. caviae - - - + - -

6564 A. caviae - - - - - - 6582 A. caviae + ND - - - -

6689 A. caviae - - - - - -

6548 A. caviae - - - + - -

6336 A. caviae - E - + - -

6376 A. caviae + E - + - -

6326 A. caviae - - - + - - 5933 A. caviae + A + + - +

5919 A. caviae - - - + - -

5845 A. caviae + - - - - - 3713 A. caviae + - - - - -

3430-1 A. caviae - A + + - +

3849 A. caviae + - - - - - 3491 A. caviae + E - + - -

24

3477 A. caviae - - - - - -

3591 A. caviae - - - + - +

3817 A. caviae - E - - - +

3793 A. caviae + - - + - -

6587 A. hydrophila - A ND - - +

6610 A. hydrophila - - - + - -

6632 A. hydrophila - - - + - -

6479 A. hydrophila + A + + - +

6698 A. hydrophila - - - + - -

6492 A. hydrophila - - - + - -

5881 A. hydrophila - - - - - -

5794 A. hydrophila - B - + - -

3510 A. hydrophila - - - + - -

3611 A. hydrophila + ND - + - -

6654 A. veronii - - - + - -

5869 A. veronii - B - - - -

3539 A. veronii - E - - - +

3925 A. media + - - - -

ND: no detectado

25

Meta 4.- Análisis de las secuencias y establecimiento del número de copias de

elementos genéticos mediante Southern blot.

Placa autoradiográfica de la hibridación Southern. Cepas de Aeromonas spp. las cuales contenían el gen del la transposasa del Tn5393 y cepas resistentes a estreptomicina. Carril 1 E. coli C600 Tn5393 testigo positivo. Carril 2 A. hydrophila 839 testigo negativo. Carriles 3 – 34 cepas problema de Aeromonas spp. CORRELACIÓN ENTRE GENES DE RESISTENCIA Y RESISTENCIAS POR ESPECIES. Como se mencionó anteriormente en diferentes cepas de Aeromonas spp. se

detectaron diferentes genes de resistencia (relacionados a integrones y

transposones) y el fenótipo de resistencia. Sin embargo en algunas cepas se

detectaron genes de resistencia pero no el fenotipo

Correlación entre genes de resistencia y fenotipo de resistencia.

# CEPA ESPECIE GENES DE RESISTENCIA PERFIL DE RESISTENCIA

3591 A. caviae dhfr15, cmlA, aadA2 TMR , CS, ETS

6597 A. caviae dhfr1, cmlA, aadA2 TMR, CS, ETS

6661 A. caviae oxa2, aadA1, oxa2 OXR, ETS,

3817 A. caviae oxa2, aadA1, oxa2 OXR, ETI,

5933 A. caviae tet A TER

26

3430-1 A. caviae dhfr12, aadA2, tetA TMR, ETS TER

6640 A. caviae tet A TER 6436 A. caviae tet B TER

3817 A. caviae tet E TER

3491 A. caviae tet E TER 6376 A. caviae tet E TER

6336 A. hydrophila tet E TER

5794 A. hydrophila tet B TER 6479 A. hydrophila dhfr12, aadA2, tet A TMR, ETS, TER

6587 A. hydrophila dhfr2d, catB3, aadA1, tet A TMR, CS, ETR, TER

5869 A. veronii tet B TER 3539 A. veronii aadA2, tet E ETR, TER

TM= trimetoprim, C= cloranfenicol, ET= estreptomicina, TE tetraciclina, OX= oxacilina, S sensible, R

resistente.

Con respecto a la relación entre los elementos genéticos encontrados, no se

observó relación entre la presencia de plásmidos con integrones y transposones

ya que se observaron cepas con plásmidos que no tienen integrón o transposones

y viceversa.

DISCUSIÓN

Por mucho tiempo en Aeromonas se ha estudiado la presencia de plásmidos y su

relación con factores de virulencia y resistencia a antibióticos, demostrándose

que Aeromonas contiene plásmidos de resistencia a diversos antibióticos, no

obstante su relación con factores de virulencia no es lo suficientemente clara.

Algunos autores concluyen que no hay evidencias sustentables de que la

presencia de algún plásmido influya en la virulencia de Aeromonas, aunado a ésto

Stuber y cols., en el 2003 reportan que en A. salmonicida genes del sistema de

secreción tipo III están localizados en un plásmido termolábil, recientemente se

ha relacionado la presencia de un plásmidos de 21 Kb con la virulencia en cepas

27

de A. hydrophila patógena para peces. Está cepas causan síndrome ulcerativo en

peces y éste plásmido parece regular la virulencia (Majumdar y cols., 2006).

La importancia en este trabajo de determinar la presencia de plásmidos radicó en

saber si estos elementos influyen en el perfil de resistencia de las cepas o si sólo

son los vehículos para la diseminación de otros elementos. Se buscó la presencia

de plásmidos en 41 cepas de 4 diferentes especies aisladas de heces diarreicas,

todas ellas aisladas de la misma región geográfica. Los plásmidos sólo se

obtuvieron de 3 especies: A. hydrophila, A. caviae y A. media. La especie en donde

se observó una mayor incidencia de plásmidos fue A. caviae (9/27), siguiéndole

A. hydrophila (3/10). En general la incidencia de estos elementos en este trabajo

fue del 32%, lo que coincide con los resultados de otros autores donde reportan

que hay una incidencia entre el 15 y 30 % (Chang y Bolton, 1987; Pérez-

Valdespino, 2004). En contraste, algunos otros reportan una incidencia menor a

15% o mayor al 70% (Huddleston y cols., 2006; Peres y cols., 2006; Borrego y cols.,

1991.). Además de las especies antes mencionadas se obtuvo DNA plasmídico en

la cepa de A. media (1/1) especie que se considera como patógeno emergente por

su bajo aislamiento de cuadros clínicos en nuestro país (Castro -Escarpulli y cols.,

2002).

En los perfiles plasmídicos obtenidos para cada cepa se observó que algunas

compartían el mismo perfil o alguna banda de un mismo peso molecular, lo que

puede sugerir que sea un plásmido que esté diseminándose entre la población,

sin embargo no podemos asegurar que cada banda corresponda a un plásmido,

para ello se tendría que realizar un estudio particular como someter a ese DNA a

una restricción.

Algunas cepas con plásmidos presentaron un perfil de resistencia diferente, estas

cepas presentaron resistencia a tetraciclina, ácido nalidíxico, trimetoprim,

28

eritromicina, cloranfenicol, azitromocina y ciprofloxacina; estos antibióticos

pudieran estar relacionados con la presencia de plásmidos, sin embargo se

necesitarían hacer otras pruebas, como curar al plásmido o realizar

conjugaciones, ya que algunas cepas presentaron resistencia a alguno de los

antibióticos antes mencionados pero no se les detectó DNA plasmídico. Además,

es importante tomar en cuenta que se han reportado plásmidos crípticos en A.

salmonicida, esto quiere decir que estos elementos no le confieren a la bacteria

alguna característica selectiva, por lo que no se descarta la posibilidad de que

alguno de los plásmidos encontrados sea un elemento críptico (Boyd y cols.,

2003).

Recientemente en cepas de A. hydrophila y A. caviae aisladas de vegetales en Brasil

se determinó la presencia de un plásmido relacionado con la resistencia a

tetraciclina (Peres y cols., 2006). Otros trabajos, han reportado plásmidos R

conjugativos los cuales contienen otros elementos genéticos como transposones e

integrones como es el caso de los plásmidos pFABOT, pRAS1, pASOT (Sørum y

cols., 2003; Rhodes y cols., 2000).

Otros elementos que contribuyen de forma importante en la adquisición de

nuevas resistencias son los integrones, es substancial remarcar que la búsqueda

de estos elementos no se ha llevado a cabo en cepas de Aeromonas de origen

clínico, solo en cepas de origen ambiental, por lo que los resultados obtenidos

son importantes para corroborar la transferencia horizontal entre cepas del

género Aeromonas, ya que hay la posibilidad de que presenten genes similares

cepas ambientales y patógenas.

La detección de integrones se realizó en las 41 cepas, no se tomó criterio de

selección con respecto a las resistencias que presentaban, ya que en la literatura

29

se han descrito más de 70 genes “cassette” de resistencia, además de que se han

descrito integrones descargados es decir no hay genes cassette insertados en la

región variable o los genes pueden estar interrumpidos por otros elementos

como transposones, por estas razones se decidió llevar a cabo la búsqueda de

estos elementos en todas la cepas.

La clasificación de los integrones se basa en la secuencia de la integrasa, en el

presente trabajo sólo se detectaron integrones de clase 1, que son los que se

encuentran con mayor frecuencia en las cepas aisladas de casos clínicos (Sabate y

Prats, 2002). Se caracterizan por tener la secuencia 5´CS que contiene el gen

codificante de la integrasa, la región variable y la mayoría de ellos incluye una

secuencia 3´ CS (Rowe-Magnus y Mazel., 2002).

El integrón se amplificó en tres partes, primero las 2 regiones conservadas y

después la región variable, sólo en 16 de 41 cepas se encontró el gen de la

integrasa (región 5´CS) de las cuales sólo en 10 se amplificó el extremo 3´ CS; en

la literatura se ha reportado que en esta región se puede presentar diferentes

estructuras (Gaze y cols., 2005). El primer tipo de arreglo esta formado por el

Tn402 like, el cual consta de un módulo de transposición (tni) conformado por 3

genes y el gen de una resolvasa. El segundo tipo In5 consiste de qacE∆1, sul1, orf

5, orf 6 y un módulo parcial de tni. El tercer tipo In4 contiene qacE∆1, sul1, orf 5 y

orf 6. En algunas ocasiones se han detectado integrones que carecen de los genes

qacE∆1 y sul1 en el extremo 3´ conservado (Martínez-Freijo y cols., 1998; Dalsgard

y cols., 2000; Gaze y cols., 2005). Por consiguiente las cepas que presentaron la

región 5´CS y no la región 3´CS podrían presentar una estructura diferente. Cabe

destacar que en una cepa el amplificado de la región 3´CS fue de menor tamaño

que el esperado, por lo que podría presentar una estructura diferente.

30

Para la detección de la región variable sólo se seleccionaron aquellas cepas que

presentaron ambas regiones conservadas (n= 10), para la detección de esta región

se emplearon 2 pares de iniciadores, unos reportados en la literatura (var I) y los

otros fueron diseñados en este trabajo (var II). Los iniciadores reportados en la

literatura amplificaron la región variable de 3 cepas, con tamaños entre 800 y

1500 pb.

Las cepas en donde no se obtuvo amplificado en la región variable (n=6) se

emplearon los iniciadores diseñados en este trabajo (Variable II) que hibridan

dentro de la región 5´CS y el extremo 3´CS , se amplificaron 5 de las 6 cepas

restantes, con amplificados entre 1400 y 3300 pb. En una cepa se observó una

banda menor a 300 pb, que indica que no hubo “cassette” insertado y en una

cepa no se obtuvo amplificado, sumado a esto las condiciones para amplificar

esta región fueron estrictas, la temperatura de alineamiento fue 10 grados más

arriba de la temperatura a la cual se amplificaron los testigos positivos.

Es importante el hecho de que con los iniciadores reportados en la literatura no

amplificaran la región variable de estas cepas, esto a pesar de que las secuencias

flanqueadoras están conservadas, lo que podría indicar una diferencia entre la

región variable y las regiones conservadas de nuestras cepas.

Se realizaron combinaciones de iniciadores, para la amplificación de la región

variable y parte de las regiones conservadas (resultados no mostrados), esto

sirvió para comprobar que el tamaño del amplificado era del tamaño esperado.

La literatura reporta que cuando hay sólo un “cassette” insertado el tamaño es

aproximadamente de 500 pb y nuestros amplificados fueron mayores, se sabe

que el número de cassettes insertados es variable y suele oscilar entre 1 y 4, como

31

en el caso de las cepas provenientes del estado de Hidalgo (Schmidt y cols., 2001;

García, 1999; Martínez- Freijo y cols., 1998).

Se sabe que puede haber integrones descargados (In0), esto es sin genes cassette

insertados (García, 1999), sin embargo la frecuencia de integrones descargados es

baja, como en el presente trabajo donde sólo en una cepa se encontró un integrón

descargado.

Se observaron amplificados de la región variable con el mismo tamaño y

regularmente presentaban un perfil de resistencia similar, dentro de los

antibióticos relacionados con la presencia de estos elementos encontramos a

tetraciclina, polimixina, azitromicina, eritromocina, ácido nalidíxico,

trimetoprim, cloranfenicol, estreptomicina, kanamicina, oxacilina y piperacilina.

Para corroborar que los amplificados del mismo tamaño correspondían al mismo

arreglo de genes, se sometieron a una restricción, y se secuenció una cepa de

cada patrón.

La secuencia de los amplificados de la región variable revelo que, los genes

cassette insertados correspondieron a dhfr12, dhfr15 y dfrB4, que codifican para

distintas dihidrofolato reductasas que confieren resistencia a trimetoprim.

Además se encontraron aadA1, aadA2, que confieren resistencia a

estreptomicina/espectinomicina, oxa2 resistencia a oxacilina, catB3 y cmlA4 que

determinan resistencia a cloranfenicol, y un marco de lectura abierto (orfD) cuya

función es desconocida.

En el género Aeromonas se ha descrito la presencia de genes dhfr 1, 2, 12 y16, en

cepas aisladas de peces, agua y heces de ganado (Schmidt y cols., 2001; Sørum y

cols., 2003; Casas y cols., 2004; Barlow y cols., 2004; Jacobs y Chenia, 2006; Poole y

cols., 2006). Sin embargo en cepas de Aeromonas spp. de origen clínico no se

32

tienen reportes, por lo que este trabajo es el primero en detectar el gen dhfr 12.

Este gen se ha detectado en Vibrio, Pseudomonas y coliformes todas ellas de origen

ambiental (Rosser y cols., 1999) y cepas patógenas como V. cholerae O1 implicado

en una pandemia en 1997 en Guinea-Bissau (Dalsgaard y cols. 2000), en E. coli

uropatogénica y E. coli aislada de heces diarreicas en cerdos (Solberg y cols.,

2006, Kang y cols., 2005) y en bacterias Gram positivas (Shi y cols., 2006).

El gen dhfr15 se reportó por primera vez en 1998, en cepas de E. coli aislada de

heces, en África (Adrian y cols., 1998). Este gen se ha encontrado en cepas

clínicas de Klebsiella pneumoniae y en Salmonella enterica (Fonseca y cols., 2006).

El gen dfrB4 (anteriormente dfr2d) se reportó en cepas de E. coli aisladas de orina

en Suecia (Grape y cols., 2003; Levings y cols., 2006).). Es importante destacar que

son pocos los reportes de este gen dfrB4 a pesar de que los genes dhfr están

ampliamente distribuidos y son los genes que se encuentran más frecuentemente

en los integrones y se han descrito múltiples variantes de este gen (Solberg y

cols., 2006).

El trimetoprim es una droga sintética que fue introducida para uso clínico en

Europa en 1960 y el primer reporte de resistencia a trimetoprim mediada por

plásmidos fue en 1972. Esta droga tiene una estructura similar al dihidrofolato,

por lo tanto es un inhibidor competitivo de la enzima dihidrofolato reductasa de

bacterias, hongos y protozoarios. Este antibiótico inhibe la vía de síntesis de

ácido fólico y la síntesis de bases nitrogenadas. El gen dhfr codifica para la

enzima dihidrofolato reductasa (DHFR), lo que implica la producción de más

enzima para que ésta no sea inhibida, se ha reportado la síntesis de DHFR con

menor afinidad por el trimetoprim (Alonso y Grady, 2006).

33

La resistencia a aminoglucósidos esta mediada por la producción de diferentes

enzimas como adeniltransferasa, acetiltransferasa y fosfotransferasa, los genes

que codifican para estas enzimas se encuentran distribuidos en integrones y

plásmidos, hay distintas variantes de genes que codifican para estas enzimas

(Fluit y Schmitz., 2004). Los genes aadA1 y aadA2 (anteriormente ant(3”)1a y

ant(3”)1b respectivamente) confieren resistencia a estreptomicina-

espectinomicina, han sido descritos en un amplio número de bacterias Gram

negativas aisladas del cuadros clínicos y muestras ambientales (Rosser y cols.,

1999; Levings y cols., 2006; Adrian y cols., 2000).

El gen aadA2 se ha identificado en A. hydrophila aislada de heces diarreicas de

cerdos (Poole y cols., 2006) y en A. salmonicida aislada de peces (Sørum y cols.,

2003). El gen aadA1 se ha encontrado en cepas de A. hydrophila, A. salmonicida, A.

sobria, A. icthiosomia y A. encheleia todas ellas aisladas de sistemas de acuacultura

en África (Jacobs y Chenia, 2006).

El gen aadA, al igual que el gen dhfr se encuentran distribuidos entre un gran

número de bacterias en diferentes áreas geográficas, es común encontrar estos

genes en un mismo arreglo (dhfr-aadA) y justamente este arreglo fue el más

común en nuestras cepas. Esto sugiere que hay flujo genético entre células de

diferentes comunidades microbianas (Adrian y cols., 2000; Gestal y cols., 2005).

El gen aadA se encontró formando parte de todos los arreglos de los integrones

encontrados (n=8), y este ha sido reportado como un gen predominante en E. coli

de origen clínico y ambiental, Vibrio cholerae O139 y S. enterica, la predominancia

de este gen sugiere que es un gen muy estable dentro del integrón, y esto pudiera

estar relacionado al uso extensivo de la estreptomicina en el control de

enfermedades de animales, plantas y el hombre (Kang y cols., 2005).

34

Otro de los genes detectados fue el gen catB3, que confiere resistencia a

cloranfenicol, el cual es un antibiótico de amplio espectro, actúa sobre un gran

número de bacterias Gram positivas y Gram negativas inhibiendo la síntesis de

proteínas. El gene catB3 codifica para una cloranfenicol acetiltransferasa (CAT),

miembro de una familia de proteínas denominadas CAT, se han descrito 3

variantes de genes catB y se describieron por primera vez en Agrobacetrium

tumefaciens (Bunny y cols., 1995).

Este gene se ha encontrado en una cepa de A. encheleia de origen ambiental (datos

no publicados). Esta cepa de A. encheleia presenta el mismo arreglo de genes

cassette, que la cepa 6587 A. hydrophila, igualmente Barlow y cols., (2004)

reportaron 2 cepas de A. veronii con el arreglo de la cepa 6587.

El gen cmlA4 es un gen que confiere resistencia a cloranfenicol, pero el

mecanismo de resistencia es diferente al codificado por el gen catB3, el gen cmlA4

codifica para una proteína de membrana externa encargada de expulsar al

antibiótico.

Las cepas de Aeromonas que contienen este gen presentan un arreglo dhfr15-

cmlA4-aadA2, este mismo arreglo se presenta en cepas de Salmonella enterica y

Klebsiella pneumoniae (Michael y cols., 2005).

Las cepas de Aeromonas se caracterizan porque producen una gran variedad de ß-

lactamasas de diferentes clases. En el presente trabajo se detectaron dos cepas se

detectó el gen oxa2 que codifica para una ß-lactamasa clase D y confiere

resistencia a oxacilina este gen se encuentra duplicado en el mismo arreglo .

Además dicho gen forma parte de un gran número de integrones, incluyendo

una cepa de A. sobria de origen ambiental (Jacobs y Chenia, 2006).

En este trabajo se identificaron dos cepas de A. caviae con el arreglo oxa2-aadA2-

oxa2-orfD, dicho arreglo se encontró formando parte del plásmido R46, aislado

35

en Europa en la década de los 70´s en S. typhimurium (Stokes y Hall, 1992; Recchia

y Hall, 1995).

Los integrones confieren ventajas selectivas y raramente capturan genes

indispensables para la bacteria, se caracterizan por tener una gran versatilidad en

el intercambio y sobre todo en la reserva de cassettes, por ello han contribuido a

una rápida adaptación al cambio que se presenta en los nichos ecológicos (Sabate

y Prats, 2002). En el presente estudio las cepas que se estudiaron contienen

integrones y estos poseen genes de resistencia que se presentan en arreglos

conservados los cuales se encuentran distribuidos en una gran variedad de

bacterias de diferentes orígenes, ratificando la movilidad horizontal de genes.

En algunas cepas con integrón se detectaron genes de resistencia, pero no el

fenotipo, esto se puede deber a la ubicación del gen con respecto al promotor, ya

que entre mas alejado de esté no se expresa, otro factor que podría influir es que

el gen mas cercano al promotor presente secuencias terminadoras que eviten la

transcripción de los genes subsecuentes o que los genes no sean funcionales. Es

importante tomar en cuenta que para determinar los perfiles de resistencia se

empleo la técnica de difusión en disco la cual es una prueba con diversas

desventajas para conocer si la cepa es sensible o resistente, por lo que seria

importante determinar la concentración mínima inhibitoria para los antibióticos

de interés.

Rowe-Magnus en el 2001 demostró la presencia de estos integrones en

microorganismos ancestrales de diferentes géneros, corroborando así que los

integrones son estructuras antiguas que han ido evolucionando conjuntamente

con el genoma bacteriano. Estas estructuras muestran alta estabilidad genética,

incluyendo los arreglos de genes, por periodos prolongados de tiempo (Dubois y

36

cols., 2007); en nuestro trabajo los integrones muestran arreglos descritos en otras

bacterias de diferentes nichos, lo cual se podría estar relacionado a su estabilidad,

sin embargo seria importante estudiar si la integrasa es funcional y por esta

razón no hay recambio de genes “cassettes” y por ellos son conservados.

En este trabajo se observó que las cepas con plásmidos no tienen integrón y

viceversa, por lo que estos elementos se podrían encontrar insertados en el

cromosoma, tal como se ha descrito para cepas de Salmonella (Zhang y cols.,

2004).

Otros genes distribuidos en un gran número de bacterias son los genes tet, que

confieren resistencia a tetraciclina. Las tetraciclinas inhiben la síntesis de

proteínas y son antimicrobianos de amplio espectro, actúan sobre un gran

número de bacterias Gram negativas, Gram positivas, microorganismos atípicos

como clamidias, micoplasmas, rickettsias y protozoarios. Hasta el momento en la

literatura se han descrito 35 genes de resistencia a tetraciclina en bacterias, estos

genes codifican para tres diferentes mecanismos de resistencia: proteínas de

protección para el ribosoma, proteínas de membrana que regulan en flujo del

antibiótico e inactivación del antibiótico vía enzimática (Chopra, 2001; Waturangi

y cols., 2003).

En Aeromonas spp. se han descrito los genes tet A, B, D, E, H y tet 31, estos genes

codifican para proteínas de membrana que regulan en flujo del antibiótico, no se

ha descrito algún gen que codifique para un mecanismo distinto de resistencia

(Chopra, 2001). En este trabajo se detectaron los genes tet A, E, y B; la especie que

presentó una notable incidencia de genes tet es A. caviae, seguida de A. hydrophila

y finalmente A. veronii. Los genes tet A y E se encuentran distribuidos entre las

37

especies antes mencionadas, sin embargo los genes tetB no se presentaron en

cepas de A. caviae.

Jacobs y Chenia, (2006) reporta cepas de Aeromonas spp. aisladas de agua de

granjas de peces, donde el 75 % de las cepas contienen genes tet A, B, E, D y H; la

especie que presenta un mayor número de estos genes es A. sobria, seguida de A.

hydrophila, no se reporta ninguna cepa de A. caviae.

Otro trabajo indica que el gen tet E esta ampliamente diseminado en cepas de A.

hydrophila y A. salmonicida aisladas de granjas de peces, y este gen esta presente

en un plásmido conjugativo (Agersø y cols., 2006). Cepas aisladas de aguas

domésticas y hospitalarias, presentan genes tet A, la especie de mayor incidencia

es A. hydrophila, seguida de A. veronii y A. salmonicida, sólo se reporta una cepa de

A. caviae (Rhodes y cols., 2000). La incidencia de genes tet en nuestro trabajo es

menor que la reportada en Aeromonas spp. de origen ambiental donde se

presentan con mayor frecuencia posiblemente debido al uso

indiscriminado de la tetraciclina en agricultura y acuicultura donde se utiliza

como promotor de crecimiento (Schmidt y cols., 2001; Miranda y cols., 2003;

Jacobs y Chenia, 2006).

Los genes tet se encuentran distribuidos en una amplia variedad de bacterias

aisladas de humanos, animales y del ambiente, la mayoría de estos genes se

encuentran asociados a plásmidos o transposones, lo cual explica su amplia

distribución entre diversas especies bacterianas.

En el 2004 Pezzella y cols., reportaron alta incidencia de genes tet en cepas de S.

enterica aislada de animales en Italia. El reporte de genes tet en cepas aisladas de

cuadros clínicos es variable, en cepas de Acinetobacter el 94% de las cepas

38

presentaron genes tet y en cepas de E. coli solo el 12% de las cepas presentó genes

de resistencia a tetraciclina (Karami y cols., 2006; Guardabassi y cols., 2000).

Es importante tomar en cuenta que la resistencia a tetraciclina puede estar

influenciada por factores geográficos (Chopra, 2001).

Como se menciona inicialmente otros elementos de gran importancia en la

transferencia de genes de resistencia son los transposones. El transposón Tn1721

se describió desde 1981 en un plásmido conjugativo en E. coli, se encuentra

distribuido ampliamente, y es el responsable de la amplia diseminación de

resistencia a tetraciclina en bacterias Gram negativas (Schmitt y cols., 1979).

Diversos estudios muestran que los genes de resistencia a tetraciclina se

encuentran en transposones como: tet A en Tn1721, tet B en Tn10, tet D el cual

esta flanqueado por dos secuencias de inserción (IS26), tet G en un integrón y tet

H está en Tn5706 (Schnabel y Jones, 1999).

En cepas clínicas se ha observado un incremento en las cepas resistentes a

tetraciclina debido a que forma parte de los antibióticos recomendados para el

tratamiento de infecciones intestinales, aunado a la contaminación ambiental.

En nuestro trabajo se detecto el Tn1721 en 4 cepas de origen clínico, con lo que

podemos decir que este elemento es de amplia distribución ya que éste se ha

reportado en cepas de Aeromonas spp. de origen ambiental (Rhodes y cols., 2000;

Sørum y cols., 2003).

El Tn1721 el cual se presentó en cepas de A. caviae (3/27) y A. hydrophila (1/10),

se reporta en la literatura mayor incidencia de este elemento en cepas de A.

hydrophila, seguida de A. veronii y A. caviae en estas cepas el transposón se

encontró en un plásmido conjugativo (pFABOT) el cual también contiene un

39

integrón (Rhodes y cols., 2000). Este transposón se ha descrito también en cepas

de A. salmonicida formando parte del plásmido conjugativo pRAS1 y del

plásmido pASOT, ambos plásmidos contienen un integrón clase 1 (Sørum y cols.,

2003).

L´Abee-Lund y Sørum en el 2000 realizaron un estudio donde ponen de

manifiesto la presencia del transposón Tn5393 el cual contiene genes que

codifican la resistencia a estreptomicina (strA-strB ). Dicho transposón se

encuentra en un plásmido conjugativo (pRAS2) en una cepa de A. salmonicida

subsp. salmonicida patógena de peces. Este plásmido también confiere resistencia

a tetraciclina y a sulfas. Cabe mencionar que este elemento es de alta incidencia

en bacterias fitopatógenas como Erwinia amilovora, Pseudomonas syringae y

Xantomonas campestre (Han y cols., 2004).

Los genes strA-strB se han aislado de bacterias que infectan animales y humanos

asociados al Tn5393 y a plásmidos (Han y cols., 2004; Matengoli y Rossolini,

2005). Se sabe que los transposones son capaces de formar diversas

combinaciones por la integración de diversos elementos y este transposón no es

excepción, ya que este elemento se relaciona con genes de resistencia a metales

pesados (Rice, 2002).

Para la detección de este elemento en nuestras cepas de origen clínico se

seleccionaron aquellas cepas resistentes a estreptomicina, en estas cepas sólo se

detectó el gen de la transposasa del Tn5393. A pesar de la aparente presencia de

la transposasa de Tn5393 no se pudo amplificar los genes strA-strB característicos

de este transposón, por lo que probablemente se trate de genes atípicos o exista

en estas cepas una variante del transposón.

40

Para descartar la presencia de falsos negativos por la técnica de PCR, se empleo

la hibridación Southern, utilizando como sonda el amplificado de los genes strA-

B, con esta técnica se encontraron tres cepas que dieron señal en la placa

autoradigráfica, una de ella con señal intensa, lo cual indica que esta cepa

presenta los genes strA-B, y que pudieran presentar una región diferente donde

pegan los iniciadores por ello no se detectaron mediante PCR.

Con este resultado podemos decir que el Tn5393 completo fue encontrado en una

cepa de Aeromonas de origen clínico.

La señal débil que presentaron dos cepas de Aeromonas spp. se pudo deber a que

son genes con alta homología a los genes str A-B, es importante resaltar que las

condiciones de hibridación fueron a una elevada astringencia. Por lo anterior es

importante llevar acabo la caracterización de estos genes.

Otra resistencia asociada a este elemento es a metales pesados, sin embargo no

parece haber una relación entre esta resistencia y la presencia de la transposasa

de Tn5393 en nuestras cepas, ya que cepas resistentes no amplificaron el gen de

la transposasa y viceversa.

Los transposones que se estudian en este trabajo pertenecen a la familia Tn3, del

subgrupo Tn21, se ha descrito que estos elementos tienen una diseminación

global y generalmente están relacionados con integrones clase 1, los integrones

no son móviles por si mismos, por ello se hallan con frecuencia en transposones

que a su vez se encuentran en plásmidos conjugativos o movilizables, por lo que

su movilidad horizontal y vertical está asegurada.

En este trabajo se detectaron elementos genéticos como plásmidos, trasnposones

e integrones en cepas de A. caviae, A. hydrophila, y A. veronii de origen clínico,

cabe mencionar que la literatura solo muestra reportes de la detección de estos

41

elementos en cepas de origen ambiental, por lo que este es el primer trabajo en

cepas aisladas de origen clínico.

La cepa más frecuentemente aislada en este trabajo fue A. caviae. Es importante

recordar que esta es la especie que se aísla en mayor número de cuadros

diarreicos (Castro-Escarpulli y cols., 2002), sin embargo el aislamiento de esta

especie en agua y pescado es menos frecuente (Castro-Escarpulli y cols., 2003,

Vásquez-Ocampo 2005). Aunado a lo anterior, se ha demostrado que cepas de

Aeromonas de la misma especie se pueden agrupar con base en su origen de

aislamiento, lo cual indica que las diferentes poblaciones, pueden ocupar un

nicho diferente (Aguilera y cols., 2005). Con base en estos antecedentes es posible

especular que existan diferencias en los elementos genéticos y los genes de

resistencia de estas cepas con respecto a los de las cepas de origen ambiental. Por

lo anterior, es importante realizar un estudio en cepas aisladas de muestras

ambientales, para comparar la incidencia de estos elementos con la observada en

cepas clínicas. Lo anterior permitiría abundar en el conocimiento de la

diversidad de los genes de resistencia en nuestro país.

CONCLUSIONES

• Las especies que se aislaron con mayor frecuencia de cuadros clínicos

intestinales son A. hydrophila A. caviae y A. veronii. Siendo de estas tres A.

caviae la que se presentó en mayor número de aislamientos.

• El 32 % (13/41) de las cepas estudiadas presentaron plásmidos entre 3 y 53

Kb.

• Se detectaron integrones clase 1 (n=9), con genes de resistencia que se

encuentran distribuidos en un gran número de bacterias,

independientemente del origen y el área geográfica, los genes “cassette”

insertados corresponden a dhfr12, dhfr15, dfrB4, que confieren resistencia a

42

trimetoprim; aadA1, aadA2, que confieren resistencia a

estreptomicina/espectinomicina, oxa2 que confieren resistencia a

oxacilina, catB3 y cmlA4 que determinan resistencia a cloranfenicol, y un

marco de lectura abierto (orfD).

• Las cepas de origen clínico resistentes a tetraciclina poseen los genes tet A,

tet E y tet B, genes ampliamente distribuidos en cepas de Aeromonas spp.

de origen ambiental.

• Se detectó el transposón Tn1721 en 4 de las 5 cepas resistentes a

tetraciclina con el gen tet A.

• Se detectó el Tn5393 completo en una cepa y en el 63% (26/41) de las

cepas de Aeromonas solo se amplificó el gen de la transposasa lo que

sugiere la presencia de un transposón diferente.

IMPACTO

Los antibióticos y otros agentes antimicrobianos se usan ampliamente en

diversas actividades, entre los cuales encontramos terapia y profilaxis en

medicina humana y veterinaria e incluso en la agricultura. El uso indiscriminado

de antibióticos repercute en el aumento de infecciones por bacterias resistentes a

los antibióticos en las poblaciones humanas y animales, alteraciones importantes

de las relaciones ecológicas y en la contaminación del medio ambiente (Cabello,

2003).

En la práctica médica las infecciones causadas por Aeromonas son tratadas, con

fluoroquinolonas, trimetoprim-sulfametoxazol, aminoglucósidos, imipenem,

meropenem, cefalosporinas y tetraciclinas, algunos de éstos son empleados

particularmente para el tratamiento de infecciones gastrointestinales (Soler, 2003;

Coria y cols., 2001).

Algunas cepas con plásmidos presentaron un perfil de resistencia diferente, estas

cepas presentaron resistencia a tetraciclina, ácido nalidíxico, trimetoprim,

eritromicina, cloranfenicol, azitromocina y ciprofloxacina; estos antibióticos

43

pudieran estar relacionados con la presencia de plásmidos, sin embargo se

necesitarían hacer otras pruebas, como curar al plásmido o realizar

conjugaciones, ya que algunas cepas presentaron resistencia a alguno de los

antibióticos antes mencionados pero no se les detectó DNA plasmídico. Además,

es importante tomar en cuenta que se han reportado plásmidos crípticos en A.

salmonicida, esto quiere decir que estos elementos no le confieren a la bacteria

alguna característica selectiva, por lo que no se descarta la posibilidad de que

alguno de los plásmidos encontrados sea un elemento críptico (Boyd y cols.,

2003).

El impacto ambiental que coadyuva en la investigación del ambiente es porque

los centros de atención en salud, especialmente los hospitales, constituyen

importantes puntos de origen de descargas de antibióticos hacia el ambiente,

produciendo un fuerte impacto en la composición física, química y biológica de

los cuerpos receptores.

Aeromonas adquiere resistencia por la presencia de elementos genéticos en los

aislados de origen ambiental; sin embargo las cepas descritas en este trabajo

provenientes de cuadros clínicos en especial de cuadros diarreicos en las cuales

la presencia de elementos genéticos (plásmidos, integrones y transposones) se

pudieron asociar a la resistencia antimicrobiana que pueden transferirse a otras

cepas.

El conocimiento de la presencia de estos elementos genéticos en cepas aisladas de

cuadros diarreicos en nuestro país destaca la importancia de llamar la atención

de las autoridades sanitarias en el control de uso indiscriminado de antibióticos

en prácticas médicas, agrícolas y veterinarias por la diseminación de cepas de

Aeromonas resistentes a antimicrobianos presentes en el medio ambiente

complicando de manera importante la efectividad de los tratamientos

empleados comúnmente.