Detección y EnumeraciónMétodos Convencionales y

RápidosEsther Z. Vega, Ph.D.Microbiología Aplicada

Métodos ConvencionalesMuestreo

• Muestra representativa• Esterilidad• Tiempo de colección Análisis• Procesamiento muestra

– Suspención homogénea

Limitaciones de contaje deplacas

• Asume– Cada célula forma una colonia– Cada colonia proviene de una sola célula bacterial– Algunas colonias puede ser originadas de una

“agrupamiento”de bacterias• Se reporta como

- Unidad formadora de colonias (CFU)/gramo óml.- NO como bacterias totales

APC

• Vertido vs. esparcido– Spiral plater

• 104 - 1

• Filtración por membranas– Plate vs. DMC– “Direct epifluorescent filter

technique”

Leche, carnes, aves,superficies

APC

• “Hydrophobic Grid Membrane Filter”– 1,600 celdas que restringen crecimiento– MPN

Métodos basados enmetabolismo

• Reacciones Redox– Tintes como azul de metileno, resazurin y

tetrazolium• Prueba de Reductasa

– Resultados comparan com SPC

Resazurin A-C

Importancia del muestro

• Revela fuentes de contaminación secundariaen el ambiente de procesamiento– Contaminación – presencia de Pseudomonas– Presencia de patógenos – Listeria

• Permite el diseño de procesos de sanitización– Define un lugar con CCP en un plan HACCP

Métodos Rápidos

Basados en aspectos inmunológicos,bioquímicos, microbiológicos, moleculares yserológicosAislamientoDetecciónEnumeraciónCaracterización Identificación

Métodos Rápidos

• En general,patógenos alimentariosestán presentes en números bajos

• Enriquecimiento, pre-enriquecimiento,y/o enriquecimieto selectivo

• Límites de detección 102-105 CFU/g en<12-24 hrs.

Requerimientos

• Validación• Tiempo de procesamiento de muestra• Certeza (accuracy)• Costos

El ensayo debe ser…

• Fácil de ejecutar• Equipo de fácil operación• Resultados de fácil interpretación• Ensayo de acuerdo al alimento• Método aceptable en la industria y en

las agencias reguladoras

Organizaciones de validación

• International Standard Organization• International Dairy Federation• AOAC International

Métodos Rápidos: MétodosTradicionales

• Diluidores Automáticos• Sistemas automatizados para placas• “Colony Counting System”

Métodos Rápidos: MétodosTradicionales

• Sistema Petrifilm• SIM Plate (MPN)• Medio especializado

SIM Plate

Métodos Rápidos:Inmunológicos

• Policlonal:monoclonal• Límite detección: 103-105

– Coating of latex particles• Latex agglutination step >106

Métodos Rápidos:Inmunológicos

• Separación inmunomagnética– Placas– PCR– ELISA

E. coli O157:H7, Listeria, Salmonella

Métodos Rápidos:Inmunológicos

• Inmunodifusión- movimiento deproteínas por agar y formación decomplejo antígeno-anticuerpo

Inmunodifusión

• Salmonella 1-2 Test• VIP Test• Reveal Test• Safe Path• PATH STIK

Salmonella 1-2 Test

Salmonella, E. coli O157:H7, Listeria,Campylobacter

“ELISA based”

• TECRA- Salmonella, Campylobacter,E.coli O157:H7

• Listeria TEK• Assurance EIA

Métodos Moleculares

• PCR-BAX• Electroforesis de campo de pulso• Ribotipos-• Tipificación de plasmidios• Amplificación al azar de DNA-• Polimorfismo de fragmentos de

restricción-

Otros

• Luminiscencia• Citometría de flujo• Impedancia