DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA ...

DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA CELULOLÍTICA DE MICROORGANISMOS AISLADOS DE SUELOS DE CULTIVOS

DE ARROZ

ANDREA DEL PILAR PACHÓN HERNÁNDEZ DIANA ANGÉLICA PEREA CALDERÓN

TRABAJO DE GRADO

Presentado como requisito Para optar al título de:

MICROBIÓLOGO INDUSTRIAL

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

FACULTAD DE CIENCIAS CARRERA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL

Bogotá, D.C. Mayo de 2010

NOTA DE ADVERTENCIA

Artículo 23 de la Resolución N° 13 de Julio de 1946

“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velará por qué no se publique nada contrario al dogma y

a la moral católica y por que las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”.


DE ARROZ


APROBADO

______________________ Ivonne Gutiérrez Rojas

Bacteriologa, M.Sc. DIRECTORA

________________________ María Ximena Rodríguez

Microbióloga Ph.D. JURADO


DE ARROZ


APROBADO _______________________ _______________________________ Ingrid Shuler Ph.D. Janeth Arias Palacios M.Sc-M.Ed Decana Académica Director de Carrera Facultad de Ciencias Microbiología Industrial

TABLA DE CONTENIDO

1. INTRODUCCIÓN ................................................................................................ 1

2. JUSTIFICACIÓN Y PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ............................... 2

3. MARCO TEÓRICO Y REFERENTES CONCEPTUALES ................................. 3

4. OBJETIVOS

4.1 Objetivo general ............................................................................................ 4

4.2 Objetivos específicos .................................................................................... 4

5. MATERIALES Y MÉTODOS

5.1 Obtención de microorganismos .................................................................... 4

5.2 Evaluación cualitativa ................................................................................... 4

5.3 Evaluación cuantitativa ................................................................................. 4

5.4 Evaluación cuantitativa de la actividad enzimática celulolítica

5.4.1 Preparación del inóculo ..................................................................... 5

5.4.2 Curva de crecimiento ......................................................................... 5

5.4.3 Cuantificación de la actividad enzimática ......................................... 5

5.5 Conservación de microorganismos .............................................................. 6

5.6 Análisis estadístico ...................................................................................... 7

6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

6.1 Evaluación cualitativa .................................................................................. 7

6.2 Evaluación cuantitativa ................................................................................ 9

7. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES .................................................. 15

8. BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................... 15

9. ANEXOS........................................................................................................... 17

RESUMEN Objetivo. Este trabajo se realizó con el fin de evaluar la actividad enzimática celulolítica de microorganismos aislados de suelos de cultivos de arroz. Materiales y métodos. Se realizó la medición de la actividad celulolítica cualitativa sobre medios agarizados mediante la técnica de revelado con rojo congo, posterior a esto se realizaron fermentaciones en discontinuo durante 24 horas para el caso de los aislamientos bacterianos y durante 12 días para los aislamientos fúngicos, tomando muestras correspondientes a las horas: 0, 4, 8, 12, 16, 20, 24, y los días 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12 respectivamente. Por medio de la técnica colorimétrica de Somogyi-Nelson se realizó la cuantificación de azúcares reductores totales en los extractos crudos obtenidos de cada una de las horas de fermentación, adicionalmente por medio de la técnica del papel filtro Whatman se determinó la actividad enzimática utilizando la misma técnica colorimétrica para la cuantificación de los azúcares reductores obtenidos después de la reacción enzimática; finalmente se realizó la técnica de crio-conservación con glicerol al 25% para los aislamientos bacterianos y conservación en agua destilada estéril para los aislamientos fúngicos Resultados. El valor más alto de actividad enzimática medida en UC se obtuvo con el aislamiento bacteriano identificado como MF15522.1-3 con 0,008 UC; para los aislamientos fúngicos se obtuvo el valor más alto para el aislamiento identificado como TF322-2 con 0,007 UC. Se evidenció aproximadamente 10 veces mas actividad por parte de los aislamientos tanto fúngicos como bacterianos en el caldo tamo de arroz que en el caldo celulosa. Conclusiones. Se observó una disminución en promedio del 80% en la actividad enzimática medida de manera cualitativa después del tiempo de conservación de los aislamientos bacterianos. PALABRAS CLAVES: Celulosa, tamo de arroz, enzimas, celulasas.

1. INTRODUCCIÓN

Las celulasas son enzimas de gran importancia en la industria, debido a sus diferentes aplicaciones, por ejemplo en la producción de alimentos y de papel (1). Debido a la composición de los residuos vegetales, en un 90% celulosa y 10% de lignina, las celulasas se convierten en una alternativa importante para acelerar la degradación de dichos residuos, disminuyendo así el impacto ambiental que se ha generado como resultado del manejo inadecuado de estos. Los microorganismos son los encargados de la producción de enzimas celulasas y por lo tanto de la degradación de la celulosa, componente principal de la pared celular de las plantas, incluyen bacterias, hongos y actinomicetos, aerobios, anaerobios, mesofílicos y termofílicos, los cuales cuentan con el sistema enzimático necesario para dicho propósito (2). La actividad enzimática llevada a cabo por estos microorganismos representa una de las estrategias que llevarían a mejorar y complementar el efecto de los fertilizantes químicos, con otras alternativas como fuentes orgánicas y biofertilizantes. La biofertilización es una alternativa viable que permite compensar las necesidades nutricionales de las plantas, reducir costos de producción y disminuir el efecto contaminante ambiental por parte de los fertilizantes químicos utilizados en cultivos de arroz. Las funciones más importantes que cumplen

los consorcios microbianos utilizados para la biofertilización son: el suministro directo de nutrientes (Fijación de nitrógeno), la transformación de compuestos orgánicos que la planta no puede tomar a formas inorgánicas que si pueden ser asimiladas; aumento del desarrollo radicular en la planta que mejora la asimilación de nutrientes y el mejoramiento de las propiedades físicas y químicas del suelo (3). Por lo anterior, el objetivo principal de este proyecto es la medición cuantitativa de la actividad enzimática de bacterias y hongos aislados de suelos de cultivos de arroz, con el fin de seleccionar aquellos aislamientos que presenten mayor actividad enzimática medida en unidades celulolíticas, para ser usados posteriormente en la formulación de un bioinoculante, el cual aumentará la tasa de degradación de los residuos lignocelulósicos en los suelos de los cultivos, incrementándose así la disponibilidad de nutrientes, lo que se verá reflejado en el aumento en la producción y rendimiento del cultivo. 2. JUSTIFICACIÓN Y PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

Las actividades desarrolladas por el hombre a través de los años han generado un sin número de consecuencias medio ambientales de grave impacto, siendo la ganadería intensiva, la explotación de recursos naturales no renovables como el petróleo y la agricultura, ejemplos característicos de la emisión de gases de tipo invernadero (CO2, CH4 y N2O) a la atmósfera. Principalmente la agricultura y en especial los cultivos de arroz, son la actividad responsable de la producción y emisión de más de la mitad de este tipo de gases, estudios realizados plantean que en épocas de inundación permanente y en presencia de grandes cantidades de materia orgánica (residuos de cosecha), se generan en promedio 20-40mg/m

2/h de CH4 (4), siendo ésta cifra un

llamado para buscar la mejora en el manejo de dichos residuos, convirtiéndose la degradación por medio de microorganismos con actividad celulolítica en una de las alternativas más viables y amigables con el medio ambiente. La generación de metano se da como resultado del metabolismo de los microorganismos que en condiciones de inundación permanente se encuentran bajo un ambiente anaerobio y por lo tanto el metabolismo para la degradación de la celulosa se da bajo estas condiciones convirtiendo así los azucares fermentables y otros polisacáridos en metano y dióxido de carbono (5). Debido a la composición biológica de los residuos de cosecha, en un alto porcentaje celulosa, éstos pueden ser utilizados por algunos microorganismos como fuente nutricional, acelerando así el proceso de degradación bajo condiciones controladas que evitarán la producción de metano; por lo tanto es de gran importancia evaluar la capacidad enzimática celulolítica de aislamientos bacterianos y fúngicos previamente aislados de suelos de cultivos de arroz con miras a la producción de un bioinoculante que acelere la degradación de los residuos y disminuya la emisión de gases tipo invernadero a la atmósfera (6). Con lo anterior, la contribución que tendrá este proyecto para el macro proyecto financiado por el Ministerio de Agricultura, será la selección de los aislamientos con mayor actividad enzimática medida en unidades celulolíticas, contando así probablemente con el componente principal del bioinoculante que se han propuesto desarrollar la Universidad Nacional de Colombia, la Pontificia Universidad Javeriana, FEDEARROZ y Biocultivos S.A..

3. MARCO TEORICO - REFERENTES CONCEPTUALES

La celulosa es uno de los compuestos más abundantes en la naturaleza, se encuentra en la pared celular de las plantas, es sintetizada por estas y por algunos organismos como animales marinos y bacterias del género Bacillus, Acetobacter, Agrobacterium, Rizhobium, entre otras. Es un polisacárido que en combinación con la hemicelulosa y la lignina constituye la fracción lignocelulósica la cual se genera en grandes cantidades durante las actividades agrícolas y madereras. Estos residuos han sido objeto de muchas investigaciones que han llevado a su utilización como sustratos en los procesos fermentativos, principalmente para la producción de combustibles y alimentos alternativos que aminoren los problemas derivados de la crisis energética, la escasez de proteínas y la contaminación ambiental (7). Para la degradación enzimática de la celulosa se hace necesaria la participación de un grupo de enzimas, celulasas, que hidrolizan oligosacáridos y polisacáridos unidos mediante enlaces ß 1-4 en monómeros de glucosa. Estas enzimas actúan de manera complementaria ya que sería imposible la degradación total de éste compuesto con un solo tipo de enzima, por tal razón las celulasas se clasifican en endoglucanasas, exoglucanasas, celobiohidrolasas y glucosidasas (8). De manera específica la endo β 1,4 glucanasa hidroliza aleatoriamente los enlaces β-1,4 glucosídicos intramoleculares para generar oligosacáridos de varias longitudes. La exo β-1,4 celobiohidrolasa cliva los extremos no reductores del sustrato generando unidades de celobiosa o glucosa y por último la β-1,4 glucosidasa, completa el proceso hidrolítico convirtiendo los fragmentos de celobiosa a glucosa (9). Diversos microorganismos como las bacterias y hongos han sido estudiados por su capacidad para degradar la celulosa en monómeros de glucosa, pero son pocos los seleccionados por su potencial de producción. Se ha encontrado actividad celulolítica en bacterias y hongos tanto aerobios como anaerobios tales como: Trichoderma reesei, Clostridium, Streptomyces, Thermomonospora y Thermobifida, Ruminococcus, Anaeromyces mucronatus, Caecomyces communis, Cyllamyces aberencis, Neocallimastix frontalis, Orpinomyces sp. y Piromyces, Cellulomonas, Bacillus y los hongos basidiomicetos responsables de la pudrición de la madera como Trametes (10). En la actualidad el estudio de los microorganismos capaces de degradar diferentes tipos de residuos como los domésticos y agroindustriales, ha tenido gran importancia, debido al potencial que muestran los microorganismos y al uso de los subproductos que se pueden obtener bajo condiciones controladas, por ejemplo etanol. Jeya et al en el 2009 (1) reportaron que Trametes hirsuta es capaz de generar azúcares reductores a partir de la biomasa celulósica proveniente de residuos de arroz y además aseguran que éste es un sustrato adecuado para la producción de este tipo de enzimas bajo condiciones de pH, temperatura y concentraciones de sustrato determinadas previamente, por lo anterior se confirma el uso de microorganismos en la degradación de residuos ricos en celulosa.

4. OBJETIVOS

4.1 Objetivo General

Evaluar cuantitativamente la actividad enzimática celulolítica de microorganismos aislados de suelos de cultivos de arroz.

4.2 Objetivos Específicos

Evaluar y seleccionar los aislamientos bacterianos y fúngicos que presenten mayor actividad celulolítica, medida cualitativamente sobre medios agarizados.

Cuantificar la actividad enzimática de los aislamientos seleccionados sobre dos sustratos específicos (tamo de arroz y celulosa).

Seleccionar y conservar los aislamientos que presenten mayor actividad enzimática sobre los sustratos evaluados.

5. MATERIALES Y METODOS

5.1 Obtención de Microorganismos

El estudio se realizó con microorganismos celulolíticos provenientes de muestreos de suelos cultivados con arroz en los departamentos de Tolima y Meta, los cuales fueron seleccionados en trabajos anteriores (11,12), por su actividad enzimática medida cualitativamente sobre medios agarizados. 5.2 Evaluación Cualitativa La evaluación cualitativa se realizó a partir de viales del banco primario conservados en glicerol al 25% (v/v) a -20°C (Anexo 1.4), realizando un aislamiento en agar celulosa (Celulosa Alimentaria 10 g/L, peptona especial 2,5 g/L, extracto de Levadura 2,5 g/L, Cloruro de Calcio 0,5 g/L, Fosfato dibásico de potasio 0,1 g/L, Fosfato monobásico de potasio 0,1 g/L, Sulfato de Amonio 0,5 g/L, Agar 15g/L), posteriormente la actividad celulolítica se evidenció mediante evaluación cualitativa con el reactivo Rojo Congo. Teather y Wood en 1982, observaron que este podía ser usado para evidenciar la hidrólisis de polisacáridos ya que el colorante puede formar complejos con las moléculas no hidrolizadas facilitando así la diferenciación entre microorganismos celulolíticos y no celulolíticos, por la formación de zonas de aclaramiento alrededor de la colonias (13). 5.3 Evaluación Cuantitativa La evaluación cuantitativa se realizó para los aislamientos que presentaron mayor halo de hidrólisis sobre los medios agarizados, siendo tres aislamientos de origen bacteriano (T393, MF1022-3B y MF1522.1-3) y dos de origen fúngico (TT812-1,

TF322-2). Para la evaluación cuantitativa se utilizó la técnica colorimétrica de Somogy-Nelson (14,15), para dicha técnica se realizó una curva patrón utilizando una solución Stock de glucosa con una concentración de 20mg/L (Anexo 2). Para la evaluación cuantitativa se realizaron curvas de crecimiento por triplicado en dos sustratos (tamo de arroz y celulosa) para cada uno de los aislamientos, tomando muestras a lo largo del tiempo de fermentación con el fin de determinar azúcares reductores mediante la técnica de Somogy-Nelson que se detallará mas adelante. Por otro lado, se evaluó la actividad enzimática de cada uno de los aislamientos, usando como sustrato papel filtro Whatman (Anexo 2.3) en buffer citrato pH: 5,0 (Anexo 1.5), relación 1:1, con tiempo de reacción extracto crudo-sustrato de 60 minutos a 37 ±2°C.

5.4 Evaluación cuantitativa de la actividad enzimática celulolítica

5.4.1 Preparación del inóculo Para evaluar la actividad enzimática de los aislamientos bacterianos, a partir de un vial conservado en glicerol al 25% a -20°C, se reactivó la cepa en agar celulosa (Anexo 1.1) y se llevó a incubación por 24 horas a 37°C, una vez crecido el microorganismo se procedió a realizar un suspensión en 10mL de solución salina al 0.85%, con una concentración igual al tubo No. 1 del patrón de Mc Farland (3x10

8

células/mL). Se realizó coloración de Gram para verificar pureza del inóculo. El montaje del inóculo se realizó por triplicado. En el caso de la evaluación enzimática de los aislamientos fúngicos, a partir de una caja de agar celulosa con el microorganismo crecido se tomaron tres discos de agar y se inocularon en 100 mL de caldo celulosa y tamo de arroz, por triplicado. 5.4.2 Curva de crecimiento Una vez obtenido el inóculo para la evaluación de la actividad enzimática de los aislamientos bacterianos, los 10mL de éste fueron transferidos a Erlenmeyers de 250mL con 90mL de caldo celulosa (Anexo 1.1) y caldo tamo de arroz (Anexo 1.2), obteniéndose un volumen efectivo de trabajo de 100mL. Los Erlenmeyers se incubaron a 37ºC, 150 rpm durante 24 horas. Se tomaron muestras cada 4 horas, para determinar: pureza del cultivo mediante coloración de Gram, azúcares reductores por medio de la técnica Somogy-Nelson y actividad enzimática sobre papel filtro. Para cada una de las muestras se llevó a cabo el siguiente procedimiento: Una vez comprobada la pureza del cultivo, los 5mL de la muestra se centrifugaron a 5.000 rpm durante 30 minutos, luego de esto el extracto obtenido fue transferido a otro tubo Falcon con el fin de repetir el procedimiento. A continuación se retiró el sobrenadante y se depositó en tubos falcon de 15mL, para la determinación de azúcares reductores y actividad enzimática (todas las determinaciones se realizaron por triplicado) procedimientos que serán detallados más adelante.

5.4.3 Cuantificación de la actividad enzimática. A partir del extracto crudo obtenido durante cada tiempo de muestreo, se realizó la determinación de azúcares reductores presentes en el medio de cultivo, siguiendo la técnica de Somogy-Nelson. Para esto se transfirieron 250 µL del extracto crudo a tubos tapa rosca de 13x100mm, a los cuales se adicionaron 200 µL del reactivo Somogy 1, manteniendo los tubos cubiertos debido a que el reactivo es fotosensible, a continuación se adicionaron 50 µL del reactivo Somogy 2, sellando los tubos tapa rosca para evitar la entrada de vapores de agua y se llevaron durante 30 minutos a agua en ebullición en baño serológico. Posteriormente se adicionaron 250µL del reactivo de Nelson a cada tubo, los tubos se dejaron en oscuridad durante 24 horas a temperatura ambiente con las tapas flojas para dejar salir el gas generado en la reacción; al pasar las 24 horas se adicionaron 750µL de agua destilada y posteriormente se realizó la lectura en el espectrofotómetro a 595nm, usando como blanco los reactivos de Somogy-Nelson con agua destilada. Para la evaluación cuantitativa de la actividad enzimática celulolítica se llevó a cabo la metodología descrita por Maryam Latifian, 2007 (16) modificada. Para esto se preparó un buffer citrato de sodio pH 5,0 (Anexo 1.5), luego se tomó 1mL de cada extracto y se mezcló con 1mL de buffer citrato con una tira de papel filtro Whatman de 1x6 cm, la mezcla se incubó a 37ºC durante 60 minutos, para que se llevara a cabo la reacción extracto crudo-sustrato. Posteriormente, se evaluó la actividad enzimática celulolítica por medio de la determinación de azucares reductores generados, mediante la técnica de Somogy-Nelson, siguiendo el procedimiento descrito

anteriormente. La unidad celulolítica (UC) se definió como la cantidad de azucares reductores (glucosa) en micromoles liberados por minuto por litro, bajo las condiciones de ensayo (17). Para la cuantificación de azúcares reductores y actividad enzimática de los aislamientos fúngicos se llevó a cabo el mismo procedimiento de medición descrito anteriormente, cambiando algunas de las condiciones del ensayo como la duración de la curva de crecimiento que en éste caso fue de 12 días, la temperatura (30°C), la agitación fue igual (150rpm) y los muestreos se realizaron cada dos días.

5.5 Conservación de microorganismos

A partir de viales del banco primario conservados en glicerol al 25% (v/v) se hizo una siembra en agar Celulosa 1% (p/v). Las cajas fueron incubadas a 37°C durante 24 horas. Luego del tiempo de incubación se hizo coloración de Gram para verificar pureza del cultivo. De los cultivos axénicos en agar Celulosa 1%(p/v), se realizaron suspensiones de cada una de las cepas en solución salina 0,85%(p/v), igualando la concentración al tubo 1 del patrón de Mc. Farland (3x10

8cel/ml). Estas suspensiones

se mezclaron con glicerol estéril al 50% (v/v) (Anexo 1.4) logrando finalmente suspensiones en glicerol al 25% (v/v), las cuales fueron distribuidas en tubos eppendorf, con volumen final de 1mL, los cuales fueron almacenados a –20ºC (18). Los hongos que demostraron mejor actividad enzimática en la evaluación cualitativa, fueron sembrados en agar celulosa, incubados a 30ºC durante 8 días, o en su defecto

hasta que su crecimiento fuese suficiente para llevar a cabo la conservación; a partir de los cuales se extrajeron discos de agar que contuvieran micelio, con la ayuda de una pipeta Pasteur invertida, y fueron depositados en tubos eppendorf que contenían 1mL de agua destilada estéril, éstos fueron almacenados a -4 ºC (19). 5.6 Análisis Estadístico

Para el análisis estadístico de los datos obtenidos, se realizó un análisis de varianza y se aplico la prueba de ANOVA para determinar si entre las medias de la actividad enzimática de las cepas a evaluar existen diferencias significativas. Se trabajó en el programa SPSS versión 17 (Los resultados se muestran en el Anexo No. 3). 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

6.1 Evaluación Cualitativa En trabajos anteriores (11,12) se seleccionaron los aislamientos que presentaron mayor actividad enzimática sobre agar celulosa medida como halos de hidrólisis en milímetros. Con el fin de verificar si los microorganismos mantenían su actividad enzimática después del tiempo de conservación, se realizó nuevamente la técnica cualitativa a éstos aislamientos; partiendo de los viales crio conservados en glicerol al 25% a -20°C, los cuales llevaban en promedio un año bajo éstas condiciones. Al observar la tabla 1 se evidencia que los aislamientos bacterianos pierden notoriamente la actividad enzimática celulolítica medida de manera cualitativa durante el tiempo de conservación; viéndose esto reflejado en la disminución del tamaño de los diámetros de los halos de hidrólisis, que en promedio disminuyó un 80%. El uso de crio protectantes como el glicerol es uno de los métodos más utilizados para la conservación de cepas bacterianas y se convierte en uno de los factores esenciales a tener en cuenta para mantener la actividad enzimática que posee el microorganismo. Debido a que los microorganismos son susceptibles a las condiciones de congelación/descongelación y a los cambios en la presión osmótica; como lo reporta Xu et al en el 2005 (21), se deben evaluar diferentes técnicas de conservación para las cepas que han sido aisladas durante el desarrollo del macropoyecto, con el fin de encontrar el método adecuado para mantener la actividad enzimática o que tenga un efecto mínimo en su pérdida. En el estudio realizado por los autores se encontró que el crio-protectante que tuvo mejor efecto en cuanto a la protección de la actividad enzimática fue el acetato de sodio anhidro, esto para el caso de un microorganismo con actividad de tipo esterasa, para el caso de las celulasas en la búsqueda bibliográfica realizada no se encontraron métodos de conservación o crio-protectantes específicos por tal razón es recomendable evaluar métodos diferentes al utilizado en ésta investigación. Por otro lado, según lo plantea Voyron et al (22) en el 2009, existen técnicas como la crio-conservación a -80°C, la liofilización y conservación con nitrógeno líquido entre otras, que según los resultados obtenidos por los autores, ningún método de los evaluados permitió mantener intacta la actividad enzimática; ya que al evaluarla después del tiempo de conservación, ésta se vio afectada en todos los métodos,

aclarando que algunos presentaron menor incidencia en la disminución. Por otro lado la pérdida de la actividad enzimática se pudo dar como resultado de una posible mutación, debido que éstos microorganismos desde el momento de la toma de muestras en las fincas cultivadas con arroz, fueron sometidos a varios pases en medio agarizados para lograr su purificación. Tabla 1. Verificación de los halos de hidrólisis de los aislamientos bacterianos realizados

en trabajos anteriores (11,12).

Cepa Coloración

Diámetro de halo (mm) Primera

evaluación

Diámetro de halo (mm) Segunda

evaluación

Muestreo

M991 Bacilos Gram positivos 8 2 1


T383 Bacilos Gram positivos

esporulados 10 4 1

T434 Bacilos Gram positivos 16 3 1


esporulados 12 2 1




esporulados 13 3 1



esporulados 20 2 1


esporulados 20 3 1


esporulados 11 3 1



M13192 Bacilos Gram positivos

esporulados 14 3 1


MF1021-3 Bacilos Gram positivos ND 1 2


MF1431-3A Bacilos Gram positivos

esporulados ND 1 2

MF1411-4B Bacilos Gram positivos ND 2 2

MF1232-6B Bacilos Gram positivos

esporulados ND 2 2

MF1022-3B Bacilos Gram positivos ND 5 2

MF1022-3A Bacilos Gram positivos ND 1 2


MF1132-5A Bacilos Gram positivos ND 2 2


Cepa Coloración

Diámetro de halo (mm) Primera

evaluación

Diámetro de halo (mm) Segunda

evaluación

Muestreo

MF1331-4 Bacilos Gram positivo ND 2 2

MF922-5C Bacilos Gram positivos ND 1 2

MF1522.1-3 Bacilos Gram positivos ND 12 2

Tabla 2. Aislamientos fúngicos Segundo Muestreo

Cepa Azul de

Lactofenol Color

Anverso Color

Reverso Textura Anverso

Textura Reverso

Diámetro de Halo

TT812-1

Conidióforo, Fiálides, Conidios, hifas hialinas no septadas

Café-Blanco Café Correosa Cremosa 14

TF322-2

Hifas hialinas no septadas, conidios

Verde-Café Café Correosa Cremosa 12

*Fuente: Autores

6.2 Evaluación cuantitativa En las figuras 1, 2 y 3 se observan los resultados de la cuantificación de los azúcares reductores presentes en el medio de cultivo y de la actividad enzimática de los tres aislamientos bacterianos evaluados, identificados como T393, MF 1022-3B y MF 1522.1 -3 respectivamente, en dos sustratos (caldo celulosa y tamo de arroz). Los tres aislamientos expresaron una tendencia similar, en donde la mayor actividad enzimática la generó el aislamiento bacteriano MF 1522.1 -3 con 0.008 UC en caldo tamo de arroz. Solo uno de los tres aislamientos (MF 1522.1 -3), mostró actividad enzimática en caldo celulosa. Lo anterior se puede dar como consecuencia del origen del aislamiento de los microorganismos (suelos de cultivos de arroz), demostrando mayor afinidad por el sustrato o fuente nutricional con la que han estado en contacto, siendo ésta el tamo de arroz, generando mayor actividad en éste medio de cultivo. Kaya y colaboradores sostienen cómo la lignina puede ejercer un efecto inductor sobre algunas endoglucanasas, favoreciendo la degradación de sustratos con alto porcentaje de lignina como el tamo de arroz (23). El caldo celulosa tiene componentes nutricionales adicionales a la fuente de carbono como las fuentes de nitrógeno (peptona especial y extracto de levadura) a partir de las cuales el microorganismo puede crecer sin la necesidad de iniciar su metabolismo enzimático para generar azúcares, procesos que para los microorganismos implican gasto de energía, por lo tanto si éste tiene lo necesario para su desarrollo no va a realizar un gasto energético innecesario. De las tres figuras al mostrar una tendencia similar, se puede concluir que en el momento en el que se agotan los azúcares reductores en el medio, de la hora 2 a la 4, para el caso del caldo tamo de arroz, inmediatamente se evidencia la actividad enzimática, fenómeno que también se observa en el caldo celulosa pero con valores de UC no representativos al ser comparados con los obtenidos en el caldo tamo de arroz.

Tiempo (horas)

0 4 8 12 16 20

Azú

care

s r

ed

ucto

res (

µg

.mL

-1)

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Tamo

Celulosa

0 4 8 12 16 20

UC

(µ

mo

l g

luco

sa.m

in.L

-1)

0,000

0,002

0,004

0,006

0,008

0,010

Tamo

Celulosa

BA

Figura 1. Resultados de la Bacteria T393. A) Azucares Reductores (µg.mL-1) Vs Tiempo

(Horas). B) Unidades Celulolíticas (µmol glucosa/minL-1)

Tiempo (Horas)

0 4 8 12 16 20

Azu

care

s R

ed

ucto

res u

g m

L-1

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Tamo

Celulosa

0 4 8 12 16 20

Un

idad

es C

elu

loli

ticas u

mo

l/m

in L

-1

0,000

0,002

0,004

0,006

0,008

0,010

Tamo

Celulosa

C D

Figura 2. Resultados de la Bacteria No. 2 (MF 1022-3B). A) Azucares Reductores (µg.mL-

1) Vs Tiempo (Horas). B) Unidades Celulolíticas (µmol glucosa/minL-1)

Tiempo (Horas)

0 4 8 12 16 20

Azú

care

s R

ed

ucto

res (

µg

/mL

)

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Tamo

Celulosa

FE

4 9 14 19 24

UC

(µ

mo

l g

luco

sa/m

inL

-1)

0,000

0,002

0,004

0,006

0,008

0,010

Tamo

Celulosa

F

Figura 3. Resultados de la Bacteria No.3 (MF 1522.1 -3). A) Azucares Reductores (µg.mL-

1) Vs Tiempo (Horas). B) Unidades Celulolíticas (µmol glucosa/minL-1)

En las figuras 4 y 5 se observa el comportamiento de los aislamientos fúngicos identificados como TT 812-1 y TF 322-2 respectivamente en caldo celulosa y tamo de arroz. Los dos aislamientos expresaron una tendencia similar, en donde la mayor actividad enzimática la generó el aislamiento fúngico TF 322-2 con 0.007 UC, tanto en caldo celulosa como en tamo de arroz, diferencia significativa al ser comparados con los aislamientos bacterianos que en su mayoría (2 de 3) demostraron actividad enzimática solamente en caldo tamo de arroz. En los dos aislamientos fúngicos se observa al igual que con los aislamientos bacterianos que cuando se agotan los azúcares reductores presentes en el medio (hora 2) se generan los picos más altos de actividad enzimática, lo particular y aquello que hace que exista un diferencia estadísticamente significativa con los aislamientos bacterianos es que éstos a lo largo de los días de fermentación siguen demostrando actividad enzimática indicando que los aislamientos fúngicos presentan un mejor potencial en la degradación de residuos de cosecha en campo como se demostró en la investigación de Delfín y Duran en el 2003, en la cual se evidencia el potencial de un hongo de podredumbre blanca (Pleurotus spp) en la degradación de residuos urbanos ricos en celulosa y lignina (24). El potencial de los hongos en la degradación de residuos ricos en celulosa se da como resultado de la alta actividad exoglucanasa, como ha sido reportado para hongos como Trichoderma harzianum y Penicillium sp., que al estar compuestos por seis grandes celulasas, dos con actividad endoglucanasa y cuatro con actividad exoglucanasa (CBHI, CBHII, EGI, EGII, EGY y Man) (25), promueven la lenta liberación de monómeros o dímeros de glucosa. En ésta investigación aunque las unidades celulíticas sean bajas no indica que los aislamientos fúngicos evaluados no

posean potencial en la degradación de los residuos de cosecha debido a que como se dijo en éstos predomina la actividad exoglucanasa que genera polímeros con extremos no reductores que no van a ser detectados por la técnica colorimétrica.

Tiempo (Dias)

0 2 4 6 8 10 12

Azu

care

s R

ed

ucto

res u

g m

L-1

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Tamo H1

Celulosa H1

Tiempo (Días)

0 2 4 6 8 10 12

UC

(u

mo

l/m

in L

-1)

0,000

0,002

0,004

0,006

0,008

0,010

Tamo H1

Celulosa H1

G H

Figura 4. Resultados del Hongo No.1 (TT 812-1). A) Azucares Reductores (µg.mL

-1)

Vs Tiempo (Horas). B) Unidades Celulolíticas (µmol glucosa/minL-1

)

Tiempo (Días)

0 2 4 6 8 10 12

Azu

care

s R

ed

uc

tore

s (

ug

mL

-1)

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Tamo H2

Celulosa H2

0 2 4 6 8 10 12

UC

(u

mo

l/ m

in L

-1)

0,000

0,002

0,004

0,006

0,008

0,010

Tamo H2

Celulosa H2

Figura 5. Resultados del Hongo No.2 (TF 322-2). A) Azucares Reductores (µg.mL

-1)

Vs Tiempo (Horas). B) Unidades Celulolíticas (µmol glucosa/minL-1

)

Al observar los resultados de la Tabla 1 (Verificación de los halos de hidrólisis de los aislamientos bacterianos realizados en trabajos anteriores (11,12); se esperaría la mayor actividad enzimática medida en UC en el aislamiento identificado como MF1522.1-3 debido a que tenía el mayor valor de halo de hidrólisis al realizar la técnica cualitativa (12 mm), siguiendo respectivamente el aislamiento bacteriano identificado como T393 y finalmente el de menor actividad enzimática sería MF1022-3B, lo anterior se daría si existiese una correlación entre el tamaño de los halos y la medición de la actividad enzimática de manera cuantitativa. Al observar las figuras 1, 2 y 3 se observa que el aislamiento bacteriano identificado como MF 1522.1 -3 (Figura 3) es aquel que presenta mayor actividad enzimática en unidades celulolíticas (0,008UC) tanto en caldo celulosa como tamo de arroz, le sigue el aislamiento bacteriano identificado como MF1022-3B (Figura 2) con 0.007UC en caldo tamo de arroz y por último el aislamiento identificado como T393 (Figura 1) con 0.006UC en caldo tamo de arroz; resultados que indican que no existe una correlación directa entre el tamaño del halo y la producción de las enzimas, en el caso del aislamiento MF1522.1-3 el cual tenía mayor valor de diámetro de halo (12 mm), si fue aquel con el que se obtuvo el valor mas alto en unidades celulolíticas, aunque como se nombra más adelante éstos valores de UC no son representativos al ser comparados con los obtenidos por otros autores. Una explicación viable ante la relación observada entre el tamaño de los halos y la producción de enzimas (evaluada de manera cuantitativa) es que la producción de celulasas se da bajo condiciones específicas de pH, fuentes nutricionales y temperatura, concluyendo que la evaluación enzimática de manera cualitativa es una aproximación poco real de la producción de las enzimas en cultivo líquido ya que en los medios agarizados se fracciona el polímero, generando los halos de hidrólisis, pero por el contrario en cultivo líquido el investigador se ve enfrentado a determinar condiciones tanto de cultivo como de prueba de la actividad enzimática, es por esto que como se ha realizado en el desarrollo del macropoyecto se recomienda trabajar de manera paralela a las evaluaciones cuantitativas en la optimización de medios y condiciones de cultivo que permitan su producción para así obtener mejores resultados en la cuantificación. Los resultados presentados anteriormente indican que bajo las condiciones del ensayo se obtuvieron unidades celulolíticas bajas al ser comparadas con los resultados obtenidos por Kumar et al en el 2000 (26), que obtuvieron 42 UC para un aislamiento fúngico en 10 días de fermentación, estos resultados se pudieron haber obtenido porque la temperatura a la cual fue incubado el ensayo de la actividad enzimática fue de 37°C durante una hora en ésta investigación y según lo reportado por Latifian et al, en el 2006 (16) la incubación de esta técnica se realizó a 50°C, variable que puede afectar notablemente los resultados del ensayo debido a que químicamente las enzimas necesitan de un catalizador que acelere la reacción en este caso la temperatura, que a valores mayores a 37°C pueden generar mayor cantidad de azúcares reductores, indicando así mayor actividad enzimática. Según lo reportado por Kumar et al en el 2000 (26) la temperatura de incubación fue de 37°C durante dos horas, observando evidentemente que las enzimas tendrán mayor tiempo de reacción, generando así mayor cantidad de azúcares reductores. Otro factor a tener en cuenta en el desarrollo de la técnica utilizada para evaluar la actividad enzimática de los microorganismos es que el complejo enzimático de las celulasas está conformado por tres tipos de enzimas las cuales tienen diferente

especificidad en cuanto al sitio de corte y por lo tanto generan diferentes polímeros, indicando que se deben realizar ensayos específicos para observar la producción de cada tipo de enzima, por ejemplo el ensayo realizado por Kumar et al en el 2000 (26) para la evaluación de las endo β 1,4 glucanasas, enzimas que liberan oligosacáridos de gran longitud que necesitan ser degradados por las otras enzimas del complejo para qué generen azúcares reductores que puedan ser detectados por la técnica colorimétrica y aumenten así las UC. En el estudio realizado por Ramírez y Coha (10) se encuentran las metodologías específicas para detectar cada una de las enzimas del complejo, de las cuales en ésta investigación solo se realizó la técnica para la actividad exo β 1-4 glucanasa. En el estudio realizado por Kumar et al en el 2000 (26) se indica que la incidencia de las fuentes nutricionales es significativa para la producción de celulasas. En el caso especifico de las fuentes de carbono; en los ensayos planteados por los autores se evidencia que el medio que contenía celulosa, suplementado con glucosa presenta 10 veces más unidades celulolíticas que el medio que solo contenía celulosa, fenómeno que explican ellos por represión catabólica, planteando que al haber exceso de sustrato (glucosa) se induce la producción de la enzima por la saturación que genera la glucosa. En esta investigación las fuentes de carbono fueron celulosa y tamo de arroz que contiene en un 44% Celulosa, fuentes que al ser polímeros de difícil degradación no generaron exceso de sustrato y por lo tanto no se indujo la producción de las enzimas por represión catabólica. En conclusión el hecho de que el medio de cultivo contenga una fuente de carbono de difícil degradación no asegura que ésta condición genere estrés al microorganismo y éste se vea obligado a la producción de las enzimas que van a degradar los polímeros para generar azúcares que pueda tomar como fuente nutricional, es por esto que al evaluar fuentes como sorbosa y xilano, fuentes poco comunes, se pueden obtener unidades celulolíticas significativas como las obtenidas por Kumar et al en el 2000 (26), 22,5 UC y 17 UC respectivamente, que es un valor realmente significativo al ser comprado con los obtenidos en ésta investigación.

7. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

Al observar los resultados de la medición cualitativa se evidencia una perdida de la actividad enzimática del 80% en promedio, al comparar con la literatura se puede determinar que la técnica de crio-conservación no es la más adecuada para este tipo de microorganismos ya que genera pérdida de la actividad celulolítica; por esto es recomendable evaluar diferentes métodos de conservación para determinar las condiciones óptimas de conservación y se genere así la menor pérdida de la actividad enzimática.

Los resultados de la medición de la actividad enzimática cuantitativa muestran que los microorganismos estudiados presentan UC más bajas al ser comparado con la literatura, y esto pudo deberse a que la producción de estas enzimas se ve influenciada por condiciones específicas de pH, temperatura, aireación, agitación, fuente de carbono y nitrógeno. Por eso se recomienda para próximos estudios evaluar

diferentes condiciones que determinen cuales son las más apropiadas para la producción de enzimas celulolíticas.

8. BIBLIOGRAFÍA

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structure and cellulolytic activity in agricultural soil amended with two biofertilizers. European Journal of Soil Biology. 2005; 41 21-29.

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(17) Ayala S. y Sánchez D. Caracterización y evaluación de la actividad pectinolítica y celulolítica de microorganismos aislados a partir de desechos cítricos. Trabajo de grado (Microbiología Industrial). Pontificia Universidad Javeriana. Facultad de Ciencias, Carrera de Microbiología industrial. Bogotá 2001. 93 páginas.

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(19) Pedroza et al 2007 (conservación de los hongos)

(20) Andrade LF., Arango R., Evaluación y cuantificación de la actividad enzimática celulolitica y ligninolítica de microorganismos aislados de cultivos de arroz en Tolima y Meta. Pontificia Universidad Javeriana. Trabajo de Grado. 2008

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(22) Voyron S., Roussel S., Munaut F., Varese G., Ginepro M., Declerck S., Filipello V. Vitality and genetic fidelity of white-rot fungi mycelia following different methods of preservation. Mycologycal Research. 2009; 13: 1027-1038

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(25) Rabinovich M., Melnick M., Bolobova A. The Structure and Mechanism of Action of Cellulolytic Enzymes. Biochemistry (Moscow) 2002; 67(8), 1026-1050.

(26) Kumar R., Dahiya J., Singh D., Nigam P. Production of endo-1,4-b-glucanase by a biocontrol fungus Cladorrhinum foecundissimum. Bioresourse Technology. 2000; 75: 95-97.

(27) Kumar R., Singh S., y Singh Om V. Bioconversion of lignocellulosic biomass: biochemical and molecular perspectives. J Ind Microbiol Biotechnol 2008; 35: 377-391.

ANEXOS

ANEXO 1.

1. PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS

1.1 Agar Celulosa

Componente Concentración g/L

Celulosa Alimentaria 10

Extracto de Levadura 2,5

Peptona Especial 2,5

Cloruro de Calcio 0,5

Sulfato de Amonio 0,5

Fosfato dibasico de Potasio 0,1

Fosfato monobásico de Potasio 0,1

Agar 15

* El caldo celulosa no contiene agar. 1.2 Caldo Tamo de Arroz


Tamo de Arroz 10

Extracto de Levadura 2,5

Peptona Especial 2,5

Cloruro de Calcio 0,5

Sulfato de Amonio 0,5

Fosfato dibasico de Potasio 0,1

Fosfato monobásico de Potasio 0,1

1.3 Solución Salina 0,85% (p/V)


Cloruro de Sodio (NaCl) 8,5

Agua Destilada Completar a 1000 mL

1.4 Glicerol 50%

Componente Concentración %

Solución Salina 0,85% 50

Glicerol 100% 50

1.5 Preparación Buffer Citrato pH: 5

1.5.1 Preparación Buffer Citrato pH 5

o Pesar 2,10g de Acido Cítrico y disolver en 100 mL de Agua Destilada o Pesar 10,24g de Citrato Trisódico Heptahidratado y disolver en 250 mL de

Agua Destilada. o Tomar 35 mL de Acido Cítrico y Mezclar lentamente con 65 mL de Citrato

Trisódico Heptahidratado para completar un volumen final de 100mL. o Medir pH con pH-metro, el valor debe ser de 5,0. o Agregar 1mL de Tween 80. o Envasar en frasco ámbar y guardar en refrigeración a 4°C.

ANEXO 2.

2. DETERMINACIÓN DE AZÚCARES REDUCTORES POR LA TECNICA SOMOGY-NELSON

2.1 Preparación de los Reactivos

2.1.1 Somogy 1

Compuesto g/200mL Carbonato de Sodio anhidro

(Na2CO3) 4.8g

Sal de Rochelle Tartrato sodio potasio tetrahidratado (KNa (C4

H4O6) * 4H2O):

2.4g

Bicarbonato se Sodio (NaHCO3):

3.2g

Sulfato de Sodio (Na2SO4): 28.8g

Agua destilada: Aforar a 200 mL En un beaker de 200 mL servir 100mL de agua destilada y disolver en agitación constante cada uno de los componentes hasta obtener una mezcla homogénea. Completar con agua destilada hasta un volumen de 200mL. En caso de precipitarse calentar antes de usar. Almacenar en frascos ámbar y en oscuridad. Nota: Es un reactivo incoloro, al adicionarse a la muestra toma una ligera coloración amarilla, con el tiempo, tiende a formar agregados de forma algodonosa, es recomendable calentarlo ligeramente hasta desaparecer la mayor cantidad de grumos, evitando altas temperaturas o ebullición.

2.1.2 Somogy 2

Compuesto g/50mL Sulfato cúprico pentahidratado

(CuSO4*5H20): 1g

Sulfato de Sodio (Na2SO4): 9g

Agua Destilada Aforar a 250mL

En un beaker de 50 mL con 25 mL de agua destilada disolver en agitación constante cada uno de los componentes hasta obtener una mezcla homogénea. Completar con agua destilada hasta un volumen de 50mL.

2.1.3 Nelson

Compuesto g/250mL

Ácido Sulfúrico (H2SO4): 10.6mL

Arsenato de Sodio heptahidratado(Na2HAsO4. 7H2O):

1.51g

Amonio Molibdato ((NH4)6Mo7O24.4H2O):

12.6g

Agua destilada: 239.4mL

Depositar en un beaker de 500 mL 225 mL de agua destilada disolviendo lentamente el molibdato de amonio, posteriormente se adiciona el ácido sulfúrico hasta obtener una mezcla homogénea. Paralelamente disolver arsenato de sodio heptahidratado en 12.6mL de agua destilada. Mezclar las dos soluciones aforando a un volumen de 250mL e incubar por 48 horas a 37ºC. Almacenar en frasco ámbar. Nota: Leer atentamente cada una de las instrucciones, siempre en agitación constante y si es posible a unos 40°C, sin que evapore, el reactivo de Nelson tiende a precipitarse debido a los 12,6g de amonio molibdato, así que se debe adicionar lentamente, mirar que se disuelva y seguir el procedimiento, siempre adicionando pequeñas cantidades, el éxito de la técnica se conoce cuando se adiciona el reactivo de Nelson, ya que se debe generar efervescencia y cambio de coloración a verde oscuro o azul.

2.2 Preparación de las soluciones de concentración conocida 20mg/100mL Empleando la formula V1*C1 = V2*C2. Se preparan 12 soluciones que tengan un volumen final de 1ml = 1000µL

Concentración Glucosa (µg/µL)

Volumen de Glucosa (µL)

Volumen de Agua Destilada

(µL) 0,005 25 975

0,01 50 950 0,02 100 900

0,03 150 850

0,04 200 800

0,05 250 750

0,06 300 700

0,07 350 650 0,08 400 600

0,09 450 550 0,10 500 500

0,12 600 400

2.3 CURVAS DE CALIBRACIÓN SOMOGY-NELSON

y = 7,7722x + 0,0315 R² = 0,9884

0,000

0,100

0,200

0,300

0,400

0,500

0,600

0,700

0,800

0,900

0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1

AB

SOR

BA

NC

IAS

CONCENTRACION GLUCOSA (µg/mL)

CURVA DE CALIBRACIÓN SOMOGY-NELSON 1

ANEXO 3.

3. Resultado del análisis estadístico ANOVA

y = 9,8329x - 0,2525 R² = 0,9945

00,10,20,30,40,50,60,70,80,9

1

0 0,05 0,1 0,15

AB

SOR

BA

NC

IA

CONCENTRACION GLUCOSA (µg/mL)

CURVA CALIBRACIÓN SOMOGY-NELSON 2.

ANEXO 4

4. Figuras de halos y aislamientos fungicos

Figura 1. Halos de hidrólisis de celulosa revelados con rojo congo en medio celulosa.

Figura 2. A. Microscopía del aislamiento fúngico TT812-1 B. Microscopía del aislamiento fúngico

TF 322-2.

Figura 3. Reverso de los aislamientos fúngicos

A B

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