DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIFÚNGICA IN VITRO DE EXTRACTOS VEGETALES SOBRE EL HONGO Mycosphaerella fijiensis

Morelet

Presentado por JOHANA OSPINA TRUJILLO

UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE PEREIRA FACULTAD DE TECNOLOGÍA

ESCUELA DE TECNOLOGÍA QUÍMICA PEREIRA- RISARALDA

Julio de 2007

DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIFÚNGICA IN VITRO DE EXTRACTOS VEGETALES SOBRE EL HONGO Mycosphaerella fijiensis

Morelet

TRABAJO DE GRADO Requisito parcial para optar al titulo de Tecnólogo Química

Presentado por

JOHANA OSPINA TRUJILLO

Director

JAIME NIÑO OSORIO

UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE PEREIRA FACULTAD DE TECNOLOGÍA

ESCUELA DE TECNOLOGÍA QUÍMICA PEREIRA- RISARALDA

Julio de 2007

CONTENIDO

Pág. Resumen................................................................................................................

i

Abstract..................................................................................................................

ii

Lista de figuras......................................................................................................

v

Lista de tablas.......................................................................................................

vi

Lista de anexos.....................................................................................................

vii

1. Introducción......................................................................................................

1

2. Marco teórico..................................................................................................... 2 2.1. Zona de estudio............................................................................................... 2.1.1. Reserva Natural Bremen-La Popa................................................................ 2.2. El cultivo........................................................................................................... 2.2.1. Origen y Taxonomía..................................................................................... 2.2.2. Clasificación genética................................................................................... 2.2.3. Ecología del cultivo....................................................................................... 2.3. El patógeno...................................................................................................... 2.3.1. Historia.......................................................................................................... 2.3.2. Origen........................................................................................................... 2.3.3. Identificación y clasificación.......................................................................... 2.3.3.1. Clasificación fase perfecta......................................................................... 2.3.3.2. Clasificación fase imperfecta..................................................................... 2.3.4. Ciclo de vida................................................................................................. 2.3.5. Diseminación................................................................................................ 2.3.6. Infección e interacción en el hospedero....................................................... 2.3.7. Síntomas de la enfermedad.......................................................................... 2.4. Control de la enfermedad................................................................................. 2.4.1. Prevención.................................................................................................... 2.4.2. Practicas culturales ...................................................................................... 2.4.3. Control químico ............................................................................................ 2.5. Efecto del crecimiento de la planta con relación a la 2.6. epidemiología de la enfermedad ....................................................................

2.6. Impacto económico sobre las cosechas ......................................................... 2.7. Características generales de las familias botánicas en estudio ...................... 2.7.1. Apocynaceae .............................................................................................. 2.7.2. Asclepiadaceae ........................................................................................... 2.7.3. Asteraceae .................................................................................................. 2.7.4. Euphorbiaceae ............................................................................................ 2.7.5. Rubiaceae ................................................................................................... 2.7.6. Solanaceae ................................................................................................. 2.8. Metabolitos secundarios ................................................................................

2.9. Bioplaguicidas ................................................................................................ 2.10. Biofungicidas de origen botánico ..................................................................

3. Justificación...................................................................................................... 4. Objetivos............................................................................................................ 4.1. Objetivos específicos ...................................................................................... 4.2. Objetivo general .............................................................................................. 5. Sección experimental ...................................................................................... 5.1. Materiales ....................................................................................................... 5.1.1. Reactivos ..................................................................................................... 5.1.2. Material de vidrio .......................................................................................... 5.1.3. Equipos ........................................................................................................ 5.1.4. Material vegetal ........................................................................................... 5.1.5. Tejido foliar de plátano infectado ................................................................. 5.2. Métodos .......................................................................................................... 5.2.1. Extracción del material vegetal .................................................................... 5.2.2. Elongación del tubo germinativo de ascosporas ......................................... 5.2.2.1. Cámara húmeda ....................................................................................... 5.2.2.2. Descarga de ascosporas .......................................................................... 5.2.3. Crecimiento radial ........................................................................................ 5.2.3.1. Obtención de cultivo monospórico de M. fijiensis ..................................... 5.2.3.1. Preparación y siembra del inóculo para ensayo de crecimiento radial ......................................................................................

5.2.3.2. Lectura del bioensayo y determinación del porcentaje de inhibición de los extractos..........................................................................

5.2.4. Preparación del medio de cultivo suplementado con extracto ..................... 6. Resultados y discusión ................................................................................... 7. Conclusiones .................................................................................................... 8. Recomendaciones ........................................................................................... 9. Anexos .............................................................................................................. 10. Bibliografía .....................................................................................................

LISTA DE FIGURAS

Pág. Figura 1. Puntos de recolección del material vegetal ............................................ Figura 2. Ciclo de vida sexual y asexual del patógeno M. fijiensis ....................... Figura 3. Estructuras asexuales de diseminación ................................................ Figura 4. Estructuras sexuales de diseminación ................................................... Figura 5. Tubo germinativo ramificado penetrando un estoma ............................. Figura 6. Estados de evolución de la enfermedad ................................................ Figura 7. Desarrollo de la planta de plátano ......................................................... Figura 8. Protocolo de cámara húmeda para descarga de ascosporas

de Sigatoka negra ..................................................................................

Figura 9. Protocolo de descarga de ascosporas de M. fijiensis ............................ Figura 10. Protocolo de obtención de un cultivo monospórico de M. fijiensis .......................................................................................

Figura 11. Protocolo de preparación de inóculo de M. fijiensis para sembrar por superficie ..........................................................................................................

LISTA DE TABLAS

Pág. Tabla 1. Productos químicos utilizados para el control de la Sigatoka negra ....................................................................................................... Tabla 2. Descripción de las plantas recolectadas en la Reserva Natural Bremen-La Popa .................................................................................................... Tabla 3. Pesos de los extractos obtenidos de las plantas recolectadas en la Reserva Natural Bremen-La Popa ................................................................ Tabla 4. Mezclas y concentraciones de solventes evaluados sobre M. fijiensis .................................................................................................... Tabla 5. Marcha fotoquímica realizada a extractos de n-hexano, diclorometano y metanólicos ..................................................................................

LISTA DE ANEXOS

Pág. Anexo 1. Prueba de Kruskal-Wallis ....................................................................... Anexo 2. Prueba de Tamhane (comparación de medias) para el último día de lectura (día 20) ..............................................................................

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RESUMEN

En este trabajo se evaluaron extractos metanólicos y de diclorometano de especies de plantas pertenecientes a las familias Apocynaceae, Asclepiadaceae, Asteraceae, Euphorbiaceae Rubiaceae y Solanaceae recolectadas en la reserva natural Bremen-La Popa (Filandia-Circacia, Quindío), sobre las fases de reproducción sexual y asexual del hongo Ascomiceto Mycosphaerella fijiensis Morelet, agente causal de la enfermedad más destructiva de los cultivos de plátano y banano conocida como Sigatoka negra; por medio del método de la elongación del tubo germinativo y de crecimiento radial respectivamente. Se encontró que un 30% de 20 extractos metanólicos y un 76.2% de extractos de diclorometano evaluados en la fase sexual de reproducción del hongo, causaron deformidad en los tubos germinativos de las ascosporas de M. fijiensis. Se determinó que en la fase asexual del hongo, un 10% de 20 extractos metanólicos y un 10.5% de 19 extractos de diclorometano evaluados, causaron efectos significativos en el crecimiento de las colonias de M. fijienis. De acuerdo al tamizaje fitoquímico realizado, los núcleos que se encuentran en la mayor parte de las especies que tuvieron actividad antifúngica sobre M. fijiensis son esteroles, triterpenos y flavonoides, pudiendo ser estos los responsables de dicha actividad. Palabras claves: Mycosphaerella fijiensis, ascosporas, biofungicidas, actividad antifúngica, plátano, bioensayo, crecimiento radial.

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1. INTRODUCCIÓN

La Sigatoka negra (SN) causada por el hongo ascomiceto Mycosphaerella fijiensis Morelet es la enfermedad más difundida y destructiva de los cultivos de plátano y otros cultivares de musa (Rodríguez et al., 1997). La diseminación de esta enfermedad ha sido favorecida por factores ambientales como el viento, la lluvia, las corrientes de los ríos y por el hombre con la movilización incontrolada de hojas infectadas (Fouré, 1989; Merchán, 2002). La SN se propaga y multiplica mediante conidios y ascosporas que son los que producen las manchas características de la enfermedad; los conidios se producen en los primeros estados o estadios de la enfermedad, mientras que las ascosporas se producen en los últimos estadios de la enfermedad (Merchan, 1997), siendo una fuente mayor de infección esta ultima, debido a que son más resistentes a las condiciones medioambientales (Fouré, 1989). En los cultivos de plátano, la SN causa pérdidas entre el 33 y el 50% debido a la reducción en el número de frutas por racimo, con menor tamaño y de menor grosor, además de causar la maduración prematura, resultando en una fruta de baja calidad y de bajo valor en el mercado (Stover, 1983; Mobambo et al., 1993). Actualmente el combate químico es la mejor y más usada alternativa para hacerle frente a esta enfermedad. Esta opción, trae consigo el deterioro del medio ambiente, problemas a la salud humana, la resistencia del hongo a los fungicidas, además de debilitar la competitividad del cultivo por los altos costos que estos productos representan (Orozco, 1998).

El control químico de la SN se considera de alto riesgo por los problemas de resistencia del hongo a algunos grupos de fungicidas como los de tipo benzimidazol (Romero et al., 1998; Stover, 1979) y los triazoles (Castro et al., 1995). Con el presente trabajo de investigación, se pretende evaluar el potencial antifúngico de especies botánicas de la Reserva Natural Bremen-La Popa (Filandia-Circasia, Quindío, Colombia) sobre las fases sexual y asexual del ciclo reproductivo M. fijiensis, por medio del método de elongación del tubo germinativo y del crecimiento radial respectivamente; con el propósito de implementar el uso de bioproductos para el control de la enfermedad y disminuir el uso de fungicidas sintéticos convencionales.

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2. MARCO TEORICO

2.1. ZONA DE ESTUDIO

2.1.1. Reserva Natural Bremen- La Popa

Según la Corporación autónoma regional del Quindío (CRQ) la Reserva Natural se encuentra en jurisdicción de los municipios de Filandia y Circasia en las veredas Cruces y Membrillal, a 22 kilómetros de Armenia, ocupa la parte alta de la Cuenca del Río Roble y tiene una extensión de 731 hectáreas, con una temperatura promedio de 16 °C y un rango altitudinal de 1.750 - 2.000 m.s.n.m. La reserva natural Bremen-La Popa, tiene áreas de regeneración natural, bosques nativos primarios y secundarios, destacándose especies como Talauma hernandezii, árbol en vía de extinción y el Media caro. Además se encuentran plantaciones de ciprés y pino pátula, las cuales se aprovechan con prácticas silviculturales adecuadas para favorecer las áreas la regeneración natural. Entre los atractivos de la Reserva se cuentan los senderos de interpretación ambiental, y el vivero con dos especies de Palma de cera y otras especies nativas como Otobo, Molinillo (Magnolia hernandezii), Media caro, Laurel amargo, bejucos, Yarumo blanco, Azuceno, Escobo, Aguacatillo, Chaquiro real, Caimo y Rapabarbo, entre la fauna representativa se encuentra el Búho, cuzumbo zorro, erizo carpinteros y oso perezoso.

2.2. EL CULTIVO DEL PLÁTANO 2.2.1. Origen y Taxonomía del plátano El plátano es una planta monocotiledónea herbácea y pertenece al orden Escitaminales, a la familia Musaceae y a la subfamilia Musoideae. Esta subfamilia tiene dos géneros: el Ensete al cual pertenecen numerosas plantas ornamentales y el Musa. El género Musa contiene entre 30 y 40 especies, todas diploides (2n=14, 18, 20, 22). Solo dos especies tienen actualmente importancia comercial, Musa acuminata y Musa balbisiana, dentro de este género se ubica también Musa textilis que tiene importancia en algunos países en la producción de cordelería (Martínez, 1997).

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El plátano y el banano, son frutas tropicales cuyo lugar de origen se encuentra en el sudeste asiático, probablemente Malasia, China Meridional e Indonesia. Sin

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embargo, la domesticación de las Musáceas se originó en el sudeste asiático, pero su distribución a nivel mundial solo ocurrió hace cerca de 2000 años (Simmonds 1962; Rodríguez et al, 2003). El plátano se cultivó principalmente en África e inicialmente fue llevado a la zona oriental por inmigrantes indonesios vía Madagascar, y posteriormente fue trasladado a la costa occidental de África por los Portugueses, en donde tuvo gran acogida en los países que poseían condiciones ecológicas del trópico húmedo (Uganda y Ruanda). En América se cree que la introducción del plátano fue hecha inicialmente por los árabes a España y de ahí fue introducido directamente a América o vía Islas Canarias. Acerca de la llegada del plátano a Colombia existen dos teorías i) fue traído a la zona del Darién de donde se difundió por toda la costa Pacifica ó ii) lo introdujeron los Padres Dominicos en el Orinoco y fue sembrado inicialmente en el municipio de San Martín, en los Llanos Orientales de Colombia (Martínez, 1998). 2.2.2. Clasificación genética La clasificación genética de los principales grupos de Musaceae cultivados se ha hecho con base en las dos especies parentales y en los juegos de cromosomas; existen especies AA, AAA, AB, AAB, ABB y ABBB, en donde A corresponde el gen Acuminata y B el gen Balbisiana. Se acepta que los triploides (AAA) son dominantes entre los bananos cultivados, porque ellos han sido seleccionados sobre los diploides (AA) por mayor vigor vegetativo y producción. Los genes de Balbisiana fueron importantes dentro del proceso de selección debido a que introdujeron resistencia a condiciones adversas y enfermedades, pero dieron mayores porcentajes de almidón y acidez a la fruta, características ideales para muchos consumidores que gustan consumirlos bajo diversas formas, una vez cocinados (Martínez, 1998). 2.2.3. Ecología del cultivo La temperatura óptima para el cultivo del plátano esta alrededor de los 27°C y es el factor ecológico que más afecta la frecuencia de emisión de hojas, alarmándose o acortándose el ciclo vegetativo dependiendo de la mayor o menor temperatura. El cultivo del plátano requiere unos 1800 mm anuales de precipitación y por ser una planta umbrófila nunca cierra totalmente sus estomas, por lo que las pérdidas de agua por transpiración son altas, además el cultivo se ve afectado seriamente por el viento cuando este excede los 20 Km/h, produciéndose ruptura de las hojas, lo que afecta seriamente la vida útil de las mismas; a mayores velocidades del viento puede ocurrir doblamiento de los seudotallos e incluso la caída total de las plantas. La humedad relativa es otro factor que afecta indirectamente el cultivo porque favorece la incidencia de enfermedades foliares, en especial las fungosas (Martínez, 1998).

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2.3. EL PATÓGENO

2.3.1. Historia La Sigatoka negra se originó en la región del Pacífico Sur entre Papua (Nueva Guinea) y las Islas de Solomon, que también se considera que está dentro del área de origen del género Musa. La enfermedad se describió primero como "raya de la hoja negra" en el Valle de Sigatoka en Fiji en 1963 (Rhodes, 1964). Sin embargo, la revisión de informes publicados han indicado que la Sigatoka negra ya estaba presente antes de su descubrimiento en otras áreas de Asia y el Pacífico (Meredith, 1970; Long, 1979; Stover, 1978). Leach (1964), describió la morfología del hongo y envió el material de la hoja a F.C. Deighton (Instituto de Micología, Kew, UK), quién propuso el nombre de Mycosphaerella fijiensis para el patógeno recientemente descubierto. El nombre fue validado después por Morelet (1969). Leach, y más tarde Meredith y Lawrence (1969), demostraron la conexión entre los estados imperfectos y perfectos del hongo. El anamorfo de M. fijiensis, primero descrito como Cercospora fijiensis Morelet, se transfirió a Pseudocercospora (Deighton, 1976) y después varió a Paracercospora como P. fijiensis (Morelet) (Deighton, 1979). La Sigatoka negra se observó primero como una enfermedad seria de los plátanos en las plantaciones en las Islas de Fiji a 100 km del valle de Sigatoka, el área de dónde la enfermedad tomó su nombre. En los años setenta, el personal de la plantación en Centroamérica acuñó el término "Sigatoka negra" para la enfermedad, porque una gran cantidad de manchas tenían una apariencia global más oscura que las de Sigatoka amarilla (Stover, 1980a). 2.3.2. Origen La Sigatoka negra está presente en todo el mundo en las áreas con clima tropical o subtropical húmedo. La enfermedad se desarrolla más rápidamente donde la humedad y lluvia son altas. Las temperaturas por debajo de 20 °C y los periodos secos inhiben el crecimiento del hongo. Los estudios en las diferentes zonas de M. fijiensis, solo ó en combinación con M. musicola, han sugerido que el centro de origen de las especies está en el área de las Islas de Solomon. Esta área es conocida como el lugar de origen de diferentes plátanos silvestres que podrían expresar muchas similitudes genéticas con tipos de bananos y plátanos de cocción (Mourichon et al., 1990). Por consiguiente, se considera que esta área puede ser el sitio principal de coevolución de este parásito. La enfermedad se descubrió primero en el Pacífico en 1963, se informó después en el Sudeste de Asia (1964), en América (1972) y en África (1978). En América Latina y el Caribe la enfermedad se observó primero en Centroamérica, en Honduras en 1972 cerca de La Lima (Stover, 1980b). De 1975 a 1977, la

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enfermedad se extendió rápidamente a lo largo de América Latina, reportándose en Belice, Guatemala, y Costa Rica (Mourichon et al., 1990). A finales de los años setenta, la enfermedad fue reportada en San Salvador, Nicaragua, Panamá, Colombia y el sur de México. La Sigatoka negra se extendió entonces hacia el sur a varias regiones de la costa Pacifica, actualmente, se encuentra difundida por todo el mundo, en las áreas productoras de banano y plátano. Los últimos sitios reportados han sido: Brasil (Maciel et al., 1998), Haití en el 2000, Australia en 2001, Trinidad y Tobago desde el 2003 (Fortune et al., 2004) y Puerto Rico en 2004 (Irish et al., 2006)

2.3.3. Identificación y clasificación El ciclo de vida de Mycosphaerella fijiensis Morelet (anamorfo Paracercospora fijiensis; Sigatoka negra) se caracteriza por tener dos fases, una fase perfecta y otra imperfecta (Alexoupoulos et al., 1979). Ambas juegan un papel importante en la infección del hospedero. 2.3.3.1. Clasificación de la fase perfecta:

• Clase: Ascomicetes • Subclase: Euascomicetes • Orden: Pseudospaeriles • Familia: Mycosphaerella

Esta etapa se caracteriza por la formación de pseudotecios, espermagonios, y ascósporas. Los pseudotecios y espermagonios, se forman en mucha mayor cantidad durante las fases 2 y 3 (síntomas de la enfermedad). Los espermogonios son mas abundantes en la cara inferior de la hoja que en la superior, se desarrollan frecuentemente en la cámara subestomática de los estomas. Los espermogonios maduros contienen hileras de espermacios (Meredith et al.,1969; Foure, 1982). 2.3.3.2. Clasificación fase imperfecta: Deuteromycota (hongo imperfecto).

• Clase: Hyphomycetae • Orden: Hyphomycetales • Familia: Demadaceae • Genero: Cercospora

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Los primeros conidioforos se observan fácilmente en la fase 2 (síntomas de la enfermedad). Los conidioforos son el resultado de la reproducción asexual, son obclavados, hialianos a pardo oliváceos con uno a diez septos (más frecuentemente siete septos), con un hilium bien marcado (Meredith et al., 1969). 2.3.4. Ciclo de vida El ciclo de vida de Mycosphaerella fijiensis (figura 1) consiste en dos fases bien diferenciadas que son, la diseminación del hongo y la infección e interacción con el hospedero o planta.

asco sp o ras co nid iasC O N TA M IN A C IÓ N

INFECCIÓN

CICLO SEXUAL REPRODUCCIÓN CICLO ASEXUAL

Sigatoka negra Paracercospora fijiensisM ycosphaerella fijiensis

Peritecio Conidióforos

Figura 1. Ciclo de vida sexual y asexual del patógeno M. fijiensis (Mourichon et al., 1997) 2.3.5. Diseminación La diseminación de la enfermedad ha sido favorecida por factores naturales como las corrientes de los ríos mediante el arrastre hacia las orillas del material enfermo; por el viento, al dispensar el inóculo proveniente de cultivos con prácticas mínimas de manejo y por el hombre mediante la movilización incontrolada de plántulas y hojas enfermas (Merchán, 2002). La Sigatoka negra se propaga y multiplica solo mediante conidios (figura 2. A) y ascosporas (figura 3. A) que se producen en las manchas foliares características de la enfermedad. Las conidiosporas se producen en la superficie abaxial de la hoja y pueden ser más abundantes en los estados dos, tres y cuatro de los síntomas de la enfermedad. Los conidios se liberan o se desprenden del conidioforo (figura 2. B) por acción del agua en forma de lluvia, rocio, irrigación, por aspersión o por el viento; se estima que una sola lesión de 20 mm2 puede producir 1200 conidios, si

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se relaciona esta cifra con el área total de una sola planta infectada (30-40 m2 en dominico hartón), la producción de conidios en cualquier plantación sin manejo resulta inmensamente grande (Merchán, 1997).

Las ascosporas (figura 3. A) que se generan en el tejido necrosado actúan como una fuente mayor de inóculo, las cuales son descargadas de los Pseudotecios (figura 3. B) por la acción de la lluvia, el aire húmedo o debido a la capa de agua que cubre las manchas de la hoja. La concentración de ascosporas puede ser diez a cien veces más alta que la de los conidios (Merchán, 1997). La infección se transmite rápidamente en la misma planta a través de los vientos aéreos verticales o hacia otras plantas por medio de las corrientes aéreas horizontales. Las ascosporas son la fuente de infección más importante, ya que son más resistentes a las condiciones medioambientales que los conidios (Fouré, 1989). Sin embargo, a medida que las esporas son transportadas por el viento se alejan de los sitios de producción, se desecan y pierden viabilidad por cambios bruscos de temperatura y humedad en la atmósfera y por el efecto de la radiación que destruye las esporas (Merchán, 1997). Figura 3. Estructuras sexuales de diseminación (A); estructuras sexuales de reproducción (B) (Merchán, 1997).

A B

A B

Figura 2. Estructuras asexuales de diseminación (A); estructuras asexuales de reproducción (B) (Merchán, 1997).

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2.3.6. Infección e interacción en el hospedero Los estomas de la hoja juegan un papel importante en el proceso de infección. El aparato estomatal en las plantaciones de plátano y banano consiste en dos células epidérmicas especializadas (células guardia), unidas por sus extremos, pero capaces de separarse en el medio para generar un poro a través de la epidermis en el sistema del espacio intercelular (Skutch, 1927). Los estomas se abren debido al cambio en la presión de turgencia de las células guardia y es esta apertura la que facilita la infección de M. fijiensis. La apertura y el cierre del estoma se regula por una gran variedad de factores externos e internos. La longitud global del estoma cambia muy poco al abrirse; el alargamiento de las células guardia parece ser el mecanismo principal para abrir el poro (Brezo, 1975). La superficie adaxial tiene menos estomas pero son más grandes que los de la superficie abaxial. Las esporas (es decir, ascosporas y conidiosporas) germinan en la superficie de la hoja. Las esporas forman germotubos que entra en el tejido de la hoja a través de un poro estomacal; en la figura 4 se observa la penetración de un tubo germinativo de una ascospora en un estoma. Las hifas penetrantes crecen entonces a lo largo de la superficie interior de la cámara subestomática y empiezan a crecer entre el tejido (Wardlaw, 1972). Los conidioforos crecen a través del estoma infectado, individualmente o en grupos pequeños. Además de los conidioforos, una o más hifas vegetativas pueden surgir del estoma en la parte más baja de la superficie con la lesión (Meredith et al., 1969). Después que emergen los conidioforos, el ciclo se cerrará para la producción de conidiosporas en las fases 2 y 3 de los síntomas de la enfermedad y la formación de ascosporas después en las otras fases de la enfermedad.

Figura 4. Tubo germinativo ramificado penetrando un estoma (Merchán, 1997). 2.3.7. Síntomas de la enfermedad Meredith y Lawrence (1969) describieron el desarrollo de los síntomas de la enfermedad en los siguientes estadios o etapas así:

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• Estado 1: Los primeros síntomas que son visibles son las manchas amarillentas de menos de 1 mm de diámetro en la superficie abaxial de la hoja. Las manchas son a menudo muy abundantes cerca del margen del lado izquierdo de la hoja, particularmente hacia la punta. Esto se debe a que al desenrollarse la hoja, el lado izquierdo se despliega primero en la fase de la hoja-corazón.

• Estado 2: La mancha inicial se alarga, mientras se va poniendo ligeramente

más ancha para formar una raya de color café rojizo de 2 mm de largo, paralela a las venas de la hoja. Ellas son visibles en la luz translúcida y reconocibles a poca distancia. En esta fase, las rayas son más visibles en el lado abaxial que en la superficie adaxial. La distribución de las rayas no es uniforme, pero ellas son igualmente numerosas en los lados derecho e izquierdos de la superficie abaxial, a veces, ellas aparecen como una banda, con varios centímetros de ancho en los lados. La longitud de las rayas puede variar considerablemente en una hoja o las rayas pueden solaparse para ponerse bastante grandes.

. • Estado 3: Las rayas cafés crecen y alcanzan los 20 a 30 mm en de longitud.

La característica de esta fase es el cambio en el color de la raya, la raya de color café rojizo cambia a café oscuro, casi negro, a veces con un tinte purpúreo. La raya es ahora claramente visible en la superficie adaxial de la hoja.

• Estado 4: La raya se ensancha y se desarrolla en una mancha elíptica, café

por debajo y negra por encima. La mancha se rodea por un castaño claro cuando el borde se empapa con agua.

• Estado 5: El área central de la mancha oscura se pone totalmente negra y la

necrosis es deprimida ligeramente. El castaño de la frontera cuando el borde se empapa con agua se vuelve más pronunciado y un halo amarillo rodea esta frontera, esto es debido al color amarillo que toma el tejido que rodea la frontera.

• Estado 6: El centro de la mancha se seca y el color cambia a un gris claro.

Este centro gris es encerrado por un anillo negro claro que esta rodeado por un halo amarillo luminoso. Las manchas están separadas de otras. Debido al contraste entre el centro gris y el anillo negro circundante las manchas permanecen visibles después de que la hoja se ha secado completamente (Wardlaw, 1972).

Los seis estadios de desarrollo de los síntomas de la enfermedad se pueden diferenciar en la figura 5.

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Figura 5. Estados de evolución de la enfermedad. A) Estado 1, B) Estado 2, C) Estado 3, D) Estado 4, E) Estado 5, F) Estado 6. 2.4. Control de la enfermedad Los productores de plátano y banano, deben poner en práctica, por separado o en conjunto, las siguientes estrategias de prevención de la enfermedad, manejo del cultivo y control químico para enfrentar con éxito la Sigatoka negra. 2.4.1. Prevención: Se realiza para evitar la diseminación de la Sigatoka negra hacia regiones libres de ella.

• No se deben transportar hojas de banano a de plátano, ni utilizar como empaque protector de la fruta o como envoltura de otros productos.

• Evitar visitar cultivos libres de Sigatoka negra después de haber visitado otras plantaciones, porque las personas pueden convertirse en portadoras de esporas del hongo a través de la ropa, el calzado, las herramientas u objetos personales (Merchán, 1997).

2.4.2. Prácticas culturales: Es el método tradicional que se ha usado para el control de la Sigatoka negra y Comprende todas la labores que de manera directa favorecen el buen desarrollo de los cultivos y de forma indirecta crean condiciones desfavorables para el progreso de la enfermedad. En este sentido, se han establecido sistemas de

A B C

D E A F

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siembra, construcción de drenajes, poda sanitaria o control de malezas, descoline, destronque, deshoje y un adecuado programa de fertilización (Merchan, 1997; Rosales et al., 2002). 2.4.3. Control químico: Este método es el más ampliamente utilizado y se dentro de un programa normal de rotación entre fungicidas sistémicos y protectantes, se emplea principalmente en plantaciones de banano dedicadas a la producción de fruta para la exportación (Marín et al., 1998). Aunque el combate químico de la Sigatoka negra en el plátano es tan efectivo como en banano, su empleo es muy limitado, principalmente por los escasos recursos de los productores, por el alto costo del control y por la topografía pendiente de muchos cultivos. El control químico se hace mediante aspersiones aéreas y terrestres en las que se utilizan fungicidas, aceites minerales y emulsificantes, los productos utilizados para el control de esta enfermedad se resumen en la tabla 1, los cuales se pueden agrupar en tres categorías según su modo de acción ( Marin et al., 1998, Merchán, 1997) así:

• Fungicidas de contacto o protectantes: Son fungicidas de acción preventiva, protegen sólo las partes de la hoja fumigadas con la aspersión, impidiendo la germinación de las esporas, sin tener acción sobre las infecciones ya establecidas.

• Fungicidas sistémicos: Tienen acción preventiva y curativa; son absorbidos

por la planta y se movilizan internamente por diferentes partes de ella. El ingrediente activo actúa sobre sitios específicos de las células del hongo, induciendo la formación de razas resistentes si se aplican con mucha frecuencia.

• Fungicidas penetrantes: La sustancia activa entra al tejido vegetal donde

tiene una ligera acción sistémica. El aceite agrícola es esencial en la aplicación de los fungicidas, porque mejora el cubrimiento y penetración de éstos y evita que sean lavados por la lluvia y sobre todo retarda los estados de desarrollo del agente causal de la enfermedad, por ser fungistático (Romero, 2006). Sin embargo, debido a que es derivado del petróleo su costo se ha elevado en los últimos tiempos, por lo cual hay que encontrar sustitutos del mismo. Tabla 1. Productos químicos utilizados para el control de la Sigatoka negra (Merchán, 1997).

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Modo de acción Grupo químico Nombre genérico Dosis del

ingrediente activo L/ha

Ditiocarbamatos Mancozeb 1000-1500 Contacto Clorotalonil Clorotalonil* 750-1675 Morfolinas Tridemorph 300-450 Penetrante Triazoles Bitertanol 125-150

Benomil 125-150 Benzimidazoles Carbendazine 125-200 Propiconazole 100

Sistémicos Triazoles

Flusilazole 100 Fungistático Aceites aromáticos Aceite agrícola** *No debe utilizarse con aceite agrícola porque causa fototoxicidad **Dosis comercial 5-22 L/ha según equipo de aspersión y modo de empleo

Hoy en día el combate químico es la alternativa más usada para hacerle frente a esta enfermedad. Esta opción trae problemas colaterales, como es el caso de la contaminación ambiental, daños a la salud humana y resistencia del hongo causal a los fungicidas (Orozco, 1998).

A escala mundial el control químico de la Sigatoka negra, se considera de alto riesgo por los problemas de resistencia del hongo a algunos grupos de fungicidas. Existen numerosos reportes sobre la pérdida de sensibilidad de Mycosphaerella fijiensis a los fungicidas tipo benzimidazol (Romero et al., 1998; Stover, 1979) y más recientemente a los triazoles (Castro et al., 1995).

Sin embargo, la aplicación de fungicidas es una de las tecnologías que siempre será necesaria para el control de la enfermedad en plantaciones comerciales, por lo que el desarrollo de nuevos fungicidas será de gran utilidad para el manejo de especies resistentes, al evitar la dependencia a uno o dos fungicidas dentro de los programas de control, reduciendo así la probabilidad de que el patógeno reconozca la molécula fungicida (Brenth, 1995). 2.4.4. Control biologico: Se han investigado métodos alternativos para el control de esta enfermedad, entre ellos el uso de extractos de plantas (Arciniegas et al. 2002, Marín et al., 2006, Obledo et al., 2004, Osorio, 2006) lixiviados de compost y lombricompost (Larco, 2004), hongos endofíticos (Osorio, 2006), que pueden ser menos tóxicos y económicos.

2.4.4.1. Biofúngicidas de origen botánico

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Los bioplaguicidas son productos de origen natural que contienen componentes de organismos vivos o son derivados de organismos vivos como las plantas, microorganismos e insectos tales como, feromonas, extractos ó biopreparados, estos productos son usados para el control de plagas y enfermedades en los cultivos. Las ventajas de usar bioplaguicidas es que usualmente son inocuos y menos dañinos que los plaguicidas convencionales, además permiten reducir la alta cantidad de residuos en las cosechas debido a que se descomponen rápidamente. Generalmente, afectan solo la plaga objetivo y los organismos estrechamente relacionados; en contraste, los plaguicidas convencionales pueden afectar organismos diferentes de la fauna como pájaros, insectos, y mamíferos (Scholaen, 2005). A lo largo de la evolución las plantas han desarrollado mecanismos de defensa químicos que tienen un gran potencial en el desarrollo de métodos más racionales para el control de plagas, bien como protectores naturales de las plantas o como modelos para el desarrollo de productos sintéticos (Murray et al., 1999),por lo cual, se hace importante su estudio. Existen varios reportes en la literatura en donde registran plantas con actividad anfúngica, como es el caso de los productos derivados de las semillas de cítricos (Citrus sp.) principalmente naranja y toronja con acción fungicida y bactericida para el control de hongos como Fusarium spp y bacterias como Erwinia caratovora, Xanthononas campestris, Xanthomonas cucurbitae, Pseudomonas solanacearum, (Scholaen, 2005). El aceite esencial obtenido desde hojas de zacate de limón (Cymbopogon citratus), que es rico en citral, myrceno, dipenteno, methylheptenona, ciertos alcoholes y ácidos volátiles (Obledo et al., 2004) y extractos etanolicos de las especies Commelina diffusa, Momordica charantia, Pavonia sp, Plenax sp, Piper hispidum, Piper peltatum, Sida rhombifolia y Syzygium aromaticum presentaron actividad antifúngica in vivo, contra Mycosphaerella fijiensis (Arciniegas et al. 2002), otros estudios in vivo con extractos botánicos, permitieron seleccionar a Senna reticulata como una especie promisoria para un programa de manejo integrado de la Sigatoka negra por su acción protectante (Osorio, 2004). Por otro lado, extractos de Neem (Azadirachta indica), Limoncillo (Swinglea glutinosa), Salvia (Salvia officinalis) y de Limoncillo más Neem, presentaron actividad antifúngica in vitro contra el hongo M. fijiensis (Marín et al., 2006) En ensayos realizados in vivo e in vitro sobre los conidios (fase asexual) de M. fijiensis, con extractos acuosos de las especies Vernonia amigdalina, Ocinum gratissimum y Azadirachta indica, presentaron actividad antifúngica sobre el hongo, siendo los extractros de O. gratissimum y A. indica al 100% los que mejores resultados presentaron en bioensayos in vitro y O. gratissiium a 50%, en bioensayos in vivo (Okibo et al., 2004).

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2.5. Efecto del crecimiento de la planta con relación a la epidemiología de la enfermedad

La forma en que se desarrolla la planta de banano tiene un efecto importante sobre la epidemiología de la enfermedad y por ende sobre su manejo. Paralelamente, la forma en que se cultiva el plátano como sistema perenne (aunque las plantas individuales no lo sean) con cosechas semanales, hace que las plantas de todas las edades deban coexistir en todo momento, lo cual tiene un impacto claro en la epidemiología de la enfermedad (Romero, 1997). La producción foliar en bananos se da en intervalos de 7 y 15 días. El proceso de desenvolvimiento de la hoja se inicia con la aparición de la misma en una forma de cilindro, conocida como la hoja candela o cigarro, que paulatinamente se levanta y se abre. La apertura de la candela comienza con la parte apical del cilindro, expone primero la superficie abaxial del semilimbo izquierdo de la hoja, forma una estructura cónica en forma de embudo para luego abrir el otro semilimbo. Durante el desarrollo de la hoja ésta tiene una posición vertical con respecto al suelo, la cual pasa luego a ser horizontal conforme envejece. La mayor parte de las infecciones ocurren durante el proceso de desenvolvimiento de la hoja candela en la superficie abaxial donde hay mayor cantidad de estomas que en la parte adaxial (Soto, 1985). Además, la hoja candela en posición vertical y de forma más o menos cilíndrica, representa un mejor flanco para el impacto de las esporas del patógeno pues hay menos tensión superficial. Existen también investigaciones que demuestran que las hojas más jóvenes son también más susceptibles a las infecciones por la Sigatoka negra que las hojas más viejas (Romero et al., 1995). La emisión foliar cesa al momento de la floración, con lo cual el llenado del racimo, que tarda alrededor de 90 días debe darse con las hojas existentes a partir de ese momento. 2.6. Impacto económico sobre las cosechas La Sigatoka negra causa perdidas entre el 33 y el 50% en las cosechas de plátano (Stover, 1983; Mobambo et al., 1993) debido a una reducción en el número de frutas por racimo y por el bajo peso de la fruta. La Sigatoka negra no tiene efecto en la altura de la planta ni en el llenado del plátano, pero si causa un retraso en el florecimiento y en la cosecha por más de un mes. La enfermedad también causa maduración prematura en la fruta (Stover, 1980b; Mobambo et al., 1993). El llenado normal de la fruta o tiempo de maduración, es decir, el tiempo de florecimiento para la cosecha es de 91 días, pero la Sigatoka negra reduce esto significativamente. Los frutos con maduración prematura causada por la Sigatoka negra se espera que tengan efectos adversos en las cualidades de poscosecha, así como la vida en estante se ve reducida; además, las frutas son más cortas y más delgadas lo cual generalmente resulta en una

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fruta de baja calidad y de más bajo valor en el mercado. La Sigatoka negra tiene un impacto negativo en el engrosamiento de la fruta, que es causada probablemente por la reducción en el área sana de la hoja por el hongo (Mobambo et al., 1993). 2.7. Metabolitos secundarios Las plantas han desarrollado una inmensa variedad de mecanismos de defensa, que pueden ser de tipo físico o químico, gracias a los cuales adquieren una serie de ventajas adaptativas (Boulter, 1993). Los mecanismos de tipo físico, son aquellos que implican una modificación morfológica en la planta, que supone una barrera a patógenos en su intento de acceso a ésta. Estas modificaciones se presentan en las plantas como espinas, tricomas, ceras, etc (Deverall, 1979). Las defensas de tipo químico pueden ser directas en forma de sustancias tóxicas, disuasoras, repelentes y reductoras de la digestibilidad (Cornell et al., 2003), o indirectas mediante sustancias volátiles que atraen a los enemigos naturales (depredadores y parasitoides) de estas plagas que atacan la planta (Turlings et al., 1995). Estos compuestos químicos denominados también metabolitos secundarios, puesto que no están implicados directamente en los procesos metabólicos primarios o de crecimiento y desarrollo de la planta, tienen una función ecológica importante como defensa química contra microorganismos, insectos, otros herbívoros e incluso contra otras plantas (Balandrin et al., 1985; Feeney., 1992; Berenbaum et al., 1992). Se han identificado más de 100.000 metabolitos secundarios en plantas (Dixon, 2001). Sin embargo, se considera que el potencial que ofrece el reino vegetal como fuente de compuestos potencialmente útiles no ha sido suficientemente aprovechado, ya que sólo un limitado porcentaje de las 270.000 especies de plantas superiores conocidas han sido investigadas en cuanto a sus compuestos activos y es frecuente el caso en que las plantas son investigadas solamente por un tipo específico de actividad biológica (Balandrin et al., 1985). Los mecanismos de defensa químicos que las plantas han desarrollado a lo largo de la evolución tienen un gran potencial en el desarrollo de métodos más racionales para el control de plagas, ya sea como protectores naturales de las plantas o como modelos para el desarrollo de productos sintéticos (Murray et al., 1999). 2.8. Características generales de las familias botánicas en estudio

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2.8.1. Apocynaceae Familia botánica que encuentra distribuida en todas las zonas tropicales y subtropicales del planeta, contando con 15.000 especies divididas en 180 géneros (Schmidt, 2006). Se trata de Plantas herbáceas, leñosa de hojas enteras y opuestas. Las estipulas son muy raras. Las inflorescencias son cimosas. Flores actimorfas, tetrámeras o pentámeras. Anteras puntiagudas en el ápice y brevemente cauliculadas en la base, conniventes en un conjunto cónico (García, 1992). 2.8.2. Asclepiadaceae Familia de plantas que cuenta con 130 géneros y unas 2000 especies, su género más representativo tiene cerca de 120 especies, muchas de ellas de distribución amplia, en especial en las regiones tropicales y subtropicales. Se trata de herbáceas vivaces con tallos erguidos suculentos que almacenan agua, hojas opuestas o verticiladas y flores pequeñas y poco comunes en inflorescencias dispuestas en el extremo de los tallos o a lo largo de éstos (Dateo et al., 1973). Entre las especies de esta familia figuran algunas de las plantas venenosas más mortíferas, pero también las hay casi inocuas. Las llamadas flores carroñeras forman otro de los géneros incluidos en esta familia (García, 1992). 2.8.3. Asteraceae Es una de las familias de plantas con más grandes flor del reino vegetal, comprende unas 20.000 especies. Estas plantas se encuentran como arbustos, subarbustos y plantas herbáceas, las flores están siempre reunidas en una inflorescencia llamada cabeza o capítulo, que parece una única flor y funciona como tal. En más de la mitad de las especies, las flores del borde del capítulo tienen unas corolas extendidas hacia afuera llamadas lígulas. Se encuentra distribuida por todo el mundo, con excepción de la Antártida, donde las únicas plantas con flor conocidas son dos especies de gramíneas. Para la flora colombiana, esta familia comprende numerosísimas especies que crecen desde el páramo (4000 msnm), hasta el nivel del mar. Sin embargo la distribución mayor de las especies de esta familia está en los páramos y subpáramos de las tres cordilleras (García, 1992). 2.8.4. Euphorbiaceae Esta familia comprende alrededor de 300 géneros y 8000 especies distribuidas en regiones tropicales, existen representantes de la familia en todo el mundo, salvo

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las regiones polares y montañosas (Carretero, 2004), generalmente son hierbas, arbustos o árboles con abundantes tallos, cuya característica mas distintiva es el látex coloreado que exudan la mayoría de las especies pertenecientes a esta familia. En nuestro país, se encuentran en la zona calida (García, 1992). 2.8.5. Rubiaceae Familia que comprende 650 géneros y 10500 especies, se encuentra principalmente en las regiones tropicales y subtropicales del planeta (García, 1992). Son plantas herbáceas, aunque en la familia predominan los arbustos y árboles, tienen hojas opuestas, simples, con estípulas; con frecuencia éstas son iguales a las hojas, y forman junto a ellas verticilos de 4-12 hojas aparentes. Flores con cáliz muy reducido y corola con los pétalos soldados (Carretero, 2004). 2.8.6. Solanaceae Esta familia compromete alrededor de 96 géneros y 3000 especies, difundidas en la mayor parte de la mundo, pero particularmente en América del Sur (Wink, 2003). Son Plantas herbáceas, árboles y arbustos de hojas simples, alternas y sin estípulas. Flores formadas normalmente por 5 sépalos y 5 pétalos soldados en corolas de morfología diversa: rotácea en Solanum, tubulosa en Datura. Los estambres se insertan en el tubo de la corola y pueden presentar las anteras connadas. El fruto puede ser baya (Solanum) o cápsula (Datura) (Carretero, 2004). En Colombia se registran numerosas especies debido a que crecen desde el nivel del mar hasta los 3000 m de altura. Tanto desde el punto de vista farmacéutico, como por la riqueza en alcaloides y otras sustancias, así como por su importancia alimenticia, esta familia es una de las más importantes económicamente de la flora colombiana (García, 1992).

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3. JUSTIFICACIÓN

El cultivo de plátano en Colombia, ha sido un sector tradicional de la economía campesina, de subsistencia para pequeños productores, de alta dispersión geográfica y de gran importancia socioeconómica desde el punto de vista de seguridad alimentaría y de generación de empleo. Se estima que en Colombia del área total cultivada en plátano, un 87% se encuentra como cultivo tradicional asociado con café, cacao, yuca y frutales, y el restante 13% se encuentra como monocultivo tecnificado (Espinal et al., 2006). Las principales enfermedades que afectan la producción de plátano son: Picudo Negro (Cosmopolites sordidus), Picudo Rayado (Metamasius hemipterus), Gusano Tornillo (Castniomera humboldti), Sigatoka negra (Mycosphaerella fijiensis), Sigatoka Amarilla (Mycosphaerella musicola), Moko (Ralstonia solanacearum), Virus del mosaico del pepino (CMV), Virus del Rayado del banano (BSV), Nemátodos fitopatógenos como el Radopholus similis, Pratylenchus sp., Helicotylenchus y Meloidogyne sp (Merchán, 1996). La Sigatoka Negra, es la enfermedad más difundida y destructiva para los cultivos de plátano, banano y otros cultivares de musa, que se ha registrado desde su aparición en el Urabá desde el año de 1981, con una rápida dispersión a las zonas productoras de la Costa Atlántica, Pacífica, Orinoquía y Amazonía. Actualmente, se reporta su presencia en los cultivos ubicados en parte media de las riveras de los ríos Magdalena, Cauca y en la zona cafetera (Rodríguez et al., 1997). La mayoría de los bananos cultivados extensivamente y con fines comerciales son susceptibles a esta enfermedad que causa necrosis en las hojas y perdidas entre el 33 y el 50% en las cosechas de plátano (Stover, 1983; Mobambo et al., 1993). En los cultivos a gran escala destinados a la exportación, se utilizan fungicidas en forma rutinaria, lo que para los pequeños productores resulta insostenible, debido a los altos costos de los productos químicos empleados en las aplicaciones, los cuales representan hasta el 40% del costo total de la producción, esto sin mencionar los severos daños al ambiente y a la salud humana; por lo que se hace necesario la utilización de otros métodos de control. Por lo tanto, la presente investigación se sustenta en la problemática económica y ambiental que causa el hongo Mycosphaerella fijiensis en los cultivos de plátano y banano, para lo cual se pretende investigar el efecto inhibidor causado por extractos de plantas recolectadas en la zona de reserva Bremen-La Popa (Filandia-Circasia, Quindío) pertenecientes a las familias de la Apocynaceae,

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Asclepiadáceae, Asteraceae, Euphorbiaceae, Rubiaceae y Solanaceae sobre el hongo Mycosphaerella fijiensis Morelet. .

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4. OBJETIVOS 4.1. OBJETIVO GENERAL: Evaluar la actividad funguicida in vitro de diferentes extractos vegetales de plantas de la zona de reserva Bremen-La Popa (Filandia-Circasia, Quindío) sobre el hongo Mycosphaerella fijiensis Morelet. 4.2. OBJETIVOS ESPECIFICOS:

• Recolectar en la zona de reserva Bremen-La Popa plantas de las familias: Apocynaceae, Asclepiadáceae, Asteraceae, Euphorbiaceae, Rubiaceae y Solanaceae.

• Obtener los extractos de n-hexano, diclorometano y metanol de las plantas

recolectadas.

• Estandarizar el bioensayo in vitro de actividad antifúngica contra el hongo Mycosphaerella fijiensis en sus fases de reproducción sexual y asexual.

• Determinar mediante el bioensayo in vitro la actividad antifúngica de los

extractos crudos metanólicos y de diclorometano de las plantas seleccionadas.

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5. SECCIÓN EXPERIMENTAL 5.1. Materiales 5.1.1. Reactivos La extracción del material vegetal se realizó con n-hexano (C6H14), diclorometano (CH2Cl2) y metanol (CH3OH), grado comercial y el solvente utilizado para preparar las soluciones patrón de los extractos fue etanol (C2H5OH) grado analítico. Los medios de cultivo usados fueron, Agar papa dextrosa (PDA) Merck (Darmstadt, Germany) y Agar bacteriológico N° 1 marca Oxoid (Basingstoke, Hampshire, England), la estreptomicina para adicionar al medio de cultivo PDA fue Sigma (St. Louis, USA). 5.1.2. Material de vidrio Los medios de cultivo fueron elaborados en erlenmeyers de diferente volumen Schott Duran (Mainz, Alemania). En los bioensayos se utilizaron cajas Petri Pyrex 100 X 15 mm y tubos de ensayo tapa rosca de 100 X 10 mm. 5.1.3. Equipos Se utilizó la balanza analítica Mettler Toledo AB 204 (Suiza), para pesar los extractos y reactivos que se requerían para los bioensayos. La preparación de los extractos vegetales y del inoculo del hongo, se realizó con ayuda de un vortex IKA MS1 (Wilmington, USA). Para la esterilización de los medios de cultivo y demás materiales, se utilizaron autoclaves All American (NJ, USA) y para la medición de volúmenes entre 100 µL y 1000 µL se utilizó una micropipeta eppendorf (Canadá) serie 2100 de volumen variable.

En la realización de los bioensayos se utilizó una cabina de seguridad biológica (C4 FLC 120) para garantizar condiciones estériles. La evaluación de las ascosporas se realizó con un microscopio de luz transmitida y FL Axiostar plus Zeiss (Göttingen, Germany) y la medición del diámetro de las colonias con un pie de rey marca Cienceware (Switzerland, USA). 5.1.4. Material vegetal La recoleccion de 21plantas pertenecientes a las familias botánicas Apocynaceae, Asclepiadaceae, Asteraceae, Euphorbiaceae Rubiaceae y Solanaceae, se efectuó

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en la Reserva Natural Bremen-La Popa (Filandia-Circasia, Quindío, Colombia), durante el periodo comprendido entre el 22 y el 24 de agosto del 2005 por el grupo de Biotecnología Productos-Naturales de la Universidad Tecnológica de Pereira (UTP), con la asesoría del taxónomo Francisco Javier Roldan del herbario de la Universidad de Antioquía (HUA, Medellín, Colombia).

5.1.5. Tejido foliar de plátano infectado Se realizó la recolección del tejido foliar infectado con el hongo en los estadios cinco y seis de los síntomas de la enfermedad en la finca la Cabañita ubicada en la vereda Arauca y en la finca La Granja situada en la vereda Palermo del Municipio de Quimbaya (Quindío-Colombia). La parte verde de la hoja se eliminó y la parte necrosada útil para el bioensayo, se almacenó en bolsas de papel y después en bolsas plásticas, para su almacenamiento a - 4°C hasta su utilización. Este material se conservó durante un periodo máximo de tres meses. 5.2. Métodos 5.2.1. Extracción del material vegetal 300g del material seco y molido, se sometió a extracción sucesiva por maceración pasiva con n-hexano (C6H14), diclorometano (CH2Cl2) y metanol (CH3OH). Cada uno de los extractos fue concentrado sucesivamente a presión reducida en rotaevaporador a una temperatura de 45 °C. Los extractos concentrados, fueron refrigerados a -10 °C, hasta su uso en la marcha fotoquímica y en los bioensayos.

Se ejecutaron dos experimentos individuales para dar cumplimiento a los objetivos planteados. En primer lugar se evaluó el efecto de 20 extractos metanólicos y 21 de diclorometano a 1000 mg/L sobre el crecimiento del tubo germinativo de las ascosporas (fase sexual) y en segundo lugar se evaluó el efecto de los mismos extractos, sobre el crecimiento radial de la colonia, sobre los conidios (fase asexual) del ciclo de reproducción de M. fijiensis.

5.2.2. Elongación del tubo germinativo de ascosporas Para determinar el efecto in vitro de los extractos en la fase sexual del hongo, se evaluó la elongación del tubo germinativo de las ascosporas, para lo cual se realizaron los procedimientos de cámara húmeda y descarga de ascoporas como se describen en las figuras 6 y 7.

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Figura 6. Protocolo de cámara húmeda para descarga de ascosporas de Sigatoka negra

Realizar el protocolo de cámara húmeda (Figura 7)

Sacar los discos de papel Kraf y sumergirlos en agua destilada durante 5 min.

Colocar los discos en las tapas de las cajas de Petri

Cortar trozos de aproximadamente 2 cm2 de la hojas de plátano infectadas en los estadios 5 ó 6 de la enfermedad.

Envolver estos discos en toallas de papel humedecidas con agua destilada.

Incubar este material por 48 horas a temperatura ambiente en bolsa plástica con sello hermético.

Pegar 9 de estos trozos a discos de papel kraf de 11 cm de diámetro con grapas metálicas, de manera que el envés de las hojas quede expuesto.

Retirar el exceso de agua del papel con una servilleta, sin tocar los segmentos de hojas de plátano.

A

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Figura 7. Protocolo de descarga de ascosporas de M. fijiensis. 5.2.2.1. Determinación de los periodos de incubación Para la realización de los bioensayos de descarga de ascosporas, se realizaron ensayos para determinar los periodos de incubación y lectura de la germinación de las ascosporas. Se realizaron bioensayos con seis extractos metanólicos y seis de diclorometano del 120 al 125, a los que se hizo un seguimiento en la germinación de las ascosporas, haciendo lecturas a las 24 y a las 48 horas de incubación, marcando el lugar que se había observado y leído a las 24 horas (se tomaron fotos); después a las 48 horas se volvieron a observar los lugares que se habían marcado. Para los extractos metanólicos, se notó que los tubos germinativos de las ascosporas eran muchos y su longitud había aumentado considerablemente, algunas tenían varios tubos germinativos saliendo de ellas (germinación deforme), además muchos tubos presentaron ramificaciones. Bajo estas condiciones el conteo de las ascosporas se hizo prácticamente imposible, no se encontraban campos visuales que permitieran hacer la lectura. Debido a esto se determinó un periodo de incubación para los extractos metanólicos de 24 horas. Para los extractos de diclorometano, se observaron ascosporas con tubos germinativos cortos a las 24 horas y un crecimiento normal de los tubos germinativos en la lectura a 48 horas, donde sí era posible realizar la lectura, ya que no hubo una densidad alta de éstos. Se determinó entonces, que la lectura para los bioensayos a realizar con los extractos de diclorometano se haría a las 48 horas de incubación.

Permitir la descarga de las ascosporas de M. fijiensis sobre agar bacteriológico N° 1 al 2% durante una hora.

Incubar a 26 °C durante un periodo de 24 ó 48 horas según el extracto.

A

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5.2.2.2. Lectura del bioensayo y determinación del porcentaje de inhibición de los extractos

Una vez realizado el procedimiento de la figura 7, el material se incubó a 26° C un periodo de 24 ó 48 horas según el tipo de extracto que se evaluaba. Terminado este periodo, se efectuó la lectura de 150 ascosporas en dos cajas de Petri, repartidas en tres campos visuales de 50 ascosporas cada uno, con un microscopio de luz bajo aumento 10X. Se determinó el porcentaje de ascosporas con germinación normal (GN), germinación deforme (GD), germinación corta (GC) y no germinadas (NG), para evaluar el porcentaje de inhibición de los extractos con base a las ascosporas con GD, GC y NG, respectivamente. 5.2.3. Crecimiento radial Con este método se determinó el efecto que causaban los extractos en la fase asexual del hongo, los procedimientos que se llevaron a cabo se muestran en las figuras 6, 7, 8 y 9. 5.2.3.1. Obtención de un cultivo monospórico de M. fijiensis Para realizar los bioensayos de crecimiento radial del hongo M. fijiensis se requieren cultivos monospóricos, para garantizar que el ensayo se haga con una sola cepa del hongo. Para la obtención de un cultivo monospórico, se deben realizar los procedimientos de cámara húmeda y de descarga de ascosporas, como se describió para la elongación del tubo germinativo; para la descarga de ascosporas, el agar se prepara al 3% y el periodo de incubación fue de 24 horas, la continuación del procedimiento se muestra en la figura 8.

Tomar una ascospora de M. fijiensis, con ayuda de un microscopio de luz bajo aumento 10X y de tubos capilares (jeringa) con un alambre metálico (embolo) en su interior (ambos estériles).

Tomar un tubo de ensayo tapa rosca que contenga PDA servido en cuña (esterilizado).

A

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Figura 8. Protocolo de obtención de un cultivo monospórico de M. fijiensis. 5.2.3.2. Preparación y siembra del inóculo para ensayo de crecimiento

radial Para realizar los bioensayos de crecimiento radial se tomaron cultivos monospóricos entre 14 y 20 días de incubación bajo luz continua y se preparó una solución de microorganismo, para después permitir la siembra por superficie de éste en tres cajas de Petri que contenían PDA (Figura 9).

Tomar tubos de plástico con tapa de 50 mL de capacidad, adicionar 5 mL de agua destilada y esterilizar.

Incubar a temperatura ambiente bajo luz contínua

Transferir la ascospora al tubo de ensayo empujándola con ayuda del alambre metálico, flamear la boca del tubo y tapar.

Permitir el crecimiento del monocultivo de M. fijiensis, durante 14-20 días.

A

Retirar con una pinza en condiciones estériles, una colonia de M. fijiensis entre 14 y 20 días de incubación.

Colocar dentro del tubo de plástico la colonia y adicionar dos perlas de ebullición.

A

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Figura 9. Protocolo de preparación de inoculo de M. fijiensis para sembrar por superficie. 5.2.3.3. Lectura del bioensayo y determinación del porcentaje de inhibición

de los extractos Se realizó la medición del crecimiento de 15 colonias de M. fijiensis en tres cajas de Petri, 5 colonias por cada caja, a los días 7, 9, 12, 15, 20 de incubación, para determinar el efecto fungicida o fungistático de los extractos sobre la fase asexual del hongo. 5.2.4. Preparación de soluciones stock de los extractos de metanol y de

diclorometano Para la realización del bioensayo de descarga de ascosporas, con los extractos de metanol y de diclorometano (Tabla 3), se ensayaron diferentes mezclas de solventes agua (destilada estéril), etanol y dimetilsulfoxido a distintas concentraciones en el agar como se presenta en la tabla 2, esto con el propósito de evaluar cual mezcla de solvente y en que concentración no causaba daño en la germinación de las ascosporas de M. fijiensis. Para todas las mezclas de solvente evaluadas se utilizaron como control positivo Benlate 1mg/L y negativo agar-agua solamente.

Agitar durante 30 seg con ayuda de vortex a 1200 rpm, para fragmentar el micelio.

Tomar 100 uL de esta solución y servir sobre PDA gelificado, esparcir con ayuda de una varilla de agitación.

Incubar a 26 °C en la oscuridad.

A

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Tabla 2. Mezclas y concentraciones de solventes evaluados sobre M. fijiensis

5.2.5. Preparación del medio de cultivo suplementado con extracto Con el fin de determinar el efecto que causaban los extractos sobre los tubos germinativos de las ascosporas y en el micelio de M. fijiensis, los medios de cultivo agar bacteriológico N° 1 al 2% y PDA fueron suplementados con soluciones stock de los extractos metanólicos y de diclorometano. Se adicionó el volumen del stock de extracto a analizar, de manera que al completar con el medio de cultivo hasta 40 mL (para dos cajas de Petri) y 60 mL (para tres cajas de Petri), el extracto quedara a 1000 mg/L y el solvente con el que se disolvieron los extractos quedara a una concentración baja entre 1 y 1.5 %. También se suplementaron los medios de cultivo con el solvente de dilución de los extractos y con Benlate a 1 mg/L, para tener el control negativo y el positivo, respectivamente.

Concentración de solvente en el agar (%)

# de mezcla Mezcla de solvente

EtOH DMSO 1 EtOH 1 ------ 2 EtOH 1.5 ------ 3 H2O : EtOH 1 ------ 4 H2O : EtOH 1.5 ------ 5 H2O : EtOH : DMSO 0.5 0.5 6 H2O : EtOH : DMSO 0.75 0.75 7 H2O : DMSO ------- 1 8 H2O : DMSO ------- 1.5

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6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

6.1. Material vegetal recolectado En la figura 10 se muestran los puntos de recolección en la Reserva Natural Bremen-La Popa de las especies que se ensayaron en este trabajo, de las cuales se obtuvieron los extractos de n-hexano, diclorometano y metanólicos, la familia, el genero, la especie y los extractos obtenidos se resumen en la tabla 2.

Figura 10. Puntos de recolección del material vegeta

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Tabla 3. Plantas recolectadas en la Reserva Natural Bremen-La Popa

6.2. Evaluación de la actividad antifúngica de los extractos por el método

de elongación del tubo germinativo de ascosporas

De de los solventes evaluados (tabla 2), se observó que la mezcla 1, 2, 3 y 4 permitieron que los tubos de las ascosporas germinaran normalmente con porcentajes de germinación normal entre 97 y 97.3%; mientras que las demás mezclas causaron daños en el desarrollo de los tubos germinativos de las ascosporas mostrando porcentajes de germinación normal entre 60 y 80%. Una vez determinado el solvente y las concentraciones de éste que permitían que las ascosporas germinaran normalmente, se prepararon las soluciones stock de

Familia Nombre Científico N° Voucher Peso Extracto (g) UTP FJR Hexano Diclorometano Metanol

Apocynaceae Cynanchum sp 123 3964 16,282 6,362 32,286 Asclepiedaceae Oxypetalum

cordifolium 139 3981 10,064 12,797 16,331 Pentacalia urbanii 122 3963 7,326 4,276 9,282 Mikania banisteriae 124 3965 7,091 7,107 9,282 Clibadium

pentaneuron 125 3966 2,984 4,972 8,270 Critoniella acuminata 127 3968 6,463 5,757 22,907 Asteraceae Baccharis sp 131 3972 7,097 7,587 10,901 Tilesia baccata 133 3974 3,510 7,600 10,328 Mikania lloensis 136 3977 2,720 5,973 14,375 Lepidaploa lehmannii 135 3976 1,337 1,058 12,617 Euphorbiaceae Acalypha diversifolia 126 3967 4,279 5,469 22,178 Alchornea calophylla 128 3969 6,188 3,756 24,975 Hyeronima sp 130 3971 7,947 4,912 40,649 Alchornea grandis 140 3982 2,227 3,159 14,058 Rubiaceae Guettarda crispiflora 132 3973 0,900 4,823 25,891 Faramea sp 138 3979 3,408 4,818 9,601 Solanaceae Solanum acerifolium 120 3961 11,804 9,720 11,695 Solanum

trachycyphum 121 3962 12,987 6,359 36,344 Sin Identificar 129 3970 4,909 3,626 13,043 Solanum lepidotum 134 3975 1,410 5,180 19,210 Cestrum sp 137 3978 8,117 5,657 7,389

42

los extractos metanólicos a 40000 mg/L en EtOH-H2O en proporción 2:3 v/v, quedando la concentración del solvente en el agar al 1%. Para la preparación de las soluciones stock de los extractos de diclorometano a 100000 mg/L, no se utilizó agua, ya que este solvente al ser adicionado causaba la precipitación del extracto; por consiguiente la preparación se realizó en etanol solamente, el cual permitió una buena solubilidad de los extractos. Una vez preparados los extractos y determinadas las condiciones de incubación y los controles para el bioensayo de elongación del tubo germinativo, se procedió a determinar la actividad antifúngica de los extractos vegetales sobre el hongo. Se evaluaron 20 extractos metanólicos y 21 de diclorometano, en las figuras 11 para los extractos metanólicos y 12 para los extractos de diclorometano, se muestran los porcentajes de inhibición que produjeron los extractos de las plantas colectadas sobre las ascosporas de M. fijiensis, expresados como germinación normal (GN), germinación corta (GC), germinación deforme (GD) y no germinado (NG).

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Porcentaje

de Inhibición

120

121

122

123

124

125

126

127

128

129

131

132

133

134

135

136

137

138

139

140

Con

t (+

)

Con

t (-)

N° UTP

% GD % GC % GN % NG

Figura 11. Porcentajes de inhibición promedio del efecto causado por extractos metanólicos en el ciclo sexual de M. fijiensis

43

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Porcentaje

de Inhibición

120

121

122

123

124

125

126

127

128

129

130

131

132

133

134

135

136

137

138

139

140

Con

t (+

)

Con

t (-)

N° UTP

% GD % GC % GN % NG

Figura 12. Porcentajes de inhibición promedio del efecto causado por extractos de diclorometano en el ciclo sexual de M. fijiensis

Un alto porcentaje de ascosporas con germinación deforme (GD), germinación corta (GC) o no germinado (NG), implica que el extracto tiene actividad antifúngica sobre las ascosporas del hongo (fase sexual). Como se observa en la figura 11, el porcentaje de actividad antifúngica que presentaron los extractos se reflejo en su mayoria en la germinación deforme, en donde tres extractos identificados con N° UTP 120, 137, pertenecientes a las especies Solanum acerifolium , Cestrum sp y el N° UTP 129 sin identificar causaron deformidad en el tubo germinativo de las ascosporas de M. fijiensis por encima del 75%. Adicionalmente, tres extractos identificados con N° UTP 125, 134 y 139 pertenecientes a las especies, Clibadium pentaneuron, Solanum lepidotum y Oxypetalum cordifolium presentaron entre el 50 y el 70% de germinación deforme, dando como resultado que un 30% de extractos metanólicos presentaron actividad antifúngica in vitro sobre las ascosporas del hongo. Los extractos de diclorometano, también produjeron germinación deforme de las ascosporas de M. fijiensis, en donde de 21 extractos de diclorometano evaluados 10 identificados con N° UTP 120, 123, 126, 127, 129, 133, 135, 136, 137 y 139 pertenecientes a las especies Solanum acerifolium, Cynanchum sp, Acalypha

44

diversifolia, Critoniella acuminata, Sin Identificar, Tilesia baccata, Lepidaploa lehmannii, Mikania lloensis, Cestrum sp y Oxypetalum cordifolium, respectivamente, mostraron actividad con un porcentaje superior o igual al 75% y seis extractos identificados con N° UTP 121, 124, 125, 128, 132 y 134 pertenecientes a las especies Solanum trachycyphum, Mikania banisteriae, Clibadium pentaneuron, Alchornea calophylla, Guettarda crispiflora y Solanum lepidotum presentaron actividad entre el 50 y el 70 % de germinación deforme, dando como resultado un 76.2 % de extractos de diclorometano presentaron actividad antifúngica in vitro contra el hongo. Cabe anotar que la germinación deforme no se determinó con relación al control positivo (Benlate 1 mg/L) ya que este mostraba una deformidad diferente a la que causaron los extractos; por lo cual, la revisión se comparó con la germinación que mostraban las ascosporas en el control negativo, estas diferencias se pueden observar en la figura 13. Figura 13. Diferentes tipos de germinación de ascosporas. A) Ascosporas con germinación normal, B) germinación deforme causada por el fungicida Benlate a 1mg/L y C) germinación deforme causada por un extracto metanólico a 1000 mg/L. Como se puede observar en los resultados de las figuras 11 y 12, ningún extracto tuvo un porcentaje de inhibición de 100%, pero si hubo porcentajes altos de inhibición en comparación con el control (+), teniendo en cuenta que se trata de extractos crudos; además, al comparar los resultados para los extractos metanólicos con los de diclorometano se observó que las especies N° UTP 120, 129, 134, 137 y 139, coinciden en su actividad en ambos extractos con porcentajes de inhibición muy similares. De acuerdo al tamizaje fitoquímico realizado para los extractos, que se muestra en la tabla 5, se detectó la alta diversidad de compuestos fitoquímicos, tales como: alcaloides, esteroles, triterpenos, saponinas, fenoles, flavonoides y taninos que presentan los extractos evaluados. Cabe resaltar que únicamente la especie Solanum acerifolium (UTP N° 120) presenta similitudes con respecto a la composición fitoquimica de sus extractos (esteroles y triterpenos), los cuales pueden ser los compuestos que estén causando la deformidad (alrededor del 80%) para ambos extractos, metanólico y de diclorometano en esta especie.

A B C

45

También cabe resaltar que cuatro de estas especies que presentaron similitud en los porcentajes de deformidad son miembros de la familia Solanaceae, familia a la que pertenecen especies como Capsicum annum, chinense y frutescens para la cual se ha reportado en la literatura, actividad antifúngica sobre el hongo Botrytis cinerea (Wilson et al., 1997). Los núcleos fitoquímicos que se encuentra en la mayor parte de las especies, que tuvieron actividad son esteroles, triterpenos y flavonoides como se observa en la tabla 5. En la literatura se han reportado terpenoides con actividad antifúngica sobre hongos como Alternaria solana, Aspergillus niger, Boletus variegatus, Ceratocytis pilifera, Lenzites saepiaria, Rhizopogon roseolus, Trichoderma viride, Uromyces appendiculatus y Verticillium dahliaepor; también se reportan saponinas con actividad sobre hongos como Aspergillus niger, Fusarium oxysporum, Fusarium solani, Phoma spp, Phytophthora cinnamoni, Rhizopus mucco, Sclerotium rolfsii, Trichoderma viride y Verticillium albo-atrum (Montes-Belmont et al., 1999), por lo cual, uno de estos núcleos presentes en las especies que tuvieron actividad sobre M. fijiensis, tanto para los extractos metanólicos como de diclorometano puede ser el responsable de causar la deformidad en los tubos germinativos de las ascosporas. 6.3. Evaluación de la actividad antifúngica de los extractos por el método

de Crecimiento radial Se evaluaron 20 extractos metanólicos y 19 de diclorometano a 1000 mg/L, a los datos obtenidos, se les realizó la prueba de Kruskal-Wiallis (Anexo 1) utilizando el software estadístico SPSS 10 para Windows, con ésta se pudo determinar que existían diferencias significativas entre los extractos evaluados, por lo cual, se realizó una comparación de medias entre los extractos y el control con la prueba de Tamhane (Anexo 2) para determinar cuales eran esas diferencias. Los resultados obtenidos para los extractos metanólicos y de diclorometano se resumen en la figura 14 y 15 respectivamente.

46

Tabla 5. Marcha fitoquímica realizada a extractos de n-hexano, diclorometano y metanólicos.

Metabolitos Secundarios Familia Nombre

Científico Extracto

Alcaloide Esteroles y Triterpenos

Saponinas Fenoles Flavonoides Taninos

Hexano -1 + - - - - Diclorometano - - - - - -

Apocynaceae Cynanchum sp

Metanol - - - - + - Hexano - - - - - - Diclorometano - - - - - -

Asclepiedaceae Oxypetalum cordifolium

Metanol + + + - + - Hexano - - - - - - Diclorometano + + - + + +

Pentacalia urbanii

Metanol - + + + + + Hexano - - - - - - Diclorometano - + - - - -

Mikania banisteriae

Metanol - + + + + + Hexano - - - - - - Diclorometano - - - - - -

Clibadium pentaneuron

Metanol - + - - - - Hexano - + - - - - Diclorometano - + - + - +

Critoniella acuminata

Metanol + - + - - - Hexano - + - - - - Diclorometano - + - - - -

Baccharis sp

Metanol - - - + - + Hexano - - - - - - Diclorometano - - - - + -

Tilesia baccata

Metanol - + + - - - Hexano - - - - - - Diclorometano - - - - - -

Asteraceae

Mikania lloensis

Metanol - - + - - - Hexano - - - - - - Diclorometano - + - + + +

Acalypha diversifolia

Metanol - - - + - + Hexano - - - + - +

Euphorbiaceae

Alchornea Diclorometano - - + + + +

47

calophylla Metanol - + + + + + Hexano - - - - - - Diclorometano - + - + + +

Hyeronima sp

Metanol - + + + + + Hexano - - + - - - Diclorometano - - + - + -

Euphorbiaceae

Alchornea grandis

Metanol - + + + - + Hexano - - - - - - Diclorometano - + - - - -

Guettarda crispiflora

Metanol - - - - - - Hexano - + - - - - Diclorometano - - - - + -

Rubiaceae Faramea sp

Metanol - - - + - + Hexano - - - - - - Diclorometano - + - + + +

Solanum acerifolium

Metanol + + + - - - Hexano - - - - - - Diclorometano + + - - + -

Solanum trachycyphum

Metanol + + + - - - Hexano - - - - - - Diclorometano - - - - + -

Sin Identificar

Metanol + + - - - - Hexano - - - - - - Diclorometano - - - - - -

Solanum lepidotum

Metanol + - - - - - Hexano - + - - - - Diclorometano - + - - + -

Solanaceae

Cestrum sp

Metanol + - - - - -

Controles positivos Papaverina

+ Hecogenina y Estigmasterol

+

Protosaponina de Dioscina A

+

Resorcinol +

Kaempferol +

Acido Tánico

+

1/ + = Detección del Fitocompuesto; - = No Detección del Fitocompuesto

48

Figura 14. Barras de error de diámetro de extractos metanólicos. A) Día 7, B) día 9, C) día 12, D) día 15, E) día 20.

253030303030302530303030303030303030303085N =

N° UTP

140

139

138

137

136

135

134

133

132

131

129

128

127

126

125

124

123

122

121

120

Con

trol

95%

IC D

iám

etro

2,0

1,5

1,0

,5

0,0

-,5

253030303030302530303025303030303025303085N =

N° UTP

140

139

138

137

136

135

134

133

132

131

129

128

127

126

125

124

123

122

121

120

Con

trol

95%

IC D

iám

etro

2,5

2,0

1,5

1,0

,5

0,0

-,5

253030303030302530303028301530303030303085N =

N° UTP

140

139

138

137

136

135

134

133

132

131

129

128

127

126

125

124

123

122

121

120

Con

trol

95%

IC D

iám

etro

1,6

1,4

1,2

1,0

,8

,6

,4

,2

0,0

-,2

253030303030302530303025303030303024283083N =

N° UTP

140

139

138

137

136

135

134

133

132

131

129

128

127

126

125

124

123

122

121

120

Con

trol

95%

IC D

iám

etro

4

3

2

1

0

-1

243030302930302530303030303030303023253080N =

N° UTP

140

139

138

137

136

135

134

133

132

131

129

128

127

126

125

124

123

122

121

120

Con

trol

95%

IC D

iám

etro

6

5

4

3

2

1

0

-1

A B

C D

E

49

Fig

ura 15. B

arras de error de diámetro de extractos de diclorom

etano. A) D

ía 7, B)

día 9, C) día 12, D

) día 15, E) día 20.

N° U

TP

139

138

137

136

135

134

132

131

130

129

128

127

126

125

124

123

122

121

120

cont (-)

95% IC diametro

6543210

N° U

TP

139

138

137

136

135

134

132

131

130

129

128

127

126

125

124

123

122

121

120

cont (-)

95% IC diametro

2,5

2,0

1,5

1,0,5

0,0

-,5

N° U

TP

139

138

137

136

135

134

132

131

130

129

128

127

126

125

124

123

122

121

120

cont (-)

95% IC diametro

3,0

2,5

2,0

1,5

1,0,5

0,0

-,5

N° U

TP

139

138

137

136

135

134

132

131

130

129

128

127

126

125

124

123

122

121

120

cont (-)

95% IC diametro

543210-1

N° U

TP

139

138

137

136

135

134

132

131

130

129

128

127

126

125

124

123

122

121

120

cont (-)

95% IC diametro

76543210

A

B

C

D

E

50

En la figura 14, se puede observar que para la mayoría de los extractos, el comportamiento que tuvieron las colonias fue similar, exceptuando los extractos identificados con N° UTP 126 y 128 pertenecientes a las especies Acalypha diversifolia y Alchornea calophylla de la familia Euphorbiaceae que en las cinco lecturas realizadas mostraron diferencias con respecto a los extractos y al control negativo; el ultimo día de lectura (día 20) estas dos especies tuvieron una diferencia de media de -3.7506 y -2.9906 mm respectivamente en relación al control negativo que tuvo una media de crecimiento de 3.7506. De acuerdo a esto, se pudo determinar que la especie Acalypha diversifolia causó mayor inhibición del hongo M. fijiensis en la fase asexual y Alchornea calophylla fue la segunda especie que mejor inhibición causó en el crecimiento del diámetro de las colonias y la especie Oxypetalum cordifolium aumenta el tamaño de las colonias. Los principales metabolitos secundarios detectados en la familia Euphorbiaceae han sido los triterpenos, flavonoides y alcaloides (Payo et al., 2001); de acuerdo al tamizaje fitoquímico realizado para estas especies (tabla 5), se evidencian triterpenos y flavonoides, que pueden ser los que estén causando el crecimiento nulo o casi nulo de las colonias de M. fijiensis. En la figura 15, se puede observar el comportamiento que tuvieron los extractos de diclorometano sobre el crecimiento de las colonias de M. fijiensis. En el día 7, los extractos tuvieron un crecimiento similar, a excepción del extracto N° UTP 127 perteneciente a la especie Critoniella acuminata que se aleja de los demás con un valor de diámetro promedio cercano a cero. Para el día 9 y 12 de la lectura, los extractos identificados con N° UTP 126, 129, y 130 pertenecientes a las especies Acalypha diversifolia, sin identificar y Hyeronima sp respectivamente, se separan un poco con diámetros por encima del conjunto de extractos que presentan comportamiento similar, además se observa que el extracto N° UTP 127 sigue alejado de este conjunto y a él se unen también con valores bajos de diámetro los extractos N° UTP 134 y 135 pertenecientes a las especies Solanum lepidotum y Lepidaploa lehmannii, que causaron disminución en el crecimiento de las colonias con respecto a los otros extractos y al control. Los dos últimos días de lectura los extractos en general presentaron un comportamiento similar al que traían, homogenizandocen los datos. Las especies Critoniella acuminata y Lepidaploa lehmannii, con diferencias de diámetro medio con respecto al control de -3,8129 y -2,2213 mm respectivamente, fueron las dos especies que menor crecimiento de las colonias de M. fijiensis causaron. Estudios realizados con ácidos grasos como el ácido (z)-9-heptadecanoico (17:1), han demostrado actividad antifúngica sobre el crecimiento del micelio de hongos como Phytophthora infestans e Idriella bolleyi, actuando en la liberación de electrolitos intracelulares y de proteinas, ademas de la desintegración del citoplasma del micelio. Por otro lado, estudios con varios acidos tetradecanoicos (14:0) han inhibido el crecimiento del micelio de hongos, actuando sobre N-

51

myristoyltransferasa (NMT), encima que utilizan muchas especies de hongos para catalizar proteinas N-myristoyl reduciendo el crecimiento del hongo. Los que hace pensar que los extractos de diclorometano, probablemente contienen este tipo de compuestos, que pueden ser los que estén evitando el crecimiento del micelio de M. fijiensis (Caballeira et al., 2005). Comparando los dos bioensayos realizados, se puede observar que ninguno de los extractos causaron mayor efecto de inhibición sobre las ascosporas que en los conidios de M. fijiensis. Este resultado, se puede deber a que la morfología y el metabolismo del micelio de los hongos, hace que estos sehan capaces de sobrevivir a la inhibición inicial y beneficiarse de la estimulacion subsiguiente, ya que los sitios de accion se encuentran distribuidos en muchas partes del micelio y no en un solo sitio como en las ascosporas (Chica et al., 2005) También, se pudo determinar que ninguno de los extractos metanólicos de las especies que tuvieron actividad en la fase sexual del hongo coincide con los extractos de las especies que presentaron actividad en la fase asexual de reproducción de M. fijiensis; Mientras que para los extractos de diclorometano, si se observa que los extractos de las especies Acalypha diversifolia, Crionella acuminata y Lepidaploa lehmannii presentaron actividad sobre el hongo M. fijiensis en sus dos fases de reproducción, lo que hace pensar en estas especies como promisorias para el control de la Sigatoka negra, ya puede atacarla en todo su ciclo reproductivo y los valores de inhibición que presentaron estas especies sobre el hongo son relativamente altos teniendo en cuenta que se trata de extractos crudos.

52

7. CONCLUSIONES • Los extractos que tuvieron actividad antifungica sobre la fase sexual del hongo

generan deformidad en los tubos germinativos de las ascosporas. • Un porcentaje alto de extractos de diclorometano causó efecto antifúngico en la

fase de reproducción sexual de M.fijiensis. • Cestrum sp es la especie que causa mayor porcentaje de inhibición sobre las

ascosporas de M. fijiensis. • El extracto de diclorometano de la especie Acalypha diversifolia tuvo el mejor

efecto inhibitorio en la fase asexual de M. fijiensis, ya que no permitió el crecimiento de éste.

• Los extractos de diclorometano de las especies Acalypha diversifolia, Crionella

acuminata y Lepidaploa lehmannii inhiben la reproducción del hongo en todo su ciclo reproductivo.

• La actividad inhibitoria de los extractos sobre el hongo en sus dos fases de

reproducción, puede estar siendo causada por esteroles, triterpenos o flavonoides.

53

8. RECOMENDACIONES

• Utilizar extractos que hayan tenido actividad en la fase de reproducción

sexual del hongo, para realizar mezclas con extractos que hayan tenido actividad antifúngica en la fase asexual del hongo y realizar bioensayos en busqueda de una mezcla de extractos que ataque al hongo en sus dos fases de reproducción.

• Aislar e identificar los metabolitos activos de los extractos crudos que hayan

tenido propiedades antifúngicas sobre M. fijiensis, por medio de separaciones bioguiadas.

• Comprobar a nivel de campo si el efecto in vitro causado por los se

mantiene en condiciones in vivo con altos niveles de presión de inóculo.

54

9. BIBLIOGRAFÍA

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59

ANEXOS

60

Anexo 1. Prueba de Kruskal-Wallis. Extractos metanólicos. Día 7. Día 9.

Día 12. Día 15.

Rangos

85 273,14

30 291,63

30 340,57

30 218,43

30 340,35

30 186,53

30 229,03

15 19,50

30 442,20

28 68,57

30 329,45

30 250,12

30 418,28

25 432,62

30 361,28

30 406,10

30 439,07

30 332,92

30 429,33

30 465,23

633

ExtractoControl

120

121

122

123

124

125

126

127

128

129

131

132

133

134

135

136

137

138

139

Total

DiámetroN

Rangopromedio

Rangos

85 418,25

30 347,62

30 383,90

30 218,02

30 421,68

30 337,57

30 192,20

30 27,50

30 405,50

30 44,22

30 256,82

30 251,15

30 366,85

25 441,32

30 298,83

30 346,22

30 427,28

30 284,95

30 390,37

30 499,02

650

ExtractoControl

120

121

122

123

124

125

126

127

128

129

131

132

133

134

135

136

137

138

139

Total

DiámetroN

Rangopromedio

Rangos

85 420,02

30 403,75

30 337,45

25 205,10

30 404,52

30 412,78

30 196,53

30 25,00

30 396,18

25 37,94

30 238,95

30 243,43

30 346,75

25 440,40

30 306,45

30 296,52

30 394,23

30 293,62

30 404,90

30 376,67

640

ExtractoControl

120

121

122

123

124

125

126

127

128

129

131

132

133

134

135

136

137

138

139

Total

DiámetroN

Rangopromedio

Rangos

83 442,16

30 402,28

28 344,29

24 145,46

30 401,23

30 386,37

30 182,28

30 26,50

30 424,78

25 41,10

30 299,37

30 230,95

30 423,87

25 440,58

30 257,08

30 276,65

30 390,62

30 375,45

30 410,65

30 501,05

25 263,36

660

ExtractoControl

120

121

122

123

124

125

126

127

128

129

131

132

133

134

135

136

137

138

139

140

Total

DiámetroN

Rangopromedio

61

Día 20.

Extractos de diclorometano Día 7. Día 9.

Día 12. Día 15.

Rangos

80 414.31

30 322.25

25 347.70

23 114.76

30 394.55

30 457.37

30 261.95

30 26.50

30 381.70

30 52.53

30 331.65

30 252.83

30 408.17

25 387.24

30 254.78

30 295.40

29 358.81

30 404.40

30 391.42

30 552.30

24 304.13

656

Extracto119

120

121

122

123

124

125

126

127

128

129

131

132

133

134

135

136

137

138

139

140

Total

DiámetroN

Rangopromedio

Rangos

65 273,20

30 153,52

30 233,50

15 339,60

30 284,15

25 188,52

30 89,92

25 368,38

30 33,07

15 360,10

25 288,78

30 318,70

30 153,68

15 364,00

15 98,87

15 105,20

15 350,77

10 290,65

15 419,87

15 337,43

480

extractocontrol

120

121

122

123

124

125

126

127

128

129

130

131

132

134

135

136

137

138

139

Total

diametroN

Rangopromedio

Rangos

65 356,07

30 201,12

30 303,28

29 265,07

30 409,58

25 342,64

30 191,85

25 516,80

30 43,12

30 342,18

25 440,94

30 480,55

30 305,03

30 323,82

30 153,63

30 159,77

30 320,45

25 288,12

30 341,57

30 366,08

614

extractocontrol

120

121

122

123

124

125

126

127

128

129

130

131

132

134

135

136

137

138

139

Total

diametroN

Rangopromedio

62

Día 20.

Anexo 2. Prueba de Tamhane (comparación de medias) para el último día de lectura (día 20).

Rangos

65 340,29

30 213,85

30 301,18

29 258,55

30 395,85

25 346,62

30 220,85

25 531,48

30 65,80

30 343,40

25 473,08

30 491,82

30 334,13

30 316,05

30 154,22

30 141,20

30 326,65

25 272,86

30 304,07

30 343,83

614

extractocontrol

120

121

122

123

124

125

126

127

128

129

130

131

132

134

135

136

137

138

139

Total

diametroN

Rangopromedio

Rangos

65 376,78

30 199,60

30 317,23

29 305,84

30 405,42

25 352,66

30 216,57

25 518,92

30 67,43

30 362,87

25 462,44

30 475,33

30 340,15

30 307,50

30 167,40

30 129,32

30 276,90

25 249,00

30 273,78

30 322,80

614

extractocontrol

120

121

122

123

124

125

126

127

128

129

130

131

132

134

135

136

137

138

139

Total

diametroN

Rangopromedio

Rangos

65 358,12

30 202,88

30 353,48

29 288,74

30 360,97

21 363,19

30 228,97

25 509,92

30 54,18

30 353,08

25 462,84

30 491,48

30 384,63

30 236,63

30 178,95

30 114,02

30 262,07

25 310,30

30 247,25

30 364,73

610

extractocontrol

120

121

122

123

124

125

126

127

128

129

130

131

132

134

135

136

137

138

139

Total

diametroN

Rangopromedio

63

Extractos metanólicos. Comparaciones múltiples Variable dependiente: diámetro Tamhane

Intervalo de confianza al 95%

(I) Extracto

(J) Extracto

Diferencia de medias

(I-J) Error típico Sig.

Límite inferior Límite superior

Control 120 .2740 .1533 .996 -.1954 .7433 121 .2586 .1641 .985 -.1648 .6821 122 1.1724* .1694 .000 .7326 1.6121 123 5.396E-02 .1533 1.000 -.5258 .6337 124 -.2944 .1533 1.000 -.9487 .3600 125 .6056* .1533 .003 .1032 1.1080 126 3.7506* .1533 .000 3.5009 4.0004 127 9.729E-02 .1533 1.000 -.4106 .6052 128 2.9906* .1533 .000 2.2491 3.7321 129 .2973 .1533 .565 -8.8101E-02 .6827 131 .6256* .1533 .001 .1365 1.1147 132 5.896E-02 .1533 1.000 -.3650 .4829 133 9.463E-02 .1641 1.000 -.4368 .6261 134 .8873 .1533 .088 -4.6456E-02 1.8210 135 .4306 .1533 .558 -.1327 .9940 136 .2179 .1552 1.000 -.3233 .7591 137 3.563E-02 .1533 1.000 -.4658 .5370 138 .1390 .1533 1.000 -.3077 .5856 139 -.9960* .1533 .004 -1.8249 -.1672 140 .9069 .1667 .853 -.4638 2.2775

* La diferencia entre las medias es significativa al nivel 0.05.

64

Extractos de diclorometano. Comparaciones múltiples Variable dependiente: diámetro Tamhane

Intervalo de confianza al 95%

(I) Extracto

(J) Extracto

Diferencia de medias

(I-J) Error típico Sig.

Límite inferior Límite superior

control 120 1,3946* ,3310 ,000 ,4077 2,3815 121 ,5163 ,3310 1,000 -1,2775 2,3101 122 ,7867 ,3349 1,000 -,7456 2,3190 123 ,4463 ,3310 1,000 -1,4062 2,2988 124 ,2675 ,3765 1,000 -1,8416 2,3766 125 1,1913* ,3310 ,007 ,1659 2,2166 126 -1,1434* ,3530 ,000 -1,6817 -,6051 127 3,8129* ,3310 ,000 2,8754 4,7505 128 -,2504 ,3310 1,000 -2,2358 1,7350 129 -,7614* ,3530 ,012 -1,4407 -8,2069E-02 130 -,9521 ,3310 ,000 -1,3957 -,5084 131 ,2629 ,3310 1,000 -1,4040 1,9299 132 1,0446* ,3310 ,011 ,1218 1,9674 134 1,4729* ,3310 ,000 ,9192 2,0267 135 2,2213* ,3310 ,000 1,7363 2,7062 136 ,8746 ,3310 ,345 -,2001 1,9494 137 ,4466 ,3530 1,000 -1,2371 2,1304 138 1,0063* ,3310 ,032 3,628E-02 1,9763 139 -2,8718E-02 ,3310 1,000 -,4491 ,3917

* La diferencia entre las medias es significativa al nivel .05.