DETERMINACION DE ACTIVIDAD DE ANTIBIOTICO POR DIFUSIÓN EN GEL
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DETERMINACION DE ACTIVIDAD DE ANTIBIOTICO POR DIFUSION EN GEL
PARTE I
EFECTO DE LA CONCENTRACION DEL ACTIVO Y EL TIPO MICROORGANISMO
1. OBJETIVO
Determinar el efecto del tipo de microorganismo y la concentración del activo sobre el
diámetro del halo de inhibición para la evaluación de una sustancia antimicrobiana por
difusión el gel.
2. MATERIALES (Materiales por grupo de Trabajo)
Tubo de ensayo con 4 ml de inóculo 1
Tubo de ensayo con 2 ml de solución estándar del antibiótico de 1mg/ml 1
Tubos de ensayo pequeños vacíos 10
Recipiente con 60 ml de agar antibiótico No.1 fundido a 50°C 1
Recipiente con 15 ml de agua destilada estéril 1
Cajas de petri vacía estéril con 11 cilindros de acero 1
Pipeta de 10 ml estéril 1
Pipeta de 1 ml estéril 12
Pinza estéril 1
3. MICROORGANISMOS
Escherichia coli
Pseudomonas eruginosa
Klebsiella pneumoniae
Staphylococcus aureus
Bacillus subtilis
Streptococcus faecalis
De los anteriores microorganismos cultivar dos cepas de cada uno en 5 ml de caldo MH
incubados a 35ºC por 24 horas.
4. PROCEDIMIENTO
4.1. Preparación del Activo
4.1.1. Marque los tubos pequeños del 1 al 10
4.1.2. Con ayuda de la pipeta de 10 ml adicione 1 ml de agua destilada estéril en cada tubo
4.1.3. Tome 1 ml de la solución estándar de antibiótico de 1 mg/ml y colóquelo en el tubo
marcado como No 1 y homogenice.
4.1.4. Del tubo 1 tome 1 ml de solución y colóquelo en tubo marcado como No. 2 y homogenice.
4.1.5. Repita el procedimiento hasta el tubo marcado como No 10 y homogenice.
4.1.6. Vea la Figura No. 1
Figura 1. Preparación de las diluciones del activo
4.2. Preparación del Inóculo
4.2.1. De cada microorganismo haga un cultivo masivo en agar MH e incube a 35°C por 24
horas.
4.2.2. Con caldo de preservación coseche el microorganismo y prepare en el mismo caldo una
suspensión del microorganismo de 25%T (600nm)
4.3.Desarrollo del Ensayo
4.3.1. Con ayuda de una pinza distribuya los cilindros de acero en la caja de petri según
diagrama adjunto (Figura No. 2).
4.3.2. Inocule el recipiente que contienen 60 ml agar antibiótico No. 1 fundido que se mantiene a
entre 48 y 50ºC con 1 ml del inóculo de 25%T.
4.3.3. Mezcle bien sin hacer burbujas y sírvalo en la caja de petri sin tumbar los cilindros de
acero.
4.3.4. Deje endurecer el agar y con ayuda de la pinza retire los cilindros de acero
4.3.5. Revise que los pozuelos no tengan agar en el interior
4.3.6. Dispense en cada pozuelo 0.1 ml de cada una de las diluciones de acuerdo con la
distribución que se ve en la Figura No 2.
4.3.7. Agregue 0.1 ml de agua destilada en el pozuelo central.
4.3.8. Incube las cajas a 35ºC por 24 horas
4.3.9. Luego de incubar mida con un calibrador los diámetros de los halos de inhibición.
Figura No.2. Distribución de los pozuelos en el agar.
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910
2
5. ANÁLISIS DE LOS RESULTADOS
5.1. Revise las características del halo de inhibición y determine cuales microorganismos producen
halos de inhibición bien definidos.
5.2. Registre en la Tabla no. 1 los valores de los diámetros de los halos de los microorganismos
seleccionados
5.3. Con la información realice el Gráfico No. 1 de Diámetro del halo versus Logaritmo de
concentración
5.4. Calcule los valores de la corona ([Diámetro del halo – Diámetro del Pozuelo]/2)
5.5. Con la información realice el Gráfico No. 2 de Longitud de la Corona versus Logaritmo de
concentración.
5.6. Por medio de la regresión de mínimos cuadrados determine la ecuación de las dos gráficos, el
valor de R2 y el del intercepto.
5.7. Para determinar el rango de concentración con la mejor correlación realice regresiones de
mínimos cuadrados en grupos de cinco (5) concentraciones C1 a C5, C2 a C6, C3 a C7,
C4 a C7, C5 a C9 y C6 a C10, en caso de ser posible. (Tenga en cuenta que el valor
máximo de diámetro del halo puede estar entre 25 y 30 mm y el menor de 12 mm).
5.8. El valor del intercepto en la Grafica No 2, es equivalente a la concentración mínima inhibitoria
5.9. Con al información calculada realice el análisis de resultados y las conclusiones respectivas,
que se emplearán para la segunda sección del trabajo.
Tabla No. 1
DOSISCONCENTRACION
mcg/ml
LOGARITMO DE
CONCENTRACION
DIAMETRO
DEL HALO
(mm)
LONGITUD
DE LA CORONA
(mm)
C1 500
C2 250
C3 125
C4 62,5
C5 31,25
C6 15,625
C7 7,8125
C8 3,90625
C9 1,953125
C10 0,9765625
DETERMINACION DE ACTIVIDAD DE ANTIBIOTICO POR DIFUSION EN GEL
PARTE II
EFECTO DE LA CONCENTRACION DE LA DENSIDAD DEL INOCULO
6. OBJETIVO
Determinar el efecto de la densidad del inóculo sobre el diámetro del halo de inhibición
para la evaluación de una sustancia antimicrobiana por difusión el gel.
7. MATERIALES (Por grupo de Trabajo)
Tubo de ensayo con 2 ml de inóculo 1
Tubo de ensayo con 2 ml de solución estándar del antibiótico de 1mg/ml 1
Tubos de ensayo pequeños vacíos 5
Recipiente con 60 ml de agar antibiótico No.1 fundido a 50°C 1
Recipiente con 10 ml de agua destilada estéril 1
Caja de petri vacía estéril con 11 cilindros de acero 1
Pipeta de 10 ml estéril 1
Pipeta de 1 ml estéril 7
Pinza estéril 1
8. MICROORGANISMO
Bacillus subtilis
9. PROCEDIMIENTO
9.1. Preparación del Activo
9.1.1. De la primera parte se ha seleccionado el rango de mejor correlación.
9.1.2. A partir de la solución de 1 mg/ml realice una dilución que tenga la concentración más alta
del rango seleccionado la cual llamaremos C1.
9.1.3. A partir de C1 realice diluciones seriadas 1:1 hasta C5 esta actividad de la misma manera
que se realizó en la sección 4.1.
9.2. Preparación del Inóculo
9.2.1. Del Bacillus subtilis haga un cultivo masivo en agar MH suplementado con MnSO4 (0,3 g/l)
e incube a 30°C por al menos 5 días.
9.2.2. Verifique al microscopio que el cultivo esté totalmente esporulado.
9.2.3. Con caldo de preservación coseche el microorganismo y prepare en el mismo caldo una
suspensión del microorganismo de 25%T (600nm). Lo llamaremos Inóculo 1X
9.2.4. Haga tratamiento térmico (70°C por 10 minutos) para eliminar las formas vegetativas
presentes en la suspensión.
9.2.5. Para preparar el inóculo de mayor densidad Tome 10 ml de la suspensión y centrifugue a
5000 rpm por 15 minutos; retire el sobrenadante; resuspenda en pellet en 1 ml de caldo de
conservación. Lo llamaremos Inóculo 10X
9.2.6. Para los inóculos menos densos haga una dilución 1:100 de la suspensión de 25%T. lo
llamaremos Inóculo 10-2X
9.3.Desarrollo del Ensayo
9.3.1. Con ayuda de una pinza distribuya los cilindros de acero en la caja de petri según
diagrama adjunto (Figura No. 2).
9.3.2. Inocule el recipiente que contienen 60 ml agar antibiótico No. 1 fundido que se mantiene a
entre 48 y 50ºC con 1 ml del inoculo 10X
9.3.3. Inocule el recipiente que contienen 60 ml agar antibiótico No. 1 fundido que se mantiene a
entre 48 y 50ºC con 0,1 ml del inoculo 10X
9.3.4. Inocule el recipiente que contienen 60 ml agar antibiótico No. 1 fundido que se mantiene a
entre 48 y 50ºC con 0,1 ml del inoculo 1X
9.3.5. Inocule el recipiente que contienen 60 ml agar antibiótico No. 1 fundido que se mantiene a
entre 48 y 50ºC con 1 ml del inoculo 10-2X
9.3.6. Inocule el recipiente que contienen 60 ml agar antibiótico No. 1 fundido que se mantiene a
entre 48 y 50ºC con 1 ml del inoculo 10-2X
9.3.7. En cada caso mezcle bien sin hacer burbujas y sírvalo en la caja de petri sin tumbar los
cilindros de acero.
9.3.8. Deje endurecer el agar y con ayuda de la pinza retire los cilindros de acero
9.3.9. Revise que los pozuelos no tengan agar en el interior
9.3.10. Dispense en cada pozuelo 0.1 ml de cada una de las diluciones de acuerdo con la
distribución que se ve en la Figura No 3.
9.3.11. Agregue 0.1 ml de agua destilada en el pozuelo central.
9.3.12. Incube las cajas a 35ºC por 8 a 12 horas
9.3.13. Luego de incubar mida con un calibrador los diámetros de los halos de inhibición.
Figura No.3. Distribución de los pozuelos en el agar.
10. ANÁLISIS DE LOS RESULTADOS
10.1. Registre en la Tabla No. 2 los valores de los diámetros de los halos
10.2. Con la información realice el Gráfico No. 1 de Diámetro del halo versus Logaritmo de
concentración
10.3. Por medio de la regresión de mínimos cuadrados determine la ecuación de las dos
gráficos, el valor de R2 .
10.4. Con los valores de pendiente e intercepto de cada gráfico determine la influencia de la
densidad del inóculo sobre la respuesta del activo.
10.5. Haga la respectiva discusión y las. conclusiones
C1
C2 C3
C2C3
C4 C5
C4C5
C1
Tabla No. 2
DOSISCONCENTRACION
mcg/ml
LOGARITMO DE
CONCENTRACION
DIAMETRO
DEL HALO
(mm)
C1
C2
C3
C4
C5
DETERMINACION DE ACTIVIDAD DE ANTIBIOTICO POR DIFUSION EN GEL
PARTE III
VALORACION DE LA POTENCIA DE UN ANTIBIOTICO
11. OBJETIVO
Determinar la potencia de un antibiótico comercial por difusión el gel.
12. MATERIALES
Tubo de ensayo con 4 ml de inóculo 1
Tubo de ensayo con 2 ml de solución estándar del antibiótico de 1mg/ml 1
Tubos de ensayo pequeños vacíos 5
Recipiente con 60 ml de agar antibiótico No.1 fundido a 50°C 1
Recipiente con 15 ml de agua destilada estéril 1
Cajas de petri vacía estéril con 11 cilindros de acero 1
Pipeta de 10 ml estéril 1
Pipeta de 1 ml estéril 3
Pinza estéril 1
13. MICROORGANISMO
Bacillus subtilis
14. PROCEDIMIENTO
14.1. Preparación del Activo
14.1.1. De la primera parte se ha seleccionado el rango de mejor correlación.
14.1.2. A partir de la solución de 1 mg/ml del antibiótico estándar realice una dilución que tenga la
concentración más alta del rango seleccionado la cual llamaremos C1.
14.1.3. Haga diluciones serias 1:1 hasta C5 de la misma manera que se hace en la sección 4.1.
14.1.4. Diluya el producto en agua destilada hasta obtener una solución de 1 mg/ml.
14.1.5. A partir de la solución de 1 mg/ml del producto realice una dilución que tenga la
concentración más alta del rango seleccionado la cual llamaremos P1.
14.1.6. Haga diluciones serias 1:1 hasta P5 de la misma manera que se hace en la sección 4.1
14.2. Preparación del Inóculo
14.2.1. Del Bacillus subtilis haga un cultivo masivo en agar MH suplementado con MnSO4 (0,3 g/l)
e incube a 30°C por al menos 5 días.
14.2.2. Verifique al microscopio que el cultivo esté totalmente esporulado.
14.2.3. Con caldo de preservación coseche el microorganismo y prepare en el mismo caldo una
suspensión del microorganismo de 25%T (600nm).
14.3. Desarrollo del Ensayo
14.3.1. Con ayuda de una pinza distribuya los cilindros de acero en la caja de petri según
diagrama adjunto (Figura No. 2).
14.3.2. Inocule el recipiente que contienen 60 ml agar antibiótico No. 1 fundido que se mantiene a
entre 48 y 50ºC con 1 ml del inoculo
14.3.3. Mezcle bien sin hacer burbujas y sírvalo en la caja de petri sin tumbar los cilindros de
acero.
14.3.4. Deje endurecer el agar y con ayuda de la pinza retire los cilindros de acero
14.3.5. Revise que los pozuelos no tengan agar en el interior. En caso de presencia de residuos
de agar retírelos con una espátula delgada estéril.
14.3.6. Dispense en cada pozuelo 0.1 ml de cada una de las diluciones de acuerdo con la
distribución que se ve en la Figura No 4.
14.3.7. Agregue 0.1 ml de agua destilada en el pozuelo central.
14.3.8. Incube las cajas a 35ºC por 8 a 12 horas
14.3.9. Luego de incubar mida con un calibrador los diámetros de los halos de inhibición.
15. ANÁLISIS DE LOS RESULTADOS
15.1. Registre en la Tabla No. 3 los valores de los diámetros de los halos
15.2. Con la información realice el Gráfico No. 1 de Diámetro del halo versus Logaritmo de
concentración
15.3. Por medio de la regresión de mínimos cuadrados determine la ecuación de las dos
gráficos, el valor de R2.
15.4. Verifique que las curvas sean paralelas.
15.5. Calcule la potencia del producto de acuerdo con las siguientes ecuaciones.
Distancia de Concentración = 2
I = Log (2)
E = [(C1 + P1) – (C5 + P5)]
F = 1/5[(P1+P2+P3+P4+P5) – (C1+C2+C3+C4+C5)]
b = I/E
M = F/b
Potencia = Antilogaritmo (M)
Figura No.4. Distribución de los pozuelos en el agar.
P1
C2 C3
P2P3
C4 C5
P4P5
C1
Tabla No. 2
DOSISCONCENTRACION
mcg/ml
LOGARITMO DE
CONCENTRACION
ESTANDARD
DIAMETRO
DEL HALO
(mm)
MUESTRA
DIAMETRO
DEL HALO
(mm)
1
2
3
4
5