2

DETERMINACION DE AISLADOS AMBIENTALES DE C. gattii, C. neoformans var neoformans Y C. neoformans var grubii PERTENECIENTES AL

COMPLEJO C. neoformans EN LOS PARQUES SIMON BOLIVAR, ANTONIA SANTOS, COLON Y NACIONAL EN EL MUNICIPIO DE SAN JOSE DE

CUCUTA, NORTE DE SANTANDER, COLOMBIA, AÑO 2017.

AYMET PATRICIA RUBIO CANO DAMARYS LORENA GELVES TRUJILLO

GYOVANY ALEXANDER RINCON CASTRILLON

UNIVERSIDAD DE SANTANDER SEDE CUCUTA

FACULTAD DE SALUD BACTERIOLOGIA Y LABORATORIO CLINICO

CUCUTA 2017

1

DETERMINACION DE AISLADOS AMBIENTALES DE C. gattii, C. neoformans var neoformans Y C. neoformans var grubii PERTENECIENTES AL

COMPLEJO C. neoformans EN LOS PARQUES SIMON BOLIVAR, ANTONIA SANTOS, COLON Y NACIONAL EN EL MUNICIPIO DE SAN JOSE DE

CUCUTA, NORTE DE SANTANDER, COLOMBIA, AÑO 2017.

AYMET PATRICIA RUBIO CANO 13171022

DAMARYS LORENA GELVES TRUJILLO 13171045

GYOVANY ALEXANDER RINCON CASTRILLON 13171042

TRABAJO DE GRADO PARA OPTAR EL TITULO DE BACTERIÓLOGO(A) Y

LABORATISTA CLÍNICO

Director De Tesis: ASBLEIDE KARINA ANGARITA SANCHEZ

Asesor Científico:

DENNY MILEY CÁRDENAS SIERRA CLAUDIA YANETH DIAZ CARVAJAL

Asesor Metodológico:

M.Sc. JAEL CONTRERAS RANGEL

UNIVERSIDAD DE SANTANDER SEDE CUCUTA

FACULTAD DE SALUD BACTERIOLOGIA Y LABORATORIO CLINICO

CUCUTA 2017

2

3

AGRADECIMIENTOS

De Aymet Patricia Rubio Cano a: Dios primeramente, porque gracias a el y a su misericordia todo fue posible, por darnos paciencia, y poder cumplir nuestra meta que es llevar a cabo este proyecto de investigación. Universidad de Santander campus Cúcuta por brindarnos la oportunidad de hacer parte de esta gran institución, por el apoyo y por el gran personal que tiene que nos ayudaron a que esto fuera realidad. Nuestra tutora de tesis, Dra. Asbleide Karina Angarita Sanchez, por haber confiado en nosotros, por guiarnos y estar con nosotros siempre, por su gran liderazgo y enseñarnos que hay que ponerle empeño y dedicación a nuestras metas. Nuestras asesoras científicas, Dra. Denny Miley Cardenas Sierra y Dra. Claudia Yaneth Diaz Carvajal, por el aporte de sus conocimientos para llevar a cabo la realización de las técnicas y cumplimiento de lo propuesto para la ejecución de la investigación. Nuestro asesor metodológico, Lic. Jael Contreras Rangel, por su apoyo incondicional en la elaboración del documento, por guiarnos, orientarnos y corregirnos para que todo nos saliera bien. Y a todos y cada uno de nosotros (los integrantes) por el compromiso y dedicación para que este proyecto se hiciera realidad, a todos los que aportaron su granito de arena, gracias infinitas a todos.

4

De Damarys Lorena Gelves Trujillo a: Dios primeramente, sin él nada de lo que hacemos fuera posible, por darnos valor, paciencia, y todo lo que necesitamos en el transcurso para llevar a cabo este proyecto de investigación. Universidad de Santander campus Cúcuta por brindarnos la oportunidad de hacer parte de esta gran institución, además del apoyo constante y los conocimientos científicos adquiridos por medio de nuestros docentes, para de esta manera poder llevar a cabo este proyecto que no sólo nos beneficia a nosotros, sino que también a la comunidad. Nuestra tutora de tesis, Dra. Asbleide Karina Angarita Sanchez, por haber depositado su confianza en nosotros para llevar a cabo con éxito este proyecto, su paciencia y entrega para cumplir a cabalidad cada objetivo trazado, y su compromiso con esta investigación. Nuestras asesoras científicas, Dra. Denny Miley Cardenas Sierra y Dra. Claudia Yaneth Diaz Carvajal, por el aporte de sus conocimientos para llevar a cabo la realización de las técnicas y cumplimiento de lo propuesto para la ejecución de la investigación. Nuestro asesor metodológico, Lic. Jael Contreras Rangel, por su apoyo en la elaboración del trabajo escrito, aplicando las técnicas y conocimientos que él aporta para que sea un buen trabajo. Y a todos y cada uno de nosotros (los integrantes) por el compromiso y dedicación para que este proyecto se hiciera realidad, a todos los que aportaron su granito de arena, gracias infinitas a todos.

5

De Gyovany Alexander Rincón Castrillón a: Quiero dar las gracias de ante mano a mi dios, ya que sin el nada es posible, él es quien nos da a vida y nos guía día a día e indispensablemente en este arduo camino de nuestro proyecto de investigación. Universidad de Santander campus Cúcuta por brindarnos la oportunidad de hacer parte de esta gran institución, además del apoyo constante y los conocimientos científicos adquiridos por medio de nuestros docentes, y el apoyo económico que fue indispensable para de esta manera poder llevar a cabo este proyecto que no sólo nos beneficia a nosotros, sino que también a la comunidad. Nuestra tutora de tesis, Dra. Asbleide Karina Angarita Sanchez, por brindarnos el gran apoyo y confianza que necesitamos para poder lograr cada uno de los objetivos trazados en nuestro proyecto de investigación Nuestras asesoras científicas, Dra. Denny Miley Cardenas Sierra y Dra. Claudia Yaneth Diaz Carvajal, por el aporte de sus conocimientos y experiencia en el campo de la investigación aportándonos grandes avances n diferentes técnicas y procedimientos en el laboratorio. Nuestro asesor metodológico, Lic. Jael Contreras Rangel, por su apoyo en la elaboración del trabajo escrito, aplicación del conocimiento científico para la elaboración de esta grandiosa tesis Y a todos y cada uno de nosotros (los integrantes) por el compromiso y dedicación para que este proyecto se hiciera realidad, a todos los que aportaron su granito de arena, gracias infinitas a todos.

6

DEDICATORIA

De Aymet Patricia Rubio Cano a:

Este proyecto quiero dedicárselo primeramente a dios por iluminar mi camino, por permitir realizar y cumplir mis sueños, por guiarme y darme la fortaleza, sabiduría para sacar este proyecto adelante y superar todas las dificultades. A mis padres porque sin su esfuerzo, sin su apoyo y comprensión no hubiera llegado hasta donde estoy, por hacer de mí una gran persona y que gracias a ellos hoy puedo decir que ya logre mi primera meta, una de tantas que tengo propuesta. A nuestra directora, asesora, y metodólogo que nos ayudaron y pusieron su granito de arena para que todo saliera perfecto. Porque fueron duros, predictivos, y siempre nos acompañaron en nuestro proceso de trabajo de grado. A mis compañeros, porque son excelentes personas y profesionales, somos un gran equipo, siempre nos comprendimos y supimos resolver nuestras dificultades, por ser siempre optimistas y siempre pensar en equipo, nunca nos rendimos, siempre salimos adelante y este es un excelente resultado. A todas las personas que confiaron en mi y me ayudaron a organizarme como bacterióloga y dieron lo mejor de ellos para que yo y mis compañeros seamos los mejores. Y principalmente le dedico este trabajo y este logro a mi hermana, es una luchadora y una excelente joven, yo soy un ejemplo para ella y sé que quiere seguir mis pasos, por eso se lo dedico.

7

De Damarys Lorena Gelves Trujillo a: Dios ya que es el ser supremo, ÉL es quien permite que cada proyecto de mi vida se realice con éxito, además me concede la oportunidad de poder finalizar de la mejor manera uno de mis propósitos en mi existir. Mis padres por permitirme hacer parte de sus vidas, por haberme educado de la manera en que lo han hecho, por formarme, y darme su aprobación en cada paso que doy en la vida, por ser mí apoyo constante en el camino para ser profesional. Nuestra directora de tesis por haber puesto su confianza en mí para hacer parte de este proyecto, por haberme brindado su experiencia y conocimiento sobre el tema para lograr con éxito la culminación de la tesis. A mis compañeros de tesis, sin ellos no hubiera sido posible lograr este objetivo trazado, es el comienzo de un futuro exitoso para cada uno de nosotros. Y a todas las personas que creyeron en mí, para ellos mis mayores agradecimientos: familiares, amigos, compañeros, conocidos y demás personas que me acompañaron en estos cinco (5) años de estudio camino al profesionalismo.

8

De Gyovany Alexander Rincón Castrillón a: Quiero dedicar este gran logro de ante mano a mi Dios, ya que sin el nada es posible, él es quien nos da a vida y nos guía día a día e indispensablemente en este arduo camino de nuestro proyecto de investigación. Mis padres por permitirme hacer parte de sus vidas, y apoyarme en cada uno de mis sueños y metas que he cumplido durante mi vida académica y ahora mi vida profesional. . A mis compañeros de tesis, sin ellos no hubiera sido posible lograr este objetivo trazado, es el comienzo de un futuro exitoso para cada uno de nosotros, y agradezco cada uno de esos momentos de paciencia que nos tocó tener unos con otros debido a grandes tropiezos y grandes obstáculos que logremos vencer. Y a todas las personas que creyeron en mí, para ellos mis mayores agradecimientos: familiares, amigos, compañeros, conocidos y demás personas que me acompañaron en estos cinco (5) años de estudio camino al profesionalismo.

9

DETERMINACION DE AISLADOS AMBIENTALES DE C. gattii, C. neoformans var neoformans Y C. neoformans var grubii PERTENECIENTES AL COM-

PLEJO C. neoformans EN LOS PARQUES SIMON BOLIVAR, ANTONIA SAN COLON TOS, Y NACIONAL EN EL MUNICIPIO DE SAN JOSE

DE CUCUTA, NORTE DE SANTANDER, COLOMBIA, AÑO 2017. Autores

Aymet Patricia Rubio Cano, Damarys Lorena Gelves Trujillo, Gyovany Alexander Rincón Castrillón

RESUMEN La Criptococosis es una micosis oportunista de gran interés por su presentación asociada a pacientes infectados por VIH, con otras inmunodeficiencias e incluso a personas inmunocompetentes. Estudios realizados han reportado hallazgos de Cryptococcus neoformans de aislamientos ambientales, que corresponden en su gran mayoría a los recuperados de excretas de palomas y suelos contaminados con excretas de palomas, y en los detritos de árboles así como de vegetales y frutas. En Cúcuta, entre los años 2008 y 2009, se logró recuperar un aislamiento de Cryptococcus gattii serotipo B y tres aislamientos de Cryptococcus neoformans var. grubii de serotipo A. El objetivo general de la investigación es realizar el aislamiento de las especies del complejo C.neoformans, específicamente C. gattii, C. neoformans var neoformans y C. neoformans var grubii, a partir de muestras de cortezas de árboles, muestras de tierra, frutos secos y excretas de aves de los parques Simón Bolívar, Antonia Santos, La Victoria y Nacional, los cuales son 4 parques públicos muy concurridos de San José de Cúcuta, para su posterior confirmación de especie y variedad mediante técnicas directas, y su respectivo análisis molecular. Realizadas las diferentes pruebas pilotos para dar continuidad con el estudio, se obtuvo gran viabilidad respecto a la investigación, por ende se hizo el respectivo muestreo en los 4 parques mencionados anteriormente, para los cuales encontramos resultados positivos en tres de los cuatro parques analizados, se hizo la primera fase de investigación mediante estudio microbiológico, haciendo la respectiva siembra en el agar semillas de girasol, además dando resultados de pigmentación carmelita intenso característico de este hongo en este medio de cultivo, apoyados además en pruebas bioquímicas tales como la urea, en la cual Cryptococcus sp es urea positiva, ya que este hongo posee la enzima ureasa. Seguido de esto se tiene como segundo objetivo específico realizar las diferentes pruebas moleculares para dar con más exactitud la especie de Cryptococcus sp, en donde obtuvimos como resultados que de los 18 aislados de muestras ambientales con ureasa positiva, 2 pertenecen a Cryptococcus serotipo VNII y 16 pertencen a Cryptococcus serotipo VNI. En conclusión tenemos que confirmamos la presencia de Cryptococcus sp en los parques estudiados en la ciudad de Cúcuta y que además con este estudio aportamos a la investigación debido a el hallazgo de la presencia de Cryptococcus neoformans en el parque La Victoria, sin antecedente alguno para este parque en la ciudad. PALABRAS CLAVES: Cryptococosis, nmunosuprimidos, inmunocompetentes.

10

DETERMINATION OF ENVIRONMENTAL ISOLATES OF C. gattii, C. neofor- mans var neoformans AND C. neoformans var grubii BELONGING TO THE C. neoformans COMPLEX IN THE PARKS SIMON BOLIVAR, ANTONIA SANTOS,

COLON

AND NATIONAL IN THE MUNICIPALITY OF SAN JOSE DE CUCUTA, NORTH OF SANTANDER, COLOMBIA, YEAR 2017.

Authors

Aymet Patricia Rubio Cano, Damarys Lorena Gelves Trujillo, Gyovany Alexander Rincón Castrillón

SUMMARY

Cryptococcosis is an opportunistic mycosis of great interest due to its presentation associated with patients infected with HIV, other immunodeficiencies and even immunocompetent persons. Studies have reported findings of Cryptococcus neoformans on environmental isolates, most of which correspond to those recovered from excreta of pigeons and soil contaminated with excreta from pigeons, and from the detritus of trees as well as from vegetables and fruits. In Cúcuta, between 2008 and 2009, it was possible to recover an isolate of Cryptococcus gattii serotype B and three isolates of Cryptococcus neoformans var. grubii of serotype A. The general objective of the research is to isolate species of the C.neoformans complex, specifically C. gattii, C. neoformans var neoformans and C. neoformans var grubii, from tree bark samples, Samples of soil, nuts and excreta of birds of the Simón Bolívar, Antonia Santos, La Victoria and Nacional parks, which are 4 very popular public parks of San José de Cúcuta, for later confirmation of species and variety through direct techniques, And their respective molecular analysis. The different pilot tests were carried out in order to continue the study, great feasibility was obtained with respect to the research, so the respective sampling was done in the 4 parks mentioned above, for which we found positive results in three of the four parks analyzed, Made the first phase of research by means of a microbiological study, making the respective planting on the agar of sunflower seeds, besides giving results of intense Carmelite pigmentation characteristic of this fungus in this culture medium, suppor- ted also in biochemical tests such like urea, in which Cryptococcus sp is positive urea, since this fungus possesses the urease enzyme. Following this, the second specific objective is to perform the different molecular tests to more accurately give the species of Cryptococcus sp, where we obtained as results that of the 18 isolates from environmental samples with positive urease, 2 belong to Cryptococcus serotype VNII and 16 belong to Cryptococcus seotipo VNI. In conlcusion we have confirmed the presence of Cryptococcus in the parks studied in the city of Cúcuta and also with this study we contribute to the investigation due to the finding of the presence of Cryptococcus neoformans in the park La Victoria, with no history for this park in the city. KEY WORDS: Cryptococcosis, immunosuppressed, immunocompet

11

TABLA DE CONTENIDO

INTRODUCCION ............................................................................................................. 20

1. PROBLEMA .............................................................................................................. 22

1.1 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ..................................................................... 22

1.2 FORMULACIÓN DEL PROBLEMA ........................................................................ 27

1.3 OBJETIVOS ........................................................................................................... 27

Objetivo general. ...................................................................................................... 27

Objetivos específicos. ............................................................................................... 27

1.4 JUSTIFICACIÓN .................................................................................................... 28

2. MARCO REFERENCIAL .......................................................................................... 29

2.1 ANTECEDENTES .................................................................................................. 29

2.2 MARCO TEÓRICO ................................................................................................. 34

2.2.1 Taxonomía. ......................................................................................................... 34

2.2.2 Epidemiología de la criptococosis ....................................................................... 35

2.2.3 La Criptococosis: Cuadros Clínicos ..................................................................... 37

2.2.3.1 Criptococosis pulmonar. ................................................................................... 37

2.2.3.2 Criptococosis meníngea. .................................................................................. 37

2.2.3.3 Criptococosis cutánea ................................................................................... 39

2.2.4 Agentes Etiológicos: Cryptococcus neoformans y Cryptococcus gattii ................. 39

2.2.4.1 Características generales ................................................................................. 39

2.2.4.2 Identificación y serotipado ................................................................................ 42

2.2.5 Factores de patogenicidad. ................................................................................. 43

2.2.5.1 Cápsula ............................................................................................................ 43

2.2.5.2 Ureasa.............................................................................................................. 44

2.2.6 Cryptococcus neoformans y Cryptococcus gattii como agentes etiológicos de la criptococosis ................................................................................................................ 44

2.2.7 Cryptococcus neoformans y Cryptococcus gatii en el ambiente. ......................... 45

2.2.8 Cryptococosis en pacientes inmunosuprimidos ................................................... 45

2.3 MARCO CONCEPTUAL ......................................................................................... 46

2.4 MARCO LEGAL ..................................................................................................... 48

2.5 MARCO CONTEXTUAL ......................................................................................... 48

2.6 SISTEMA DE HIPÓTESIS ...................................................................................... 50

2.7 MATRIZ OPERATIVA DE LAS VARIABLES .......................................................... 51

3. MARCO METODOLOGICO ...................................................................................... 52

12

3.1 TIPO DE INVESTIGACIÓN .................................................................................... 52

3.1.1 Nivel de investigación .......................................................................................... 52

3.1.2 Diseño de investigación ....................................................................................... 52

3.3 POBLACION Y MUESTRA ..................................................................................... 54

3.3.1 Población ............................................................................................................ 54

3.3.2 Muestra ............................................................................................................... 54

3.3.3 Técnicas de muestreo ......................................................................................... 54

3.3.3.1 Muestreo no probabilístico: ............................................................................... 54

3.4 TECNICAS DE PROCESAMIENTO Y ANALISIS DE DATOS ................................ 54

3.5 TECNICAS E INTRUMENTO DE RECOLECCIÓN DE DATOS ............................. 55

3.5.1 INVESTIGACION DOCUMENTAL.. ..................................................................... 55

3.5.2 INVESTIGACION DE CAMPO: ........................................................................... 55

4. ANALISIS E INTERPRETACION DE RESULTADOS .................................................. 56

4.1 RESULTADOS ....................................................................................................... 56

4.1.1 Objetivo 1 ............................................................................................................ 56

4.1.1.1 Presencia de Cryptococcus sp parque Simón Bolívar y la Libertad .................. 56

4.1.1.2 Presencia de Cryptococcus sp parque Antonia Santos y Colon....... ................ 57

4.1.1.3 Confirmación de la especie de Cryptococcus con CGB .................................... 59

4.1.1.4 Muestreo parque Nacional ................................................................................ 59

4.1.2 Objetivo 2 ............................................................................................................ 60

4.1.2.1 Caracterización genética .................................................................................. 60

4.2 DISCUSION ........................................................................................................... 61

5. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES ............................................................... 64

5.1 CONCLUSIONES ................................................................................................... 64

5.2 RECOMENDACIONES .......................................................................................... 65

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................... 140

13

TABLA DE ANEXOS

Anexo 1. RECOLECCION DE MUESTRAS AMBIENTALES .... ¡Error! Marcador no definido.

Anexo 2. SOLUCION BUFFER DE FOSFATO ... ¡Error! Marcador no definido.

Anexo 3. PREPARACION DE MUESTRAS ........ ¡Error! Marcador no definido.

Anexo 4. PREPARACION DE AGAR GIRASOL . ¡Error! Marcador no definido.

Anexo 5. PRUEBA DE UREA ............................. ¡Error! Marcador no definido.

Anexo 6. PREPARACION DE MEDIO CANAVANINA-GLICINA-AZUL DE BROMOTIMOL (MEDIO CGB) .............................. ¡Error! Marcador no definido.

Anexo 7. CONSERVACION DE CEPAS ............. ¡Error! Marcador no definido.

Anexo 8. EXTRACION DE ADN .......................... ¡Error! Marcador no definido.

Anexo 9. PCR HUELLA DIGITAL ........................ ¡Error! Marcador no definido.

Anexo 10. REGISTRO DE MUESTRAS AMBIENTALES PARQUE SIMON

BOLIVAR ........................................................................................................... 94

Anexo 11. REGISTRO DE MUESTRAS AMBIENTALES PARQUE LA

LIBERTAD ....................................................................................................... 108

Anexo 12. REGISTRO MUESTRAS AMBIENTALES PARQUE ANTONIA

SANTOS .......................................................................................................... 112

Anexo 13. REGISTRO DE MUESTRAS AMBIENTALES PARQUE LA

VICTORIA ........................................................................................................ 115

Anexo 14. EVIDENCIAS DE TRABAJO EN EL LABORATORIO ................... 127

Anexo 16. ACTAS DE SUSTENTACION ....................................................... 131

Anexo 17. FORMATO DE ENTREGA DE TRABAJO DE GRADO-ESTUDIANTE ....................................................... ¡Error! Marcador no definido.

Anexo 18. FORMATO DE ENTREGA DE TRABAJO DE GRADO-DIRECTOR ........................................................... ¡Error! Marcador no definido.

14

TABLA DE IMÁGENES

Pág.

Tabla 1. Cryptococcus neoformans y C. gattii. Variedades y serotipos …….

35

Tabla 2. Matriz Operativa de las Variables……………....................................................................................

51

Tabla 3. Genotipos de C.neoformans …………………………………………

60

15

TABLA DE FIGURAS

Pág. Figura 1. Paloma Comun........................................................................... 36

Figura 2. Celulas levaduriformes capsulares de Cryptococcus…………... 40

Figura 3. Medio de cultivo SDA………………………………………………. 40

Figura 4. Crytococcus en Agar Guizotia…………...................................... 41

Figura 5. Tincion de Tinta China................................................................ 42

Figura 6. Medio de Cultivo CGB……………………………………………… 42

Figura 7. Medio de Cultivo Urea……………………………………………… 44

Figura 8. Ubicación Parque Antonia Santos………………………………… 48

Figura 9. Ubicación Parque Simon Bolivar………………………………… 49

Figura 10. Ubicación Parque La Victoria….…………………………………. 49

Figura 11. Ubicación Parque Nacional……………………………………… 49

Figura 12. Ubicacion Parque La Libertad………………………………….. 50

Figura 13: Metodología……………………………………………………….. 53

Figura 14: Aislados ambientales de C. neoformans de los parques Simon Bolivar y La Libertad……………………………………………………………

56

Figura15: Mapa del Parque Simon bolívar con el individuo positivo para Cryptococcus sp………………………………………………………………..

56

Figura 16: Mapa del Parque La libertad con el individuo positivo para Cryptococcus sp………………………………………………………………..

57

16

Figura 17: Aislados ambientales de C. neoformans de los parques Anto- nia Santos y La Victoria………………………………………………….

57

Figura 18: Mapa del Parque Antonia Santos con el individuo positivo para Cryptococcus sp………………………………………………………….........

58

Figura 19: Mapa del Parque La Victoria con los individuos positivos para Cryptococcus sp………………………………………………………………..

58

Figura 20: Confirmación con CGB………………………………………….. 59

Figura 21: Ausencia de Cryptococcus sp en el Parque Nacional………… 59

Figura 22: PCR- huella digital………………………………………………… 60

17

GLOSARIO

CEPA: “es, en microbiología, población de células de una sola especie

descendientes de una única célula, usualmente propagada clonalmente”.1 CRIPTOCOCOSIS: “es una micosis sistémica, generalmente, oportunista. Es producida por Cryptococcus neoformans, la mayoría de la veces, aunque también

puede ser producida por Cryptococcus gattii”.2 CRYPTOCOCCUS: “es un género de fungi. Las especies crecen en cultivo como levaduras. Las formas perfectas (sexuales) o teleomorfas de las especies de

Cryptococcus son hongos filamentosos en el género Filobasidiella“.3 ESPORADICO: “se produce con poca frecuencia y de forma separada.

[Enfermedad] que no constituye una epidemia”.4 EUCALIPTOS: “son árboles perennes, de porte recto. Pueden llegar a medir más de 60 m de altura, si bien se habla de ejemplares ya desaparecidos que han

alcanzado los 150 metros”.5 FENOTIPO: “conjunto de caracteres visibles que un individuo presenta como

resultado de la interacción entre su genotipo y el medio”.6

1 MADIGAN M., MARTINKO J., DUNLAP P., CLARK D. (2009). Brock. Biología de los microorganismos. Duodécima edición. Pearson Educación. 2 DENNIS L. KASPER, STEPHEN L. HAUSER, DAN L. LONGO, J. LARRY JAMESON, AND JOSEPH LOSCALZO. MCGRAW-HILL HARRISON. Principios de medicina interna. Anthony S. Fauci, Eugene Braunwald, Eds. 3 CHAN PA. Cryptococcosis. In: Ferri FF, ed. Ferri's Clinical Advisor 2017. Philadelphia, PA: Elsevier; 2017: 333-333.e1. 4 ROBLES WS, AMEEN M. Cryptococcosis. In: Lebwohl MG, Heymann WR, Berth-Jones J, Coul- son I, eds. Treatment of Skin Disease: Comprehensive Therapeutic Strategies. 4th ed. Philadelphia, PA: Elsevier Saunders; 2014:chap 47. 5 BROOKER, M.I.H.; KLEINIG, D.A. (2006). Field Guide to Eucalyptus. Melbourne: Bloomings. 3ª ed. ISBN 1-876473-52-5 vol. 1. South-eastern Australia 6 Varios autores. Genética médica. Edicions Universitat Barcelona. p. 32. ISBN

18

GENOTIPO: “conjunto de los genes que existen en el núcleo celular de cada

individuo”.8 HIV: “virus de la inmunodeficiencia humana. Es un lentivirus que causa la infección

por VIH y con el tiempo el síndrome de inmunodeficiencia adquirida”.9 INMUNOCOMPROMETIDO: “es aquel que, por su enfermedad de base, tiene alterado uno o algunos mecanismos de defensa, fenómeno que lo hace susceptible

a infecciones oportunistas”.10 INMUNOSUPRIMIDO: “se define como la inhibición de uno o más componentes del sistema inmunitario adaptativo o innato (la inflamación), que puede producirse como resultado de una enfermedad subyacente o de forma intencional mediante el uso de

medicamentos”.11 LCR: “líquido cefalorraquídeo es un líquido incoloro, que baña el encéfalo y la médula espinal. Circula por el espacio subaracnoideo, los ventrículos cerebrales y el canal ependimario sumando un volumen entre 100 y 150 ml, en condiciones

normales”.12 MENINGITIS: “es una infección de las membranas que cubren el cerebro y la

médula espinal. La cubierta se llama meningitis”.13

8 FEITO GRANDE L. El sueño de lo posible: bioética y terapia génica. Madrid: Universidad Pontificia Comillas; 1999. p.35. 9 WEISS RA (May 1993). "How does HIV cause AIDS?". Science. 260 (5112): 1273–9. Bibcode:1993Sci...260.1273W. doi:10.1126/science.8493571. PMID 8493571. 10 DOUEK DC, ROEDERER M, KOUP RA (2009). "Emerging Concepts in the Immunopathogenesis of AIDS". Annu. Rev. Med. 60: 471–84. 11 ABBAS, A.B.; LICHTMAN A.H. (2009). Basic Immunology. Functions and disorders of the im- mune system (3rd edición). Saunders (Elsevier). ISBN 978-1-4160-4688-2. 12 PERA, CRISTÓBAL; SEBASTIÁN GARCÍA DÍAZ (1996). Cirugía (2da edición). Elsevier, España. p. 694. ISBN 8445803778 13 NATH A. Meningitis: bacterial, viral, and other. In: Goldman L, Schafer AI, eds. Goldman-Cecil Medicine. 25th ed. Philadelphia, PA: Elsevier Saunders; 2016:chap 412. MORTALIDAD: “es la cantidad de personas que mueren en un lugar y en un período

de tiempo determinados en relación con el total de la población”.14

19

PCR: “reacción en cadena de la polimerasa, conocida como PCR por sus siglas en inglés (polymerase chain reaction), es una técnica de biología molecular

desarrollada en 1986 por Kary Mullis”.15 PROTEOMICA: “es el estudio a gran escala de las proteínas, en particular de su estructura y función. Las proteínas son partes vitales de los organismos vivos, ya

que son los componentes principales de las rutas metabólicas de las células”.16

SEROTIPO: “es un tipo de microorganismo infeccioso clasificado según los

antígenos que presentan en su superficie celular”.17

14 GERARDO NÚÑEZ MEDINA, Determinantes Contextuales de la Mortalidad en México 2011. 15 SAIKI RK, GELFAND DH, STOFFEL S, SCHARF SJ, HIGUCHI R, HORN GT, MULLIS KB, et al.(1988) Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polyme- rase. Science 239: 487–491 16 WILM M. Quantitative proteomics in biological research. Proteomics. 2009 Oct;9(20):4590-605. 17 KENNETH RYAN et al "Sherris Medical microbiology - An Introduction to Infectious Diseases" 4th edition, Editorial McGraw-Hill Medical, 2003. ISBN 0-83-858529-9.

20

INTRODUCCION

Las especies del complejo Cryptococcus neoformans / Cryptococcus gattii comprenden un grupo de levaduras capsuladas causando la criptococosis en humanos y animales de todo el mundo. Según Tello y colaboradores “la criptococosis corresponde a una micosis esporádica a nivel mundial, potencialmente peligrosa en humanos, y es relevante por considerarse oportunista, debido a su asociación con pacientes tanto

inmunocomproetidos, como a pacientes inmunocompetentes”18, lo cual refleja la patogenicidad de sus agentes etiológicos: Cryptococcus neoformans y Cryptococcus gattii, aislados del ambiente (suelo, excretas de paloma y árboles). “El primero presenta dos variedades: Cryptococcus neoformans var. grubii (comprendiendo a su vez al serotipo A, con subgrupos genéticos VNI, VNII y VNB) y Cryptococcus neoformans var. neoformans (comprendiendo al serotipo D, con subgrupo genético VNIV); éstas presentan un híbrido, correspondiente al serotipo AD y subgrupo genético VNIII. Por su parte, Cryptococcus gattii comprende los serotipos B (subgrupos genéticos VGI y VGII) y serotipo C (subgrupos genéticos VGIII y

VGIV)”.19 La enfermedad criptocócica es una de las más importantes, y un contribuyente de mortalidad temprana, especialmente a causa de meningitis, teniendo en cuenta que pese a que su vía de entrada es mediante inhalación, luego de causar una infección pulmonar, los hongos causantes diseminan vía sanguínea al Sistema Nervioso Central, además a piel, tejidos blandos y tracto genitourinario, como se refiere también para otros casos de individuos inmunosuprimidos. Así, la meningitis criptocóccica corresponde a la micosis más común causada por el género Cryptococcus sp en pacientes inmunosuprimidos, a modo de meningoencefalitis subaguda en pacientes con inmunosupresión grave (recuento de linfocitos T CD4 inferior a 100 células/µl), conllevando a elevada mortalidad asociada en países en vía de desarrollo, como se refiere entre 35% y 65%, o incluso 70%, particularmente en África sub Sahariana. La mayoría de los casos en países en vía de desarrollo están relacionados con infección por Cryptococcus neoformans, var. grubii, respecto a Cryptococcus neoformans, var. neoformans, referido en países europeos y a Cryptococcus gattii , es más a menudo asociada con trastornos neurológicos en huéspedes con inmunidad normal. Las variedades presentan diferencias en la distribución geográfica y en el hábitat.

18 TELLO M, GUTIÉRREZ E, BÉJAR V, GALARZA C, RAMOS W, ORTEGA-LOAYZA A. Criptococosis. Revista médica Risaralda 2013; 19(2):147- 53. 19 LIZARAZO J, RODRÍGUEZ M, ORDÓÑEZ N, VARGAS J, CASTAÑEDA N. Meningitis por Cryptococcus sp en el Hospital Erasmo Meoz de Cúcuta. Acta Neurol Colomb. 1995;11:259-67.

21

La variedad grubii tiene distribución mundial y predilección por suelos contaminados con excrementos de aves, especialmente de palomas (Columba livia). La variedad gattii estaba limitada a regiones templadas, tropicales y subtropicales; no obstante,aislamientos encontrados en Vancouver hacen prever la capacidad de adaptación de la variedad a otras latitudes. El hábitat de la variedad gattii se asocia con diferentes especies de Eucalyptus y con otros árboles como almendros. Investigaciones previas han establecido una posible relación entre la infección humana y la exposición a ambientes donde se ha demostrado la presencia de la levadura. Por esta razón, es interesante determinar el hábitat del hongo, los factores abióticos que lo afectan y las relaciones ecológicas que establece en su ambiente natural. En Colombia, Cryptococcus neoformans var. grubii es la causa más importante de la criptococosis, seguido de Cryptococcus gattii. Por otro lado, Cryptococcus gattii se ha aislado varias veces de diferentes fuentes ambientales en el mundo; por esa razón, el objetivo de este trabajo fue realizar una amplia encuesta de muestreo ambiental en diferentes zonas de la ciudad de Cúcuta, en un intento de aislar el complejo Cryptococcus neoformans / Cryptococcus gattii de diferentes árboles, para determinar su circulación y para ampliar nuestros conocimientos sobre la ecología y la epidemiología de esta levadura patógena en nuestra ciudad. El hallazgo de Cryptococcus neoformans a partir de muestras ambientales en la ciudad de Cúcuta corresponden en su gran mayoría a los recuperados de excretas de paloma y suelos contaminados con dichas excretas de paloma; también se ha aislado de los detritos de árboles, así como de vegetales y frutas. “Durante los años 2008 y 2009, en el municipio de Cúcuta, se logró recuperar un aislamiento de Cryptococcus gattii y tres aislamientos de Cryptococcus neoformans var. grubii, a

partir del rastreo de 4.389 muestras de árboles.” 20

Lo anterior permitirá a futuro tomar medidas preventivas ya sea en cuanto a proponer el uso de normas de bioseguridad que puedan ser adoptas por parte de la comunidad susceptible (barreras de protección física), o bien respecto a la recurrencia de ésta en las zonas de riesgo o en cuanto a la toma de medidas de control sobre los focos ambientales, por parte de las autoridades sanitarias. Adicionalmente, los resultados de éste trabajo contribuirán al conocimiento del comportamiento ecoepidemiológico de este microorganismo en el municipio de San José de Cúcuta.

20 ESCANDÓN, P., DE BEDOUT, C., LIZARAZO, J., AGUDELO, C. I., TOBÓN, Á., BELLO, S. & CASTAÑEDA, E. (2012). Cryptococcosis in Colombia: Results of the national surveillance program for the years 2006-2010. Biomédica, 32,386-398. PROBLEMA

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1. PROBLEMA

1.1 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

“La Criptococosis corresponde a una micosis esporádica a nivel mundial, potencialmente peligrosa en humanos, y es relevante por considerarse oportunista, debido a su asociación con pacientes infectados por el Virus de Inmunodeficiencia Humana, VIH, aunque puede afectar incluso a individuos VIH negativos, lo cual refleja la patogenicidad de sus agentes etiológicos: Cryptococcus neoformans y Cryptococcus gattii, aislados del ambiente (suelo, excretas de paloma y árboles).” 21El primero presenta dos variedades: Cryptococcus neoformans var. grubii (comprendiendo a su vez al serotipo A, con subgrupos genéticos VNI, VNII y VNB) y Cryptococcus neoformans var. neoformans (comprendiendo al serotipo D, con subgrupo genético VNIV); éstas presentan un híbrido, correspondiente al serotipo AD y subgrupo genético VNIII. Por su parte, Cryptococcus gattii comprende los serotipos B (subgrupos genéticos VGI y VGII) y serotipo C (subgrupos genéticos VGIII y VGIV). En el primero de los casos, el aumento en el acceso a la terapia antiretroviral ha transformado el pronóstico de los pacientes infectados por el VIH, sin embargo, en entornos con recursos limitados, en donde la cobertura del tratamiento sigue siendo relativamente baja, y el diagnóstico del VIH se produce en una etapa tardía, muchos de los pacientes siguen muriendo de infecciones oportunistas relacionadas con el VIH en las semanas previas y meses después del inicio de la terapia antirretroviral. La enfermedad criptocócica es una de las más importantes, y un contribuyente de mortalidad temprana, especialmente a causa de meningitis, teniendo en cuenta que pese a que su vía de entrada es mediante inhalación, luego de causar una infección pulmonar, los hongos causantes diseminan vía sanguínea al Sistema Nervioso Central, además a piel, tejidos blandos y tracto genitourinario, como se refiere también para otros casos de individuos inmunosuprimidos. Así, la meningitis criptocóccica corresponde a la micosis más común causada por el género Cryptococcus sp en pacientes VIH positivos, a modo de meningoencefalitis subaguda en pacientes con inmunosupresión grave (recuento de linfocitos T CD4 inferior a 100 células/µl), conllevando a elevada mortalidad asociada en países en vía de desarrollo, como se refiere entre 35% y 65%, o incluso 70%, particularmente en África sub Sahariana. La mayoría de los casos en países en vía de desarrollo están relacionados con infección por Cryptococcus neoformans var. grubii (serotipo A), respecto a Cryptococcus neoformans var. neoformans (serotipo D), referido en países europeos y a Cryptococcus gattii , causante de una minoría de éstos.

21 ELLIS DH. PFEIFFER TJ. ECOLOAV, (1997) -. life cvcle. and infectious propagule of Cryptococcus neoformans. Lancet 1990;336:923-5.(consulta: disponible https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1976940).

23

En Perú, durante el 2002 han logrado Aislar e identificar las variedades de Cryptococcus neoformans que existen en excretas de palomas, suelo y ambientes aéreos del perímetro urbano de la ciudad de Ica, logrando obtener 124 muestras procedentes de palomares de la Facultad de Medicina de la Universidad Nacional San Luis Gonzaga de Ica, capilla del Hospital Socorro, Los viñedos de Santa María, La Victoria y San Joaquín. Se aislaron 26 cepas del género Cryptococcus de las cuales nueve cepas correspondieron a C. neoformans var. neoformans y 17 a Cryptococcus spp; llegando a la conclusión que la relación epidemiologia y su habitat de este hongo es muy estrecha con la complicación de pacientes inmunosuprimidos el contagiarse con este. “C. neoformans var. grubii es un hongo de distribución universal, que se aísla con facilidad del medio ambiente, principalmente del suelo

contaminado con excrementos secos de palomas y otras aves”.22 C. neoformans var. neoformans es principalmente encontrado en Europa y causa enfermedad con menor frecuencia. ”Ambas variedades afectan principalmente a pacientes

inmunocomprometidos”23. C. gattii es encontrado principalmente en climas tropicales y subtropicales, sin embargo un brote de C. gattii en América del Norte indica un cambio drástico en la adaptación de este microorganismo a otros ambientes. C. gattii se ha aislado de una gran variedad de fuentes naturales, se le ha asociado a Eucaliptos de la variedad Eucalyptus camaldulensis y Eucalyptus tereticornis, pero en la actualidad se ha demostrado que más de 32 especies de árboles de diversos géneros y familias pueden albergar a una o más variedades del complejo C. neoformans/ C. gattii. C. gattii afecta principalmente a pacientes inmunocompetentes. La incidencia de la criptococosis aumentó con el inicio del síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) en la década de 1980. Tras el advenimiento de la terapia antirretroviral altamente efectiva (TARGA) desde mediados de 1990, su frecuencia comenzó a disminuir en los países desarrollados. De esta manera un estudio realizado en EEUU (Atlanta, Georgia, y Houston, Texas) demuestra que la incidencia de criptococosis disminuyó de 2,4 - 6,6 % (1992-1993) a 0,2-0,7% (2000), así mismo otro estudio realizado en Francia demuestra una disminución del 46% en la incidencia de criptococosis. Sin embargo en países sin acceso a TARGA la incidencia de criptococosis es aun alta. Así mismo, se reporta que hasta el 6 % de las personas con deterioro de la función de la inmunidad celular debido a otras causas (como neoplasias, lupus eritematoso sistémico, trasplante de órgano sólido o médula ósea, diabetes, sarcoidosis, tratamiento con Corticoides u otra medicación inmunosupresora) se encuentran en riesgo de presentar criptococosis.

22 MAK, S., VÉLEZ, N., CASTAÑEDA, E., & ESCANDÓN, P. (2015). The Fungus among Us: Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii Ecological Modeling for Colombia. Journal of Fungi, 332-344. (Consulta: Disponible:

http://www.mdpi.com/2309- 608X/1/3/332/htm).23 Ibíd, pag 17.

24

Se estima que actualmente a nivel mundial se presentan más de 1.000.000 de casos anuales de neurocriptococosis con un total de 625.000 fallecidos, la mayoría de los casos provienen de África Subsahariana. En los últimos años la criptococosis ha recobrado importancia sobre todo por los recientes brotes de C. gattii en Vancouver, Canadá los cuales ocurrieron en pacientes inmunocompetentes. También se han reportado casos de esta cepa en lugares alejados como Puget Sound, Washington e incluso en turistas Europeos que regresaban de Vancouver, dos de ellos después de un largo tiempo desde su retorno. En estos brotes hubo una gran cantidad de afectados por lo que las autoridades de salud declararon esta enfermedad como de notificación obligatoria. Estudios genéticos demuestran que los brotes ocurridos en la costa occidental Canadá y EE.UU. fueron producidos principalmente por el genotipo AFLP5/VGII, a su vez estos aislamientos presentan tres linajes clonales distintos que han sido designados como VGIIa (mayor), VGIIb (menor) y VGIIc (emergente). Estos genotipos ocasionan mayor letalidad en los animales de experimentación, a su vez, muestran valores de concentración inhibitoria mínima más elevados frente a diversos antifúngicos. Desde finales de 1990 hasta la actualidad cerca de 300 personas han sido afectadas las cuales presentan por lo general cuadros clínicos más tórpidos con pobre respuesta al tratamiento. En Colombia, se han aislado C. neoformans y C. gattii en especímenes clínicos, con una frecuencia de 92.8% para C. neoformans y 7.4% para C. gattii, no obstante, es importante señalar que el 64% de los casos de Criptococosis diagnosticados en Cúcuta son causados por C. gatti. “En Colombia, la criptococosis a nivel del SNC ha venido siendo descrita desde

1956”, 24contándose con reportes en diferentes partes del país, En los últimos años, debido al incremento en el número de casos de pacientes con SIDA, se ha observado un aumento significativo en la frecuencia de criptococosis. En la década comprendida entre 1980 y 1990 se presentó un incremento en la frecuencia de criptococosis de cuatro veces más, al pasar de 72 casos en 1980 a 295 casos en 1990. Este incremento se debió principalmente a pacientes con criptococosis que presentaron coinfección con VIH. En el periodo comprendido entre 1990 y 1995, se reportó un aumento en la proporción de este tipo de pacientes del 27 a 80,4%. En el año 2001 se reportó una incidencia de 2,3 casos por millón de habitantes y una incidencia de 4,7 casos por cada cien mil pacientes VIH positivo.

24 LIZARAZO J, RODRÍGUEZ M, ORDÓÑEZ N, VARGAS J, CASTAÑEDA N. Meningitis por Cryptococcus sp en el Hospital Erasmo Meoz de Cúcuta. Acta Neurol Colomb. 1995;11:259- 67.

25

En el último estudio epidemiológico realizado por el Grupo Colombiano para el Estudio de la Criptococosis, que comprende un periodo de 9 años (1997-2005), se reportó una incidencia promedio anual de 2,4 casos por millón de habitantes, pero en pacientes con SIDA la incidencia fue de 3,0 casos por cada mil habitantes. El 82,7% de los casos reportados, se presentó en hombres jóvenes, y un 2,5% se presentó en niños. El 95,7% de casos reportados fueron por neurocriptococosis, el 2,9% fueron por formas pulmonares, 0,5% fueron por lesiones a nivel cutáneo, 0,2% por formas ganglionares, 0,2% por ulceras orofaríngeas, y un 0,1% a causa de las siguientes formas clínicas: peritonitis, lesión a nivel hepático, celulitis en los miembros inferiores e infección en vías urinarias. A partir de 788 aislamientos remitidos, se estableció que la infección con C. neoformans var. grubii (serotipo A) es la más frecuente con un porcentaje del 95,9% de los casos. La enfermedad causada por C. gattii (serotipo B) presenta un menor porcentaje (3,3%); sin embargo, este mismo serotipo presenta una alta prevalencia (77%) en Norte de Santander. El porcentaje de casos por C. gattii serotipo C es de 0,5% y C. neoformans var. neoformans (serotipo D) es el más bajo (0,3%) (Lizarazo, Linares et al. 2007). “El hallazgo de C. neoformans a partir de muestras ambientales corresponden en su gran mayoría a los recuperados de excretas de paloma y suelos contaminados con dichas excretas de paloma; también se ha aislado de los detritos de árboles,

así como de vegetales y frutas”25. Durante los años 2008 y 2009, en el municipio de Cúcuta, se logró recuperar un aislamiento de C. gattii, serotipo B y tres aislamientos de C. neoformans var. grubii de serotipo A, a partir del rastreo de 4.389 muestras de árboles. Sin embargo, no existen estudios reportados en la región que permitan cotejar o bien, comparar los aislados de Cryptococcus sp. Obtenidos a partir de muestras de suelo, corteza de árboles y excretas de paloma, con aquellos obtenidos a partir de muestras clínicas (causando patología en humanos), concretamente procedentes de población altamente susceptible, como es el caso de los pacientes VIH positivos. En Colombia, el Grupo Colombiano para el Estudio de la Criptococosis ha informado que 95,9% de los aislamientos clínicos corresponden a C. neoformans var. grubii (serotipo A), 0,3% a C. neoformans var. neoformans (serotipo D), 3,3% de los casos a C. gatii (serotipo B) y 0,5% de los casos a C. gatii (serotipo C), siendo Norte de Santander, el departamento con mayor frecuencia de casos reportados de criptococosis (77%) por causa de C. gattii en pacientes inmunocompetentes. En los santanderes, la incidencia promedio anual de criptococosis por C. gattii se encuentra entre los 3,7 casos/millón de habitantes durante un periodo de 9 años (1997-2005) .

25ESCANDON, P, Op. Cit, pag 15. 26 KWON-CHUNG KJ. A new species of Filobasidiella, the sexual state of Cryptococcus neoformans B and C serotypes. Mycologia 1976;68:943-946.

26

“Estudios a nivel ecológico en nuestro país han mostrado una alta semejanza con lo reportado a nivel mundial, donde se establece que la variedad grubii está

asociada principalmente con excremento de aves” 26 C. gattii serotipo C, se encuentra asociado a almendros (Cúcuta), y el serotipo B, asociado principalmente a eucaliptos (Cúndinamarca). Pese a que en Cúcuta se ha reportado el mayor número de casos de criptococosis en pacientes inmunocompetentes a causa de C. gatii (serotipo B), hasta ahora este serotipo no ha sido recuperado a partir del ambiente, y por ende no se ha podido establecer cuál puede ser la fuente ambiental potencial a partir de la cual se infectan los pacientes en esta ciudad.

26 KWON-CHUNG KJ. A new species of Filobasidiella, the sexual state of Cryptococcus neoformans B and C serotypes. Mycologia 1976;68:943-946.

27

1.2 FORMULACIÓN DEL PROBLEMA ¿Cuáles son los serotipos de los aislados de Cryptococcus neoformans var neoformans, Cryptococcus neoformans var grubii, Cryptococcus gattii provenientes de los parques de San José de Cúcuta?

1.3 OBJETIVOS

Objetivo general. Se formula el siguiente: Determinar los aislados de Cryptococcus neoformans var neoformans, Cryptococcus neoformans var grubii, Cryptococcus gattii obtenidos de muestras ambientales provenientes de los parques de la ciudad de Cúcuta.

Objetivos específicos. Se formulan los siguientes: Identificar aislados de C. gattii, C. neoformans var neoformans y C. neoformans var grubii obtenidos de muestras ambientales mediante pruebas directas. Caracterizar genéticamente los aislados ambientales de C. gattii, C. neoformans var neoformans y C. neoformans var grubii, mediante técnicas moleculares.

28

1.4 JUSTIFICACIÓN El complejo de especies Cryptococcus neoformans-Cryptococccus gattii, incluye dos especies anamórficas, y a su vez C. neoformans incluye las variedades grubii y neoformans, presentes naturalmente en el ambiente, específicamente en suelo, polvo y excretas de paloma, entre otros, por lo que raramente causan afectación de la salud humana, salvo en grupos poblacionales altamente susceptibles como individuos infectados por el Virus de Inmunodeficiencia Humana, VIH, o bien que padecen otras inmunodeficiencias secundarias a causa de: desordenes linfoproliferativos, tratamiento inmunosupresor prolongado, enfermedades como diabetes, sarcoidosis, malignidad avanzada, Lupus Eritematoso Sistémico, transplante de órgano sólido, transplante de médula ósea o incluso linfopenia T CD4 idiopática, pudiendo afectar hasta el 6% de los individuos con afectación de la inmunidad celular, por lo que éste género es considerado patógeno accidental para humanos. Las micosis oportunistas representan un grave problema de salud pública especialmente en pacientes con VIH. Este tema reviste especial importancia, teniendo en cuenta que la prevalencia estimada de infección por el Virus de Inmunodeficiencia Humana (VIH) a nivel mundial es de 35,3 millones de casos, con una incidencia anual de 2,3 millones de nuevas infecciones y 1,6 millones de muertes por Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida, SIDA. En Colombia para el año 2012 se reportaron 8.196 casos de infección por VIH y 2.216 muertes asociadas, lo que refleja una mortalidad asociada del 27 % y en Norte de Santander, en particular, la incidencia de infección por VIH es de 22,7 casos por cada 100.000 habitantes/año (Ministerio de Salud, Boletín Epidemiológico, 2013). Así, una de las más lamentables micosis oportunistas en pacientes VIH positivas corresponde a la meningitis criptocóccica, con una incidencia cercana al 8% y mortalidad de hasta el 12% en países desarrollados, pero que por otra parte, en países en vía de desarrollo registra una incidencia cercana al 3%, con una mortalidad de hasta el 70%. En la ciudad de San José de Cúcuta se ha evidenciado una muy alta letalidad en pacientes VIH positivos con criptococosis meníngea, resaltando la necesidad de tomar medidas preventivas que posibiliten un control de éste evento en población susceptible en nuestra región. “Las dos especies de hongos patógenos causantes de Criptococosis: Cryptococcus neoformans y Cryptococcus gatti habitan naturalmente en suelo, aire y árboles, siendo mucho mayor la prevalencia ambiental de C. neoformans, especialmente C. neoformans var grubii (serotipo A), cuyo hábitat

se extiende también a excretas de ave.” 27 La determinación de este patógeno sirve

para que las entidades gubernamentales tomen acciones preventivas, con el fin de

evitar la propagación de dicha enfermedad, y que además pueda ser un causante

común de micosis en personas tanto inmunocompetentes como en

inmunocomprometidos.

27 MAK, S. Op. Cit. pag 17.

29

2. MARCO REFERENCIAL

2.1 ANTECEDENTES En el 2015, Godoy describió que la Criptococosis es una micosis sistémica oportunista causada por dos especies levaduriformes capsuladas, C. neoformans causan infecciones en individuos immunodeprimidos ptincipalmente y Criptococcus gattii lo hace tanto en immunocompetentes como en personas inmunodeprimidas. C. neoformans es comúnmente asociado a excretas de palomas mientras que la especie C. gattii es encontrado en especies arbóreas como eucaliptos, ficus y otras. C neoformans se subdivide en dos variedades distintas neoformans (VNIV) y grubii (VNI y VNII) en cambio C. gattii presenta como genotipos la VGI, VGII, VGIII y VGIV. En este estudio se emplearon muestras clínicas aisladas desde LCR y hemocultivos de pacientes provenientes de tres ciudades distintas (Concepción, Valdivia y Osomo) del sur de Chile entre el 2009 y 2011. Para poder identificar las 20 cepas de levaduras se utilizaron ensayos bioquímicos y morfológicos, del total de la muestra el 60% provenían de pacientes VIH positivo y un 40% correspondían aislamientos solo de la ciudad de Valdivia. En esta primera identificación los resultados arrojaron que el 100% de las cepas analizadas correspondía a la especie C. neoformans. Se emplearon dos pruebas moleculares, PCR Fingerprinting y RAPD, para detemlinar el polimorfismo de las cepas de C. neoformans. Los resultados indicaron que el número y tamafio de las bandas corresponden al genotipo VNIV lo que significa que es la variedad neoformans. Para el caso de la prueba PCR Fingerprinting el 95% de las cepas corresponden a este genotipo VNIV con tres grandes y diversos subgrupos distintos al ser comparadas las cepas por medio de dendrogramas mientras que el 5% corresponde a la variedad grubii. Para la prueba PCR-RAPD el 95% corresponden al mismo genotipo VNIV (var. neoformans) igual con tres subgrupos genéticos distintos mientras que el 5% no evidenció bandas. “Finalmente podemos concluir que el agente etiológico para criptococosis en el sur de Chile corresponde a la misma especie C. neoformans var. neoformans genotipo VNIV que podría estar

asociado al clima de la región.”28 En el 2014, Ferrara, G., Panizo realizo un estudio donde cuyo objetivo fue comparar la identificación de levaduras de interés clínico por los métodos automatizados Vitek YBC® y Microscan Walk Away RYID® con los métodos fenotípicos convencionales.

28 GODOY, P. (2015). Caracterizacion fenotipica y tipificacion molecular de cepas de Cryptococcus neoformans aisladas de muestras clínicas en hospitales terciarios del sur de chile. Disponible: http://dspace2.conicyt.cl/handle/10533/91353?show=full

30

Se utilizaron 193 aislamientos de levaduras provenientes de muestras clínicas y cinco cepas controles. Todas las levaduras fueron identificadas por los métodos automatizados antes nombrados y los métodos fenotípicos convencionales de asimilación de carbohidratos, visualización de la morfología microscópica con agar harina de maíz y el uso de agar cromogénico. Para evaluar las variables se utilizaron tablas de contingencia de 2×2, Chi cuadrado de Mc Nemar, el índice Kappa, y se calcularon los valores de concordancia, así como los errores mayores y menores de los métodos automatizados. Las levaduras se dividieron en dos grupos: 1) de aislamiento frecuente y 2) de aislamiento poco frecuente. Los sistemas Vitek YBC® y Microscan Walk Away RYID® fueron concordantes en un 88,4 y 85,9% respectivamente, cuando se compararon con los métodos fenotípicos convencionales. Aunque ambos sistemas automatizados se pueden utilizar para la identificación de levaduras, la presencia de errores mayores y menores indica la posibilidad de identificaciones incorrectas, por lo tanto, el operador de estos equipos debe utilizar paralelamente pruebas fenotípicas como la visualización de la morfología microscópica en agar harina de maíz y el agar cromogénico, sobre todo frente a levaduras de aislamiento poco frecuente. “Los sistemas automatizados son una herramienta valiosa, sin embargo, la experiencia y el criterio del microbiólogo

son una fortaleza importante para asegurar la calidad de los resultados.”29

En el 2012, casillas vega realizo un estudio donde se identificación de la fenotipificación y genotipificación del complejo Cryptococcus neoformans / C. gattii en aislamientos clínicos. El objetivo del estudio fue caracterizar el fenotipo y genotipo de las especies del complejo C. neoformans / C. gattii en aislamientos clínicos del noreste del México. Se incluyeron 166 aislamientos del complejo Cryptococcus neoformans / C. gattii de origen clínico. Los aislamientos se identificaron por las pruebas bioquímicas: asimilación de carbohidratos, producción de melanina, ureasa y asimilación de glicina. Se realizaron pruebas de susceptibilidad antifúngica in vitro por el método de macrodilución en tubo utilizando anfotericina B, fluconazol y voriconazol. Se llevó a cabo la genotipificación mediante PCR fingerprinting empleando el primer específico de la secuencia del microsatélite del fago M13. Contribuciones y Conclusiones: De acuerdo a las pruebas bioquímicas, 153 aislamientos se identificaron como C. neoformans y 13 como C. gattii. El 100% de los aislamientos del complejo fueron susceptibles a todos los fármacos probados.

29 FERRARA, G., PANIZO, M. M., MAZZONE, M., PEQUENEZE, M. D., & REVIAKINA, V. (2014). Estudio comparativo entre los sistemas automatizados Vitek YBC® y Microscan Walk Away RYID® con los métodos fenotípicos convencionales para la identificación de levaduras de interés clínico. Investigación Clínica,55. Disponible: http://200.74.222.178/in- dex.php/investigacion/article/view/19106

31

“Se detectaron los ocho tipos moleculares del complejo C. neoformans / C. gattii. VNI (75%), VNII (9%), VNIII (5%), VNIV (3%), VGI (4%), VGII (2%), VGIII (1%), VGIV (1%). Se confirma la presencia de C. gattii en el noreste de México y se

encontró alta diversidad clonal del complejo Cryptococcus neoformans / C. gattii”.30

En el 2012, Khell Da Silva realizo un estudio que consistía en aislamientos clínicos del complejo Cryptococcus neoformans-Cryptococcus gattii, del Estado Amazonas – Brasil tenia como objetivo caracterizar 40 aislamientos clínicos del complejo Cryptococcus neoformans de pacientes que fueron atendidos en la Fundación de Medicina Tropical de Amazonas desde 2006 hasta 2008. Métodos. Se utilizaron métodos fenotípicos (producción de enzimas y pruebas de sensibilidad a los antifúngicos) y moleculares (URA5-RFLP). Resultados. Los pacientes con VIH/SIDA fueron los más afectados de criptococosis. Se observó que 31 (75,5%) y 9 (22,5%) de los aislamientos fueron Cryptococcus neoformans y Cryptococcus gattii, respectivamente. La producción de proteasa y fosfolipasa fue alta en la mayoría de las cepas. Utilizando la prueba de difusión en disco (CLSI M44-A) se observó que el 81, 35 y 100% de los aislamientos de C. neoformans fueron sensibles al fluconazol, itraconazol y amphotericin B, respectivamente, mientras que 78, 56 y 100% de los aislamientos de C. gattii fueron sensibles a estas sustancias. El valor promedio de la concentración mínima inhibitoria (CMI) para C. neoformans y C. gattii fue de 0,26 y 0,58mg/ml, respectivamente. Todos los aislamientos (9) de C. gattii presentaron un patrón de electroforesis compatible con el genotipo VGII, y todos los aislamientos de C. neoformans presentaron el genotipo VNI. Conclusiones. “Este estudio confirma la importancia del HIV/SIDA para la epidemiología de la criptococosis, la sensibilidad de los aislamientos a la anfotericina B y la alta prevalencia de los genotipos moleculares

VNI y VGII en el norte de Brasil(AU)” 31

30 CASILLAS VEGA, N. G. (2012). Fenotipificación y genotipificación del complejo crypto- coccus neoformans. Disponible: http://cdigital.dgb.uanl.mx/te/1080224827.PDF 31 KHELL DA SILVA, B., FREIRE, A. K., DOS SANTOS BENTES, A., LIMA SAMPAIO, I. D., OLI- VEIRA SANTOS, L., SILVA DOS SANTOS, M., DE SOUZA, J. V. (2012). Caracterización de aisla- mientos clínicos del complejo Cryptococcus neoformans-Cryptococcus gattii, del Estado Amazonas-Brasil. Rev Iberoam Micol, 40-43. Disponible: http://saudepublica.bvs.br/pes- quisa/resource/pt/ibc-96550

32

En el 2011, CONTRERAS MARTINEZ realizó un estudio sobre la identificación presuntiva de Cryptococcus gattii aislado de árboles con el objetivo de: determinar la relación ecológica de Cryptococcus gattii con árboles de Terminalia catappa presentes en la zona urbana de la ciudad de Montería, Colombia, en una poblacion de 163 árboles de Terminalia catappa de los cuales se tomaron muestras de corteza, hojas, flores, fruto y suelo circundante, aplicando los procedimientos siguientes: El aislamiento se realizó utilizando el medio de agar semillas de Guizotia abyssinica, la identificación se hizo mediante pruebas morfológicas y fisiológicas y la variedad se determinó con las pruebas de L-canavanina-glicina-azul de bromotimol (CGB), D-prolina y D-triptofano. Los resultados obtenidos son: se obtuvieron 9,050 UFC/g con características de Cryptococcus spp. De ellas, 5,795 UFC/g correspondieron presuntivamente a Cryptococcus gattii. El mayor porcentaje de aislamientos se encontró en flores, seguido por corteza y fruto, con tamaños celulares y capsulares pequeños. Estos aislamientos fueron más frecuentes en el sur de la ciudad, seguido por la zona centro y en menor porcentaje por la zona norte. Como conclusión se obtuvo que los hallazgos muestran una estrecha relación entre Cryptococcus gattii y Terminalia catappa. Este estudio es el primero que se hace en la ciudad de Montería. Los resultados brindan información valiosa para la comprensión y el análisis sobre la epidemiología de la criptococosis en la ciudad de Montería, Colombia. En el 2010, TORRES RODRÍGUEZ realizó un estudio donde recolectó aislamientos colombianos de C. gattii serotipo B, patrón molecular VGII procedentes de Cúcuta, con el objetivo de comparar algunas características genotípicas y fenotípicas para poder determinar diferencias y similitudes existentes con cepas provenientes de la epidemia en Vancouver. Para tal fin, se evaluaron 13 aislamientos clínicos de este mismo serotipo provenientes de Cúcuta mediante técnicas moleculares, logrando concluir que 11 de 13 aislamientos colombianos de C. gattii, presentan un subtipo molecular propio, distinto a los subtipos VGIIa y VGIIb, descritos a partir del brote de Vancouver. Por otra parte, “basados en la evaluación de los principales factores de virulencia se escogieron los aislamientos de mayor y menor virulencia, para ser evaluados en un modelo animal, observando en general una menor virulencia en los aislamientos de Colombia, indicando que en Cúcuta no hay aislamientos de C.

gattii patrón VGII que representen un riesgo en salud pública”.32

32.TORRES RODRÍGUEZ, G. E. Estudio de características genotípicas y

fenotípicas entre aislamientos colombianos de cryptococcus gattii serotipo b–patrón vgii, procedentes de Cú- cuta y aislamientos responsables de la epidemia en Vancouver, Canadá/Study of genotypic and phenotypic characteristics among c. gattii serotype b-molecular type vgii clinical isolates from Cúcuta, colombia and isolates responsible for the outbreak in Vancouver, Canada (Doctoral dissertation, Universidad Nacional de Colombia). http://www.bdigi-tal.unal.edu.co/8740/1/186281.2010.pd.

33

En 1998, CALLEJAS CARDENAS realizó un estudio donde el objetivo del trabajo

fue investigar el habitat de especies de Cryptococcus en asociacion con ciertos

arboles y animales en la ciudad de Cucuta, Norte de Santander. Para ello, se

escogió esta ciudad porque en ella predominan los aislamientos de C. neoformans

var gatti en muestras clínicas. Se recolectaron mensualmente, durante un año, 542

muestras de suelo con restos de vegetales, corteza hojas y flores de 12 acacias

rojas (Delonix regia), 12 almendros (Terminalia catappa) y otros 23 arboles. Todas

las muestras fueron procesadas con metodologia previamente estandarizada y

sembradas en tres medios selectivos, agar Guizotia abyssinica, agar acido cafeico

y agar acido cafeico con rosa de bengala.

Durante el periodo de recoleccion de las muestras se tuvieron en cuenta las

condiciones ambientales de temperatura y precipitacion mensual. Adicionalmente,

se tomaron muestras de animales que compartian la vivienda de algunos pacientes

con cryptococosis para determinar antigeno de C. neoformans en suero asi como

colonizacion nasal. De las 542 muestras procesadas 44(8,1 por ciento) fueron

positivas y de ellas se recuperaron 86 (15,6 por ciento) aislamientos de especies de

Cryptococcus, 41 (7,5 por ciento) C. neoformans, 28 (5,1 por ciento) C. laurentii y

17 (3,1 por ciento) C. albidus. De las 12 acacias estudiadas se procesaron 230

muestras y de 10 (83,3 por ciento) arboles positivos se obtuvieron 16 (6,9 por ciento)

C. albidus, 10 (4.3 por ciento) C. laurentii y 10 C. neoformans var neoformans.

En 6 (50 por ciento) de los 12 almendros se obtuvieron 18 aislamientos, 2(4,1 por

ciento) C. neoformans var neoformans, 5 (10,4 por ciento), C. neoformans var gatti

y 11 (26,8 por ciento) C. laurentii. De los otros 23 arboles, se obtuvieron 32 (11,8

por ciento) aislamientos 24 (8,8 por ciento) C. neoformans var neoformans, 7 (2,5

por ciento) C. laurentii y 1 (0.3 por ciento) C. albidus.33

33CALLEJAS CARDENAS, A. R. Estudio del habitat de las especies de

Cryptoccoccus en dentritos de diferentes arboles de la ciudad de Cucuta, Norte de

Santander. Pontificia Universidad Javeriana. Facultad de Ciencias. Santafe de

Bogota, D.C, Santafe de Bogota, 1998 - 1998 páginas. Disponible en:

https://books.google.com.co/books/about/Estudio_del_habitat_de_las_especies_d

e_C.html?id=GR-DHAAACAAJ&redir_esc=y.

34

2.2 MARCO TEÓRICO

2.2.1 Taxonomía. La clasificación convencional de los hongos se basa en las características de la reproducción sexual y asexual. Específicamente, las levaduras se clasifican en Ascomycetes si son formadoras de ascosporas, Basidiomycetes al presentar basidiosporas y en Deuteromycetes u hongos imperfectos a los que no se conoce la reproducción sexuada. En este grupo también se incluye la fase anamorfa de la forma sexuada34. “Los estados perfectos o teleomorfos de Cryptococcus neoformans se denominan

Filobasidiella neoformans para los serotipos A y D”35, y Filobasidiella bacillispora para los serotipos B y C. Filobasidiella neoformans produce basidiosporas de forma globosa u ovalada con paredes rugosas, en cambio F. bacillispora las presenta con paredes lisas. En 1981, se estudió la relación genética de F. neoformans y F. bacillispora, comparando el porcentaje de homología inter e intraespecífica que presentaba el ADN de ambas. Se observó que había aproximadamente un 55% a 60% de homología entre los aislados de ambas especies frente a un 88 a 95% de homología entre los aislados de la misma especie. Boekhout et al en el 2001, utilizó la técnica de AFLP (siglas en inglés de Amplified Fragments Length Polymorphism), que consiste en la combinación de los métodos de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y los análisis de fragmentos de restricción, con el fin de detectar polimorfismos en el genotipo. Estas diferencias son registradas Como patrones variables en número y tamaño del número de bandas generadas. Estos autores evaluaron el polimorfismo del genotipo de aislados de C. neoformans var grubii (serotipo A), C. neoformans var neoformans (serotipo D) y C. neoformans serotipo B. En base a ello, obtuvieron un árbol secuencial en donde se distinguen dos ramas que corresponden a dos agrupaciones con genotipos diferentes de C. neoformans y C. bacillisporus (C. neoformans var gattii).

34 BARO TORRES, M. T. Epidemiología de la criptococosis en España. Caracterización de los aislados de Cryptococcus neoformans. Tesis doctoral. Disponible en: http://www.tdx.cat/bitstream/handle/10803/3864/mtbt1de2.pdf?sequence=1 35 KWON-CHUNG KJ. A new genus, filobasidiella, the perfect state of Cryptococcus neoformans. Mycologia 1975;67:1197-1200. Finalmente, de acuerdo a todas estas propuestas establecidas, se considera que

35

existen al menos dos especies patogénicas de Cryptococcus sp (Tabla 1) y cinco serotipos, el serotipo A, B, C, D y AD. Este último serotipo es considerado hasta ahora un híbrido entre los serotipos A y D.

Género especie Variedad serotipo

Cryptococcus neoformans grubii A

Cryptococcus neoformans neoformans D

Cryptococcus gattii - B

Cryptococcus gattii - C

Cryptococcus neoformans AD

Tabla 1: Cryptococcus neoformans y C. gattii. Variedades y serotipos.

2.2.2 Epidemiología de la criptococosis. “La criptococosis es adquirida fundamentalmente por inhalación de las células levaduriformes o según han sugerido varios autores por basidiosporas. La infección pulmonar primaria es frecuentemente asintomática y puede ser contenida y erradicada dentro de un granuloma. Sin embargo, dependiendo de los factores del huésped, el tamaño del inóculo y posiblemente la virulencia de la cepa; el microorganismo puede diseminarse de forma aguda o luego de un período de latencia a sitios

extrapulmonares, teniendo particular predilección por el SNC”.36 Se han descrito casos clínicos ocasionados por otras especies como Cryptococcus albidus y Cryptococcus laurentii, compatibles con criptococosis cutánea, de cornea, pulmonar, renal; en donde solo se han aislado éstas levaduras. Las infecciones que se han producidos por C. albidus han ocurrido en humanos con deficiencias en su sistema inmune, asi como también en animales. Los casos clínicos descritos de C. laurentii se han producido solo en humanos y presentaron resistencias al tratamiento con antifúngicos. Los datos disponibles demuestran que C. neoformans var. grubii es la especie más comúnmente aislada de enfermos inmunodeprimidos con criptococosis, no obstante la variedad neoformans (serotipo D) puede tener una prevalencia elevada con respecto al serotipo A, en algunas áreas geográficas, como por ejemplo en Estados Unidos (New York City). Asimismo la var. grubii, es la que se aísla más frecuentemente de muestras ambientales, ya que tiene predilección por suelos contaminados con excrementos de aves, especialmente de palomas comunes (Columba livia domestica) (Figura 1).

36 ELLIS DH, PFEIFFER TJ. Natural habitat of Cryptococcus neoformans var. gattii. J Clin Microbiol 1990;28:1642-1644

36

Figura 1: Paloma común (Columba livia).

Tomado de la Universidad Autonoma de Barcelona, Depratamento de genética y microbiología.

Inicialmente se consideró que C. gattii presentaba una distribución geográfica muy restringida, pero a lo largo de los años se ha aislado de muestras ambientales de suelo y árboles, y se ha sugerido que su nicho ecológico está estrechamente relacionado con los árboles de eucalipto (Eucalyptus camaldulensis). La criptococosis por C. gattii se ha considerado una micosis o patolología de países tropicales, debido a que la mayoría de los casos se han registrado en países con clima tropical. Los casos clínicos descritos fuera de éstas zonas se consideran casos excepcionales, y siempre se trata de establecer relaciones entre el paciente o el ambiente que lo rodea, con algún elemento “importado”, viaje o traslado de un país tropical. Cuando el número de casos de criptococosis localizados en países de clima templado aumenta en un período corto de tiempo, es necesario considerar la alerta epidemiológica. Tal fue el caso en 1999, en La isla de Vancouver, British Columbia (BC) en Canadá, donde ocurrió un brote muy importante de criptococosis específicamente por C. gattii. La mayoría de los humanos y animales infectados eran inmunocompetentes, y debido a ello, la institución gubernamental British Columbia Centre for Disease Control en junio de 2002, advirtió al público y al personal sanitario de ésta zona acerca del riesgo potencial de enfermedad al cual estaban expuestos. A partir de entonces, en BC, la criptococosis es una enfermedad de notificación obligada a las autoridades sanitarias. La patología producida por C. gattii, se asemeja en muchos casos a la producida por los hongos patógenos primarios, puesto que afecta a personas y animales inmunocompetentes. Antes de la aparición de la epidemia del síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA), la criptococosis ocurría esporádicamente tanto en hombres como en animales en todo el mundo. A principios de la década de 1980, por la aparición del virus de inmunodeficiencia humana (VIH) un incremento de la

37

adquisición de la criptococosis se produjo en éste tipo de pacientes. Hasta 1998, la criptococosis fue considerada la cuarta causa de muerte en pacientes con SIDA (36) y afortunadamente con el desarrollo y aplicación de las terapias inhibidoras de la proteasa y los tratamientos antiretrovirales de gran actividad (TARGA), se ha reducido en países desarrollados, significativamente la tasa de infección por Cryptococcus y otros microorganismos oportunistas.

2.2.3 La Criptococosis: Cuadros Clínicos 2.2.3.1 Criptococosis pulmonar. La principal vía de entrada de las levaduras y eventualmente basidiosporas ambientales de Cryptococcus neoformans y C. gattii es la vía respiratoria. La inhalación de las esporas fúngicas ocasiona una primoinfección pulmonar. “La criptococosis pulmonar suele ser asintomética o en todo

caso, ocasiona síntomas inespecíficos que dificultan el diagnóstico”37

. En la mayoría de los casos puede presentarse con tos, fiebre, dísnea, pérdida de peso y dolor pleurítico. Debido al cuadro general inespecífico que produce, es preciso realizar un diagnóstico diferencial con la tuberculosis y otras patologías infecciosas. Esta primera etapa de primoinfección puede remitir espontáneamente o progresar dependiendo de la capacidad de Resistencia del huésped. Las lesiones pulmonares se pueden presentar en cualquier zona, y las imágenes radiológicas suelen ser también inespecíficas. Se observan infiltrados localizados, no muy extensos. Suelen ser lesiones pequeñas y por ello pasar desapercibidas en la radiografía simple de tórax, la mayoría curan sin dejar granulomas. 2.2.3.2 Criptococosis meníngea. La meningitis criptocócica es la forma de presentación más frecuente, constituyendo la máxima expresión del neurotropismo del hongo. Una de las razones aducidas para explicarlo, hace referencia a una ausencia de factores inhibidores del crecimiento en el liquido cefalorraquídeo (LCR) mientras que un segundo argumento supone la existencia en el tejido nervioso de factores nutricionales selectivos, tales como asparagina, que pueden funcionar como fuente de nitrógeno y estimular el crecimiento del C. neoformans. No se ha esclarecido totalmente la razón de este tropismo tan marcado por el SNC, se cree que C. neoformans puede escapar del sistema inmunitario del huésped en el LCR, debido a la baja tasa de unión de la fracción C3· del sistema de complemento a la superficie de la cápsula.

37 MCDONNELL JM, HUTCHINS GM. Pulmonary cryptococcosis. Hum Pathol 1985;16:121-128.

38

La baja concentración de glucosa presente en las meninges también puede favorecer el tropismo por el SNC, ya que se ha demostrado que altas concentraciones de glucosa inhiben la acción de la enzima fenoloxidasa también llamada la casa de Cryptococcus sp. La acción de ésta enzima protege a las células fúngicas contra ciertas sustancias oxidantes como los rayos UV que suelen tener efecto fungicida así como también sirve de protección contra algunos antifúngicos, como la AB. En los enfermos de SIDA con meningitis criptocócica el LCR puede ser de apariencia normal sin ninguna alteración importante. El aspecto puede ser claro, con hiperproteinorráquia variable y disminución ligera de la glucosa. Si se observan células, principalmente serán linfocitos. El número de criptococos presentes en el LCR es variable. Se visualizan en el sedimento mezclado con tinta china, evidenciando la presencia de la cápsula. En ciertos casos se han descrito meningitis criptocócica purulenta, que recuerda una meningitis bacteriana, con aspecto turbio del LCR y recuento celular elevado y Predominio de neutrófilos. En estos casos los pacientes suelen tener alguna patología hepática, renal o enfermedad de Hodgkin. En cualquiera de los casos el diagnótico definitivo se obtiene con el cultivo, aislamiento e identificación del microorganismo. La apariencia macroscópica de las meninges puede ser casi normal pero habitualmente se describe un aspecto reluciente o edematoso, así como, una ocupación del espacio subaracnoideo por un material mucoide o gelatinoso que puede propagarse también por los espacios de Virchow-Robin, distendiéndolos hasta determinar una transformación pseudomicroquística de los mismos. “La evolución a meningoencefalitis es poco frecuente y en caso de ocurrir, se trata

de una infección agresiva, de curso muy rápido y fulminante”.38 Otra patología que puede afectar al SNC es el desarrollo de tumoraciones llamadas criptococoma cerebral. Son pocos los casos reportados, y al parecer suele ocurrir en sujetos inmunocompetentes, se trata de una masa granulomatosa de curso crónico que puede producir signos y síntomas de hipertensión craneal como nauseas, vómitos, cefaleas, diplopía y hemiparesias. Algunos pacientes sufren de cambios de personalidad y somnolencia, así como trastornos mentales, alucinaciones, irritabilidad, confusión, llegando a sufrir incluso ataques epilépticos. Debido a la expansión del criptococoma, se puede llegar a producir hemiparesía y hemiplejía. 38 SIVASANGEETHA K, HARISH BN, SUJATHA S, PARIJA SC, DUTTA TK. Cryptococcal meningoencephalitis diagnosed by blood culture. Indian J Med Microbiol 2007;25:282- 284.

39

2.2.3.3 Criptococosis cutánea. En 1894, se describe el primer caso de criptococosis con localización cutánea, por Busse y Buschke en un hombre con lesiones en la piel, infecciones óseas y enfermedad generalizada. La afectación cutánea se ha descrito con mayor frecuencia en enfermos de SIDA. Las lesiones se pueden presentar como vesículas o abscesos que luego se ulceran, también con aspecto maculopapular y pustulosas. Pueden presentarse junto con las lesiones, signos y síntomas como cefalea, vómitos de hasta 3 semanas de duración, e incluso diarrea. “La cara y el cuello son las zonas mas afectadas, pero también pueden aparecer en la región torácica. Si se cultivan las lesiones, se puede obtener el

aislamiento del Cryptococcus sp”, 39aunque en solo 5-15% de los pacientes se ha llegado a confirmar. Las lesiones que se distribuye en cara y cuello pueden simular otras enfermedades dermatológicas, como por ejemplo el carcinoma basocelular, paracoccidioidomicosis e histoplasmosis diseminada y molluscum contagiosum. A pesar de que la mayoría de los casos descritos de criptococosis cutánea son a causa de una diseminación hematógena criptocósica, se han visto casos en donde se describen infecciones cutáneas primarias incluso sin antecedentes de inmunosupresión.

2.2.4 Agentes Etiológicos: Cryptococcus neoformans y Cryptococcus gattii 2.2.4.1 Características generales.Cryptococcus neoformans y C. gattii por lo general presentan ambos formas de levadura esférica, ovoide y a veces de forma alargada, con gemación unipolar o multipolar (Figura 2). Crecen bien a 37ºC en los medios de cultivo habituales de micología, como el de agar Sabouraud dextrosa (SDA) y no forman pseudomicelio.

39 VASANTHI S, PADMAVATHY BK, GOPAL R, SUNDARAM RS, MANOHARAN G. Cuta- neous cryptococcosis among HIV infected patients. Indian J Med Microbiol 2002;20:165- 166.

40

Figura 2: Células levaduriformes capsulares de Cryptococcus sp. A la derecha levaduras con gemación unipolar, a la izquierda levaduras con gemación multipolar. Preparación de tinta china objetivo 100x. Tomado de la Universidad Autonoma de Barcelona, Depratamento de genética y microbio- logía Las cepas de C. neoformans y C. gattii, presentan una cápsula mucopolisacárida que le confiere aspecto macroscópico mucoide, cremoso y color blanco amarillento a las colonias crecidas en medios de cultivo SDA (Figura 3). Esta cápsula en el huésped infectado puede llegar a ser muy voluminosa con un diámetro mayor que el de la propia levadura (3,5-7 x 3,5-8 µm). En cambio en cultivo, y luego de realizar varias resiembras de la misma cepa en medio de Sabouraud, la cápsula disminuye su tamaño y puede llegar a perderse.Ciertas características morfológicas se asocian especialmente con cada una de las dos especies. Las colonias de C. gattii crecen sobre los medios convencionales generalmente más mucosas y más húmedas que las colonias de C. neoformans (Figura 3).

Figura 3: Medio de cultivo SDA.

A: C. neoformans, colonias cremosas. B: C. gattii, colonias mucoides. Tomado de la Universidad Autonoma de Barcelona, Depratamento de genética y microbio- logía.

UR- UR-

41

“Se ha descrito que el pigmento de color marrón producido por las colonias de C. gattii sobre el medio de cultivo de semillas de Guizotia abyssinica (Figura 4) es menos intenso que el de C. neoformans”40 y en cuanto a la forma que presentan las levaduras de C. gattii se describen ligeramente mas elípticas. Figura 4: Guizotia abyssinica. Colonias de Cryptococcus gattii pigmentadas

con color marrón. Tomado de la Universidad de Santander. Grupo Cryptococcus

Las cepas de C. neoformans y C. gattii, presentan una cápsula mucopolisacárida que le confiere aspecto macroscópico mucoide, cremoso y color blanco amarillento a las colonias crecidas en medios de cultivo SDA (Figura 3). Esta cápsula en el huésped infectado puede llegar a ser muy voluminosa con un diámetro mayor que el de la propia levadura (3,5-7 x 3,5-8 µm). En cambio en cultivo, y luego de realizar varias resiembras de la misma cepa en medio de Sabouraud, la cápsula disminuye su tamaño y puede llegar a perderse. La cápsula polisacárida no se tiñe con los colorantes habituales de microbiología, como el Gram o el Giemsa, por el contrario, se evidencia por contraste negativo, como un espacio claro alrededor de la célula levaduriforme. El líquido de montaje mas utilizado para este fin es la tinta china (Figura 5), que permite la visualización con contraste oscuro sobre el que destaca la célula con su cápsula. “Si se dispone de ellas, la tinción de mucicarmín permite la tinción de los mucopolisacáridos y la

de Gomori-Grocott que tiñe la pared celular también son de gran utilidad”.41

40 KWON-CHUNG KJ, BENNETT JE, THEODORE TS. Cryptococcus bacillisporus sp. nov.: Serotype B-C of Cryptococcus neoformans. Int J Syst Bacteriol 1978;28:616–620. 41 VANCE AM. The use of the mucicarmine stain for a rapid presumptive identification of Cryptococcus from culture. Am J Med Technol 1961;27:125-128.

42

Figura 5: Levaduras capsuladas de Cryptococcus gattii, Tinción de tinta china. Tomado de la Universidad Autonoma de Barcelona, Departamento de genética y microbio- logía. 2.2.4.2 Identificación y serotipado. Existen varias formas de identificar a nivel de especie C. neoformans y C. gattii. Una de ellas es a través de la capacidad de crecimiento en medio enriquecido con canavanina y glicina. El medio de cultivo CGB, llamado así por presentar en su composición Canavanine-Glycine-Bromotymol blue. Cryptococcus gattii, a diferencia de C. neoformans, es capaz de utilizar la glicina como única fuente de carbono, además siendo resistente a la canavanina, crece en éste medio de cultivo, produciendo la alcalinización del medio, lo cual se evidencia con la aparición del color azul intenso (Figura 6). Esta alcalinización resulta de la liberación de amonio durante la degradación de la glicina. Otra forma tradicional de identificar a C. neoformans y C. gattii, es a través de la asimilación de D-prolina y D-triptófano C. gattii utiliza ambos aminoácidos como fuente de nitrógeno. Mediante técnicas de biología molecular y genotipificación, también se puede reali- zar la identificación de especies de levaduras de Cryptococcus sp. Se ha comentado anteriormente el trabajo realizado por Boekhout en 2001, en donde utilizando la AFLP se identificaron las especies C. neoformans y C. bacillisporus.

Figura 6: Medio de cultivo CGB. El color azul corresponde a aislados de C. gattii, el color amarillo original del medio corresponde a cepas de C.

neoformans sembradas. Tomado de grupo de Cryptococcus universidad de Santander cucuta.

UR-

43

“Mediante técnicas de biología molecular y genotipificación, también se puede realizar la identificación de especies de levaduras de Cryptococcus sp. Se ha

comentado anteriormente el trabajo realizado por Boekhout en 2001”42, en donde utilizando la AFLP se identificaron las especies C. neoformans y C. bacillisporus. También existen otros trabajos mas recientes como el de Ito-Kuwa et al en donde logran identificar los serotipos de ambas especies mediante la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

2.2.5 Factores de patogenicidad. Entre los factores que se consideran responsables del poder patógeno de Cryptococcus sp se encuentran la cápsula, la capacidad de adherencia y las proteínas con actividad enzimática, como las proteinasas, las fosfolipasas, la fenoloxidasa y la ureasa. 2.2.5.1 Cápsula. La cápsula de C. neoformans es un polisacárido compuesto principalmente por xilosa, manosa y ácido glucurónido. Esta composición particular de la cápsula de Cryptococcus sp lo distingue de otros hongos de interés clínico, ya que no contiene almidón, glicógeno, ni sulfato de mucoitina. Por el contrario, contiene gran variación en la estructura polisacárida, produciendo diferentes reacciones antigénicas y en base a ello, las cepas de Cryptococcus neoformans y C. gattii se dividen en 4 serotipos A, D y B, C, respectivamente. Mediante gran variedad de técnicas se puede visualizar la presencia de la cápsula con aplicación de tinción de tinta china, reacciones inmunológicas (inmunofluorescencia) y microscopía electrónica. La cápsula se encuentra inmediatamente fuera de la pared celular, las uniones bioquímicas que las mantienen unidas no se conocen completamente, pero se piensa que se trata de uniones no covalentes. El tamaño puede ser variable desde <1µm a >50 µm de diámetro, dependiendo de la cepa, medioambiente y las condiciones de crecimiento. En el huésped infectado, las cepas de Cryptococcus neoformans presentan una cápsula que puede ser muy voluminosa con un diámetro varias veces mayor que el de la misma célula (Figura 5). Al realizar cultivos sucesivos de las cepas, la cápsula puede reducir su tamaño e incluso puede llegar a perderse. “Se conoce que la cápsula es un factor de patogenicidad importante para la virulencia de cepas de C. neoformans; ya que se ha demostrado que bloqueando los diversos genes que intervienen en su síntesis, se pueden

obtener in vitro aislados acapsulares avirulentos para modelos en roedores”.43

42 ITO-KUWA S, NAKAMURA K, AOKI S, VIDOTTO V. Serotype identification of Cryptococcus neoformans by multiplex PCR. Mycoses 2007;50:277-281. 43 CHANG YC, KWON-CHUNG KJ. Complementation of a capsule-deficient mutation of Cryptococcus neoformans restores its virulence. Mol Cell Biol 1994;14:4912-4919.

44

2.2.5.2 Ureasa. Es una níquel-metaloenzima cuya función es catalizar la hidrólisis de la urea a amonio y carbamato. La actividad ureasa se utiliza rutinariamente como una prueba de identificación de esta levadura mediante el medio de ureasa de Christensen (Figura 9) y de algunos otros hongos patógenos, como dermatofitos (Trichophyton mentagrophytes). Como factor de patogenicidad en el desarrollo de la criptococosis meníngea, se ha descrito que la ureasa puede contribuir al paso de estas levaduras a través de la barrera hematoencefálica. Figura 7: Medio de cultivo Urea de Christensen. Tomado de grupo de investigación de Cryptococcus, universidad de Santander cucuta. Olszewski et al, “estudiaron el posible poder patógeno de la ureasa, al comprobar in vivo que la diseminación de Cryptococcus sp (H99-ureasa+) hacia el cerebro, ocurría acompañado de secuestro masivo de levaduras por la vía de los microcapilares y que por el contrario no ocurrió en el grupo de animales inoculados

con la cepa knockout useasa (-)”.44

2.2.6 Cryptococcus neoformans y Cryptococcus gattii como agentes etiológicos de la criptococosis. Estas especies del género Cryptococcus sp son las más importantes debido a su etiología ya que son las que producen la criptococosis, estas especies a su vez tienen subtipos o serotipos, que pueden causar de una u otra manera patogenia, entre estos tenemos Cryptococcus neoformans var grubii, y Cryptococcus neoformans var neoformans, partiendo de la idea que la segunda subespecie es la principal causa de meningitis en el mundo.

44 OLSZEWSKI MA, NOVERR MC, CHEN GH, TOEWS GB, Cox GM, Perfect JR, et al. Urease expression by Cryptococcus neoformans promotes microvascular sequestration, thereby enhancing central nervous system invasion. Am J Pathol 2004;164:1761-1771.

45

Además se ha podido resaltar que Cryptococcus gattii ha sido aislado tanto en personas inmunosuprimidas como en inmunocompetentes. En esta misma línea del pensamiento Kyung J. Kwon-Chung señala que “La proporción de "aparentemente normal" frente a los pacientes inmunodeprimidos es significativamente mayor con C. gattii infección. Estos pacientes aparentemente normales podrían tener algunos defectos inmunológicos desconocidos que no son detectadas por las pruebas de rutina empleadas en los laboratorios clínicos. Recientemente, se han detectado GM-CSF-neutralizar los autoanticuerpos en el plasma de los pacientes de otro modo inmunocompetentes con infección de C. gattii, un hallazgo que sugiere que las pruebas inmunológicas expandidas pueden descubrir los riesgos desconocidos

hasta ahora en pacientes criptococosis por lo demás sanos”.45

2.2.7 Cryptococcus neoformans y Cryptococcus gatii en el ambiente. Carlos Franco-Paredes, muchos aspectos de las características epidemiológicas y clínicas de las infecciones causadas por C. gattii son relativamente menos bien definido. C. gattii es un hongo patógeno que crece preferentemente en el suelo alrededor de varios tipos de árboles. De manera similar a C. neoformans, que causa la enfermedad pulmonar y del SNC en las personas. El referido autor precisa que estas especies de Cryptococcus sp son muy frecuentemente encontradas en el ambiente, especialmente en el suelo alrededor de los árboles, esto conlleva a que muchas personas puedan adquirir la enfermedad en zonas que son concurrentes, como sitios públicos donde hay gran variedad de árboles y gran afluencia de personas, especialmente los parques donde se encuentran también las palomas otra fuente gigante de contraer el hongo y desarrollar la enfermedad. 2.2.8 Cryptococosis en pacientes inmunosuprimidos. “La criptococosis es una infección micótica de distribución mundial, su incidencia ha ido aumentando en los últimos 20 años debido a la epidemia de enfermedades y terapias

inmunosupresoras del inicio del siglo XXI”46. Esta micosis está causada por el complejo Cryptococcus neoformans y Cryptococcus gattii. C. neoformans afecta esencialmente a personas inmunocomprometidas y C. gattii a pacientes inmunocompetentes expuestos al nicho ecológico del hongo. El habitat para la variedad gattii y neoformans son la excreta de palomas y árboles de eucalipto, sin embargo para C. gattii su habitat es más amplio. La forma de transmisión es por la inhalación de esporas, que da lugar a una neumonía auto limitada resolviéndose en algunas semanas o meses aún sin tratamiento.

45 KWON-CHUNG KJ, BENNETT JE, THEODORE TS. Cryptococcus bacillisporus sp. nov.: Serotype B-C of Cryptococcus neoformans. Int J Syst Bacteriol 1978;28:616–620. 46 VANCE AM. The use of the mucicarmine stain for a rapid presumptive identification of Cryptococcus from culture. Am J Med Technol 1961;27:125-128. Subsiguientemente, puede diseminarse por vía hematógena al sistema nervioso

46

central, hueso, próstata y piel. La meningitis o las lesiones focales cerebrales constituyen su forma clínica más importante. La respuesta del organismo ante la infección depende esencialmente de la inmunidad celular. El autor referido precisa que dependiendo de la inmunidad celular es decir si es inmunosuprimido u inmunocompetente, las personas pueden desarrollar la enfermedad de una manera agresiva o de manera menos brusca, este hongo es capaz de diseminarse por todo el cuerpo por vía hematógena llegando al sistema nervioso central donde causa su principal foco infeccioso el cual es meningoencefalitis, partiendo de que las personas pueden adquirirlo en cualquier sitio donde hayan palomas, o algún nicho ecológico donde podamos encontrar el hongo debido a que se hace involuntariamente la inhalación de las esporas para empezar el ciclo biológico en el humano.

2.3 MARCO CONCEPTUAL AFECCIÓN CARACTERÍSTICA DEL SIDA: “cualquier enfermedad relacionada con el VIH incluida en la lista decriterios de diagnóstico del SIDA preparada por los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades (CDC). Estas afecciones incluyen infecciones oportunistas y varias clases de cáncer potencialmente mortales

para una persona con el VIH”47. AGENTE PATÓGENO: “cualquier microorganismo, como una bacteria o un virus,

causante de enfermedad”48. CULTIVO: “procedimiento de laboratorio utilizado para la multiplicación de este hongo causante de infecciones graves en la piel, pulmones, hueso y del eje

cerebroespinal”48

CRYPTOCOCCUS: “una levadura encapsulada que se puede aislar del ambiente y cuya manifestación clínica más grave es la afectación del sistema nervioso

central”30.

47 TELLO M, GUTIÉRREZ E, BÉJAR V, GALARZA C, RAMOS W, ORTEGA-LOAYZA AG. Cryptococcosis. Revista Médica de Risaralda. 2013;19(2):147-53. 48 LIZARAZO J, RODRÍGUEZ M, ORDÓÑEZ N, VARGAS J, CASTAÑEDA N. Meningitis por Cryptococcus en el Hospital Erasmo Meoz de Cúcuta. Acta Neurol Colomb. 1995;11:259-67.

47

CRIPTOCOCOSIS: “una micosis sistémica causada por el complejo de especies

patógenas del género Cryptococcus: C. neoformans y C. gattii”30. CRIPTOCOCOSIS: “una micosis sistémica causada por el complejo de especies

patógenas del género Cryptococcus: C. neoformans y C. gattii”30. EFICACIA: “capacidad de surtir efecto que tiene un medicamento u otra intervención médica. Se somete a prueba la eficacia de los medicamentos para asegurarse de que produzcan el efecto deseado en el tratamiento de una

enfermedad o afección”.48 ENFERMEDAD INFECCIOSA: “enfermedad causada por un microorganismo, como una bacteria, un virus o un protozoo, que no se encuentra normalmente en el cuerpo y que puede causar infección. Algunas enfermedades infecciosas, no todas, son contagiosas, lo que significa que pueden propagarse de una persona a otra. Otras enfermedades infecciosas pueden propagarse de los animales o insectos al

ser humano, pero no de una persona a otra”31. ESTADO SEROLÓGICO: “estado en el cual una persona tiene o no tiene anticuerpos detectables contra un antígeno específico, medidos con un análisis de

sangre (una prueba serológica)”31 GANGLIOS LINFÁTICOS: “órganos muy pequeños del sistema linfático. Están localizados en muchas partes del cuerpo, sobre todo en el cuello, las axilas y la ingle. Desempeñan una función importante en el sistema inmunitario. Cuando la linfa se filtra a través de los ganglios linfáticos, las sustancias extrañas son atrapadas y destruidas por los linfocitos que recubren la estructura interna de los

ganglios linfáticos”31. INFECCIÓN: “invasión y proliferación de un microorganismo infeccioso, como una bacteria o un virus, en el cuerpo. También se puede referir a la enfermedad causada

por el microorganismo infeccioso”31.

30 CASILLAS VEGA, Op. cit. pag 27 31 KHELL DA SILVA, B., Op. Cit. pag 27

48

2.4 MARCO LEGAL Real Decreto 664/1997, de 12 de mayo, sobre la protección de los trabajadores contra los riesgos relacionados con la exposición a agentes biológicos durante el trabajo. MINISTERIO DE LA PRESIDENCIA, Publicado en BOE de 24 de Mayo de 1997, Vigencia desde 31 de Marzo de 1998. MINISTERIO DE SALUD Y PROTECCIÓN SOCIAL Resolución número (04 6 7 SDE 2015 (P1 1 NOV 2015 ) Por la cual se adopta la Clasificación Única de Procedimientos en Salud — CUPS y se dictan otras disposiciones. MINISTERIO DE SALUD Y PROTECCIÓN SOCIAL RESOLUCIÓN, Mka a 5591E 2015 ( 24 DIC 2015) Por la cual se actualiza integralmente el Plan de Beneficios en Salud con cargo a la Unidad de Pago por Capitación-UPC del Sistema General de Seguridad Social en Salud —SGSSS y se dictan otras disposiciones. MINISTERIO DE SALUD Y PROTECCIÓN SOCIAL RESOLUCIÓN NÚMERO 7 DE 27 DIC. 2013 Por la cual se define, aclara y actualiza integralmente el Plan Obligatorio de Salud (POS). Manual para Obtención y envío de muestras salud pública para análisis de eventos de interés en ISBN: 978-958-13-0145-4 República de Colombia Instituto Nacional de Salud Subdirección Red Nacional de Laboratorios 2011.

2.5 MARCO CONTEXTUAL El estudio se llevara a cabo en la ciudad de cucuta, Norte de Santander, en los siguientes parques: Parque Antonia santos: Se encuentra ubicado en la calle 6 A con Avenida 7 junto al canal Bogotá.

Figura 8: Parque Antonia Santos, a la izquierda vemos su ubicación y a la derecha una imagen del parque.

49

Parque Simón Bolívar: Se encuentra ubicado en La Gran Colombia con Avenida Guaimaral.

Figura 9: Parque Simon Bolivar, a la izquierda vemos una imagen del parque

y a la de-recha su ubicación. Parque La Victoria: Se encuentra ubicado en avenida 2 con calle 13.

Figura 10: Parque Simon Bolivar, a la izquierda vemos una imagen del parque y a la derecha su ubicación.

Parque Nacional: Se encuentra ubicado entre la calle 8ª y 9ª con avenida 3ª y 4ª.

Figura 11: Parque Nacional, a la izquierda vemos una imagen del parque y a la derecha su ubicación.

50

Parque La Libertad (Arcoiris): Se encuentra ubicado en avenida 2 con calle 13.

Figura 13: Parque La Libertad (arcoíris), a la izquierda vemos una imagen del

parque y a la derecha su ubicación.

2.6 SISTEMA DE HIPÓTESIS H.T: A mayor relación ecoepidemiológica de los parques del municipio de San José de Cúcuta, existe mayor posibilidad de determinar la presencia del complejo C. neoformans/C. gattii en el ambiente. H.O: A mayor relación ecoepidemiológica de los parques del municipio de S an José de Cúcuta, NO existe mayor posibilidad de determinar la presencia del complejo C. neoformans/C. gattii en el ambiente.

51

2.7 MATRIZ OPERATIVA DE LAS VARIABLES

PRE- GUNTA

OBJE- TIVO

VARIABLE

DIMEN- SIÓN

OPERACIONALIZACION DE LAS VARIABLES

INDICA- DOR

INSTRU- MENTO

ES- CALA

FUENTE

Cuáles son los aislados de C. gattii, C. neofor- mans var neo- formans y C. neo- formans var gru- bii obte- nidos de mues- tras am- bienta- les

Identificar aislados de C. gat- tii, C. neo- formans var neo- formans y C. neofor- mans var grubii ob- tenidos de muestras ambienta- les me- diante pruebas directas

Cryptococ- cus

Varie- dad neo- for- mans Varie- dad grubii Varie- dad gati

Presencia ausencia

Técnica directas: Medios de cultivo ( agar gi- rasol) tinción de tinta china prueba de urea

Nominal

Heces de aves Suelo Corteza de árbo- les

Cuáles son las caracte- rísticas genéti- cas de los aisla- dos am- bienta- les de C. gattii, C. neo- formans var neo- formans y C. neo- formans var gru- bii

Caracteri- zar genéti- camente los aisla- dos am- bientales de C. gat- tii, C. neo- formans var neo- formans y C. neofor- mans var grubii, me- diante téc- nicas mo- lecul

Cryptococ- cus

Varie- dad neo- for- mans Varie- dad grubii Varie- dad gati

C. gat- tii C. neo- for- mans var neo- for- mans C. neo- for- mans var grubii

Técnicas mo- leculares Aisla- miento de ADN PCR Electrofo- resis en gel de agarosa Genotipi- ficacion

Nominal

aislados de C. gattii, C. neoformans var neofor- mans y C. neoformans var grubii

52

3. MARCO METODOLOGICO

3.1 TIPO DE INVESTIGACIÓN

3.1.1 Nivel de investigación El nivel de investigación es descriptivo porque propone caracterizar las variables del objeto de estudio o los componentes del fenómeno o problema observado. Se limita a realizar una descripción de los hechos, de la estructura o comportamiento de la variable medida, contada o caracterizada, se señalan los datos obtenidos y la naturaleza exacta de la población de donde fueron extraídos. Además con esta investigación se busca confirmar resultados obtenidos en otras investigaciones realizadas en la ciudad y analizar diferentes muestras a las cuales no se les ha realizado este tipo de estudio. Se considera un estudio de tipo transversal porque consiste en estudiar en un momento determinado a distintos grupos de muestras (corteza, suelo, hojas, frutos), extraídas de diferentes tipos de árboles de los diferentes parques (Simón Bolívar, La Victoria, Antonia Santos, Nacional, La Libertad).

3.1.2 Diseño de investigación Es un estudio de campo, debido a que nos permite obtener nuevos conocimientos en la realidad social, además de estudiar una situación que nos ayude a diagnosticar necesidades y problemas en el ambiente en el que habitamos, además nosotros los investigadores nos limitamos a levantar la información de manera directa en la fuente sin alterar las condiciones existentes en la realidad donde se desarrollan los hechos, en este caso tomar las muestras en los diferentes parques antes mencionados, sin alterar la naturaleza de las muestras obtenidas.

53

3.2 METODOS O PROCEDIMIENTOS

Figura 14: Metodología

FASE I DESCRIPTIVA Antes de la recolección de las muestras se realizó un respectivo croquis del sitio de muestreo, es decir de cada parque, con el croquis elaborado, se procede hacer la toma de muestra a cada individuo, tomando hojas de los árboles, frutos secos y de suelo, las cuales se tomaran con pala recolectora depositándose cada muestra en su respectiva bolsa plástica. Seguido se recolectó la muestra de corteza de árbol con pinza metálica, provenientes de los diferentes árboles ubicados en los parques Simón Bolívar, La Victoria, Antonia Santos, Nacional y la Libertad (Arcoíris), cada uno diferenciado con un código, y la naturaleza de la muestra, esto se obtuvo en bolsas ziploc donde se recolectaron las muestras por separado. Para terminar esta fase se llevan las muestras al laboratorio para su respectivo procesamiento. FASE II ANALITICA Preparación de la muestra en el laboratorio: Se agregó 5 g de muestra en un tubo falcón de 50 ml, rotulado como las bolsas ziploc, seguido de esto se agregó 25 ml de PBS al 1X, se tapó y agitó con vortex, se filtró la muestra con un embudo y gasa en un tubo de 15 ml, se agregó 200 ul de Cloranfenicol, esto con el fin de preparar la muestra para su posterior cultivo.

54

Identificación de aislados mediante técnicas directas: Se empezó realizando una siembra en agar girasol, agregando 100 ul de la solución preparada anteriormente, se colocó a incubar durante 20 días a 28°C, ya teniendo las muestras sospechosas de ser Cryptococcus sp., se procede a la degradación de la urea, en la cual se tomó una asada de la colonia y se inoculó en el caldo urea, se dejó incubar por 48 horas y se observó, si viraba a rosado o rojo se dice que es urea positivo y un posible Cryptococcus sp. presente en la muestra, ya teniendo estas pruebas se procedió a realizar la identificación de la especie de este patógeno mediante la prueba de canavanina-glicina-azul de bromotimol (CGB) la cual viró de color verde el cual es el original a color amarillo en Cryptococcus neoformans y a color azul en Cryptococcus gattii, teniendo esto ya confirmado, se procede a realizar la caracterización molecular. Caracterización molecular (determinación de la variante genética C.neoformans VN I, II, III y C.gattii VN I, II, III, IV), mediante PCR Huella digital, seguido de esto se procede a realizar la respectiva electroforesis. FASE III CONCLUSIVA Teniendo ya caracterizado se procede a realizar el respectivo análisis e interpretación de los resultados.

3.3 POBLACION Y MUESTRA 3.3.1 Población: Parques de la ciudad de San José de Cúcuta. 3.3.2 Muestra: Árboles que se encuentren en los parques Simón Bolívar, la Victoria, Antonia Santos, Nacional, La libertad (Arcoiris).

3.3.3 Técnicas de muestreo 3.3.3.1 Muestreo no probabilístico: Es de tipo intencional u opinatico, ya que es un muestreo en el que los elementos o personas que conformaran la muestra son seleccionados por el investigador con base a juicios o criterios preestablecidos.

3.4 TECNICAS DE PROCESAMIENTO Y ANALISIS DE DATOS Para la respectiva codificación de los datos se asigna un código que identificara cada muestra. Por ejemplo: si el parque se muestrea es el Simón bolívar entonces su código queda SB/ ind 1/ corteza dependiendo de la muestra que se esté tomando (si es corteza, suelo, hojas secas, frutos secos, o excretas de paloma); si es el parque la Victoria quedaría LV/ ind 1/ corteza; si es el Parque Antonia quedaría AS/ind 1/ corteza; si es el parque nacional seria PN/ ind 1/ corteza.

55

Los datos van a ser tabulados en Microsoft Office Excel en el cual se va a tener toda la información, pero para el procesamiento y análisis estadístico se utilizó el programa SPSS Stadistics Base, el cual nos va a facilitar el trabajo ya que este trabajo requirió bastante tiempo, por ello este nos ayuda a que todo sea muy fácil y organizado. El análisis de la información decimos que es un Analisis Bivariado, ya que se va a comparar las muestras recolectadas por cada parque, es decir, en cuales individuos y en que parte del individuo se logró aislar este hongo (Cryptococcus neoformans/gattii) con respecto a cada parque, es decir por parque se va a hacer un análisis de la información.

3.5 TECNICAS E INTRUMENTO DE RECOLECCIÓN DE DATOS

3.5.1 INVESTIGACION DOCUMENTAL: se realiza por medio de observación, documental, presentación resumida, resumen analítico y análisis crítico. Esto se hace mediante fichas, computadores, unidades de almacenamiento. También se realiza análisis de contenido mediante fichas de trabajo, fichas de análisis de contenido. 3.5.2 INVESTIGACION DE CAMPO: se realiza por medio de la observación utilizando un diario de campo, mapa de los parques, guía de observación, cámaras fotográficas.

56

4. ANALISIS E INTERPRETACION DE RESULTADOS

4.1 RESULTADOS

4.1.1 Objetivo 1

4.1.1.1 Presencia de Cryptococcus sp parque Simón Bolívar y la Libertad

En el muestreo realizado se obtuvieron dos aislados de C.neoformans correspondientes a los parques Simon Bolivar y La libertad (Arcoiris) obtenidos de muestras de corteza provenientes de arboles de tipo Almendro.

Figura 16: Parque Simon bolivar, 2017, Mapa, Elaborado por: Aymet Patricia

Rubio Cano, Damarys Lorena Gelves Trujillo, Gyovany Alexander Rincon Castrillon.

57

Figura 17: Parque La Libertad (Arcoiris), 2017, Mapa, Elaborado por: Aymet Patricia Rubio Cano, Damarys Lorena Gelves Trujillo, Gyovany Alexander

Rincon Castrillon.

4.1.1.2 Presencia de Cryptococcus sp parque Antonia Santos y Colon

En el muestreo realizado se obtuvieron seis aislados de C.neoformans (un aislado correspondiente al parque Antonia santos obtenido de muestra de tierra proveniente

58

de un arbol de tipo: Oiti (Mokilia tomentosa) ; y cinco aisalados correspondientes a los parques La Victoria obtenidos de muestras de tierra y corteza provenientes de arboles de tipo: Totumo (Cressentia cuejte), Mango, Chiminango, Limon Swingtea, Mamoncillo).

Figura 19: Parque Antonia Santos, 2017, Mapa, Elaborado por: Aymet Patricia Rubio Cano, Damarys Lorena Gelves Trujillo, Gyovany Alexander

Rincon Castrillon.

Figura 20: Parque La victoria , 2017, Mapa, Elaborado por: Aymet Patricia Rubio Cano, Damarys Lorena Gelves Trujillo, Gyovany Alexander Rincon

Castrillon.

59

4.1.1.3 Confirmación de la especie de Cryptococcus con CGB

4.1.1.4 Muestreo parque Nacional

Figura 20a. confirmación de la especie Cryptococcus neoformans, de las muestras ambientales mediante el medio canavanina-glicina-

azul de bromotimol (CGB).

60

En el tercer muestreo realizado no se obtuvo aislados ambientales. Por lo tanto podemos decir que de las 200 muestras analizadas no se aislo Cryptococcus sp, lo que quiere decir la ausencia de este hongo en el Parque Nacional.

4.1.2 Objetivo 2

4.1.2.1 Caracterización genética

GENOTIPOS AISLADOS

AMBIENTALES %

VNI 16 89%

VNII 2 11%

TOTAL 18 100%

Tabla-3 Genotipos de C. neoformans por PCR-Huella digital en muestras ambientales de los parques Simón Bolívar, Antonia Santos y La Victoria.

Figura 22. Resultados de la electroforesis en gel de agarosa. PCR- huella digital generada con el iniciador (GTG)5. (1) Marcador de Peso Molecular 1kb; (2-9) Patrones de Cryptococcus sp; (10) Control

Negativo; (11-28) Muestras de los aislados ambientales positivos para Cryptococcus neoformans, serotipo A: VNI, VNII.

61

4.2 DISCUSION “La criptococosis es una enfermedad de interés en salud debido a que causa

meningitis en personas tanto inmunosuprimidas como inmunocompetentes”49, se logró aislar cepas ambientales del complejo Cryptococcus neoformans, es de gran importancia debido a que este hongo ha causado infinidad de enfermedades meningocócicas no sólo a nivel mundial, nacional, sino que también a nivel local, en el municipio de San José de Cúcuta, según estudios realizados en años anteriores. El objetivo de este estudio es la determinación del complejo Cryptococcus neoformans var neoformans, Cryptococcus neoformans var grubii, y Cryptococcus gattii aisladas de muestras ambientales provenientes de los Parques de San José de Cúcuta.

“En estudios anteriores ya se había utilizado el agar Semillas de Girasol”50, el cual se empleó en este estudio, siendo efectivo a la hora de realizar el aislamiento de Cryptococcus sp., siendo un medio selectivo y diferencial para este patógeno, además de esto se sabe que es un microorganismo productor de cápsula, que se puede evidenciar en la realización de una técnica directa llamada Tinta China, en el cuál al observarlo al microscopio la cápsula se ve incolora, el resto de la composición se va a teñir de color negro, seguido de esto se procede a hacer la identificación mediante técnicas bioquímicas, en este caso se realiza mediante la síntesis de la ureasa la cual es una metaloenzima que cataliza la conversión de urea a amonio y carbamato. La detección de esta enzima se utiliza corrientemente como una prueba para la identificación de diversos microorganismos, entre ellos Cryptococcus sp.debido a que es uno de los factores que hace que este microorganismo se vuelva más patógeno. Seguido de haber realizado estas pruebas se procede a hacer la identificación de especies mediante una técnica bioquímica denominada canavanina-glicina-azul de bromotimol (CGB) la cual permite diferenciar Cryptococcus gattii de Cryptococcus neoformans, debido a que Cryptococcus gattii resistente a la L-canavanina (aminoácido natural estructuralmente similar a la L-arginina), el cual es degradado por las cepas de esta variedad, liberando amonio como compuesto final.

49 Vidotto V, Leone R, Sinicco A, Ito-kuwa S, Criseo G. Comparison of phospholipase production in Cryptococcus neoformans isolates from AIDS patients and bird droppings. Mycopathologia 1998;142:71-76. 50 Kwon-Chung KJ, Polacheck I, Bennett JE. Improved diagnostic medium for separation of Crypto- coccus neoformans var. neoformans (serotypes A and D) and Cryptococcus neoformans var. gattii (serotypes B and C). J Clin Microbiol. 1982;15:535-537.

62

El amonio en el medio eleva el pH del mismo, que pasa de 5,8 a 7 o más, virando el color del medio de amarillo verdoso a un azul de cobalto, por la presencia de azul de bromotimol. Mientras tanto, Cryptococcus neoformans no es capaz de asimilar la glicina presente en el medio, por tanto no va a virar el medio, permaneciendo del color inicial. El segundo objetivo específico hace referencia a la identificación y respectiva serotipificación de las cepas aisladas de Cryptococcus sp. para dar con exactitud el género, especie y serotipo de este patógeno, realizando las diferentes pruebas moleculares, tales como Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). En estudios anteriores se han encontrado especies del complejo Cryptococcus neoformans/Cryptococcus gattii en parques de la Ciudad de San José de Cúcuta, lo cual se pudo comprobar con nuestro estudio, iniciando con una prueba piloto realizada en el Parque Antonia Santos de la ciudad, en los cuales se logró aislar cepas de Cryptococcus sp. Seguidamente se procedió con el estudio de los parques en estudio, se obtuvo que en tres de los cuatro parques se logró el aislamiento de Cryptococcus neoformans, dando además aportes a la investigación hasta ahora de gran relevancia, ya que no se había encontrado Cryptococcus sp, en el parque La Victoria, esto conlleva a seguir haciendo investigaciones al respecto, e identificación respectiva de la especie encontrada en este parque. El presente estudio además nos permitió asociar el hongo con diferentes tipos de árboles, teniendo en cuenta que no ha sido asociado con una especie de árbol en específico, aunque en estudios anteriores se había hallado en árboles con unas características morfológicas parecidas en cuanto a la corteza se refiere, sabiendo que los individuos utilizados en el estudio fueron los árboles, además, las muestras fueron tomadas de la corteza, suelo, frutos y hojas secas, obteniendo resultados positivos para Cryptococcus sp, en la corteza de estos individuos y en el suelo de algunos de ellos. Estos resultados difieren en varias situaciones, empezando por el tipo de árbol descrito en bibliografías anteriores, “ya que se había aislado en Eucalipto y

Almendros”51, en nuestro caso además de los almendros se logró aislar de Mamoncillo, Oiti, Limón swinglea, Totumo y Chiminango.

51 Mak, S., Vélez, N., Castañeda, E., & Escandón, P. (2015). The Fungus among Us: Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii Ecological Modeling for Colombia. Journal of Fungi, 332-344. (Consulta: Disponible: http://www.mdpi.com/2309-608X/1/3/332/htm).

63

Teniendo en cuenta que estos árboles poseen características muy diferentes, además los resultados respecto a estudios anteriores difieren ya que se había logrado aislar Cryptoccocus gattii en estos parques, actualmente encontramos fue la especie Cryptococcus neoformans, correspondiente al serotipo A : VNI y VNII, esto realizado por PCR-Huella Digital.

Es por ello que se recomienda seguir haciendo estudios acerca de este microorganismo muchas veces letal para el ser humano, y siguiendo con la idea de que en La Victoria se aisló este patógeno. También hacer un seguimiento de este hongo oportunista, ya que se puede controlar tanto para personas sanas, como con su sistema inmune débil.

64

5. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

5.1 CONCLUSIONES

La Criptococosis corresponde a una micosis esporádica a nivel mundial, potencialmente peligrosa en humanos, dada la importancia de los resultados, se dice que es uno de los principales agentes oportunistas a nivel mundial (Cryptococcus neoformans) causante de una de las principales enfermedades meníngeas y que si no se trata a tiempo puede tener consecuencias graves para el ser humano (Meningitis micótica) causada por este hongo en estudio.

Con este estudio se aportó a la investigación debido a el hallazgo de la presencia de Cryptococcus neoformans en el parque La Victoria, sin antecedente alguno para este parque en la ciudad, obteniendo cinco aislados correspondientes de muestras de tierra y corteza provenientes de árboles de tipo: Totumo (Cressentia cuejte), Mango, Chiminango, Limon Swingtea, Mamoncillo).

Mediante el actual estudio se pudo evidenciar una ausencia de Cryptococcus sp en el parque Nacional, de 200 muestras analizadas no se obtuvo ningún aislamiento positivo; destacando que esto se puede deber a que este importante parque de la ciudad de Cúcuta se encontraba en un 80 % sellado debido a adecuación y mantenimiento, por lo tanto no se logró muestrear en totalidad.

Se logró evidenciar con respecto a la literatura que la gran positividad de Cryptococcus sp, se logra obtener en su gran mayoría de los nichos ecológicos ya reportados; muestras de tipos corteza y tierra en árboles de tipo Almendros y Oiti, siendo estos respetivamente los nicho donde siempre logramos aislar el hongo en cada uno de nuestros parque analizados, sin dejar a un lado los aislados identificados en otros tipos de árboles.

El aislamiento y la identificación de este hongo en muestras ambientales es una tarea ardua; en el cual debemos priorizar desde el primer momento en la recolección de la muestras que debe ser en grandes totalidades; lo cual no se pudo lograr en el parque nacional y por ese se evidencio la ausencia en este hongo; posterior a esto las pruebas de identificación directa nos permiten hacer un gran filtro y disminuir la totalidad de individuos y solo seguir el proceso con los positivos debido a que la fase final de la identificación genética debe ser muy específica y es de gran costo, por lo cual debemos garantizar la identificación fenotípica y genotípica de nuestros asilados.

65

Mediante la prueba PCR huella digital se logró identificar genotípicamente 18 aislados identificados fenotípicamente, obteniendo aislados ambientales positivos para Cryptococcus neoformans, serotipo A: VNI, VNII (16 y 2 respectivamente); ratificando que esta técnica empleada por el instituto nacional de salud utilizando 8 patrones de los serotipos que presenta Cryptococcus sp.

Mediante la identificación genotípica se logró evidenciar una prevalencia de 89% en los aislados con patrón molecular VNI y un 11 % en patrón molecular VNII comprobando una vez más que este patrón correspondiente al serotipo A continua siento el más frecuente en Colombia lo que concuerda con lo reportado en la literatura como el genotipo que causa en la mayoría de casos la criptococosis en pacientes inmunosuprimidos.

5.2 RECOMENDACIONES

Una vez concluida la tesis, se considera interesante discutir un poco más acerca de los siguientes aspectos:

Extender los estudios relacionados con Cryptococcus sp., teniendo en cuenta las diferentes épocas del año, así mismo tomar en cuenta zonas pertenecientes a la ciudad de San José de Cúcuta, pero que sean externas al centro de la ciudad.

Trabajar en el hallazgo de Cryptococcus sp. en el Parque Nacional, puesto que en nuestro estudio no se logró aislar este patógeno, se requiere hacer la confirmación de estos datos.

Se solicita a las entidades departamentales, tomar en cuenta estos resultados obtenidos, para realizar la respectiva prevención en cuanto a la propagación de la Criptococosis.

PROCEDIMIENTO OPERATIVO ESTANDAR (POE)

RECOLECCION DE MUESTRAS AMBIENTALES

Programa de Bacteriología y Laboratorio Clínico.

Semillero de Investigación Dolly

Fecha de revisión: junio del 2017

Código: POERMA-01 Versión: 02

RECOLECCION DE MUESTRAS AMBIENTALES

1. OBJETIVO

Implementar las medidas pertinentes para la recolección de muestra de suelos,

cortezas de árboles y heces de palomas que serán sometidas a distintos análisis con

el fin de identificar presencia de Cryptococcus spp.

2. INTRODUCCION

El diseño del muestreo consiste en proponer y aplicar en cada sitio el procedimiento

más adecuado para obtener información apropiada sobre la presencia de

microorganismos ambientales concurridos. La importancia del muestreo radica en

que la información de los resultados obtenidos ha de ser significativa y fiable, de

manera que la toma de decisiones sobre el sitio potencialmente contaminado sea

adecuada a su particular problemática. En concreto, la problemática de cada sitio

queda referida a los riesgos que existan para la salud humana y la protección de los

ecosistemas.

3. SEGURIDAD

Precauciones generales: Para la toma de muestra se usará en todo

momento las medidas de bioseguridad necesarias, tales como uso de bata,

guantes, tapabocas, lentes de protección y gorro. Se deberá evitar el contacto

directo con la piel y prestar atención adecuada a la higiene. Al terminar el

procedimiento, quítese los guantes y lávese bien las manos.

4. DEFINICIONESExcretas: Todo material de desecho que se elimina del organismo, como heces.

Cortezas de árboles: Es la capa más externa de tallos y de raíces de plantas

leñosas, como los árboles.

Suelo: Es la parte superficial de la corteza terrestre, biológicamente activa, que

proviene de la desintegración o alteración física y química de las rocas y de los

residuos de las actividades de seres vivos que se asientan sobre ella

Parque: Es un terreno de larga extensión natural y protegido por el estado el

cual es situado en el interior de una población, que se destina a prados, jardines

PROCEDIMIENTO OPERATIVO ESTANDAR (POE)

RECOLECCION DE MUESTRAS AMBIENTALES

Programa de Bacteriología y Laboratorio Clínico.

Semillero de Investigación Dolly

Fecha de revisión: junio del 2017

Código: POERMA-01 Versión: 02

y arbolado sirviendo como lugar de esparcimiento y recreación de los

ciudadanos.

Palomas: Ave domestica que provino de la paloma silvestre, de la que hay

muchas variedades que se diferencian principalmente por el tamaño y color.

5. MATERIALES Y EQUIPOS

Bolsas plásticas de cierre hermético (capacidad de 6x6)

Pinzas

Balanza

Espátula

Papel kraff

Cava (para transporte de muestras)

6. REACTIVOS

Alcohol antiséptico al 70%.

7. RESPONSABLES

Aymet Patricia Rubio Cano Damarys Lorena Gelves Trujillo Gyovany Alexander Rincón

Castrillon Dra. Denny Cárdenas

Dra. Karina Angarita

8. DURACION

4 horas

9. PROCEDIMIENTO

Inicialmente se debe usar las Normas de Bioseguridad necesarias para la

toma de muestra con la finalidad de evitar cualquier tipo de accidente, o

alguna contaminación que pueda afectar los resultados de este estudio.

Se llevara a cabo los siguientes pasos:

Área de muestreo

Toma de muestra

Envasado e identificación de la muestra

Transporte

PROCEDIMIENTO OPERATIVO ESTANDAR (POE)

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Semillero de Investigación Dolly

Fecha de revisión: junio del 2017

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9.1 AREA DE MUESTREO: Se realizara un croquis del área de muestreo

asignando una respetiva identificación para cada árbol, siendo estos

considerados como individuos. Por lo tanto, se debe muestrear la totalidad

de individuos.

9.2 TOMA DE MUESTRA: Con el croquis elaborado, se procede hacer la toma

de muestra a cada individuo, tomando hojas de los árboles, frutos secos y

de suelo, las cuales se tomaran con pala recolectora depositándose cada

muestra en su respectiva bolsa plástica. Seguido se recolectara la toma de

muestra de corteza de árbol con pinza metálica y se depositara en bolsa

plástica. Por último se procede a la toma de muestra de heces de palomas

con la pala recolectora depositándose en una bolsa plástica. Es importante

tener en cuenta que la cantidad establecida para cada muestra es de 5gr.

9.3 ROTULACION E IDENTIFICACIÓN DE LA MUESTRA: las muestras se

envasan en una bolsa de plástico resistente con cierre hermético, se rotulan

con lápiz de tinta no borrable; se debe rotular teniendo en cuenta las

iniciales del parque, el numero de individuo del parque, y el tipo de muestra.

Por lo tanto quedaría así, ejemplo: SB/ individuo 1 / corteza.

Se recomienda no introducir en la bolsa materiales externos a la muestra.

9.4 TRANSPORTE: Se debe evitar que las muestras recolectadas sean

expuestas directamente al sol o a otra fuente de calor durante su transporte,

el que debe ser en el menor tiempo posible. Además, se debe reducir el

riesgo de eventuales contaminaciones externas durante el recorrido al

laboratorio.

10. REFERENCIAS:

http://www.sag.cl/sites/default/files/Protocolo%20toma%20muestras%20suel o.pdf

http://www.juntadeandalucia.es/medioambiente/web/Bloques_Tematicos/Esta do_Y_Calidad_De_Los_Recursos_Naturales/Suelo/Contaminacion_pdf/Toma. pdf

SOLUCION BUFFER DE FOSFATO

1. OBJETIVO: Establecer los lineamientos para la realización, la constitución,

y el funcionamiento de soluciones amortiguadoras de pH, para las prácticas

de laboratorio.

2. FUNDAMENTO: La Solución Salina Amortiguada por Fosfatos (PBS)

constituye una solución amortiguadora de pH comúnmente empleada para

procedimientos bioquímicos. Su osmolaridad y concentración de iones (Cl- ,

Na+ y K+ ). Esta solución se prepara a partir de Cloruro de Sodio, Fosfato de

Sodio.

3. SEGURIDAD:

Se usará en todo momento las medidas de bioseguridad necesarias, tales

como uso de bata, guantes, tapabocas, lentes de protección y gorro.

Se deberá evitar el contacto directo con la piel y prestar atención adecuada

a la higiene. Los buffers son sustancias irritantes que contienen clorhidrato

de guanidina. Este reactivo es nocivo al entrar en contacto con la piel, ser

inhalado o ingerido. Al terminar el procedimiento, quítese los guantes y

lávese bien las manos.

4. DEFINICIONES

PH: Es una medida de acidez o alcalinidad de una disolución. El pH indica la

concentración de iones hidrógeno [H]+ presentes en determinadas disoluciones.

SOLUCION SALINA: Es una disolución acuosa de sustancias compatibles con los

organismos vivos debido a sus características definidas de osmoticidad, pH y fuerza

iónica. Está compuesto de agua y electrolitos.

CLORURO DE SODIO: Comúnmente conocido como sal de mesa, o en su forma

mineral halita, es un compuesto químico con la fórmula NaCl. El cloruro de sodio es

una de las sales responsable de la salinidad del océano y del fluido extracelular de

muchos organismos.

FOSFATO DE SODIO: Es una forma genérica de definir las tres diferentes sales del

sodio y del ácido fosfórico.

PROCEDIMIENTO OPERATIVO ESTANDAR

(POE)

PREPARACION DE PBS

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5. MATERIALES Y EQUIPOS

Probetas de 50mL, 100mL y 1000mL Vaso precipitado 1000mL

Agitador

Balanza

Papel Kraff

Espátula

Papel aluminio

6. REACTIVOS

NaCl ............................................................. 8.5 gr

Na2HPO4 ........................................................ 1.4 gr

Agua Destilada ............................................... 1000 ml

7. RESPONSABLES

Aymet Patricia Rubio

Cano| Damarys Lorena

Gelves Trujillo Gyovany

Alexander Rincón

Castrillon Dra. Denny

Cárdenas

Dra. Karina Angarita

8. DURACION

1 Hora

PROCEDIMIE

NTO Nota:

PROCEDIMIENTO OPERATIVO ESTANDAR

(POE)

PREPARACION DE PBS

Programa de Bacteriología y Laboratorio Clínico.

Semillero de Investigación Dolly

Fecha de revisión: junio del 2017

Código: POEPBS-02

Versión: 02

Para poder obtener PBS AL 1X SE DEBE HACER PRIMERO A 10X

Para la preparación de 1000 mL de PBS a una concentración

de 10X se llevaran a cabo los siguientes pasos:

Por cada litro de pbs al 10X que preparemos nos va a alcanzar

para 10 litros de pbs al 1X.

1 litro de PBS a 10X se prepara de la siguiente manera:

1. En un vaso precipitado adicionar 500ml de agua destilada.

2. Agregar las

sales: Para 1

litro se

agrega:

NaCl----------------

--- g

Na2HPO4---------

---

3. Se completa hasta 1 litro con agua destilada y se revuelve con un agitador.

4. Se rotula como PBS 10X, con la fecha de preparación y responsable.

5. Se lleva a auto clavar por 2 horas.

6. Almacene a temperatura ambiente (uso rutinario) o bajo refrigeración entre 4 y 8 °C.

DILUCION DE PBS AL 1X

100 ml de PBS 10X

+ Concentración Final 1X

900ml de Agua Destilada

1. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

Tomado de Protocolo del Instituto Nacional de Salud, Micologia estudio de Cryptococcus spp.

PREPARACION DE MUESTRAS

1. OBJETIVOS: preparación de las muestras y siembra de muestras

ambientales con el fin de aislar Cryptococcus spp.

2. INTRODUCCION:

Las muestras ambientales a causa de su alta carga de microrganismos

deberán ser sometidas a un proceso previo que permita su purificación y así

mejorar las condiciones de crecimientos de Cryptococcus spp.

3. SEGURIDAD

Precauciones generales: Para la toma de muestra se usará en todo

momento las medidas de bioseguridad necesarias, tales como uso de bata,

guantes, tapabocas, lentes de protección y gorro. Se deberá evitar el contacto

directo con la piel y prestar atención adecuada a la higiene. Al terminar el

procedimiento, quítese los guantes y lávese bien las manos.

4. DEFINICIONES

CLORANFENICOL: Es un antibiótico bacteriostático de amplio espectro

contra bacterias grampositivas y gramnegativas, así como contra otros

microorganismos

TUBOS FALCON: Tubos de fondo cónico, en polipropileno transparente,

indicados para pruebas con centrifugación en laboratorios de inmunología,

microbiología, etc.

PBS: es una solución tampón o buffer empleada en la investigación biológica,

bioquímica y de inmunología diagnóstica. Es una solución acuosa y salina

que contiene cloruro sódico, fosfato sódico, cloruro de potasio y fosfato

de potasio puede emplearse como diluyente para métodos de desecación

de biomoleculas.

5. MATERIALES

1 Tubos falcon 50ml

1Tubos falcon 15ml

PROCEDIMIENTO OPERATIVO ESTANDAR

(POE)

PREPARACION Y SIEMBRA DE MUESTRAS AMBIENTALES

Programa de Bacteriología y Laboratorio Clínico.

Semillero de Investigación Dolly

Fecha de revisión: junio

del 2017

Código: POEPSMA-03

Versión: 02

1 Embudo pequeño

Micropipeta de 1000ul

Puntas de 200ul

Asas desechable

Gasa

Gradillas

6. REACTIVOS

Cloranfenicol 40gr x litro

PBS al 1X

7. RESPONSABLES

Aymet Patricia Rubio Cano Damarys Lorena Gelves Trujillo Gyovany Alexander

Rincón Castrillon Dra.

Denny Cárdenas

Dra. Karina Angarita

8. DURACION

1 hora y 20 minutos 9. PROCEDIMIENTO

o Pesar tubo falcón de 50 ml.

o Agregar 5 gr de la muestra

o Agregar 25ml de PBS al 1X y tapar

o Agitar por inversión

o Filtrar con un embudo y gasa en tubo de 15ml

o Agregar 200ul de Cloranfenicol

o Se deja una hora a temperatura ambiente y finalmente se

procede a la siembra en el agar girasol y se incuba durante 20

días a una temperatura no mayor de 28°C se debe seguir una

supervisión diaria del crecimiento el cual será registrado en el

Formato RCAG-05.

10. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS http://www.uca.edu.ar/uca/common/grupo11/files/micolog

ia-

PROCEDIMIENTO OPERATIVO ESTANDAR (POE)

PREPARACION AGAR SEMILLAS DE GIRASOL

Programa de Bacteriología y Laboratorio Clínico.

Semillero de Investigación Dolly

Fecha de revisión: junio del 2017

Código: POEAG-04

Versión: 02

PREPARACION DE AGAR GIRASOL

1. OBJETIVO.

Establecer los lineamientos para la preparación de agar girasol utilizado para

el aislamiento de Cryptococcus sp a partir de muestras ambientales como

corteza de árboles, suelo, y excretas de palomas.

2. FUNDAMENTO.

El medio de cultivo contiene ácido cafeico contenido en el extracto de la semilla de girasol (Guizzotia abisynica) que permite detectar la enzima fenol oxidasa desarrollada por Cryptococcus neoformans. La reacción enzimática produce melanina, la cual es absorbida por la pared celular del hongo produciendo un color marrón. El medio Guizotia abisynica es usado para el aislamiento de Cryptococcus neoformans de substratos naturales, tales como las excretas de paloma, debido a que las colonias toman un pigmento marrón característico; sin embargo, el crecimiento excesivo de otras especies de levaduras puede impedir el crecimiento de Cryptococcus neoformans.

3. SEGURIDAD.

Se usará en todo momento las medidas de bioseguridad necesarias, tales como uso de bata, guantes, tapabocas, lentes de protección y gorro. Cambie los guantes cada vez que sea necesario.

Al terminar el procedimiento, quítese los guantes y lávese bien las manos.

PROCEDIMIENTO OPERATIVO ESTANDAR (POE)

PREPARACION AGAR SEMILLAS DE GIRASOL

Programa de Bacteriología y Laboratorio Clínico.

Semillero de Investigación Dolly

Fecha de revisión: junio del 2017

Código: POEAG-04

Versión: 02

4. DEFINICIONES.

Fosfato de potasio monobásico (KH2PO4): Agente amortiguador.

Guizotia abisynica: Es el nombre botánico de esta especie perteneciente a la familia Asteraceae y es conocida de forma común como: semilla de niger, ramtil, ramtilla, semilla inga, semilla negra, niger, noog y nug

5. MATERIALES Y EQUIPOS.

Magneto Baño serológico Termómetro Probeta de 1000 ml Erlenmeyer 1000 ml Estufa Licuadora Gasas Balanza Espátulas Guantes de látex Mechero Cabina de seguridad Cajas de Petri 20 ml Papel craf Cinta tirro Cepas ATCC Cryptococcus Asas desechables Fosforos Papel absorbente Toalla de tela Ampollas de control autoclave.

6. REACTIVOS.

Agar- Agar Semillas de Girasol Creatinina Glucosa Fosfato de Potasio Monobásico ( KH2PO4) Agua Destilada Bifenil

PROCEDIMIENTO OPERATIVO ESTANDAR (POE)

PREPARACION AGAR SEMILLAS DE GIRASOL

Programa de Bacteriología y Laboratorio Clínico.

Semillero de Investigación Dolly

Fecha de revisión: junio del 2017

Código: POEAG-04

Versión: 02

Amicacina Cloranfenicol Etanol Alcohol 70% en recipiente spray

7. RESPONSABLES

Aymet Patricia Rubio Cano Damarys Lorena Gelves Gyovany Alexander Rincón Dra. Denny Cárdenas Dra. Karina Angarita

8. DURACIÓN.

1 hora.

9. PROCEDIMIENTO.

Preparación de agar girasol para 1 litro

Licuar 50g de semillas de girasol en 500 ml de agua destilada, después

de licuado colarlo en una probeta de 1000 ml con la ayuda de una gaza

y completar a 1000 ml de agua destilada, hervir y filtrar con gasa. Esto se

deposita en un matraz de 1000ml. Se le agrega los siguientes

compuestos:

KH2PO4 -------------------------------------------------------------1 g

Creatina --------------------------------------------------------------1 g

Agar ----------------------------------------------------------------- 15 g

- Se revuelve con un agitador y se pone a calentar hasta que

PROCEDIMIENTO OPERATIVO ESTANDAR (POE)

PREPARACION AGAR SEMILLAS DE GIRASOL

Programa de Bacteriología y Laboratorio Clínico.

Semillero de Investigación Dolly

Fecha de revisión: junio del 2017

Código: POEAG-04

Versión: 02

hierva; mientras hierve se debe estar revolviendo

constantemente para que no se pegue.

- Luego de haber hervido se lleva a autoclavar por 2 horas.

- Cuando salen del autoclave se deja enfriar hasta que esté al calor de leche.

- Antes de servirlas en las cajas de Petri se debe prepararlo siguiente:

Preparación del Bifenil: por cada 1 litro de agar se agrega 25 ml de

bifenil que se prepara de la siguiente manera:

Bifenil -------------------------------------------------------------1 g

Etanol -------------------------------------------------------------25ml

Preparación del Cloranfenicol: por cada 1 litro de agar se agrega 2

ml de cloranfenicol que se prepara de la siguiente manera:

[ ] De cloranfenicol= 40 g/litro

En este caso se hace una

regla de tres: 40 g----------

---------------1000 ml

x-------------------------------- 2 ml ---- aquí va lo que necesitamos preparar de

cloranfenicol para la cantidad de litros de agar que se tiene.(EN ESTE

CASO 1)

SE NECESITA 0.8.

SE PUEDE PARTIR DE LA CONCNETRACION DE LA CAPSULA

COMERCIAL LA CUAL ES DE 0.25 GRAMOS.

40 g-------------------------1000 ml

PROCEDIMIENTO OPERATIVO ESTANDAR (POE)

PREPARACION AGAR SEMILLAS DE GIRASOL

Programa de Bacteriología y Laboratorio Clínico.

Semillero de Investigación Dolly

Fecha de revisión: junio del 2017

Código: POEAG-04

Versión: 02

0,25-------------------------- X

El resultado que nos da es lo que necesitamos de cloranfenicol en

capsula, teniendo en cuenta que cada capsula trae 0.25 gramos.

Preparación del Amikacina: por cada 1 litro de agar se agrega 1 ml, en

este caso la amikacina viene en ampolla.

- Luego de preparar todo estos compuestos se le agregan al agar y se

revuelve y ahí si se procede a servir en las cajas de Petri plásticas,

las cajas deben quedar rebosadas de agar, es decir casi llenas.

CONTROL DE CALIDAD

Esterilidad:

37ºC por 24 H

Aspecto: café

claro

Para Aspecto y Crecimiento: Emplear un control positivo de Cryptococcus

sp, el cual desarrollará una pigmentación marrón y un control negativo de

Candida sp. que desarrollará de color blanco. Registrar los datos en EL

RCMC-04

10. REGISTROS RELACIONADOS. Registro control de medios de Cultivos RCMC 04.

11. REVISIÓN PERIÓDICA.

El presente documento se revisará durante la etapa de planificación de los proyectos de investigación del semillero DOLLY y del grupo de investigación BIOGEN que involucren la determinación de aislados ambientales del complejo Cryptococcus neofromans/gattii en los parques Simón bolívar,

Antonia santos, Colon y Nacional, y se harán las correspondientes modificaciones de acuerdo a los objetivos del estudio y al kit comercial a

PROCEDIMIENTO OPERATIVO ESTANDAR (POE)

PREPARACION AGAR SEMILLAS DE GIRASOL

Programa de Bacteriologíay Laboratorio

Clínico.

Semillero de Investigación Dolly

Fecha de revisión: junio del 2017

Código: POEAG-04

Versión: 02

emplear.

12. DOCUMENTOS Y REFERENCIAS.

Barcelona, u. a. (2002). epidemiologia de la Criptococosis en España.

Ministerio de Salud del Perú, I. N. (2010). Manual de procedimientos y

técnicas de laboratorio para la identificación de los principales hongos

oportunistas causantes de micosis humanas. Medicina & Laboratorio,

Volumen 16, Números 9-10, .

MALDONADO L, B; SOSA B, A y MIZRACHI, R. Aislamiento de levaduras

del género Cryptococcus de excretas de palomas. Rev. Soc. Ven. Microbiol.

[online]. 2001, vol.21, n.2 [citado 2016-07-06], pp. 29-30 . Disponible en:

<http://www.scielo.org.ve/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1315-

25562001000200008&lng=es&nrm=iso>. ISSN 1315

75

PROCEDIMIENTO OPERATIVO ESTANDAR (POE)

PREPARACION CALDO UREA

Programa de Bacteriologíay Laboratorio

Clínico.

Semillero de Investigación Dolly

Fecha de revisión: junio del 2017

Código: POEU-05 Versión: 02 PRUEBA DE

UREA

1. OBJETIVO

Determinar el género Cryptococcus sp. y sus especies que son capaces de

hidrolizar la urea, mediante la aplicación de la técnica directa utilizando como

medio de cultivo el caldo urea de los aislados obtenidos tanto de muestras

ambientales como clínicas.

2. INTRODUCCION

Al momento de hacer la identificación de diferentes géneros levaduras entre

ellas Cryptococcus sp., es de gran utilidad la prueba de ureasa a partir del

aprovechamiento del caldo urea, en la cual vamos a ver reflejada la

capacidad del microorganismo de producir la enzima ureasa, partiendo de la

teoría de que esta levadura es productora por excelencia de la ureasa.

FUNDAMENTO

La urea constituye una fuente de nutrición nitrogenada utilizada por diversos

microorganismos, los cuales producen una enzima (ureasa) que degrada a

la misma contenida en el medio. Esta enzima ureasa cataliza la hidrólisis de

la urea hasta obtener amonio y carbamato. El carbamato es hidrolizado de

manera espontánea para originar ácido carbónico y una segunda molécula

de amonio. Se basa en la capacidad de producir la enzima ureasa, la cual

desdobla la urea en dióxido de carbono y amonio, incrementando el pH del

medio y produciendo un cambio de color rojo – púrpura en el indicador rojo

de fenol. La prueba se considera positiva cuando se alcaliniza el medio lo

que produce un cambio de color original (amarillo) a rosa o rojo.

3. SEGURIDAD

Precauciones

generales

Se usará en todo momento las medidas de bioseguridad necesarias, tales como uso de bata desechable, guantes, tapabocas N95, lentes de protección

76

PROCEDIMIENTO OPERATIVO ESTANDAR (POE)

PREPARACION CALDO UREA

Programa de Bacteriología y Laboratorio Clínico.

Semillero de Investigación Dolly

Fecha de revisión: junio del 2017

Código: POEU-05 Versión: 02

y gorro.

Todas las muestras se considerarán un peligro biológico. Se deberá evitar el contacto directo con la piel y prestar atención adecuada a la higiene. Si hay contacto con la piel, limpie con Hipoclorito de sodio al 10%. Al terminar el procedimiento, quítese los guantes y lávese bien las manos. Nocivo por ingestión. Posibilidad de sensibilización por inhalación.

4. DEFINICIONES

Amonio: Es el producto primario del metabolismo de los aminoácidos y es

sintetizado en todos los órganos. El amoníaco se presenta principalmente en

su forma ionizada, NH4+. El nitrógeno generado en forma de amonio a partir

de los aminoácidos se excreta como urea.

Caldo urea: Medio utilizado para la identificación de microorganismos, en base

a la actividad ureásica.

Carbamato: Son compuestos orgánicos derivados del ácido carbámico

(NH2COOH). Los esteres de carbamato son también llamados uretanos.

Rojo fenol: El rojo de fenol es un compuesto organico usado en laboratorio

como indicador de pH, también se le conoce como Fenolsulfonftaleina,

Sulfental, Sulfonftal o PSP.

5. MATERIALES Y EQUIPOS

Incubadora

Tubos de 10 ml tapa rosca

Cabina de seguridad

Mechero

Bata, gorro, tapabocas

Botella de vidrio

Guantes de látex

Balanza

Papel Kraft

Espátulas

Agua destilada

Autoclave

77

PROCEDIMIENTO OPERATIVO ESTANDAR (POE)

PREPARACION CALDO UREA

Programa de Bacteriología y Laboratorio Clínico.

Semillero de Investigación Dolly

Fecha de revisión: junio del 2017

Código: POEU-05 Versión: 02

6. REACTIVOS

Fórmula típica en gramos por litro caldo urea deshidratado

Peptona 1.0

Glucosa 1.0

Cloruro de sodio

5.0 Fosfato

disódico 1.2

Dihidrógeno fosfato de

potasio 0,8 Rojo fenol 0,004

7. RESPONSABLES

Damarys Lorena Gelves Trujillo Aymet Patricia Rubio Cano Gyovany Alexander Rincon Castrillon Asbleide Karina Angarita

8. DURACIÓN

40 minutos

9. PROCEDIMIENTO

Añadir 0,9 g de caldo urea deshidratado a 95 ml de agua destilada.

Esterilizar en autoclave a 115 ° C durante 20 minutos.

Enfriar a 55 ° C

Mezclar bien y distribuir cantidades de 3 ml en recipientes estériles.

Seguido de esto con ayuda de un asa de platino se toma una asada de

colonias sospechosas de ser Cryptococcus sp., y se inoculan en el medio,

con el fin de determinar si es o no esta levadura.

CONTROL DE CALIDAD

Esterilidad: 37ºC por 24 H

Aspecto: Naranja

Crecimiento: Emplear un control positivo de Cryptococcus sp, el cual virara

de color naranja a color fuscia y un control negativo de candida el cual no

cambiara de color temperatura de 37°C. Registrar los datos en EL RCMC-

04.

78

PROCEDIMIENTO OPERATIVO ESTANDAR (POE)

PREPARACION CALDO UREA

Programa de Bacteriología y Laboratorio Clínico.

Semillero de Investigación Dolly

Fecha de revisión: junio del 2017

Código: POEU-05 Versión: 02

10. REGISTROS RELACIONADOS: Registro control de medios de Cultivos RCMC 04.

11. REVISIÓN PERIÓDICA

El presente documento se revisará durante la etapa de planificación de los

proyectos de investigación del grupo BIOGEN que involucren el estudio de

aislados ambientales y clínicos relacionados con Cryptococcus sp. en

parques y humanos respectivamente, y se harán las correspondientes

modificaciones de acuerdo a los objetivos del estudio y al kit comercial a

emplear.

12. DOCUMENTOS Y REFERENCIAS

Oxoid Microbiology Products. Caldo Urea de Base. Sitio

web:http://www.oxoid.com/UK/blue/prod_detail/prod_detail.asp?pr=CM0071

&org=109

Revista de la Sociedad Venezolana de Microbiología. Utilización del caldo de

urea de Stuart para el test de la ureasa, como prueba en el diagnóstico de las

levaduras. Sitio web:

http://www.scielo.org.ve/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1315-

25562002000200008

79

PROCEDIMIENTO OPERATIVO ESTANDAR

(POE)

PREPARACION DE MEDIO CANAVANINA-GLICINA-AZUL

DE BROMOTIMOL (MEDIO CGB)

Programa de Bacteriología y Laboratorio Clínico.

Semillero de Investigación Dolly

Fecha de revisión: junio

del 2017

Código: POECGB-06 Versión: 02

PREPARACION DE MEDIO CANAVANINA-GLICINA-AZUL DE

BROMOTIMOL (MEDIO CGB)

1. OBJETIVO.

Establecer los lineamientos para la preparación de Medio canavanina-glicina-azul de bromotimol (medio CGB) utilizado para el aislamiento de Cryptococcus sp a partir de muestras ambientales como corteza de árboles, suelo, y excretas de palomas.

2. FUNDAMENTO.

Esta fórmula contiene agar para la solidificación, la glicina como fuente de carbono, y fosfato de potasio, sulfato de magnesio y clorhidrato de tiamina como vitaminas y nutrientes. Sulfato de L- canavanina permite el aislamiento de Cryptococcus , ya que son los únicos levaduras se sabe que tienen una resistencia natural. (7) se añade de bromotimol azul para indicar el cambio de pH a 7,0 cuando los medios de comunicación aparece azul cobalto.

3. SEGURIDAD.

Se usará en todo momento las medidas de

80

PROCEDIMIENTO OPERATIVO ESTANDAR

(POE)

PREPARACION DE MEDIO CANAVANINA-GLICINA-AZUL

DE BROMOTIMOL (MEDIO CGB)

Programa de Bacteriología y Laboratorio Clínico.

Semillero de Investigación Dolly

Fecha de revisión: junio

del 2017

Código: POECGB-06 Versión: 02

bioseguridad necesarias, tales como uso de bata, guantes, tapabocas, lentes de protección y gorro. Cambie los guantes cada vez que sea necesario; Al terminar el procedimiento, quítese los guantes y lávese bien las manos.

Este producto es para uso de laboratorio. Es para ser utilizado sólo por personal de laboratorio debidamente formados y cualificados. Observar las indicaciones de seguridad y utilizar técnicas asépticas. Todas las muestras de laboratorio deben ser considerados infecciosos y manejados de acuerdo a "precauciones estándar".

4. DEFINICIONES.

sulfato de L-canavanina: la droga que ayuda a la tipificación de ambas variedades de cryptococcus

Azul de Bromotimol Sódico: Indicador

Fosfato de potasio monobásico (KH2PO4): Agente amortiguador.

Glicina como única fuente de carbono y nitrógeno

5. MATERIALES Y EQUIPOS.

Baño serológico Termómetro Probeta de 1000 ml Erlenmeyer 1000 ml Estufa Gasas Balanza Espátulas Guantes de látex Mechero Cabina de seguridad Cajas de Petri 20 ml Papel craf Cinta tirro Cepas ATCC Cryptococcus

81

PROCEDIMIENTO OPERATIVO ESTANDAR

(POE)

PREPARACION DE MEDIO CANAVANINA-GLICINA-AZUL

DE BROMOTIMOL (MEDIO CGB)

Programa de Bacteriología y Laboratorio Clínico.

Semillero de Investigación Dolly

Fecha de revisión: junio

del 2017

Código: POECGB-06 Versión: 02

Asas desechables Fosforos Papel absorbente Toalla de tela Termometro Ampollas de control autoclave.

6. REACTIVOS.

Alcohol 70% en recipiente spray fosfato de potasio monobásico KH2PO4 Glicina sulfato de magnesio MgSO4 tiamina-HCl sulfato de L-canavanina agua destilada Azul de bromotimol

7. RESPONSABLES

Aymet Patricia Rubio Cano Damarys Lorena Gelves Trujillo Gyovany Alexander Rincón Castrillón Asbleide Karina Angarita

8. DURACIÓN.

1 hora.

9. PROCEDIMIENTO.

Medio canavanina-glicina-azul de bromotimol (medio CGB)

9.1 Solución A:

Glicina ------------------------------------------------

82

PROCEDIMIENTO OPERATIVO ESTANDAR

(POE)

PREPARACION DE MEDIO CANAVANINA-GLICINA-AZUL

DE BROMOTIMOL (MEDIO CGB)

Programa de Bacteriología y Laboratorio Clínico.

Semillero de Investigación Dolly

Fecha de revisión: junio

del 2017

Código: POECGB-06 Versión: 02

----10 g

Fosfato de potasio monobásico KH2PO4

--------------1 g Sulfato de magnesio

MgSO4 ----------------------------1 g Tiamina-

HCl ---------------------------------------------1

mg

Sulfato de L-canavanina --------------------------------30 mg

Agua destilada--------------------------------------

-------100 ml

pH ------------------------------------------------------------5,6

Se esteriliza por filtración.

9.3 Solución B:

Azul de bromotimol -----------------------0,4gr

Agua destilada------------------------------- 100

ml.

Para 1.000 ml del medio:

solución B 20 ml; agua

destilada -----------------------------

880 ml

83

PROCEDIMIENTO OPERATIVO ESTANDAR

(POE)

PREPARACION DE MEDIO CANAVANINA-GLICINA-AZUL

DE BROMOTIMOL (MEDIO CGB)

Programa de Bacteriología y Laboratorio Clínico.

Semillero de Investigación Dolly

Fecha de revisión: junio

del 2017

Código: POECGB-06 Versión: 02

agar bacteriologico----------------------------- 20 g

solución A ----------------------------------100 ml.

Se mezcla 20 ml de la solución B en un matraz de 2 litros agregar 880 de agua destilada y 20 gr el agar bacteriológico.

Disolver al calor y esterilizar en autoclave a 121°C /5 minutos.

Dejar enfriar a baño maria a 50°C y agregar 100ml de solución A.

Se distribuye rápidamente 4 ml por tubo, dejando solidificar con taco y

bisel.

Almacenar en refrigeración.

CONTROL DE CALIDAD

Esterilidad: incubar 37 °C/24 horas

Aspecto: color amarillo , aspecto opalescente

Crecimiento: C. neoformans var. Neoformans 25-27°C no crece y cuando crece no vira de color y C. neoformans var. gattii 25-27°C al cabo de cuatro días hay crecimiento y viraje del indicador de amarillo a azul cobalto.

10. REGISTROS RELACIONADOS: Registro control de medios de Cultivos

RCMC 04.

11. REVISIÓN PERIÓDICA.

El presente documento se revisará durante la etapa de planificación de los proyectos de investigación del semillero DOLLY y del grupo de investigación BIOGEN que involucren la determinación de aislados ambientales del complejo Cryptococcus neofromans/gattii en los parques Simón bolívar, Antonia santos, Colon y Nacional, y se harán las correspondientes modificaciones de acuerdo a los objetivos del estudio y al kit comercial a emplear.

12. DOCUMENTOS Y REFERENCIAS.

84

PROCEDIMIENTO OPERATIVO ESTANDAR

(POE)

PREPARACION DE MEDIO CANAVANINA-GLICINA-AZUL

DE BROMOTIMOL (MEDIO CGB)

Programa de Bacteriología y Laboratorio Clínico.

Semillero de Investigación Dolly

Fecha de revisión: junio

del 2017

Código: POECGB-06 Versión: 02

Kwon-Chung KJ, Polacheck I, Bennett JE. Improved diagnostic

medium for separation of Cryptococcus neoformansvar neoformans

(serotypes A y D) Cryptococcus neoformans var gattii (serotypes

B y C). J. Clin. Microbiol.1982; 15(3): 535-537.

Bennett JE, Kwon-Chung KJ, Theodore TS. Biochemical differences between serotypes of Cryptococcus neoformans.Sabouraudia. 1978; 16: 167-174. [ Links ]

81

PROCEDIMIENTO OPERATIVO

ESTANDAR (POE)

CONSERVACION DE CEPAS

Programa de Bacteriología y Laboratorio Clínico.

Semillero de Investigación Dolly

Fecha de revisión: julio del 2016

Código: POECC-06

Versión: 01

CONSERVACION DE CEPAS

1-OBJETIVO:

Mantener y conservar las cepas de cryptococcus en cada una de las metodologías

agua destilada, leche descremada la viabilidad y las particularidades, es necesario

desarrollar técnicas óptimas que garanticen la conservación de características

fisiológicas y morfológicas de cada aislamiento de cryptococcus.

2. INTRODUCCION

El mantenimiento y conservación de un cepario de cryptococcus es una tarea

fundamental para el establecimiento de una colección que cumpla con los

parámetros e implementar dos métodos de conservación agua destilada Y BHI

glicerol, la finalidad de tener un protocolo de conservación de muestra la real

importancia que tiene es conservar adecuadamente las muestras para su utilización

posterior y su disminución de espacio en el laboratorio lo cual no tenga ninguna otra

contaminación las cepas guardadas para el estudio molecular o ya sea con el

propósito a procesar las muestras .

3. FUNDAMENTO:

Conservación por suspensión con agua destilada y congelación con BHI+glicerol

50%: Estos métodos muy utilizados y que dan altos porcentajes de viabilidad,

muestran altos porcentajes de viabilidad en periodos superiores a 5 años.

4. SEGURIDAD

Se usará en todo momento las medidas de bioseguridad necesarias, tales como uso de bata, guantes, tapabocas, lentes de protección y gorro.

5. DEFINICIONES

Agua destilada: El agua destilada es aquella cuya composición se basa en la

unidad de moléculas de H2O. Es aquella a la que se le han eliminado las impurezas

e iones mediante destilación.

Destilación: La destilación es un método en desuso para la producción de agua

pura a nivel industrial.

82

PROCEDIMIENTO OPERATIVO

ESTANDAR (POE)

CONSERVACION DE CEPAS

Programa de Bacteriología y Laboratorio Clínico.

Semillero de Investigación Dolly

Fecha de revisión: julio del 2016

Código: POECC-06

Versión: 01

Conidio: Un conidio es una espora asexual inmóvil formada directamente a partir

de una hifa o célula conidiógena o esporógena

Cepa: es en microbiología, una variante fenotípica de una especie o, incluso, de un

taxón inferior, usualmente propagada clonalmente, debido al interés en la

conservación de sus cualidades definitorias

BHI: es un medio de uso general adecuado para el cultivo de una amplia variedad

de tipos de organismos, incluidos las bacterias, levaduras y hongos filamentosos, a

partir de muestras clínicas.

Glicerol: compuesto higroscópico, lo que quiere decir que tiene la capacidad de

ceder o absorber la humedad presente en el medio ambiente que lo rodea. Es

fácilmente soluble en agua, y se descompone en ebullición, en la cual entra a una

temperatura de 290ºC. Es un compuesto líquido si se encuentra a temperatura

ambiente, (a unos 25ºC).

6. MATERIALES Y REACTIVOS

Autoclave

Agua destilada

Vortex

BHI

Vaso precipitado

Tubo con tapa rosca

Glicerol

Microviales

Gradillas

Tubos de ensayo

Caja de Petri

Asas desechables

Micropipetas de 1000 ul

pipetas

7. RESPONSABLES Erika Guerrero Martínez Eliana Moreno Mora Kelly Carrascal Quintero

83

PROCEDIMIENTO OPERATIVO

ESTANDAR (POE)

CONSERVACION DE CEPAS

Programa de Bacteriología y Laboratorio Clínico.

Semillero de Investigación Dolly

Fecha de revisión: julio del 2016

Código: POECC-06

Versión: 01

8. DURACION

2 Horas

9. PROCEDIMIENTOS: CONSERVACION EN AGUA DESTILADA:

Esterilizar los tubos tapa de rosca conteniendo 2 ml de agua destilada

durante 20 minutos a 121°C.

Dejar enfriar a temperatura ambiente.

Repicar dos inoculo de dos colonias diferentes de la caja de Petri a los tubos

por medio de una asada de las colonias de Cryptococcus ssp

Preparar alícuotas 1 ml.

Almacenar un vial a temperatura ambiente y uno en refrigeración

(aproximadamente a 4°C).estas muestras deben ser duplicadas para mejores

resultados como lo indica el estudio.

PROCEDIMIENTO BHI+ GLICEROL al 50%

Se debe adicionar 37 g de este caldo en 1 litro de agua destilada

mezclar muy bien y distribuir en recipientes definitivos en este caso en una

botella de 150mL con tapa rosca.

Esterilizar en la autoclave a 121 ° C durante 15 minutos y finalmente se

procede a que se enfrié a temperatura ambiente y se debe conservar a una

temperatura de 4°C.

Se realiza una siembra masiva en agar saboraud de la colonia aislada, lacual

se trabajara mitad de parte para dos tubos y la otra mitad otros dos tubos los

cuales cada uno va a tener 0.5ml de BHI y 0,5 ml de glicerol 50% en cada uno

de los tubos se inoculara una asada tomada de la caja de Petri se hará el

transpaso a los microviales dando vortex en por tres minutos donde se

conservaran dos en congelación una muestras se deja para la otra y la otra

como reserva.

10. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS http://www.gasp-lac.net/wp-

content/uploads2/SpanishFull_FINAL- VERSION-1_Mar-28-

2012.pdf

http://scielo.sld.cu/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0375-

07602013000300009

84

EXTRACCION DE ADN

Programa de Bacteriología y Laboratorio Clínico.

Semillero de Investigación Dolly

Fecha de revisión: Junio del 2017

Código: POE08-EADN

Versión: 01

EXTRACION DE ADN

1-OBJETIVO: Investigar las relaciones epidemiológicas de clínico y ambiental aísla

del Cryptococcus neoformans el complejo de especie en Colombia.

2. INTRODUCCION:

Los miembros del complejo de especies de Cryptococcus neoformans ,

Cryptococcus neoformans y Cryptococcus gattii , son la causa de la criptococosis,

una micosis sistémica de seres humanos y animales Dentro de C. neoformans , se

reconocen dos variedades y tres serotipos: C. neoformans var. Grubii (serotipo A),

C. neoformans var. Neoformans (serotipo D) y un serotipo híbrido AD. Cryptococcus

gattii comprende los serotipos B y C ; En el medio ambiente, ambas especies se

encuentran asociadas con diferentes huéspedes. La inhalación de los propágulos

infecciosos (basidiospores o blastoconidios) del medio ambiente parece ser la

fuente de la infección para animales y seres humanos.

3. FUNDAMENTO:

La criptococosis se considera una causa importante de morbilidad y mortalidad,

especialmente en pacientes con un sistema inmunitario deteriorado, que afecta

principalmente a los individuos positivos al virus de inmunodeficiencia humana (VIH)

( Casadevall y Perfect, 1998 ). La mayoría de las infecciones en huéspedes

inmunocomprometidos son causadas por C. neoformans var, mientras que C. gattii

afecta principalmente a individuos inmunocompetentes ( Kwon-Chung & Bennett,

1984a, Casadevall y Perfect, 1998 ). En Colombia, se ha reportado un aumento

significativo en el número de casos de criptococosis en pacientes infectados por el

VIH. Cryptococcus gattii es cada vez más frecuente en Colombia, siendo el serotipo

B el causante de la mayoría de las infecciones criptocócicas en individuos

inmunocompetentes.

4. SEGURIDAD

4.1 PRECAUCIONES GENERALES

Se usará en todo momento las medidas de bioseguridad necesarias,

tales como uso de bata, guantes, tapabocas, lentes de protección y gorro.

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EXTRACCION DE ADN

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Código: POE08-EADN

Versión: 01

5. DEFINICIONES

ADN:es un acido nucleico formado por nucleotidos que contiene.azucar,fosfato

base nitrogenada.bases nitrogenadas se componen por 4 elementos:adenina (a)

timina (t).

PCR

Reacción en Cadena de la Polimerasa Técnica de Biología Molecular que tiene

porobjetivo la amplificación directa de un gen (ofragmento de DNA) o indirecta

de un RNA,presente en mezclas de muy diversas fuentes. * No es necesaria

una purificación previa de la muestra íntegra original.

Locus: Un locus es el lugar específico del cromosoma donde está localizado un gen

u otra secuencia de ADN

Alelos: un alelo resulta ser cada una de las formas alternativas que presenta un

gen, que ocupa la misma posición en cada par de cromosomas homólogos, se

diferencia en su secuencia y que se puede manifestar en modificaciones concretas

de la función de ese gen.

Criptococosis: es una micosis sistémica, generalmente, oportunista. Es producida

por Cryptococcus neoformans, la mayoría de la veces, aunque también puede ser

producida por Cryptococcus gattii.

Inmunocompetentes: Cuando el cuerpo puede producir una respuesta inmunitaria normal.

Polimorfismo: hace referencia a la existencia en una población de múltiples alelos

de un gen. Es decir, un polimorfismo es una variación en la secuencia de un

lugar determinado del ADN entre los individuos de una población.

Amplificación: es aumento en el número de copias de un fragmento de ADN

particular. Una célula tumoral amplifica o copia segmentos de ADN en forma

aberrante, como resultado de las señales celulares y en ocasiones debido a daños

causados por efectos ambientales. También pueden tener su uso en medicina como

técnicas de diagnóstico, reacción en cadena de la polimerasa

Genotipo: El genotipo resulta ser el conjunto de genes característicos de cada

especie, vegetal o animal, es decir, el genotipo son los genes en formato de ADN

86

EXTRACCION DE ADN

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Versión: 01

que un animal, un vegetal o un ser humano recibe de herencia de parte de sus dos

progenitores, madre y padre, y que por tanto se encuentra conformado por las dos

dotaciones de cromosomas que contienen la información genética del ser en

cuestión.

Cebadores: Es una cadena de ácido nucleico o de una molécula relacionada que

sirve como punto de partida para la replicación del ADN. Es una secuencia corta de

ácido nucleico que contiene un grupo 3'hidroxilo libre que forma pares de bases

complementarios a una hebra molde y actúa como punto de inicio para la adición de

nucleótidos con el fin de copiar la hebra molde. Se necesita un partidor porque la

mayoría de ADN polimerasas, enzimas que catalizan la replicación del ADN

Termociclador: Un termociclador es un aparato usado en Biología Molecular que

permite realizar los ciclos de temperaturas necesarios para la amplificación de

diversas hebras de ADN en la técnica de la PCR (Reacción en cadena de la

polimerasa) o para reacciones de secuencia con el método de Sanger

6. MATERIALES Y REACTIVOS

Buffer de lisis 100 ml solución (0,5 g sodio Docedil sulfato SDS,1.,4 g

NaCl,0,73 EDTA,20 ml Tris –HCI.

2-mercaptoetanol

Fenol:cloroformo :alcohol isoamilico (v:v:v25:24:1)

Isopropanol

Etanol 70%

Agua esteril o buffer Tris EDTA (TE)

7. RESPONSABLES

Aymet patricia rubio

Damarys Lorena

gelvez

Gyovany rincón castrlloin

8. DURACION

3 HORAS

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9. PROCEDIMIENTO:

1- Tomar una asada del cultivo previamente sembrado durante 48 horas en agar

glucosado de Saboraud o agar Extracto de levadura,peptona,dextrosa (YEPD),y

transferida a un tubo de microcentrifuga de 1,5 ml y almacenarlo a -20°C durante 30

minutos por lo menos mejor durante la noche .

2- Adicionar 500ul de buffer de lisis y 5 ul de 2-

mercaptoetanol. 3-agitar vigorasamente en vortex

4- incubar a 65°C durante 1 hora (agitar en vortex al menos 1 vez durante la incubación)

5- Adicionar 500 ul fenol:cloroformo:alcohol isoamilico (v:v:v 25:24:1)y mezclar en

vortex durante 2 minutos parahast obtener una suspension homogénea.

6- Centrifugar a 14000 rpm durante 15 minutos

7- Retirar la capa acuosa superior (sobrenadante),transferir a otro tubo de 1,5 ml y

mezclar con un volumen igual de isopropanol.Precipitar el sobrenadante a -20°C

durante 30 minutos por lo menos(la precipitación del ADN durante toda la noche a -

20°C mejora el rendimiento de la exraccion )

8- centrifugar a 14.000 rpm a 4°C durante 15 minutos

9- descartar el sobrenadante y lavar el pellet con una solución acuosa de etanol

al 70% 10-centrifugar a 14.000 rpm durante 15 minutos

11-descrtar e

sobrenadante 12-secar

el pellet

13- Re-suspender el ADN en 50-100 ul agua destilada esteril o buffer TE.

14- determinar la concentración del ADN y diluir según la concentración requerida

para la PCR.

88

EXTRACCION DE ADN

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Fecha de revisión: Junio del 2017

Código: POE08-EADN

Versión: 01

10. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

Grupo de Microbiolog´ıa, Instituto Nacional de Salud, Bogota, Colombia and

´ 2 Molecular Mycology Research Laboratory, Center for Infectious Diseases

and Microbiology at Westmead Hospital, Westmead Millennium Institute, The

University of Sydney Western Clinical School, Westmead, NSW, Australia.

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PROCEDIMIENTO OPERATIVO ESTANDAR

(POE)

PCR HUELLA DIGITAL

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Fecha de revisión: junio

del 2017

Código: POEPCR-09 Versión: 01

PCR HUELLA

DIGITAL

1. OBJETIVO.

Establecer los lineamientos para la realización de PCR Huella digital para el

aislamiento de Cryptococcus sp a partir de muestras ambientales como corteza de

árboles, suelo, y excretas de palomas.

2. FUNDAMENTO.

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica de laboratorio común utilizada para hacer muchas copias (¡millones o miles de millones!) de una región particular de ADN. Esta región de ADN puede ser cualquier cosa que le interese al experimentador. Por lo general, el objetivo de la PCR es producir suficiente ADN de la región blanco para que pueda analizarse o usarse de alguna otra manera. Por ejemplo, el ADN amplificado por PCR se puede secuenciar, visualizar por electroforesis en gel o clonar en un plásmido para otros experimentos. La PCR se utiliza en muchas áreas de la biología y la medicina, como la investigación en biología molecular, el diagnóstico médico e incluso algunas ramas de la ecología. El medio de cultivo contiene ácido cafeico contenido en el extracto de la semilla de girasol (Guizzotia abisynica) que permite detectar la enzima fenol oxidasa desarrollada por Cryptococcus neoformans. La reacción enzimática produce melanina, la cual es absorbida por la pared celular del hongo produciendo un color marrón.

El medio Guizotia abisynica es usado para el aislamiento de Cryptococcus neoformans de substratos naturales, tales como las excretas de paloma, debido a que las colonias toman un pigmento marrón característico; sin embargo, el crecimiento excesivo de otras especies de levaduras puede impedir el crecimiento de Cryptococcus neoformans.

3. SEGURIDAD.

Se usará en todo momento las medidas de bioseguridad necesarias, tales como uso de bata, guantes de nitrilo, tapabocas, lentes de protección y gorro. Cambie los guantes cada vez que sea necesario.

Al terminar el procedimiento, quítese los guantes y lávese bien las manos.

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PROCEDIMIENTO OPERATIVO ESTANDAR

(POE)

PCR HUELLA DIGITAL

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Fecha de revisión: junio

del 2017

Código: POEPCR-09 Versión: 01

4. DEFINICIONES.

PCR: técnica de amplificación de ADN mediante la reacción en cadena de la polimerasa

TERMOCICLADOR: es un aparato usado en Biología Molecular que permite realizar los ciclos de temperaturas necesarios para una reacción en cadena de la polimerasa de amplificación de ADN o para reacciones de secuencia con el método de Sanger.

5. MATERIALES Y EQUIPOS.

Luz ultravioleta Tubos Eppendorf de 1.5 ml Tubos Eppendorf de 0,25 ml Micropipetas P10, P20, P200 Puntas amarillas Puntas azules Balanza Termociclador Microcentrífuga Papel absorbente Geles de agarosa Horno Erlenmeyer de 250 ml Vaso de precipitado de 500 ml Hielo Vortex

6. REACTIVOS.

Agua desionizada esteril Soluciones de ADN genómico (10 ng/µl) Buffer de PCR 10X Cloruro de Magnesio MgCl2 50 mM dNTPs 2 mM Acetato de Sodio 50 mM Primer 10 ng/µl Albumina de suero bovino 2X Taq ADN Polimerasa 5 U/µl Tris/ HCL Gel Red Buffer carga

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PROCEDIMIENTO OPERATIVO ESTANDAR

(POE)

PCR HUELLA DIGITAL

Programa de Bacteriología y Laboratorio Clínico.

Semillero de Investigación Dolly

Fecha de revisión: junio

del 2017

Código: POEPCR-09 Versión: 01

7. RESPONSABLES

Aymet Patricia Rubio Cano Damarys Lorena Gelves Trujillo Gyovany Alexander Rincón

Castrillon Dra. Denny

Cárdenas

Dra. Karina Angarita

8. DURACIÓN.

2 días

9. PROCEDIMIENTO.

Para esta técnica se utiliza cebadores de la secuencia de núcleo minisatélite-específica del fago de tipo salvaje M13 (5'GAGGGTGGCGGTTCT3 ') y de las secuencias de microsatélites-específico (GTG) y (GACA).

Las amplificaciones se realizan en un volumen final de 50 ul, que debe contener:

Agua desionizada esteril-------------------------

----------------------------------------------------- PCR buffer----------------------------------------------- Cloruro de Magnesio (MgCl2)----------------------- dNTPs-------------------------------------------------- Acetato de Sodio--------------------------------------- Primer----------------------------------------------------- Albúmina de suero bovino--------------------------- Taq ADN Polimerasa-------------------------------

Cuando hay varias muestras de ADN para amplificar con el mismo iniciador de

PCR, la forma más eficiente de realizar la PCR es preparar un “Maxter mix” de los ingredientes, que luego se pueden adicionar a cada muestra. Esto permite también que disminuyan los errores de pipeteo cuando se utilizan volúmenes muy pequeños, y se asegura de que cada reacción contiene la misma cantidad de cada componente. Siempre preparar mezcla maestra suficiente para una muestra adicional para compensar los pequeños errores

92

PROCEDIMIENTO OPERATIVO ESTANDAR

(POE)

PCR HUELLA DIGITAL

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Semillero de Investigación Dolly

Fecha de revisión: junio

del 2017

Código: POEPCR-09 Versión: 01

de pipeteo.

Centrifugar brevemente, para que todos los componentes bajen a la parte

inferior del tubo Eppendorf. Cierre los tubos y colóquelos en el termociclador.

La PCR se lleva a cabo en un Termociclador SimpliAmp ™ utilizando

las siguientes condiciones:

Primer Paso: 35 ciclos de:

- Desnaturalización: 94°C durante 20 seg - Anillamiento: 50°C durante 1 min - Extensión: 72 °C durante 20 seg -

Segundo paso: 1 ciclo de:

- Ciclo de extensión final: 72°C durante 6 min -

Tercer paso: - Mantener a 5 °C

Cuando se ha alcanzado el ciclo de enfriamiento, se finalizó la reacción de

PCR. Este ciclo puede ser utilizado para ejecutar una reacción de PCR durante la noche y almacenar los productos de PCR a 5 °C hasta que se utilice para la electroforesis. Después de la PCR, tome los productos amplificados de PCR y almacénelos a 4 °C.

Añadir a cada producto de PCR 1/5 de volumen de buffer carga, mezclar cada muestra muy bien.

Los productos de amplificación se deben separar por electroforesis en

geles de agarosa al 1,4% en tampón Tris-borato EDTA (TBE) 1X a 150 V durante 1,5 horas.

Las bandas se deben visualizar bajo luz UV.

Se debe cargar un marcador de tamaño molecular de 1 kb en tres pocillos

para permitir la normalización de los geles.

Los tipos moleculares (VNI-VNIV y VGI-VGIV) se deben asignar por

comparación con las cepas de referencia de los ocho tipos moleculares principales cargados en cada gel.

93

PROCEDIMIENTO OPERATIVO ESTANDAR

(POE)

PCR HUELLA DIGITAL

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Semillero de Investigación Dolly

Fecha de revisión: junio

del 2017

Código: POEPCR-09 Versión: 01

CONTROL DE CALIDAD

10. REGISTROS RELACIONADOS. Registro control de medios de Cultivos RCMC

04.

11. REVISIÓN PERIÓDICA.

El presente documento se revisará durante la etapa de planificación de los proyectos de investigación del semillero DOLLY y del grupo de investigación BIOGEN que involucren la determinación de aislados ambientales del complejo Cryptococcus neofromans/gattii en los parques Simón bolívar, Antonia santos, Colon y Nacional, y se harán las correspondientes modificaciones de acuerdo a los objetivos del estudio y al kit comercial a emplear.

12. DOCUMENTOS Y REFERENCIAS.

Escandón, P., Sánchez, A., Martínez, M., Meyer, W., & Castañeda, E. (2006).

Molecular epidemiology of clinical and environmental isolates of the Cryptococcus

neoformans species complex reveals a high genetic diversity and the presence of

the molecular type VGII mating type a in Colombia. FEMS yeast research, 6(4), 625-

635.

94

REGISTRO DE MUESTRAS

AMBIENTALES PARQUE SIMON

BOLIVAR

RTMA-001

Versión: 01

Vigencia: Junio 2016

Revisión: Junio 2016

FECHA:31-octubre-2016 HORA: 3:00 pm

TEMPERATURA AMBEINTE _30 c

NOMBRE DEL PARQUE: Simon Bolivar

TOTAL DE MUESTRAS RECOLECTAS: 243

IDENTIFICACION TIPO DE MUESTRA OBSERVACIONES OBSERVACIONES

DE MUESTRAS

CORTEZA

FRUTOS

HO- JAS

SUELO

POR INDIVIDUO

GENERALES

SB/ind1/corteza x

SB/ind1/frutos x

SB/ind1/hojas x

SB/ind1/tierra x

SB/ind2/corteza x

SB/ind2/frutos x

95

SB/ind2/hojas x

SB/ind2/tierra x

SB/ind3/corteza x

SB/ind3/frutos x

SB/ind3/hojas x

SB/ind3/tierra x

SB/ind4/corteza x

SB/ind4/hojas x

SB/ind4/tierra x

SB/ind5/corteza x

SB/ind5/frutos x

SB/ind5/hojas x

SB/ind5/tierra x

SB/ind6/corteza x

SB/ind6/frutos x

SB/ind6/hojas x

SB/ind6/tierra x

SB/ind7/corteza x

SB/ind7/frutos x

96

SB/ind7/hojas x

SB/ind7/tierra x

SB/ind8/corteza x

SB/ind8/frutos x

SB/ind8/hojas x

SB/ind8/tierra x

SB/ind9/corteza x

SB/ind9/frutos x

SB/ind9/hojas x

SB/ind9/tierra x

SB/ind10/corteza x

SB/ind10/frutos x

SB/ind10/hojas x

SB/ind10/tierra x

SB/ind11/corteza x

SB/ind11/frutos x

SB/ind11/hojas x

SB/ind11/tierra x

SB/ind12/corteza x

97

SB/ind12/frutos x

SB/ind12/hojas x

SB/ind12/tierra x

SB/ind13/corteza x

SB/ind13/hojas x

SB/ind13/tierra x

SB/ind14/corteza x

SB/ind14/hojas x

SB/ind14/tierra x

SB/ind15/corteza x

SB/ind15/hojas x

SB/ind15/tierra x

SB/ind16/corteza x

SB/ind16/tierra x

SB/ind17/corteza x

SB/ind17/tierra x

SB/ind18/corteza x

SB/ind18/hojas x

SB/ind18/tierra x

98

SB/ind19/corteza x

SB/ind19/hojas x

SB/ind19/tierra x

SB/ind20/corteza x

SB/ind20/tierra x

SB/ind21/corteza x

SB/ind21/tierra x

SB/ind22/corteza x

SB/ind22/hojas x

SB/ind22/tierra x

SB/ind23/corteza x

SB/ind23/hojas x

SB/ind23/tierra x

SB/ind24/corteza x

SB/ind24/tierra x

SB/ind25/corteza x

SB/ind25/hojas x

SB/ind25/tierra x

SB/ind26/corteza x

99

SB/ind26/hoja x

SB/ind26/tierra x

SB/ind27/corteza x

SB/ind27/tierra x

SB/ind28/corteza x

SB/ind28/tierra x

SB/ind29/corteza x

SB/ind29/hojas x

SB/ind29/tierra x

SB/ind30/corteza x

SB/ind30/tierra x

SB/ind31/corteza x

SB/ind31/hojas x

SB/ind31/tierra x

SB/ind32/corteza x

SB/ind32/hojas x

SB/ind32/tierra x

SB/ind33/corteza x

SB/ind33/hojas x

100

SB/ind33/tierra x

SB/ind34/corteza x

SB/ind34/hojas x

SB/ind34/tierra x

SB/ind35/corteza x

SB/ind35/hojas x

SB/ind35/tierra x

SB/ind36/corteza x

SB/ind36/tierra x

SB/ind37/corteza x

SB/ind37/hojas x

SB/ind37/tierra x

SB/ind38/corteza x

SB/ind38/hojas x

SB/ind38/tierra x

SB/ind39/corteza x

SB/ind39/hojas x

SB/ind39/tierra x

SB/ind40/corteza x

101

SB/ind40/hojas x

SB/ind40/tierra x

SB/ind41/corteza x

SB/ind41/hojas x

SB/ind41/tierra x

SB/ind42/corteza x

SB/ind42/hojas x

SB/ind42/tierra x

SB/ind43/corteza x

SB/ind43/hojas x

SB/ind43/tierra x

SB/ind44/corteza x

SB/ind44/hojas x

SB/ind44/tierra x

SB/ind45/corteza x

SB/ind45/hojas x

SB/ind45/tierra x

SB/ind46/corteza x

SB/ind46/hojas x

102

SB/ind46/tierra x

SB/ind47/corteza x

SB/ind47/hojas x

SB/ind47/tierra x

SB/ind48/corteza x

SB/ind48/hojas x

SB/ind48/tierra x

SB/ind49/corteza x

SB/ind49/hojas x

SB/ind49/tierra x

SB/ind50/corteza x

SB/ind50/hojas x

SB/ind50/tierra x

SB/ind51/corteza x

SB/ind51/hojas x

SB/ind51/tierra x

SB/ind52/corteza x

SB/ind52/hojas x

SB/ind52/tierra x

103

SB/ind53/corteza x

SB/ind53/hojas x

SB/ind53/tierra x

SB/ind54/corteza x

SB/ind54/hojas x

SB/ind54/tierra x

SB/ind55/corteza x

SB/ind55/hojas x

SB/ind55/tierra x

SB/ind56/corteza x

SB/ind56/hojas x

SB/ind56/tierra x

SB/ind57/corteza x

SB/ind57/hojas x

SB/ind57/tierra x

SB/ind58/corteza x

SB/ind58/tierra x

SB/ind59/corteza x

SB/ind59/tierra x

104

SB/ind60/corteza x

SB/ind60/hojas x

SB/ind60/tierra x

SB/ind61/corteza x

SB/ind61/hojas x

SB/ind61/tierra x

SB/ind62/corteza x

SB/ind62/hojas x

SB/ind62/tierra x

SB/ind63/corteza x

SB/ind63/hojas x

SB/ind63/tierra x

SB/ind64/corteza x

SB/ind64/hojas x

SB/ind64/tierra x

SB/ind65/corteza x

SB/ind65/hojas x

SB/ind65/tierra x

SB/ind66/corteza x

105

SB/ind66/hojas x

SB/ind66/tierra x

SB/ind67/corteza x

SB/ind67/hojas x

SB/ind67/tierra x

SB/ind68/corteza x

SB/ind68/hojas x

SB/ind68/fruto x

SB/ind68/tierra x

SB/ind69/corteza x

SB/ind69/hojas x

SB/ind69/fruto x

SB/ind69/tierra x

SB/ind70/corteza x

SB/ind70/hojas x

SB/ind70/tierra x

SB/ind71/corteza x

SB/ind71/hojas x

SB/ind71/tierra x

106

SB/ind72/corteza x

SB/ind72/hojas x

SB/ind72/tierra x

SB/ind73/corteza x

SB/ind73/hojas x

SB/ind73/tierra x

SB/ind74/corteza x

SB/ind74/hojas x

SB/ind74/tierra x

SB/ind75/corteza x

SB/ind75/hojas x

SB/ind75/tierra x

SB/ind76/corteza x

SB/ind76/hojas x

SB/ind76/fruto x

SB/ind76/tierra x

SB/ind77/corteza x

SB/ind77/hojas x

SB/ind77/tierra x

107

SB/ind78/corteza x

SB/ind78/hojas x

SB/ind78/tierra x

SB/ind79/corteza x

SB/ind79/hojas x

SB/ind79/tierra x

SB/ind80/corteza x

SB/ind80/hojas x

SB/ind80/tierra x

Observaciones: Cada uno de los registros de muestra debera llevar diagrama anexo del croquis de muestreo. Con la respectiva identificacipon de los inviduios.

108

REGISTRO DE MUESTRAS

AMBIENTALES PARQUE LA

LIBERTAD

RTMA-001

Versión: 01

Vigencia: Junio 2016

Revisión: Junio 2016

FECHA:31-octubre-2016 HORA: 3:00 pm

TEMPERATURA AMBEINTE _30 c

NOMBRE DEL PARQUE: La Libertad

TOTAL DE MUESTRAS RECOLECTAS: 243

IDENTIFICACION TIPO DE MUESTRA OBSERVACIONES OBSERVACIONES

DE MUESTRAS

CORTEZA

FRUTOS

HO- JAS

SUELO

POR INDIVIDUO

GENERALES

LI/ind1/hojas x

LI/ind1/tierra x

LI/ind2/hojas x

LI/ind2/tierra x

109

LI/ind3/hojas x

LI/ind3/tierra x

LI/ind4/corteza x

LI/ind4/hojas x

LI/ind4/tierra x

LI/ind5/hojas x

LI/ind5/tierra x

LI/ind6/hojas x

LI/ind6/tierra x

LI/ind7/hojas x

LI/ind7/tierra x

LI/ind8/hojas x

LI/ind8/tierra x

LI/ind9/hojas x

LI/ind9/tierra x

LI/ind10/corteza x

LI/ind10/frutos x

LI/ind10/hojas x

LI/ind10/tierra x

110

LI/ind11/corteza x

LI/ind11/hojas x

LI/ind11/tierra x

LI/ind12/corteza x

LI/ind12/frutos x

LI/ind12/hojas x

LI/ind12/tierra x

LI/ind13/frutos x

LI/ind13/hojas x

LI/ind13/tierra x

LI/ind14/corteza x

LI/ind14/hojas x

LI/ind14/frutos x

LI/ind14/tierra x

LI/ind15/corteza x

LI/ind15/hojas x

LI/ind15/frutos x

LI/ind15/tierra x

LI/ind16/corteza x

111

LI/ind16/hojas x

LI/ind16/frutos x

LI/ind16/tierra x

LI/ind17/corteza x

LI/ind17/hojas x

LI/ind17/frutos x

LI/ind17/tierra x

LI/ind18/corteza x

LI/ind18/hojas x

LI/ind18/frutos x

LI/ind18/tierra x

LI/ind19/corteza x

LI/ind19/hojas x

LI/ind19/frutos x

LI/ind19/tierra x

LI/ind20/corteza x

LI/ind20/hojas x

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REGISTRO MUESTRAS

AMBIENTALES PARQUE

ANTONIA SANTOS

Versión: 01

Vigencia: Junio 2016

Revisión: Junio 2016

FECHA:16-Enero-2017 HORA: 2:00 pm

TEMPERATURA AMBEINTE _32 c

NOMBRE DEL PARQUE: Antonia Santos

TOTAL DE MUESTRAS RECOLECTAS: 40

IDENTIFICACION TIPO DE MUESTRA OBSERVACIONES OBSERVACIONES

DE MUESTRAS

CORTEZA

FRUTOS

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REGISTRO DE MUESTRAS

AMBIENTALES

PARQUE COLON

RTMA-001

Versión: 01

Vigencia: Junio 2016

Revisión: Junio 2016

FECHA:16- Enero-2017 HORA: 3:00 pm

TEMPERATURA AMBEINTE _30 c

NOMBRE DEL PARQUE: COLON

TOTAL DE MUESTRAS RECOLECTAS: 204

IDENTIFICACION TIPO DE MUESTRA OBSERVACIONES OBSERVACIONES

DE MUESTRAS

CORTEZA

FRUTOS

HO- JAS

SUELO

POR INDIVIDUO

GENERALES

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EVIDENCIAS DE TRABAJO EN EL LABORATORIO

Realizando Limpieza de la incubadora

Realizando repiques de muestra clinicas

128

Conservación de Muestras clinicas en caldo BHI

129

Ejecución de las primeras 600 muestras del proyecto en el Instituto Nacional de Salud

hhhhh

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Ejecución de los dos últimos muestreo del proyecto en la Universidad de San- tander.

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Actas de susutentacion

132

133

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135

136

141

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DETERMINACION DE AISLADOS AMBIENTALES DE C. gattii, C. neoformans var neoformans Y C. neoformans var grubii PERTENECIENTES AL COMPLEJO C. neoformans EN LOS

PARQUES SIMON BOLIVAR, ANTONIA SANTOS, COLON Y NACIONAL EN EL MUNICIPIO DE SAN JOSE DE CUCUTA, NORTE DE SANTANDER, COLOMBIA, AÑO 2017.

Asbleide K . Angarita1,3, Patricia L. Escandón2 , Aymet P Rubio3, Damarys L Gelves3, Gyovany A

Rincón 3, Denny M. Cardenas 3 .

1 Maestría Investigación de Enfermedades infecciosas, Universidad de Santander, Bucaramanga.Colombia. as.angarita@mail.udes.edu.co

2 Grupo de Microbiología, Instituto Nacional de Salud, Bogotá, Colombia.pescandon@ins.gov.co 3Grupo BIOGEN, Universidad de Santander, Cúcuta, Colombia. de.cardenas@mail.udes.edu.co

RESUMEN

La criptococosis es una micosis oportunista causada por las especies neoformans y gatti del hongo Cryptococcus. Cryptococcus neoformans agrupa dos variedades y cuatro patrones moleculares: C. neoformans var. grubii (VNI,VNII), C. neoformans var. neoformans (VNIV) y un híbrido (VNIII) y Cryptococcus gatti cuatro patrones moleculares (VGI,VGII,VGII y VGIV) se encuentran en el ambiente en una gran variedad de nichos, por lo tanto, el estudio de su ecología es de gran importancia. El Grupo Colombiano para el estudio ambiental de Cryptococcus ha reportado aislamientos de C. neoformans y C. gattii en zonas periféricas de la ciudad de Cúcuta. El objetivo de este estudio fue buscar aislamientos de C. neoformans y C. gattii a partir de muestras ambientales tomadas en zonas céntricas de San José de Cúcuta. Se recolectaron 800 muestras de 5 parques: Arcoiris, Nacional, Simón Bolivar, Antonia Santos y La Victoria. Se realizó un mapeo para cada árbol de manera individual; se recogieron muestras de corteza, frutos, tierra y hojas en bolsas plásticas (10 gramos aproximadamente) y se procesaron utilizando la técnica de suspensión en de tampón fosfatado salino (PBS) suplementando con clorafenicol y amikacina. Posteriormente, las muestras se cultivaron en agar Guizotia abyssinica, se incubaron a 27 °C durante 20 días con observación diaria. Se aislaron todas las colonias cremosas, elevadas, con bordes regulares y pigmento marrón (producción de melanina) para posteriormente determinar la degradación de la urea y se caracterizaron en medio sólido CGB (canavanina-glicina-azul de bromotimol). Los aislamientos confirmados como C. neoformans/C. gattii se tipificaron por PCR huella digital con el iniciador (GTG)5. Se determinó presencia de Cryptococcus neoformans, con una prevalencia en el ambiente 3,21 % (8 muestras positivas), distribuidos de la siguiente manera: Parques Arcoiris, Simón Bolivar y Antonia Santos 12,5% en cada uno de estos (1 muestra positiva por parque), La Victoria 62,5% (5 muestras positivas) y en el parque nacional no hubo positividad. De las 8 muestras positivas se obtuvo un total de 18 aislamientos caracterizados genéticamente así: 16 aislamientos VNI y dos aislamientos VNII. El estudio de la ecología del hongo es necesario, especialmente en aquellas áreas con una alta prevalencia de criptococosis. El muestreo longitudinal de los nichos ambientales donde el hongo se ha recuperado previamente revela su persistencia en hábitats donde Cryptococcus encuentra condiciones favorables para sobrevivir. Este tipo de investigaciones representan un aporte importante para los estudios epidemiológicos de la criptocococosis. Palabras claves: Aislamiento, cryptococcus, cryptococosis, nicho ambiental, prevalencia.

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ABSTRACT Cryptococcosis is an opportunistic fungal infection caused by the neoformed and gatti species of the fungus Cryptococcus. Cryptococcus neoformans groups two varieties and four molecular patterns: C. neoformans var. grubii (VNI, VNII), C. neoformans var. neoformans (VNIV) and a hybrid (VNIII) and Cryptococcus gatti four molecular patterns (VGI, VGII, VGII and VGIV) are found in the environment in a variety of niches, therefore, the study of their ecology is of great importance . The Colombian Group for the environmental study of Cryptococcus has reported isolates of C. neoformans and C. gattii in peripheral areas of the city of Cúcuta. The objective of this study was isolations of C. neoformans and C. gattii from samples taken in central zones of San José de Cúcuta. We collected 800 samples from 5 parks: Arcoiris, Nacional, Simón Bolívar, Antonia Santos and La Victoria. Individually, a mapping was made for each tree; samples of bark, fruits, soil and leaves were collected in plastic bags (approximately 10 grams) and processed using the suspension technique in phosphate buffered saline (PBS) supplemented with chlorafenicol and amikacin. Subsequently, the samples were cultured on Guizotia abyssinica agar, incubated at 27 ° C for 20 days with daily observation. All the creamy colonies were isolated, elevated, with regular edges and brown pigment (production of melanin). Later on, the degradation of the urea was determined and characterized in solid medium CGB (canavanine-glycine-bromothymol blue). Confirmed isolates such as C. neoformans / C. gattii were typed by fingerprint PCR with the primer (GTG) 5. The presence of Cryptococcus neoformans was determined, with a prevalence in the environment of 3.21% (8 positive samples), distributed from the following way: Rainbow Parks, Simon Bolivar and Antonia Santos 12.5% in each of these (1 positive sample per park), La Victoria 62.5% (5 positive samples) and in the national park there was no positivity. Of the 8 positive samples, a total of 18 isolates were genetically characterized as follows: 16 NIV isolates and two VNII isolates. The study of the ecology of the fungus is necessary, especially in the areas with high prevalence of cryptococcosis. The longitudinal sampling of the environmental angles where the fungus has previously recovered reveals its persistence in habitats where Cryptococcus finds favorable conditions to survive. This type of research represents an important element for epidemiological studies of cryptococcosis. Key words: Isolation, cryptococcus, cryptococcosis, environmental niche, prevalence. INTRODUCCION La Criptococosis corresponde a una micosis esporádica a nivel mundial, potencialmente peligrosa en humanos, y es relevante por considerarse oportunista, debido a su asociación con pacientes infectados por el Virus de Inmunodeficiencia Humana, VIH, aunque puede afectar incluso a individuos VIH negativos, lo cual refleja la patogenicidad de sus agentes etiológicos: Cryptococcus neoformans y Cryptococcus gattii, aislados del ambiente (suelo, excretas de paloma y árboles). El primero presenta dos variedades: Cryptococcus neoformans var. grubii (comprendiendo a su vez al serotipo A, con subgrupos genéticos VNI, VNII y VNB) y Cryptococcus neoformans var. neoformans (comprendiendo al serotipo D, con subgrupo genético VNIV); éstas presentan un híbrido,

correspondiente al serotipo AD y subgrupo genético VNIII. Por su parte, Cryptococcus gattii comprende los serotipos B (subgrupos genéticos VGI y VGII) y serotipo C (subgrupos genéticos VGIII y VGIV). La enfermedad criptocócica es una de las más importantes, y un contribuyente de mortalidad temprana, especialmente a causa de meningitis, teniendo en cuenta que pese a que su vía de entrada es mediante inhalación, luego de causar una infección pulmonar, los hongos causantes diseminan vía sanguínea al Sistema Nervioso Central, además a piel, tejidos blandos y tracto genitourinario, como se refiere también para otros casos de individuos inmunosuprimidos. Así, la meningitis criptocóccica corresponde a la micosis más común causada por el género Cryptococcus en pacientes inmunosuprimidos, a modo de

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meningoencefalitis subaguda en pacientes con inmunosupresión grave (recuento de linfocitos T CD4 inferior a 100 células/µl), conllevando a elevada mortalidad asociada en países en vía de desarrollo, como se refiere entre 35% y 65%, o incluso 70%, particularmente en África sub Sahariana. La mayoría de los casos en países en vía de desarrollo están relacionados con infección por Cryptococcus neoformans, var. grubii, respecto a Cryptococcus neoformans, var. neoformans, referido en países europeos y a Cryptococcus gattii , es más a menudo asociada con trastornos neurológicos en huéspedes con inmunidad normal. Las variedades presentan diferencias en la distribución geográfica y en el hábitat. La variedad grubii tiene distribución mundial y predilección por suelos contaminados con excrementos de aves, especialmente de palomas (Columba livia). La variedad gattii estaba limitada a regiones templadas, tropicales y subtropicales; no obstante, aislamientos encontrados en Vancouver hacen prever la capacidad de adaptación de la variedad a otras latitudes. El hábitat de la variedad gattii se asocia con diferentes especies de Eucalyptus y con otros árboles como almendros. Investigaciones previas han establecido una posible relación entre la infección humana y la exposición a ambientes donde se ha demostrado la presencia de la levadura. Por esta razón, es interesante determinar el hábitat del hongo, los factores abióticos que lo afectan y las relaciones ecológicas que establece en su ambiente natural. En Colombia, Cryptococcus neoformans var. grubii es la causa más importante de la criptococosis, seguido de Cryptococcus gattii. Por otro lado, Cryptococcus gattii se ha aislado varias veces de diferentes fuentes ambientales en el mundo; por esa razón, el objetivo de este trabajo fue realizar una amplia encuesta de muestreo ambiental en diferentes zonas de la ciudad de Cúcuta, en un intento de aislar el complejo Cryptococcus neoformans / Cryptococcus gattii de diferentes árboles, para determinar su circulación y para ampliar nuestros conocimientos sobre la ecología y la

epidemiología de esta levadura patógena en nuestra ciudad. El hallazgo de Cryptococcus neoformans a partir de muestras ambientales en la ciudad de Cúcuta corresponden en su gran mayoría a los recuperados de excretas de paloma y suelos contaminados con dichas excretas de paloma; también se ha aislado de los detritos de árboles, así como de vegetales y frutas. Durante los años 2008 y 2009, en el municipio de Cúcuta, se logró recuperar un aislamiento de Cryptococcus gattii y tres aislamientos de Cryptococcus neoformans var. grubii, a partir del rastreo de 4.389 muestras de árboles. Lo anterior permitirá a futuro tomar medidas preventivas ya sea en cuanto a proponer el uso de normas de bioseguridad que puedan ser adoptas por parte de la comunidad susceptible (barreras de protección física), o bien respecto a la recurrencia de ésta en las zonas de riesgo o en cuanto a la toma de medidas de control sobre los focos ambientales, por parte de las autoridades sanitarias. Adicionalmente, los resultados de éste trabajo contribuirán al conocimiento del comportamiento ecoepidemiológico de este microorganismo en el municipio de San José de Cúcuta. La criptococosis no es una enfermedad de notificación obligatoria en ningún lugar del mundo, excepto en la provincia de British Columbia en Canadá. En Colombia existe muy poca información sobre su incidencia, y principalmente en los grupos de alto riesgo, no obstante, el Grupo colombiano de estudio de la criptococosis ha unido esfuerzos para lograr que esta importante entidad adquiera la relevancia que merece en la salud pública del país. Como resultado de esta iniciativa, en 2007 se publicó el más reciente estudio epidemiológico de la enfermedad en Colombia a partir de los nueve años de la Encuesta Epidemiológica sobre la Criptococosis, la cual pretende identificar las características demográficas de la población afectada, conocer los factores de riesgo, la extensión de la diseminación de la infección al momento del diagnóstico y los métodos de laboratorio empleados para establecerlo, la especie del agente causal y el tratamiento inicial de los pacientes infectados por aislamientos del complejo.

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Esta encuesta reveló que para el año 2005 la incidencia promedio anual de criptococosis fue de 2,4 casos x 106 en la población general, mientras que en los pacientes con sida era de 3 casos x 103 . Se encontró que el 95,9% de los aislamientos pertenecieron al serotipo A; 0,3% al D; 3,3% al B; y 0,5% al C (10). Para realizar estudios epidemiológicos y genéticos del complejo C. neoformans/C. gattii se han empleado diferentes técnicas de tipificación molecular, las cuales han demostrado un alto poder discriminatorio al agrupar los aislamientos en diferentes patrones moleculares. Dentro de estas técnicas moleculares predominan la PCR huella digital con iniciadores universales como el M13, (GACA)4 y (GTG)5 (8, 9, 11, 12), el análisis del polimorfismo en longitud de fragmentos amplificados (AFLP) (13), el análisis del polimorfismo en longitud de fragmentos de restricción (RFLP) de los genes URA5 y PLB1 (9, 14) y la tipificación de secuencias multilocus (MLST) empleando siete genes con servados (CAP59, GPD1, LAC1, PLB1, SOD1, URA5 y la región IGS1). Estudios posteriores hechos en el Grupo de Microbiología del instituto nacional de salud han indicado que el patrón molecular VNI continúa siendo el más frecuente entre los aislamientos del serotipo A (11), lo que concuerda con lo reportado en la literatura (12) como el genotipo que causa en la mayoría de casos la criptococosis en pacientes inmunosuprimidos. MATERILES Y METODOS Área de estudio Parque Simon Bolivar, Antonia Santos, La Victoria, La Libertad (arcoíris, Nacional de la ciudad de San Jose de Cucuta, Norte de Santander. Son parques concurridos de la ciudad , donde en algunos de ellos estudios anteriores registran aislamientos positivos para Cryptococcus. Muestras Las muestras que se utilizaron para este muestreo son (corteza, suelo, hojas, frutos), extraídas de diferentes tipos de árboles de los diferentes parques (Simón Bolívar, La

Victoria, Antonia Santos, Nacional, La libertad). Se realizaron tres muestreos, el primero fue el 31 de octubre de 2016, donde muestreamos el parque Simon Bolivar y parque la Libertad( Arcoiris), donde se recolectaron 240 muestras del parque Simon Bolivar y 60 muestras del parque la Libertad (Arcoiris). El segundo muestreo se realizo el 16 de enero de 2017, donde muestreamos los parques, La victoria y Antonia Santos, donde se recolectaron 240 muestras del parque La Victoria y 60 del parque Antonia santos. Y por ultimo el tercer muestreo se realizo el 17 de abril de 2017, donde muestramos el parue Nacional recolectando 200 muestra de este parque. En total obtuvimos recolectamos entre los tres muestreos 800 muestras , provenientes de muestra de corteza, hojas, tierra, (frutos y excrtas de palomas si las habían) de alrededor de 270 arboles(individuos) de tipo almendros, oiti, mango, entre otros. Procesamiento de las muestras FASE I DESCRIPTIVA Antes de la recolección de las muestras se realizó un respectivo croquis del sitio de muestreo, es decir de cada parque, con el croquis elaborado, se procede hacer la toma de muestra a cada individuo, tomando hojas de los árboles, frutos secos y de suelo, las cuales se tomaran con pala recolectora depositándose cada muestra en su respectiva bolsa plástica. Seguido se recolectara la toma de muestra de corteza de árbol con pinza metálica, provenientes de los diferentes árboles ubicados en los parques Simón Bolívar, La Victoria, Antonia Santos, Nacional y la Libertad (Arcoíris), cada uno diferenciado con un código, y la naturaleza de la muestra, esto se obtuvo en bolsas ziploc donde se recolectaron las muestras por separado. Para terminar esta fase se llevan las muestras al laboratorio para su respectivo procesamiento. FASE II ANALITICA 1.Preparación de la muestra en el laboratorio: Se agrega 5 g de muestra en un tubo falcón

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de 50 ml, rotulado como las bolsas ziploc, seguido de esto se agregan 25 ml de PBS al 1X, tapar y agitar con vortex, se filtra la muestra con un embudo y gasa en un tubo de 15 ml, se agregan 200 ul de Cloranfenicol, esto con el fin de preparar la muestra para su posterior cultivo.

Figura 1. Preparación de la muestra en el laboratorio 2. Identificación de aislados mediante técnicas directas: Se empieza realizando una siembra en agar girasol, agregando 100 ul de la solución preparada anteriormente, se coloca a incubar durante 20 días a 28°C, ya teniendo las 48 muestras sospechosas de ser Cryptococcus sp., se procede a la degradación de la urea, en la cual se toma una asada de la colonia y se inocula en el caldo urea, se deja incubar por 48 horas y se observa, si vira a rosado o rojo se dice que es urea positivo y un posible Cryptococcus sp. presente en la muestra, ya teniendo estas pruebas se procede a realizar la identificación de la especie de este patógeno mediante la prueba de canavanina-glicina-azul de bromotimol (CGB) la cual vira de color verde el cual es el original a color amarillo en Cryptococcus neoformans y a color azul en Cryptococcus gattii, teniendo esto ya confirmado, se procede a realizar la caracterización molecular. 3. Caracterización molecular (determinación de la variante genética C.neoformans VN I, II, III y C.gattii VN I, II, III, IV), mediante PCR Huella digital, seguido de esto se procede a realizar la respectiva electroforesis.

Técnica de Extraccion de ADN se realizo de la manera: 1.Se toma una asada del cultivo previamente sembrado durante 48 horas en agar glucosado de Saboraud o agar Extracto de levadura,peptona,dextrosa (YEPD),y transferida a un tubo de microcentrifuga de 1,5 ml y almacenarlo a -20°C durante 30 minutos por lo menos mejor durante la noche.

2. Adicionar 500ul de buffer de lisis y 5 ul de 2-mercaptoetanol 3. agitar vigorasamente en vortex . 4. incubar a 65°C durante 1 hora (agitar en vortex al menos 1 vez durante la incubación). 5. Adicionar 500 ul fenol:cloroformo:alcohol isoamilico (v:v:v 25:24:1)y mezclar en vortex durante 2 minutos parahast obtener una suspension homogénea. 6. Centrifugar a 14000 rpm durante 15 minutos. 7. Retirar la capa acuosa superior (sobrenadante),transferir a otro tubo de 1,5 ml y mezclar con un volumen igual de isopropanol.Precipitar el sobrenadante a -20°C durante 30 minutos por lo menos(la precipitación del ADN durante toda la noche a -20°C mejora el rendimiento de la exraccion). 8. centrifugar a 14.000 rpm a 4°C durante 15 minutos. 9. descartar el sobrenadante y lavar el pellet con una solución acuosa de etanol al 70%. 10.centrifugar a 14.000 rpm durante 15 minutos. 11. descrtar e sobrenadante y dejar secar el pellet. 12. Re-suspender el ADN en 50-100 ul agua destilada esteril o buffer TE.

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13. determinar la concentración del ADN y diluir según la concentración requerida para la PCR. Tecnica PCR Huella digital Para esta técnica se utiliza cebadores de la secuencia de núcleo minisatélite-específica del fago de tipo salvaje M13 (5'GAGGGTGGCGGTTCT3 ') y de las secuencias de microsatélites-específico (GTG) y (GACA). Las amplificaciones se realizan en un volumen final de 50 ul, que debe contener:

Agua desionizada esteril---------------- 31.5 µl

ADN--------------------------------------------- 2.5ul

PCR buffer------------------------------------ 5 µl

Cloruro de Magnesio (MgCl2)------------- 2 µl

dNTPs--------------------------------------- 0.5 µl

Acetato de Sodio------------------------------ 3 µl

Primer-------------------------------------------- 4 µl

Albúmina de suero bovino------------------- 1 µl

Taq ADN Polimerasa----------------------- 0.5 µl Cuando hay varias muestras de ADN para amplificar con el mismo iniciador de PCR, la forma más eficiente de realizar la PCR es preparar un “Maxter mix” de los ingredientes, que luego se pueden adicionar a cada muestra. Esto permite también que disminuyan los errores de pipeteo cuando se utilizan volúmenes muy pequeños, y se asegura de que cada reacción contiene la misma cantidad de cada componente. Siempre preparar mezcla maestra suficiente para una muestra adicional para compensar los pequeños errores de pipeteo. Centrifugar brevemente, para que todos los componentes bajen a la parte inferior del tubo Eppendorf. Cierre los tubos y colóquelos en el termociclador. La PCR se lleva a cabo en un Termociclador SimpliAmp ™ utilizando las siguientes condiciones: Primer Paso: 35 ciclos de: Desnaturalización: 94°C durante 20 seg Anillamiento: 50°C durante 1 min Extensión: 72 °C durante 20 seg Segundo paso: 1 ciclo de: - Ciclo de extensión final: 72°C durante 6 min

Tercer paso: - Mantener a 5 °C Cuando se ha alcanzado el ciclo de enfriamiento, se finalizó la reacción de PCR. Este ciclo puede ser utilizado para ejecutar una reacción de PCR durante la noche y almacenar los productos de PCR a 5 °C hasta que se utilice para la electroforesis. Después de la PCR, tome los productos amplificados de PCR y almacénelos a 4 °C. RESULTADOS En el primer muestreo realizado se obtuvieron dos aislados de C.neoformans correspondientes a los parques Simon Bolivar y La libertad (Arcoiris) obtenidos de muestras de corteza provenientes de arboles de tipo Almendro. En el segundo muestreo realizado se obtuvieron seis aislados de C.neoformans (un aislado correspondiente al parque Antonia santos obtenido de muestra de 52 tierra proveniente de un arbol de tipo: Oiti (Mokilia tomentosa) ; y cinco aisalados correspondientes a los parques La Victoria obtenidos de muestras de tierra y corteza provenientes de arboles de tipo: Totumo (Cressentia cuejte), Mango, Chiminango, Limon Swingtea, Mamoncillo). En el tercer muestreo realizado no se obtuvo aislados ambientales. Por lo tanto podemos decir que de las 200 muestras analizadas no se aislo Cryptococcus sp, lo que quiere decirla ausencia de este hongo en el Parque Nacional.

Tabla 1. Genotipos de C. neoformans por PCR-Huella digital en muestras ambientales de los parques Simón Bolívar, Antonia Santos y La Victoria.

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Figura 2. PCR- huella digital generada con el iniciador M13. Patrón de cryptococcus(8 patrones de los serotipos que presenta Cryptococcus sp.) y muestras de los aislados ambientales positivos para cryptococcus neoformans, serotipo A: VNI, VNII DISCUSIÓN La criptococosis es una enfermedad de interés en salud debido a que causa meningitis en personas tanto inmunosuprimidas como inmunocompetentes, se logró aislar cepas ambientales del complejo Cryptococcus neoformans, es de gran importancia debido a que este hongo ha causado infinidad de enfermedades meningocócicas no sólo a nivel mundial, nacional, sino que también a nivel local, en el municipio de San José de Cúcuta, según estudios realizados en años anteriores. El objetivo de este estudio es la determinación del complejo Cryptococcus neoformans var neoformans, Cryptococcus neoformans var grubii, y Cryptococcus gattii aisladas de muestras ambientales provenientes de los Parques de San José de Cúcuta. En estudios anteriores ya se había utilizado el agar Semillas de Girasol, el cual se empleó en este estudio, siendo efectivo a la hora de realizar el aislamiento de Cryptococcus sp., siendo un medio selectivo y diferencial para este patógeno, además de esto se sabe que es un microorganismo productor de cápsula, que se puede evidenciar en la realización de una técnica directa llamada Tinta China, en el cuál al observarlo al microscopio la cápsula se ve incolora, el resto de la composición se va a teñir de color negro, seguido de esto se procede a hacer la identificación mediante técnicas bioquímicas, en este caso se realiza

mediante la síntesis de la ureasa la cual es una metaloenzima que cataliza la conversión de urea a amonio y carbamato. La detección de esta enzima se utiliza corrientemente como una prueba para la identificación de diversos microorganismos, entre ellos Cryptococcus sp.debido a que es uno de los factores que hace que este microorganismo se vuelva más patógeno. Seguido de haber realizado estas pruebas se procede a hacer la identificación de especies mediante una técnica bioquímica denominada canavanina-glicina-azul de bromotimol (CGB) la cual permite diferenciar Cryptococcus gattii de Cryptococcus neoformans, debido a que Cryptococcus gattii resistente a la L-canavanina (aminoácido natural estructuralmente similar a la L-arginina), el cual es degradado por las cepas de esta variedad, liberando amonio como compuesto final. En estudios anteriores se han encontrado especies del complejo Cryptococcus neoformans/Cryptococcus gattii en parques de la Ciudad de San José de Cúcuta, lo cual se pudo comprobar con nuestro estudio, iniciando con una prueba piloto realizada en el Parque Antonia Santos de la ciudad, en los cuales se logró aislar cepas de Cryptococcus sp. Seguidamente se procedió con el estudio de los parques en estudio, se obtuvo que en tres de los cuatro parques se logró el aislamiento de Cryptococcus neoformans, dando además aportes a la investigación hasta ahora de gran relevancia, ya que no se había encontrado Cryptococcus sp, en el parque La Victoria, esto conlleva a seguir haciendo investigaciones al respecto, e identificación respectiva de la especie encontrada en este parque. El presente estudio además nos ha permitido asociar el Hongo con diferentes tipos de árboles, teniendo en cuenta que no ha sido asociado con una especie de árbol en específico, aunque en estudios anteriores se había hallado en árboles con unas características morfológicas parecidas en cuanto a la corteza se refiere, sabiendo que los individuos utilizados en el estudio fueron los árboles, además, las muestras fueron tomadas de la corteza, suelo, frutos y hojas secas, obteniendo resultados positivos para

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Cryptococcus sp, en la corteza de estos individuos y en el suelo de algunos de ellos. Estos resultados difieren en varias situaciones, empezando por el tipo de árbol descrito en bibliografías anteriores, ya que se había aislado en Eucalipto y Almendros, en nuestro caso además de los almendros se logró aislar de Mamoncillo, Oiti, Limón swinglea, Totumo y Chiminango, teniendo en cuenta que estos árboles poseen características muy diferentes, además los resultados respecto a estudios anteriores difieren ya que se había logrado aislar Cryptoccocus gattii en estos parques, actualmente encontramos fue la especie Cryptococcus neoformans, correspondiente al serotipo A : VNI y VNII, esto realizado por PCR-Huella Digital. Es por ello que se recomienda seguir haciendo estudios acerca de este microorganismo muchas veces letal para el ser humano, y siguiendo con la idea de que en La Victoria se aisló este patógeno. También hacer un seguimiento de este hongo oportunista, ya que se puede controlar tanto para personas sanas, como con su sistema inmune débil. CONCLUSIONES La Criptococosis corresponde a una micosis esporádica a nivel mundial, potencialmente peligrosa en humanos, dada la importancia de los resultados, se dice que es uno de los principales agentes oportunistas a nivel mundial (Cryptococcus neoformans) causante de una de las principales enfermedades meníngeas y que si no se trata a tiempo puede tener consecuencias graves para el ser humano (Meningitis micótica) causada por este hongo en estudio. En cuanto a la metodología empleada en esta investigación se desarrolla en cuatro fases, la cuales se inicia con la recolección de las muestras ambientales, posteriormente se llevan al laboratorio, se prepararan para su respectivo cultivo en agar girasol, medio en el cual el hongo produce melanina y se ve reflejado por una pigmentación carmelita intenso, seguido de esto a las cepas sospechosas se les realiza la prueba de

urea, con la cual Cryptococcus sp. Presenta la enzima ureasa por tanto se va a mostrar positiva esta prueba, seguido de esto se le realizan pruebas moleculares para determinar el serotipo de dicho microorganismo. En la ciudad de Cúcuta, podemos evidenciar la presencia de especies patógenas de Cryptococcus sp no sólo en estudios anteriormente realizados, sino que además en el que se está desarrollando, lo cual implica un factor de riesgo para las personas inmunosuprimidos e inmunocompetentes, de adquirir una meningitis criptocococica, ya que como se ha dicho este agente no sólo afecta a personas con alguna enfermedad de base, también afecta a personas sanas. Con este estudio aportamos a la investigación debido a el hallazgo de la presencia de Cryptococcus neoformans en el parque La Victoria, sin antecedente alguno para este parque en la ciudad. Con este grandioso estudio queremos ratificar y apoyar una vez más la tipificación molecular de los aislamientos del complejo C. neoformans/C. gattii, siendo este un patógeno oportunista que merece recibir la importancia epidemiologia a nivel de salud pública; y por medio esto cumplir el objetivo de la PCR huella digital en dar a conocer al cuerpo estudiantil de la universidad y a los profesionales médicos y bacteriólogos de la institución el estudio de la diversidad genética de los aislamientos del complejo C. neoformans/C. gattii obtenidos en el país. Mediante estudio podemos ratificar las bases teóricas que existen sobre las dos especies variaciones epidemiológicas, ecológicas y moleculares lo suficientemente amplias como para ser consideradas como especies diferentes. Por ejemplo, se sabe que C. neoformans afecta principalmente a pacientes inmunosuprimidos, mientras que C. gattii se ha aislado principalmente de personas inmunocompetentes; debido a que se indago suficiente literatura para poder identificar los nichos y focos donde se alberga este patógeno, teniendo en cuenta que este estudio se hizo en muestras

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ambientales. Debido a que esta enfermedad no es de notificación obligatoria en ningún país del mundo excepto en la provincia de British Columbia en Canadá, y con gran infección del virus del hiv en Colombia especialmente en norte de Santander, con este estudio queremos dar a conocer algunos de los nichos ecológicos presentes en la ciudad de Cúcuta, entre los cuales se encuentran los parques más transitados de nuestra ciudad y para nadie es un secreto en nuestro sector de la salud que en nuestro departamento mueren a menudo pacientes inmunosuprimidos como los anteriormente mencionados por este patógeno portunista. Una vez concluidos los objetivos de nuestro estudio se logró correlacionar diferentes estudios anteriormente realizados con resultado muy similares, lo cual nos lleva a concluir que en nuestra región se ve tan afectados los paciente inmunosuprimidos con este patógeno oportunista debido a que presentamos grandes nichos ecológicos característicos de este patógeno. BIBLIOGRAFÍA Alonso M, Garcia F, Mallolas J, Soriano A, Ortega M, Miro JM, et al. Disseminated cryptococcosis in patients with AIDS. Prognostic factors of poor outcome. Med Clin (Barc) 1999;112:401-405. Aulakh HS, Straus SE, Kwon-Chung KJ. Genetic relatedness of Filobasidiella neoformans (Cryptococcus neoformans) and Filobasidiella bacillispora (Cryptococcus bacillispora) as determined by DNA base composition and sequence homology studies. Int J Syst Bacteriol 1981;31:97–103. Bicanic T, Harrison TS. Cryptococcal meningitis. Br Med Bull 2004;72:99-118. Burnik C, Altintas ND, Ozkaya G, Serter T, Selcuk ZT, Firat P, et al. Acute respiratory distress syndrome due to Cryptococcus albidus pneumonia: case report and review of the literature. Med Mycol 2007;45:469-473.

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