DETERMINACIÓN DE BIOMASAI. INTRODUCCIÓN

La determinación de la biomasa es una de las variables más importantes en un bioproceso, ya que su determinación nos lleva a la comprensión de la eficiencia del mismo. Se trata de una variable clara para establecer las tazas de producción, de consumo de nutrientes y el cálculo de los balances demás de cualquier proceso biológico.Los métodos clásicos de determinación de biomasa son métodos directos que se basan en el número de células o en el peso celular. Los métodos de enumeración celular, son método de observación, basados en propiedades físicas o en la actividad biológica. Actualmente hay un gran interés en métodos alternativos de determinación de la biomasa. Estos métodos son indirectos y estiman algún componente celular o alguna actividad metabólica especifica. No requieren el examen visual de los organismos ni su incubación.

II. OBJETIVOS

Objetivo General:

Determinar la concentración de células por conteo en cámara Neubauer. Expresándolas en unidades de células/mL.

Objetivo Específico:

Reconocer la técnica de contaje en Cámara Neubauer. Comparar estadísticamente los valores de concentración obtenidos; de manera general y

manera aleatoria, mediante los métodos de variabilidad y desviación estándar.

III. FUNDAMENTO TEÓRICO

Biomasa es un término general que se refiere a los microorganismos presentes en un sistema. A la vez también se puede referir como la cantidad de células, de personas o masa de seres vivos. El objetivo de la biomasa es la reproducción de células.

La determinación de biomasa es una de las variables más importantes en un bioproceso, ya que su determinación nos lleva a la comprensión de la eficiencia del mismo. Se trata de una variable clara para establecer las tazas de producción, de consumo de nutrientes y el cálculo de los balances demás de cualquier proceso biológico. Una variedad de análisis están disponibles para la determinación de Biomasa de muestras biológicas (en nuestro caso de la levadura Saccharomyces cerevisae).

A. Métodos directos de determinación de biomasa : Se basan en el número de células o en el peso celular, dentro de estos métodos podemos distinguir a los siguientes:

1. Métodos gravimétricos (Peso Seco)La cantidad total de biomasa presente en una muestra puede medirse en términos de peso seco por unidad de volumen, ya sea como sólidos en suspensión totales (SST) o sólidos en suspensión volátiles (SSV). Las células se separan del líquido bien por centrifugación bien por filtración. Se expresan en g.m.s/mL.

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2. Métodos espectrofotométricos.Se basan en la existencia de una relación directa entre el número total de microorganismos presentes en una muestra y su valor de turbidez. Tras la determinación de la turbidez de la suspensión celular mediante espectrofotometría, el resultado se expresa en unidades de absorbancia.

3. Métodos microscópicos de recuento celular en cámaras

El recuento de microorganismos se realiza en la cuadrícula central de la cámara y se multiplica por la profundidad, obteniéndose el número de microorganismos por unidad de volumen (número de células/ml, generalmente).

a. CÁMARA DE NEUBAUER. Es una cámara de contaje adaptada al microscopio de campo claro o al de contraste de fases. Se trata de un portaobjetos con una depresión en el centro, en el fondo de la cual se ha marcado con la ayuda de un diamante una cuadrícula como la que se ve en la imagen. Es un cuadrado de 3 x 3 mm, con una separación entre dos líneas consecutivas de 0.25 mm. Así pues el área sombreada y marcada L corresponde a 1 milímetro cuadrado. La depresión central del cubreobjetos está hundida 0.1 mm respecto a la superficie, de forma que cuando se cubre con un cubreobjetos éste dista de la superficie marcada 0.1 milímetro, y el volumen comprendido entre la superficie L y el cubreobjetos es de 0.1 milímetro cúbico, es decir 0.1 microlitro.

Conteo en cámara de Neubauer, Esta cámara se utiliza para conteo celular.

Limpie la cámara y la laminilla de cuarzo suavemente con alcohol. Revise la laminilla de cuarzo que no debe estar desbordada o quebrada. Coloque la laminilla de cuarzo sobre la cámara en

forma vertical, este debe quedar centrada. Proceda a llenar la cámara. Este paso es muy

importante y definitivo en la distribución de las células. Es recomendable llenarla con micropipeta pequeña o con una jeringa ya que la cámara se llena con una gota. El llenado debe ser continuo en un solo intento.

La cámara no puede quedar seca esto se detecta porque en las esquinas del recuadro de llenado se ven porciones secas. Tampoco se debe inundar, la apariencia en la cámara es de líquido abundante en las terminaciones del recuadro.

Figura 1. Conteo por Cámara Neubauer. Representación de la cuadricula 10 X.

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IV.MATERIALES Y MÉTODOS

B. Metodología

Con una jeringa se tomará una cantidad de la solución previamente preparada la cual se encuentra en un tubo de ensayo en dilución a la 10 -1 y se dejará caer unas gotas en la cámara de Neubauer.

Se colocará la laminilla cubreobjetos sobre la portaobjetos en la zona central, para apreciar una zona cuadriculada.

Con la ayuda de una jeringa se obtendrá una pequeña muestra del tubo de ensayo, y se colocará en el borde del cubreobjetos. Se dejará que la solución ingrese a la cámara por capilaridad, sin que pase a los canales laterales.

Una vez que la muestra ingrese por la cámara de Neubauer, se dejará reposar, y posteriormente, se colocará en el microscopio.

Se realizará la cuantificación de células en las zonas de los cuadrados más pequeños de 0.05 mm. tomando precauciones para evitar contar dos veces la misma célula u omitir alguna. Se contarán las células que estén dentro de los cuadrados las que se noten bien y las células que estén en el lado superior y lado izquierdo de cada cuadrado de 4 x 4.

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Luego de calcular las células en los cuadrados intermedios, extremos y los determinados al azar, se deberá calcular el número de células/ mL (por cuadrado), y por medio de la siguiente fórmula, se determinó el número de células por mililitro.

A la vez se deberá calcular la desviación estándar de las 25 celdas. Luego tomaremos 5 celdas al azar de la cual deberemos calcular su variabilidad (coeficiente) y su desviación estándar para luego hacer una comparación.

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V. RESULTADOS Y DISCUSIONES

Tabla 1. Conteo de Células en Cámara Neubauer

Tabla 2. Concentración de las células en las 25 celdas, Desviación estándar y coeficiente de Variación 0.004

Tabla 3. Al azar 5 Células de las 25 celdas de la Cámara Neubauer

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V. CONCLUSIONES

Se determinó la biomasa expresada en células/ml en una solución de levadura.

Se aprendió el método de recuento en la cámara de Neubauer. Las rutas metabólicas entre las levaduras son idénticas, sugiriendo la conformación

de un grupo metabólico idéntico.

VI. RECOMENDACIONES

El margen de error en los cálculos debe ser mínimo.

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