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DETERMINACIN DE LA CURVA DE CRECIMIENTO DE LEVADURA
Sacharomyces cerevisae, APLICANDO EL MODELO DE GOMPERTZ
LABORATORIO DE BIOTECNOLOGA DE LOS PRODUCTOS
AGROINDUSTRIALES
PROFESOR: ING. SNCHEZ GONZALES, JESS ALEXANDER
CICLO: IX
HORARIO: JUEVES 11-1PM
UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLOINGENIERA AGROINDUSTRIAL
TRUJILLO-2012
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Determinacin de la curva de crecimiento de levadura Sacharomyces cerevisae, aplicando el
modelo de Gompertz UNT
INTEGRANTES
ALFARO LAYZA MASSIEL
AROCA CASTILLO RONALD
BANCES NEZ PEDRO
CALDAS REYES PATRICIA
CERQUN RODRGUEZ DIEGO
COLLANTES ARANA LUIS
ESQUIVEL PEREA VIRGINIAESPINOZA ROMERO DIEGO
GORDILLO SILVA CARLOS
GUERRERO MEDINA NEIVER
GUTIERREZ MARIN VIVIANA
IZZIGA LUNA NARDY
JARA PONTE ANVAL
LEN PICN BRUCE
LZARO HARO DANNY
LUCAS FLORES YOVEN
MARTNEZ SALDAA YURICO
MNDEZ SOSA JIMMY
MORALES NARVEZ CARLOS
RODRGUEZ ANTICONA ROBERTO
RODRGUEZ LEN ANDR
SANTILLN HONORIO HILBAR
VARGAS RAFAEL ANGIE
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Determinacin de la curva de crecimiento de levadura Sacharomyces cerevisae, aplicando el
modelo de Gompertz UNT
DETERMINACIN DE LA CURVA DE CRECIMIENTO DE LEVADURASacharomy ces cerevisae, APLICANDO EL MODELO DE GOMPERTZ
I. INTRODUCCIN:
La microbiologa predictiva de alimentos (MPA) es un rea multidisciplinaria
emergente de la microbiologa de alimentos, que surge como alternativa a la
necesidad de acortar tiempos de respuestas, reducir costos econmicos,
reemplazar metodologas dispendiosas y disminuir la laboriosidad en los anlisis de
la microbiologa clsica de alimentos. Es un rea multidisciplinaria ya que abarcadistintas disciplinas como la microbiologa, matemtica, estadstica, informtica,
bioqumica, etc., con el fin de desarrollar y aplicar modelos de simulacin que
permitan predecir las respuestas de los microorganismos ante diversos factores
medioambientales.
La microbiologa predictiva se basa en la siguiente premisa: las respuestas de los
microorganismos ante los cambios en los factores ambientales pueden ser
reproducidas de forma controlada en el laboratorio, de esta forma, a travs de
diversos modelos es posibles posible predecir cul ser el comportamiento de estos
microorganismos cuando cambian las condiciones ambientales que les rodea.
Los modelos matemticos considerados en el mbito de la microbiologa predictiva
se pueden clasificar segn distintos criterios, usos y finalidades. Existen modelos
probabilsticos (que permiten estimar los lmites de crecimiento/no crecimiento o
produccin/no produccin de toxina), modelos cinticos de crecimiento, de
supervivencia o de inactivacin (para determinar el nmero de microorganismos en
funcin del tiempo). Tras ajustar la curva de crecimiento microbiana mediante
funciones matemticas (modelos primarios) y estudiar sus parmetros segn
cambios en las condiciones ambientales (modelos secundarios), es posible
modelizar el comportamiento microbiano en funcin de la temperatura, el pH, la
actividad del agua y otros factores, independientemente del alimento y a partir de
estos datos predecir lo que suceder durante el almacenamiento, procesado, etc.
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Determinacin de la curva de crecimiento de levadura Sacharomyces cerevisae, aplicando el
modelo de Gompertz UNT
II. OBJETIVOS
Preparar medios de cultivo y manejar adecuadamente la autoclave.
Confeccionar la grfica de crecimiento de levadura Sacharomyces cerevisae
mediante el modelo de GOMPERTZ.
Se conoci el modelo de Gompertz para el clculo de la curva de crecimiento
de las levaduras.
Identificar cada una de sus fases.
Calcular el Tiempo de Generacin por el mtodo grfico.
III. MARCO TERICO
A) FORMULACIN DE MEDIOS DE FERMENTACIN
La preparacin de medios para el desarrollo de procesos de fermentacin es una
etapa fundamental para asegurar la productividad de los mismos. Donde los
componentes de los medios constituyen los efectores externos de naturaleza
qumica que desempean un rol esencial en los procesos ya que deben cumplir con
los requerimientos del crecimiento y de formacin de productos y adems
suministrar energa para la sntesis de metabolitos y para el mantenimiento celular.
No obstante que los microorganismos varan considerablemente respecto de los
nutrientes que pueden necesitar es posible efectuar la distincin de las siguientes
categoras de componentes:
a) Macronutrientes, agregados en cantidades de gramos por litro que estnrepresentados por las fuentes de C, N, S, P, K y Mg.
b) Micronutrienteso elementos trazas representados por las sales de Fe, Mn, Mo,
Ca, Zn y Co que se agregan a los medios en cantidades de miligramos o
microgramos por litro.
c) Factores de crecimiento, que estn constitudos generalmente por componentes
orgnicos suministrados en baja concentracin y que no son sintetizados nimetabolizados por las clulas, sino incorporados a estructuras celulares y de funcin
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Determinacin de la curva de crecimiento de levadura Sacharomyces cerevisae, aplicando el
modelo de Gompertz UNT
metablica especfica, como vitaminas, algunos aminocidos, cidos grasos no
saturados, etc.
Los medios pueden clasificarse, considerando la naturaleza qumica de los
componentes, en:
Medios sintticos o medios qumicamente definidos.
Medios complejos, en cuya composicin intervienen sustancias de origen
animal o vegetal como peptonas, extracto de levadura, macerado de maz,
harina de soja, etc. que aportan las sustancias fundamentales ya mencionadas,
pero que son qumicamente indefinidas y de composicin variable
B) CRECIMIENTO CELULAR
Es importante conocer la cintica de crecimiento de los cultivos microbianos porque
es necesario poder predecir cmo va a evolucionar un cultivo, cmo va a ir
consumindose el substrato y cmo se va a ir acumulando el producto de una
fermentacin. Sin conocer estos factores es muy imprudente iniciar el cultivo en un
fermentador de 10.000 litros, por ejemplo, con el coste que ello supone, puesto que
no podemos predecir qu va a pasar, cundo va a completarse el crecimiento, cmo
se va a acumular el producto, etc.
Las clulas aisladas cultivadas en un volumen finito de medio de cultivo apropiado
van utilizando los nutrientes que tienen disponibles con la mayor eficiencia y rapidez
que pueden, sintetizando sus propios componentes celulares y dividindose en
cuanto han podido duplicar su masa y su material gentico. El tiempo que tarda una
clula en hacer. Cada vez que transcurre un tiempo de generacin, el nmero de
clulas se duplica, siguiendo, por tanto, un incremento exponencial.
Si llamamos N0 al nmero de clulas inicial, y g al nmero de generaciones
transcurridas, el nmero de clulas final (N) ser:
Llamando Tal tiempo de generacin yt al tiempo de cultivo transcurrido, la ecuacin
anterior puede transformarse en la siguiente:
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Las ecuaciones exponenciales son muy difciles de manejar grficamente, por ello
es mejor transformarlas en algo ms simple, como puede ser una recta.
Para transformar las ecuaciones anteriores en una recta, tomamos logaritmos en los
dos trminos y resulta:
Esto es: el logaritmo del nmero de clulas crece linealmente con el tiempo a razn
de una constante igual a ln2/T. Si el tiempo de generacin T es muy grande, el
crecimiento tendr poca pendiente (ser lento) y si T es pequeo el crecimiento ser
rpido.Esto es: el incremento en el nmero de clulas, en la biomasa de cultivo y enla acumulacin de metabolitos primarios, protenas, cidos nucleicos etc., es
paralelo.
Otra forma de representar la cintica es considerando el incremento en el nmero
de clulas (dN) en un intervalo corto de tiempo (dt). En este caso, la ecuacin que
describe la cintica es la siguiente:
Esto es: el incremento del nmero de clulas (dN) por unidad de tiempo (dt) es
proporcional al nmero de clulas presentes en el cultivo (N). A la constante de
proporcionalidad () se le denomina tasa de crecimiento y puede considerarse algo
as como la probabilidad de que una clula se divida en un tiempo determinado la
transformacin de esta ecuacin en una recta (tomando logaritmos) rinde lo
siguiente:
Esto es: el incremento del logaritmo del nmero de clulas aumenta linealmente
con el tiempo siendo la constante de proporcionalidad . Comparando esta
ecuacin con la similar presentada ms arriba, podemos concluir que = ln2/T y,
por consiguiente, que T = ln2/. Es decir, que hay una correlacin inversa entre el
valor de la tasa de crecimiento () y el tiempo de generacin.
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Determinacin de la curva de crecimiento de levadura Sacharomyces cerevisae, aplicando el
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Estas ecuaciones nos permiten predecir cul ser el nmero de clulas, masa
celular, etc. despus de un cierto tiempo de cultivo (t) si conocemos ; o bien, poder
calcular la tasa de crecimiento a partir de medidas experimentales del incremento
en el nmero de clulas, biomasa, etc.
Figura 1. Crecimiento celular
El grfico representa la variacin de la biomasa (o nmero de clulas, etc.) de un
cultivo (lnea roja) a lo largo del tiempo. En este cultivo, se va consumiendo un
substrato cuya concentracin (lnea azul) decrece de forma proporcional al
crecimiento de la biomasa.
C)CINTICA DEL CRECIMIENTO DE BIOMASA
Una fermentacin aerbica tipo batch o discontinua puede ser considerada como
un sistema cerrado. En el tiempo inicial el medio de cultivo estril dentro del
fermentador se inocula con microorganismos y la incubacin se da bajo condiciones
fisiolgicas ptimas. En el transcurso de toda la fermentacin, solo se adiciona
oxgeno (en forma de aire), un agente antiespumante, y un cido o base para el
control del pH, con el fin de garantizar las condiciones ptimas de operacin que
permitan obtener una alta concentracin celular. La composicin del medio de
cultivo, la concentracin de biomasa, y la concentracin del metabolito cambia
constantemente como resultado del metabolismo celular. En el transcurso de la
fermentacin hay 4 fases de crecimiento, por las cuales pasa el microorganismo a
travs el tiempo, como se muestra en la figura 4: fase lag, fase exponencial, fase
estacionaria y fase de muerte (Snchez, 2003).
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Figura 2. Curva de crecimiento de los microorganismos.
Fase Lag o de adaptacin: tambin llamada fase de latencia. Cuando las
clulas son transferidas de un medio a otro, no hay inicialmente un incremento
en el nmero de clulas. Durante esta fase los microorganismos se toman un
tiempo para adaptarse a su nuevo ambiente fisicoqumico y en ocasiones se
sintetizan nuevas enzimas o componentes estructurales (Snchez, 2003;
Duarte, 1998). La duracin de esta fase puede variar dependiendo del
crecimiento de las clulas en el inculo, el cual debe tener una edad tal que la
mayor parte de las clulas que contiene deben encontrarse en fase exponencial
y metablicamente activas (Barrera, 2004). Es recomendable utilizar inculos
entre aproximadamente 5 y 10% del volumen total del reactor con el fin de
reducir el tiempo de latencia (Soto, 2004).
Fase Exponencial o log:Al finalizar la fase lag, las clulas se han adaptado a
las nuevas condiciones de crecimiento. En este punto las clulas se reproducen
sin limitacin de sustancias nutritivas a velocidad mxima. El crecimiento de las
clulas se puede describir cuantitativamente como la duplicacin del nmero de
clulas o biomasa por unidad de tiempo. A travs de esta fase las clulas
alteran el medio constantemente tomando los sustratos y excretando losproductos metabolizados. El crecimiento permanece constante durante esta
fase. La velocidad de crecimiento es independiente de la concentracin de
sustrato mientras exista sustrato en el medio y se correlaciona con la velocidad
de crecimiento especfico y la concentracin de clulas x [clulas/ mL] segn
la ecuacin nmero 1.
(1)
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La velocidad de crecimiento especfico , es generalmente una funcin de tres
parmetros: la concentracin del sustrato limitante S , la tasa de crecimiento
mxima max , y la constante especifica de sustrato s K , en cuya concentracin
se obtiene la mitad de la mxima velocidad especfica de crecimiento ( = 0.5 mx.
). Esta relacin puede ser expresada por medio de la ecuacin de Monod (2):
La velocidad mxima de crecimiento especfico max es de considerable
importancia a nivel industrial, debido a que es en este punto donde se obtiene el
valor mximo de a niveles de saturacin de sustrato, relacionando la dependenciade los microorganismos con las condiciones del fermentador, donde a medida que
aumenta la densidad de poblacin decrece la concentracin del sustrato limitante
del crecimiento, causando un descenso de . Fase estacionaria: ocurre cuando se
agota una sustancia nutritiva y el sustrato se ha metabolizado, cuando se han
formado sustancias txicas o ha ocurrido un cambio de condiciones como pH,
temperatura y concentracin de oxgeno disuelto. El crecimiento celular desciende
lentamente o para completamente y en el caso en el que aun pueda estar
ocurriendo crecimiento, este se contrarresta por la rapidez de muerte o lisis celular.
La biomasa incrementa slo gradualmente o permanece constante durante la fase
estacionaria, aunque la composicin de las clulas puede cambiar (Snchez, 2003;
Duarte, 1998).
Fase de muerte:tambin llamada fase de decaimiento. En esta fase la reserva
de energa de las clulas se ha acabado, debido a condiciones de inanicin o
como consecuencia del metabolismo de mantenimiento de algunas clulas. Eltiempo entre la fase estacionaria y la fase de muerte depende del
microorganismo y el proceso utilizado (Snchez, 2003; Duarte, 1998).
D) CONSUMO DE SUBSTRATOS LA LEVADURA Sacchharom yces cerevis iae
La levadura Sacchharomyces cerevisiaees capaz de asimilar una gran variedad de
monosacridos. Tambin puede hidrolizar y consumir algunos carbohidratos
mayores, como la sacarosa, maltosa, rafinosa, maltotriosa y pectina, pero carece delas enzimas necesarias para utilizar la lactosa, el glucan y el almidn. Estos ltimos
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substratos deben ser desdoblados previamente, ya sea por hidrlisis cida y calor
(pH 2.5), o por la actividad de enzimas exgenas de origen microbiano o vegetal:
lactasa, glucanasa, a y b-amilasas o glucoamilasa. En los mostos de procesos
industriales, las concentraciones de carbohidratos fermentables fluctan
generalmente entre 6-12% (p/v).
Los carbohidratos asimilados son degradados y oxidados durante el catabolismo a
travs del ciclo de la Gluclisis (o va Embden-Meyerhof-Parnas). La levadura
aprovecha la energa liberada de cada mol de glucosa: para formar dos moles de
ATP y los usa en la etapa anablica. El ciclo se estabiliza al reducir finalmente dos
moles de NAD+, mientras forma los productos de la fermentacin.
Adems de la fuente de carbono, la levadura requiere que el medio de cultivo tenga
fuentes apropiadas y suficientes de otros macronutrientes: N, O, H, S y P; de
micronutrientes: Na, K, Ca, Mg, Mn y Fe; de elementos traza y de vitaminas. Se ha
observado un mejor aprovechamiento del nitrgeno cuando sus fuentes son
aminocidos libres o pptidos pequeos, en comparacin con las protenas, porque
las proteasas de la levadura tienen actividad limitada.
La velocidad de consumo de substrato limitante (fuente de carbono) est ligada
directamente a la velocidad de crecimiento de la levadura. Al entrar en la clula, el
substrato tiene tres destinos: para funciones de mantenimiento, para crecimiento
microbiano y para la formacin de productos excretados. En un cultivo sumergido
discontinuo (cintica) la cintica de consumo de substrato limitante se representa
as:
Dnde:
qs: Velocidad especfica de consumo de substrato
m: Tasa de mantenimiento
Velocidad de consumo de substrato para el crecimiento microbiano:
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modelo de Gompertz UNT
Velocidad de consumo de substrato para la formacin de los productos ligados alcrecimiento microbiano:
E) CRECIMIENTO DE LA LEVADURA
El proceso de reproduccin normal de Saccharomyces cerevisiae es asexual
(mitosis) y se llama gemacin. En ste se observa la formacin de yemas o
blastosporas que dan origen a nuevas clulas haploides al crecer. Slo en
condiciones crticas se combinan dos clulas para formar un cigoto diploide, y
despus de la reduccin de cromosomas (meiosis) se forman 4 esporas sexuales
(ascosporas) que al germinar producen nuevas clulas haploides.
Saccharomyces cerevisiaees anaerobia facultativa, por lo que se obtiene un mayor
rendimiento de biomasa en aerobiosis que en anaerobiosis. El cultivo aerobio es
importante durante la propagacin del inculo, llamado tambin cultivo semilla
El cultivo principal se realiza en condiciones anaerobias o microaerfilas
El valor de la velocidad especfica de crecimiento microbiano (m) en anaerobiosis
flucta entre: 0.13 y 0.408 h-1
. El rendimiento aproximado de biomasa con respectoal consumo de substrato en estas condiciones es:
Y el de produccin de ATP es de:
F)CRECIMIENTO Y SNTESIS DEL PRODUCTO EN PROCESOS INDUSTRIALES.
Hay dos tipos fundamentales de productos metablicos: primarios y secundarios. Un
metabolito primario es el que se forma durante la fase primaria del crecimiento del
microorganismo, mientras que un metabolito secundario es el que se forma cerca
del final de la fase de crecimiento, frecuentemente cerca de, o en la fase
estacionaria del crecimiento. Las diferencias entre un metabolito primario y un
metabolito secundario se ilustran en la imagen de la izquierda.
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modelo de Gompertz UNT
Metabolitos primarios microbianos.
Un proceso microbiano tpico, en el que el producto se forma durante la fase
primaria del crecimiento, es el alcohol (etanol) obtenido por fermentacin*. El etanol
es un producto del metabolismo anxico de la levadura y de algunas bacterias y se
forma como parte del metabolismo de la energa. Debido a que el crecimiento slo
puede tener lugar si puede producirse energa, la formacin de etanol tiene lugar en
paralelo con el crecimiento.
Metabolitos secundarios microbianos.
Un tipo ms complejo de productos industriales es aquel en el que el producto
deseado no se produce durante la fase primaria del crecimiento sino durante la fase
estacionaria. Los metabolitos producidos durante la fase estacionaria se denominan
metabolitos secundarios y son algunos de los metabolitos ms comunes y ms
importantes de inters industrial. Mientras que el metabolismo primario es
generalmente similar en todas las clulas, el metabolismo secundario presenta
claras diferencias entre un organismo y otro. Las caractersticas reconocidas del
metabolismo secundario son:
Cada metabolito secundario slo lo forman relativamente pocos
organismos.
Los metabolitos secundarios, aparentemente no son esenciales para el
crecimiento y la reproduccin.
Con frecuencia, los metabolitos secundarios se producen como un grupo
de estructuras estrechamente relacionadas.
Con frecuencia es posible obtener una espectacular superproduccin demetabolitos secundarios, en tanto que los metabolitos primarios, ligados
como estn al metabolismo primario, usualmente no se pueden
superproducir de una manera tan espectacular.
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modelo de Gompertz UNT
G) MEDIO DE CULTIVO.
La produccin de levadura, requiere adems de unas condiciones ambientales
ptimas, de una variedad de nutrientes esenciales y vitaminas (Gmez, 2003). Los
nutrientes existentes en los medios de cultivo dan a la clula microbiana todos los
ingredientes requeridos para que produzca ms clulas semejantes a ella misma
(Ramrez y Pedroza, 2001). Por lo tanto, es conveniente considerar un diseo de
medio de fermentacin que genere las mejores garantas de crecimiento, el mejor
desarrollo para el microorganismo y el mximo rendimiento de produccin. El medio
debe satisfacer los requerimientos nutricionales y ambientales del microorganismo,
adems de las restricciones tcnico-econmicas para minimizar los costos de
separacin y purificacin. La determinacin de los requerimientos nutrimentales,ambintales y la composicin, dependen de la estequiometra de crecimiento y
formacin de producto (Duarte, 1998).
En la Figura 3, se muestran los requerimientos bsicos de nutrientes para los
microorganismos y las formas comunes de satisfacerlos en los cultivos
Figura 3. Requerimientos nutrimentales para los medios de cultivo
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Determinacin de la curv a de crecim iento de levadura Sacharom yces cerevisae, apl icando
el modelo de Gomp ertz
UNT
Los medios se clasifican de acuerdo a la naturaleza de los componentes, en: 1)
medios sintticos o tambin llamados medios qumicamente definidos y 2)
medios complejos, en cuya composicin intervienen sustancias de origen
animal y vegetal, como peptonas, extracto de levadura, macerado de maz,harina de soya, de pescado, de sangre, extracto de carne, entre otros, que
aportan las sustancias fundamentales (macro y micronutrientes) (Ramrez y
Pedroza, 2001).
La formulacin del medio tiene que ver con los aspectos cuantitativos,
estableciendo las concentraciones y cantidades de cada componente. Para
promover el crecimiento celular son requeridos factores esenciales en los
medios de cultivo como ciertos aminocidos y vitaminas (Ramrez y Pedroza,2001). En el caso de la clula de levadura, para su desarrollo sta requiere de
nutrientes como el nitrgeno (sales de amonio, sulfato de amonio y urea),
fsforo (fosfato diamnico y cido fosfrico), magnesio (sales de magnesio),
potasio, calcio, azufre, hidrocarburos y trazas de hierro, zinc, cobre, manganeso
y molibdeno (Guilliermond, 1920; CNMA, 1998). En cuanto a las vitaminas son
necesarias la biotina, inositol, cido pantotenoico y tiamina (Asenjo, 1995;
CNMA, 1998).
Para la fabricacin industrial de levadura de panadera las principales materias
primas son el cultivo puro de levadura y la melaza de caa que constituye la
principal fuente de carbono del medio de cultivo, debido a su alto contenido de
azcares fermentables (45 a 55% en peso) en forma de sacarosa, glucosa y
fructosa (CNMA, 1998). A nivel de laboratorio S. cerevisiae se cultiva en medios
complejos que aportan a la clula los nutrientes necesarios para su crecimiento,
entre los que se destacan YM, Goering y Van Soest y el de Pell y Pschofield.Sin embargo, la composicin de los medios de cultivo debe ser constantemente
adaptada a los procesos de fermentacin (Ramrez y Pedroza, 2001).
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el modelo de Gomp ertz
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IV. MATERIALES Y METODOLOGA
A. MATERIALES Y EQUIPOS
Materiales
Sacarosa
Harina de soya
fosfato de amonio
Tiosulfato de sodio
cido fosfrico
cido ctrico
Agua destilada
Levaduras Fleshman
Equipo:
Microscopio
Cmara de Neubauer.
Bioreactor
Balanza analtica.
Cocina.
Otros:
Lmina cubreobjetos
Jeringa de carga
Baln
Vaso de precipitacin
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el modelo de Gomp ertz
UNT
B. METODOLOGA
Procedimientos
Clc u lo s
En primer lugar se procedi hacer los clculos el medio de cultivo, tomando en
cuenta las necesidades de la levadura Sacharomyces Cerevisae y teniendo
en cuenta que la levadora se trat de calcular un medio lo ms natural posible.
Preparacin d el medio d e cul t ivo (ver en Anexos)
Se procedi a pesar los materiales necesarios en base a nuestros clculos,
para la preparacin el medio de cultivo los cuales son los siguientes:
200g de sacarosa
100g de harina de soya
8.117g fosfato de amonio pentahidratado
8.96g Tiosulfato de sodio
469g cido fosfrico
800g agua destilada
En un recipiente se combin los materiales, la harina de soya fue agregada
poco apoco y paralelamente se fue removiendo con el fin de que no quedase
ningn grumo por la harina de soya.
Enseguida se procedi a medir los grados Brix del medio, el cual fue de 20
Brix y con un pH de 6.2, se ajust el pH con cido ctrico hasta que llegase a
un pH de 5.
Luego esta solucin se puso en un baln de vidrio con un corcho en la boca, el
cual tena un pequeo orificio para el termmetro.
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Determinacin de la curv a de crecim iento de levadura Sacharom yces cerevisae, apl icando
el modelo de Gomp ertz
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Paralelamente en una olla se puso a calentar agua hasta que llegue a una
temperatura de 50C.
A esta temperatura de 50C recin se puso el baln conteniendo el medio de
cultivo, y se sigui calentando hasta que la solucin dentro del baln llegase a
80 C y se conserv a esta temperatura por 15min con el fin de pasteurizar el
medio de cultivo.
Luego se dej enfriar el medio de cultivo hasta 30C.
Act ivacin de las levaduras
Se hizo una solucin de 20 brix, con el fin de activar la levadura en polvo.
Se adiciono la levadura en polvo, se removi y se dej reposar por unos
minutos.
Despus de algunos minutos se not rpidamente el crecimiento y la
activacin de la levadura, puesto que la levadura la espuma que daba la
levadura (CO2) rebos el vaso de precipitacin donde se estaba
preparando el medio de cultivo.
Luego se hizo un recuento en la cmara de neubauer, pero no se pudocontabilizar pues eran demasiadas. Motivo por lo cual se procedi a hacer
una dilucin de 1/10 para que la concentracin llegara 107 levaduras/mL
esto de acuerdo a las indicaciones del docente.
Crecimiento d e las levaduras en el birreactor
Luego que se lleg a enfriar medio de cultivo a 30C recin se agreg las el
10% de levaduras en funcin al medio. En seguida se agreg esta solucin al birreactor, el cual estaba en
constante agitacin.
Seguidamente por un lapso de 2 horas se extrajo muestra cada 15
minutos. La primera muestra extrada con una jeringa fue vertida en la
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Determinacin de la curv a de crecim iento de levadura Sacharom yces cerevisae, apl icando
el modelo de Gomp ertz
UNT
cmara de Neubauer sobre una laminilla y luego fue colocada en el
microscopio
Luego procedimos con un aumento de 40X se realiz el conteo respectivo
de clulas Pasada ya las 2 horas las se iniciaron a extraer las muestras cada 30
minutos.
Despus de unas horas el crecimiento de la poblacin aumento
considerablemente por ello se consider realizar una dilucin 10 -1.
Finalmente se procede a realizar la respectiva curva de crecimiento para la
produccin de levadura.
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V. RESULTADOS DETERMINACIN DE LA CURVA DE CRECIMIENTO DE LEVADURA Sacharomycescerevisae, APLICANDO EL MODELO DE GOMPERTZ
TABLA 1. Datos de los nmeros de levaduras de Sacharomyces cerevisae, tomadas al azar
MEDIDAS NMEROS DE LEVADURAS AL AZAR TOTAL PROMEDIO VOLUMEN DILUCIN
MUESTRA
ORIGINAL1 79 88 73 77 83 400 80 0.000004 - 20000000
2 132 120 81 75 101 509 101.8 0.000004 - 25450000
3 16 20 22 13 13 84 16.8 0.000004 10 42000000
4 17 23 18 12 16 86 17.2 0.000004 10 43000000
5 16 14 15 17 9 71 14.2 0.000004 10 35500000
6 25 19 7 12 26 89 17.8 0.000004 10 44500000
7 25 26 23 24 22 120 24 0.000004 10 60000000
8 22 18 17 20 21 98 19.6 0.000004 10 49000000
9 25 21 28 25 24 123 24.6 0.000004 10 61500000
10 24 28 21 29 24 126 25.2 0.000004 10 63000000
11 27 28 23 25 27 130 26 0.000004 10 65000000
12 27 25 26 22 32 132 26.4 0.000004 10 66000000
13 41 43 40 38 35 197 39.4 0.000004 10 98500000
14 40 41 37 46 43 207 41.4 0.000004 10 103500000
15 42 46 35 39 47 209 41.8 0.000004 10 104500000
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TABLA 2. Determinacin de los parmetros de crecimiento de levaduras Sacharomyces cerevisae del medio de cultivo.
TABLA 3. Parmetros para clculo de grfica de Gompertz
MUESTRAS TIEMPO (h)MUESTRA ORIGINAL
LOG( N/N0)(UFC/g)N
1 0.166667 20000000 0
2 0.333333 25450000 0.104657791
3 0.500000 42000000 0.3222192954 0.666667 43000000 0.33243846
5 0.833333 35500000 0.249198357
6 1.000000 44500000 0.347330015
7 1.166667 60000000 0.477121255
8 1.333333 49000000 0.389166084
9 1.500000 61500000 0.48784512
10 2.000000 63000000 0.498310554
11 2.500000 65000000 0.511883361
12 3.000000 66000000 0.51851394
13 3.500000 98500000 0.692406235
14 4.000000 103500000 0.713910354
15 4.500000 104500000 0.718086295
a 0.676447
b 0.706306
c 1.095409
mximo 0.74098544
-0.2681135
G 0.93543968
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Determinacin de la curva de crecimiento de levadura Sacharomyces cerevisae, aplicandoel modelo de Gompertz
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Figura 4. Determinacin de la Curva de Crecimiento de la Sacharomyces cerevisae aplicando modelo de Gompertz
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Figura 5.Tiempo (horas) vs Log (UFC/g) en Sacharomyces cerevisae
y = 0.2099ln(x) + 0.3749R = 0.9256
-0.1
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.0000000.5000001.0000001.5000002.0000002.5000003.0000003.5000004.0000004.5000005.000000
Log(N/N0)(UFC/g)
Tiempo (horas)
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Determinacin de la curv a de crecim iento de levadura Sacharom yces cerevisae, apl icando
el modelo de Gomp ertz
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Segn Ventanas (2000); nos cuenta que el desarrollo de los microorganismos
puede representarse mediante una grfica que corresponde a una funcin
matemtica relativamente compleja. El estudio de estas funciones matemticas
tiene gran inters desde el punto de vista microbiolgico, ya que puede servir parapredecir el crecimiento de los microorganismos, y de este modo saber mediante
un simple clculo matemtico, con un ordenador, la evolucin que tendran los
microorganismo de inters en un producto determinado. De hecho, se est
haciendo un considerable esfuerzo para disear y validar los modelos
matemticos que permiten establecer el desarrollo microbiano y que son de gran
valor a la hora de tomar decisiones respecto al diseo de instalaciones y procesos,
adquisicin de equipos o caractersticas de los productos. Una de las frmulas
ms ampliamente utilizadas es la ecuacin de Gompertz. As mismo; en la Figura
4 podemos observar los resultados arrojados por STATISTICA validados para el
modelo de Gompertz; donde, el valor de a es igual a 0.676 nos indica el numero
inicial de microorganismos viables. El valor de b nos indica una velocidad de
crecimiento relativa de 0.706 en unidades de 1/horas a la velocidad mxima de
crecimiento en las condiciones trabajadas. La diferencia entre el nmero inicial y el
recuento mximo que se puede alcanzar en el medio est indicado por el valor c
que es 1.095.
Segn Hernndez (2008), nos dice que la curva de crecimiento de un
microorganismo representa el comportamiento de su crecimiento a travs del
tiempo. Con base en ella, se determina cuando se produce la mayor cantidad de
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el modelo de Gomp ertz
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biomasa o de metabolitos (primarios o secundarios). Si hacemos un contraste
entre la curva de la figura 1 obtenida en el software statistica 7; y la curva de
crecimiento extrada de bibliografa (Figura 5); observamos que la fase de latencia
que present la levadura no fue tan marcada, casi imperceptible, esto se debe aque la levadura presente en el inculo entr al biorreactor en una fase logartmica,
esto porque se puso a la levadura en un medio con sustrato (azcar) y a la misma
temperatura que se trabaj en el biorreactor para que vaya adaptndose antes de
ser vertido en el reactor. En un proceso de obtencin de biomasa la fase de mayor
importancia es la fase logartmica, pues de la velocidad de cmo se de sta
dependen factores como el costo. En la figura 4 se aprecia que la mayor pendiente
de la curva de crecimiento, es decir la mxima velocidad de crecimiento de la
levadura Saccharomyces cerevisiaese da entre los tiempos de 0.5 y 1 horas, es
decir el mayor crecimiento se dio entre los 30 min y 60min.
Segn Scragg (1996), nos dice que la fase lag, es un tiempo de aparente no
crecimiento, el cual se da en nuestro caso para la primera 0.5 hora, pero estudios
bioqumicos demuestran actividad metablica, indicando que las clulas estn en
proceso de adaptacin a las condiciones ambientales y que un nuevo crecimiento
comenzar, eventualmente. Existe, luego, una fase de aceleracin transitoria
cuando el inculo comienza a crecer que es seguida, rpidamente, por una fase
de crecimiento exponencial, esta fase exponencial se aprecia a un tiempo de 4
horas aproximadamente, ya que luego comienza a decaer. Esta fase final del ciclo,
es la fase de muerte, cuando la velocidad de crecimiento ha cesado. Y segn el
mismo autor, la mayora de los procesos biotecnolgicos por lotes se detiene
antes de esta fase, debido a la disminucin en el metabolismo y a la lisis celular.
Segn Hidalgo (2003), nos recalca que los azcares fermentables por las
levaduras son la principal fuente de alimentacin carbonadas, especialmente la
glucosa y la fructosa como azucares mayoritarios, sirviendo de base para la
sntesis de los compuestos que necesitan, as como tambin de fuente de energa
para atender sus funciones vitales como en el caso de la prctica que se le aadi
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soya que es un alimento con alto contenido de nitrgeno; adems de fsforo,
azufre y amonio que se apoy de compuestos qumicos tales como el cido
sulfrico, fosfato de amonio y tiosulfato de sodio. As el autor nos dice que en
medios muy pobre, con menos de 10 gramos/litro, la velocidad es muy lenta,acelerando hasta concentraciones de 20 gramos/ litros, donde a partir de este
valor la velocidad se mantiene hasta los 200 gramos/ litro. Despus de esta
cantidad la velocidad de fermentacin decrece a medida que la concentracin
aumenta, cesando totalmente a partir de los 600 gramos/litro por la elevada
presin osmtica presente en el medio. Esto se nota en la experimentacin ya que
segn la curva de crecimiento, existe un punto en el cual el crecimiento aumenta
la velocidad de crecimiento y otro punto en el cual este se detiene.
Segn Doran (1998), nos afirma que una de las condiciones que se tiene que
tener en cuenta en el biorreactor para el crecimiento de la biomasa es el aporte de
oxgeno, y si analizamos lo que se dio en nuestra practica podemos decir que este
fue continuo para ayudar al aporte de estas (levaduras) y para evitar la
fermentacin y as conllevar a la produccin de alcohol y CO2. El autor tambin
expresa que este aporte de oxigeno adems de evitar la fermentacin, sirve para
mantener las clulas uniformemente distribuidas en todo el volumen del cultivo a
fin de prevenir la sedimentacin o la flotacin, mantener constante y homognea la
temperatura.
Segn IICA (1989), la biomasa de microorganismos es una excelente fuente de
nutrientes (protenas, grasa, vitaminas, minerales y otros factores). Por lo tanto,
siempre ha existido un inters de incorporarla al sistema alimentario humano tanto
en forma directa como indirecta (a travs de animales). Entre ellas, es la
proveniente de levaduras la que posiblemente se ha estudiado con mayor
profundidad. Por lo dicho se puede afirmar que no solo es un proceso previo a la
fermentacin de un vino, cerveza o cualquier bebida alcohlica el hecho de poner
en un biorreactor un inculo de levaduras con el fin de aumentar el nmero de
clulas y hacer ms factible la fermentacin alcohlica; si no es un proceso que
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el modelo de Gomp ertz
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puede manejarse a nivel alimentario con el fin de obtener una fuente rica en
protenas como lo son las levaduras, para ello se necesitara produccin de
grandes cantidades de biomasa en cortos tiempos. Todo esto se podra llevar a
cabo evaluando los mejores parmetros de temperatura, pH y nutrientes quenecesitan las levaduras.
VI. CONCLUSIONES
Se prepar un medio de cultiv basado en soja, azcar rubia y dems
componentes y se manej adecuadamente la autoclave.
Se confeccion la grfica de crecimiento de levadura Sacharomyces cerevisae
mediante el modelo de Gompertz, obteniendo el modelo matemtico de
y=0.2099Ln(x)+0.3749, con un R2 de 0.9256, un valor alto que se acerca a
uno, lo cual nos indica un ndice de confianza aceptable. En las cuadros 1 y 2
se puede observar cmo va creciendo la levadura hasta llegar a un valor donde
se tiende a hacerse constante, lo cual nos indica que ha llegado a su punto
mximo de crecimiento.
Se conoci un poco ms acerca del mtodo de Gompertz en el crecimiento de
levadura Sacharomyces cerevisae.
Se identific sus fases, las cuales se pueden apreciar en la Figura 1. Curva de
crecimiento microbiano, utilizando el mtodo de Gompertz, las cuales son:Fase
Lag: Del Punto inicial hasta la interseccin del punto 0.0-0.1. Fase exponencial:
Desde el segundo punto (0.0-0.1) hasta la lectura del punto 13. Fase
Estacionaria: Desde el punto 13 hasta el punto 15 donde tiene una tendencia a
mantenerse constante. Fase Muerte: No se determin dado que solo se obtuvo
hasta Fase Estacionaria.
Se calcul el tiempo de generacin mediante el modelo:y=0.2099Ln(x)+0.3749; donde Y= Log (N/No)X=tiempo.
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el modelo de Gomp ertz
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VII. BIBLIOGRAFA
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Zaragoza: Editorial Acribia.
DORAN, P. (1998) .Principios De Ingeniera De los Bioprocesos. Edit.Acribia. S.A
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DUARTE P. (1998). Biotecnologa de la fermentacin, Primera Edicin, Editorial
Acriba S.A., Zaragoza (Espaa).
GOMEZ E. (2003), ASPECTOS BSICOS DE BIOTECNOLOGA. Instituto
Tecnolgico y de Estudios Superiores de Occidente, A
HERNNDEZ, A. (2008). Microbiologa Industrial.
Hidalgo J. (2003) Tratado de etnologa Editoria: Mundi-Prensa Libros S.A., Mxico.
IICA (1989). Oportunidades de las biotecnologas Agropecuarias en Amrica
Central. Programa II; Generacin y Transferencia de Tecnologa.
RAMREZ O. PEDROZA M. (2001). Evaluacin De Parmetros Cinticos Para La
Sacharomyces Cerevisiae Utilizando Agua De Coco Como Sustrato, San Jos,
Costa Rica.
SANCHEZ A. (2003). Las biotecnologas: desafos y promesas InvestigacionesBiolgicas. La Habana..
SCRAGG, A.(1996). Biotecnologa. Edit. El Manual Moderno. Mxico D.F.
VENTANAS, J. (2000). Tecnologa del jamn Ibrico: Delos sistemas tradiciones a
la explotacin racional del sabor y el aroma. Ediciones Mundi-Prensa. Madrid.
Espaa.
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ANEXOS
ANEXO 01.Diseo de un medio de cultivo
Reaccin general
A C12H22O11 +BO2 +C NH3 C3.72H6.11O1.95N0.61 +D CO2 +E H2O
Donde:
Si:
100g sacarosa100g levadura10,4 (NH3)102,6g (O2)
Para el diseo de un medio se necesita de ciertos componentes tales como Macronutrientes
(CHONPS) y Micronutrientes (P y S) teniendo
Materiales.
Harina de soya (100g)Fuente.
P 0.61g
Mg 0.27gS 0.42
Zn 0.5gProtena 43g
Protena
Sacarosa (azcar rubia) 200g20Brix
Fosfato de amonio (NH3)4 PO4 63g/mol Acido fosfrico H3PO4 98g/mol
Tiosulfato de sodio Na2S2O3 164g/mol
Levadura
90.5g (90%)
10g (10%)
100g
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Requerimientos
Macronutrientes
Fosforo (P) 4gAzufre (S) 4g
Amonio (NH3) 10.4gSacarosa 200gOxigeno 102.6g
MicronutrientesZinc (Zn) 5mg
Magnesio (Mg) 5mg
Dnde: la harina de soya se completa los requerimientos de Zn (5mg), de P(faltara 3,39g), de Mg
se completa , de S (falta 3,5g) y del NH3 ( faltara 2.g)
Entonces calculamos para completar:
NH3
Azufre
Fosforo
g P
Entonces nos faltara3,39-1.905=1.485g P
Finalmente nuestras molculas para el medio de cultivo serian.
200g sacarosa
100g harina de soya
8.117g fosfato de amonio
8.96g tiosulfato de sodio 469g
Buffer
El cual se encontrara en agitacin constante
800g H2O
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Figura 6. Materiales para el diseo
del medio de cultivo
Figura 7. Harina de Soya para
el medio de cultivo
Figura 8. Pesado de la
Harina de Soya.
Figura 9. Pesado de los
materiales
Figura 10. Preparacin delMedio de Cultivo
Figura 11. Medio de Cultivo
Figura 12. Medio de cultivo 2 Litros Figura 13. Medicin de la
temperatura del medio de
cultivo
Figura 14. Medio de Cultivo en
Coccin.
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el modelo de Gomp ertz
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Figura 13. Pesaje del
Cultivo para la medicin
de Levaduras
Figura 14. Medio de Cultivo Figura 15. Materiales para el conteo
de Levaduras Sacharomyces
cerevisae
TUTORIAL MICROBIOLOGA PREDICTIVA GOMPERTZ
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Model is: YA=a*exp(-exp(b-c*TA))
OK , OK
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OK
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Summary: Parameter estimates
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