DETERMINACIONES DE METODOS MICROBIOLOGICOS

Proceso: Laboratorio

Versión: 01 Código: LB-PR-08

Página 1 de 12 Vigente desde: 2017/08/09

Página 1 de 12

1. OBJETIVO

Describir la metodología para llevar a cabo la detección y cuantificación de microorganismos Mesófilos o Heterotrofos, E. coli y Coliformes totales en muestras de agua.

2. ALCANCE

Este documento se tomará como referencia en el análisis de microorganismos de E. coli, coliformes totales y mesófilos (heterótrofos) en muestras de aguas potables y superficiales y para su respectivo control de calidad. Coliformes Totales y E-Coli: Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater 22th Edition 2012. Methods 9223 B. Mesófilos o Heterótrofos: Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater 22th Edition 2012. Methods 9215 E.

3. SOPORTE NORMATIVO

Norma Técnica Colombiana, “NTC ISO/IEC 17025 Requisitos Generales para la Competencia de los Laboratorios de Ensayo y de Calibración”, edición 2005.

AWWA, APHA, WEF “Standard Methods for the Examination of water and Wastewater” 22 th edition; 2012.

4. TERMINOLOGÍA Y DEFINICIONES Coliformes: Bacterias Gram Negativas en forma bacilar que fermentan la lactosa a temperatura de 35 a 37ºC, produciendo ácido y gas (CO2) en un plazo de 24 a 48 horas. Se clasifican como aerobias o anaerobias facultativas, son oxidasa negativa, no forman esporas y presentan actividad enzimática de la β galactosidasa. Es un indicador de contaminación microbiológica del agua para consumo humano. Escherichia Coli: Bacilo aerobio Gram Negativo no esporulado que se caracteriza por tener enzimas específicas como la β galactosidasa y β glucoronidasa. Es el indicador microbiológico preciso de contaminación fecal en el agua para consumo humano.

DETERMINACIÓNES DE METODOS MICROBIOLOGICOS Código LB-PR-08 Versión 01

Página 2 de 12

Bacterias Mesófilas Aerobias: Grupo heterogéneo de bacterias capaces de crecer entre 15 y 45ºC con un rango óptimo de 35ºC. En la industria de alimentos es considerado como el grupo indicador más grande que existe. En productos terminados es utilizado como indicador de vida útil. Sustrato definido enzimático: Prueba que contiene sustratos hidrolizables para la detección de las enzimas X-GAL de los Coliformes y de las enzimas MUG de la E. coli. El nutriente permite que los microrganismos objeto de la prueba, una vez incubados en un medio reactivo, produzcan color o fluorescencia, indicando y confirmando la presencia del microrganismo objeto de investigación.

5. RESPONSABLES Personal de laboratorio ()

6. CONDICIONES GENERALES

6.1. LIMITACIONES E INTERFERENCIAS

Si la muestra no es procesada dentro de las 24 horas siguientes a su recolección y que se haya sometido a refrigeración (de 2°C a 6°C) más no congelación no se debe procesar.

Se debe desinfectar el área de trabajo antes y después del procedimiento.

Todo el material debe estar estéril.

Se debe agitar muy bien la muestra como también las diluciones.

Para leer los resultados obtenidos debemos tener en cuenta la intensidad del color que se debe tener, para esto comparar con el frasco indicador que es un patrón, para evitar falso positivos o falsos negativos.

6.2. PREPARACION DE DILUCIONES Realice la dilución deseada con agua destilada y desionizada estéril así:

DILUCIONES PARA MICROBIOLOGIA

Serie impar

Cantidad de muestra Cantidad de Agua Dilución

10 ml 90 ml 101

1 ml 10-1 99 ml 103

1 ml 10-3 99 ml 105

1 ml 10-5 99 ml 107

1 ml 10-7 99 ml 109

Serie par

10 ml 90 ml 101

10 ml 10-1 90 ml 102

1 ml 10-2 99 ml 104

DETERMINACIÓNES DE METODOS MICROBIOLOGICOS Código LB-PR-08 Versión 01

Página 3 de 12

1 ml 10-4 99 ml 106

1 ml 10-6 99 ml 108

6.3. DETERMINACION DE COLIFORMES TOTALES Y E-COLI 6.3.1. GENERALIDADES Colilert* detecta simultáneamente los coliformes totales y E. coli en el agua. Se basa en Defined Substrate Technology* (Tecnología de substrato definido [DST*]), patentada por IDEXX. Cuando los coliformes totales metabolizan el indicador ONPG de nutrientes de Colilert, la muestra toma una coloración amarilla. Cuando E. coli metaboliza el indicador MUG de nutrientes de Colilert, la muestra además fluoresce. Colilert puede detectar simultáneamente estas bacterias a una concentración de 1 UFC/100 ml dentro de las 24 horas, hasta en presencia de 2 millones de bacterias heterotróficas por cada 100 ml. El medio se debe almacenar a temperatura de 2–30°C, alejado de la luz. 6.3.2. DETERMINACION MICROBIOLOGICA POR PRESECIA/AUSENCIA

Añadir el contenido de una dosis a una muestra de 100 ml en un recipiente estéril transparente, no fluorescente.

Tapar y agitar el recipiente.

Incubar a 35±0,5°C durante 24 horas.

Leer los resultados de acuerdo con el cuadro de interpretación de resultados. 6.3.3. DETERMINACION MICROBIOLOGICA CUANTITATIVA

Añadir el contenido de un paquete a una muestra de 100 ml de agua, en un recipiente estéril.

Tapar y agitar el recipiente hasta disolver.

Verter la mezcla de muestra/reactivo en una Quanti-Tray* o una Quanti-Tray*/2000 y sellar en un IDEXX Quanti-Tray* Sealer.

Colocar la bandeja sellada en una incubadora a 35±0,5°C durante 24 horas.

Leer los resultados de acuerdo con el cuadro de interpretación de resultados. Contar el número de pocillos positivos y referirse al cuadro NMP proporcionado con las bandejas para obtener el número más probable.

6.4. DETERMINACION DE MICROORGANISMOS HETROTROFOS EN PLACA (MESOFILOS) 6.4.1. GENERALIDADES El recuento de heterótrofos en placa (Heterotrophic Plate Count, HPC) para la prueba Quanti-Tray* se utiliza con el fin de realizar la cuantificación de los organismos heterótrofos en 100 ml de agua. El HPC para la prueba Quanti-Tray se basa en la Multiple Enzyme Technology* patentada por IDEXX, la cual detecta los organismos heterótrofos viables por medio de la evaluación de la presencia de enzimas que se sabe se encuentran en estos organismos. La prueba utiliza sustratos de enzimas múltiples que producen fluorescencia azul cuando son

DETERMINACIÓNES DE METODOS MICROBIOLOGICOS Código LB-PR-08 Versión 01

Página 4 de 12

metabolizados por las bacterias que se encuentran en el agua. La mezcla de muestra/reactivo se agrega a Quanti-Tray*, se incuba y luego se examina para pocillos fluorescentes. La cantidad de pocillos fluorescentes corresponde a un número más probable (most probable number, NMP) de organismos heterótrofos totales en la muestra original. El HPC para la prueba Quanti-Tray detecta organismos en 1 UFC/100 ml luego de 44 a 72 horas de incubación 6.4.2. DETERMINACION MICROBIOLOGICA CUANTITATIVA

Agregar el contenido del reactivo a una muestra de 100 ml de agua en un recipiente estéril.

Tapar el recipiente y agitarlo hasta que el reactivo se disuelva.

Verter la mezcla de muestra/reactivo dentro de una Quanti-Tray o Quanti-Tray*/2000 y sellar utilizando un Quanti-Tray* Sealer.

Colocar la bandeja sellada en una incubadora a 35°C ±0.5°C durante 48 horas. Los resultados son válidos en un rango entre las 45 y 72 horas.

Interpretar los resultados de acuerdo con la tabla de interpretación de resultados que figura más adelante. Consultar la tabla del NMP facilitada con las bandejas para obtener el número más probable.

6.5. INTERPRETACION DE RESULTADOS Pasado el tiempo de incubación examine los pozos de la bolsa para ver si hay o no crecimiento de microorganismos, para esto tenga en cuenta: Coliformes Totales y E-Coli

Aspecto Resultado

Pozos Incoloros Negativo para Coliformes totales y E-Coli

Pozos de color Amarillo Positivo para Coliformes Totales

Pozos de Color Amarillo y Fluorescente Positivo para E-Coli

Mesofilos o Heterótrofos

Aspecto Resultado

Pozos con fluorescencia Azul Positivo para Organismos Heterótrofos

Pozos sin fluorescencia Azul Negativo para Organismos Heterótrofos

Cuente los pozos positivos grandes y registre el resultado en el formato, enseguida cuente los pozos pequeños positivos y registre también en el formato. Para el reporte del resultado final consulte la tabla de NMP.- Quanti-tray /2000, que se encuentra en la parte superior del mesón, busque el número de los pozos grandes en la primer columna (números colocado verticalmente, al lado izquierdo de esta), y en la parte superior de la tabla ubique el número de pozos pequeños. Reporte el dato del punto de encuentro entre la fila y la columna en el formato de registro bajo la columna correspondiente.

DETERMINACIÓNES DE METODOS MICROBIOLOGICOS Código LB-PR-08 Versión 01

Página 5 de 12

Notas:

1. Buscar fluorescencia usando una luz UV de 6 vatios, 365 nm a distancia de unas 5 pulgadas (13 cm) de la muestra, en un entorno oscuro. Apuntar el haz de luz en dirección contraria a los ojos y hacia la muestra.

2. Los resultados de Colilert se deben leer a las 24 horas de incubación. Es posible

prolongar el tiempo de lectura 4 horas más, hasta las 28 horas, para que en caso de duda el color o la fluorescencia se intensifiquen. Los resultados positivos para Coliformes totales y E. coli antes de las 24 horas y negativos tras 28 horas también son válidos.

3. Si la respuesta cromogénica es cuestionable (amarillo no es nítido o no corresponde

exactamente al patrón) después de 24 horas incubar 4 horas adicionales. Si el cromógeno se intensifica, la muestra es positiva para coliformes totales si no, es negativa.

4. Los resultados del HPC para Quanti-Tray son definitivos a las 45 a 72 horas

6.6. MANEJO DE QUANTY TRAY

Sostenga en una mano el dispositivo Quanti-Tray* en posición vertical, con el lado de las celdas orientado

hacia la palma

Apriete la parte superior del dispositivo Quanti-Tray de modo se doble hacia la palma.

DETERMINACIÓNES DE METODOS MICROBIOLOGICOS Código LB-PR-08 Versión 01

Página 6 de 12

Abra el dispositivo Quanti-Tray tirando de la lengüeta metálica del lado que contiene las celdas. Evite tocar el

interior de la lengueta o del dispositivo

Vierta la mezcla de reactivo y la muestra directamente dentro del dispositivo Quanti-Tray, evitando tocar la lengüeta. Golpear los pequeños pocillos 2 ó 3 veces

para eliminar posibles burbujas de aire. Deja reposar la espuma.

Coloque el dispositivo Quanti-Tray lleno de la muestra sobre el portadispositivo de goma del selladora Quanti-

Tray, orientando el lado de las celdas de plástico del dispositivo hacia abajo en el molde

6.7. CONTROL DE CALIDAD La calidad del agua para reactivos, se verifica antes de su uso. Para análisis Microbiológico se debe cumplir con las siguientes especificaciones:

Test Frecuencia Límite Máx

Análisis Químicos

Conductividad Cada Lote < 2 µS/cm

COT Mensual <1.0 mg/L

Cloro Residual Cada Lote < 0.1 mg/L

Metales Pesados

Anual <0.05 mg/L

Análisis Bacteriológicos

Heterótrofos Mensual < 500 UFC/mL

DETERMINACIÓNES DE METODOS MICROBIOLOGICOS Código LB-PR-08 Versión 01

Página 7 de 12

Realizar diariamente control del blanco, controles positivos y negativos del método, duplicados de aguas naturales (crudas) a la par con el procesamiento de las muestras.

7. DESCRIPCION DEL PROCEDIMIENTO

ETAPAS DESCRIPCIÓN DE LA

ACTIVIDAD RESPONSABLE REGISTRO

PUNTO DE CONTROL

1

Alistamiento de áreas y materiales: Realiza la limpieza y desinfección de áreas antes y después de realizar los análisis. Alista todos los materiales y equipos necesarios para realizar la prueba

Analista

LB-FR-14 Limpieza y

Desinfección de Áreas

LB-FR-06 Verificación de

Balanza LB-FR-07

Verificación de pH-metro LB-FR-08

Verificación de Conductidimetro

LB-FR-10 Verificación de

espectrofotometro HACH

LB-FR-11 Verificación de Turbidimetro

Se realiza verificación de

las condiciones

ambientales y del lavado de

material

3

Alistamiento de Muestras: Dispone de la muestra y revisa que esta se encuentre en las condiciones requeridas para realizar la prueba (temperatura ambiente). De ser necesario realiza diluciones de la muestra de acuerdo a su aspecto, color y procedencia (ver numeral 6.1). Para cada muestra a analizar

Analista

LB-FR-18 Determinaciones Microbiologicas

No Aplica

DETERMINACIÓNES DE METODOS MICROBIOLOGICOS Código LB-PR-08 Versión 01

Página 8 de 12

ETAPAS DESCRIPCIÓN DE LA

ACTIVIDAD RESPONSABLE REGISTRO

PUNTO DE CONTROL

alista dos recipientes, uno para análisis de Coliformes Totales y E-Coli por el método de Colilert y otro para análisis de Mesófilos por el método de HPC.

6

Dilución del medio: Para cada prueba, golpee suavemente el vial tres veces sobre la mesa para que el contenido quede en el fondo del recipiente. A 100 mL de la muestra se le adiciona el contenido de un vial, desprenda la parte superior teniendo en cuenta de agregar todo el contenido.

Analista No Aplica No Aplica

8

Sellado del Quanti-try: Mezcle de manera que se disuelva completamente, luego vierta toda la suspensión a una bolsa de Quanti-tray, tomándola con la mano izquierda con los pozos hacia la palma de la mano, dejando caer el líquido sobre el papel de aluminio, golpear suavemente el extremo inferior de la bolsa con el mesón para sacar las burbujas, se deja en reposo hasta que se observe la desaparición de las burbujas. Colocar la bolsa sobre la plantilla de caucho haciendo que los pozos de la bolsa coincidan con los orificios de la plantilla, y la parte superior de la bolsa (boca) dirigida hacia el analista, deslice la plantilla hasta que la selladora la sujete con los rodillos e inicie el sellamiento. Recupere la bolsa sellada que se desplaza a la parte posterior de la misma.

Analista No Aplica

Revise visualmente que quede muestra en todos los

cuadros del quanti-try,

aunque no es necesario que estén llenos.

DETERMINACIÓNES DE METODOS MICROBIOLOGICOS Código LB-PR-08 Versión 01

Página 9 de 12

ETAPAS DESCRIPCIÓN DE LA

ACTIVIDAD RESPONSABLE REGISTRO

PUNTO DE CONTROL

10

Incubación final: Verifique que la bolsa esté bien sellada e incube según las disposiciones de la prueba. La posición de la bolsa en la incubadora no tiene importancia debido a que la temperatura en es uniforme. Transcurrido el tiempo cuente los pozos de color según se indica en la sección de interpretación de resultados. Para emitir el resultado, usar la tabla proporcionada por el proveedor que está localizada en la parte superior del mesón de microbiología.

Analista LB-FR-18

Determinaciones Microbiologicas

No Aplica

13

Control de Calidad: Analice los resultados de control de calidad del día. Reporte los duplicados en el formato, revise los controles positivos y negativos y la calidad del agua tipo reactivo

Analista LB-FR-19

Precisión de Métodos MB

Revise que se cumplen los límites de

control establecidos

por el laboratorio

8. DOCUMENTOS Y REGISTROS REFERENCIADOS

NOMBRE CÓDIGO RESP. ARCHIVAR

Determinaciones Microbiológicas LB-FR-18 Analista

Precisión de Métodos Microbiológicos LB-FR-19 Analista

Verificación de pH-metro

LB-FR-07 Analista

Verificación de Conductidimetro

LB-FR-08 Analista

Limpieza y Desinfección de Áreas

LB-FR-14 Analista

DETERMINACIÓNES DE METODOS MICROBIOLOGICOS Código LB-PR-08 Versión 01

Página 10 de 12

LB-FR-06 Verificación de Balanza

LB-FR-06 Analista

Verificación de Turbidimetro LB-FR-11 Analista

Verificación de espectrofotometro HACH

LB-FR-10 Analista

9. CONTROL DE CAMBIOS

VERSION DESCRIPCION DEL CAMBIO FECHA

01 Creación del documento 2017/08/09

DETERMINACIÓNES DE METODOS MICROBIOLOGICOS Código LB-PR-08 Versión 01

Página 11 de 12

10. ANEXOS

ANÁLISIS DE PRECISION DE ENSAYOS MICROBIOLOGICOS (MANEJO DE DUPLICADOS) Se calcula la precisión de los análisis por duplicado de cada tipo de muestra estudiada (agua cruda, agua para consumo) de acuerdo con el siguiente procedimiento: Se realizan análisis por duplicado de las primeras 15 muestras positivas de un tipo de agua en concreto. Cada grupo de duplicados lo realizará el mismo analista, aunque participarán todos los analistas del laboratorio. Se registrarán los análisis duplicados como D1 y D2. Se calcula el logaritmo (L1 y L2) de cada resultado, si en algún grupo de duplicados uno de los resultados es cero, se sumará 1 a ambos valores antes de calcular los logaritmos. Se calcula el rango del logaritmo (Rlog) determinando el valor absoluto entre la diferencia de los

logaritmos L1 y L2 para cada muestra. Se realiza la sumatoria de los resultados (∑ Rlog) de las 15 muestras analizadas.

Se determina el promedio de la sumatoria (R̅ = ∑ Rlog

n)

Se determina el criterio de aceptación del método aplicando la fórmula:

Criterio de aceptación = 3.27R̅ En cada caso, identifica la Aceptación del Rango, siendo: Aceptable (A), si Rlog ≤ Criterio de aceptación

Inaceptable (U), si Rlog > Criterio de aceptación

Se digitan los datos en LB-FR-19 Precisión de Métodos MB ESpecificando: Parámetro de control. Método de análisis, se hace referencia al código del método normalizado (en caso de Estándar Methods, SM) y a la técnica especifica de análisis utilizada. Ejemplo: SM 9223B, Colilert. Unidades: Según corresponda (NMP de microorganismos/mL) Tipo de Muestra: Agua Cruda – Agua de consumo Carta N°: Relación numérica de la carta control (se inicia con la cero) Criterio de Aceptación: La carta cero no reporta, la carta 1, reporta como criterio de aceptación el dato de criterio final de aceptación indicado en la carta 0, y así sucesivamente. Nota: Cada 15 muestras se calcula el criterio de aceptación, el cual cambia para la siguiente carta de precisión, el laboratorio verificará las variaciones que se presenten y determinará según este análisis si la precisión del método mejora.

DETERMINACIÓNES DE METODOS MICROBIOLOGICOS Código LB-PR-08 Versión 01

Página 12 de 12

Para cada análisis, se verifican los valores obtenidos de los duplicados, revisando siempre que no se sobrepasen los valores del criterio de aceptación. Si se sobrepasa el valor del criterio de aceptación, se realizará alguna de las siguientes acciones según aplique: -Si una medida supera el criterio de aceptación, se repetirá el análisis y se verificarán las condiciones iniciales de la prueba, en busca de un error sistemático o instrumental. -Si existen dos medidas que sobrepasen el criterio de aceptación, se debe detener el análisis, verificar calibraciones, estandarizar reactivos, preparar soluciones y repetir controles por triplicado para garantizar la estabilidad de la corrección aplicada. *Posibles fallas a detectar dependiendo del método:

a. Revisar calibración de equipos en los rangos aceptables. b. Preparación de soluciones y medios de cultivo. c. Toma de Muestra d. Verificar lavado de material. e. Verificar limpieza de las áreas

Se debe reportar el ensayo no conforme en su respectivo formato y proceda según dicho procedimiento.