Diagnòstic microbiològic precoç de la sèpsia

M. GiménezServei de Microbiologia HUGTiPBarcelona, 19 de Gener de 2012

Importància diagnòstic ràpid sèpsia

Diagnòstic ràpid Sèpsia/ Agent causal/Antibiograma

Presa de decisions clíniques• Instaurar tractament antibiòtic i de suport• Modificar tractament• Restringir espectre antibiòtic• Reingrés pacient alta urgències

Evolució dels pacients: morbi-mortalitat

Diagnòstic ràpid Fase inflamació

Tractament immunomodulador?Evolució i Pronòstic

The estimated risk of death from BSI varied considerably according to the source and resistance of organisms, time to onset, and appropiateness of

treatment. CID 2006; 42:1118-26.

(1980-1990)

Septi-chekR (BBL)Medi bifàsic (Ruiz-Castañeda) Sistèmes semiautomàtics

Eina diagnòstica de la sèpsia: hemocultiu

Automatització:Major rapidesa de temps de deteccióMajor sensibilitatReducció càrrega de treball

Sistemes automàtics d’hemocultius

BacT/AlerT. (bioMérieux)

Charcoal

Sistema automàtic de lectura continua

Bactec BD

Resines Quelant atb

Mecànic

Sistema automàtic de lectura continua

Rendiment de l’hemocultiu

SENSIBILITAT ESPECIFICITAT

VOLUM DE SANGVOLUM DE SANG

FALSOS NEGATIUS

Capacitat flascó Pediàtric: 3 mL Capacitat flascó Adult: 10 mL

Rendiment de l’hemocultiu

SENSIBILITAT ESPECIFICITAT

VOLUM DE SANGVOLUM DE SANG

FALSOS NEGATIUS

MÈTODE D’EXTRACCIÓ

LLOC EXTRACCIÓ

FALSOS POSITIUS

• Mètode d’extracció:– Tècnica asèptica:

• Rentat pell del pacient• Antisèpsia• Mascareta

• Lloc d’extracció:– Vena perifèrica– NO catèter

• Contaminacions:– Estafilococs coag. neg.– S. grup viridans– Corynebacterium sp.

Especificitat

[>24 h d’incubació]

7,4

55,4

4,34,9

3,6 3,4

2,533

0

1

2

3

4

5

6

7

8

2000 1 2 6 7 8 9 10 11

Vigilància i control

Contaminacions urgències pediatria

Hemocultiu convencional

Tinció de Gram, un cop detectat creixement

BGN enterobactèria Pseudomonas Diplococs gram positius CGP estafilococ

Antibiograma

Creixement i tècniques identificacióRessembra medis selectius

i enriquits

48-72h

10’

800rpm 3000rpm

10’McF=1

Identificaciói antibiograma

Clin Microbiol Infect 2010; 16: 137-140.

Sèpsia per bacils gramnegatius (BacT/AlerT)

Vitek-2 Compact: Temps identificació: 4,57 ± 1,37 hTemps sensibilitat: 6,52 ± 1,64Microscan: Identificació i antibiograma: 18-24 h.

Mètode convencional: 17h + 24h (I. medi cultiu) + 24h (I. Id. i atb) ~ 65h

Mètode convencional + Vitek:17h + 24h (I. medi cultiu)+ 6h (Id. i atb) ~ 47h

Vitek directe hemocultiu: 17h + 6h (Id. i atb) ~23h

24-48h abans que mètode

convencional!!

Clin Microbiol Infect 2010; 16: 137-140.

10’

750g-2’ 2500g-5’

McF=1.5-2

5’

Identificaciói antibiograma

Performance of Vitek-2 Compact for Direct Identification and Susceptibility Testing of Gram-positive cocci from Positive FAN BacT/ALERT Blood Culture Bottles

M.Giménez, M.D Quesada, S.Molinos, J.Hidalgo, M.C. Colomer, Y.Hernández, V. AusinaHospital Universitari Germans Trias i Pujol. Badalona. Spain

Sèpsia per estafilococs i enterococs (BacT/AlerT)

EspeciesNº aislamientos

Identificaciócorrecta

No identificats Mal identificats

Staphylococci (88)

S.aureus 53 42 (80%) 4 7a

S.epidermidis 25 24 (96%) 0 1b

Otros coagulasa negativos 10 8 2 0

Micrococcus luteus 1 1 0 0

Enterococci (25)

E.faecalis 18 17(94.5%) 0 1c

E.faecium 7 3 (43%) 0 4d

Total 114 95 (83,3%) 6 13

ª S.intermedius (2), Kocuria spp.(2), Aerococcus sp.(1), S.cromogenes (1), S.caprae (1)b Kocuria sp.c E.gallinarum d E. faecalis (1), E. gallinarum (3)

Sèpsia per estafilococs i enterococs (BacT/AlerT)

•2 (1.09%)

•0

•3 (0.68%) •1(0.41%) •434 (98.63%)•440• Total

•241 (99.17%)•243• Resistant

•13 (86.6%)•15• Intermediate

•180 (98.9%)•182• Susceptible

•Enterococcci

•5 (0.37%)•6* (2.23%)•1329 (99.17%)•1340• Total

•261(97.02%)•269• Resistant

•26(89.65%)•29• Intermediate

•1042(100%)•1042• Susceptible

•Staphylococci

•No.of major errors

•(%)

•No.of minor errors

•(%)

•No.of •very major errors•(%)

•No.of strains in agreement • (%)

•No.of•antibiotics •tested

Intepretative

category

Susceptibility category agreement between direct VITEK-2 system and the reference method

*All related to Penicillin. β-lactamase was positive in all cases.Identificació(hores)

Antibiograma(hores)

Bacils gramnegatius 4,5±1,3 6,5±1,6Estafilococs 5,6±1 9,2±1,2Enterococs 3,6±1,3 9,5±3

Accuracy of Vitek-2 Compact for Rapid Identification and Susceptibility Testing Directly from

Positive Paediatric FAN BacT/ALERT Blood Culture BottlesM. D. Quesada, M. Giménez, C. Rodrigo, S. Molinos, J. Hidalgo, M. C. Colomer, V. Ausina.

Hospital Universitari Germans Trias i Pujol. Badalona. Spain.

Resultats: 35 hemocultius pediàtrics30 (85,7%) ID correcte618 combinacions d’antibiòtics: >99% concordança22/32 (68,7%) pacients: canvis en el tractament antibiòtic

Inici tractament antibiòtic: 8Canvi a un tractament antibiòtic efectiu: 3 (S. aureus, S. epidermidis,

E. cloacae BLEA)

Restricció tractament antibiòtic empíric: 11

Conclusió:•El protocol directe de flascons pediàtrics positius FAN BacT/ALERT utilitzant VITEK-2 compact és fàcil i fiable. Permet començar mesures d’aïllament o canvis en el tractament antibiòtic ~ 24 h. abans que amb els mètodes convencionals en el 68,7% dels pacients.

Sèpsia per bacils gramnegatius, estafilococs i enterococs (BACTEC)

Identificació i antibiogramaautomatitzat

Tinció de Gram, un cop detectat creixement

BGN enterobactèria Pseudomonas CGP estafilococDiplococs gram positius

(Preu: 12 eur)

10’

800rpm 3000rpm

10’McF=0,5-0,63

Impacte informació precoç de les bacterièmies

Identificació i antibiograma ràpid (6.52h ± 1.64)Iniciar precoçment tractament efectiuAjustar tractament empíricAïllament (o desaïllament) de multirresistents

37

4650 52 54 54,3

0

10

20

30

40

50

60

1996 2001-2004

2005-2006

2007-2009

2010 2011

Bacteriemia por Staphylococcus aureus complicada Implicación de los factores de virulencia de la cepa

Factores de virulencia nº pacientes (% el total)

CHIPS 52 ( 74,3%)SCIN 50 ( 71,4%)PVL 2 (3%)

TSST-1 12 ( 17,2%)Enterotoxinas 37 ( 53%)

mecA 13 ( 18,6%)Factores de virulencia

Factores de virulencia nº pacientes (% el total)

CHIPS 52 ( 74,3%)SCIN 50 ( 71,4%)PVL 2 (3%)

TSST-1 12 ( 17,2%)Enterotoxinas 37 ( 53%)

mecA 13 ( 18,6%)Factores de virulencia

bacteriemia de origen en el catéterPVL2 pacientes foco en un absceso isquio-rectal

mec A13 pacientes

9 Complicaciones

6 Shock séptico4 Metástasis sépticas

Foco aparente7 catéter2 EHQ4 cutáneo

tst12 pacientes

10 curación

1 recidiva1 exitus relacionado

En ningún caso se encontraron eta, etb( toxinas exfoliativas)

chp se relacionó con la presencia de complicaciones (86,2%), pacientescon shock séptico (94,4% ), con una diferencia estadísticamentesignificativa.

Entre tst y el foco de origen o el desarrollo de complicaciones no seencontró relación. Tampoco con los demás factores de virulencia

Conclusiones

1. La mayoría de bacteriemias por S.aureus son nosocomiales y de origen en el catéter.

2. El 41,4% de los pacientes presentan complicaciones. Las más frecuentes fueron metástasis sépticas y shockséptico.

3. El tratamiento diferente a cloxacil·lina es un factor de riesgo de evolución desfavorable

4. La presencia de CHIPS se relaciona significativamente con la evolución a shock séptico.

nº pacientes=71

Sèpsia per S. aureus .Detecció precoç.

A B

C D

S.aureus S.epidermidis

Flascó anaerobi Flascó anaerobi

Flascó aerobi Flascó aerobi

Cèl·lules petites ( <1μm)Grans agrupacions

Cèl·lules grans(≥1 μm)Petites agrupacions

Cèl·lules grans(≥1 μm)Agrupacions 8-32 cèl·lules

Cèl·lules variablesPetites agrupacions

Murdoch D R et alJ.Clin Pathol 2004; 57:199-201

Sèpsia per S. aureus .Tinció de Gram.

Prova S (%) E (%) VPP (%) VPN(%)

PC en tub(Preu: 5 €)

84,1 100 100 88,9

Rapidec Staph(bioMerieux)

(Preu: 5 €)

95,7 98,9 98,5 96,7

PNA FISH(AdvanDx)

98,6 100 100 98,9

Chapin et al. J Clin Microbiol 2003; 41: 4324-4327

Diferenciar S. aureus /ECN directament de l’hemocultiu

2h

Prova S (%) E (%) VPP (%) VPN(%)

PC en tub(Preu: 5 €)

84,1 100 100 88,9

Rapidec Staph(bioMerieux)

(Preu: 5 €)

95,7 98,9 98,5 96,7

PNA FISH(AdvanDx)

98,6 100 100 98,9

Chapin et al. J Clin Microbiol 2003; 41: 4324-4327

Diferenciar S. aureus /ECN directament de l’hemocultiu

157/1*ECN

10099,299,4100128/128S. aureusVPN (%)VPP (%)E (%)S (%)HC+/Prova +Microorg.

* Staphylococcus schleiferiClumping factor

DNA asa

•Microscopi de fluorescència•Objectiu especial

2h

Temps procediment“in hands”: 30’

S. aureus PNA FISH

Identificació S.aureus Detecció PBP2a

30’

Temps procediment“in hands”: 20’

Preu: 20€

• Mostres: 94 flascons positius (36 pacients)*• S. aureus: 77 (82%), 15 (19,4%) SARM• S. epidermidis: 17 (18%)• S: 100%• E: 100%• VPP I VPN: 100%

* 3 flascons no va surtir el control positiu

RESULTATS:

Sensibilitat: 91% (Mixtes)Preu: 60 €

GeneXpert System (Cepheid-Izasa)

75’

GENOMERA MRSA/SA (ABACUS Diagnostica-Alere)

50’

Resultat: 16 mostres concordants amb mètode de referència

MALDI-TOF-MS (Espectòmetre de masses)

• Protocol:– 200 µL + 40 µL (5% saponina): 5’– Aigua destilada fins 1,5 mL: 2 rentats a

16.600 g 1’.– Sediment: 5 µL ac. trifluoroacètic 10%– 1 µL tarjeta MALDI (protocol espectr.)– Mixtes: millora tinció Gram.

Ferroni A, Suarez S, Beretti JL et al. JCM 2010; 1542-1548

20’

Sang

Hemocultiu Tub + EDTA

Positiu NegatiuAmplificació

PCR microorganisme-

específica

PCR- Multiplex

PCR- Universal

Cultiu convencional

Identificació proteïnes

Identificació ac. nucleics

Espectrometria

Hibridació

Amplificació

FISH

PCR específicaPCR universal

Piroseqüenciació

Microarray

15h 15h

SeptiFAST (Roche)Microorganismes inclosos en l’assaig

Protocol

Vi sang: 3mLPas de lisis previPCR a temps real: identificació dels microorganismes per diferents sondes

Internal Transcribed Spacer Region

(ITS)

• Multiple copies• Well investigated• Excellent for differentiation

16 S 23 SITS

Multi-copy target regions

Preu per mostra: 289 €

6 h

SeptiFAST: ResultatsComparació resultats obtinguts SepstiFAST/Hemocultius

Article N mostres Sensibilitat Especificitat VPP VPNWesth, H et al Clin Microbiol Infect, 2009;15:544-51 558 68% –a) –a) –a)

Avolio, M et al. Shock, 2010;34(1), 27-30 144 –a) 90,10% 75% 96,80%

Josefson, P et al. Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 2011;30(9)1127-34 1093 –b) 98% –b) 97%

a) No especificat a l'articleb) especificat per a cada microorganisme de l'assaig, no valors generals

Josefson, P et al. EJCM 2011; 30; 1127-34. Sensibilitat i VPP segons microorganisme

PLEX-ID (Abbott Molecular)Microorganismes inclosos en l’assaig

Protocol

Vi sang: 1,250 mLPas de lisis previPCR convencionalIdentificació dels diferents microorganismes per espectrometria de masses (ESI-MS) (composició de bases dels fragments de PCR)

Primers universals, no limitació de detecció

Preu per mostra: 70-100 €Inversió prèvia en tecnologia

6-8 h

Identificació convencional del patogen

Sang total Hemocultiu

MOSTRES D’ESTUDI

DNA Sang directa

DNA Hemocultius

MOSTRES CLÍNIQUES

Identificació molecular del patogen mitjançant el PLEX-IDAmplificació amb primers universals

Detecció per espectometria de masses (ESI-MS)

PCR

PLEX-ID

PLEX-ID: Resultats

32; 39%

6; 7%

44; 54%

Igual ID PCR/HCDiferent ID PCR/HCNo detecció PCR

Nº Mostres Sensibilitat Especificitat VPP VPN

232 61% 83% 72% 74%

Hemocultiu positiu monomicrobiàHemocultiu positiu polimicrobià

1; 5%4; 21%

12; 64%

1; 5% 1; 5%Igual ID PCR/HCDetecció extra PCRDetecció extra HCNo detecció PCRResultat complex

19; 15%

112; 85%

(+) PCR(-) PCR

Hemocultiu negatiu

8: SC7: contaminats4: ?

4h30’ 6-8h

SANGTOTAL

PCR-ESI-MS(PLEX-ID)

PCR multiplex(Septifast)

PCR específica microorganisme

GeneXpert(~ 2h)

MALDI(20 min)

Hemocultiupositiu

Extracció DNA

~15h ~40h-48 ~60-72 h~22h

Vitek 2 Compact

~6h

~24h ~24h

IDENTIFICACIÓ!!

IDENTIFICACIÓ!!

Mancini N, Carletti S, Ghidoli N et al. Clin Microbiol Rev 2010; 23: 235-251.

Importància diagnòstic precoç sèpsia

Diagnòstic ràpid Sèpsia/ Agent causal/Antibiograma

Presa de decisions clíniques• Instaurar tractament antibiòtic i de suport• Modificar tractament• Restringir espectre antibiòtic• Reingrés pacient alta urgències

Evolució dels pacients: morbi-mortalitat

Diagnòstic ràpid Fase inflamació

Marcadors de l’inflamació

The estimated risk of death from BSI varied considerably according to the source and resistance of organisms, time to onset, and appropiateness of

treatment. CID 2006; 42:1118-26.

Mesura de citocines:ràpid turnover, vida mitja curta en plasma, factors bloquejants,

producció compartimentalitzada

Marcadors d’inflamació. Hem de triar….

Increment en sèrum/plasma en resposta a infecció o dany tissular Vida mitja més llarga

Menys variació en els nivells diarisEstables in vivo i ex vivo

Fàcil mesura

IL-6, IL-8,sTREM-1

Proteïnes de fase aguda

“Hormokines”

Regulades per citocines Hormones amb comportament “citocina-like” durant la sèpsia

Proteïna C reactivaNeopterina

Procalcitonina

EJCMID 2004; 23: 136-138

Evaluation of procalcitonin, neopterin, IL-6 and IL-8 as a diagnostic marker of infection in patients with febrile neutropenia.

Cristina Prat1, Juan Manuel Sancho2, Josep Domínguez1, Blanca Xicoy2, Montse Giménez1, Christelle Ferrà2, Silvia Blanco1, Josep Maria Ribera2 and Vicenç Ausina1

1Servei de Microbiologia, 2Servei d’Hematologia. Hospital Universitari Germans Trias i Pujol. Badalona. Universitat Autònoma de Barcelona, Spain

Leukemia & Linfoma 2008; 49; 1752-1761.

Serum Concentrations of Procalcitonin After Cardiac Surgery

C. Prat1, P.Ricart2, X.Ruyra3, J.Domínguez1, J.Morillas2, S.Blanco1, T.Tomasa2, T.Torres2, L.Camara3, A.Pallarés1 and V.Ausina1

1Servei de Microbiologia, Hospital Universitari Germans Trias i Pujol, Badalona, Spain. Facultat de Medicina. Universitat Autònoma de Barcelona, Barcelona, Spain, 2Servei de Medicina Intensiva, Hospital Universitari Germans Trias i Pujol,

3Servei de Cirurgia Cardíaca, Hospital Universitari Germans Trias i PujolJ Card Surg 2008; 23: 627-32.

Marcadors d’inflamació

Conclusions

• La procalcitonina és un marcador sensible i específic d’infeccióbacteriana sistèmica

• Neutropènics: nivells de PCT són mes elevats en la sèpsia per gramnegatius a les 24-48 h. Tendència a nivells més alts en infeccions fúngiques al 4-5 dia.

• Les determinacions seriades de marcadors tenen un valor pronòstic.

• És probable que l’òptima rendibilitat s’obtingui amb l’adequada

combinació de marcadors, i l’adequada selecció de pacients.

• L´ús de marcadors no ha de substituir mai un correcte diagnòstic i

seguiment clínic i microbiològic.

Marcadors d’inflamació

GRÀCIES

Meningitisbacteriana: 25 pacientesNeisseria meningitidis: 18 pacientesStreptococcus pneumoniae: 6 pacientesHaemophilus influenzae: 1 paciente

Meningitis aséptica: 18 pacientesHemocultivos y cultivos LCR negativosAnálisis LCR compatible

Infección bacteriana localizada: 22 pacientesConjuntivitis purulenta, otitis meda aguda, sinusitis, faringitis estreptocócica

Sèpsia i Meningitis

Cut- off PCT 2 ng/mlCRP 40 mg/L

Meningitis bacteriana vs asèptica:Sensibilidad PCT 100% CRP 88%Especificidad PCT 100% CRP 72.2%

Meningitis bacteriana vs infecció localitzada:

Sensibilitat PCT 100% CRP 88%

Especificitat PCT 100% CRP 50%

PCT es un marcador sensible i específic d’ infecció bacteriana sistèmica.

Evaluation of procalcitonin, neopterin, IL-6 and IL-8 as a diagnostic marker of infection in patients with febrile neutropenia.

Cristina Prat1, Juan Manuel Sancho2, Josep Domínguez1, Blanca Xicoy2, Montse Giménez1, Christelle Ferrà2, Silvia Blanco1, Josep Maria Ribera2 and Vicenç Ausina1

1Servei de Microbiologia, 2Servei d’Hematologia. Hospital Universitari Germans Trias i Pujol. Badalona. Universitat Autònoma de Barcelona, SpainLeukemia & Linfoma 2008; 49; 1752-1761.

Febre neutropènica

Pacients amb neoplàsia hematològica.Tractament inducció, consolidació o TAPH.

Febre neutropènica

Febre documentada microbiològicament. 26 pacientsBacterièmia primària. 12 pacientsBacterièmia d’origen en el catèter. 7 pacientsInfecció respiratòria. 1 pacientInfecció urinària. 6 pacients

Febre sense documentació microbiològica d’infecció. 31 pacientsInfecció fúngica probable. 4 pacientsMucositis. 18 pacientsFebre d’origen desconegut. 9 pacients

P=0.007

P=0.412 P=0.422

P=0.143

Nivells de PCT més elevats en bacterièmia per gramnegatius a les 24-48 h

Nivells de PCT més elevats en infeccions fúngiques al 4rt-5 dia

Post-operats cirurgia cardíaca

Serum Concentrations Of Procalcitonin After Cardiac Surgery

C. Prat1, P.Ricart2, X.Ruyra3, J.Domínguez1, J.Morillas2, S.Blanco1, T.Tomasa2, T.Torres2, L.Camara3, A.Pallarés1 and V.Ausina1

1Servei de Microbiologia, Hospital Universitari Germans Trias i Pujol, Badalona, Spain. Facultat de Medicina. Universitat Autònoma de Barcelona, Barcelona, Spain, 2Servei de Medicina Intensiva, Hospital Universitari Germans Trias i Pujol,

3Servei de Cirurgia Cardíaca, Hospital Universitari Germans Trias i PujolJ Card Surg 2008; 23: 627-32.

Cirurgia cardíaca: 151 pacientsBypass CPB: 69 pacients

Recanvi valvular: 69 pacientsOff-pump bypass: 13 pacients

Complicacions. Infeccioses: 7 pacientsNo infeccioses: 8 pacients(shock cardiogènic, insuficiència renal)

Cirurgia cardíaca amb bypass cardiopulmonar (CPB)Clampatge aòrtic Exposició de la sang a superfícies no fisiològiques Alliberament d’endotoxines SIRS

Discret augment nivells de PCT en el primer dia post-operatoriElevació significativa només en presència de complicacions

No elevació en relació a temps de CPB, temps de clampatge aòrtic o temps de VM

Predicció de bacterièmia a urgències