Dialnet-ObtencionDeAzucaresFermentablesAPartirDeInulinasas-2695331

7/24/2019 Dialnet-ObtencionDeAzucaresFermentablesAPartirDeInulinasas-2695331

1/6106

C i e n c i a y T e c n o l o g a

Obtencin de azcares fermentables a partir de inulinasasinmovilizadas por el mtodo de sol-gel

Leandro Rodrigo Gonzlez-Gonzlez1,2, Ignacio Garca Martnez1,2, Rafael Prez Bedolla2,

Karla Lorena Gutirrez Paredes1y Anayeli Garca Cruz1

1Universidad Simn Bolvar, 2Tecnolgico de Estudios Superiores de Ecatepec.

Resumen

El objetivo de este trabajo fue determinar el contenido de azcares reductores disponibles

por efecto de la inulinasa inmovilizada mediante el mtodo de sol-gel, que consiste en la

formacin de redes slidas compuestas por elementos inorgnicos; posterior a esto se de-

termin la actividad de la enzima inmovilizada con sustrato de inulina de Agave tequilana

Weber var. Azul; con esto se logr cambiar las condiciones que en operacin existen, re-

duciendo tiempos originados por la adicin de cido que hidroliza la inulina y la posteriorneutralizacin con lcali.

Palabras clave:inulinasas, azcares reductores, fructanos, sol-gel.

Abstract

The objective of this work was to determine the content of sugar reducers for the effect of

the immobilized inulinase by means of the sol-gel method, which consists in the formation

of solid nets composed by inorganic elements, and afterwards to determine the activity of

the immobilized enzyme with substrate of inuline of Agave tequilana Weber var. Azul. Withthis, the existing conditions in operation were found to change, reducing times originated

by the addition of acid that hydrolyzes inuline and the later neutralization with alkali.

Keywords:inulinases, sugar reducers, fructans, sol-gel

Introduccin

A partir de la segunda mitad del siglo XX se intro-dujeron en la industria alimentara los jarabes de

fructosa obtenidos del maz, lo que ha impactadoen la economa de los pases productores de azcarde caa. En estos ltimos aos, se han puesto enevidencia los nuevos escenarios en los que la fruc-tosa juega un papel central. Es en este sentido quedestacan las fructanas, nombre genrico que se daa compuestos constituidos por largas cadenas demolculas de fructosa unidas qumicamente y que enforma de inulina o de levana constituyen el reservo-rio energtico de una amplia diversidad de plantasde las cuales se incluye a tubrculos de la alcachofa

de Jerusaln (Helianthus tuberosus L.) y dalia (Dahliapinnata Cav.), los bulbos de iris (Iris sp) y las racesde dientes de len (Taraxacum oficinales Weker)y la achicoria (Chicorium intyvus L.) o los agaves,

de la misma forma se ha encontrado la inulina envarias hortalizas y cereales tales como cebolla, ajo,alcaucil, puerro, esprrago, y trigo (Arrazola, 1969;Wesche, 2000).

La inulina es un polmero lineal compuesto de ca-denas de 25 a 35 residuos de fructosa unidas porenlaces glucosdicos (2 1) y termina con unamolcula de sacarosa (figura 1).

INVESTIGACIN UN IVERSITARIA MULTIDISCIPL INA RIA - AO 6, N6, DICIEMBRE 2007


2/6107


Algunos fructanos son ramificados, que en su con-junto forman un polvo blanco que est conformadopor una mezcla de poli y oligosacridos con unamisma estructura qumica GFn (G: Glucosa, F: Fruc-tosa y n: nmero de unidades de fructosa ligadasuna a la otra). El nmero mximo de unidades de

fructosa en la inulina, extrada de la achicoria, porejemplo, es alrededor de 60 (Singh, 2006).

De la inulina es posible obtener, mediante su hi-drlisis enzimtica parcial, diferentes compuestoscomo la oligofructosa, que consiste en una mezclade oligosacridos que es desarrollada para finesalimenticios (Marquina, 2005).

Recientemente se ha reportado que la inulina, comola oligofructosa son rpida y totalmente fermenta-das por la microflora intestinal, siendo por tanto unprebitico y, como tal, puede ser combinado ven-

tajosamente con cultivos probiticos en productoslcteos fermentados (Marquina, 2005).

Su propiedad tecnolgica va an ms all, puespermite reemplazar la grasa por fibras alimentarasen diferentes tipos de productos lcteos. Estabilizael agua en una estructura cremosa con la mismasensacin bucal que la grasa (Wesche, 2000).

Actualmente se emplean tres procesos para la ob-tencin de jarabes fructosados a partir de agave:

1) Evaporacin y concentracin de extractosobtenidos de la coccin y prensado de laspias de agave

2) Evaporacin y concentracin de hidrolizadoscon cidos minerales

3) Evaporacin y concentracin de hidrolizadoscon enzimas comerciales

De stos, los productos de pias cocidas e hidrlisiscida presentan la limitante de obtener jarabes debaja pureza con txicos como el hidroximetilfurfu-ral y sus hidrolizados enzimticos presentan des-ventajas asociadas al costo parcialmente elevadopor el uso de enzimas comerciales (Lpez-Mungua,2007; Bautista, 2001).

La inulina est ligada a una de las industrias degran tradicin, la tequilera: siendo abundanteen las pias maduras de Agave tequilana, Webervar. Azulque contiene aproximadamente 75% decarbohidratos, de los cuales se han identificado glu-cosa, dextrinas, almidn, levanas y principalmenteinulina. Para la produccin de tequila los carbo-hidratos del agave se hidrolizan por un procesotrmico dando varias molculas de azcares librescomo la fructosa, alrededor del 20% de sacarosay el trisacrido 1, -fructosil inubiosa (Feingold,1956 y Takashi, 1955, citados por Arrazola, 1969).

La hidrlisis cida del jugo de agave afecta el ren-dimiento y el tiempo de fermentacin alcohlicadebido a las reacciones colaterales, con la conse-cuente disminucin de la actividad microbiana en lafermentacin (Mancilla-Margalli y Lpez, 2002).

La fructosa y la glucosa presentes en el agave sondos azcares reductores que pueden ser utilizadospara obtener alcohol con un proceso de fermen-tacin, adems de que pueden interactuar con lasprotenas dando como resultado la caramelizacino reacciones de Maillard (Tllez, 1998), por lo quees posible obtener mayor contenido de azcaresreductores a partir del contacto del jugo previoa la hidrlisis cida, con el soporte de sol-gel yla enzima (2 1) fructan 1-fructosiltransferasa(inulinasa) inmovilizada.

La capacidad de la enzima en un soporte se superapor ser ms termoestable adems de que se re-portan rendimientos de 7000 g hexosa/min.mg,determinadas stas con 4% de sacarosa a 50C ypH 5.0. Estos rendimientos de la inulinasa fueron

Figura 1.Molcula de inulina.

INVESTIGACIN UN IVERSITARIA MULTIDI SCIPL INARIA - AO 6, N6, DICIEMBRE 2007


3/6108


constantes en un rango de pH de 3.5 a 6.0 y conrangos de saturacin de oxgeno disuelto de 2.5 a40% de saturacin (Parekh, 1985).

El ambiente en la proximidad de la enzima inmovili-zada puede ser totalmente diferente del que preva-lece en el seno de la fase; el ambiente modificado enlas proximidades de un sistema enzimtico inmovili-zado ha mostrado algunas veces ser el responsablede los cambios en los perfiles pH-actividad, en elcaso de varias enzimas enlazadas a un acarreadorpolielectroltico. Desplazamientos de pH de 1-2.5unidades se pueden observar en medios de reaccincon valores de fuerza inica baja (Goldstein y Kat-chalski, 1968); sin embargo, este efecto se atenaa fuerzas inicas elevadas.

Objetivo

Analizar la obtencin de azcares reductoresfermentables a partir de la inmovilizacin de (2-1) fructan-fructosiltransferasa por el mtodode sol-gel, estableciendo la mejor condicin deinmovilizacin enzimtica, considerando par-metros fisicoqumicos y bioqumicos del sistemasol-gel e inulina.

Mtodo

Se emplearon muestras de inulina del desgarre deAgave tequilana Weber var. Azul y enzima inulinasa( (2-1) fructan fructosiltransferasa) de Aspergillusniger, previa extraccin (Martirosyan, 2004). Todoslos estndares usados fueron grado reactivo, SigmaChemical Co. (St. Louis Missouri, USA); los reactivosy disolventes empleados fueron grado analtico(J. T. Baker). En la primera etapa se caracteriz laenzima libre para obtener sus parmetros cinticos;acto seguido se llev a cabo la incorporacin de la

enzima en un soporte inerte llamado sol-gel.

El mtodo de sol-gel (Brinker y Sherer, 1990) con-siste bsicamente en la formacin de redes slidascompuestas por elementos inorgnicos con unaestructura reticular obtenindose por medio deuna reaccin qumica a partir de una solucinhomognea llamada sol compuesta de alcxidos,agua, solvente y catalizador de hidrlisis, la cual seinvolucra en otra solucin coloidal, efectundose

la condensacin por olacin o bien por oxolacin.La oxolacin es descrita como una dispersin departculas que tienen un dimetro aproximado de100 ; en el sol se forman miscelas suspendidas

en el lquido, las cuales aumentan de tamao enfuncin del tiempo.

En esta etapa se forman las partculas uniformesslidas, a partir de geles mediante mecanismos deexpansin y estabilizacin proveniente de aglome-raciones de slidos cuando stos son secados a 70 C,existiendo una contraccin considerable de la redcristalina capaz de estabilizar al gel; es aqu cuandola enzima es incorporada y se observa la evolucinde la estructura mediante la consolidacin del gel entiempos determinados por la formacin de pelculasuniformes en ste.

La formacin del sol-gel con la inulina atrapadarequiri de un lavado con un buffer de citrato yfosfatos para retirar la enzima libre y su posteriorestabilizacin al rango de pH ya establecido.

La determinacin de la actividad enzimtica de lainulinasa ( (2-1) fructan fructosiltransferasa) seefectu utilizando el mtodo de DNS (Miller, 1959)con un espectrofotmetro Varian Cary 50 Bio y con-trol de temperatura Lauda Instruments, que permitela cuantificacin de los azcares reductores obteni-dos a partir del cocido de agave hasta el contacto

con la enzima y la inulina parcialmente hidrolizada.Esta actividad se determin en el rango de pH de4 a 6 que corresponde al mismo de la preparacindel mosto tequilero, estas mismas condiciones detrabajo se efectuaron para la enzima atrapada y losensayos con la enzima libre.

Resultados

Los primeros ensayos se realizaron con la enzimalibre y un sustrato inicial de agave cocido, de con-

centracin de 1.00176 g/L de fructosa presente(figura 2), esto permite conocer la concentracin defructosa que se genera a los diferentes tiempos encontacto con la enzima libre; resultado expresadosin acumulacin, se alcanz una concentracinpromedio de 5 g/L a los 90 minutos que equivalea un rendimiento de hidrlisis del 40% compara-do con el mtodo de hidrlisis cido (Arrazola,1969;Parekh, 1985).



4/6109


Figura 2.Evolucin de la fructosa en contacto con enzima libre.

Se realizaron los ensayos de pH con la enzima inmovilizada y el sustrato de agave cocido, reportando lascondiciones en que ste afecta la estabilidad de la enzima en sol-gel; la mejor respuesta se obtuvo cuandoel pH alcanza un valor de 5 (figuras 3 y 4).

Figura 3.Concentracin de fructosa con enzima inmovilizada a diferentes pH.

0 20

tiempo (min)

40 60 80 100

5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

4.5

5.0

[Fructosg/L]

0 20 40 60 80 100

0

1

2

3

4

5

6

7

[

Fructosa

g/L]

pH3

pH4

pH4.5

pH5

pH5.5

pH6

pH6.5

pH7

tiempo (min)



5/6110


Es importante resaltar que la velocidad de reaccin encontrada para la enzima soportada es de 0.1541 ml-1min-1 a pH de 5 y temperatura de 35o C, condicin equivalente en la preparacin del mosto (Parekh, 1985).

Figura 4.Efecto de pH en la velocidad de reaccin para la produccin de fructosa con inulinasa inmovilizada.

2 3 4 5 6 7 8

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

0,14

0,16

VelocidaddeReaccion(ml-1

min-1)

p H

0 10 20 30 40 50 60 70 80

0. 0

0. 2

0. 4

0. 6

0. 8

1. 0

Absorbancia

tiempo (min)

Como una propiedad muy importante de las enzimas es su especificidad, se encontr que la inactivacin dela enzima se manifiesta de forma constante a lo largo de todas las resiembras (figura 5); todos los ensayos se

realizaron bajo las mismas condiciones de temperatura y pH descritas anteriormente.

Figura 5.Decaimiento de la actividad de la enzima soportada en Sol-Gel despus de varias resiembras.



6/6111


La informacin directa del mecanismo de reaccinque cataliza la especificidad de la enzima se reportaen trminos de su eficiencia, la cual en comparacincon la enzima libre 7000 g fructosa/min.mg (Parekh,

1985), manifiesta ser parecida con respecto a la inmo-vilizacin con valores de 600 g fructosa/min.mg.

Discusin

Se asume que el estado estacionario y la concentra-cin local de sustrato y producto se determinan porla velocidad de la reaccin cataltica y por las tazasde difusin del producto y del sustrato; por lo tanto,al contener la misma concentracin de los mismos, seasume que el sustrato se encuentra presente en una

monocapa. El entender este modo de accin de lasenzimas en una inmovilizacin, estableciendo la co-rrelacin que existe entre la actividad enzimtica y elflujo de sustrato sin agitacin, genera microambientesproducto de una catlisis heterognea controlada porla disposicin de la enzima inmovilizada y su sustrato(Goldstein y Katchalski, 1968).

Es de llamar la atencin que en los mtodos de in-movilizacin, siempre existe una marcada diferenciaentre la cantidad de la enzima que es atrapada y laenzima que se dispone para su inmovilizacin, ademsde que los fenmenos asociados por el transporte y la

presencia de azcares requiere de los datos asociadosa la cintica. Sin embargo, cuando una enzima estinmovilizada a un soporte slido, el comportamientocintico de la reaccin cambia considerablemente,provocando una modificacin de los valores de losparmetros cinticos de la ecuacin anterior. De estamanera, los parmetros observados, son slo aparen-tes y no intrnsecos. (Shinji, Hiroyasu y Kenji, 1993)

Conclusin

Es evidente que la enzima se ve afectada adversamen-te en el curso de la reaccin de inmovilizacin, estodebido posiblemente a la interaccin entre la protenay el polmero de soporte conduciendo a la desnaturali-zacin y de acuerdo con la tasa de reaccin, podemosestablecer que efectivamente existen efectos difusivoso electrostticas asociados.

A diferencia de una enzima soluble, la enzima soporta-da en una matriz ejerce su accin cataltica en un me-

dio ambiente heterogneo, por lo cual, los fenmenosde transporte de las especies qumicas involucradas enla transformacin, tienen un papel determinante enlas tasas de reaccin observadas.

Referencias

Arrazola, D.F. de M (1969). Estudio del contenido de azcares enla pia de agave tequilana. Tesis de Licenciatura enQumica. Universidad Autnoma de Puebla, Mxico,pp. 4 y 5.

Bautista Justo, M.; Garca Oropeza, L.; Salcedo Hernndez, R. yParra Negrete, L. A. (2001). Azcares en agaves (AgavetequilanaWeber) cultivados en el estado de Guanajua-to. Acta Universitaria Universidad de Guanajuato,11(1) 33-38.

Brinker, J. y Sherer, G. W. (1990) Sol-Gel, The Physics and Chemistryof Sol-Gel Processing:Academic Press Inc. HarcourtBrace & Company Publishers, Caps. 1 y 2, pp. 2-30

Goldstein, L y Katchalski-Katzir, E. (1968) Analitical chemical.New York, tomo 243, p. 375

Lpez-Mungua Canales, A. (2007) Caracterizacin enzimticade fructanas. Memorias del XII Congreso Nacional deBiotecnologa y Bioingeniera, Morelia Michoacn.

Mancilla-Margalli, N. A. y Lopez, M. G. (2002) Generation ofMaillard. Compounds from inulin during the thermalProcessing of Agave tequilana Weber. Var, azul. J. of

Agric. and Food Chem, 50, 806-812.

Marquina, D.; y Santos, A. ( 2005) Probiticos, prebiticos y salud.Microb Internacional, 32 (24) 1121

Martirosyan, G.V. (2004). Inulinase of Bacillus subtillis: extraction,purification and characterization. National Academy ofSciences of RA electronic Journal of Natural Sciences,1(2), 38-42.

Miller, G. L. (1959) Use of dinitrosalicylic acid reagent for determi-nation of reducing sugar. Anal. Chem, 31; 426-428.

Parekh, S. y Margaritis, A. (1985) Inulinase (beta-fructofuranoisi-dase) production by Kluyeromyces marxiianus in batchculture. Appl. Microbiol. Biotechnol,. 22 pp. 446-448.

Shinji, W.; Hiroyasu, I. y Kenji, T. (1993), Removal of phenols fromwastewater by soluble and inmobilized tyrosinase.Biotech. and Bioeng, 42, 254-258.

Singh, P. y Kaur, G. (2006). Production of inulinases: Recent Ad-vances. Food Technol. Biotechnol, 44 (2) pp151-162.

Tellez, M. P. (1998). El cocimiento, una etapa importante en la pro-duccin de Tequila. Bebidas Mexicanas, 7(1) 19-20.

Wesche, E. P. (2000) Qumica de Alimentos de Origen Vegetal:Universidad de las Amricas- Puebla. Recuperado enhttp://webserver.pue.udlap.mx/~pwesche/3.4.html


Dialnet-ObtencionDeAzucaresFermentablesAPartirDeInulinasas-2695331

Documents

Transcript of Dialnet-ObtencionDeAzucaresFermentablesAPartirDeInulinasas-2695331