Centro de Bachillerato Tecnológico Industrial y de Servicios Noº128

Práctica 4. Dilución bacteriana.

Sub módulo 3: Ejecuta técnicas de identificación de microorganismos con base en las normas.

Equipo 3. Integrantes: Cabral Brandon, González Lesly, Hernández Nayeli, Hernández Alan, Jiménez Fabiola, Lagunas Itzel, Lira Vanesa, Mata Lizbet.

Facilitadora: Ing. Acosta Jessica

Fecha: Inició 22 de Octubre del 2014, 28 de Octubre del 2014.

Introducción

En diversos estudios microbiológicos (como análisis de alimentos, de agua de bebida, de productos farmacéuticos o del medioambiente entre otros) en este caso sería el agua de tubería, se requiere conocer el número de microorganismos presentes en un material con un objeto de determinar su calidad. Para esto se emplea la técnica de recuento por dilución bacteriana que consiste en inocular una serie de frascos tipo antibiótico con 9 ml del medio de cultivo apropiado según el tipo de bacteria a evaluar. Se obtiene 1 ml de la muestra usando una jeringa descartable estéril de 1 o 2 ml. Se inocula el 2do frasco con una nueva jeringa, se retira 1 ml del frasco no. 2, previamente agitado y se inocula el frasco no. 3 y así sucesivamente, utilizando una nueva jeringa para cada frasco.Posteriormente se aplica lo que se conoce como número más probable, que es una estrategia eficiente para estimar densidades de población, lo que ayuda cuando una evaluación cuantitativa de elementos no es factible. Después de la dilución en serie de la muestra de cultivo en un medio líquido adecuado para el crecimiento de dicho organismo de un volumen 10 veces mayor. Luego de incuban las muestras de esos tubos y pasando un tiempo de examinan.

Resumen

Primero que nada, se obtuvieron muestras de agua de diferentes puntos de la ciudad.

En 7 tubos de ensaye pusimos 9ml de agua esterilizada o destilada, en el primer tubo agregamos 1ml de muestra del cual después tomamos otro mililitro de muestra y la vaciamos en el siguiente (tubo 2), de este también tomamos 1ml y lo vaciamos en el tubo 3 y así sucesivamente.

Ya se tenían 7 cajas Petri con M.C Nutritivo para cada serie, de la dilución que realizamos en cada tubo tomamos una muestra del tubo 1 para inocularlo en la caja 1, una muestra del tubo 2 para inocular en la caja 2, etc.

Después desechamos las diluciones que habíamos realzado en los tubos. Así terminamos con la primera parte de la práctica.

Para la siguiente parte se tienen 7 tubos con Caldo Nutritivo, tomamos 1ml de muestra (se tomó directamente) y lo vaciamos en uno de los 7 tubos. De este primer tubo de ensaye tomamos otro mililitro y lo pasamos a el segundo tubo, así repetimos la operación que se realizó con los otros tubos.

Los llevamos a la incubadora y cuando fue momento de sacarlos observamos el crecimiento que había tanto en las cajas Petri con M.C Nutritivo como en los tubos de ensayo con Caldo Nutritivo.

De los tubos de ensaye con Caldo Nutritivo se realizaron 2 series cada una con diferentes muestras de agua.

Abstract

First of all, water samples was obtained from different parts of the city.

In 7 test tubes we put 9ml of sterilized or distilled water, in the first tube add 1ml of sample which then took another milliliter of sample and empty it in the following ( tube 2 ) , this also take 1ml and emptied in the tube 3 and so on.

And 7 Petri dishes were had with MC Nourishing for each series of dilution in each tube we do take a sample to inoculate the tube 1 in the box 1 , a sample of the tube 2 in the box to inoculate 2, etc.

Discard the dilutions after we had highlighted in the tubes. Thus ended the first part of practice.

For the next part will have 7 tubes containing nutrient broth, take 1ml of sample (I was taken directly) and pour into one of 7 tubes. In this first test tube took another milliliter and had a second tube, so we repeat the operation that was carried out with the other tubes.

We took them to the incubator and when it was time to remove them had observed the growth in both Petri dishes with MC Nutritional and test tubes with nutrient broth.

In test tubes with Nourishing Broth 2 series were performed each with different water samples.

Materiales y métodos

Materiales

Cajas Petri Tubos de ensaye Asas de platino Mechero de Bunsen Gradilla Agar nutritivo Caldo nutritivo Agua estéril Agua de la llave Porta objetos Cubre objetos Microscopio

Métodos

Técnicas de vaciado: Se prepararon 2 tipos de cultivos: agar nutritivo y caldo nutritivo una vez obtenidos se hizo el vaciado de agar nutritivo sobre cajas Petri y el caldo nutritivo sobre dos series de tubos de ensayo. Luego de esto se preparaban los tubos de ensayo para esterilizar.

Estriado: Una vez que se cuajó el agar nutritivo en las cajas Petri se toma un poco de muestra del tubo #1 y se estría en la caja #1, un poco del tubo #2 y se estría en la caja #2 y así sucesivamente hasta llegar al final de cada uno de ellos.

Dilución: En los tubos de ensayo se enumeraron del 1 al 7 y en cada uno de ellos se le vertió 10 ml, 9 ml de agua estéril y 1 ml de agua de la llave, primeramente esto se llevó a cabo en el tubo #1

después de este tubo se tomó 1 ml de muestra y se vertió en el tubo #2 y así sucesivamente hasta llegar al #7 y se hizo lo mismo con la serie #2.

Morfología de colonias: Una vez que se dejó reposar las cajas Petri se observaban las colonias de bacterias que habían crecido sobre el agar nutritivo permitiendo saber que el agua de la llave no está del todo limpia tomando en cuenta la forma, borde, superficie, color y el número de colonia, al igual que con los tubos de ensayo se observaba la turbidez que se produjo en cada uno de ellos.

Tinción de Gram: En ello se toma un poco de una de las colonias de bacterias que crecieron en las cajas Petri y en porta objetos se colocaba 1 gota de agua y con un asa de platino se pone la muestra de la colonia, dejando que se seque y fijándola sobre un mechero. Luego de esto se tiñe la muestra con diferentes tinturas tales como cristal violeta, lodo-Lugol, alcohol-cetona, safranina y aceite de inmersión para así después poder observarlas en un microscopio.

Resultados

En los tubos de ensayo, pudo observarse el crecimiento de colonias provenientes de una muestra de agua potable. En la primera serie de tubos de ensayo (7 tubos), el primer tubo en el que se agregó un ml de muestra estaba más turbio, por lo que presentaba un mayor crecimiento de colonias; en los tubos siguientes, la turbidez fue disminuyendo, en el tubo 7 se apreció la menor turbidez de la serie. En la segunda serie de tubos (7 tubos), el primer tubo presentó la mayor turbidez, esta última fue disminuyendo en los tubos siguientes, y en el tubo 7 se apreció una menor turbidez y una película sobre el medio líquido. En los primeros tubos de cada serie se observaron colonias sedimentadas.

Al cultivar un medio de cultivo como nutritivo que en este caso fue el que se utilizó y se obtuvieron cantidades de crecimiento en colonias tanto mínimas como mayores en los agares, que en la siguiente tabla se mostraran los resultados de estos.

m. c forma color

superficie

borde colonias

1-Nutritivo

Puntiforme

Blanco

Plana Redondeado

6

2-Nutritivo

Puntiforme

Blanco

Plana Redondeado

17

3-Nutritivo

Puntiforme

Blanco

Plana Redondeado

12

4-Nutritivo

Puntiforme

Blanco

Plana Redondeado

26

5-Nutritivo

Puntiforme

Blanco

Plana Redondeado

60

6-Nutritivo

Puntiforme

Blanco

Plana Redondeado

29

7-Nutritivo

Puntiforme

Blanco

Plana Redondeado

67

Como se muestra en la tabla respecto a la forma, color , borde y superficie se tuvieron los mismos resultados ya que es el mismo medio de cultivo, si en este caso se utilizara otro pues las características ya mencionadas serian diferentes , pero al respecto de las colonias que crecieron se encuentra una gran diferencia.

De igual manera cabe mencionar que en los agares 3 & 4 hubo crecimiento de filamentosa.

También al realizar la tinción en la que se toma una pequeña cantidad de muestra de cada uno de los agares se obtuvieron los siguientes resultados:

Muestra Forma TipoNutritivo #1 Cocos PositivoNutritivo #2 Cocos NegativoNutritivo #3 Cocos PositivoNutritivo #4 Bacilos NegativoNutritivo #5 Cocos Positivo

En esta ocasión solo se lograron observar bacterias en 5 de los agares.

Conclusiones

Cabral Brandon: Esto nos ayuda porque los estudios microbiológicos estudian los alimentos, agua, productos farmacéuticos y productos o del medio ambiente. Por qué nos ayuda a saber la calidad del producto si es que está contaminado o no, usan do los tipos de estriado para poder realizarlo.

González Lesly: En esta práctica se estudió la dilución bacteriana por el meto del número más probable para poder conocer y calcular el número de microorganismos que se encuentran en el agua potable de diferentes casas, para poder observar cantas bacterias son las que se encuentran en el agua que tomamos día a día, y que tanto es que están contaminadas las tuberías de la ciudad, no se realizó el objetivo ya que al momento de estar haciendo el procedimiento de dilución por número más probable el tubo 7 se contamino de alguna manera, por estar fuera del triángulo de seguridad, siendo así el más contaminado de la serie, se observó bastante turbidez en los tubos pero siendo el tubo numero 7 presentando más turbidez que al 1. Mientras que en las cajas Petri se observó poco crecimiento de colonias a 24 hr de incubación, mientras que al momento de volverlas a revisar a las 96 hrs se notó un gran crecimiento de bacterias y hongos.

Hernández Nayelli: Sobre la práctica y el estriado primeramente hay que tener mucho en cuenta las reglas que hay para realizar este, saber que estriado en la placa se hará y antes de esto practicar para que en la placa salga bien y que al momento de su cultivación las bacterias o lo que valla a crecer se halla hecho de manera correcta así como estriar dentro del trianguló que se hace con los mecheros para que estas no se contaminen dependiendo del agar.

Como también podemos darnos cuenta como ya se dijo anteriormente podemos observar los cambios que estas presentan ya sea en el color y el número de colonias que nacen en los cultivos y así tomar muestras y poder ver qué tipo de bacterias estamos tratando y tener un mejor conocimiento de estas.

Hernández Alan: La dilución bacteriana permite aplicar la técnica del NMP, la cual busca establecer una estimación del número de bacterias tomando en cuenta las densidades del medio y las colonias. Debido a lo anterior, la dilución bacteriana es muy importante debido a que permite obtener resultados cuantitativos relacionados con la cantidad de bacterias.

En la realización de la práctica no se empleó la técnica NMP, solamente se realizó la dilución bacteriana. Esta última, permitió comprobar que la

turbidez de un medio líquido va disminuyendo conforme disminuye la dilución inoculada en este (la cual contiene por lo menos una bacteria que permita dar origen a otras).

Jiménez Fabiola: Gracias a la dilución se pueden evaluar diferentes grupos bacterianos, en este caso en este caso se analizaron algunas muestras de agua de diferentes viviendas de la ciudad; y se pudo notar como el agua que bebemos no está muy contaminada como parece, sí, tiene bacterias y no nos damos cuenta, pero la práctica nos ayudó a ver qué gérmenes y microorganismos hay en lo que nuestro cuerpo ingiere.

Lagunas Itzel: Este procedimiento tiene una gran importancia al determinar la calidad de cierto producto. El uso de esta técnica de simple ejecución y fácil interpretación, se pueden evaluar diferentes grupos bacterianos según el medio de cultivo que contenga el frasco.

Lira Vanessa: Al realizar la práctica se toman en cuenta diversas cosas como desde que al estriar se debe de realizar dentro del triángulo de los mecheros ya que si esto no se hace pues afectaría al agar y este se contaminaría y ya no se le podría dar uso, al igual que tener los materiales limpios, al igual que entre más se practiquen las cosas más se aprende.

Respecto a la morfología y tinción es importante realizara ya que se pueden observar cambios cuando se utilizan diferentes medios de cultivo y así se puede tener un conocimiento más amplio del tipo de bacteria que crece, la forma y el color que obtienen, o entre otras cosas. Para que de la misma manera se pueda destacar que es lo que define a una bacteria, sus propiedades y lo que la caracteriza.

Mata Lucero: La dilución bacteriana nos ayuda principalmente al conteo rápido de las bacterias, nos permite hacerlo por medio de una disminución de microorganismos que pasan de una muestra a otra reduciendo así el número de bacterias que crezcan. Todo esto lo identificamos por medio de la turbidez que existe en cada uno de los tubos de ensaye. Es muy probable que el resultado que

obtengamos si no se hace de una forma lo bastante correcta no sea el resultado exacto pero es el más cercano a este.

Meléndez Araceli: Tomamos muestras de agua de diferentes puntos de la ciudad con la finalidad de saber que tan contaminadas están las tuberías de cada parte de la ciudad ya que cada compañero vive en diferentes áreas muy alejadas de las otras, a través de esta práctica los resultados esperados eran que las zonas con más años es decir más viejas estuvieran más contaminadas las tuberías, durante la práctica se obtuvieron algunos resultados deseados pero lamentablemente algunos no deseados como la contaminación nuestra.

Discusión

Gracias a la realización de esta práctica se aprendió a hacer las diluciones en caldos, se tomó como muestra el agua potable de las casas de los integrantes del equipo, siendo todas de diferentes sectores, estas muestras se cultivaron en cajas Petri obteniendo poco crecimiento de colonias puntiformes en el medio. Mientras que en las diluciones en tubo el objetivo no se cumplió, ya que al momento de observar el crecimiento y turbidez se presentó más en el tubo 7 que en el 1, debido a que algún paso quedo inconcluso, o la jeringa con la que se estaba vaciando la muestra se contamino. Y por último se realizaron las tinciones para así poder determinar la morfología de la bacteria.

Bibliografía

Camacho, A., M.Giles, A.Ortegón, M.Palao, B.Serrano y O.Velázquez. (2009). Técnicas para el Análisis Microbiológico de Alimentos. 2ª ed. Facultad de Química, UNAM. México.

Laboratorio de Microbiología Industrial. (2013). Técnica de recuento por dilución. Octubre 31, 2014, de MAG .Sitio web: http://www.laboratoriomag.com.ar/sitio2/index.php/tecnicas-recomendadas/tecnica-de-recuento-por-dilucion

Anexos

DILUCION BACTERIANA

El conteo bacteriano señala la magnitud de la población total bacteriana. En ese sentido se puede determinar por diversas técnicas que se basan en algunos de los siguientes tipos de medida: cuenta celular (directamente al microscopio o mediante un contador electrónico de partículas o indirectamente con la cuenta de colonias), masa celular (en forma directa pesando el contenido celular del nitrógeno o indirectamente por turbidimetría, proporcional al número de células) y actividad celular (indirectamente relacionando el grado de actividad bioquímica al tamaño de la población bacteriana).

Conteo en caja de Petri

Método más usado para contar bacterias. Un caldo de cultivo con microorganismos es diluido y posteriormente muestras del mismo son distribuidas en la caja de Petri contenedora de agar. Es de suponerse que cada célula se dividirá en sus múltiples alrededores para producir colonias separadas en el agar. Cada célula es llamada unidad formadora de colonias (UFC). Después de la incubación, el número de colonias se reflejará en el número de células UFC originalmente presentes. Es importante considerar un número limitado de colonias pues de no ser así, éstas pueden sobre poblarse y dificultar el conteo de las mismas (rango sugerido de acuerdo a FDA 25-250 colonias). El conteo se facilita utilizando un contador de colonias. Este método es deseable porque arroja el total de células viables (sólo células vivas); en contraste con el conteo microscópico y el conteo de peso seco. Una desventaja radica en el tiempo que requiere para producir las colonias, ya que se necesitan como mínimo veinticuatro horas o más. Por otra parte, no es cien por ciento fiable porque generalmente las colonias crecen unidas en cadenas o en grupos.

Conteo por filtración

Es realizado cuando la cantidad de bacterias es muy pequeña, como en casos de lagos y arroyos relativamente puros. En esta técnica se necesitan al menos 100 mL de agua que atraviesen una membrana delgada de un filtro, con poros tan

pequeños que no permitan el paso de bacterias, de esta forma éstas son retenidas en la superficie del filtro. Posteriormente el filtro es transferido a una caja de Petri que cuenta con un caldo nutritivo, en la cual las colonias surgen de las bacterias en la superficie del filtro. Las colonias bacterianas formadas por este método son distintivas cuando ocupan un medio diferencial.

Este método es aplicado frecuentemente en la detección y enumeración de bacterias coliformes, las cuales son indicadores de contaminación fecal en la comida o en el agua.

GENERALIDADES

Cuando se requiere investigar el contenido de microorganismos viables en un alimento, la técnica comúnmente utilizada es la cuenta en placa. Esta técnica no pretende detectar a todos los microorganismos presentes, pero el medio de cultivo, las condiciones de temperatura y la presencia de oxígeno, permiten seleccionar grupos de bacterias cuya presencia es importante en diferentes alimentos; por ejemplo, las bacterias mesofílicas aerobias, o mesófilos aerobios son un indicador general de la población que pueden estar presente en una muestra y, por lo tanto, de la higiene con que ha sido manejado el producto. Este grupo en particular, se determina en la mayor parte de los alimentos, pero para algunos productos, también es importante determinar la presencia de bacterias termofílicas, psicrofílicas y/o psicrotróficas para predecir la estabilidad del producto bajo diferentes condiciones de almacenamiento. La técnica básica es la misma, pero cambian las condiciones de incubación, medios de cultivo y algunos otros detalles, que se mencionan en la técnica. Si se modifican las condiciones de incubación o se somete la muestra a algún tratamiento previo, el método puede aplicarse también a la detección de otros grupos como anaerobios o esporulados, desde luego, con la adecuada selección de medios de cultivo.

El método permite numerosas fuentes de variación, algunas de ellas controlables, pero sujetas a la influencia de diversos factores por lo que es muy importante apegarse a la técnica y controlar cuidadosamente las condiciones.

FUNDAMENTO

La técnica se basa en contar las “unidades formadoras de colonias” o UFC presentes en un gramo o mililitro de muestra. Se considera que cada

colonia que desarrolla en el medio de cultivo de elección después de un cierto tiempo de incubación a la temperatura adecuada, proviene de un microorganismo o de un agregado de ellos, de la muestra bajo estudio; ese microorganismo o microorganismos son capaces de formar la colonia, es decir una UFC. Para que las colonias puedan contarse de manera confiable, se hacen las diluciones decimales necesarias de la muestra, antes de ponerla en el medio de cultivo; la técnica para realizar este procedimiento se describe en “Preparación y dilución de muestras de alimentos para su análisis microbiológico”.

NMP (NUMERO MAS PROBABLE)

Es una técnica de estimación estadística basada en el hecho que a mayor número de bacterias en una muestra, mayor será la dilución necesitada para reducir la densidad hasta el punto en que ninguna bacteria se le permita crecer en la serie de tubos de dilución. Muestras microbianas son añadidas a tubos con caldos de lactosa y la presencia o ausencia de gas formado en la fermentación y da un estimado de número de células. Este método es más útil cuando las bacterias que están siendo contados no crecerán en medios sólidos, como en el caso de Chemoautotrof phic nitrifying bacteria. También es útil cuando el crecimiento de la bacteria es en un medio líquido diferencial, usado para identificar microbios, como en bacterias coliformes. El NMP es la única afirmación en la cual existe 95% de probabilidad que la población bacteriana sea de rango correcto, siendo el número estadístico más probable.

EL METODO DE NUMERO MAS PROBABLE (NMP) es una estrategia eficiente de estimación de densidades poblacionales especialmente cuando una evaluación cuantitativa de células individuales no es factible. La técnica se basa en la determinación de presencia o ausencia (pos o neg) en réplicas de diluciones consecutivas de atributos particulares de microorganismos presentes en muestras de suelo u otros ambientes. Por lo tanto, un requisito importante de este método es la necesidad de poder reconocer un atributo particular de la población(es) en el medio de crecimiento a utilizarse. El estimado de densidad poblacional se obtiene del patrón de ocurrencia de ese atributo en diluciones seriadas y el uso de una tabla probabilística.

Algunas de las ventajas del NMP son: (i) la capacidad de estimar tamaños poblacionales basados en atributos relacionados a un proceso

(selectividad); por ejemplo se puede determinar la densidad poblacional de organismos que pueden nodular leguminosas en una muestra de suelo usando el método de infección de plantas, (ii) provee una recuperación uniforme de las poblaciones microbianas de suelos diversificados, (iii) determina sólo organismos vivos y activos metabólicamente, y (iv) suele ser más rápido e igual de confiable que los métodos tradicionales de esparcimiento en platos de cultivo, entre otros.

En este ejercicio, se utilizará una variante de esta metodología para estimar la densidad total de bacterias presentes en una muestra. El atributo particular a utilizarse será la capacidad de microorganismos a formar colonias en medios sólidos de crecimiento.