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DISEÑO, SÍNTESIS Y EVALUACIÓN BIOLÓGICA DE NUEVOS DERIVADOS DE 1,4-DI-N-ÓXIDO DE QUINOXALINA COMO AGENTES ANTIMALÁRICOS Y ANTILEISHMANIÁSICOS Proyecto de Investigación XX Máster Universitario en Investigación, Desarrollo e Innovación de Medicamentos Unidad de Investigación y Desarrollo de Medicamentos Facultad de Farmacia – C.I.F.A MARIELA CARBALLO GUERRERO Pamplona, Diciembre 2010
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DISEÑO, SÍNTESIS Y EVALUACIÓN BIOLÓGICA
DE NUEVOS DERIVADOS DE 1,4-DI-N-ÓXIDO DE
QUINOXALINA COMO AGENTES
ANTIMALÁRICOS Y ANTILEISHMANIÁSICOS
Proyecto de Investigación
XX Máster Universitario en Investigación, Desarrollo e Innovación de
Medicamentos
Unidad de Investigación y Desarrollo de Medicamentos
Facultad de Farmacia – C.I.F.A
MARIELA CARBALLO GUERRERO
Pamplona, Diciembre 2010
DISEÑO, SÍNTESIS Y EVALUACIÓN BIOLÓGICA
DE NUEVOS DERIVADOS DE 1,4-DI-N-ÓXIDO DE
QUINOXALINA COMO AGENTES
ANTIMALÁRICOS Y ANTILEISHMANIÁSICOS
Proyecto de Investigación
XX Máster Universitario en Investigación, Desarrollo e Innovación de
Medicamentos
Fdo. D. Ignacio Aldana Moraza Fdo. Dña. Elsa Moreno de Viguri
MARIELA CARBALLO GUERRERO
Pamplona, Diciembre 2010
El D. Ignacio Aldana Moraza y Dña. Elsa Moreno de Viguri CERTIFICAN que el presente
trabajo ha sido realizado por la Licenciada MARIELA CARBALLO GUERRERO,
Fdo. D. IGNACIO ALDANA MORAZA Fdo. Dña. ELSA MORENO DE VIGURI
Pamplona, 15 de diciembre de 2010
Agradecimientos
Deseo agradecer a quienes me acompañaron en esta etapa de mi vida, a grandes
amigos y maestros que contribuyeron en mi formación y facilitaron que este trabajo llegara
a un feliz término.
Al Dr. Antonio Monge, por sus palabras de apoyo y confianza durante el máster.
Por enseñarme que a través del esfuerzo y la dedicación se pueden lograr grandes
objetivos. Gracias porque su gran capacidad científica y académica me dieron la
oportunidad de llevar a cabo uno de mis sueños, conocer el mundo de la investigación.
Al Dr. Ignacio Aldana, por su ayuda académica, compromiso y apoyo durante la
realización del proyecto de investigación.
A la Dra. Silvia Pérez-Silanes, por su disponibilidad y por la ayuda brindada en
todo momento. Por siempre estar pendiente de la coordinación del máster y facilitarnos lo
que necesitábamos con tan buena disposición.
A Elsa Moreno, por tu apoyo y confianza en todo momento. Por tu disponibilidad y
paciencia ante mis dudas de novata durante el desarrollo del proyecto de investigación.
Tu ayuda ha sido un aporte invaluable. Te agradezco también el haberme enseñado todas
las técnicas necesarias.
A Enrique Torres, por tu disponibilidad y ayuda en el día a día del laboratorio. Tu
colaboración fue de gran ayuda durante mis horas en el departamento.
A mis compañeros del departamento, por acogerme con cariño y ayudarme cada
vez que los necesite. Por orientarme y acompañarme durante estos meses en el
departamento.
A mis compañeros del Máster, por estos meses compartidos. Por acogerme con
cariño, por dejarme disfrutar de su amistad y por hacerme sentir tan bien a pesar de estar
lejos de mi país. Gracias por poder contar con ustedes.
A mis padres, por siempre brindarme su amor y apoyo, por permitirme llegar a
cada meta que me trazo y darme la oportunidad de ser alguien en la vida. Por estar
conmigo y comprenderme en los momentos más difíciles. Porque a pesar de no estar
presentes físicamente, siempre procuraron mi bienestar desde mi país, Costa Rica.
Gracias por confiar y creer en mí. Son los mejores padres del mundo.
A mis hermanos, por ser mi ejemplo de valentía, capacidad y superación. Por su
cariño y apoyo incondicional. Por ser como son, les deseo lo mejor. Aquí estaré para
apoyarlos siempre en todo lo que necesiten.
A Sil, María, Yali, Kristy y Juli, porque a pesar de la distancia, el apoyo, ánimo y
alegría que me brindaron siempre me dio la fortaleza necesaria para seguir adelante. Por
todos los momentos de alegría, tristeza, ilusión y esfuerzo que hemos vivido juntas. Por
compartir gran parte de sus vidas conmigo, por su sincera amistad; de verdad serán
inolvidables.
A Andre, por ser mi amiga, hermana y confidente desde el primer momento que
llegue a Pamplona. Por brindarme todo el apoyo, colaboración y cariño sin ningún interés.
Por tu sonrisa cada mañana que hacían que las cosas malas se convirtieran en buenas, la
tristeza se transformara en alegría y la soledad no existiera.
A Victor y Eduardo, por brindarme su amistad y haber hecho tan agradable mi
estancia aquí. Por hacerme reír y apoyarme en todo momento. Por sus consejos y todos
sus momentos de escucha. Los extrañaré mucho.
A mis amigos ticos en Pamplona, por acogerme con cariño desde el primer
momento. Por esos domingos de pinto que me hacían sentir tan cerca de casa. Por todos
los momentos compartidos que llenaron de alegría mis días en Pamplona. A Olman, por
orientarme y aconsejarme. Por ser tan buen amigo y ayudarme con tan buena disposición
cada vez que lo necesite. A Anita, por esos inolvidables momentos, viajes y vida en
Pamplona que compartimos juntas.
Al Consejo Nacional para Investigaciones Científicas y Tecnológicas (CONICIT) de
Costa Rica, por haber financiado gran parte de mis estudios del máster.
A mis padres,
A mis hermanos,
“Se alcanza el éxito convirtiendo cada paso en una meta
y cada meta en un paso”
(Carlos Cumanda Cortez)
ÍNDICE
Glosario de abreviaturas
INTRODUCCIÓN
1.1 Definición de Malaria………………………………………………………………………3
1.2 Historia de la Malaria……………………………………………………………………...4
1.2.1 Historia de la enfermedad………………………………………………………..4
1.2.2 Historia del vector…………………………………………………………………5
1.3 Epidemiología de la Malaria………………………………………………………………6
1.4 Etiología de la Malaria…………………………………………………………………...10
1.4.1 Parásito…………………………………………………………………………...10
1.4.1.1 Características generales de Plasmodium………………………………..10
1.4.2 Vector……………………………………………………………………………..12
1.5 Ciclo de vida de la Malaria………………………………………………………………13
1.6 Transmisión de la Malaria……………………………………………………………….16
1.7 Patogénesis de la Malaria……………………………………………………………….17
1.8 Manifestaciones clínicas de la Malaria………………………………………………...18
1.9 Diagnóstico de la Malaria………………………………………………………………..21
1.10 Tratamiento de la Malaria……………………………………………………………….22
1.11 Prevención y control de la Malaria……………………………………………………..26
1.11.1 Control del vector………………………………………………………………..26
1.11.2 Vacunas para la Malaria………………………………………………………..27
1.12 Aproximaciones en la búsqueda de fármacos antimaláricos………………………..29
2.1 Definición de Leishmaniasis…………………………………………………………….30
2.2 Historia de la Leishmaniasis…………………………………………………………….31
2.3 Epidemiología de la Leishmaniasis…………………………………………………….32
2.4 Etiología de la Leishmaniasis…………………………………………………………...34
2.4.1 Parásito…………………………………………………………………………...34
2.4.1.1 Características generales de Leishmania………………..………………..34
2.4.2 Vector……………………………………………………………………………..35
2.5 Ciclo de vida de la Leishmaniasis………………………………………………………37
2.6 Transmisión de la Leishmaniasis……………………………………………………….39
2.7 Patogénesis de la Leishmaniasis………………………………………………………40
2.7.1 Invasión y desarrollo en las células susceptibles…………………………….40
2.8 Manifestaciones clínicas de la Leishmaniasis………………………………………...41
2.8.1 Leishmaniasis visceral…………………………………………………………..41
2.8.2 Leishmaniasis cutánea………………………………………………………….42
2.8.2.1 Leishmaniasis cutánea aguda………………………………..…………….42
2.8.2.2 Leishmaniasis cutánea crónica………………………………..……………43
2.8.2.3 Leishmaniasis cutánea difusa o diseminada……………………..……….43
2.8.3 Leishmaniasis mucocutánea…………………………………………………...44
2.9 Diagnóstico de la Leishmaniasis……………………………………………………….45
2.10 Tratamiento de la Leishmaniasis……………………………………………………….47
2.11 Prevención y control de la Leishmaniasis……………………………………………..49
2.12 Aproximaciones en la búsqueda de fármacos antileishmaniásicos………………...50
ANTECEDENTES
3.1 Actividad biológica de las quinoxalinas………………………………………………..53
3.1.1 Quinoxalinas como antitumorales……………………………………………..55
3.1.2 Quinoxalinas como antibacterianos y antimicrobianos……………………...56
3.2 Derivados de 1,4-di-N-óxido de quinoxalina y enfermedades olvidadas…………..58
3.2.1 Derivados de 1,4-di-N-óxido de quinoxalina y tuberculosis…………………58
3.2.2 Derivados de 1,4-di-N-óxido de quinoxalina y enfermedad de Chagas…...60
3.2.3 Derivados de 1,4-di-N-óxido de quinoxalina y malaria………………………63
3.2.4 Derivados de 1,4-di-N-óxido de quinoxalina y leishmaniasis……………….67
OBJETIVOS Y PLAN DE TRABAJO
4.1 Objetivos…………………………………………………………………………………..71
4.2 Plan de trabajo……………………………………………………………………………72
4.2.1 Diseño de los compuestos……………………………………………………...72
4.2.1.1 Quinoxalina……………………………………………………………………73
4.2.1.2 Grupo alcohol………………………………………………………………...74
4.2.1.3 Amina central………………………………………………………………....74
4.2.1.4 Grupo aromático…………………………………………………………...…74
4.2.2 Síntesis química………………………………………………………………….76
4.2.3 Evaluación biológica…………………………………………………………….76
4.2.4 Relación estructura química-actividad biológica……………………………..76
SÍNTESIS QUÍMICA
5.1 Introducción a la química de los N-óxido de quinoxalina…………………………….79
5.1.1 La función del N-óxido en el anillo de quinoxalina…………………………...79
5.1.2 Métodos de síntesis de derivados 1,4-di-N-óxido de quinoxalina………….80
5.1.2.1 Reacción de Beirut…………………………………………………………...80
5.1.2.1.1 Reacción con enaminas generadas in situ……………………….80
5.1.2.1.2 Reacción con dienaminas y 1-aza-1,3-butadienos………………81
5.1.2.1.3 Reacción con enolatos, fenolatos y cetonas α-β-insaturadas…..82
5.1.2.1.4 Reacción con malononitrilo…………………………………………83
5.1.3 Reacciones fotoquímicas de derivados de 1,4-di-N-óxido de quinoxalina..83
5.2 Esquemas generales de síntesis……………………………………………………….85
5.3 Método de síntesis…………………………………………………………………..…...88
5.3.1 Método de síntesis de los derivados metilcetona………………………..…..88
5.3.1.1 Síntesis de los derivados de 1,4-di-N-óxido de 2-acetil-3-
metilquinoxalinas……………………………………………………………..88
5.3.1.2 Mecanismo de reacción……………………………………………………..89
5.3.2 Método de síntesis de la metilquinoxalina…………..………………………..90
5.3.2.1 Síntesis de los derivados de 1,4-di-N-óxido de 2-metilquinoxalina….....90
5.3.2.2 Mecanismo de reacción……………………………………………………..91
5.3.3 Método de síntesis de los derivados de 1,4-di-N-óxido de 2-(3-
cloropropanoil)-3-metilquinoxalina……………………………………………..95
5.3.3.1 Síntesis de los derivados de 1,4-di-N-óxido de 2-(3-cloropropanoil)-3-
metilquinoxalina……………………………………………..………………..95
5.3.3.2 Mecanismo de reacción…………………………………………………..…97
5.3.4 Método de síntesis de los derivados 1,4-di-N-óxido de 2-[4-(4-(2-nitro-4-
(trifluorometil)fenil)piperazin-1-il)-2-oxobutil]quinoxalina……………………98
5.3.4.1 Síntesis de los derivados 1,4-di-N-óxido de 2-[4-(4-(2-nitro-4-
(trifluorometil)fenil)piperazin-1-il)-2-oxobutil]quinoxalina………………...98
5.3.4.2 Mecanismo de reacción………………………………………………….….99
5.3.5 Método de síntesis de los derivados 1,4-di-N-óxido de 2-[4-(4-(2-nitro-4-
(trifluorometil)fenil)piperazin-1-il)-2-oxobutil]quinoxalina…………………..100
5.3.5.1 Síntesis de los derivados 1,4-di-N-óxido de 2-[4-(4-(2-nitro-4-
(trifluorometil)fenil)piperazin-1-il)-2-oxobutil]quinoxalina…………….....100
5.4 Parte experimental de los procesos de síntesis…………………………………..103
5.4.1 Generalidades……………………………………………………………...….103
5.4.1.1 Seguimiento de las reacciones………………………………...……….…103
5.4.1.2 Purificación de los compuestos…………………………………………...103
5.4.1.3 Elucidación estructural de los compuestos……………………………...104
5.4.1.4 Descripción de los compuestos…………………………………...………105
5.4.1.4.1 Productos de partida……………………………………..………..105
5.4.1.4.2 Compuestos finales…………………………………………..……105
5.4.2 Esquema general de síntesis………………………………………….…..…106
5.4.3 Experimental…………………………………………………………..………..107
5.4.3.1 Productos de partida: derivados de 1,4-di-N-óxido de 2-
metilquinoxalinas……………………………………………..…………….107
5.4.3.2 Productos intermedios: derivados de 1,4-di-N-óxido de 2-(4-cloro-2-
oxobutil)quinoxalina…..……………………..…………………..…………115
5.4.3.3 Productos finales: derivados 1,4-di-N-óxido de 2-[4-(4-(2-nitro-4-
(trifluorometil)fenil)piperazina-1-il)-2-oxobutil]quinoxalina………..…....117
ANÁLISIS ORGÁNICO
6.1 Espectroscopía de infrarrojo………………………………………………………..…125
6.2 Espectroscopía de resonancia magnética nuclear………………………………….128
6.2.1 Estudio 2D de RMN de 1,4-di-N-óxido de 2-metil-6-metoxiquinoxalina….128
METODOLOGÍA DE LOS ENSAYOS BIOLÓGICOS
7.1 Evaluación de la actividad biológica……………………………………………...…..133
7.1.1 Evaluación de la actividad biológica de los compuestos antimaláricos….133
7.1.2 Evaluación de la actividad biológica de los compuestos
antileishmaniásicos…………………………………………………………….134
RESULTADOS Y DISCUSIÓN 139
CONCLUSIONES 145
BIBLIOGRAFÍA 149
Glosario de abreviaturas
ADN Ácido desoxirribonucleico
AMPA Receptor de glutamato
Ar Aromático
ARN Ácido ribonucleico
ATP Adenosin trifosfato
a.C. antes de Cristo
BFX Benzofuroxano
13C-RMN Resonancia magnética nuclear de carbono
13C- 1H HMBC Experimento de RMN de correlación heteronuclear a varios
enlaces carbono-protón
CBX Carbadox
CDCl3 Cloroformo deuterado
CLAR Cromatografía líquida de alta resolución
c.p.m Cuentas por minuto
CYA Cyadox
DCM Diclorometano
DDT Dicloro-difenil-tricloroetano
DHFR Dihidrofolato reductasa
DHPS Dihidropteroato sintasa
DMSO Dimetilsulfóxido
DMSO-d6 Dimetilsulfóxido deuterado
EDO Enfermedades de declaración obligatoria
FM Fórmula molecular
1H-RMN Resonancia magnética nuclear de protón
Hz Herzios
IC50 Concentración inhibitoria 50
IR Infrarrojo
IgG Inmunoglobulina G
J Constante de acoplamiento
L. infantum Leishmania infantum
L. chagasi Leishmania chagasi
L. donovani Leishmania donovani
L. archibaldi Leishmania archibaldi
L. tropica Leishmania tropica
L. major Leishmania major
L. aethiopica Leishmania aethiopica
L. mexicana Leishmania mexicana
L. braziliensis Leishmania braziliensis
L. panamensis Leishmania panamensis
L. guyanensis Leishmania guyanensis
MEQ Mequindox
MIT Mosquiteros tratados con insecticida
M. tuberculosis Mycobacterium tuberculosis
OMS Organización Mundial de la Salud
OLA Olaquindox
PCR Reacción en cadena de polimerasa
Pf Punto de fusión
P. falciparum Plasmodium falciparum
P. knowlesi Plasmodium knowlesi
P. malariae Plasmodium malariae
P. ovale Plasmodium ovale
P. vivax Plasmodium vivax
PM Peso molecular
ppm Partes por millón
QCT Quinocetona
QSAR Relación estructura-actividad
QX Quinoxalina
Rto Rendimiento
SNC Sistema Nervioso Central
T. cruzi Trypanosoma cruzi
TDA Tolueno, Dioxano, Acetato
THF Tetrahidrofurano
TLC Cromatografía en capa fina
TMS Tetrametilsilano
TPZ Tirapazamina
TR Tripanotiona reductasa
UV Ultravioleta
UNICEF Fondo de Naciones Unidas para la Infancia
VIH Virus de la inmunodeficiencia humana
δ Desplazamiento quimico
λ Longitud de onda
Ʋ Número de onda
IInnttrroodduucccciióónn
Introducción
3
1.1 Definición de Malaria
La malaria, fiebre palúdica o también llamada paludismo, es una enfermedad
infecciosa causada por el parásito protozoario del género Plasmodium que se transmite al
ser humano por la picadura de la hembra del mosquito infectado del género Anopheles, el
llamado vector de la malaria, que infecta y destruye los glóbulos rojos provocando fiebre,
anemia severa, malaria cerebral y si no es tratada, la muerte.
Hay cuatro especies que infectan al hombre: P. ovale, P. malariae, P. vivax y P.
falciparum. P. ovale típicamente causa una infección relativamente benigna. P. malariae
es también con frecuencia clínicamente silenciosa, aunque después de una infección
crónica puede desarrollarse un complejo inmune asociado a glomerulonefropatía. A pesar
de que rara vez es mortal, P. vivax es una causa frecuente de enfermedad febril aguda,
especialmente en Asia, América del Sur y Oceanía. Sin embargo, la mayoría de los casos
graves de la enfermedad y muertes son causados por P. falciparum, que es endémica en
la mayor parte de África subsahariana y los trópicos1. En los últimos años también ha
habido algunos casos humanos por P. knowlesi, un parásito del mono que aparece en
zonas boscosas de Asia Sudoriental.
La malaria es una de las enfermedades infecciosas más extendida. El mapa global
de la malaria se ha reducido en los últimos 50 años, pero actualmente más personas
están en riesgo de sufrir malaria que en cualquier otro momento de la historia;
aproximadamente el 40% de la población mundial vive en países donde la enfermedad es
endémica y alrededor de 247 millones de personas sufren de esta enfermedad cada año2.
La carga de la enfermedad es mayor en niños africanos menores de 5 años de
edad (que tienen ataques frecuentes y una protección inmunológica baja) y en mujeres
embarazadas. La malaria es tanto una causa como una consecuencia de la pobreza; en
países con alta transmisión de malaria, el impacto económico de la enfermedad enlentece
el crecimiento económico en un 1,3% por año2.
Introducción
4
1.2 Historia de la Malaria
1.2.1 Historia de la enfermedad3
Históricamente, la palabra malaria proviene del "mal aire" de los sitios cenagosos
donde se reproduce el mosquito vector. La malaria ha afectado al hombre desde hace
milenios, y hoy es una de las enfermedades infecciosas de mayor prevalencia en el
mundo.
En el siglo V a. C., el médico griego Hipócrates fue el primero en describir las
manifestaciones clínicas y algunas complicaciones de la malaria y de relacionar
lógicamente la aparición de la enfermedad a las estaciones del año o lugares donde
vivían sus pacientes. La asociación de fiebres periódicas y de esplenomegalia con la
exposición a aguas estancadas y pantanos llevó a los griegos, y más tarde a los romanos,
a realizar diversos métodos de drenaje, siendo este todavía un método eficaz para el
control de la malaria.
En el siglo XVII, la corteza del árbol de la quina fue utilizado con éxito para el
tratamiento de la fiebre intermitente. Sin embargo, el alcaloide quinina, el principio activo,
no fue aislado hasta el año 1820 por Pelletier y Caventou en Francia.
El primer avance importante en el entendimiento de la etiología de la enfermedad
fue en el año 1880, cuando Laveran, un cirujano francés del ejército en Argelia, describió
por primera vez los gametocitos exflagelados de P. falciparum en una extensión de
sangre fresca de un paciente con malaria. Cinco años después, Golgi informó en detalle
las formas asexuales de P. vivax y P. malariae.
La transmisión de la malaria fue un misterio hasta los años 80, cuando Patrick
Manson descubrió que la filariasis era transmitida por mosquitos y postuló que la malaria
era transmitida de manera similar. En 1898, Ronald Ross, un cirujano británico del ejército
en India, estableció las características principales del ciclo de vida del plasmodio
mediante una serie de experimentos en gorriones infectados naturalmente.
Introducción
5
Durante el siglo XX, se lograron avances en la tecnología para el control del vector
y en el desarrollo de potentes compuestos sintéticos antimaláricos.
1.2.2 Historia del vector4
El descubrimiento del vector data de finales del siglo XIX, y debe ser asignado a
Ronald Ross (primer investigador que demostró el papel de los mosquitos en la
transmisión de la enfermedad en aves) y a Giovanni Batista Grassi (quien confirmó los
mosquitos del género Anopheles (Orden Diptera, Familia Culicidae) como los vectores de
la malaria humana).
Figura 1.1 Dr. Ronald Ross
El género Anopheles tiene una distribución prácticamente mundial y alberga
alrededor de 70 especies potencialmente transmisoras de la enfermedad. Pueden hallarse
poblaciones en un amplio rango de altitudes, desde el nivel del mar hasta los 3.000
metros en condiciones favorables. Su capacidad vectorial no queda restringida
únicamente a plasmodios, ya que se conoce bastante bien su papel en la transmisión
activa de diversos arbovirus y filarias.
Introducción
6
1.3 Epidemiología de la Malaria
La malaria es la enfermedad parasitaria más frecuente en el mundo. El alto riesgo
de contraer esta enfermedad potencialmente mortal en el 40% de la población mundial
sitúa a la malaria entre las mayores preocupaciones a nivel de Salud Pública. Es una
enfermedad endémica en 109 países y territorios de regiones tropicales y subtropicales,
siendo África subsahariana la región más castigada. Cada año se registran entre 190 y
330 millones de casos de malaria clínica5.
Según el Informe Mundial sobre la Malaria 2009 de la Organización Mundial de la
Salud (OMS), la malaria a finales del año 2008 presentaba la distribución que se muestra
en la Figura 1.2.
Figura 1.2 Países sin malaria y países endémicos en fases de control, pre-eliminación,
eliminación y prevención de reintroducción (Fuente: OMS).
Introducción
7
Las cifras exactas son desconocidas, pero ocurren alrededor de 1,5 a 2,7 millones
muertes por malaria cada año. Actualmente, aproximadamente el 90% de todas las
muertes por malaria suceden en África subsahariana y la mayoría de estas muertes
corresponden a niños menores de cinco años de edad (Figura 1.3). En África, la malaria
es la principal causa de mortalidad entre los menores de cinco años (el 16%)5.
Figura 1.3 Número de episodios de malaria y complicaciones que ocurren cada año en
niños menores de 5 años en África subsahariana y en las mujeres embarazadas de
África13.
La malaria afecta de manera desproporcionada la población pobre, la morbilidad y
la mortalidad más alta puede atribuirse en gran medida a la falta de acceso a un
tratamiento eficaz; el 60% de las muertes por malaria en el mundo ocurren en el 20% de
la población más pobre6.
Además de los niños, las mujeres embarazadas y las personas no inmunes (por
ejemplo, trabajadores extranjeros, viajeros) están en mayor riesgo de una enfermedad
severa. Sin embargo, todos los grupos de edad pueden estar en riesgo de enfermedad
grave durante las epidemias de malaria, que ocurren ya sea cuando se producen cambios
en el medio ambiente (causados por variación climática, proyectos agrícolas o mineros,
Introducción
8
entre otros) que aumentan la capacidad de los mosquitos para transmitir la enfermedad o
cuando la población se desplaza a otro lugar (por ejemplo debido a un desastre natural,
guerras) que expone a las personas no inmunes a la infección6.
El parásito protozoario del género Plasmodium es el responsable de la malaria.
Sólo cuatro de las más de 100 especies de plasmodios son infecciosos para el ser
humano. La mayoría de los casos y prácticamente todas las muertes son causadas por P.
falciparum. P. vivax, P. ovale y P. malariae causan una enfermedad menos severa. Como
se menciono anteriormente, la malaria está presente en 109 países, en la mayoría de los
cuales existen cepas resistentes a los fármacos (Tabla 1.1).
Tabla 1.1 Distribución geográfica de la resistencia a drogas de la malaria6.
Especie Países
Plasmodium falciparum
Resistencia a Cloroquina
Resistencia a Mefloquina
Todas las áreas donde se presenta infección
por P. falciparum excepto México, República
Dominicana, Haití, América Central, Argentina,
el norte de África y China.
La frontera de Tailandia con Cambodia y
Myanmar.
Plasmodium vivax
Resistencia a Cloroquina
Resistencia a Primaquina
Oceanía, Myanmar, Guyana, Colombia y
Brasil.
Oceanía, Sureste de Asia y Somalia.
Los esfuerzos para erradicar la malaria han fracasado en muchas regiones del
mundo, y los esfuerzos actuales para controlar la enfermedad están enfocados en la
Introducción
9
reducción de la morbilidad y mortalidad atribuible. El programa de malaria “Roll Back”, una
asociación mundial establecida por la OMS, el Banco Mundial, Programa para el
Desarrollo de las Naciones Unidas y UNICEF, se ha expandido para incluir los gobiernos
nacionales, organizaciones no gubernamentales, grupos del sector privado y los
investigadores. Los cuatro componentes principales de este programa incluyen:
1. Mejorar el acceso a un tratamiento eficaz.
2. Prevenir la malaria durante el embarazo.
3. Reducir el contacto mosquito-humano mediante el uso de insecticidas.
4. Garantizar medidas oportunas y adecuadas durante las epidemias de malaria.
Introducción
10
1.4 Etiología de la Malaria
1.4.1 Parásito
1.4.1.1 Características generales de Plasmodium4
A lo largo de los siglos XVIII y XIX, se discutió mucho acerca de la etiología de la
malaria por parte de diversos investigadores, a la luz de teorías sobre el origen de la
enfermedad tan dispares como el telúrico, vegetal o bacteriano. No fue hasta el año 1880
que el médico militar francés Charles Louis Alphonse Laveran, tras numerosas
observaciones, evidenció el origen protozoario de la parasitosis. Sin embargo, debió
transcurrir un tiempo hasta que el agente causal pudo ser situado a nivel taxonómico,
hecho atribuido a los científicos italianos Ettore Marchiafava y Angelo Celli en 1885,
recibiendo el nombre genérico de Plasmodium.
Plasmodium es un género de protistas del filo Apicomplexa, clase Aconoidasida,
orden Haemosporida y familia Plasmodiidae del que se conocen más de 175 especies. El
parásito siempre tiene dos huéspedes en su ciclo vital: un mosquito que actúa como
vector y un huésped vertebrado.
Figura 1.4 Trofozoíto de un Plasmodium.
Introducción
11
En la actualidad se reconocen cuatro especies parásitas en humanos dentro del
género Plasmodium:
1. P. falciparum (Welch, 1897): Organismo eucariota que cuenta con 14
cromosomas. Es la especie más patógena, causante del 90% de las muertes
por malaria y común en áreas tropicales. Requiere una temperatura mínima de
19ºC para poder desarrollarse en el hospedador invertebrado. En general, todas
las especies de plasmodios reducen el tiempo necesario para completar su ciclo
en base a incrementos térmicos. Esta afinidad térmica sí es dependiente de las
distintas especies, pero todas sucumben a temperaturas sostenidas por encima
de 45ºC. Es el agente causal responsable de las “fiebres tercianas malignas”.
2. P. vivax (Grassi & Feletti 1890): Posee el mayor rango de distribución
geográfica, ya que puede desarrollarse también en climas templados.
Relativamente poco común en África tropical, especialmente en su región más
occidental, debido fundamentalmente a factores inmunológicos de la población
humana allí existente. Actualmente es la única especie presente en los escasos
ciclos de transmisión activa en Europa. Junto con P. falciparum, monopoliza el
90% de los casos de plasmodiosis humana diagnosticados anualmente. Por
debajo de 15ºC no puede concluir la fase esquizogónica. Posee una fase
quiescente o latente llamada hipnozoíto que se sitúa a nivel hepático humano.
Causante de las “fiebres tercianas benignas”.
3. P. ovale (Stephens, 1922): También presenta hipnozoítos. Se localiza en la
costa oeste africana, donde parece suplantar a P. vivax. Responsable también
de las “fiebres tercianas benignas”.
4. P. malariae (Feletti & Grassi, 1889): Especie caracterizada por mostrar baja
parasitemia. Presente a nivel tropical del continente africano, tanto en regiones
orientales como occidentales. Causante de las “fiebres cuartanas”.
Introducción
12
1.4.2 Vector
Anopheles, es un género de mosquito de la familia Culicidae que habita en
prácticamente todo el mundo incluyendo Europa, África, Asia, América y Oceanía, con
especial intensidad en las zonas templadas, tropicales y subtropicales. Muchas especies
de Anopheles transmiten la malaria, las diferentes especies han variado las habilidades
para transmitir la enfermedad. Entre los vectores de la malaria más competentes están
Anopheles gambiae y Anopheles funestus en África y Anopheles darlingi en la cuenca del
Amazonas.
Figura 1.5 Anopheles gambiae
Introducción
13
1.5 Ciclo de vida de la Malaria
Las cuatro especies de parásitos de la malaria mencionadas anteriormente, tienen
ciclos de vida similares, aunque presentan ciertas diferencias menores. Llevan a cabo un
ciclo asexual (esquizogonia) en los vertebrados, que comprende una fase eritrocitaria y
otra extraeritrocitaria. El ciclo sexual (esporogonia) tiene lugar en el mosquito7.
1. Esquizogonia
Fase extraeritrocitaria: Los esporozoitos inoculados por el mosquito
alcanzan el parénquima hepático en unos 30 minutos. En el hepatocito el
parásito se divide en numerosos elementos hijos, dando lugar a un
esquizonte hepático cuyos merozoitos se liberan al torrente sanguíneo
unos 8-12 días después.
En 1980, Krotoski et al descubrieron que los esporozoitos de aquellas
especies que presentaban recidivas (P. vivax y P. ovale) no solamente
desarrollaban esquizontes tisulares en el hígado, sino que se
diferenciaban también en una forma a la que se denominó hipnozoito. Los
hipnozoitos permanecen durmientes en los hepatocitos y su tamaño es de
4-5 µm de diámetro. En un momento dado crecen y desarrollan una
esquizogonia exoeritrocitaria de la que resultan múltiples merozoitos que
invaden el torrente sanguíneo, provocando una recaída clínica.
Fase eritrocitaria: Los merozoitos liberados del esquizonte hepático
penetran en los hematíes, y dan origen a la enfermedad clínica si logran
hacerlo en un número significativo, ya que muchos son destruidos antes.
Una vez dentro de los hematíes se transforman primero en corpúsculos
específicos, que ofrecen prolongaciones protoplásmicas ameboides, y por
tener una vacuola central y el núcleo situado excéntricamente forman
pequeños anillos o trofozoitos. A continuación los parásitos destruyen la
hemoglobina, elaboran un pigmento hemático oscuro y crecen hasta
Introducción
14
convertirse en parásitos “semiadultos”. Después de acumularse todo el
pigmento en el centro eritrocitario se produce la división en un número
determinado de merozoitos jóvenes, y el hematíe resulta destruido.
Entonces los parásitos jóvenes quedan libres, penetran en seguida otros
hematíes y forman los esquizontes, que vuelven a madurar y dividirse.
Cuando la enfermedad se prolonga largo tiempo, junto a los esquizontes
de la generación asexual se presenta en la sangre alguna que otra forma
sexual diferenciada llamada gameto, que se distingue de los esquizontes
por carecer de vacuola y de las prolongaciones protoplásmicas, y por
presentar un núcleo grande y el pigmento dispuesto en forma
groseramente bacilar.
2. Esporogonia: Estos gametos, al ser ingeridos por el mosquito que pica al
palúdico que los posee, experimentan la proliferación sexual (esporogonia) en
el cuerpo del mosquito. Los gametos pasan al estómago del mosquito, donde
las formas asexuales mueren y se efectúa la fecundación, originándose
formas falciformes, los esporozoitos, que de la cavidad abdominal del
mosquito emigran a su glándula salival, de la que son inoculados al hombre
mediante nueva picadura. Con esta generación alternante asexuada en el
hombre enfermo y sexuada en el seno del mosquito, queda cerrado el ciclo
evolutivo del parásito. El desarrollo sexual dura de 10 a 20 días y necesita
temperaturas exteriores altas, de más de 15°C (no inferiores a 8°C por la
noche).
Introducción
15
Figura 1.6 Ciclo de vida completo del plasmodio. El mosquito Anopheles infectado en
su picadura transmite los esporozoitos del parásito Plasmodio. Los esporozoitos
infectan células hepáticas que maduran hasta esquizontes y liberarán después
merozoitos. Fase Exo-Eritrocítica y fase Endo-Eritrocítica. Los merozoitos
infectan los hematíes. Los trofozoítos maduros dan esquizontes que se rompen para
dar más merozoitos. Algunos merozoitos pasan a ser nuevos gametocitos. Los
gametocitos sexuados son ingeridos por el mosquito. La fase Esporogónica.
Microgametos y macrogametos forman cigotos que evolucionan hasta ookinete.
Estos a su vez se desarrollan hasta que los oocitos se rompen dando esporocitos que
se almacenan en las glándulas salivares del mosquito esperando a ser inoculadas a otro
humano . Http://www.dpd.cdc.gov/dpdx/HTML/ImageLibrary/Malaria_il.htm
Introducción
16
1.6 Transmisión de la Malaria
Los patrones de transmisión de la malaria y de la enfermedad en sí varían mucho
de una región a otra, incluso dentro de un mismo país. Esta diversidad se debe a
variaciones entre los parásitos de la malaria y los vectores mosquito, a las condiciones
ecológicas que afectan a la transmisión de la malaria y a factores socioeconómicos, tales
como la pobreza y el acceso a servicios de prevención y de asistencia sanitaria efectivos.
Generalmente, la malaria es transmitida por el mosquito Anopheles hembra que
pica por la noche. También, al igual que cualquier patógeno que invade la sangre, es
posible infectarse a través de transfusiones sanguíneas, inoculación accidental o
trasplante de órganos. Además, el parásito puede transmitirse de madre a feto8.
La infección por malaria durante el embarazo puede provocar el nacimiento de
niños con bajo peso, el retraso en el crecimiento intrauterino del feto y la anemia materna,
entre otros trastornos. Las mujeres embarazadas con baja inmunidad adquirida contra la
malaria tienen un mayor riesgo de sufrir las complicaciones más graves, entre ellas la
anemia grave por malaria, abortos, el nacimiento de un niño muerto y, finalmente, la
muerte de la madre y del recién nacido9.
La intensidad de la transmisión de la malaria puede ser definida por la tasa de
inoculación entomológica y el número de picaduras de mosquito infectado por persona por
año. La transmisión de la malaria puede ser durante todo el año, o en regiones con
estaciones de lluvias, a menudo dramáticamente después de los picos de la aparición de
las lluvias. En algunas zonas la incidencia de la malaria por P. falciparum es estacional,
mientras que la malaria por P. vivax, que puede tener un período más largo de
incubación, se produce todo el año.
Introducción
17
1.7 Patogénesis de la Malaria
El fenómeno esencial que ocurre durante la infección malárica es el secuestro de
eritrocitos que contienen formas maduras del parásito en el lecho vascular profundo. Los
glóbulos parasitados son menos deformables que los otros eritrocitos, y por ello no pasan
fácilmente a través del lecho capilar7.
Varios factores contribuyen a la severidad de la enfermedad clínica. Cargas del
parásito altas combinado con la capacidad única de los eritrocitos infectados a adherirse
al endotelio contribuye a la oclusión microvascular, alteración metabólica y acidosis, que
conducen a las manifestaciones de malaria severa (síndrome de dificultad respiratoria
aguda, insuficiencia renal y malaria cerebral). Además, una respuesta vigorosa de las
citoquinas a las proteínas del parásito liberada durante la ruptura de los esquizontes
puede contribuir a resultados clínicos adversos6.
Las manifestaciones de la enfermedad también pueden estar relacionadas con
hemólisis intravascular y el consumo de glucosa por el parásito. Los factores del huésped
tales como la enfermedad de células falciformes y la deficiencia de glucosa-6-fosfato
deshidrogenasa pueden modificar la gravedad de la enfermedad.
Las infecciones causadas por P. vivax, P. malariae y P. ovale generalmente son
más leves que la malaria por P. falciparum; los síntomas están relacionados con carga
parasitaria y liberación de citocinas, siempre y cuando no se produzcan fenómenos vaso-
oclusivos6.
Introducción
18
1.8 Manifestaciones clínicas de la Malaria10
Las manifestaciones clínicas de la malaria se deben sólo a las formas asexuadas
de la esquizogonia hemática, ya que ni las exoeritrocíticas (intrahepáticas), ni las
sanguíneas sexuadas (gametocitos) producen síntoma alguno.
Están influidas por factores dependientes del parásito y del huésped. En cuanto al
parásito, P. ovale y P. vivax parasitan sólo los hematíes más jóvenes, P. malariae los más
viejos y P. falciparum tiene capacidad de parasitar los de todas las edades, por lo que sus
parasitemias pueden ser mucho mayores. En cuanto al huésped, el grado de inmunidad,
innata o adquirida, influye en las manifestaciones de la malaria.
Se pueden considerar diversas situaciones como:
Malaria no complicada
Malaria grave o complicada
Malaria y embarazo
Malaria en la infancia
Malaria e infección por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH)
Otras complicaciones de la malaria.
Malaria no complicada
Los síntomas iniciales son inespecíficos y comunes a las cuatro especies. El
síntoma principal es la fiebre que aparece al romperse los hematíes parasitados. Esta
ruptura al inicio es anárquica, por lo que el patrón de fiebre es irregular. Posteriormente se
sincroniza, sin conocerse el mecanismo, y se hace cíclica: fiebres cuartanas (cada tres
días) en P. malariae y fiebres tercianas (cada dos días) en las otras tres especies. Suele
acompañarse de escalofríos, tiritonas, cefaleas y artromialgias. Puede haber diarrea,
principalmente en niños.
Introducción
19
Malaria grave o complicada
La OMS ha establecido una serie de criterios que definen la malaria grave o
complicada (Tabla 1.2). La menor o mayor gravedad de la enfermedad estará
determinada por el número de criterios de gravedad que tenga el paciente.
Tabla 1.2 Criterios de gravedad del paludismo.
Criterios de la malaria grave o complicada (OMS)
1. Malaria cerebral.
2. Crisis convulsivas generalizadas o repetidas.
3. Anemia normocítica severa.
4. Insuficiencia renal.
5. Edema agudo de pulmón o distress respiratorio del adulto.
6. Hipoglucemia
7. Shock
8. Coagulación intravascular diseminada.
9. Acidosis metabólica.
10. Hemoglobinuria
11. Hiperparasitemia > 5% en no semi-inmunes.
Malaria y embarazo
Durante el embarazo disminuye la semi-inmunidad adquirida y aumenta la
frecuencia y gravedad de los accesos maláricos, sobre todo en primigestas y en el primer
y segundo trimestres del embarazo. Los abortos, la mortalidad infantil y el bajo peso del
recién nacido son más frecuentes.
Introducción
20
Malaria en la infancia
La malaria congénita es muy rara, <0,3% en zonas de hiperendemia, más si la
madre es semi-inmune. La malaria perinatal es la adquirida en el momento del
nacimiento, por un traumatismo obstétrico. Es la principal causa de morbilidad y
mortalidad infantil, siendo raro en lactantes de menos de tres meses, debido a los
anticuerpos transmitidos por la madre. La malaria severa ocurre principalmente entre los
seis meses y los tres años de edad. En los casos severos en la infancia son frecuentes:
coma, convulsiones, acidosis, hipoglucemia y anemia severa, siendo raros la ictericia y el
edema pulmonar y muy raro el fracaso renal.
Figura 1.7 Niño de Gambia con anemia severa por malaria.
Malaria e infección por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH)
Las dos enfermedades coinciden en amplias zonas. En África Subsahariana se
estima en 29 millones el número de personas VIH positivas. Cada vez es mayor la
evidencia de la interacción entre la malaria por P. falciparum e infección VIH. En pacientes
sin semi-inmunidad es más severo si son VIH positivos.
Introducción
21
1.9 Diagnóstico de la Malaria11
Actualmente, se cuenta con varias opciones diagnósticas. El diagnóstico clínico es
muy inexacto incluso en áreas endémicas. La microscopía es el mejor estándar en el
diagnóstico de la malaria. Se pueden realizar extensiones de sangre fina y gruesa; de las
cuales la última tiene la ventaja de que concentra los parásitos (20 a 40 veces más que
las extensiones finas). Además, la microscopía permite el diagnóstico de infecciones
mixtas y cuantificación del parásito, por lo que permite monitorizar el tratamiento.
La prueba de diagnóstico rápida, determina anticuerpos en unas tiras en forma
simple pero sólo permite identificar al P. falciparum y P.vivax. No permite cuantificar la
parasitemia y se cree que es subóptima en recuentos bajos del parásito. Por su parte, la
coloración fluorescente con naranja de acridina detecta el parásito en sangre aún con
parasitemias bajas. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) realiza una
amplificación de los genes del parásito (plásmidos).
Diagnóstico diferencial
La malaria al tener una variedad de síntomas inespecíficos, su diagnóstico siempre
debe de estar presente ante un cuadro febril; debe ser considerada en pacientes con
historia de viaje reciente sobre todo en áreas endémicas, posterior a trasfusiones,
trasplantes de órganos. Ningún antimalárico utilizado como profilaxis puede garantizar
protección absoluta en la actualidad. Algunas entidades con las que se debe realizar el
diagnostico diferencial son: hepatitis virales, citomegalovirus, Epstein Barr Virus,
Leptospirosis, dengue, fiebre amarilla entre otros.
Introducción
22
1.10 Tratamiento de la Malaria12
Las drogas antimaláricas de uso común proceden de cinco clases de compuestos:
quinolinas y arilaminoalcoholes, antifolatos, derivados de la artemisinina,
hidroxinaftaquinonas y agentes antibacterianos.
1. Quinolinas y arilaminoalcoholes: En esta clase de compuestos están la
cloroquina, la amodiaquina, quinina, quinidina, mefloquina, halofantrina,
primaquina, tafenoquina, lumefantrina, piperaquina y pironaridina.
Cloroquina: 4-aminoquinolina que actúa principalmente en las etapas
maduras del trofozoito del parásito.
Amodiaquina: Base de Mannich 4-aminoquinolina. Es más activa que la
cloroquina contra parásitos resistentes.
Quinina: Medicamento derivado de la corteza del árbol de la quina. Para
el tratamiento de malaria por P. falciparum contraída en regiones donde la
sensibilidad a la quinina está reducida.
Quinidina: Está relacionada con la quinina, pero es más cardiotóxica.
Mefloquina: Compuesto de metanol de quinolina con una vida media de
eliminación prolongada.
Primaquina: 8-aminoquinolina que erradica hipnozoitos de P. vivax y P.
ovale en el hígado.
Tafenoquina: 8-aminoquinolina nueva que tiene una vida media mucho
más larga que la primaquina.
Lumefantrina: Derivado racémico 2, 4, 7, 9-fluor sustituido.
Piperaquina: Compuesto de bisquinolina relacionado a la cloroquina.
Pironaridina: Base de Mannich desarrollada en China.
Introducción
23
Figura 1.8 Estructura de drogas antimaláricas del grupo de las quinolinas y
arilaminoalcoholes.
2. Antifolatos: Inhibidores de la síntesis de folato, por ejemplo, piremetamina,
proguanil, clorproguanil y trimetropin.
Pirimetamina: Actúa inhibiendo la dihidrofolato reductasa plasmodial
(DHFR) mientras que las drogas sulfa con las que es combinada inhiben
la dihidropteroato sintasa (DHPS).
Proguanil: Es una biguanida y, como el clorproguanil, actúa como un
profármaco de un metabolito activo que también inhibe la DHFR.
Introducción
24
Figura 1.9 Estructura de drogas antimaláricas del grupo de los antifolatos.
3. Derivados de artemisinina: A esta clase de compuestos pertenecen la
artemisinina, dihidroartemisinina, arteméter y artesunato. Constituyen la base
del tratamiento moderno de la malaria.
Figura 1.10 Estructura de drogas antimaláricas del grupo de los derivados de artemisinina.
4. Hidroxinaptaquinonas
Atovaquona: Se utiliza en una combinación fija con proguanil para la
profilaxis y el tratamiento de la malaria.
Introducción
25
Figura 1.11 Estructura de la droga antimalárica Atovaquona.
5. Medicamentos antibacterianos con actividad antimalárica: Por ejemplo, la
clindamicina y las tetraciclinas. Estos medicamentos son antimaláricos débiles,
de acción lenta y no deben ser utilizados como monoterapia para el
tratamiento de la malaria.
Introducción
26
1.11 Prevención y control de la Malaria
1.11.1 Control del vector13
El genoma del Anopheles gambiae ha sido secuenciado proporcionando
oportunidades para medidas de control nuevas. El control de los mosquitos ha estado en
el centro de esfuerzos anteriores para erradicar la malaria, principalmente mediante el uso
del insecticida DDT (dicloro-difenil-tricloroetano) para el interior de las viviendas. Se
alcanzaron éxitos notables, pero el programa no fue sostenible.
Los ensayos de mosquiteros tratados con insecticida (MTI) han mostrado una
reducción consistente en la mortalidad infantil y en los episodios de malaria clínica
durante un periodo de 1-2 años. Los repelentes pueden proporcionar protección útil contra
la malaria, especialmente en lugares donde los mosquitos pican al anochecer. En estas
situaciones pueden añadir un beneficio a los MTI.
Inevitablemente, la resistencia a los piretroides está emergiendo, pero se está
avanzando en la identificación de insecticidas alternativos que pueden ser utilizados para
el tratamiento de mallas y otros materiales. Una forma de evitar la resistencia a los
insecticidas es el uso de mezclas de insecticidas en las mallas.
A pesar de los beneficios y la rentabilidad de los MTI, su uso generalizado ha
demostrado ser difícil. En la mayoría de los países de África subsahariana, sólo un
pequeño porcentaje de personas que deberían estar protegidos por mallas
realmente las utilizan, debido a que su costo hace que no estén disponibles para la
mayoría de los grupos vulnerables.
La gestión ambiental (incluyendo el drenaje de sitios de reproducción), la mejora del
diseño de las casas, el uso de peces larvívoros y la zooprofilaxis han demostrado su
eficacia en algunas situaciones epidemiológicas específicas, pero se deben basar en un
conocimiento detallado del comportamiento de los principales vectores locales.
Introducción
27
1.11.2 Vacunas para la Malaria14
Se han realizado numerosos intentos por lograr la protección contra la infección
por plasmodios, fundamentalmente por P. falciparum, en sus distintos estadios. Todas las
estrategias empleadas, sin embargo, convergen en tres direcciones básicas:
1. Vacunas dirigidas contra las fases hemáticas asexuadas.
2. Vacunas bloqueadoras de la transmisión.
3. Vacunas preeritrocíticas.
Vacunas dirigidas contra las fases hemáticas asexuadas
Estas vacunas están diseñadas para reducir la frecuencia y la gravedad de las
manifestaciones clínicas de la enfermedad producida por el parásito. Están dirigidas a
evitar la invasión parasitaria de los eritrocitos una vez que las células hepáticas liberan a
los merozoítos. Este proceso, que requiere de una estrecha adhesión del merozoíto al
eritrocito, culmina con la fusión de las membranas plasmáticas de ambas células.
Vacunas bloqueadoras de la transmisión
Están diseñadas para bloquear la transmisión de la enfermedad ya que estimulan
la producción de anticuerpos contra antígenos de la fase sexuada del parásito, que
puedan impedir el desarrollo de esporozoítos infecciosos en las glándulas salivales de los
mosquitos Anopheles.
Teóricamente, estas vacunas podrían interrumpir el ciclo de transmisión del
parásito al paso de este por el vector y serían de gran utilidad para reducir la diseminación
de parásitos de cepas resistentes a otros tipos de vacunas.
Dos formulaciones de vacunas bloqueadoras de la transmisión (una basada en el
antígeno Pv25 de P. vivax expresado en Saccharomices cerevisiae, y otra en el antígeno
Introducción
28
Pf25 de P. falciparum expresado en Picchia pastoris) han pasado con éxito la fase de
estudios preclínicos y se encuentran actualmente en estudios clínicos de fase I.
Vacunas preeritrocíticas
Están dirigidas contra los esporozoítos y las formas asexuadas que se alojan en el
hígado, y tienen como objetivo evitar la liberación de merozoítos primarios hacia el
torrente circulatorio. Estas vacunas interrumpirían el proceso infeccioso y, en
consecuencia, evitarían las manifestaciones clínicas de la enfermedad.
De los antígenos empleados en este tipo de vacuna, la proteína circunsporozoítica
es la que ha generado más respuestas inmunoprotectoras. De los numerosos candidatos
vacunales diseñados a partir de las secuencias de esta proteína, el más avanzado se
basa en los polipéptidos RTS,S/AS02A.
Introducción
29
1.12 Aproximaciones en la búsqueda de fármacos
antimaláricos15
Recientemente se han producido una serie de avances que abren nuevas
expectativas en el desarrollo de antimaláricos. El advenimiento del proyecto genoma junto
con el conocimiento cada vez mayor del mecanismo de acción de ciertos fármacos y de
las bases moleculares de la resistencia constituyen el punto de partida para identificación
de nuevos compuestos.
En relación con las estrategias utilizadas en la identificación de nuevos
compuestos aplicables al control de la malaria existen dos tendencias:
1. La utilización de combinaciones nuevas de fármacos ya conocidos o derivados
de clases de compuestos de eficacia reconocida con el fin de generar análogos
que sean activos incluso frente a cepas resistentes.
2. La identificación de una serie de potenciales dianas terapéuticas, esenciales
para la viabilidad que resultan del conocimiento del parásito, y que desde una
perspectiva “racional” se estudian para desarrollar inhibidores específicos a
partir de información funcional y estructural.
Solo algunos ejemplos de compuestos están en fase de estudios preclínicos.
Algunos de los ejemplos más significativos de compuestos en fase de desarrollo son:
1. Los inhibidores de proteasas.
2. Inhibidores de la síntesis de ácidos grasos.
3. Inhibidores de la ruta de biosíntesis de isoprenoides.
4. Compuestos que interfieren con el transporte y el metabolismo de fosfolípidos.
5. Inhibidores del metabolismo mitocondrial.
6. Inhibidores del metabolismo de pirimidinas.
Introducción
30
2.1 Definición de Leishmaniasis16
La leishmaniasis es una infección causada por parásitos protozoarios del género
Leishmania, transmitida al ser humano por la picadura de hembras de los flebótomos,
pertenecientes a los géneros Phlebotomus y Luztzomyia. Varias especies de Leishmania
pueden infectar al ser humano produciendo un espectro clínico que incluye infección
asintomática y tres síndromes clínicos principales: leishmaniasis visceral, leishmaniasis
cutánea y leishmaniasis mucosa o mucocutánea.
La leishmaniasis visceral, también conocida como kala-azar, se caracteriza por
episodios irregulares de fiebre, pérdida de peso considerable, inflamación del bazo y del
hígado y anemia.
La forma más común de la enfermedad es la leishmaniasis cutánea. Por lo
general, produce úlceras en las partes expuestas del cuerpo, tales como la cara, los
brazos y las piernas. Puede haber un gran número de lesiones que pueden causar una
discapacidad grave.
En la leishmaniasis mucocutánea, las lesiones pueden llevar a la destrucción
parcial o total de las membranas mucosas de la nariz, boca y cavidades de la garganta y
tejidos circundantes.
Introducción
31
2.2 Historia de la Leishmaniasis17
Se conocen referencias de la enfermedad en el papiro de Ebers (hacia 1600 a.C.).
La evolución del conocimiento de la leishmaniasis desde el punto de vista histórico se
resume en la Tabla 2.1.
Tabla 2.1 Historia de la leishmaniasis17.
Historia de la leishmaniasis
Papiro de Ebers (hacia 1600 a.C.): «Grano del Nilo»
Biblia: La sexta plaga de Egipto (Éxodo 9, v.8).
Nuevo Mundo: Formas mucocutáneas en la época precolombina: «huacos».
1756: Alexander Russell, en Aleppo: primera descripción de la enfermedad en inglés.
1885: Cunningham: identifica a los parásitos como causantes de la enfermedad.
1898: Borowsky: distingue núcleo y quinetoplasto dentro de los amastigotes.
1903: Leishman y Donovan, en la India, y Wright a partir de una úlcera en un niño
armenio, describen el protozoo causante del kala-azar. Ross establece el género
Leishmania.
1908: Nicolle publica los procedimientos de cultivo del parásito.
1909: Lindenberg realiza las primeras publicaciones en el Nuevo Mundo.
1911: Wenyon sugiere que el mosquito podría ser el vector. Vianna clasifica el
parásito como Leishmania braziliensis, y establece la utilidad de los antimoniales en el
tratamiento. Bates, comunica el primer caso de leishmaniasis mucocutánea.
1921: Los hermanos Sergent, Parrot, Donatein y Bequet, picadura experimental en
voluntarios, con desarrollo de lesión cutánea.
1925: Adler y Theodor identifican el agente causal y el vector infectando
artificialmente mosquitos y comprobando la transmisión a través de su picadura.
1926: Montenegro desarrolla su test cutáneo.
1942: Vilanova introduce el tratamiento intralesional con antimonio pentavalente.
1968: Gunders et al señalan el carácter zoonótico de la leishmaniasis, aislando L.
major de Psammomys obesus.
1985: De la Loma et al describen por primera vez la coinfección Leishmania/VIH.
1996: Alvar et al señalan el ciclo artificial antroponótico en coinfectados.
Introducción
32
2.3 Epidemiología de la Leishmaniasis18
La leishmaniasis sigue siendo un problema de salud pública en todo el mundo,
afectando aproximadamente 12 millones de personas en 88 países en los que viven 350
millones de personas, principalmente en zonas rurales remotas. La enfermedad es de
declaración obligatoria solo en 40 países, por lo que de los aproximadamente 2 millones
de casos nuevos estimados por año, solo 600.000 se declaran oficialmente.
La leishmaniasis visceral es endémica en más de 60 países en las zonas
tropicales y subtropicales, y en los países del Mediterráneo; sin embargo el 90% de los
500.000 nuevos casos que ocurren por año solo involucran seis países: India, Nepal,
Brasil, Etiopia, Sudán y Bangladesh. En la última década, se ha expandido o surgido en
varios focos en todo el mundo debido al clima y factores humanos (por ejemplo,
urbanización, deforestación).
La leishmaniasis cutánea es endémica en más de 70 países, con un estimado de
1,5-2 millones de casos nuevos por año; de las formas cutáneas el 90% ocurren en
Afganistán, Arabia Saudí, Irán, Siria, Brasil y Perú, y el 90% de las mucocutáneas se
concentran en Bolivia, Brasil y Perú. Este tipo de leishmaniasis es más común en las
zonas rurales, en los entornos que van desde bosques tropicales hasta las zonas áridas;
sin embargo es cada vez más reportada en las zonas urbanas y peri-urbanas del Viejo y
Nuevo Mundo.
La leishmaniasis en España
En España, tanto la leishmaniasis cutánea como la visceral están producidas por
L. infantum y han sido enfermedades de declaración obligatoria (EDO) desde febrero de
1982 hasta el 1 de julio de 1996; a partir de entonces, son enfermedades de notificación
regional y sólo se registran en las comunidades autónomas donde se considere oportuno.
Introducción
33
Por ello no se dispone de una información fiable, aunque la declaración obligatoria previa
tampoco reflejaba la realidad por existir una subdeclaración evidente.
De acuerdo con los datos oficiales EDO, las comunidades autónomas más
afectadas son Aragón, Baleares, Cataluña y Valencia y, en un segundo grupo, Andalucía,
Castilla-La Mancha y Madrid. Por otra parte, en esta declaración no se diferencia entre
leishmaniasis cutánea y kala-azar, por lo que es muy difícil establecer una estimación.
Una estimación realista sería de unos 200 casos nuevos viscerales y 100 cutáneos al año.
Figura 2.1 Distribución geográfica de leishmaniasis visceral en el Viejo y Nuevo
Mundo (OMS, 2010).
Introducción
34
2.4 Etiología de la Leishmaniasis
2.4.1 Parásito
2.4.1.1 Características generales de Leishmania17,19
Leishmania, descrita en 1903 por Leishman y Donovan en la India y
simultáneamente por Wright en un niño armenio, es un protozoario flagelado
perteneciente al reino Protista, a la clase Zoomastigophora, orden Kinetoplastida y familia
Trypanosomatidae.
Leishman (1865-1926) Donovan (1863-1915)
Figura 2.3 William Boog Leishman y Charles Donovan.
El género Leishmania incluye más de dos docenas de especies, la mayoría de las
cuales parasita al ser humano. De todas ellas, L. donovani (L. archibaldi en el este de
África) y L. infantum (L. chagasi en el Nuevo Mundo), tienen un tropismo preferentemente
visceral y el resto cutáneo o mucocutáneo. No obstante, algunas de estas especies
viscerotrópicas pueden dar lugar a afectación exclusivamente cutánea, como es el caso
de L. infantum, agente de la leishmaniasis cutánea en España y en el resto de la cuenca
mediterránea occidental y L. chagasi, molecularmente idéntica a L. infantum, también es
Introducción
35
responsable de formas cutáneas en el Nuevo Mundo. Igualmente se han descrito casos
de afectación visceral por L. tropica en zonas endémicas y en veteranos de la guerra del
Golfo.
El parásito Leishmania, se ha adaptado a entornos muy variados y heterogéneos,
por ejemplo:
1. Temperaturas desde 37°C en el huésped mamífero hasta la temperatura
ambiente en el flebótomo e in vitro.
2. pH neutro hasta altamente ácido en el estómago del mosquito y los macrófagos.
3. Contenidos de nutrientes y oxígeno.
4. Ataque inmune: Complemento, anticuerpos, linfocitos T.
Esta rápida adaptación al medio ambiente debe haber sido debido a la capacidad
de Leishmania para modular la expresión de genes, que probablemente ocurre por la
amplificación de genes específicos.
2.4.2 Vector20, 21
La identificación de los flebótomos como vectores fue llevada a cabo, por primera
vez, por Adler y Theodor en 1925. Los vectores de las leishmaniasis (Figura 2.4) son
mosquitos del orden Dipterae, familia Psychodidae, subfamilia Phlebotominae y géneros
Phlebotomus (12 subgéneros), en el Viejo Mundo y Lutzomya (25 subgéneros), en el
Nuevo Mundo.
En general, las especies de mosquitos del Viejo Mundo viven en el desierto o en
los ecosistemas semiáridos y las especies del Nuevo Mundo habitan en los bosques.
Los flebótomos son pequeños insectos de color variable de blanquecinos a casi negros,
de aproximadamente 2-3 mm de longitud y de cuerpo y alas pilosos. Se encuentran
alrededor de asentamientos humanos y se reproducen en determinados residuos
orgánicos tales como heces, estiércol, madrigueras de roedores y en rincones oscuros, en
las grietas de las paredes con humedad y temperatura, aunque también se pueden
Introducción
36
observar en las regiones secas con un microclima local favorable (grietas, montículos de
termitas, cuevas, huecos y agujeros en las raíces de los árboles).
Son insectos de actividad crepuscular o nocturna, aunque algunas especies
pueden picar durante el día, y, aparentemente, no se desplazan lejos de su entorno
habitual. Ambos sexos suelen alimentarse de fuentes vegetales de azúcar, como la savia,
pero mientras que los machos son exclusivamente fitófagos, las hembras necesitan
alimentarse también con sangre, nutrición proteica imprescindible para la producción de
huevos. Por este motivo sólo las hembras son hematófagas y los machos no pican.
Figura 2.4 Vectores de la leishmaniasis19.
Introducción
37
2.5 Ciclo de vida de la Leishmaniasis7
Las leishmanias desarrollan su ciclo de vida en dos huéspedes: uno vertebrado
(mamíferos) y otro invertebrado (mosquitos hembra de la familia Phlebotomidae). En el
huésped vertebrado, Leishmania se encuentra en los macrófagos en forma amastigote
como parásito intracelular estricto. Esta forma parasitaria tiene un tamaño entre 3-5 µm x
2-3 µm y con un flagelo rudimentario que no sobresale del soma del protozoo. Los
amastigotes pasan al vector con la picadura, al ingerir éste sangre de un mamífero
parasitado. En la bolsa peritrófica del intestino medio del vector, los amastigotes se
transforman a promastigotes. El promastigote es una forma móvil y alargada con una
longitud que oscila entre 10-20 µm de largo por 4-8 µm de ancho, y con un único flagelo
en su polo anterior, de 10-20 µm de largo. Estos promastigotes se multiplican activamente
en el intestino medio del mosquito hematófago y al cabo de 15-20 días de su ingestión
algunos comienzan a desprenderse de la cutícula intestinal e invaden la hipofaringe. Por
la picadura a un nuevo huésped, el flebótomo inocula estos “promastigotes metacíclicos”,
que ya en el interior del huésped vertebrado serán fagocitados por las células del sistema
monocito-macrófago, donde se transforman y multiplican en amastigotes.
Introducción
38
Figura 2.5 Ciclo de vida completo de Leishmania. Los flebótomos inyectan la etapa
infecciosa, los promastigotes, durante las comidas en la sangre . Los promastigotes que
llegan a la herida punzante son fagocitados por los macrófagos y se transforman en
amastigotes . Los amastigotes se multiplican en las células infectadas y afectan distintos
tejidos, dependiendo en parte de las especies de Leishmania . Esto origina las
manifestaciones clínicas de la leishmaniasis. Los flebótomos son infectados durante las
comidas de sangre en un huésped infectado cuando ingieren macrófagos infectados con
amastigotes ( , ). En el intestino del mosquito, los parásitos se diferencian en
promastigotes , que se multiplican y migran a la probóscide .
Introducción
39
2.6 Transmisión de la Leishmaniasis
El vector responsable de la transmisión natural de Leishmania es la hembra
hematófaga de insectos dípteros del género Phlebotomus en el Viejo Mundo (Europa,
norte de África, Medio Este y Asia), y por el género Luztzmyia en el Nuevo Mundo (sur de
Estados Unidos hasta el norte de Argentina). Aproximadamente, 30 especies o
subespecies de estos vectores transmiten el parásito y se especula que alrededor de 40
especies adicionales están probablemente implicadas en la transmisión20.
La infección también puede ser transmitida por transfusión de sangre, trasplante
de órganos y congénitamente18. Excepcionalmente se ha comunicado la transmisión
accidental por aplastamiento de mosquitos infectados contra la piel, mecánica por la
mosca Stomoxys calcitrans (contaminada al alimentarse en úlceras infectadas por
Leishmania y posarse posteriormente en heridas no infectadas en seres humanos)22. La
transmisión por agujas infectadas en drogadictos es un mecanismo relativamente reciente
y de gran trascendencia en la coinfección Leishmania/VIH23.
Introducción
40
2.7 Patogénesis de la Leishmaniasis7
Desde el momento en que Leishmania penetra en el huésped, suceden una serie
de acontecimientos, en un principio de forma local y posteriormente a nivel general, que
pueden determinar o un fracaso en la instauración de la infección, o una infección, que
puede variar desde una forma incipiente o subclíncia a cualquiera de las formas clínicas
de esta parasitosis.
2.7.1 Invasión y desarrollo en las células susceptibles
La dosis de inoculo eficaz para que se pueda instaurar una leishmaniasis en el
hombre es deconocida, pero se supone que es una cifra bastante pequeña, del orden de
100 promastigotes. Estos promastigotes deben ser fagocitados por macrófagos, ya que un
largo tiempo sin ser fagocitados supone la destrucción del parásito por el suero humano,
probablemente por activación del complemento. En esta interacción macrófago-
Leishmania, la adherencia de la membrana del parásito a la del macrófago es muy
importante.
Una vez adherido a la membrana se produce la fagocitosis por parte del
macrófago. Desde el momento que comienza la fagocitosis los metabolitos del oxígeno se
liberan; sin embargo, esta liberación es pobre en los macrófagos no estimulados, y
además Leishmania posee superoxidodismutasa y catalasa que impiden la actividad
microbicida de estos productos.
Por otra parte, una vez producida la fagocitosis, el fagosoma se une a un lisosoma
primario. En el fagolisosoma comienza la transformación a amastigote. Los cambios que
se producen en esta transformación son los principales responsables de la supervivencia
en la célula huésped. Posteriormente, y una vez que los parásitos se han establecido en
el macrófago, se produce su multiplicación, que puede ocasionar la rotura de la célula y la
liberación de amastigotes que a su vez serán fagocitados por nuevas células.
Introducción
41
2.8 Manifestaciones clínicas de la Leishmaniasis
Las manifestaciones clínicas de las leishmaniasis son muy variadas y dependen
de la interacción de factores del parásito, factores dependientes del vector y de la
situación inmunitaria y susceptibilidad genética del huésped. Factores del parásito, como
por ejemplo, el tropismo de la especie y su capacidad infectiva, patogenicidad y virulencia.
Entre los factores dependientes del vector están el número de picaduras o la composición
de su saliva.
Este polimorfismo clínico se agrupa en tres formas diferentes como se mencionó
anteriormente: leishmaniasis visceral o kala-azar, la forma más grave; leishmaniasis
cutánea y leishmaniasis mucocutánea, que produce extensas lesiones destructivas de la
mucosa nasal, oral y faringe dando lugar a terribles desfiguraciones.
2.8.1 Leishmaniasis visceral24
La leishmaniasis visceral, también conocida como kala-azar, es una de las
enfermedades causadas por más de 20 especies de Leishmania. Por lo general, los
pacientes con leishmaniasis visceral presentan fiebre, tos, dolor abdominal, diarrea,
epistaxis, esplenomegalia, hepatomegalia, caquexia y pancitopenia. La linfadenopatía
periférica es común en algunos focos. L. donovani es la causa principal de leishmaniasis
visceral en el subcontinente indio y África oriental, L. infantum en la región mediterránea y
L. chagasi en el Nuevo Mundo. Las dos últimas especies son idénticas. Los seres
humanos son el único reservorio conocido de L. donovani.
Hay de 30-100 infecciones subclínicas para cada caso evidente de leishmaniasis
visceral. Los factores de riesgo para el desarrollo de la enfermedad clínica son la
desnutrición, las drogas inmunosupresoras, y, sobre todo, la coinfección por VIH. El
número de coinfecciones seguirá aumentando, especialmente en la India y Brasil, donde
la epidemia urbana del VIH y la epidemia rural de leishmaniasis visceral rurales están
Introducción
42
cada vez más en contacto. Los casos de coinfección se ven como una enfermedad
importada en áreas no endémicas. Los pacientes coinfectados pueden ser difíciles de
diagnosticar, no responden bien al tratamiento, y en repetidas ocasiones sufren recaída.
Figura 2.6 Leishmaniasis visceral (OMS)
2.8.2 Leishmaniasis cutánea17
2.8.2.1 Leishmaniasis cutánea aguda
Es la forma más habitual y comprende aquellos casos de menos de un año de
evolución si se trata de infecciones zoonóticas y de 2 años si son antroponóticas. Está
causada con más frecuencia por L. tropica, L. major, L. infantum (en la cuenca
mediterránea occidental fundamentalmente) y L. aethiopica, en el Viejo Mundo y L.
mexicana y L. braziliensis en el Nuevo Mundo. La localización preferente es la cara y, en
general, áreas descubiertas, por la natural accesibilidad a la picadura.
Introducción
43
2.8.2.2 Leishmaniasis cutánea crónica
Incluye los casos que exceden en duración a las formas agudas. Las lesiones
suelen ser más polimorfas (grandes placas induradas de borde papuloso,
eczematiformes, verrugosas, de aspecto queloideo). Suele estar asociada con L. tropica
en el Viejo Mundo y con L. braziliensis en el Nuevo Mundo, donde es mucho más
infrecuente aunque también puede producirse en la infección por L. infantum.
2.8.2.3 Leishmaniasis cutánea difusa o diseminada
Producida por L. aethiopica en el Viejo Mundo y L. mexicana complex en el Nuevo
Mundo. Se inicia con una pápula o nódulo que se disemina inicialmente en la vecindad y
luego a distancia con la aparición de numerosos nódulos, en cara y resto del tegumento,
de modo similar a la lepra. En cara da lugar a facies leonina, como la lepra lepromatosa.
Las lesiones suelen ser asintomáticas y sin tendencia a la ulceración. Esta forma tiene
mala respuesta al tratamiento, tiende a recidivar aunque no hay afectación visceral.
Figura 2.7 Leishmaniasis cutánea. Lesiones de varios meses de evolución en las que no
se ha producido ulceración17.
Introducción
44
2.8.3 Leishmaniasis mucocutánea25
Es la manifestación más severa de la enfermedad cutánea. Ocurre diseminación
hematógena o linfática de los parásitos desde la piel hasta la mucosa oro-nasofaríngea.
Los síntomas nasales crónicos pueden preceder a la destrucción progresiva de la
cavidad bucal y nasofaríngea. Causada por parásitos del subgénero Viannia en la
mayoría de los casos (L. braziliensis, en mayor proporción, L. guyanensis y L.
panamensis). No hay cura espontánea, difícil de tratar, potencialmente fatal. Fuera de
América Latina existen reportes escasos relacionados solo con la especie L. aethiopica.
Figura 2.8 Leishmaniasis mucocutánea (OMS).
Introducción
45
2.9 Diagnóstico de la Leishmaniasis
El diagnóstico diferencial de la leishmaniasis varía según la forma clínica y el área
de adquisición de la infección. La Tabla 2.2 muestra el diagnóstico diferencial de todas las
formas de la leishmaniasis. Aunque es muy poco frecuente en los viajeros, la
leishmaniasis visceral debe sospecharse en personas con historia de viaje a un área
endémica y enfermedad febril inexplicable, especialmente cuando hay
hepatoesplenomegalia y trombocitopenia. Debido al largo período de incubación de la
leishmaniasis, es fundamental que los médicos consideren los viajes a zonas endémicas
que se produjeron en el pasado. Los factores de riesgo para la infección por VIH también
deben ser considerados, incluidos los encuentros sexuales, el uso de drogas intravenosas
y las transfusiones de sangre obtenidas en el extranjero26.
Tabla 2.2 Diagnóstico diferencial de leishmaniasis18.
Leishmaniasis visceral Leishmaniasis cutánea y mucocutánea
Fiebre tifoidea
Brucelosis
Endocarditis bacteriana subaguda
Tuberculosis
Mononucleosis infecciosa
Malaria
Síndrome de esplenomegalia tropical
Histoplasmosis
Tripanosomiasis
Esquistosomiasis
Leucemia
Linfoma
Tuberculosis
Úlcera de Buruli
Lepra
Sifilis
Actinomicosis
Micosis
Infección bacteriana
Picaduras de insectos infectados
Sarcoidosis
Polipos nasales
Granulomatosis de Wegener
Desviación del tabique
Introducción
46
El examen microscópico del frotis de la médula ósea es el método de referencia
para el diagnóstico de la leishmaniasis visceral, y se asocia con >90% de sensibilidad en
los niños y el 70% de sensibilidad en adultos. Con aspirados del bazo se observan tasas
de sensibilidad más altas (> 95%), sin embargo cuando existe trombocitopenia profunda,
la toma de muestras del bazo puede desencadenar en una hemorragia mortal. El
diagnóstico también puede ser confirmado con métodos moleculares usando una serie de
muestras clínicas (sangre periférica, médula ósea, bazo) con alto porcentaje de
sensibilidad y especificidad27.
Las pruebas serológicas, como: las pruebas de aglutinación directas, la prueba de
inmunoensayo ligado a enzimas y la inmuno fluorescencia indirecta, se utilizan en lugares
donde otros métodos de diagnóstico no están disponibles con alta sensibilidad y
especificidad. Por regla general, los anticuerpos IgG permanecen detectables durante
varios años después de un tratamiento éxitoso, y por lo tanto las pruebas serológicas no
debe ser utilizadas en casos de recaídas18.
Los médicos deben considerar la posibilidad de leishmaniasis cutánea en
personas que hayan viajado a zonas endémicas y que presenten lesiones en la piel
crónicas que no cicatricen. La confirmación de laboratorio de la leishmaniasis cutánea se
logra mediante la detección de parásitos de Leishmania a través del examen microscópico
de las muestras de la piel manchada26. Las pruebas serológicas no son fiables para el
diagnóstico de leishmaniasis cutánea. La PCR es útil para el diagnóstico de leishmaniasis
cutánea y leishmaniasis mucocutánea debido al bajo número de parásitos. Actualmente,
el método más común disponible para el diagnóstico específico de las especies de
leishmaniasis es la PCR, importante para la elección del tratamiento adecuado18.
Introducción
47
2.10 Tratamiento de la Leishmaniasis28, 29
El fracaso terapéutico en leishmaniasis es común en áreas endémicas. Ocurre
debido al compromiso inmunológico del paciente, a cambios en la farmacocinética de las
drogas o a infecciones recurrentes. La resistencia a drogas juega un papel fundamental
en este fracaso terapéutico, y hasta ahora no existen marcadores de resistencia fáciles de
utilizar en la clínica. El único método confiable lo constituye el modelo in vitro macrófago-
amastigote, que es laborioso y de alto costo.
El establecimiento de una quimioterapia idónea contra leishmaniasis ha resultado
difícil, ya que el éxito de la misma varía con la especie de Leishmania y la severidad de la
enfermedad, el lugar donde se infecta el individuo y el estado nutricional e inmunológico
del paciente. Se han descrito más de 20 fármacos como eficientes para el tratamiento de
la leishmaniasis; sin embargo, sólo algunos son utilizados en el manejo clínico de esta
patología.
Los medicamentos más utilizados contra la leishmaniasis, están principalmente
dirigidos al estadio intracelular del parásito. El antimoniato de N-metilglucamina
(Glucantime®) fue descrito en 1912 y el estibogluconato sódico ha sido utilizado desde
1945. Algunos autores proponen que el mecanismo de acción de estos fármacos está
asociado al bloqueo de la glicólisis, el metabolismo de ácidos grasos y la formación de
ATP. También, se ha propuesto que los antimoniales bloquean la formación de grupos
sulfihidrilos de enzimas reguladoras de la actividad metabólica del parásito en los
glicosomas.
Otro fármaco muy utilizado desde 1960 es la anfotericina B. Este es un antibiótico
poliénico que se administra por vía parenteral como deoxicolato, y desde 1997 en
liposomas (Ambisome®). Este fármaco altera la permeabilidad de la membrana celular al
unirse a grupos esteroles y formar poros, aumentando la salida de K+. La anfotericina B
presenta una actividad selectiva contra Leishmania y Tripanosoma cruzi. Sin embargo, su
Introducción
48
uso en regiones endémicas tiene como limitaciones el costo del tratamiento, las
dificultades de administración y su toxicidad.
Como alternativas de tratamiento de segunda línea se utilizan la pentamidina y la
paromicina desde 1987, y el ketoconazol y la dapsona, más recientemente. La
pentamidina es una diamidina que bloquea la síntesis de poliaminas y del ADN del
kinetoplasto del parásito; tiene un espectro relativamente amplio y es eficaz en la
leishmaniasis visceral y la tripanosomiasis. Por su parte, la paromicina es un
aminoglicósido que bloquea la síntesis de proteínas al disminuir la transducción de
ARNm. El ketoconazol (imidazol) es un antimicótico que bloquea la C-14 desmetilasa,
alterando la función de la membrana, y la dapsona es un antimetabolito. Ambos se utilizan
como alternativas orales o tópicas en casos de leishmaniasis cutánea.
Introducción
49
2.11 Prevención y control de la Leishmaniasis16
En la actualidad, no existe ningún modelo bien definido para un control
costoeficaz. Es evidente que deben reforzarse tanto la detección activa de casos de
leishmaniasis cutánea y visceral como la capacidad de diagnóstico en los centros de
salud.
La estrategia de la OMS para apoyar a los países endémicos tiene por objeto
reducir la incidencia de la leishmaniasis a un nivel que permita a cada país integrar las
actividades de control y vigilancia, técnico y financiero, en general las actividades de
desarrollo sanitario. Para lograr esto, la OMS ha adoptado un enfoque de cinco vertientes:
1. Facilitar el diagnóstico precoz y tratamiento oportuno.
2. Ofrecer soporte para el control del vector mediante la fumigación de las casas y
el uso de mosquiteros impregnados con insecticida.
3. Proveer educación para la salud y la producción de material de capacitación.
4. Detectar y controlar las epidemias en las primeras etapas.
5. Brindar un manejo eficaz de las coinfecciones de leishmania/VIH.
Introducción
50
2.12 Aproximaciones en la búsqueda de fármacos
antileishmaniásicos
La disponibilidad reciente de la secuencia genómica de Leishmania ha favorecido
la identificación y validación de nuevas dianas terapéuticas. Actualmente, se están
ensayando:
1. Inhibidores de la biosíntesis de ergosterol (Roberts y col, 2003)
2. Inhibidores de diversas cisteínas-proteasas (Ponte-Sucre y col, 2007)
3. Inhibidores del metabolismo del pirofosfato (Yardely y col, 2002)
4. Inhibidores de la síntesis y metabolismo de la tripanotiona (Heby y col, 2007)
5. Inhibidores de la incorporación de purinas y de la síntesis de fosfolípidos (Heby
y col, 2007).
El lento desarrollo de estos fármacos se debe fundamentalmente a la falta de
estímulos económicos que éstos representan para la industria farmacéutica.
Además, se han probado donadores de óxido nítrico30 y extractos de plantas
medicinales31. Por otra parte, se ha evaluado la posibilidad de realizar inmunoterapia
utilizando factores de virulencia como la glicoproteína gp63 (proteasa de superficie o
leishmaniolisina en la L. mexicana), la glicoproteína gp46/M2 y el complejo de proteínas
protectoras P8 en el género L. pifanoi, entre otros32.
El fracaso terapéutico contra la leishmaniasis puede estar relacionado con los
fármacos, el parásito y el hospedero. Las causas relacionadas con los fármacos incluyen
las propiedades farmacocinéticas, el uso de dosis sub-óptimas, el costo del tratamiento y
la toxicidad de los compuestos. Entre las relacionadas con el parásito están la
quimioresistencia y la tolerancia. Finalmente, las causas imputables al hospedero están
establecidas por el estatus inmunológico del paciente, la reinfección y su interrelación con
el parásito.
AAnntteecceeddeenntteess
Antecedentes
53
3.1 Actividad biológica de las quinoxalinas
Los derivados de quinoxalina, especialmente los 1,4-di-N-óxidos, son una clase de
compuestos que presenta actividad biológica como antiviral, anticancerosa,
antibacteriana, antimicrobiana, antiulcerosa, antimalárica, antiinflamatoria, entre otros33-37;
motivo por el cual en las últimas décadas el interés por estos compuestos ha estado
creciendo dentro del área de la química medicinal38.
El anillo de quinoxalina está descrito como bioisóstero de los de quinoleína,
naftaleno, benzotiofeno y otros ciclos aromáticos como piridina y pirazina (Figura 3.1),
algunos de los cuales son la base de conocidos agentes antimaláricos y antituberculosos
de uso clínico39.
Figura 3.1 Estructura del anillo de 1,4-di-N-óxido de quinoxalina y sus bioisósteros39.
Las quinoxalinas 1,4-di-N-óxido amplían las actividades biológicas de sus
análogos reducidos7, como la actividad antibacteriana y la actividad anticancerosa en
hipoxia40.
Antecedentes
54
Científicos en Bélgica y el Reino Unido han descubierto que los derivados de
quinoxalina son un tratamiento potencial para la infección por el VIH, y funcionan bien en
combinación con lamivudina, abacavir y efavirenz40. Su mecanismo de acción es como
inhibidores de la enzima transcriptasa inversa del VIH-141. Entre los compuestos
destacados con buena actividad antiviral está el 6-cloro-4-(isopropeniloxicarbonil)-3,3-
dimetil-3,4-dihidroquinoxalin-2-[1H]tiona (Figura 3.2).
Figura 3.2 Estructura del 6-cloro-4-(isopropeniloxicarbonil)-3,3-dimetil-3,4-
dihidroquinoxalin-2-[1H]tiona41.
El Instituto de Química Farmacéutica y Toxicología de la Universidad de Sassari
(Italia) ha desarrollado derivados de quinoxalina 2-(arilmetilmercapto-, arilmetilsulfinil- y
piperazinil-3-R-sustituidas), los cuales han mostrado una importante actividad
gastroprotectora y antiulcerosa. El 3-metil-[N-etil-piperazin-1-il]quinoxalina (Figura 3.3) es
el derivado más potente debido a que presenta una actividad superior a la de la
ranitidina42.
Figura 3.3 Estructura del 3-metil-[N-etil-piperazin-1-il]quinoxalina42.
Antecedentes
55
Cabe destacar, la actividad que presentan algunos derivados de quinoxalina en el
tratamiento de enfermedades del sistema nervioso central43. En los años 80 mostraron
actividad como antagonistas competitivos de los receptores AMPA del glutamato44 y
fueron considerados para la mejora de la eficacia, selectividad y solubilidad en el
desarrollo de fármacos con actividad en el SNC.
3.1.1 Quinoxalinas como antitumorales
Se ha propuesto que las células hipóxicas en tumores sólidos juegan un papel
negativo en el éxito de algunas terapias antitumorales debido a la resistencia que
presentan éstas frente a la radioterapia y los agentes quimioterapéuticos
convencionales45. Estas células contienen altos niveles de enzimas biorreductivas, por lo
que se podría establecer que representan una buena diana terapéutica para ser atacadas
por agentes activados “biorreductivamente”.
Diversos tipos de compuestos que son activados bajo condiciones hipóxicas están
en diferentes etapas de desarrollo: nitroderivados, incluyendo nitroimidazoles, 9-
alquilamino-1-nitroacridinas y nitroquinolinas; derivados de quinona (el derivado de
mitomicina C, E09); y agentes derivados de 1,2,4-benzotriazina-1,4-di-N-óxido y
quinoxalina-1,4-di-N-óxido45.
Tomando la benzotriazina-3-amino-1,2,4-benzotriazina-1,4-dioxido (WIN 59075;
Tirapazamina (TPZ); Figura 3.4) como antecedente estructural, nuestro grupo de
investigación se planteó la síntesis y la evaluación biológica de nuevos agentes derivados
de quinoxalina-1,4-di-N-óxido y compuestos relacionados que han demostrado ser
agentes citotóxicos eficientes contra las células hipóxicas en tumores sólidos.
Antecedentes
56
Figura 3.4 Estructura de la tirapazamina45.
Por otro lado, bajo las condiciones de hipoxia encontradas en las células
tumorales, la TPZ activada puede causar daño citotóxico en el ADN. Se tiene la hipótesis
de que la reducción de la TPZ conduce a la producción de un radical altamente oxidante
que daña el ADN; sin embargo, la identidad exacta de esta especie sigue siendo motivo
de debate46. Uno de los agentes citotóxicos más potentes en concentraciones de hipoxia
es la 1,4-di-N-óxido de 2-benzoil-6,7-dicloro-3-fenilquinoxalina (Figura 3.5)47-48.
Figura 3.5 Estructura del 1,4-di-N-óxido de 2-benzoil-6,7-dicloro-3-fenilquinoxalina48.
3.1.2 Quinoxalinas como antibacterianos y antimicrobianos
Las quinoxalinas también presentan actividad frente a bacterias Gram(+) y
Gram(-), motivo por el cual se han sintetizado derivados de quinoxalina con el objetivo de
investigar su actividad.
Desde el año 1940 los derivados de 1,4-di-N-óxido de quinoxalina son conocidos
como potentes agentes antibacterianos y han sido utilizados como aditivos de piensos
Antecedentes
57
para promover el crecimiento de los animales y mejorar la eficacia de la alimentación.
Entre estos compuestos se pueden mencionar el carbadox (CBX), el olaquindox (OLA), el
cyadox (CYA), el mequindox (MEQ) y la quinocetona (QCT)49.
Metzner y cols. mantienen que las quinoxalinas sustituidas en posiciones 2,3 y/o 6
presentan actividad antibacteriana. Entre los compuestos destacados en este estudio está
el 2-cloro-3-metil-6-nitroquinoxalina (Figura 3.6) que ha demostrado tener actividad sobre
Candida albicans y ciertas bacterias Gram (+)50.
Figura 3.6 Estructura del 2-cloro-3-metil-6-nitroquinoxalina50.
Antecedentes
58
3.2 Derivados de 1,4-di-N-óxido de quinoxalina y enfermedades
olvidadas
La necesidad de buscar nuevas terapias económicamente accesibles para la
población afectada por enfermedades olvidadas es cada vez más urgente. A lo largo de
los años, nuestro grupo de investigación ha llevado a cabo el diseño y la síntesis de
diversos derivados de 1,4-di-N-óxido de quinoxalina con el objetivo de encontrar nuevos
líderes para el tratamiento de algunas de estas enfermedades. Como resultado de varios
proyectos de investigación, se han desarrollado nuevas estructuras activas como agentes
antituberculosos, antimaláricos, antichagásicos y, más recientemente, como agentes
antileishmaniásicos39.
3.2.1 Derivados de 1,4-di-N-óxido de quinoxalina y tuberculosis
Como ya se ha comentado anteriormente, los derivados 1,4-di-N-óxido de
quinoxalina han mostrado importante actividad como antibacterianos. Debido a la similitud
entre algunos medicamentos antituberculosos y la quinoxalina (Figura 3.7), así como la
presencia del heterociclo de quinoxalina en algunos antibióticos de amplio espectro, se
pensó que los análogos de quinoxalina podrían exhibir actividad antituberculosa51.
Figura 3.7 Estructuras de ciertos medicamentos para el tratamiento de tuberculosis51.
Antecedentes
59
Nuestro grupo de trabajo ha publicado varios estudios en los cuales la síntesis y la
evaluación biológica de numerosas quinoxalinas y derivados de 1,4-di-N-óxido de
quinoxalina han sido descritos39,52-56. Estos estudios han facilitado un amplio análisis de la
relación estructura-actividad (QSAR) que ha llevado al diseño de una serie de derivados
de 1,4-di-N-óxido de quinoxalina sustituidos en posición 2 (ésteres, cetonas, carbonitrilos,
amidas), 3 (fenilos, metilos), 6 y 7 que presentan actividad antituberculosa33,38. Por
ejemplo, diferentes 7-cloro-3-(p-sustituidos)fenilaminoquinoxalina-2-carbonitrilo 1,4-di-N-
óxidos (I, Figura 3.8) han demostrado presentar valores de inhibición del crecimiento de
M.tuberculosis del 99%53 y los derivados 6,7-dicloro-2-etoxicarbonil-3-metilquinoxalina 1,4-
di-N-óxido (II, Figura 3.8) y 3-acetamida-6,7-dicloroquinoxalina-2-carbonitrilo 1,4-di-N-
óxido producen valores de inhibición del crecimiento del 100%54,57. Por otra parte, se
observó que la falta de los dos grupos N-óxido generalmente lleva a una pérdida de la
actividad antibacteriana58.
Figura 3.8 Derivados de 1,4-di-N-óxido de quinoxalina con actividad antituberculosa58.
Recientemente, se han realizado estudios de nuevas series de derivados de 1,4-
di-N-óxido de quinoxalina-2-carboxamida (Figura 3.9) con el objetivo de obtener nuevos
fármacos para el tratamiento de tuberculosis que puedan mejorar la terapia actual33,38.
Para dichos estudios, se sintetizaron 83 derivados de 1,4-di-N-óxido de quinoxalina-2-
carboxamida nuevos. Los resultados indican que los compuestos sustituidos en posición 3
con un metilo, con una cadena alifática de 2 metilenos y no sustituidos sobre el fenilo,
ofrecen un enfoque eficaz para el desarrollo de futuros agentes antituberculosos38.
Antecedentes
60
Figura 3.9 Diseño de nuevas series de 1,4-di-N-óxido de quinoxalina-2-carboxamida38.
3.2.2 Derivados de 1,4-di-N-óxido de quinoxalina y enfermedad de
Chagas
La búsqueda de nuevos agentes antichagásicos es un objetivo de interés social y
económico, ya que es un importante problema de salud que afecta alrededor de veinte
millones de personas en Centro y Suramérica, motivo por el cual nuestro grupo de trabajo
está estudiando posibles alternativas terapéuticas capaces de mejorar los medicamentos
ya existentes para la enfermedad de Chagas.
Entre la década de 1960 y 1970 se obtuvieron las dos drogas clásicas en el
tratamiento antichagásico: el Nirfurtimox y el Benznidazol, las cuales actualmente son las
únicas internacionalmente aprobadas como indicación en la infección por Trypanosoma
cruzi59. Estas dos drogas son efectivas contra la forma circulante del parásito
(tripomastigoto) durante la fase aguda de la enfermedad, pero no así durante la fase
crónica. Además, estos compuestos causan efectos secundarios significantes y muestran
una eficacia clínica pobre60.
Varios tipos de compuestos han sido descritos como agentes anti-T.cruzi. La
tripanotiona reductasa (TR) puede que sea una de las enzimas más estudiadas del
metabolismo redox de la tripanotiona. Nuestro grupo de trabajo, ha sintetizado derivados
de quinoxalina que se asemejan en la estructura plana y tipo de sustituyentes a los
inhibidores de la TR (Figura 3.10)60.
Antecedentes
61
Figura 3.10 Inhibidores de la TR reconocidos y estructuralmente relacionados con 1,4-di-
N-óxido quinoxalinas, inhibidores del crecimiento de T.cruzi 60.
Continuando con la búsqueda de nuevos derivados 1,4-di-N-óxido de quinoxalina
con actividad frente a T.cruzi, se observó que las quinoxalinas al oxidarse actuaban como
sustrato de enzimas reductoras, donde los productos reducidos reaccionan con el
oxígeno, sumado a la capacidad de las quinoxalinas oxidadas como agentes
antiinfecciosos, lo que llevó a nuestro grupo de trabajo a estudiar 33 derivados1,4-di-N-
óxido de quinoxalina para el tratamiento de la enfermedad de Chagas61. De los 33
derivados estudiados, seis mostraron actividad frente a dos cepas de T. cruzi (Tulahuen y
Brener), similares al fármaco de referencia, Nifurtimox.
Antecedentes
62
Figura 3.11 Estructuras de las primeras quinoxalinas estudiadas como agentes
antichagásicos.
Actualmente, nuestro grupo de trabajo está trabajando con la síntesis y evaluación
frente a T. cruzi de 23 3-arilquinoxalina-2-carbonitrilo di-N-óxidos (Figura 3.12), de los
cuales 5 han presentado valores de IC50 de la misma magnitud que la droga de referencia
Nifurtimox, haciéndolos válidos como nuevos compuestos líderes62.
Figura 3.12 Diseño de 3-arilquinoxalina-2-carbonitrilo di-N-óxidos, 1-23, como drogas anti-
T-cruzi, obtenidas de compuestos líderes previos con modificaciones estructurales62.
Antecedentes
63
3.2.3 Derivados de 1,4-di-N-óxido de quinoxalina y malaria
Debido a la similitud entre la estructura de las quinolinas y quinoxalinas, así como
la presencia del heterociclo de quinoxalina en algunos antibióticos de amplio espectro, se
esperaba que las quinoxalinas análogas de quinolinas antimaláricas pudieran exhibir
actividad antimalárica.
Las primeras publicaciones que se refieren a derivados de quinoxalina como
agentes antimaláricos se remontan a principios de los años 70 (Moreno & Schultz 1970a;
1970b; Moreno et al., 1972; Fischer et al., 1975). El grupo de Moreno y Schultz probó la
actividad antimalárica contra Plasmodium berghei en ratones, con derivados 2-
quinoxalinametanol, 2-quinoxalinil ketoximas y 5,8-dimetoxiquinoxalina.
Desafortunadamente, todos los compuestos fueron inactivos.
Nuestro grupo de trabajo empezó a investigar la actividad antimalárica de las
quinoxalinas alrededor del año 2003, estudiando la influencia de los grupos 1,4-di-N-óxido
en el anillo de quinoxalina en la actividad antiplasmodial, confirmando de esta forma su
importancia para aumentar la actividad. A continuación, se describen brevemente algunos
de los estudios más recientes.
Como primer ejemplo, nuestro grupo de trabajo ha sintetizado derivados de 1,4-di-
N-óxido de 3-fenilquinoxalina-2-carbonitrilo y basado en los resultados de actividad
obtenidos decidió sintetizar nuevas series de compuestos con modificaciones
estructurales a los compuestos líderes previamente sintetizados (Figura 3.13), con el
objetivo de establecer los requerimientos estructurales para la inhibición del P.falciparum.
El cambio realizado fue la sustitución del grupo fenil en posición 3 por 2-furil (series A) o
2-tienil (series B), con el propósito de determinar la influencia del tamaño y naturaleza de
los anillos aromáticos en esa posición63.
Antecedentes
64
Figura 3.13 Diseño de nuevos derivados como drogas antimaláricas a partir de nuestro
compuesto líder previo63.
Recientemente, se ha identificado como compuesto líder, un derivado de 1,4-di-N-
óxido de 3-(4´-cloro)fenilquinoxalina-2-carbonitrilo, con actividad potente frente a la cepa
de P. falciparum (FcB1) resistente a cloroquina. Con el propósito de establecer los
requisitos estructurales necesarios para la inhibición de P. falciparum, se han propuesto
tres nuevas series de derivados de quinoxalina basadas en modificaciones estructurales
de los compuestos líderes (Figura 3.14). Estas modificaciones se pueden resumir de la
siguiente manera: (a) variaciones en el patrón electrónico del sustituyente presente en el
anillo de la 1,4-di-N-óxido quinoxalina y en el grupo fenil unido a C-4 (serie I); y (b)
sustitución de la subunidad nitrilo, presente en el compuesto líder, por un grupo éster en
la serie II y por un ácido carboxílico en la serie III64.
Antecedentes
65
Figura 3.14 Diseño de nuevos agentes antimaláricos basado en resultados previos64.
También se pueden encontrar publicaciones en las que se describe la conversión
de compuestos líderes en derivados de hidrazidas y amidas llevadas a cabo mediante
reacciones de hidrazinolisis y aminolisis, en las cuales se han obtenido resultados no
esperados (Figura 3.15). Por ejemplo, se han descrito los perfiles de reducción de
derivados de aminas cuando actúan sobre el derivado de 1,4-di-N-óxido de 3-
fenilquinoxalina-2-carboxilato65.
Antecedentes
66
Figura 3.15 Diseño de nuevos derivados 1,4-di-N-óxido de quinoxalina65.
Por otro lado, nuestro grupo de trabajo ha desarrollado una serie de derivados
para el tratamiento de la depresión y se ha visto que la estructura de estos derivados tiene
similitud con las quinolinas y sus derivados aminoalcoholes. De forma tal que se ha
buscado la similitud estructural para la síntesis y evaluación biológica de nuevos agentes
con actividad antimalárica, ya que como se puede observar en la Figura 3.16, muchos de
los compuestos antimaláricos de las diferentes subfamilias mencionadas anteriormente
tienen su base de desarrollo en la quinolina. Además, se muestra que las Aminoquinolinas
tienen como similitud estructural, un grupo amino unido a la cadena alifática por el lado
contrario al OH o resto quinolina. También, en la familia de Arilaminoalcoholes y
Aminoquinolinas se observa la presencia de las cadenas alifáticas en el extremo amino66.
Antecedentes
67
Figura 3.16 Compuestos que han sido utilizados en el tratamiento de la malaria66.
3.2.4 Derivados de 1,4-di-N-óxido de quinoxalina y leishmaniasis
Debido a la actividad antiplasmodial de ciertos derivados de 1,4-di-N-óxido de
quinoxalina, algunos grupos de investigación han ensayado este tipo de derivados frente
a otros agentes protozoarios como Leishmania spp. Estos trabajos son muy recientes. La
primera publicación sobre derivados de 1,4-di-N-óxido de quinoxalina como agentes
antileishmaniásicos es del año 2003 (Loriga et al., 2003).
Por otro lado, se han realizado revisiones bibliográficas sobre extractos de plantas
y moléculas químicamente definidas de origen natural que muestran actividad
antileishmaniásica. Por ejemplo, extractos de plantas de las familias Agavaceae,
Antecedentes
68
Annonaceae, Apocynaceae, Asteraceae, entre otras. Y sustancias químicas como
alopurinol, camptotecina, formicina B y ácido laurico67.
OObbjjeettiivvooss yy ppllaann ddee ttrraabbaajjoo
Objetivos y plan de trabajo
71
4.1 Objetivos
Teniendo en cuenta la necesidad de buscar nuevas terapias accesibles para la
población afectada por malaria y leishmaniasis, así como la excelente actividad biológica
que presentan los derivados de 1,4-di-N-óxido de quinoxalina en este campo, se plantean
los siguientes objetivos:
1. Diseño estructural de nuevos compuestos derivados de 1,4-di-N-óxido de
quinoxalina como agentes antimaláricos y antileishmaniásicos a partir de
estructuras biológicamente activas.
2. Puesta a punto de la ruta sintetica adecuada para la obtención de los productos
objetivo.
3. Síntesis química, purificación y caracterización estructural de los compuestos
sintetizados mediante técnicas de espectroscopia de infrarrojo, resonancia
magnética nuclear y análisis elemental de C, H y N.
4. Evaluación biológica de los productos obtenidos.
5. Estudio de las posibles relaciones estructura química-actividad biológica de los
compuestos sintetizados que permita optimizar el diseño de nuevos derivados
hacia estructuras más activas.
6. Búsqueda de nuevos cabezas de serie.
Objetivos y plan de trabajo
72
4.2 Plan de trabajo
4.2.1 Diseño de los compuestos
Teniendo en cuenta las cabezas de serie sintetizadas anteriormente y los
resultados previos obtenidos por nuestro grupo de trabajo en varios proyectos de
investigación, además de la información disponible relacionada con los derivados de 1,4-
di-N-óxido de quinoxalina y su actividad, se plantea la síntesis de una serie de nuevos
compuestos con el heterociclo de quinoxalina como estructura base.
Se establece el heterociclo dioxidado de quinoxalina como la estructura base para
la búsqueda de nuevos compuestos con potencial actividad antimalárica y
antileishmaniásica.
Figura 4.1 Estructura general de los derivados de 1,4-di-N-óxido de quinoxalina.
Se mantiene la presencia de los N-óxidos en los derivados debido a que como se
explica en los antecedentes dicho sistema aumenta la actividad biológica de las
quinoxalinas al tener una influencia positiva sobre éstas en los estudios previamente
realizados.
Para el diseño y obtención de nuevos compuestos se parte del benzofuroxano
correspondiente sustituido en posición 5, para conseguir distintos derivados de 1,4-di-N-
óxido de quinoxalina sustituidos en las posiciones 2 y 6.
Con respecto a la posición 2, en la cual se sitúa el grupo principal, nuestro grupo
de trabajo ha trabajado, principalmente, con derivados de amidas, cetonas y ésteres,
Objetivos y plan de trabajo
73
además del grupo carbonitrilo. En el presente trabajo se ha propuesto introducir un
derivado aminoalcohol.
Los sustituyentes estudiados en posición 3 son, entre otros, metilo, trifluorometilo,
piperazinilo, amina y fenilo. De este modo, se plantea introducir un grupo metilo en las
nuevas moléculas.
Por último, los hidrógenos de las posiciones R6 y R7 generalmente se sustituyen
por los grupos fluor, cloro, metil, trifluorometil y metoxi. Se introducen halógenos debido a
que estos grupos potencian la actividad antibacteriana y antiprotozoaria de las
quinoxalinas. Para estudiar la influencia de diferentes tipos de sustituyentes en esta
posición, se introducen tanto sustituyentes electrodonantes (grupo metilo) como
electroatrayentes (halógenos), además de sintetizar los compuestos sin sustituir.
El proceso de diseño estructural (Figura 4.2) de las nuevas moléculas fue el
siguiente:
4.2.1.1 Quinoxalina
Al estar el heterociclo de quinoxalina (Figura 4.2) descrito como un bioisóstero de
la quinoleína y este ser el grupo base de conocidos agentes antimaláricos de uso clínico,
por ejemplo, las Aminoquinolinas y Metanolquinolinas, se plantea la posibilidad de la
sustitución de la quinoleína por el heterociclo de quinoxalina. Se ha tenido en cuenta que
en los derivados de la familia de Arilaminoalcoholes, el grupo quinoleína es variable, como
el derivado Halofantrina, donde el grupo es fenantreno. Además, según la bibliografía el
heterociclo de quinoxalina ha mostrado numerosas propiedades biológicas, entre las que
se puede mencionar su actividad antimalárica.
Objetivos y plan de trabajo
74
4.2.1.2 Grupo alcohol
Según la bibliografía, este grupo se considera esencial para la actividad
antimalárica, como se puede observar en la quinina, halofantrina y meloquina (Figura 4.2)
citadas anteriormente en los antecedentes.
4.2.1.3 Amina central
Las Aminoquinolinas (Figura 4.2), tienen como similitud estructural un grupo amino
unido a la cadena alifática por el lado contrario al OH o resto quinolina. En este trabajo se
plantea el uso de una piperazina en esa posición para ver el efecto del cambio y
determinar qué tipo de estructura resulta mejor.
4.2.1.4 Grupo aromático
La estructura de los Arilaminoalcoholes y Aminoquinolinas tiene cadenas alifáticas
en el extremo amino. Los nuevos derivados combinan la amina cíclica con un anillo
aromático que se encuentra sustituido en orto y para, por los grupos NO2 y CF3,
respectivamente. El grupo CF3 presente en las Metanolquinolinas y Arilaminoalcoholes, ha
demostrado ser esencial para que un derivado de 1,4-di-N-óxido de quinoxalina
demuestre actividad antiplasmódica. Además, según la bibliografía el grupo NO2 ha
presentado cierta actividad antimalárica68.
Objetivos y plan de trabajo
75
Figura 4.2 Esquema general del proceso de diseño de las moléculas.
Objetivos y plan de trabajo
76
4.2.2 Síntesis química
Teniendo en cuenta lo comentado anteriormente, se plantea una ruta de síntesis
para la preparación de los derivados de 1,4-di-N-óxido de 2-[1-hidroxi-3-(4-(2-nitro-4-
(trifluorometil)fenil)piperazina-1-il)propil]-3-metilquinoxalina a partir de los
correspondientes benzofuroxanos, la acetilacetona y la 1-[2-nitro-4-
(trifluorometil)fenil]piperazina.
4.2.3 Evaluación biológica
El estudio de la actividad antimalárica se llevará a cabo por el Grupo Malaria de la
Universidad de Antioquia, Medellín, Colombia.
Por otro lado, el estudio de la actividad antileishmaniásica se llevará a cabo por el
Grupo de Enfermedades Infecciosas de la Universidad Peruana Cayetano Heredia, Lima,
Perú.
4.2.4 Relación estructura química -actividad biológica
En función de los resultados de actividad biológica proporcionados por el Grupo
Malaria de la Universidad de Antioquia y por el Grupo de Enfermedades Infecciosas de la
Universidad Peruana Cayetano Heredia se realizará el estudio necesario para establecer
la relación existente entre la estructura química de los compuestos sintetizados y su
actividad biológica. De esa forma, se establecerán criterios racionales que orienten al
diseño de nuevos derivados de quinoxalina y la búsqueda de nuevas cabezas de serie.
SSíínntteessiiss qquuíímmiiccaa
Síntesis química
79
5.1 Introducción a la química de los N-óxido de quinoxalinas
5.1.1 La función del N-óxido en el anillo de quinoxalina
Como se ha mencionado en la sección de objetivos y plan de trabajo, el heterociclo
dioxidado de quinoxalina se establece como la estructura base para la búsqueda de
nuevos compuestos con potencial actividad antimalárica y antileishmaniásica. Los N-
óxidos heteroaromáticos contienen un enlace electrodonante del nitrógeno al oxigeno y,
por tanto, cierta carga positiva sobre el primero. En él, la carga positiva se encuentra
distribuida por todo el anillo en sus formas mesoméricas (Figura 5.1).
Figura 5.1 Formas mesoméricas de 1-óxido de piridina69.
Por otro lado, como ocurre siempre que un átomo σ-dador posee un orbital π
disponible para aceptar electrones, tienen lugar la retrodonación y, por tanto, han de
considerarse también estas otras formas resonantes (Figura 5.2).
Figura 5.2 Formas resonantes de 1-óxido de piridina69.
Síntesis química
80
Esta doble función del N-óxido, pudiendo actuar bien como aceptor o bien como
dador de electrones π, hace que las propiedades electrónicas y espectroscópicas varíen
en función de los sustituyentes presentes en la molécula69.
5.1.2 Métodos de síntesis de derivados 1,4 -di-N-óxido de quinoxalina
5.1.2.1 Reacción de Beirut
En 1965, Haddadin e Issidorides revolucionaron la química de los N-óxidos
aromáticos consiguiendo la síntesis de 1,4-di-N-óxidos de quinoxalina en un único paso
(Figura 5.3), a partir de benzofuroxanos (BFX) y enaminas. Desde entonces, en honor a la
ciudad donde fue descrita por primera vez, se denomina reacción de Beirut70.
Figura 5.3 Reacción de Beirut70.
Se han descrito numerosas variantes en la reacción de Beirut; en ellas, el BFX
reacciona con diferentes tipos de reactivos y en función de éstos, se pueden clasificar en
cuatro tipos de reacciones:
5.1.2.1.1 Reacción con enaminas generadas in situ
Haddadin e Issidorides utilizaron enaminas simples en la reacción con BFX. Sin
embargo, es posible realizar la síntesis por condensación de BFX con un derivado
carbonílico (cetona o aldehído) en presencia de una base. Esta reacción transcurre
Síntesis química
81
mediante un intermedio enamina generada in situ a partir del derivado carbonílico y el
amoniaco, como se representa en la Figura 5.471-72.
Figura 5.4 Esquema de reacción de Beirut con formación del intermedio enamina in
situ71.
5.1.2.1.2 Reacción con dienaminas y 1-aza-1,3-butadienos
Se ha descrito la reacción entre BFX y dienaminas73-74, pero no se logra mejorar
los rendimientos en la obtención de 1,4-di-N-óxidos de quinoxalina. También se ha
observado que derivados de 1-aza-1,3-butadienos reaccionan con BFX formando los
correspondientes N-óxidos de quinoxalina75. Un ejemplo es la reacción que se muestra en
la Figura 5.5.
Figura 5.5 Esquema de reacción de 1-aza-1,3-butadieno y benzofuroxano75.
Síntesis química
82
5.1.2.1.3 Reacción con enolatos, fenolatos y cetonas α,β-insaturadas
Existe constancia de varios ejemplos de reacciones con enolatos y fenolatos72.
Algunos autores afirman que las cetonas α,β-insaturadas dan lugar a derivados mono-N-
oxidados y que varios derivados alifáticos, en presencia de aminas secundarias, forman 1-
óxido de 2-acil-3-alquilquinoxalinas, mientras que con aminas primarias se obtienen
derivados 3-acil-2-alquílicos76. Otro método de preparación de quinoxalinas es mediante la
reacción entre BFX y cetonas α,β-insaturadas utilizando tamiz molecular como superficie
de reacción77.
Resulta de especial interés la reacción de BFX con β-dicetonas, β-cetoésteres y β-
cetoamidas asimétricas, en las que se ha observado que la regioespecificidad de ciclación
se ve influida por factores estéricos y polares del derivado carbonílico y la naturaleza de
los sustituyentes del BFX de partida (Figura 5.6)72,78,79.
Figura 5.6 Esquema de formación de 1,4-di-N-óxido de 2-acil-3-alquilquinoxalina a partir
de benzofuroxano y una β-dicetona79.
Síntesis química
83
Cabe destacar el empleo de sales de calcio para la preparación de derivados de
1,4-di-N-óxido de quinoxalina por reacción entre BFX y acetoacetamidas (Figura 5.7)71,80.
Figura 5.7 Esquema de reacción entre benzofuroxanos y acetoacetamidas en presencia
de sales de calcio80.
5.1.2.1.4 Reacción con malononitrilo
La primera referencia de esta reacción se recoge en una patente81 que data del
año 1966 (Figura 5.8) y que posteriormente, ha sido citada en numerosas ocasiones en la
bibliografía71,82,83.
Figura 5.8 Esquema de la reacción de Beirut entre benzofuroxano y malononitrilo83.
5.1.3 Reacciones fotoquímicas de derivados de 1,4 -di-N-óxido de
quinoxalina
La inestabilidad fotoquímica de los derivados de 1,4-di-N-óxido de quinoxalina es
un aspecto que debe considerarse cuando se trabaja con estos compuestos. Se ha
Síntesis química
84
observado que la absorción del espectro de soluciones diluidas de 1,4-di-N-óxidos de
quinoxalina cambia rápidamente si estas soluciones son expuestas a la luz solar84.
Existe documentación sobre la fotólisis de derivados de 1,4-di-N-óxido de
quinoxalina en solución alcohólica85 y en solución acuosa neutra86 observándose la
conversión a 4-óxido de 2-quinoxalinona, pasando por el intermedio oxaziridina84 (Figura
5.9). Por estas razones, es necesario conservar los productos aislados de la luz y la
humedad.
Figura 5.9 Esquema de fotólisis de 1,4-di-N-óxido de quinoxalina84.
Síntesis química
85
5.2 Esquemas generales de síntesis
Figura 5.10 Esquema inicial de síntesis.
Síntesis química
86
Figura 5.11 Modificación al esquema inicial de síntesis.
Síntesis química
87
Figura 5.12 Esquema final de síntesis.
Síntesis química
88
5.3 Métodos de síntesis
5.3.2 Método de síntesis de los derivados metilcetona
5.3.1.1 Síntesis de los derivados de 1,4-di-N-óxido de 2-acetil-3-metilquinoxalina
Se disuelve el benzofuroxano correspondiente (10,00 mmol) y el CaCl2 (1,00 mmol)
en metanol (50,00 mL) con agitación. Una vez disuelta la mezcla, se añade etanolamina
(1,00 mmol) y gota a gota acetilacetona (12,00 mmol). Se deja la reacción en agitación a
temperatura ambiente y se sigue por TLC. A medida que transcurre la reacción se va
formando un precipitado. Transcurridas 24 horas se para la reacción. Se realiza una
extracción DCM:H2O, la fase orgánica se seca con Na2SO4 anhídrido y el disolvente se
elimina a presión reducida en el rotavapor. El residuo obtenido se precipita con éter
dietílico y se filtra a vacío.
La síntesis de estos compuestos es llevada a cabo por la reacción de Beirut. Como
se muestra en la Figura 5.13, el correspondiente benzofuroxano reacciona con
acetilacetona en presencia de cloruro cálcico y etanolamina para formar el
correspondiente derivado de 1,4-di-N-óxido de 2-acetil-3-metilquinoxalina.
Figura 5.13 Reacción de Beirut. Síntesis de los derivados de 1,4-di-N-óxido de 2-acetil-3-
metilquinoxalina.
Síntesis química
89
5.3.1.2 Mecanismo de reacción
El mecanismo de reacción propuesto (Figura 5.14) sucede a través de un ataque
nucleofílico de un carbanión, generado a partir de la β-dicetona, sobre el nitrógeno
positivo del benzofuroxano. Este carbanión es generado gracias a la base utilizada
(etanolamina), ya que ésta es capaz de capturar un protón del metileno en α al grupo
carbonilo de la β-dicetona. Posteriormente, se produce un ataque del nitrógeno
nucleofílico sobre el carbono sp2 unido al oxígeno y la posterior salida del grupo Ca como
Ca/OH/Cl. Se ha sugerido la importancia de que se forme como intermedio el quelato de
calcio para que se lleve a cabo esta reacción71.
Figura 5.14 Mecanismo propuesto para la síntesis de los derivados de 1,4-di-N-óxido de
2-acetil-3-metilquinoxalina.
Al realizar la elucidación estructural de los compuestos sintetizados por esta ruta,
en los espectros de IR no se mostraba la banda correspondiente a la señal del grupo
Síntesis química
90
carbonilo presente en la molécula. Además, los espectros de 1H-RMN no mostraban el
desplazamiento químico de la señal del CH3 de la metilcetona, ya que realmente se
estaban formando metilquinoxalinas. En este punto de la investigación, se decidió realizar
una modificación en la ruta de síntesis inicial que permitiera obtener los productos finales
objetivo a partir de las meteilquinoxalinas sintetizadas. Por consiguiente, a partir de este
punto se continuó según el esquema de síntesis de la Figura 5.11.
5.3.2 Método de síntesis de la metilquinoxalina
5.3.2.1 Síntesis de los derivados de1,4-di-N-óxido de 2-metilquinoxalina
Se disuelve el benzofuroxano correspondiente (20,00 mmol) y el CaCl2 (2,00 mmol)
en metanol (100,00 mL) con agitación. Una vez disuelta la mezcla, se añade etanolamina
(33,14 mmol) y gota a gota acetilacetona (24,00 mmol). Se deja la reacción en agitación a
temperatura ambiente y se sigue por TLC. A medida que transcurre la reacción se va
formando un precipitado. Transcurridas 24 horas se para la reacción. Se realiza una
extracción DCM:H2O, la fase orgánica se seca con Na2SO4 anhídrido y el disolvente se
elimina a presión reducida en el rotavapor. El residuo obtenido se precipita con éter
dietílico y se filtra a vacío.
La síntesis de estos compuestos es llevada a cabo por la reacción de Beirut
(Figura 5.15), la cual implica la condensación del benzofuroxano con la acetilacetona en
presencia de etanolamina y cloruro cálcico.
Figura 5.15 Reacción de Beirut. Síntesis de los derivados de 1,4-di-N-óxido de
2-metilquinoxalina.
Síntesis química
91
5.3.2.2 Mecanismo de reacción
El estudio del posible mecanismo de reacción para la síntesis de los derivados de
1,4-di-N-óxido de 2-metilquinoxalina se realizó mediante la monitorización de la reacción
con TLC y Cromatografía Líquida del Alta Resolución (CLAR).
Como se puede observar en la Figura 5.16, al colocar a reaccionar el
correspondiente benzofuroxano con la acetilacetona primero se forma el derivado
metilcetona y posteriormente éste último va desapareciendo poco a poco y se va
formando la metilquinoxalina. Esto explica lo que pudo haber sucedido en la reacción
citada anteriormente, ya que por un exceso de la base etanolamina, los reactivos pueden
seguir reaccionando hasta llegar a formar la correspondiente metilquinoxalina.
Figura 5.16 Monitorización de la síntesis de 1,4-di-N-óxido de 2-metil-6-metoxiquinoxalina
por TLC.
La síntesis de 1,4-di-N-óxido de 2-metil-6-metoxiquinoxalina se sometió a un
estudio de CLAR en condiciones isocráticas (Figura 5.17, Figura 5.18 y Figura 5.19), con
el objetivo de monitorizar simultáneamente con las TLC la reacción, y de esta forma
comprobar el posible mecanismo de reacción. Las condiciones cromatográficas fueron las
siguientes:
Equipo: Ultimate 3000 casa DIOXINES. Chromekon V 6.8
Columna: RP 18 LICHROSPHER 100 RP 18 E.C. 5µm; 10x0.45 TEKNOKPONA
Síntesis química
92
Fase móvil: metanol/agua (50:50)
Volumen de inyección: 20 µL
Flujo: 1 mL/min
Detector: 254nm λ de referencia
Temperatura del horno: 25 °C
Temperatura del automuestreador: 25 °C
Tiempo de análisis: 10 minutos
El agua es desionizada y purificada con filtros Mili-Q de Millipore. Los tiempos de
retención se nombran como tr y la longitud de onda (λ) de referencia es 254 nm.
Figura 5.17 Monitorización de la síntesis de 1,4-di-N-óxido de 2-metil-6-metoxiquinoxalina
por CLAR, tiempo 0h.
Síntesis química
93
Figura 5.18 Monitorización de la síntesis de 1,4-di-N-óxido de 2-metil-6-metoxiquinoxalina
por CLAR, tiempo 5h.
Figura 5.19 Monitorización de la síntesis de 1,4-di-N-óxido de 2-metil-6-metoxiquinoxalina
por CLAR, tiempo 24h.
Síntesis química
94
Además, para confirmar la hipótesis planteada, se colocó a reaccionar la
metilcetona con un exceso de etanolamina, dando origen a la correspondiente
metilquinoxalina como se esperaba. Esta reacción también fue monitorizada mediante
TLC (Figura 5.20).
Figura 5.20 Monitorización de la síntesis de de 1,4-di-N-óxido de 2-metil-6-
metoxiquinoxalina por TLC.
Por lo tanto, después del estudio explicado anteriormente, el mecanismo de
reacción propuesto para la síntesis de los derivados de 1,4-di-N-óxido de 2-
metilquinoxalina se muestra en la Figura 5.21.
Síntesis química
95
Figura 5.21 Mecanismo propuesto para la síntesis de los derivados de 1,4-di-N-óxido de
2-metilquinoxalina.
5.3.3 Método de síntesis de los derivados de 1,4-di-N-óxido de 2-(3-
cloropropanoil)-3-metilquinoxalina
5.3.3.1 Síntesis de los derivados de 1,4-di-N-óxido de 2-(3-cloropropanoil)-3-
metilquinoxalina
Se disuelve la 1,4-di-N-óxido de 2-metilquinoxalina correspondiente (5,00 mmol)
en cloroformo seco (30,00 mL) con agitación. Una vez disuelta la mezcla, se añade AlCl3
(5,00 mmol) y se coloca la reacción en baño de hielo. Se añade gota a gota cloruro de
ácido (7,50 mmol). La reacción se mantiene en agitación a temperatura ambiente y se
sigue por TLC.
Síntesis química
96
Transcurridas 24 horas se para la reacción y se filtra sobre celite con el fin de
eliminar los restos de metales (AlCl3). Las aguas madres se vierten en un vaso de
precipitado con hielo con el propósito de hidrolizar los restos de cloruro de ácido y AlCl3.
Se realiza una extracción CHCl3:H2O. La fase orgánica se seca con Na2SO4 anhídrido y el
disolvente se elimina a presión reducida en el rotavapor. El aceite obtenido se purifica por
cromatografía de columna. El residuo obtenido se precipita con éter dietílico y se filtra a
vacío.
En la síntesis de estos compuestos la correspondiente 1,4-di-N-óxido de 2-
metilquinoxalina reacciona con el cloruro de ácido en presencia de tricloruro de aluminio
para formar el correspondiente derivado de 1,4-di-N-óxido de 2-(3-cloropropanoil)-3-
metilquinoxalina como se puede observar en la Figura 5.22.
Figura 5.22 Esquema de síntesis de los derivados de 1,4-di-N-óxido de 2-(3-
cloropropanoil)-3-metilquinoxalina.
Al realizar la elucidación estructural de los compuestos sintetizados por esta ruta,
los espectros de 1H-RMN mostraron que los productos sí contenían el grupo funcional de
interés, pero éste no se estaba uniendo a la posición 3 de la quinoxalina como se
esperaba (Figura 5.22), sino al metilo en posición 2 (Figura 5.23). De esta forma,
permitían la existencia de un grupo metileno entre la quinoxalina y el carbonilo, ofreciendo
un gran abanico de posibilidades para el futuro al poseer los requerimientos estructurales
del farmacóforo. Por lo tanto, se decidió realizar la segunda modificación a la ruta de
síntesis inicial, siguiendo el esquema de síntesis de la Figura 5.12 que permite la
obtención de los productos finales deseados.
Síntesis química
97
Figura 5.23 Esquema de síntesis de los derivados de 1,4-di-N-óxido de 2-(4-cloro-2-
oxobutil)quinoxalina.
5.3.3.2 Mecanismo de reacción
El mecanismo de reacción que se propone parece estar relacionado con el
mecanismo de reacción de la acilación de las metilazinas87,88,89.
Figura 5.24 Mecanismo de reacción propuesto para la síntesis de los derivados de 1,4-di-
N-óxido de 2-(4-cloro-2-oxobutil)quinoxalina.
Síntesis química
98
5.3.4 Método de síntesis de los derivados 1,4-di-N-óxido de 2-[4-(4-(2-
nitro-4-(trifluorometil)fenil)piperazin-1-il)-2-oxobutil]quinoxalina
5.3.4.1 Síntesis de los derivados 1,4-di-N-óxido de 2-[4-(4-(2-nitro-4-
(trifluorometil)fenil)piperazin-1-il)-2-oxobutil]quinoxalina
Se disuelve la 1,4-di-N-óxido de 2-(4-cloro-2-oxobutil)quinoxalina correspondiente
(1,0 eq) y la 1-[2-nitro-4-(trifluorometil)fenil]piperazina (1,2 eq) en THF (25,00 mL) con
agitación. Una vez disuelta la mezcla, se añade la cantidad equimolecular de carbonato
potásico (1,5 eq). La reacción se mantiene en agitación y se pone a reflujo 18 horas. El
avance de la reacción se va comprobando por TLC. El THF se elimina a presión reducida
en el rotavapor. Luego se realiza una extracción DCM:H2O. La fase orgánica se seca con
Na2SO4 anhídrido y el disolvente se elimina a presión reducida en el rotavapor. El residuo
obtenido se precipita con éter dietílico y se filtra a vacío.
En la síntesis de estos compuestos la correspondiente 1,4-di-N-óxido de 2-(4-
cloro-2-oxobutil)quinoxalina reacciona con la 1-[2-nitro-4-(trifluorometil)fenil]piperazina en
presencia de carbonato potásico (Figura 5.25).
Síntesis química
99
Figura 5.25 Esquema de síntesis de los derivados 1,4-di-N-óxido de 2-[4-(4-(2-nitro-4-
(trifluorometil)fenil)piperazin-1-il)-2-oxobutil]quinoxalina.
5.3.4.2 Mecanismo de reacción
El mecanismo de reacción ocurre por una sustitución nucleofílica SN2, en la cual
el carbono alifático sp3 unido al Cl es atacado por un par libre del nucleófilo, el Cl es
liberado y se forma el correspondiente derivado 1,4-di-N-óxido de 2-[4-(4-(2-nitro-4-
(trifluorometil)fenil)piperazin-1-il)-2-oxobutil]quinoxalina.
Síntesis química
100
Figura 5.26 Mecanismo propuesto para la síntesis de los derivados 1,4-di-N-óxido de 2-[4-
(4-(2-nitro-4-(trifluorometil)fenil)piperazin-1-il)-2-oxobutil]quinoxalina.
5.3.5 Método de síntesis de los derivados 1,4-di-N-óxido de 2-[2-hidroxi-
4-(4-(2-nitro-4-(trifluorometil)fenil)piperazin-1-il)butil]quinoxalina66,90
5.3.5.1 Síntesis de los derivados 1,4-di-N-óxido de 2-[2-hidroxi-4-(4-(2-nitro-4-
(trifluorometil)fenil)piperazin-1-il)butil]quinoxalina
Se disuelve la 1,4-di-N-óxido de 2-[4-(4-(2-nitro-4-(trifluorometil)fenil)piperazin-1-il)-
2-oxobutil]quinoxalina correspondiente en cantidad suficiente de metanol con agitación.
Una vez disuelta la mezcla, se coloca en baño de hielo y se añade el borohidruro sódico,
utilizado como agente reductor.
La temperatura de reacción se mantiene alrededor de 0ºC para evitar que sea
demasiado rápida y ralentizar reacciones secundarias que tienen lugar entre el
Síntesis química
101
borohidruro y el metanol, que provocaría la formación de boratos y el consumo del
hidrógeno, lo que obliga a utilizar un exceso de reactivo. En todo caso, la reacción entre el
borohidruro y la cetona, que se da de forma prácticamente completa dentro de la primera
media hora de reacción, es lo suficientemente rápida como para que tenga lugar antes de
la descomposición del reactivo.
Debido a que el grupo carbonilo es plano el ión hidruro puede atacar ambas caras
con igual probabilidad. En consecuencia, en la reacción se pueden formar en principio
cantidades iguales de cada uno de los enantiómeros. El alcohol producido en la reacción
sería una mezcla racémica.
En la síntesis de estos compuestos la correspondiente 1,4-di-N-óxido de 2-[4-(4-(2-
nitro-4-(trifluorometil)fenil)piperazin-1-il)-2-oxobutil]quinoxalina reacciona con el
borohidruro sódico para la formación del correspondiente derivado 1,4-di-N-óxido de 2-[2-
hidroxi-4-(4-(2-nitro-4-(trifluorometil)fenil)piperazin-1-il)butil]quinoxalina (Figura 5.27).
Síntesis química
102
Figura 5.27 Esquema de síntesis de los derivados 1,4-di-N-óxido de 2-[2-hidroxi-4-(4-(2-
nitro-4-(trifluorometil)fenil)piperazin-1-il)butil]quinoxalina.
La síntesis de estos compuestos no fue lograda con éxito. Por lo tanto, no es
posible confirmar de forma completamente definitiva su método de síntesis adecuado.
Síntesis química
103
5.4 Parte experimental de los procesos de síntesis
5.4.1 Generalidades
5.4.1.1 Seguimiento de las reacciones
Las técnicas utilizadas para la monitorización de las reacciones son la
cromatografía en capa fina (TLC) y en los casos en los que se considera necesario la
espectroscopia infrarroja (IR). Las cromatografías en capa fina, se desarrollan sobre
placas metálicas cubiertas de gel de sílice de 0.2 mm de espesor Alugram SIL G/UV254
(ref. 818133) (Macherey-Nagel GmbH & Co. KG. Postfach 101352. D-52313 DÜren,
Germany). Se emplean como fase móvil diferentes solventes orgánicos. Las placas se
revelan bajo luz visible y ultravioleta (λ=254 y 354 nm).
5.4.1.2 Purificación de los compuestos
La purificación de los compuestos intermedios se lleva a cabo mediante
extracciones líquido-líquido seguidas de cromatografía en columna en los casos
necesarios. Las extracciones líquido-líquido se realizan empleando como fase orgánica
cloroformo o diclorometano y como fase acuosa agua. La cromatografía en columna se
desarrolla en columnas de vidrio de 3 cm de diámetro empaquetadas con gel de sílice 60
(Merck 1.09385.2500; 0.040-0.063 mm de tamaño de partícula). Se emplea como fase
móvil una mezcla de tolueno:dioxano (8/2; 6/4).
La purificación de los compuestos finales se lleva a cabo mediante extracciones
líquido-líquido utilizando como fase orgánica diclorometano y como fase acuosa agua.
Síntesis química
104
5.4.1.3 Elucidación estructural de los compuestos
Las técnicas empleadas para elucidación estructural son la Espectroscopía
Infrarroja, la Resonancia Magnética Nuclear de protón (1H-RMN), la Resonancia
Magnética Nuclear de carbono (13C-RMN), el Experimento de correlación heteronuclear a
varios enlaces carbono-protón (13C- 1H HMBC) y Análisis Elementales de C, H, N.
Los espectros de infrarrojo, se realizan es un espectrómetro Thermo Nicolet FT-IR
Nexus Euro (Madison, USA) con el programa informático OMNIC 6.0. Se utilizan pastillas
de bromuro potásico para muestras sólidas y de cloruro sódico para aceites y líquidos.
Los números de onda (ѵ) se expresan en cm-1 y la intensidad de las bandas se detalla de
la siguiente manera: señal intensa (f), señal media (m) y señal débil (d).
Los espectros de 1H-RMN se registran en un aparato Bruker 400 Ultrashield (400
MHz) (Rheinstetten, Germany) utilizando tetrametilsilano (TMS) como referencia. El
disolvente empleado para la preparación de las muestras de los compuestos intermedios
es cloroformo deuterado (CDCl3) y para la elaboración de las muestras de los compuestos
finales es dimetilsulfóxido (DMSO-d6). La multiplicidad de las señales se expresa como:
singlete (s), doblete (d), triplete (t), multiplete (m), singlete ancho (sa) y doble doblete (dd).
Los desplazamientos químicos (δ) se expresan en partes por millón (ppm) y las
constantes de acoplamiento (J) se expresan en herzios (Hz).
Para los experimentos de 13C-RMN y HMBC se utiliza el mismo equipo empleado
en 1H-RMN, al igual que los disolventes.
Los Análisis Elementales se realizan en un microanalizador LECO CHN-900
(Michigan, USA) a partir de muestras previamente secadas en un desecador a vacío (3-4
mmHg) y en presencia de pentóxido de fósforo durante 13-14 horas a 30-40°C. El
intervalo de error admitido en los productos finales es de +0,5 para cada tipo de átomo
determinado.
Síntesis química
105
Los puntos de fusión de los productos descritos se determinan en un equipo Metter
FP82 + FP80. La temperatura de fusión se indica en grados centígrados (°C).
5.4.1.4 Descripción de los compuestos
5.4.1.4.1 Productos de partida
En la descripción de los productos de partida se introducen los siguientes datos
identificativos: nombre químico, estructura química, código del compuesto, fórmula
molecular (FM), peso molecular (PM), punto de fusión (Pf), aspecto físico, rendimiento
(Rto), método de síntesis empleado, las señales más representativas de IR y 1H-RMN y el
análisis elemental de C, H, N.
5.4.1.4.2 Compuestos finales
En la descripción de los compuestos finales se introduce: nombre químico,
estructura química, código del compuesto, fórmula molecular (FM), peso molecular (PM),
punto de fusión (Pf), aspecto físico, rendimiento (Rto), método de síntesis empleado, las
señales más representativas de IR y 1H-RMN y el análisis elemental de C, H, N.
Síntesis química
106
5.4.2 Esquema general de síntesis
Síntesis química
107
5.4.3 Experimental
5.4.3.1 Productos de partida: derivados de1,4-di-N-óxido de
2-metilquinoxalina (1)
1,4-di-N-óxido de 2-metilquinoxalina
[1A]
FM: C9H8N2O2
PM: 176,17
Pf: 170-171
Rendimiento: 5,9%
Aspecto físico: Sólido café claro
Método de síntesis experimental
En un matraz de 250,00 mL se disuelve el benzofuroxano (20,00 mmol; 2,72 g) y el
CaCl2 (2,00 mmol; 0,22 g) en metanol (100,00 mL) con agitación. La disolución adquiere
color amarillo. Una vez disuelta la mezcla, se añade etanolamina (33,14 mmol; 2,00 mL) y
gota a gota acetilacetona (24,00 mmol; 2,48 mL). Al añadir la etanolamina la disolución se
torna color granate. Se cubre el matraz con papel aluminio con el fin de protegerlo de la
luz y se deja la reacción en agitación a temperatura ambiente y se sigue por TLC hasta
que el benzofuroxano desaparece por completo. A medida que transcurre la reacción se
va formando un precipitado. Transcurridas 24 horas se para la reacción.
Se realiza una extracción DCM:H2O, la fase orgánica se seca con Na2SO4
anhídrido y el disolvente se elimina a presión reducida en el rotavapor. El residuo obtenido
se precipita con éter dietílico y se filtra, obteniéndose un sólido café claro.
Síntesis química
108
IR: (KBr) (ѵ, cm-1): 3042 (d, Ʋ=C-H, anillo aromático); 1335 (f, ƲN+-O-).
1H-RMN (400 MHz, CDCl3) (δ, ppm): 8,66-8,58 (m, 2H, H5+H8); 8,38 (s, 1H, H3); 7,92-7,84
(m, 2H, H6+H7); 2,65 (s, 3H, CH3).
Análisis Elemental C,H,N (%):
C% H% N%
Calculado 61,40 4,50 15,90
Hallado 61,60 4,90 15,90
Síntesis química
109
1,4-di-N-óxido de 2,6-dimetilquinoxalina
[1B]
FM: C10H10N2O2
PM: 190,20
Pf: 171-172
Rendimiento: 34,7%
Aspecto físico: Sólido amarillo
Método de síntesis experimental
En un matraz de 250,00 mL se disuelve el 5-metilbenzofuroxano (20,00 mmol; 3,00
g) y el CaCl2 (2,00 mmol; 0,22 g) en metanol (100,00 mL) con agitación. La disolución
adquiere color amarillo. Una vez disuelta la mezcla, se añade etanolamina (33,14 mmol;
2,00 mL) y gota a gota acetilacetona (24,00 mmol; 2,48 mL). Al añadir la etanolamina la
disolución se torna color granate. Se cubre el matraz con papel aluminio con el fin de
protegerlo de la luz y se deja la reacción en agitación a temperatura ambiente y se sigue
por TLC hasta que el 5-metilbenzofuroxano desaparece por completo. A medida que
transcurre la reacción se va formando un precipitado. Transcurridas 24 horas se para la
reacción.
Se realiza una extracción DCM:H2O, la fase orgánica se seca con Na2SO4
anhídrido y el disolvente se elimina a presión reducida en el rotavapor. El residuo obtenido
se precipita con éter dietílico y se filtra, obteniéndose un sólido amarillo.
IR: (KBr) (ѵ, cm-1): 3055 (d, Ʋ=C-H, anillo aromático); 1350 (f, ƲN+-O-).
1H-RMN (400 MHz, CDCl3) (δ, ppm): 8,52 (d, J8-7=8,8 Hz, 1H, H8); 8,39 (s, 1H, H3); 8,28 (s,
1H, H5); 7,70 (d, 1H, H7); 2,62 (d, 6H, CH3).
Síntesis química
110
Análisis Elemental C,H,N (%):
C% H% N%
Calculado 63,10 5,30 14,70
Hallado 62,60 5,30 14,70
Síntesis química
111
1,4-di-N-óxido de 2-metil-6-metoxiquinoxalina
[1C]
FM: C10H10N2O3
PM: 206,20
Pf: 191-192
Rendimiento: 56,0%
Aspecto físico: Sólido amarillo
Método de síntesis experimental
En un matraz de 250,00 mL se disuelve el 5-metoxibenzofuroxano (20,00 mmol;
3,30 g) y el CaCl2 (2,00 mmol; 0,22 g) en metanol (100,00 mL) con agitación. La disolución
adquiere color amarillo. Una vez disuelta la mezcla, se añade etanolamina (33,14 mmol;
2,00 mL) y gota a gota acetilacetona (24,00 mmol; 2,48 mL). Al añadir la etanolamina la
disolución se torna color granate. Se cubre el matraz con papel aluminio con el fin de
protegerlo de la luz y se deja la reacción en agitación a temperatura ambiente y se sigue
por TLC hasta que el 5-metoxibenzofuroxano desaparece por completo. A medida que
transcurre la reacción se va formando un precipitado. Transcurridas 24 horas se para la
reacción.
Se realiza una extracción DCM:H2O, la fase orgánica se seca con Na2SO4
anhídrido y el disolvente se elimina a presión reducida en el rotavapor. El residuo obtenido
se precipita con éter dietílico y se filtra, obteniéndose un sólido amarillo.
IR: (KBr) (ѵ, cm-1): 3055 (d, Ʋ=C-H, anillo aromático); 1344 (f, ƲN+-O-); 1261 (f, ƲC-O).
1H-RMN (400 MHz, CDCl3) (δ, ppm): 8,51 (d, J8-7=9,4 Hz, 1 H, H8); 8,30 (s, 1 H, H3); 7,87
(s, 1 H, H5); 7,45 (d, 1 H, H7); 4,02 (s, 3 H, CH3O); 2,59 (s, 3 H, CH3).
Síntesis química
112
Análisis Elemental C,H,N (%):
C% H% N%
Calculado 58,30 4,90 13,60
Hallado 58,80 5,00 13,50
Síntesis química
113
1,4-di-N-óxido de 6-cloro-2-metilquinoxalina
[1D]
FM: C9H7ClN2O2
PM: 210,62
Pf: 186-187
Rendimiento: 10,9%
Aspecto físico: Sólido amarillo
Método de síntesis experimental
En un matraz de 250,00 mL se disuelve el 5-clorobenzofuroxano (20,00 mmol;
3,41 g) y el CaCl2 (2,00 mmol; 0,22 g) en metanol (60,00 mL) con agitación. La disolución
adquiere color amarillo. Una vez disuelta la mezcla, se añade etanolamina (33,14 mmol;
2,00 mL) y gota a gota acetilacetona (24,00 mmol; 2,48 mL). Al añadir la etanolamina la
disolución se torna color granate y al agregar la acetilacetona la reacción toma un color
café-negruzco. Se cubre el matraz con papel aluminio con el fin de protegerlo de la luz y
se deja la reacción en agitación a temperatura ambiente y se sigue por TLC hasta que el
5-clorobenzofuroxano desaparece por completo. A medida que transcurre la reacción se
va formando un precipitado. Transcurridas 24 horas se para la reacción.
El metanol se elimina a presión reducida en el rotavapor. El aceite obtenido se
purifica por cromatografía de columna, utilizando tolueno:dioxano (6/4) como fase móvil.
El residuo obtenido se precipita con éter dietílico y se filtra, obteniéndose un sólido
amarillo.
IR: (KBr) (ѵ, cm-1): 3036 (d, Ʋ=C-H, anillo aromático); 1346 (f, ƲN+-O-); 1102 (m, ƲAr-Cl).
1H-RMN (400 MHz, CDCl3) (δ, ppm): 8,60 (s, 1 H, H5); 8,58 (d, J8-7=8,0 Hz, 1 H, H8); 8,32
(s, 1H, H3); 7,81 (dd, J7-5= 2,2 Hz, 1H, H7); 2,62 (s, 3 H, CH3).
Síntesis química
114
Análisis Elemental C,H,N (%):
C% H% N%
Calculado 51,30 3,30 13,30
Hallado 51,10 3,30 13,00
Síntesis química
115
5.4.3.2 Productos intermedios: derivados de 1,4-di-N-óxido de 2-(4-
cloro-2-oxobutil) quinoxalina (2)
1,4-di-N-óxido de 2-(4-cloro-2-oxobutil)-6-metilquinoxalina
[2B]
FM: C13H13ClN2O3
PM: 280,71
Pf: 120-121
Rendimiento: 12,5%
Aspecto físico: Sólido café
Método de síntesis experimental
En un matraz de 100,00 mL se disuelve la 1,4-di-N-óxido de 2,6-dimetilquinoxalina
(6,30 mmol; 1,20 g) en cloroformo seco (30,00 mL) con agitación. La disolución adquiere
color granate. Una vez disuelta la mezcla, se añade AlCl3 (6,30 mmol; 0,84 g) y se coloca
la reacción en baño de hielo. Se añade gota a gota cloruro de ácido (9,50 mmol; 0,90 mL).
La mezcla de reacción adquiere color negro verduzco. Se cubre el matraz con papel
aluminio con el objetivo de proteger la reacción de la luz. La reacción se mantiene en
agitación a temperatura ambiente y se sigue por TLC.
Transcurridas 24 horas se para la reacción y se filtra sobre celite con el fin de
eliminar los restos de metales (AlCl3). Las aguas madres se vierten en un vaso de
precipitado con hielo con el propósito de hidrolizar los restos de cloruro de ácido y AlCl3.
Las aguas madres adquieren color morado negruzco.
Se realiza una extracción CHCl3:H2O. La fase orgánica se seca con Na2SO4
anhídrido y el disolvente se elimina a presión reducida en el rotavapor. El aceite obtenido
Síntesis química
116
se purifica por cromatografía de columna, utilizando tolueno:dioxano (8/2) como fase
móvil. El residuo obtenido se precipita con éter dietílico y se filtra, obteniéndose un sólido
café.
IR: (KBr) (ѵ, cm-1): 3065 (d, Ʋ=C-H, anillo aromático); 1730 (f, ƲC=O); 1355 (f, ƲN+-O-);
1180 (f, ƲC-Cl).
1H-RMN (400 MHz, CDCl3) (δ, ppm): 8,48 (s, 1H, H3); 8,37 (s, 1H, H5); 8,08 (d, J=8,7 Hz,
1H, H8); 7,71 (dd, J7-8= 8,6 Hz, J7-5= 1,8 Hz, 1H, H7); 5,45 (s, 2H, QX-CH2-CO); 3,84 (t, 2H,
CH2-Cl); 2,98 (t, 2H, CO-CH2); 2,64 (s, 3H, CH3).
Análisis Elemental C,H,N (%):
C% H% N%
Calculado 55,60 4,60 10,00
Hallado 55,10 4,70 9,80
Síntesis química
117
1,4-di-N-óxido de 2-(4-cloro-2-oxobutil)-6-metoxiquinoxalina
[2C]
FM: C13H13ClN2O4
PM: 296,71
Pf: 123-124
Rendimiento: 18,5%
Aspecto físico: Sólido rosado claro
Método de síntesis experimental
En un matraz de 100,00 mL se disuelve la 1,4-di-N-óxido de 6-metoxi-2-
metilquinoxalina (5,80 mmol; 1,20 g) en cloroformo seco (30,00 mL) con agitación. La
disolución adquiere color granate. Una vez disuelta la mezcla, se añade AlCl3 (5,80 mmol;
0,77 g) y se coloca la reacción en baño de hielo. Se añade gota a gota cloruro de ácido
(8,70 mmol; 0,80 mL). La mezcla de reacción adquiere color negro verduzco. Se cubre el
matraz con papel aluminio con el objetivo de proteger la reacción de la luz. La reacción se
mantiene en agitación a temperatura ambiente y se sigue por TLC.
Transcurridas 24 horas se para la reacción y se filtra sobre celite con el fin de
eliminar los restos de metales (AlCl3). Las aguas madres se vierten en un vaso de
precipitado con hielo con el propósito de hidrolizar los restos de cloruro de ácido y AlCl3.
Las aguas madres adquieren color morado negruzco.
Se realiza una extracción CHCl3:H2O. La fase orgánica se seca con Na2SO4
anhídrido y el disolvente se elimina a presión reducida en el rotavapor. El aceite obtenido
se purifica por cromatografía de columna, utilizando tolueno:dioxano (8/2) como fase
móvil. El residuo obtenido se precipita con éter dietílico y se filtra, obteniéndose un sólido
rosado claro.
Síntesis química
118
IR: (KBr) (ѵ, cm-1): 3074 (d, Ʋ=C-H, anillo aromático); 1730 (f, ƲC=O); 1357 (f, ƲN+-O-);
1186 (f, ƲC-Cl).
1H-RMN (400 MHz, CDCl3) (δ, ppm): 8,48 (s, 1H, H3); 8,00 (dd, J8-7= 9,2 Hz, 1H, H8); 7,88
(d, J5-7=2,7 Hz, 1H, H5); 7,47 (dd, 1H, H7); 5,39 (s, 2H, QX-CH2-CO); 4,02 (s, 3H, OCH3);
3,83 (t, J= 6,5 Hz, 2H, CH2-Cl); 2,96 (t, 2H, CO-CH2).
Análisis Elemental C,H,N (%):
C% H% N%
Calculado 52,6 4,4 9,4
Hallado 53,1 4,7 9,6
Síntesis química
119
5.4.3.3 Productos finales: derivados de 1,4-di-N-óxido de 2-[4-(4-(2-
nitro-4-(trifluorometil)fenil)piperazin-1-il)-2-oxobutil] quinoxalina (3)
1,4-di-N-óxido de 6-metil-2-[4-(4-(2-nitro-4-trifluorometilfenil)piperazin-1-il)-2-oxobutil]
quinoxalina
[3B]
FM: C24H24F3N5O5
PM: 519,47
Pf: 111-112
Rendimiento: 28,0%
Aspecto físico: Sólido amarillo
Método de síntesis experimental
En un matraz de 100,00 mL se disuelve la 1,4-di-N-óxido de 2-(4-cloro-2-oxobutil)-
6-metilquinoxalina (1 eq; 0,37 mmol; 0,10 g) y la 1-[2-nitro-4-(trifluorometil)fenil]piperazina
(1,2 eq; 0,44 mmol; 0,12 g) en THF (25,00 mL) con agitación. Una vez disuelta la mezcla,
se añade la cantidad equimolecular de carbonato potásico (1,5 eq; 0,55 mmol; 0,08 g). La
disolución adquiere color amarillo. La reacción se mantiene en agitación y se pone a
reflujo por 18 horas. El avance de la reacción se va comprobando por TLC.
El THF se elimina a presión reducida en el rotavapor. Luego se realiza una
extracción DCM:H2O. La fase orgánica se seca con Na2SO4 anhídrido y el disolvente se
elimina a presión reducida en el rotavapor. El residuo obtenido se precipita con éter
dietílico y se filtra, obteniéndose un sólido amarillo.
Síntesis química
120
IR: (KBr) (ѵ, cm-1): 2946 (d, Ʋ=C-H, anillo aromático); 1736 (f, ƲC=O); 1534 (f, ƲC-NO2);
1330 (f, ƲN+-O-); 1123 (f, ƲAr-CF3).
1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) (δ, ppm): 8,73 (s, 1H, H3); 8,24 (s, 1H, H3´); 8,14 (s, 1H, H5);
7,99 (d, J=8,4 Hz, 1H, H8); 7,86 (d, J=8,1 Hz, 1H, H5´); 7,76 (d, J7-8=8,3 Hz, 1H, H7); 7,39
(d, J=8,6 Hz, 1H, H6´); 5,32 (s, 2H, QX-CH2-CO); 3,31 (sa, 2H, CH2-piperazina); 3,10 (sa,
4H, H3+H5 piperazina); 2,68 (sa, 4H, H2+H6 piperazina); 2,55 (sa, 3H, CH3); 2,52 (X, 2H,
CO-CH2).
Análisis Elemental C,H,N (%):
C% H% N%
Calculado 55,50 4,60 13,50
Hallado 55,00 4,40 13,60
Síntesis química
121
1,4-di-N-óxido de 6-metoxi-2-[4-(4-(2-nitro-4-(trifluorometil)fenil)piperazin-1-il)-2-oxobutil]
quinoxalina
[3C]
FM: C24H24F3N5O6
PM: 535,47
Pf: 107-108
Rendimiento: 65,6%
Aspecto físico: Sólido amarillo
Método de síntesis experimental
En un matraz de 100,00 mL se disuelve la 1,4-di-N-óxido de 2-(4-cloro-2-oxobutil)-
6-metoxiquinoxalina (1; 1,01 mmol; 0,30 g) y la 1-[2-nitro-4-(trifluorometil)fenil]piperazina
(1,2; 1,21 mmol; 0,33 g) en THF (25,00 mL) con agitación. Una vez disuelta la mezcla, se
añade el carbonato potásico (2,5; 2,53 mmol; 0,35 g). La disolución adquiere color
amarillo. La reacción se mantiene en agitación y se pone a reflujo por aproximadamente
11 horas alternadas durante los 6 días de la reacción. El avance de la reacción se va
comprobando por TLC.
Transcurridos 6 días se para la reacción. El THF se elimina a presión reducida en
el rotavapor. Luego se realiza una extracción DCM:H2O con el objetivo de eliminar la 1-[2-
nitro-4-(trifluorometil)fenil]piperazina restante. La fase orgánica se seca con Na2SO4
anhídrido y el disolvente se elimina a presión reducida en el rotavapor. El residuo obtenido
se precipita con éter dietílico y se filtra, obteniéndose un sólido amarillo.
IR: (KBr) (ѵ, cm-1): 2952 (d, Ʋ=C-H, anillo aromático); 1736 (f, ƲC=O); 1532 (f, ƲC-NO2);
1329 (f, ƲN+-O-); 1157 (f, ƲAr-CF3).
Síntesis química
122
1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) (δ, ppm): 8,64 (s, 1H, H3); 8,09 (s, 1H, H3´); 7,98 (d, J8-7=
9,3 Hz, 1H, H8); 7,85 (d, J5-7=2,8 Hz, 1H, H5); 7,71 (d, J=8,1 Hz, 1H, H5´); 7,47 (dd, 1H, H7);
7,23 (d, J=8,8 Hz, 1H, H6´); 5,40 (s, 2H, QX-CH2-CO); 4,01 (s, 3H, OCH3); 3,28 (sa, 4H,
H3+H5 piperazina); 2,96 (sa, 2H, CH2-piperazina); 2,74 (sa, 4H, H2+H6 piperazina); 1,64
(sa, 2H, CO-CH2).
Análisis Elemental C,H,N (%):
C% H% N%
Calculado 53,80 4,50 13,10
Hallado 53,70 4,70 12,70
AAnnáálliissiiss oorrggáánniiccoo
Análisis orgánico
125
6.1 Espectroscopía de infrarrojo
La espectroscopía de infrarrojo (IR) se ha utilizado para la elucidación estructural de
los productos de partida, intermedios y finales, aportando principalmente información
sobre la funcionalidad de las moléculas91.
Los compuestos presentes en esta memoria muestran un conjunto de bandas
debidas a los grupos funcionales que los caracterizan (Figura 6.1 y Tabla 6.1).
Los derivados de N-óxido de quinoxalina presentan una banda característica a
una Ʋ~1330 cm-1 debido a la tensión de vibración del grupo N+-O-. En algunos de
los compuestos este grupo también puede presentarse en dos bandas (Ʋ~1350 y
1320 cm-1) debidas a la tensión de vibración de los grupos N+-O- que aparecen a
distinto número de onda por la influencia del entorno en función de los
sustituyentes que presenta la molécula.
Los derivados de 1,4-di-N-óxido de 2-[4-(4-(2-nitro-4-(trifluorometil)fenil)piperazin-
1-il)-2-oxobutil] quinoxalina de este estudio muestran las bandas características
del grupo carbonilo. Presentan una banda a Ʋ~1730 cm-1 correspondiente a la
tensión de vibración del enlace C=O, una banda a Ʋ~1530 cm-1 debida a la
tensión de vibración del enlace C-NO2 y una banda a Ʋ~1150 cm-1
correspondiente a la tensión de vibración del enlace Ar-CF3.
Análisis orgánico
126
Figura 6.1 Estructura general de los derivados de 1,4-di-N-óxido de 2-[4-(4-(2-nitro-4-
(trifluorometil)fenil)piperazin-1-il)-2-oxobutil] quinoxalina.
Tabla 6.1 Bandas de IR características de los derivados de 1,4-di-N-óxido de 2-[4-(4-(2-
nitro-4-(trifluorometil)fenil)piperazin-1-il)-2-oxobutil] quinoxalina.
Código compuesto R6/R7 ƲC=O (cm-1) ƲC-NO2 (cm-1) ƲN+
-O- (cm-1) ƲAR-CF3 (cm-1)
3B CH3/H 1736 1534 1330 1123
3C OCH3/H 1736 1532 1329 1157
Análisis orgánico
127
Figura 6.2 Espectro de IR de un derivado de 1,4-di-N-óxido de 2-[4-(4-(2-nitro-4-
(trifluorometil)fenil)piperazin-1-il)-2-oxobutil] quinoxalina.
Análisis orgánico
128
6.2 Espectroscopía de resonancia magnética nuclear
6.2.1 Estudio 2D de RMN de 1,4-di-N-óxido de 2-metil-6-
metoxiquinoxalina
Con el objetivo de llevar a cabo la completa asignación de las señales de protón
de los compuestos sintetizados, en este caso para estudiar la inequívoca asignación de
las señales de los protones H3 y H5, se realiza un estudio de la estructura 1,4-di-N-óxido
de 2-metil-6-metoxiquinoxalina (Figura 6.3) por HMBC (Heteronuclear Multiple Bond)
(Figura 6.4), ya que este es el experimento bidimensional heteronuclear de RMN que más
información aporta acerca de la conectividad de la molécula, debido a que se pueden
observar acoplamientos H-C a tres enlaces de distancia92.
Figura 6.3 Estructura e identificación de los hidrógenos del compuesto en estudio.
Análisis orgánico
129
Figura 6.4 Espectro de HMBC de 1,4-di-N-óxido de 2-metil-6-metoxiquinoxalina.
Los datos de correlación C-H se recogen en la siguiente tabla (Tabla 6.2):
Tabla 6.2 Correlación de los desplazamientos químicos C-H de 1,4-di-N-óxido de 2-metil-
6-metoxiquinoxalina.
3 5 7 8 CH3 OCH3
13C-RMN 131,51 99,01 124,88 121,55 16,04 56,77
1H-RMN 8,30 7,87 7,45 8,51 2,59 4,02
Análisis orgánico
130
Los desplazamientos químicos para las señales correspondientes a los carbonos C6
y CH3 según el espectro de 13C-RMN para el compuesto 1,4-di-N-óxido de 2-metil-6-
metoxiquinoxalina son 162,49 ppm y 16,04 ppm, respectivamente. Como era de esperar
se puede observar en la Figura 6.5, el acoplamiento existente entre el C6 y el H5, y entre el
carbono CH3 del grupo metilo sustituido en posición 2 del anillo de quinoxalina con el H3
situados en las posiciones contiguas. Llegados a este punto se está en disposición de
asignar de forma correcta los desplazamientos químicos para las señales de los protones
H3 y H5.
Figura 6.5 Zoom de los acoplamientos para los protones aromáticos H3 y H5 obtenido del
espectro HMBC de 1,4-di-N-óxido de 2-metil-6-metoxiquinoxalina.
MMeettooddoollooggííaa ddee llooss eennssaayyooss
Metodología de los ensayos biológicos
133
7.1 Evaluación de la actividad biológica
7.1.1 Evaluación de la actividad biológica de los compuestos
antimaláricos
El estudio de la actividad antimalárica de los compuestos descritos es llevado a
cabo por el Grupo Malaria de la Universidad de Antioquia, Medellín, Colombia.
Los ensayos in vitro se realizan en cepas Colombian FCR-3 de P. falciparum,
resistentes a la Cloroquina. Los cultivos se desarrollan a 37ºC, en una atmósfera de
CO2 al 5% y en un medio de glucosa enriquecida RPMI 1640, con gentamicina a una
concentración de 0,1 mg/mL y suero humano al 10% inactivado por calor. Los
compuestos se disuelven en dimetilsulfóxido (DMSO) hasta completar un rango de
concentración entre 200 y 0,1 µM. La concentración final de DMSO nunca es superior al
0,1%.
La actividad antimalárica in vitro se mide utilizando el ensayo de incorporación de
Hipoxantina tritiada (MP Biomedicals, USA) según el método de Desjardins. El método
consiste en una medición indirecta de la actividad metabólica del parásito, por medio de
la incorporación de un precursor de ácidos nucléicos marcado radiactivamente.
El Plasmodium es incapaz de sintetizar las purinas que necesita para su
replicación, obteniéndolas de una fuente externa. La utilización del precursor de purinas
marcadas permite determinar la incorporación del material genético del parásito, y por
tanto, se comportará como marcador de la regeneración del mismo.
Los ensayos se realizan por triplicado y los resultados se obtienen por
interpolación lineal. Finalmente se expresan como IC50 (concentración que produce una
inhibición del 50% del crecimiento ± la desviación estándar), siendo:
Log (IC50) = log (X1) + (50-Y1)/(Y2-Y1) [log (X2) – log (X1)].
X1: Concentración del compuesto que da un % de inhibición de la parasitemia
Y1>50%.
Metodología de los ensayos biológicos
134
X2: Concentración de compuesto que da un % de inhibición del la parasitemia
Y2<50%.
El porcentaje de incorporación de Hipoxantina unida al parásito = 100 –
(P/T*100).
P: cuentas por minuto (c.p.m.) para cada concentración.
T: control negativo (eritrocitos sin tratar).
7.1.2 Evaluación de la actividad biológica de los compuestos
antileishmaniásicos
El estudio de la actividad antileishmaniásica de los compuestos descritos frente al
agente Leishmania es llevada a cabo por el Grupo de Enfermedades Infecciosas de la
Universidad Peruana Cayetano Heredia, Lima, Perú.
Los ensayos in vitro se realizan en cepas MHOM/BR/76/LTB-012A de Leishmania
amazonensis. Las formas libres adultas del amastigote de L. amazonensis son
mantenidas en un medio MAA/20 (Sereno and Lemesre, 1997) a 32 ± 1ºC en 25 cm2 de
un frasco de cultivo tisular.
L. peruviana (cepa MHOM/PE/LCA08) y L. braziliensis (cepa MHOM/PE/PER006)
son preservados en estadio promastigote en un medio bifásico (agar sangre con 0.89%
NaCl, pH 7,4) a 24 °C. Los promastigotes (5x106 parásitos) son luego transferidos a 25
cm2 de un frasco de cultivo tisular que contienen 5 mL de medio suplementado M199 con
10% de suero bovino fetal (FBS), a un pH de 7,4. Después de 4 días, la fase exponencial
de promastigotes es centrifugada durante 10 minutos a 1500 g y 4°C. El sobrenadante se
descarta y se reemplaza por un medio fresco M199 suplementado con 20% FBS, a un pH
de 5,5. Los amastigotes libres transformados son luego inducidos por incremento de la
temperatura a 34°C e incubados durante 96 horas (Teixeira et al., 2002).
Macrófagos de cavidades peritoneales de ratones BALB/c hembra de 6-8 semanas
Metodología de los ensayos biológicos
135
son sembrados en un medio congelado M199 suplementado con 10 % FBS (Sauvain et
al., 1993). Las células extraídas son inmediatamente depositadas en cristales
esterilizados de 4x4 mm cubiertos y colocados en cada pocillo de una placa de 96. Las
placas se dejan incubando durante 24 horas a 37 °C y a 5% de CO2 para permitir la
adhesión celular. Un medio M199 completo precalentado se usa dos veces para eliminar
las células no-adherentes. Aproximadamente 7x104 células viable son depositadas en
cada pocillo para la adhesión.
La actividad antileishmaniásica in vitro de los compuestos es determinada en
cultivos de amastigotes puros de L. amazonensis. Para estimar la concentración
inhibitoria del 50% (IC50) de los extractos, se utiliza el micrométodo de 3-(4,5-dimetiltiazol-
2-il)-2,5-difeniltetrazolium bromado (MTT) (Sereno and Lemesre, 1997b).
La determinación de la toxicidad a macrófagos se realiza con macrófagos
peritoneales de roedor, los cuales son tratados con el método de exclusión de la tinción
azul tripán (Castillo et al., 2007). Se añaden diluciones de 10, 1 y 0,1 µM en medio
completo hasta alcanzar un volumen final de 100 µL. El cultivo se incuba durante otras 48
horas a 37°C con 5% de CO2. Después de esta incubación, se contabiliza el número de
células viables usando un hematocitómetro con una solución de azul tripán 0,4% en PBS.
Así se determina la mitad de la dosis citotóxica máxima 50 para cada tipo celular;
repitiendo estos experimentos 3 veces.
Respecto a la infección de los macrófagos por los amastigotes, para calcular la
actividad antileishmaniásica intracelular, el medio que contienen los macrófagos en los
pocillos es reemplazado por una suspensión que contiene amastigotes, usando una
infección de proporción 3/1 amastigotes/macrófagos. Veinticuatro horas después de la
infección, se añade al cultivo una solución del compuesto para ser probado a varias
concentraciones y se mantiene en incubación a 37°C con 5% CO2 durante 48 horas más.
Las placas se fijan con metanol y una tinción Giemsa 10 %. El porcentaje de macrófagos
infectados se determina microscópicamente a 1000 aumentos. El número de amastigotes
Metodología de los ensayos biológicos
136
intracelulares se determina en 300 células. El porcentaje de tasa de infección (%IR) de
cada cultivo se calcula de la siguiente manera:
%IR = 100 – (tasa de infección del cultivo tratado / tasa de infección del cultivo
sin tratar) x 100.
El IC50 se calcula también como la dosis capaz de reducir al 50% el número de
células infectadas. Se repiten los experimentos por triplicado. Se utiliza el test ANOVA
para realizar el estudio estadístico. El número total de carga parásita se calcula como el
número de células infectadas por amastigotes, por el número de macrófagos infectados.
RReessuullttaaddooss yy ddiissccuussiióónn
Resultados y discusión
139
8.1 Resultados y discusión
Tal y como se había descrito en el apartado de objetivos, se han sintetizado
derivados de 1,4-di-N -óxido de quinoxalina. A continuación, se presentan los 8
compuestos sintetizados y caracterizados.
Figura 8.1 Relación de derivados de 1,4-di-N-óxido de quinoxalina sintetizados.
En la siguiente tabla se muestra la relación de compuestos sintetizados así como
los rendimientos obtenidos. Puede observarse que los rendimientos varían mucho de un
Resultados y discusión
140
compuesto a otro probablemente debido a las dificultades encontradas tanto en la síntesis
como en la purificación de algunos de estos, ya que era necesario realizar la purificación
mediante cromatografía en columna en la mayoría de los compuestos sintetizados.
Tabla 8.1 Relación de compuestos sintetizados y su rendimiento.
Código compuesto R6 R7 Rto. (%)
1A H H 5,9
1B CH3 H 34,7
1C OCH3 H 56,0
1D Cl H 10,9
2B CH3 H 12,5
2C OCH3 H 18,5
3B CH3 H 28,0
3C OCH3 H 65,6
Los compuestos 1A, 1C, 2B, 2C, 3B y 3C, han sido enviados a la Universidad de
Antioquia, Medellín y a la Universidad Peruana Cayetano Heredia, Lima, para la
evaluación biológica frente a P. falciparum y L. amazonensis, respectivamente.
Actualmente, solo se dispone de los resultados frente a L. amazonensis (Tabla 8.2) y
estamos a la espera de los resultados frente a P. falciparum.
Resultados y discusión
141
Tabla 8.2 Resultados de los ensayos biológicos frente a L. amazonensis.
Código compuesto R6 R7 % inhib. 1 µM IC50 (µM)
1A H H 93,3 33,3
1C OCH3 H 1,4 ND
2B CH3 H 4,5 ND
3B CH3 H 6,8 ND
3C OCH3 H 5,1 ND
Anfotericina B 100,6 1,1
ND: No determinado por presentar poca actividad a la máxima concentración.
Como se observa en los resultados, el único compuesto con actividad biológica
frente a L. amazonensis es el 1A.
CCoonncclluussiioonneess
Conclusiones
145
Conclusiones
El trabajo descrito en esta memoria permite llegar a las siguientes conclusiones:
1. Se han sintetizado y caracterizado ocho nuevos compuestos derivados de 1,4-di-N-
óxido de quinoxalina que no aparecen descritos con anterioridad en la bibliografía
consultada, siendo originales en su estructura. Todos ellos han sido identificados por
las técnicas analíticas de espectroscopía de infrarrojo, espectroscopía de resonancia
magnética nuclear de protón y análisis elemental.
2. Se ha estudiado y propuesto el posible mecanismo de reacción para la síntesis de los
derivados de 1,4-di-N-óxido de 2-metilquinoxalina mediante la monitorización de la
reacción con TLC y CLAR.
3. El estudio de 1,4-di-N-óxido de 2-metil-6-metoxiquinoxalina, mediante el empleo de
técnicas espectroscópicas de resonancia magnética nuclear, ha permitido asignar de
modo inequívoco los desplazamientos químicos para las señales de los protones H3 y
H5 de estos derivados.
4. Se han ensayado los compuestos 1A, 1C, 2B, 3B y 3C frente a Leishmania
amazonensis. El compuesto 1A ha mostrado actividad frente a L. amazonensis. El
resto de los compuestos no presentan actividad frente al parásito.
BBiibblliiooggrraaffííaa
Bibliografía
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