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TOXICIDAD DRMICA SUBCRNICA: ENSAYO DE 90 DAS ENROEDORES

1. INFORMACIN PRELIMINAR

Requisitos previos

- Sustancias de ensayo slidas o lquidas

- Identificacin qumica de la sustancia problema

- pureza (impurezas) de sustancia de ensayo

- caractersticas de solubilidad

- PH (en su caso)

- La estabilidad, incluida la estabilidad en el vehculo cuando se aplica as

- Punto de fusin / punto de ebullicin

2. METODO

2.1 Aplicacin y lmites de la prueba

En la valoracin y evaluacin de las caractersticas txicas de una sustancia qumica paradeterminar la toxicidad drmica subcrnica puede llevarse a cabo despus de lainformacin relativa a la toxicidad se ha obtenido mediante el estudio agudo.Proporciona informacin sobre posibles peligros para la salud que puedan derivarse dela exposicin repetida por va cutnea durante un perodo de tiempo limitado.

Definiciones

Toxicidad drmica subcrnica: es los efectos adversos que se producen como resultadode la aplicacin drmica diaria repetida de un producto qumico a animalesexperimentales para la parte (no superior a 10 por ciento) de un perodo de vida.

Dosis en una prueba cutnea: es la cantidad de sustancia de ensayo que se aplica a la piel(se aplica a diario en las pruebas subcrnica). La dosis se expresa como el peso (g, mg),en peso de la sustancia de ensayo por unidad de peso del animal (por ejemplo, mg / kg).

Nivel sin efecto Nivel Bajo / no-txico-efecto / sin efecto adverso: es la dosis mximautilizada en una prueba que no produce efectos adversos. Un nivel de efecto se expresaen trminos del peso de una sustancia dada a diario por unidad de peso del animal (mg/ kg).

Toxicidad acumulativa: son los efectos adversos de dosis repetidas que se producen comoresultado de una accin prolongada en, o aumento de la concentracin de la sustanciaadministrada o sus metabolitos en, tejido susceptible.

Principio del mtodo

Se aplican a diario dosis crecientes de la sustancia estudiada en la piel de animales deexperimentacin integrados en varios grupos, a razn de una dosis por grupo durante unperodo de 90 das. Durante el perodo de aplicacin se observa diariamente a losanimales en busca de signos de toxicidad. Los animales que mueran durante la pruebase someten a autopsia, que se practica tambin a los supervivientes al concluir el estudio.

2.2 Descripcin del mtodo

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Preparativos

Se mantiene a los animales en las condiciones de alojamiento y alimentacinexperimentales durante al menos 5 das previos a la prueba. Antes de comenzarla, sedistribuye al azar a los animales, que sern jvenes y sanos, para formar grupos detratamiento y de control. Antes de proceder a la aplicacin, se elimina el pelo de la regin

dorsal del tronco de los animales. Puede emplearse afeitado, pero deber practicarseaproximadamente 24 horas antes de la prueba. Suelen ser necesarios cortes o afeitadosreiterados del pelo, ms o menos a intervalos semanales. Al practicarlos, hay que cuidarde no lesionar la piel. Deber dejarse despejada, para la aplicacin de la sustancia enestudio, una superficie no inferior al 10% de la corporal. Para decidir la zona que debedespejarse y las dimensiones de la superficie a tratar, se tendr en cuenta el peso delanimal. Cuando se prueben slidos, que pueden pulverizarse si se considera oportuno,se humedecer lo suficiente la sustancia estudiada con agua o, en caso necesario, unvehculo apropiado para garantizar un buen contacto con la piel. Las sustancias lquidasse emplean por lo general sin diluir. Se practican aplicaciones diarias 5 7 das a lasemana.

Animales de experimentacin

Seleccin de especie

Pueden emplearse ratas, conejos o cobayas adultos. Es posible emplear otras especies,pero su uso exigira justificacin. Al principio de la prueba, los pesos no diferirn en unporcentaje superior al 20% del peso medio en ratas, de 200 a 300 g; conejos, 2,0 a 3,0kg; cobayas, 350 a 450 g. Cuando se realice una prueba drmica subcrnica comopreliminar a una de ndole crnica, se utilizar en ambas las misma especie y cepa.

Nmero y sexo

Se utilizarn al menos 20 animales (10 hembras y 10 machos) con piel sana para cadadosis. Las hembras sern nulparas y no estarn preadas. Si est previsto el sacrificiode algunos animales durante la prueba, debe aumentarse su nmero en una cantidadigual a la de los que vayan a sacrificarse antes de terminar el estudio. Adems, puedetratarse a un grupo satlite de 20 animales (10 de cada sexo) con la dosis ms alta durante90 das para observar en ellos la reversibilidad, la persistencia o la aparicin tarda deefectos txicos durante 28 das tras el tratamiento.

Alojamiento y alimentacin

Los animales deben ser alojados en jaulas individuales. La temperatura en el cuarto deexperimentacin debe ser de 22 C ( 3 ) para los roedores o 20 C ( 3 ) para losconejos y la humedad relativa del 30-70 por ciento. Cuando la iluminacin es artificial,la secuencia debe ser de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad. Para la alimentacin,las dietas de laboratorio convencionales se pueden usar con un suministro ilimitado deagua potable.

Condiciones del ensayo

Los niveles de dosis

Se utilizarn al menos tres niveles posolgicos y un control, o un control para el vehculosi se emplea ste. El perodo de exposicin no ser inferior a 6 horas diarias. La aplicacinde la sustancia de prueba debe hacerse a las mismas horas todos los das, y la cantidad

de producto se ajustar a intervalos (semanales o quincenales) de forma que se mantengauna dosis constante en relacin con el peso del animal. Salvo por la omisin de la

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sustancia estudiada, los animales del grupo de control deben recibir un trato idntico alde los integrantes del grupo de prueba. Cuando se utilice un vehculo para facilitar laadministracin, el grupo de control lo recibir de igual modo que los grupos tratados, yen cantidad igual a la administrada al grupo con dosis ms alta. La dosis ms alta debeoriginar efectos txicos, pero producir pocos fallecimientos, o ninguno. La dosis ms baja

no debe originar signo alguno de toxicidad. Cuando se disponga de una estimacin vlidade la exposicin humana, la dosis mnima ser superior a ese valor. Lo ideal sera que ladosis media produjera el efecto txico mnimo observable. Si se emplea ms de una dosisintermedia, la diferencia entre dosis ser suficiente para que los efectos txicosresultantes sean escalonados. En los grupos con dosis bajas e intermedias, as como enlos controles, la mortalidad debe ser baja, a fin de permitir una evaluacin significativade los resultados.

Si la aplicacin de la sustancia probada provoca una irritacin cutnea grave, sereducirn las concentraciones, lo que quiz origine una reduccin, o la ausencia, de otrosefectos txicos con la dosis alta. Si la piel ha sufrido lesiones importantes, quiz seanecesario dar por concluido el estudio y emprender uno nuevo a concentraciones

menores.

Ensayo lmite

Si un ensayo con una sola dosis de al menos 1000 mg kg de peso corporal / (en funcinde la exposicin humana esperada puede indicar la necesidad de utilizar una dosis alta),utilizando los procedimientos descritos en este estudio, no produce ningn efecto txicoobservable y si la toxicidad no lo hara esperarse sobre la base de datos de compuestosestructuralmente relacionados, realizar un estudio completo con tres dosis puede no serconsiderada necesaria.

Perodo de observacin

Un cuidadoso examen clnico debe hacerse por lo menos una vez al da.

Las observaciones se deben hacer todos los das de manera que se minimizar la prdidade los animales para el estudio, por ejemplo, autopsia o refrigeracin de los animalesmuertos, as como aislamiento o sacrificio de los animales dbiles o moribundos.

Es preciso observar a diario a los animales de experimentacin en busca de signos detoxicidad. Hay que tomar nota del momento del fallecimiento y de los de aparicin ydesaparicin de signos de toxicidad.

Procedimiento

Los animales se alojarn en jaulas individuales. El rgimen ideal comprende laadministracin, a los animales, de la sustancia ensayada por 7 das de la semana duranteun perodo de 90 das. Sin embargo, basado principalmente en la prctica, la aplicacinsobre una base 5 das por semana se considera que es aceptable. Los animales de grupossatlites destinados a observaciones complementarias deben observarse 28 das ms sintratamiento para apreciar la recuperacin de los efectos txicos, o su persistencia. Elperodo de exposicin diario ser de 6 horas. La sustancia estudiada se aplicaruniformemente sobre una zona que corresponda aproximadamente al 10% de lasuperficie corporal total. En caso de sustancias muy txicas, la zona tratada puede serinferior, pero se cubrir con una capa lo ms uniforme y delgada posible.

Durante la exposicin, la sustancia estudiada se mantiene en contacto con la piel conayuda de un apsito de gasa poroso y esparadrapo no irritante. Adems, la zona tratada

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se cubrir de forma que se mantengan colocados el apsito y la sustancia y se impida alos animales la ingestin de sta. Cabe utilizar dispositivos de sujecin para evitar laingestin de la sustancia objeto de estudio, pero no se recomienda la inmovilizacincompleta.

Al final del perodo de exposicin, se eliminar la sustancia restante, siempre que sea

posible, por medio de agua o algn otro mtodo apropiado de limpieza de la piel. Espreciso observar a diario a todos los animales y registrar los signos de toxicidad, incluidosel momento de comienzo, el grado y la duracin. Entre las observaciones que debenpracticarse sobre los animales enjaulados destacan las de modificaciones de la piel y elpelo, los ojos y las membranas mucosas, as como de los sistemas respiratorio,circulatorio, autonmico y nervioso central, la actividad somatomotriz y elcomportamiento. Cada semana, se determinarn el consumo de alimento y el peso de losanimales. Son necesarias observaciones peridicas de los animales para evitar en loposible la prdida de alguno por causa de canibalismo, autlisis de tejidos oenjaulamiento errneo. Al final del perodo de prueba, se realiza la autopsia a todos lossupervivientes de los grupos de tratamiento no satlites. Los animales moribundos se

retirarn y sometern a autopsia.

En todos los animales, incluidos los controles, se practican habitualmentelos exmenes clnicos siguientes:

a) Exploracin oftalmolgica con un oftalmoscopio o equipo apropiado equivalente,antes de administrar la sustancia estudiada y al final del estudio, preferiblemente entodos los animales, pero por lo menos en los grupos con dosis altas y de control. Si seapreciaran alteraciones oculares, se examinar a todos los animales.

b)Pruebas hematolgicas al final del perodo de estudio: hematocrito, concentracin dehemoglobina, recuento eritrocitario, recuento y frmula leucocitarios, y determinacin

de la coagulacin por pruebas como tiempo de coagulacin, tiempo de protrombina,tiempo de tromboplastina o recuento de plaquetas.

c)Determinaciones bioqumicas clnicas en la sangre al final del perodo de prueba. Seconsideran aspectos de inters en todos los estudios el balance electroltico, elmetabolismo de hidratos de carbono y las funciones hepticas y renal. En la seleccin delas pruebas concretas influirn las observaciones sobre el modo de accin de la sustancia.Se sugiere la determinacin de los parmetros siguientes: calcio, fsforo, cloruro, sodio,potasio, glucosa en ayunas (con perodo de ayuno apropiado a cada especie),transaminasas glutamicopirvica (Conocida actualmente como alaninaminotransferasasrica) y glutamicooxaloactica (Conocida actualmente como aspartatoaminotransferasa

srica) s ricas, ornitindescarboxilasa, gammaglutamiltranspeptidasa, nitrgeno ureico,albmina, creatinina plasmtica, bilirrubina total y protenas sricas totales. Entre otrasdeterminaciones que pueden ser necesarias para una evaluacin toxicolgica adecuadafiguran los anlisis de lpidos, hormonas, equilibrio acidobsico, metahemoglobina yactividad de colinesterasa. Siempre que sea preciso, se emplearn otras pruebasbioqumicas clnicas para ampliar la investigacin de los efectos observados.

d)El anlisis de orina no es necesario de forma sistemtica, sino slo en caso de efectostxicos probables o manifiestos. Si los datos de referencia previos son insuficientes,habr que considerar la posible determinacin de los parmetros hematolgicos y debioqumica clnica antes de iniciar la administracin.

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Patologa

Autopsia

Se practicar en todos los animales una autopsia completa que comprenda la inspeccinde la superficie externa del cuerpo, todos sus orificios y las cavidades craneal, torcica y

abdominal y sus contenidos. Hgado, riones, suprarrenales y testculos deben pesarsefrescos lo antes posible tras la diseccin, a fin de evitar la desecacin. Se conservarn enun medio adecuado para un posible examen histopatolgico posterior los rganos ytejidos siguientes: todas las lesiones macroscpicas, el cerebro incluidos cortes debulbo/protuberancia, corteza cerebelosa y enceflica, hipfisis, tiroides/paratiroides,tejido tmico (trquea), pulmones, corazn, aorta (glndulas salivares), hgado, bazo,riones, suprarrenales, pncreas, gnadas, tero, rganos genitales accesorios, vesculabiliar (si existe), esfago, estmago, duodeno, yeyuno, leon, ciego, colon, recto, vejigaurinaria, ganglio linftico representativo (glndula mamaria femenina) (musculatura delmuslo), nervio perifrico (ojos) (esternn con mdula sea) (fmur, incluida superficiearticular) (mdula espinal a tres niveles: cervical, mesotorcico y lumbar) y (glndulas

lagrimales exorbitarias). Los tejidos que aparecen entre parntesis slo se examinarn sias lo aconsejan los signos de toxicidad o afectacin del rgano diana.

Examen histopatolgico

a) Se sometern a un examen histopatolgico completo la piel normal y la tratada, y losrganos y tejidos de los animales de los grupos de control y los de dosis mxima.

b) Se examinarn todas las lesiones macroscpicas.

c) Se examinarn los rganos efectores de los animales de grupos con otras dosis.

d) Si se utilizan ratas, se sometern los pulmones de los animales integrantes de los

grupos con dosis mnimas e intermedias a examen histopatolgico en busca de signos deinfeccin, ya que esta medida permite una evaluacin cmoda del estado de salud de losanimales. Es posible que en los animales de estos grupos no sean necesarios por sistemaexmenes histopatolgicos complementarios, pero siempre se llevarn a cabo en losrganos de los del grupo con dosis mxima que presenten indicios de lesiones.

e) Cuando se utilice un grupo satlite, se practicar un examen histopatolgico de lostejidos y rganos que presenten signos de toxicidad en los grupos tratados.

3. RESULTADOS Y REPORTE

Tratamiento de datos

El informe sobre el ensayo incluir sifuera posible:

Especie, cepa, origen,condiciones ambientales,alimentacin

Condiciones de la prueba

Dosis (incluido el vehculo, siprocede) y concentraciones

Datos de respuesta txica enfuncin del sexo y la dosis

Dosis carente de efectos, si esposible

Momento de la muerte duranteel estudio, o indicacin de que losanimales sobrevivieron a laexperiencia

Descripcin de los efectostxicos o de otro tipo

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Momento de observacin decada signo anmalo y evolucinde ste

Datos sobre alimentacin y peso

Hallazgos oftalmolgicos Pruebas hematolgicas

practicadas y sus resultadoscompletos

Pruebas de bioqumica clnicaempleadas y sus resultados

completos (incluidos los delanlisis de orina, si procede)

Hallazgos de autopsia

Descripcin detallada de los

hallazgos histopatolgicos Tratamiento estadstico de los

resultados, si es posible

Comentario de los resultados

Interpretacin de los resultados.

Evaluacin de los resultados

Los resultados de un estudio de toxicidad drmica subcrnica deben ser evaluados en

conjunto con los hallazgos de estudios anteriores y se considera en trminos de losefectos txicos observados y la necropsia adems de los hallazgos histopatolgicos. Laevaluacin incluir la relacin entre la dosis de la sustancia de ensayo y la presencia oausencia, la incidencia y la gravedad, de anormalidades, incluyendo las anomalasclnicas y de comportamiento, las lesiones macroscpicas, objetivo identificado rganos,cambios de peso, efectos sobre la mortalidad y cualquier otro general o especfico efectostxicos. Una prueba subcrnica realizado correctamente debera proporcionar unaestimacin satisfactoria de un nivel sin efecto.

Informe de la prueba

El informe del ensayo debe incluir la siguiente informacin:

- Especie / cepa utilizada;- Datos de reacciones txicas por sexo y dosis;- Momento de la muerte durante el estudio o si los animales sobrevivieron

a la experiencia;- Efectos txicos o de otro tipo;- Momento de observacin de cualquier sntoma anormal y su evolucin;- alimentos y el peso corporal de datos;- Anlisis hematolgicos practicados y resultados con los datos de

referencia pertinente;- Pruebas de bioqumica clnica empleadas y los resultados con los datos de

referencia pertinente;

-

hallazgos de la autopsia;- Una descripcin detallada de los hallazgos histopatolgicos; y- Tratamiento estadstico de los resultados en su caso.

4. BIBLIOGRAFIA

Subchronic Dermal Toxicity: 90-day Study; 411 OECD GUIDELINE FORTESTING OF CHEMICALS Adopted: 12 May 1981.

Diario Oficial de las Comunidades Europeas; Toxicidad Drmica Subcrnica:ensayo de 90 das en roedores.

Manuel Repetto Jimnez, Guillermo Repetto Kuhn. TOXICOLOGA

FUNDAMENTAL; Instituto Nacional de Toxicologa; Universidad de Sevilla.Cuarta edicin.