e. coli
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AISLAMIENTO DE E. COLI Y PLÁSMIDOS CON RESISTENCIA ADIVERSOS ANTIBIÓTICOS
OBJETIVOS. Preparar medio nutritivo para el crecimiento de bacterias y agar mac-conkey.
Aislar, identificar y verificar si hay resistencia a la ampicilina y otros antibióticos
por el microorganismo de interés.
FUNDAMENTO TEORICO.La adición de determinadas sustancias al medio de cultivo que permite el aislamiento de
bacterias que han sufrido transformaciones genéticas. En algunos casos, por ejemplo, se
utiliza cristal violeta, sales biliares, acida sódica, telurito potasio, antibióticos, etc., en la
concentración adecuada, actúan como agentes selectivos frente a determinados
microorganismos.
La Escherichia coli (pronunciado /eske'rikia 'koli/), también conocida por la abreviación de
su nombre, E. coli, es quizás el organismo procariota más estudiado por el ser humano.
Se trata de una enterobacteria que se encuentra generalmente en los intestinos
animales, y por ende en las aguas negras, pero se lo puede encontrar en todos lados,
dado que es un organismo ubicuo. Fue descrita por primera vez en 1885 por Theodore
von Escherich, bacteriólogo alemán, quien la denominó Bacterium coli. Posteriormente la
taxonomía le adjudicó el nombre de Escherichia coli, en honor a su descubridor.
Los plásmidos son moléculas de ADN extracromosómico circular o lineal que se replican
y transcriben independientes del ADN cromosómico. Están presentes normalmente en
bacterias, y en algunas ocasiones en organismos eucariotas como las levaduras. Su
tamaño varía desde 3 a 10 kb. El número de plásmidos puede variar, dependiendo de su
tipo, desde una sola copia hasta algunos cientos por célula. Los vectores plasmídicos
permiten clonar ligandos de DNA exógeno de hasta 4 kb ya que un tamaño mayor a éste
dificulta la clonación en estos vectores. El término plásmido fue presentado por primera
vez por el biólogo molecular norteamericano Joshua Lederberg en 1952.1
Las moléculas de ADN plasmídico, adoptan una conformación tipo doble hélice al igual
que el ADN de los cromosomas, aunque, por definición, se encuentran fuera de los
mismos. Se han encontrado plásmidos en casi todas las bacterias. A diferencia del ADN
cromosomal, los plásmidos no tienen proteínas asociadas.
En general, no contienen información esencial, sino que confieren ventajas al
hospedador en condiciones de crecimiento determinadas. El ejemplo más común es el
de los plásmidos que contienen genes de resistencia a un determinado antibiótico, de
manera que el plásmido únicamente supondrá una ventaja en presencia de ese
antibiótico.
Hay algunos plásmidos integrativos, es decir, que tienen la capacidad de insertarse en el
cromosoma bacteriano. Estos rompen momentáneamente el cromosoma y se sitúan en
su interior, con lo cual, automáticamente la maquinaria celular también reproduce el
plásmido. Cuando ese plásmido se ha insertado se les da el nombre de episoma.
Los plásmidos se utilizan como vectores de clonación en ingeniería genética por su
capacidad de reproducirse de manera independiente del ADN cromosomal así como
también porque es relativamente fácil manipularlos e insertar nuevas secuencias
genéticas.
Los plásmidos usados en Ingeniería Genética suelen contener uno o dos genes que les
confieren resistencia a antibióticos y permiten seleccionar clones recombinantes. Hay
otros métodos de selección además de la resistencia a antibióticos, como los basados en
fluorescencia o en proteínas que destruyen las células sin uso de antibióticos. Estos
nuevos métodos de selección de plásmidos son de uso frecuente en agrobiotecnología,
debido a la fuerte crítica de grupos ecologistas contra la posibilidad de presencia de
antibióticos en los organismos modificados genéticamente.
Resistencia a los antibióticos
Los plásmidos a menudo contienen genes o paquetes de genes que les confieren una
ventaja selectiva, lo que les da la habilidad de hacer a la bacteria resistente a los
antibióticos.
Cada plásmido contiene al menos una secuencia de ADN que sirve como un origen de
replicación u ORI (un punto inicial para la replicación del ADN), lo cual habilita al ADN
para ser duplicado independientemente del ADN cromosomal. Los plásmidos de la
mayoría de las bacterias son circulares, pero también se conocen algunos lineales, los
cuales reensamblan superficialmente los cromosomas de la mayoría de eucariotas.
TiposUna forma de agrupar plásmidos es por su habilidad de transferirse a otra bacteria. Los
plásmidos conjugativos contienen “tra-genes”, los cuales ejecutan complejos procesos de
conjugación, como la transferencia sexual de plásmidos a otra bacteria. Los plásmidos
no-conjugativos, son incapaces de iniciar una conjugación, de allí que ellos pueden
transferirse únicamente con la asistencia de los plásmidos conjugativos y lo hacen “por
accidente”. Una clase intermedia de plásmidos son los “movilizables” los cuales llevan
solo un subtipo de genes requeridos para la transferencia. Ellos pueden “parasitar” un
plásmido conjugativo, transfiriéndose a una alta frecuencia solo en su presencia.
Es posible para plásmidos de diferentes tipos el coexistir en una celular simple.
Siete tipos diferentes de plásmidos han sido encontrados en la E.Coli. Pero normalmente
plásmidos relacionados son incompatibles, en el sentido de que solo uno de ellos
sobrevive en la línea celular, debido a la regulación de las funciones vitales de los
plásmidos. Por lo tanto, los plásmidos pueden ser diferenciados de acuerdo a grupos de
compatibilidad.
Otra forma de clasificar plásmidos es por función. Hay 5 clases principales: Plásmidos de fertilidad: los cuales contienen tra-genes, son capaces de
conjugarse.
Plásmidos de resistencia: los cuales contienen genes que pueden constituir
resistencia contra antibióticos o venenos. Históricamente conocidos como
Factores R, antes de que se entendiera la naturaleza de los plásmidos.
Col-plásmidos: los cuales contienen genes que codifican (determinan la
producción de) colinas y proteínas que pueden matar a otra bacteria.
Plásmidos degradativos: los cuales habilitan la digestión de sustancias
inusuales como tolueno o ácido salicílico.
Plásmidos virulentos: los cuales convierten la bacteria en un patógeno.
Los plásmidos pueden pertenecer a más de uno de estos grupos funcionales.
Los plásmidos solo pueden coexistir como una o más copias en cada bacteria, debido a
la división celular pueden perderse en una de las bacterias segregadas.
Algunos plásmidos incluyen un sistema de adición o “Sistema de Muerte
Postsegregacional” (PSK: Postsegregational Killing System). Ellos producen en conjunto
un veneno de larga vida y un antídoto de vida corta. Las células hija que retienen una
copia del plásmido sobreviven, mientras que una célula hija que falla al integrar el
plásmido muere o sufre una reducida tasa de crecimiento debido al veneno que obtuvo
de la célula padre. Este es un ejemplo de plásmidos como el ADN replicante.
Extracción del ADN plasmídico
En el maxiprep se cultivan volúmenes mucho más grandes de bacterias en suspensión.
Esencialmente, este es un escalado de la preparación mini-prep, el cual es seguido por
una purificación adicional. Esto resulta en una cantidad relativamente grande (0,5 -1 mg)
de ADN plásmido muy puro.
En los últimos tiempos muchos kits comerciales han sido creados para realizar la
extracción plasmídica a varias escalas, purezas y niveles de automatización.
Las bacterias resistentes en la población humana
Como hemos mencionado anteriormente las resistencias bacterianas han sido
identificadas desde hace mucho tiempo, aunque quizás no tan bien la magnitud de su
impacto en salud pública y salud animal. Si bien no hay demasiados datos en lo que
hace a resistencias en bacterias que afectan seres humanos, la mayor información
proviene, en forma bastante lógica, del campo hospitalario.
Un listado de las bacterias resistentes de mayor trascendencia en infecciones hospitalarias, debería incluir a:
Estafilococos meticilino-resistentes
Enterobacter cloacae
Enterococos
Pseudomonas aeruginosa
Por su parte, en la población urbana o rural, las infecciones por microorganismos resistentes serían causadas por:
Streptococcus pneumoniae
Streptococcus pyogenes
Escherichia coli
Mycobacterium tuberculosis
Neisseria gonorrheae
Salmonella
Campylobacter
Clases de medios de cultivo Medios generales. En éstos se desarrollan una gran variedad de
microorganismos.
Medios de enriquecimiento. Favorece el crecimiento de un determinado
microorganismo, sin llegar a inhibir totalmente el crecimiento del resto celular.
Medios selectivos. Permiten el desarrollo de un microorganismo determinado,
inhibiendo el desarrollo de otros.
Medios diferenciales. Son aquellos en los que se ponen de relieve propiedades
de un microorganismo determinado
MATERIALES. Tubos de ensayo.
Aza.
Discos de antibiótico.
Estufas de cultivo.
Mechero.
Preparaciones a cantidades necesarias de: Agar mac-conkey.
Agar nutritivo.
Medio de nutritivo liquido: Extracto de levadura 5 g.
Triptona y peptona 10g.
Cloruro de sodio 10g.
Agua destilada csp. 1000ml.
PROCEDIMIENTOPara esta práctica traer una muestra que contenga escherichia coli específica y
exclusivamente, ya que no nos interesa saber ni investigar e. coli en muestras x.
Colocar al frente nuestro el mechero y la muestra que contiene los
microorganismos, así como es resto del material.
Flamear el filamento del aza, hasta que alcance el rojo incandescente.
Realizar todas las operaciones en la proximidad de la llama, introduzca el aza de
la siembra a la muestra. Trasfiera el inoculo al medio de cultivo solido (medio
mac-conkey ) y siembra de zigzag sobre la superficie.
Inocular a 37º c por 24 horas o el tiempo necesario para que se desarrollen las
bacterias.
Aislamiento de identificación. Después del desarrollo bacteriano en la caja Petri, transfiera una colonia con el
asa, siembre por agotamiento por estrías en agar nutritivo preparado la anterior
clase práctica.
Colocar los discos de antibiótico que se les proveerán, equidistantes entre sí.
Incubar a 24-48 h horas a 37ºc.
Analizar e interpretar los resultados, como un antibiograma cualquiera.
ESQUEMAMartesDesinfectamos el área de trabajo
Preparar nuestros materiales
Realizar la siembra: introducir el aza de la siembra a la muestra
Identificar la muestra
MiércolesColocar los discos de antibiótico
Observados el desarrollo de e.coli
JuevesRealizados las diferentes lecturas de los 3 grupos
RESULTADO
Sea identificado presencia de e. coli lo cual cambia de color, con un olor fétido y de
presencia característico.
Se ha observado que hay más sensibilidad en los antibióticos más comúnmente
conocidos.
ANTIBIÓTICOS 1 GRUPO 2 GRUPO 3 GRUPO
CROCIPNalAMCERY
sensible
sensible
resistentesensible
resistente
sensible
sensible
resistentesensible
sensible
resistenteresistentesensible
CONCLUSION.Se ha realizado las respetivas siembras en el agar mac-conkey y agar nutritivo en el cual
observamos el desarrollo bacteriano en la caja Petri después Colocamos los discos de
antibiótico en el medio de cultivo y se observa mayor sensibilidad en los antibióticos
usados mas comúnmente.
CUESTIONARIO.1.- ¿Qué componentes tiene el medio de cultivo mac-conkey?
Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones
Peptona 17.0Suspender 50 g del polvo por litro de
agua destilada. Reposar 5 minutos y
mezclar hasta uniformar. Calentar
suavemente y hervir 1 a 2 minutos
hasta disolver. Esterilizar en
autoclave a 121°C durante 15
minutos.
Pluripeptona 3.0
Lactosa 10.0
Mezcla de sales biliares 1.5
Cloruro de sodio 5.0
Agar 13.5
Rojo neutro 0.03
Cristal violeta 0.001
pH final: 7.1 ± 0.2
2.- ¿Qué diferencia hay entre el medio nutritivo líquido y el sódico?
- Medios líquidos: Son los que se presentan en este estado, denominándose por esta
razón caldos. El medio líquido más utilizado es el llamado caldo nutritivo, compuesto
principalmente de extracto de carne, peptona y agua. Se utiliza fundamentalmente
cuando se pretende la obtención de una suspensión bacteriana de una determinada
concentración.
- Medios sólidos: Se preparan a partir de los medios líquidos, agregándoles un agente
gelificante. Los más utilizados son la gelatina y el agar. Gelatina: Es una proteína animal
obtenida de los huesos. Tiene el inconveniente de que es hidrolizada por muchas
bacterias, y además su uso está muy limitado porque su punto de fusión es bajo (licúa a
temperatura ambiente) razón por la que no puede utilizarse para cultivos a 37ºC, que es
la tempera óptima de crecimiento para muchos microorganismos.
3.- ¿para que se utiliza el medio nutritivo, y que contiene?El agar nutritivo es un medio de cultivo usado normalmente como rutina para todo tipo de
bacteria. Es muy útil porque permanece sólido incluso a relativas altas temperaturas.
Además, el crecimiento bacteriano en este agar lo hace en la superficie, por lo que se
distinguen mejor las colonias pequeñas.
En un caldo de nutrientes, la bacteria crece en el líquido, y aparece como una sustancia
espesa, con colonias difícilmente observables. El agar nutritivo contiene normalmente
(p/v):1
0,5 % de peptona;
0,3 % de extracto de carne/extracto de levadura;
1,5 % de agar;
0,5 % de cloruro de sodio;
agua destilada;
pH casi neutro (6,8) a 25 °C.
El caldo nutritivo se hace exactamente igual, excepto por la omisión del agar.
4.- ¿Qué microorganismos se usan comúnmente en el estudio de laboratorio de biotecnología?
Levaduras
Mohos
bacterias
5.- ¿Cuáles son las ventajas de usar microorganismos en las técnicas biotecnológicas?Ventajas
Ofrece los medios para producir alimentos de mejor calidad, en forma más eficiente y
segura para la salud y el medio ambiente.
Desde el punto de vista productivo, el uso de estas nuevas tecnologías.
permite aumentar la competitividad de países agroexportadores como la Argentina.
aumentando los rendimientos, disminuyendo los costos y aumentando la seguridad
de la cosecha.
generar innovaciones y mejoras en los alimentos conduciendo a prácticas agrícolas
más ecológicas, contribuyendo a una agricultura sustentable, que utiliza con respeto
los recursos del medio ambiente y sin hipotecar generaciones futuras.
6.- ¿Qué particularidades tiene la e. coli para ser usada en biotecnología?
Mayor velocidad específica de crecimiento que las levaduras y células de mamíferos; fácil
manipulación genética, no posee requerimientos costosos asociados a medios de cultivo o
equipamiento a diferencia de las células de organismos superiores; existencia de gran variedad
de vectores de expresión estables, y ser un microorganismo aprobado por las entidades
reguladoras para su utilización como hospedero en la producción de biofármaco.
7.- ¿Qué son los plasmodios y donde se encuentran?Un plasmodio es una célula multinucleada formada por fusión de varias (al contrario que
el sincitio, que es también multinucleado, pero en ese caso por división celular sin citocinesis,
solo cariocinesis). Estos agregados tienen forma de masa gelatinosa, y suelen producirse en
alguna etapa del ciclo vital de algunos protistas.
Se encuentran en ambientes húmedos deslizándose muy lentamente por el suelo en busca
de las partículas de alimento.
8.- ¿Qué otro microorganismo está siendo usado en reemplazo de e. coli, qué ventajas tiene?Salmonella cholerausis
9.- ¿Qué otros medios podemos emplear en el laboratorio en lugar de mac-comkey?Agarnsalmonella- shiguella
10.-¿qué medio se utiliza generalmente en la clínica para realizar los antibiogramas?Método de difusión en agar.
BIBLIOGRAFIA.
https://biotaetscientia.wordpress.com/tag/medio-de-cultivo/
https://www.google.com.bo/search?q=ventajas+de+usar+microorganismos+en+las+t %C3%A9cnicas+biotecnol%C3%B3gicas&oq=ventajas+de+usar+microorganismos+en+las+t%C3%A9cnicas+biotecnol%C3%B3gicas&aqs=chrome..69i57.374j0j8&sourceid=chrome&es_sm=93&ie=UTF-8#q=Qu%C3%A9+otro+microorganismo+est%C3%A1+siendo+usado+en+reemplazo+de+e.+coli
http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/SeminarioAntibioticos.htm