EFECTO COOPERADOR DE E6E7HPV16 Y LA AUSENCIA DE RXRa …
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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
ESCUELA NACIONAL DE MEDICINA Y HOMEOPATÍA
PROGRAMA INSTITUCIONAL DE BIOMEDICINA MOLECULAR
SECCIÓN DE ESTUDIOS DE POSGRADO E INVESTIGACIÓN
EFECTO COOPERADOR DE E6E7HPV16 Y LA AUSENCIA DE RXRa EN LA
CARCINOGÉNESIS CERVICAL EN RATONES TRIPLE TRANSGÉNICOS
T E S I S
PARA OBTENER EL GRADO DE
DOCTOR EN CIENCIAS EN BIOMEDICINA MOLECULAR
PRESENTA: Maestro en Ciencias
OCÁDIZ DELGADO RODOLFO BENJAMÍN
DIRECTORES DE TESIS
DR. PATRICIO GARIGLIO DR. DAVID GUILLERMO PEREZ-ISHIWARA
MÉXICO, D.F. 2012
Ocádiz-Delgado Rodolfo B. Tesis Dr. en C. 2012
ÍNDICE
ÍNDICE …………………………………………………………………………….. i
Dedicatoria ................................................................................ v
Agradecimientos …………………………………………………………………………….. vi
Lista de Figuras …………………………………………………………………..........… x
Lista de Tablas …………………………………………………………………………..… xi
Abreviaturas ………………………………………………………………………..…… xii
Resumen …………………………………………………………………………….. xiv
Abstract …………………………………………………………………………….. xv
1 INTRODUCCIÓN ……………………………........................................... 1
1.1 Funciones de las oncoproteínas E6 y E7 del HPV ….………………………….… 3
1.2 La oncoproteína E6 …………………………………..……….………………….……. 3
1.2.1 Inactivación y degradación de p53 a través
del complejo E6/E6AP ……………………..…………………………….….. 3
1.2.2 Inducción de hTERT mediada por E6 ……….……………………….….. 4
1.2.3 Las proteínas PDZ son degradadas por E6 ..…………………………… 5
1.3 La función de la oncoproteína E7 ………………………………………………….. 5
1.3.1 Inactivación de pRb ………………………………………………….. 5
1.3.2 Oncogenes, anti-oncogenes, marcadores tumorales
y Cáncer Cervicouterino ………………..………………………………... 6
1.4 Ratones transgénicos para los
oncogenes E6 y E7 del HPV16:
bK6-E6/E7 [E6E7 (tg/0)] ……..................………………………...… 10
1.5 Receptores a retinoides ..................................................... 11
1.6 Cáncer Cervical y Receptores a Retinoides ……………………………….……….. 15
1.6.1 Receptores a Retinoides y cáncer …………………………………….….. 17
1.7 Apoptosis y Cáncer ………………………………………..………… 20
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2 ANTECEDENTES ………………………………………………….. 24
2.1 El modelo murino triple transgénico condicional para
RXRα / transgénico para E6/E7
[RXRα (Cvx L-/L-)/E6E7 (tg/0); Tam-RTT] ……..……………………………… 24
3 JUSTIFICACIÓN …………………………..……………………… 27
4 HIPÓTESIS ……..…………………………………………... 28
5 OBJETIVOS
5.1 Objetivo General …………………………………………..……… 29
5.2 Objetivos Específicos …………………………………..……………… 29
6 ESTRATEGIA EXPERIMENTAL ………………..……………….………….……. 30
7 MATERIALES Y MÉTODOS ………………………..………………………… 31
7.1 Generación de ratones RXRα condicionales
(RXRα L2/L2) tratados con Tamoxifén
[(Cvx L-/L-)], Ratones Triple Transgénicos
[RTT; RXRα (Cvx L2/L2)/E6E7 (tg/0)]
y Ratones Triple Transgénicos tratados
con Tamoxifén [Tam-RTT: RXRα (Cvx L-/L-)/E6E7 (tg/0)] ................. 31
7.2. Genotipificación de los alelos RXRα ………………………………..……………….. 32
7.3. Genotipificación de los alelos E6E7 ………………………………..................... 33
7.4. Muestras de tejido cervical ………………………………………………….. 34
7.5. Análisis histopatológico ………………………………………………….. 34
7.6. Inmunohistoquímica ………………………………………………….. 35
7.7. Determinación de los niveles de
apoptosis mediante TUNEL ………………………………………………….. 36
7.8. PCR in situ ..................................................... 37
7.9. RT-PCR in situ ..................................................... 38
7.10. Detección in situ de los productos de
amplificación ………………………………………………….. 40
7.11. Captura digital de imágenes, análisis y
cuantificación de la señal ………………………………………………….. 40 ii
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7.12. Aislamiento y purificación de
RNA total ………………………………………………….. 41
7.13. Síntesis de cDNA para el análisis
cuantitativo por RT-PCR en Tiempo Real
(RTqPCR) ………………………………………………….. 41
7.14. Cuantificación relativa del mRNA
mediante RTqPCR ………………………………………………….. 41
8 RESULTADOS
8.1. Eliminación específica del receptor RXRα
en epitelio cervical de ratones triple transgénicos
RXRα (Cvx L-/L)/E6E7 (tg/0) tratados con
Tamoxifén (Tam-RTT) ………………………………………………….. 43
8.2. El transgén E6E7 en el cérvix de ratones
transgénicos E6E7 (tg/0) y ratones
Tam-RTT ………………………………………………….. 46
8.3. Detección de la oncoproteína E6 del HPV-16 y
de la expresión de p16NK4A en tejido cervical
de ratones E6E7 (tg/0) y Tam-RTT ………………………………………… 46
8.4. Cambios histológicos en cérvix de ratones
transgénicos E6E7 (tg/0) y
RTT-Tam ………………………………………………….. 48
8.5. Incremento de los niveles de proliferación
celular e inhibición de la apoptosis en
ratones -RTT …………………………….……………………. 51
8.6. Determinación de los niveles de expresión
de los genes c-myc, Bax, Bcl-2 y p21WAF1
en ratones transgénicos E6E7
(tg/0) y RTT-Tam ………………………………………………….. 54
9 DISCUSIÓN ………………………………………………….. 56
iii
Ocádiz-Delgado Rodolfo B. Tesis Dr. en C. 2012
9.1. La deleción del receptor RXRα incrementa
los niveles de apoptosis en el cérvix de
ratones condicionales RXRα
(Cvx L-/L-) ……..……………………………………………. 57
9.2. La expresión de las oncoproteínas E6 y E7
del HPV-16 disminuyen los niveles de
apoptosis en cérvix de ratones transgénicos
E6E7 (tg/0) y RTT-Tam …………………………………................... 57
9.3. Los niveles de proliferación celular están
incrementados en el epitelio cervical de
los ratones triple transgénicos
RTT-Tam ……………………………………………………. 60
9.4. El biomarcador tumoral p16INK4A está
incrementado en ratones condicionales
RXRα (Cvx L-/L-) y
ratones RTT-Tam …..……………………………………………….. 60
9.5. Modificación de los niveles de expresión de
un grupo de genes asociados con
carcinogénesis cervical …….……………………………………………… 61
9.6 Posible mecanismo molecular de la
carcinogénesis cervical en ratones
triple transgénicos RXRα (Cvx L2/L2)
/E6E7 (tg/0) ……………………………………………………. 63
9.7 Consideraciones finales ……………………………………………………. 66
10 CONCLUSIONES ………………….………………………………… 67
11 PERSPECTIVAS ………………….………………………………… 68
12 BIBLIOGRAFÍA ………………….………………………………… 69
13 PRODUCCIÓN RELACIONADA CON ESTE TRABAJO ……………………….79 iv
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DEDICATORIA
El esfuerzo que representa este trabajo lo dedico con
humildad a quien todo lo debo:
DIOS
Él guía mis pasos.
A quienes han dado ánimo y motivo a mi vida:
Mi Esposa (Mi Gabox, Mi Esposita) y a
Mi Hija (Mi Melissa, Mi Princesa).
A mis Padres, a quienes debo la vida.
A las personas que han perdido la vida por causa del cáncer.
A las pacientes que padecen esta enfermedad y
que sin embargo no he podido todavía ayudar directamente.
Salmos
121:1 Alzaré mis ojos a los montes; ¿De dónde vendrá mi socorro? 121:2 Mi socorro viene de Jehová, Que hizo los cielos y la tierra.
124:8 Nuestro socorro está en el nombre de Jehová, Que hizo el cielo y la tierra.
v
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Agradecimientos
Al Creador, A quien todo lo debo,
DIOS
Quien en su infinito Amor, nos permite aprender
tan sólo un poco de su Eterna Sabiduría
GRACIAS DIOS!, GRACIAS PADRE!
Cada día te bendeciré, Y alabaré tu nombre eternamente y
para siempre.
Salmos 145:2
vi
Ocádiz-Delgado Rodolfo B. Tesis Dr. en C. 2012
AGRADECIMIENTOS
A la QFB Gabriela González Rodríguez,
Mi Esposa,
Mi Pequitas
Con todo mi Amor, Cariño, Respeto, Admiración y Alegría
Gracias por tu infinita paciencia y sobretodo por Tu Amor,
Sin tu apoyo no hubiese llegado hasta este día
Siempre estaré agradecido por todo lo bueno que
has traído a mi vida
GRACIAS
TE AMO
Agradezco a la personita increíble y bella que me ha hecho
mejorar día con día:
Mi Hija: Melissa Ocádiz González
Gracias por tus sonrisas, gracias por tus miradas tiernas,
por Tu Amor
Tú eres una razón más para superarme
GRACIAS
TE AMO
Dios las Bendiga Siempre
vii
Ocádiz-Delgado Rodolfo B. Tesis Dr. en C. 2012
AGRADECIMIENTOS
A la Enfermera Blanca Delgado Díaz, Mi Madre, que aunque ya no está
conmigo, sé que está orgullosa y feliz. Gracias “Jechu”!!!!
Al Dr. Benjamín Ocádiz López, mi Padre, por sus enseñanzas y apoyo.
Gracias “Apá”!!!
Agradezco al Dr. Patricio Gariglio por sus constantes enseñanzas durante
más de 25 años realizando investigación en Oncología Molecular.
Agradezco al Dr. Guillermo Pérez Ishiwara por su apoyo, paciencia y
constantes consejos.
Agradezco especialmente a mis asesores: Dra. Consuelo Gómez García,
Dra. Laurence Marchat y Dra. Esther Ramírez Moreno.
Agradezco muy especialmente a la Dra. Luz Ma. Barajas por su constante
apoyo.
Agradezco al PiBioM-IPN, al CINVESTAV-IPN, al CONACyT, al ICGEB
(Trieste, Italia) y al IGBMC (Estrasburgo, Francia) por las facilidades y apoyo
para realizar este trabajo.
Al Dr. Guillermo Alfaro Martínez (1942-2008), por ser uno de mis mejores
maestros y amigos. Gracias Memo!!!.
Al Dr. Eduardo Castañeda Saucedo por su apoyo y amistad. Y obviamente
por haber obtenido los ratones triple transgénicos (tema principal de esta
Tesis!!, gracias Lalo!!).
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Ocádiz-Delgado Rodolfo B. Tesis Dr. en C. 2012
AGRADECIMIENTOS
A los Drs. Pierre Chambon y Daniel Metzger (IGBMC, Estrasburgo, Francia)
por diseñar los ratones condicionales RXRα.
Especialmente al Dr. Rogelio Hernádez-Pando (Depto. de Patología del
INCMNSZ, INNSZ) por su amistad y por toda la asesoría para el análisis
histológico de los tejidos.
Al Dr. Luis Covarrubias (IBT-UNAM) por los ratones transgénicos bK6-E6/E7.
A mis compañeros del CINVESTAV del Departamento de Genética y Biología
Molecular y del PiBioM-IPN.
Agradezco a mi gran amigo Wilox R. por la escritura, transcripción y revisión
de este trabajo. Feliz 33 Aniversario Ratón!!
En general, agradezco a todas y cada una de las personas que de algún modo contribuyeron a la realización de este trabajo.
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Ocádiz-Delgado Rodolfo B. Tesis Dr. en C. 2012
Lista de Figuras Figura 1. Inducción de la transformación celular por la infección persistente por el HPV. La Figura muestra el proceso de transformación celular desde la infección por el HPV a través de una lesión hasta el desarrollo de carcinoma invasor. Figura 2. Efecto de la expresión de los oncogenes E6 y E7 sobre procesos celulares. Figura 3. El producto del gen C-Myc actúa como regulador transcripcional de muchos genes que participan en el progreso del ciclo celular, apoptosis y transformación celular. Figura 4. La proteína p21WAF1 participa en diferentes eventos celulares como son la reparación y replicación del DNA en la fase S del ciclo celular y en la inhibición de la apoptosis. Figura 5. Expresión de p21WAF1 durante la carcinogénesis cervical. Figura 6. Características fenotípicas e histológicas de los ratones transgénicos bK6-E6/E7 [E6E7 (tg/0)]. Figura 7. Los retinoides y sus receptores (RXR, RAR) controlan diferentes eventos celulares. Figura 8. Regulación de la transcripción génica mediada por receptores nucleares. En el esquema se muestra la activación de receptores nucleares que funcionan como heterodímeros con RXR. Figura 9. La deficiencia de Vitamina A induce el desarrollo de metaplasia epidermoide. Figura 10. Alteraciones histológicas de tejido cervical de ratones condicionales después de la deleción selectiva del gen RXRα. Figura 11. La apoptosis puede ser inducida principalmente mediante dos vías de señalización celular: la vía extrínseca y la vía intrínseca. Figura 12. Participación de Bcl-2 y Bax en la vía intrínseca de la apoptosis. Figura 13. Los ratones Triple Transgénicos tratados con Tamoxifén presentan elevados niveles de proliferación celular (determinado mediante la detección del marcador PCNA). Figura 14. Imágenes representativas de ratones triple transgénicos sin tratar con Tamoxifén (RTT) y ratones triple transgénicos tratados con Tamoxifén (Tam-RTT) [RXRα (Cvx L-/L-)/E6E7 (tg/0)]. Figure 15. Controles positivos (tratamiento con DNasa) y negativos (sin incubación con TdT) para el ensayo de TUNEL. Figura 16. Tipificación molecular de la recombinación de los alelos “floxed” para RXRα (L-) después del tratamiento con Tamoxifén (Tam) y de la presencia del transgén E6E7 en cepas de ratones incluidas en este trabajo. Figura 17. Deleción tejido específica del gen RXRα y expresión eficiente de los oncogenes E6 y E7 en cérvix de ratones triple transgénicos tratados con Tamoxifén (Tam-RTT) mediante PCR in situ (Panel PCR) y RT-PCR in situ (RT-PCR). Figura 18. Detección de las proteínas E6 y p16INK4A. Los niveles de expresión de estas proteínas están incrementados en el cérvix de ratones Tam-RTT. Figura 19. Alteraciones histológicas y de proliferación celular en tejido cervical después de la deleción del gen RXRα y la expresión de las oncoproteínas virales E6 y E7. Figura 20. Incremento de los niveles de proliferación celular en ratones Tam-RTT. Se determinó el efecto de la deleción de RXRα y la presencia de E6 y E7 sobre los niveles de proliferación en los tejidos cervicales de las diferentes cepas de ratón. Figura 21. Los niveles de apoptosis en el cérvix de ratones mutantes RXRα se reducen importantemente debido a la expresión de las oncoproteínas E6 y E7.
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Figura 22. Expresión relativa (RTqPCR) de genes involucrados en los procesos de proliferación celular y apoptosis en cérvix murino. Figura 23. Modelo teórico que describe la posible cooperación entre la expresión de los oncogenes E6 y E7 del HPV y la deleción del receptor RXRα, alterando el control del crecimiento celular, la proliferación celular y la apoptosis en el cérvix de Ratones Triple Transgénicos. Figura 24. Modelo simplificado de la participación de los oncogenes E6 y E7 del HPV y la deleción del receptor RXRα en la carcinogénesis cervical en Ratones Triple Transgénicos.
Lista de Tablas
Tabla 1. Secuencias de oligonucleótidos y condiciones de
amplificación utilizados en los ensayos de RT-PCR
in situ y RT-PCR cuantitativa en tiempo real ………………………………. 39
Tabla 2. Análisis histológico de tejido cervical …………………………...... 50
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Ocádiz-Delgado Rodolfo B. Tesis Dr. en C. 2012
Abreviaturas
AR Receptores a Andrógenos
atRA “all trans Retinoic Acid”
bK6 Promotor bovino de citoqueratina 6
CaCu Cáncer Cervicouterino
CIN Neoplasia Intraepitelial Cervical
DBD Dominio de Unión al DNA
DNA Ácido deoxirribonucleico
ER Receptores a Estrógenos
GR Receptores a Glucocorticoides
HPV Virus del Papiloma Humano; Papilomavirus Humano
HR-HPV Virus del Papiloma Humano de Alto Riesgo
HREs Elementos de Respuesta a Hormonas
IFNs Interferones
Kb Kilobases
LBD Dominio de Unión al Ligando
MHC Complejo Principal de Histocompatibilidad
mRNA Ácido ribonucleico mensajero
NRs Receptores Nucleares
pb Pares de bases
PCNA Antígeno Nuclear de Proliferación Celular
PCR Reacción en Cadena de la Polimerasa
PPARs Receptores activados por compuestos inductores de la
proliferación de peroxisomas
PRs Receptores a Progestinas
RA Ácido Retinoico
RAR Receptor(es) para el Ácido Retinoico
RAREs Elementos de Respuesta en el DNA
REs Elementos de Respuesta
RT-PCR Retrotranscripción-Reacción en Cadena de la Polimerasa
RAR Receptores para el Ácido Retinoico xii
Ocádiz-Delgado Rodolfo B. Tesis Dr. en C. 2012
RXR Receptor(es) X a Retinoides
Tam Tamoxifén
TRs Receptores a Hormonas Tiroideas
VDR Receptor para la Vitamina D
WHO Organización Mundial de la Salud
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Resumen
El Cáncer de cérvix es la segunda causa de las muertes por cáncer en las
mujeres a nivel mundial. Los papilomavirus de alto riesgo (HR-HPVs) juegan un
importante papel etiológico en el desarrollo del carcinoma del cuello uterino. Sin
embargo, existen factores importantes como es el estatus inmunológico del
huésped, que pueden determinar el desenlace de una infección genital con HR-
HPV. Normalmente, la infección es controlada y eliminada en la mayoría de las
lesiones precancerosas, sin progresar a carcinomas invasores. Los retinoides,
que llevan a cabo su acción a través de sus receptores (RARs, RXRs), juegan
un papel crucial en el desarrollo del cérvix así como en la homeostasis del
epitelio, regulando el crecimiento y la diferenciación de una amplia variedad de
tipos celulares; de hecho, estos receptores pueden inhibir la proliferación
celular así como también inducir la diferenciación celular o la muerte celular
programada (apoptosis). En este trabajo estudiamos un modelo murino que
desarrolla en forma espontánea lesiones cervicales malignas, las
características histopatológicas y la expresión de diversas moléculas del
huésped relacionadas con el proceso oncogénico. Este modelo presentó
características similares a lo reportado para los tumores obtenidos de muestras
clínicas como son: altos niveles de proliferación celular, bajos niveles de
apoptosis y cambios en los niveles de genes relacionados con estos procesos,
lo que condujo al desarrollo de carcinoma in situ y carcinoma invasor. Los
resultados obtenidos nos permiten sugerir que existe un efecto cooperador
entre la expresión de los oncogenes E6E7 del HPV16 y la ausencia del
receptor RXRα en el desarrollo de cáncer cervicouterino. Este modelo puede
ser útil no solo para el estudio de la carcinogénesis en el cuello uterino en
etapas múltiples sino para la evaluación de diversas estrategias
quimioterapéuticas para el tratamiento de esta neoplasia.
Palabras clave: E6E7; HPV; Receptor a Retinoides; Cáncer Cervicouterino;
Modelos murinos
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Abstract
Cervical cancer is the second leading cause of cancer deaths among women
worldwide. High-Risk-Human Papillomaviruses (HR-HPVs) play an important
etiologic role in the development of carcinoma of the uterine cervix. However,
host factors, mainly host immunological status, are important in determining
the outcome of genital HPV infection as most cervical precancerous lesions
containing HR-HPVs normally do not progress to invasive carcinomas. Retinoids,
acting through nuclear receptors (RARs, RXRs), play a crucial role in cervix
development and in homeostasis regulating growth and differentiation of a wide
variety of cell types; indeed, they can inhibit cell proliferation, and induce cell
differentiation or apoptotic cell death. Here we studied a mouse model that
develops spontaneously malignant cervical lesions, histopathological features
and the expression of selected molecules related with the oncogenic process.
This model showed similar characteristics to those reported for tumor clinical
samples: high cell proliferation levels, low apoptosis levels and changes in the
expression of genes related to both processes. These alterations induced the
development of in situ carcinoma and invasive carcinoma. These results
strongly suggest a cooperative effect between HPV16E6E7 expression and the
lack of RXRα in cervical cancer development. This model could be useful not
only to study multistep carcinogenesis of uterine cervix tissue and might
improve chemopreventive and chemotherapeutic strategies for this neoplasia,
but for the evaluation of several therapeutic strategies.
Keywords: E6E7; HPV; Retinoid receptor; Cervical Cancer; Murine models
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Ocádiz-Delgado Rodolfo B. Tesis Dr. en C. 2012
1 INTRODUCCIÓN
Los Virus del Papiloma Humano (HPVs por sus siglas en inglés: “Human
Papillomaviruses”) son pequeños virus de DNA que se encuentran estrechamente
asociados con el desarrollo de cánceres específicos [zur Hausen, 2006; zur Hausen, 2009;
Acevedo-Rocha et al., 2012] (Figura 1). Los HPVs de alto riesgo (siendo los más
frecuentes los tipos 16 y 18) se encuentran en más del 90% de los cánceres invasores
del cérvix, una de las enfermedades más comunes en la mujer. Los papilomavirus de alto
riesgo codifican dos oncoproteínas, E6 y E7, las cuales inactivan la función de las
proteínas supresoras de tumor p53 y retinoblastoma, respectivamente [Scheffner et al.,
1994] y se ha demostrado que inmortalizan células en cultivo. Sin embargo, en el epitelio
escamoso del cérvix humano, la mayoría de las lesiones que contienen HPVs de alto
riesgo no progresan hacia carcinomas in situ o invasores, implicando cofactores ya sea
ambientales (dieta baja en ácido retinoico [RA; del inglés “Retinoic Acid”], ingesta crónica
de estrógeno, alteración de los mecanismos epigenéticos de la regulación de la
expresión) o genéticos (oncogenes celulares o mutaciones en genes supresores de
tumor, mutaciones en receptores al ácido retinoico [RAR; del inglés “Retinoic Acid
Receptor”] o receptores a retinoides X [RXR; del inglés “Retinoid Receptor X”]) en
aquellos casos en donde ocurre una progresión maligna. [Castellsagué y Muñoz, 2003;
Muñoz et al., 2006; Gariglio et al., 2009; Huh, 2009; zur Hausen, 2009].
Entre los cofactores que han sido repetidamente asociados con neoplasias en las
que participa el HPV, tenemos el tabaquismo y la exposición a estrógeno
(www.cancer.gov; http://cancernet.uci.nih.gov/trialsrch.shtml). Parece ser que durante el
embarazo se crea un ambiente permisivo para una infección permanente con HPV;
también ha sido demostrado que el uso prolongado de anticonceptivos orales, la mayoría
de los cuales contienen estrógenos, duplica el riesgo de desarrollar una neoplasia
asociada al HPV (Figura 1). Por otro lado, hay varios reportes de ratones transgénicos
para los oncogenes E6 y E7 en los que se ha inducido la neoplasia [Song et al., 2000;
Eckert et al., 2000; Wolf, et al., 2003; Shai et al., 2010; Valencia et al., 2008; Jabbar et
al., 2009]. En uno de estos modelos se demostró que la exposición crónica a estrógeno
puede inducir carcinogénesis escamosa de cérvix y vagina, mientras que cuando se
Ocádiz-Delgado Rodolfo B. Tesis Dr. en C. 2012
2
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201
2].
Ocádiz-Delgado Rodolfo B. Tesis Dr. en C. 2012
3
emplearon concentraciones bajas de estrógeno en este sistema modelo, sólo se observó
carcinogénesis de células escamosas en la zona de transformación [Elson et al., 2000].
De gran interés ha sido la observación de que el tratamiento con RA de
queratinocitos humanos inmortalizados, reduce la transformación celular y los niveles de
mRNA y de proteína de los oncogenes E6 y E7 de HPV16 [Creek et al., 1994]. De
manera similar, células CaSki tratadas con ácido retinoico “all-trans” (atRA) presentaron
un nivel bajo de transcripción para E6 y E7, comparado con el control sin tratar. Aún más
importante, se reportó la ausencia de respuesta al RA en células cervicales inmortalizadas
después de que estas se volvieron tumorigénicas [Sarma et al., 1996].
1.1 Funciones de las oncoproteínas E6 y E7 del HPV
Las proteínas E6 y E7 son esenciales para inducir y mantener la transformación
celular debido a su capacidad de interferir con el control del ciclo celular y de la
apoptosis. Asimismo, la inestabilidad genómica tiene un papel central para la
transformación maligna, de hecho, se ha demostrado in vitro que las oncoproteínas E6 y
E7 pueden inducir rápidamente poliploidía poco después de haber sido introducidas en las
células [Narisawa-Saito et al., 2007]. Esto parece ser debido a la desregulación de Plk1
durante la pérdida de p53 mediada por E6 y el secuestro y destrucción de miembros de la
familia de pRb mediada por E7 [Incassati et al., 2006]. Incluso, la pérdida severa de los
miembros de la familia de pRb puede inducir amplificación del centrosoma y aneuploidía
(18 de narisawa). Además, como ya se ha mencionado anteriormente, E6 y E7 pueden
causar la desregulación tanto de genes celulares que controlan la fase de transición G2/M
del ciclo celular permitiendo la progresión a mitosis, como de genes con controlan la
homeostasis del centrosoma [Narisawa-Saito y Kiyono, 2007] (Figura 2).
1.2 La oncoproteína E6
1.2.1 Inactivación y degradación de p53 a través del complejo E6/E6AP
Es bien conocida la capacidad que tiene la proteína E6 para promover la
degradación de p53 a través de su interacción con una proteína celular denominada
E6AP, la cual es una ubiquitina ligasa [zur Hausen, 2006]. El gen supresor de tumores
p53 tiene la capacidad de regular el ciclo celular y la apoptosis en caso de existir daño al
DNA. Cuando este daño es moderado, se produce un arresto prolongado del ciclo celular
Ocádiz-Delgado Rodolfo B. Tesis Dr. en C. 2012
4
dependiente de p53 permitiendo la reparación del DNA, sin embargo, si el daño es
severo, se induce la apoptosis. En el caso de las células infectadas con HPV, la muerte
celular es inhibida por la inactivación de p53 mediada por E6. Además, E6 interfiere con
otras proteínas pro-apoptóticas como Bak, FADD y procaspasa 8 [Lagunas et al., 2010]
[Ganguly y Parihar, 2009] (Figura 2).
1.2.2 Inducción de hTERT mediada por E6
En la última década se han descrito diversas proteínas propuestas como blanco de
E6, las cuales podrían contribuir a la transformación celular [Ganguly y Parihar, 2009],
siendo la telomerasa un importante ejemplo. La telomerasa humana es un complejo
ribonucleoproteico compuesto por la transcriptasa catalítica reversa (hTERT; por sus
siglas en inglés: “human Telomerase Reverse Transcriptase”) y un componente de RNA
(hTR). hTERT es expresada normalmente en células germinales linaje-específico, células
madre precursoras en tejidos en reparación y en células cancerosas. La expresión de
Figura 2. Efecto de la expresión de los oncogenes E6 y E7 sobre procesos celulares [Modificado de Narisawa-Saito y Kiyono, 2007].
Ocádiz-Delgado Rodolfo B. Tesis Dr. en C. 2012
5
hTERT en células normales reconstituye la actividad de la telomerasa y suprime la
senescencia o envejecimiento [Narisawa et al., 2007]. Debido a que la actividad de la
telomerasa es mínima en la mayoría de los tejidos, los telómeros se acortan en cada
división celular, conduciendo eventualmente a la senescencia, debido a una síntesis
incompleta de la cadena de DNA. Se ha observado una alta actividad de la telomerasa en
más del 85% de células humanas cancerosas, indicando un papel clave de esta enzima
en la tumorigénesis [Pendido et al., 2006]. E6 tiene la capacidad de inducir la actividad
de la telomerasa y por lo tanto contribuir a la inmortalización de células epitelales
mediante el mantenimiento del largo de la longitud del telómero. Se ha demostrado
tambíén, que la interacción entre E6 y el oncogene Myc permite la activación del
promotor de hTERT [Veldman et al., 2003]. En forma adicional, se ha confirmado que
E6/E6AP degrada a NFX1-91, el cual es represor celular del promotor de hTERT
resultando en el incremento de su expresión [Gewin et al., 2004] (Figura 2).
1.2.3 Las proteínas PDZ son degradadas por E6
Se ha demostrado que la oncoproteína E6, mediante su motivo C-terminal, tiene la
capacidad de interactuar con proteínas que contienen el dominio denominado PDZ,
conduciendo a su degradación [Narisawa-Saito y Kiyono, 2007] (Figura 2). Esta
capacidad, la cual es distinta a la mostrada para la degradación de p53, es importante
para la transformación celular debido a que las proteínas PDZ están involucradas en
diversas funciones tales como señalización y adhesión celular.
1.3 La función de la oncoproteína E7
1.3.1 Inactivación de pRb
E7 es una pequeña fosfoproteína separada en tres regiones conservadas
denominadas CR1, CR2 y CR3 [Narisawa-Saito y Kiyono, 2007]. E7 tiene la capacidad de
unirse al producto del gene supresor de tumores de retinoblastoma (pRb) así como a los
miembros de la familia p107 y p130. En el estado hipofosforilado, las proteínas de la
familia pRb pueden unirse a factores de transcripción como los de la familia E2F y así
reprimir la transcripción de genes involucrados en la síntesis de DNA y progresión del
ciclo celular [Narisawa-Saito y Kiyono, 2007]. La fosforilación de pRb realizada por
cinasas dependientes de ciclina G1, permite la liberación de E2F conduciendo a la
Ocádiz-Delgado Rodolfo B. Tesis Dr. en C. 2012
6
progresión del ciclo celular hacia la fase S. Debido a que E7 se une a pRb no fosforilado,
puede inducir a las células a entrar a la fase S evitando la formación de complejos pRb-
E2F [Narisawa-Saito y Kiyono, 2007] (Figura 2). Recientemente se ha demostrado que E7
promueve la degradación proteosomal de pRb [Narisawa et al., 2007]. La inactivación de
pRb mediada por E7 puede inducir la expresión de un inhibidor de cinasas dependientes
de ciclina p16INK4A [Samarawardana et al., 2010]. Normalmente, la sobre-expresión de
p16INK4A resulta en el arresto del ciclo celular sin embargo, la expresión de E7 evita esta
función. Con base en esto, la sobre-expresión de p16INK4A se utiliza como un bio-
marcador útil para evaluar la actividad patogénica del HPV en lesiones cervicales
[Narisawa-Saito y Kiyono, 2007; Ganguly y Parihar, 2009; Samarawardana et al., 2010]
(Figura 2).
La proteína E7 también puede inactivar a otros miembros de la familia pRb. Por
ejemplo, E7 se asocia a desacetilasas de histonas (co-represores transcripcionales;
HDAC) permitiendo el crecimiento celular [Narisawa et al., 2007]. Asimismo, E7 tiene la
capacidad de interaccionar con p48 e IRF1 permitiendo la evasión de la respuesta inmune
[Ganguly y Parihar, 2009] (Figura 2). En resumen, la proteína E7 permite la replicación
del HPV en las capas superiores del epitelio en donde las células hijas normalmente
tendrían que diferenciarse y salir completamente del ciclo celular.
En conclusión, las oncoproteínas E6 y E7 del HPV son factores esenciales para la
inmortalización celular, transformación y carcinogénesis inducida por HPV (Figura 2)
[Ganguly y Parihar, 2009; Narisawa-Saito y Kiyono, 2007].
1.3.2 Oncogenes, anti-oncogenes, marcadores tumorales y Cáncer
Cervicouterino
A nivel molecular, se ha descrito la activación de oncogenes y/o la inhibición de la
función de genes supresores tanto en líneas celulares derivadas de Cáncer Cervicouterino
(CaCu) como en muestras de tumores obtenidos de pacientes con esta enfermedad
[Brychtová et al., 2004; Incassati et al., 2006; Gariglio et al., 2009]. Por ejemplo, las
alteraciones del oncogén C-Myc en muestras de CaCu fue descrita por primera vez en el
mundo en 1987 en donde se analizaron muestras de pacientes mexicanas [Ocadiz et al.,
1987]. El producto de este gen actúa como regulador transcripcional de muchos genes
que participan en el progreso del ciclo celular, apoptosis y transformación celular. Aunque
Ocádiz-Delgado Rodolfo B. Tesis Dr. en C. 2012
7
se ha reportado que los cambios en la expresión del producto de C-Myc son significativos
cuando se comparan lesiones displásicas de alto grado con lesiones de bajo grado, se ha
observado que los cambios en su expresión génica no son significativos cuando se
comparan muestras de tejido tumoral cervical con tejido normal, sin embargo, se ha visto
que su expresión es mayor en carcinomas cervicales escamosos en comparación con
adenocarcinomas [Ocadiz et al., 1987; Brychtová, 2004] (Figura 3).
Por otro lado, se ha identificado un marcador tumoral el cual funciona normalmente
como un antioncogén: p21 (WAF1 o CDKN1) [Gartel y Tyner, 2002]. Esta proteína inhibe
la actividad de las cinasas 2 y 4, regulando negativamente el ciclo celular en la fase G1;
TP53 regula fuertemente la expresión de este gen. La proteína p21WAF1 puede
interactuar con el antígeno nuclear de proliferación celular (PCNA), un factor accesorio de
la DNA polimerasa, induciendo así la reparación y replicación del DNA en la fase S del
Figura 3. El producto del gen C-Myc actúa como regulador transcripcional de muchos genes que participan en el progreso del ciclo celular, apoptosis y transformación celular.
Ocádiz-Delgado Rodolfo B. Tesis Dr. en C. 2012
8
ciclo celular. Esta proteína también interviene en la inhibición de la apoptosis (Figura 4).
Hace algunos años se sugirió a p21WAF1 como marcador pronóstico, ya que su expresión
era suprimida en adenocarcinomas cervicales en comparación con tejido glandular
cervical normal. Posteriormente, se observó de forma similar una tendencia en la
reducción de la expresión de p21WAF1 de epitelio normal hacia cáncer invasor.
Figura 4. La proteína p21WAF1 participa en diferentes eventos celulares como son la reparación y replicación del DNA en la fase S del ciclo celular y en la inhibición de la apoptosis.
Ocádiz-Delgado Rodolfo B. Tesis Dr. en C. 2012
9
Estos datos apoyan la idea de emplear a p21WAF1 como marcador tumoral de
pronóstico (Figura 5). En estudios de análisis global se ha reportado la expresión de este
gen a través de varias estrategias. En una de ellas, ya descrita para el gen p16INK4a y
BIRC5, se estudió el efecto de los genes E6 y E7 del HPV16 mediante la infección de
queratinocitos cervicales con un retrovirus. Cuando se infectaron éstos se encontró un
cambio significativo de 0.47 (valor de corte menor y mayor a 1.0, p<0.01) en la
expresión de p21WAF1. En otro análisis se identificó similarmente la supresión de la
expresión de p21WAF1 (-4.0 de un valor de corte de ±2.0) mediante la expresión de las
oncoproteínas E6 y E7 del HPV16 en cultivos primarios de queratinocitos infectados con
un retrovirus [Gartel y Tyner, 2002].
Figura 5. Expresión de p21WAF1 durante la carcinogénesis cervical.
Ocádiz-Delgado Rodolfo B. Tesis Dr. en C. 2012
10
1.4 Ratones transgénicos para los oncogenes E6 y E7 del HPV16: bK6-E6/E7
[E6E7 (tg/0)]
A finales de la década pasada, el grupo del Dr. Patricio Gariglio
(Departamento de Genética y Biología Molecular, CINVESTAV- IPN) en colaboración con
el grupo del Dr. Luis Covarrubias (Departamento de Genética y Fisiología Molecular, IBT-
UNAM), diseñaron un modelo murino en el cual la expresión de los oncogenes E6 y E7 del
HPV se encuentra bajo el control del promotor de la citoqueratina 6 de bovino (bK6 por
sus siglas en Inglés), esto lo lograron insertando la región completa del marco de lectura
abierta de los oncogenes E6/E7 del HPV16 en un vector que contenía el promotor bK6.
Recientemente, estos investigadores describieron anomalías en el ciclo del desarrollo del
pelo de estos ratones provocadas por la expresión de los genes E6/E7 [Escalante-Alcalde
et al., 2000]. De hecho, una de las características principales de estos ratones es la de
poseer un pelaje con una densidad baja así como también tienen la característica de
regenerarlo más rápidamente que los ratones silvestres. Esta regeneración se identificó
en los folículos pilosos los cuales muestran una fase de crecimiento más larga (anagena),
así como una regresión del bulbo (catagena) mientras que no se observó una fase de
arresto (telogena) [Escalante-Alcalde et al., 2000]. Estos ratones muestran una
capacidad de regeneración epitelial aumentada después de haber recibido una herida
[Valencia et al., 2008]. Por otro lado, estudios previos han demostrado que los ratones
hembra en cérvix expresan diferentes niveles de E6/E7 de acuerdo al ciclo estral,
detectándose los niveles más altos de expresión durante las fases proestro-estro [Ocádiz-
Delgado et al., comunicación personal]. Además, estos ratones muestran alteraciones
histopatológicas en el epitelio de la lengua como son: binucleación, núcleos irregulares,
hipercromatismo, alta frecuencia de halos perinucleares e infiltrados inflamatorios, todas
estas características coinciden con condiciones preneoplásicas [Ocádiz-Delgado et al.,
2009] (Figura 6).
A pesar de que este modelo fue desarrollado con el propósito de estudiar el
efecto de la expresión de los oncogenes virales E6 y E7 en células suprabasales del cérvix
murino, a la fecha no existe ningún reporte al respecto. Algunos estudios preliminares
sugieren que algunos de estos ratones presentan a nivel cervical, en forma espontánea,
principalmente displasia moderada y en pocos casos displasia severa [Ocádiz-Delgado,
comunicación persona] (Figura 6).
Ocádiz-Delgado Rodolfo B. Tesis Dr. en C. 2012
11
1.5 Receptores a retinoides
La Vitamina A (all-trans retinol) así como sus metabolitos activos, colectivamente
son llamados retinoides, regulan muchos eventos celulares durante el desarrollo de los
vertebrados y controlan aspectos importantes de la célula como la proliferación, la
diferenciación y la apoptosis [Tang y Gudas, 2011; Bastien y Rochette-Egly, 2004;
Gariglio et al., 2009] (Figura 7). Los receptores para el ácido retinoico (isoformas
múltiples: RARα, RARβ, RARγ) y los receptores X para retinoides (isoformas RXRα, RXRβ
fh
MB
bn
bn ii
A
B
C
D
Figura 6. Características fenotípicas e histológicas de los ratones transgénicos bK6-E6/E7 [E6E7 (tg/0)]. (A) Los ratones E6E7 (tg/0) presentan alopecia severa; (B) capacidad de regeneración incrementada; (C) en forma espontánea presentan hiperplasia folicular en lengua y (D) displasia moderada a severa en cérvix. Las flechas indican la señal positiva para el marcador de proliferación PCNA. Como se observa, existe proliferación celular prácticamente en todos los estratos del epitelio cervical (Escalante-Alcalde et al., 2000; Valencia et al., 2008; Ocadiz-Delgado, Comunicación Personal, 2008; Ocadiz-Delgado et al., 2009). Wt: RatónSilvestre; Tg: Ratón Transgénico; hp: halo perinuclear; hf: hiperplasia folicular; ii: infiltrado inflamatorio; bn: binucleación; MB. Membrana Basal.
Ocádiz-Delgado Rodolfo B. Tesis Dr. en C. 2012
12
y RXRγ), constituyen dos tipos de factores de transcripción, los cuales intervienen en la
mayoría de las acciones del ácido retinoico biológicamente activo all-trans (RA) y sus
metabolitos específicos [Gudas, 2011]. La diferenciación inducida por los Retinoides es
una respuesta celular crucial para la protección contra el desarrollo de cáncer. Sin
embargo, la investigación de este proceso ha estado limitada a ensayos en células en
cultivo [Abu et al., 2005; Germain et al., 2006; Mongan et al., 2007; Soprano et al.,
2007] o a algunos modelos murinos que han permitido la manipulación condicional de la
deleción del receptor a retinoides RXRα en queratinocitos epidérmicos de ratones adultos
[Indra et al., 1999; Metzger et al., 2003].
Los RAR y RXR forman heterodímeros estables requeridos para la unión de alta
afinidad con elementos de respuesta en el DNA (RAREs; del inglés; “Retinoic Acid
Response Element”). Después de su unión al DNA, los heterodímeros RAR-RXR regulan la
expresión genética de genes blanco para el RA de una manera dependiente de ligando
[Chambon, 1996; Kastner et al., 1997]. Los RXR son también capaces de formar
homodímeros y heterodímeros con otros miembros de la superfamilia, como TRs, VDR y
PPARs [MacDonald et al., 2001]. En tejidos epiteliales RXRα es el más abundante y actúa
como un factor auxiliar en la unión a RAREs (Figura 7), permitiendo la intercomunicación
Figura 7. Los retinoides y sus receptores (RXR, RAR) controlan diferentes eventos celulares (modificado de: Altucci y Gronemeyer, 2001)
Ocádiz-Delgado Rodolfo B. Tesis Dr. en C. 2012
13
y la intermodulación por RA, de múltiples vías de señalización. Adicionalmente, la
expresión de RXRα puede ser regulada por otros miembros de la familia de recptores
nucleares (NRs; del inglés: “Nuclear Receptors”), tal como el Receptor a Estrógeno (ER;
del inglés: “Estrogen Receptor”) activado por estrógeno (E2). Los retinoides y las
hormonas esteroideas (como E2) son reguladores poderosos de la diferenciación y
función epitelial normal del tracto reproductivo murino. E2 induce la expresión de RXRα
(dentro de los primeros 30 min de tratamiento) y expresión de RARγ (a las 4h) en el
epitelio cervical del ratón [Celli et al., 1996].
Utilizando un modelo murino condicional [RXRα (Cvx L-/L-)], se demostró que la
deleción epitelio específica temporalmente controlada de los alelos RXRα resulta en
anormalidades severas en la piel incluyendo alopecia, hiperproliferación, procesos
inflamatorios y diferenciación terminal aberrante [Li et al., 2000; Indra et al., 2007].
Además, en este mismo modelo, se ha demostrado que la eliminación del receptor RXRα
en células epiteliales de ratones adultos, resulta en el incremento simultáneo de los
niveles de proliferación celular y de apoptosis, acompañado de la alteración en los niveles
de expresión de genes involucrados en ambos procesos [Ocádiz-Delgado et al., 2008].
En conclusión, los retinoides transducen señales importantes en cérvix, piel y otros
tejidos epiteliales. El modelo actual de la acción de los retinoides concibe una acción dual
para los heterodímeros RXR-RAR: actúan como represores en ausencia de ligando y como
activadores en su presencia (Figura 8). En la ausencia de ligando, los heterodímeros se
unen a la región regulatoria de genes blanco y se asocian a un complejo represor que
incluye a la histona desacetilasa. Esta desacetilación resulta en la condensación de la
cromatina y la represión de la transcripción (Figura 8a). Después de la unión del ligando,
los receptores liberan los corepresores y reclutan un complejo coactivador el cual
contiene componentes que catalizan modificaciones de las histonas originando la pérdida
de la estructura de la cromatina (Figura 8b). Subsecuentemente, un complejo coactivador
diferente, denominado mediador, establece una unión entre los receptores y la
maquinaria general de transcripción reclutando a la polimerasa II e iniciando la
Ocádiz-Delgado Rodolfo B. Tesis Dr. en C. 2012
14
transcripción (Torchia et al., 1998; Altucci, 2007; Noy N, 2010). En tejido cervical, los
RXR y en particular RXRα podrían jugar un papel muy importante en la regulación de
genes implicados en proliferación y en apoptosis, es decir en el control de procesos
neoplásicos.
Figura 8. Regulación de la transcripción génica mediada por receptores nucleares. En el esquema se muestra la activación de receptores nucleares que funcionan como heterodímeros con RXR [Altucci, 2007; Noy N, 2010].
Ocádiz-Delgado Rodolfo B. Tesis Dr. en C. 2012
15
1.6 Cáncer Cervical y Receptores a Retinoides
Numerosas observaciones tanto epidemiológicas como experimentales han indicado
que los retinoides tienen un efecto protector del cáncer. Por ejemplo, se ha encontrado
una asociación inversa significativa entre la concentración de retinol (vitamina A) en el
suero y neoplasia intraepitelial cervical (NIC) [French et al., 2000]. Por otro lado, la
ausencia de retinoides en la dieta de ratones induce lesiones premalignas equivalentes a
NICs, sin embargo, se ha descrito que mujeres con deficiencia en Vitamina A induce el
desarrollo de metaplasia epidermoide [Ponnamperuma et al., 1999] (Figura 9). En parte
debido a estas observaciones, el RA está considerado actualmente como uno de los
compuestos más prometedores en quimioterapia y quimioprevención del cáncer.
Se ha demostrado que los RAR son expresados en todos los epitelios cervicales
normales, mientras que todas las lesiones NIC, incluyendo NIC I, NIC II y NIC III,
exhiben un claro decremento en la expresión de RARα, RARβ y RARγ [Xu et al., 1999].
Además, se ha reportado que RARβ es un gen supresor de tumor [Sun et al., 2000], el
cual se encuentra regulado negativamente en células de carcinoma cervical y que es
capaz de inhibir el crecimiento in vitro de células derivadas de CaCu [Geisen et al., 2000].
Dado que el ácido retinoico es uno de los compuestos más prometedores en
quimioprevención y quimioterapia del cáncer, muchos laboratorios han intentado
encontrar los mecanismos por los cuales actúa [Dong et al., 1995]. Se ha propuesto para
la actividad antitumoral de los heterodímeros RXR-RAR, activados por retinoides, el
bloqueo de la función de AP1 o la activación de RAREs en algunos genes blanco. La
expresión regulada del factor transcripcional AP1 juega un importante papel en la
progresión preneoplásica-neoplásica en modelos de cultivo celular [Dong et al., 1995].
Las NICs han sido definidas como lesiones precursoras del cáncer cervical invasor
y constituyen un sistema modelo humano para estudiar el desarrollo de lesiones
premalignas ya que exhiben varias anormalidades histológicas graduales. Varios reportes
clínicos sugieren que los retinoides son agentes quimiopreventivos efectivos para NICs
[Meyskens et al., 1995]. También parecen ser efectivos en el tratamiento del cáncer
cervical invasor, en particular cuando los retinoides se asocian con interferones (IFNs)
[Lotan et al., 1995]. Observaciones posteriores han demostrado que la combinación de
retinoides e IFNs resulta en un efecto sinérgico que induce la apoptosis en líneas
celulares derivadas de carcinoma [Giandomenico et al., 1997]. Respecto a los
Ocádiz-Delgado Rodolfo B. Tesis Dr. en C. 2012
16
mecanismos de este efecto terapéutico cooperador se ha observado que el RA puede
incrementar los niveles de factores de transcripción requeridos en la activación de genes
inducida por IFNs [Percario et al., 1999]; entre estos genes podemos citar a los que
intervienen en adhesión celular [Matarrese et al., 1998] y los que codifican para
Moléculas del Complejo Principal de Histocompatibilidad (MHC; del inglés “Major
Histocompatibility Complex”) [Santin et al., 1998].
Figura 9. La deficiencia de Vitamina A induce el desarrollo de metaplasia epidermoide (Ponnamperuma et al., 1999).
Ocádiz-Delgado Rodolfo B. Tesis Dr. en C. 2012
17
1.6.1 Receptores a Retinoides y cáncer
El epitelio cervical contiene dos fenotipos, estratificado escamoso y columnar simple,
los cuales se juntan en la unión escamocolumnar o zona de transformación. Estas
regiones en donde un tipo de epitelio reemplaza a otro (metaplasia) tienen predilección
por el desarrollo de cáncer; en particular, los cánceres cervicales asociados a infecciones
con HPV se desarrollan primariamente en la zona de transformación (una región donde
se pueden detectar células escamosas metaplásicas en el epitelio columnar de las
glándulas endocervicales). Es justamente en la zona de transformación donde la
exposición a estrógeno induce la carcinogénesis cervical escamosa [Elson et al., 2000].
Algo muy interesante es que el epitelio columnar simple sufre metaplasia escamosa
(condición premaligna) en respuesta a la deficiencia en vitamina A. Es importante señalar
que los transcritos de RXR (α y β) y de RARγ se expresan en el epitelio escamoso
estratificado del cérvix [Darwiche et al., 1994]. También, el epitelio columnar simple, el
cual responde notablemente a la concentración de vitamina A, expresa altos niveles de
transcritos de RARα, RARβ y RXR (α y β). Sólo los transcritos RARβ y RXR (α y β) fueron
regulados negativamente por la condición de deficiencia en vitamina A y se expresaron
menos en los foci metaplásicos escamosos que en el epitelio columnar simple [Darwiche
et al., 1994]. El hecho de que los RXRs están localizados principalmente en células
basales y columnares del cérvix sugiere que ejecutan funciones específicas, tanto en la
diferenciación epitelial del cérvix [Darwiche et al., 1994] como en la prevención del
cáncer cervical.
Ya que éstos y otros resultados experimentales sugieren que los receptores a
retinoides están asociados a transformación celular y a la formación de tumores, es
importante estudiar el efecto fenotípico causado por la inactivación específica de los
receptores a retinoides en piel y en tejido cervical y determinar la contribución de estas
mutaciones en el desarrollo del cáncer. RARα, RARγ y RXRα son los receptores a
retinoides más frecuentemente expresados en la epidermis del ratón, tanto durante la
embriogénesis, como en el adulto; sin embargo ratones “knockout” (nulos) para RARα o
RARγ son completamente normales con respecto a la estructura de la piel, tal vez debido
a una redundancia funcional entre estos receptores [Kastner et al., 1997]. Apoyando la
observación anterior se encontró que los doble mutantes RARα-/-/RARγ-/- mueren en una
etapa temprana del desarrollo [Mascrez et al., 1998]. Más aún, un ratón nulo para RXRα,
Ocádiz-Delgado Rodolfo B. Tesis Dr. en C. 2012
18
el principal isotipo RXR en piel, es letal en útero antes de la formación de la piel [Mascrez
et al., 1998]. Este problema fue recientemente resuelto con el desarrollo de una técnica
eficiente para crear mutaciones somáticas en ratones adultos, controladas espacio-
temporalmente por Tamoxifén (Tam), el cual actúa como inductor de la Cre-ERT2
recombinasa, enzima de fusión que contiene una mutación en el dominio del receptor
para estrógeno por el cual normalmente este receptor se une a la hormona [Metzger y
Chambon, 2007; Vasioukhin et al., 1999]. En este sistema modelo ha sido posible abatir
RXRα en forma selectiva en queratinocitos del ratón adulto y demostrar que este receptor
participa en la homeostasis de la piel y en el ciclo de crecimiento del pelo, probablemente
a través de heterodímeros RXR/VDR [Li et al., 2000]. Recientemente, nuestro grupo ha
descrito que, a nivel cervical, los ratones mutantes para el gen RXRα mostraron una
alteración importante en la homeostasis epitelial, alteraciones en los niveles de
proliferación celular y apoptosis, así como también mostraron el desarrollo de lesiones
preneoplásicas como son metaplasia cervical y mitosis frecuentes (Figura 10) [Ocádiz-
Delgado et al., 2008].
En conclusión, los NRs y en particular RAR/RXR juegan un papel clave en el control
del crecimiento normal o maligno de los epitelios; los retinoides, al activar estos
receptores, inhiben la proliferación e incrementan la apoptosis de varios tipos de células
tumorales in vitro e in vivo y reducen la incidencia de cánceres epiteliales. Los RXRs
forman heterodímeros con VDR (del inglés: “Vitamin D Receptor”), RAR, TRs (del inglés:
“Thyroid Receptor”) y PPARs (del inglés: “Peroxisome Proliferator-Activated Receptor”) y
las moléculas diméricas son la forma activa de estos NRs. El RXRα es muy importante en
la transmisión de señales inducidas por los retinoides y se expresa abundantemente en
tejido cervical. Para entender la participación de los RXR en neoplasias humanas
frecuentes, es crucial el desarrollo de sistemas modelo que permitan estudiar in vivo el
papel de los receptores nucleares y en particular de los RAR y RXR.
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19
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1.7 Apoptosis y Cáncer
La apoptosis o muerte celular programada es un proceso finamente regulado, que
es utilizado para la eliminación de células innecesarias, dañadas, mutadas, infectadas con
virus o desconocidas para el organismo [Boya et al., 2004; Elmore, 2007]. Este
mecanismo es imprescindible para el funcionamiento de diferentes procesos fisiológicos
normales en los organismos multicelulares, dentro de los cuales se incluyen el desarrollo
embrionario, la renovación tisular, la diferenciación, la morfogénesis, la respuesta
inmunológica, entre otras [Elmore, 2007; Krammer et al., 2007a; Opferman y Korsmeyer,
2003]. La apoptosis puede ser inducida por una gran variedad de factores, como son la
carencia de factores de crecimiento, mediante receptores de muerte, exposición a luz
ultravioleta, radiaciones o también mediante drogas quimioterapéuticas. Dependiendo del
estímulo apoptótico y el tipo de célula afectada, este proceso puede durar desde unas
cuantas horas, hasta unos pocos días [Norbury y Hickson, 2001].
La apoptosis puede ser inducida principalmente mediante dos vías de señalización
celular: la vía extrínseca y la vía intrínseca (Figura 11). La primera incluye la activación de
receptores de muerte, moléculas de superficie celular de la superfamilia del Factor de
Necrosis tumoral (TNF; por sus siglas en inglés: “Tumoral Necrosis Factor”); mientras que
la vía intrínseca involucra la liberación de factores pro-apoptóticos de la mitocondria al
citoplasma como Citocromo C. Ambas vías son seguidas por una cascada de eventos
dependientes principalmente de la activación de caspasas proteolíticas, resultando así en
la degradación de proteínas y activación de enzimas que culminan en la muerte
apoptótica [Krammer et al., 2007b].
Ocádiz-Delgado Rodolfo B. Tesis Dr. en C. 2012
21
Como se mencionó anteriormente, la apoptosis se encuentra involucrada en una
gran variedad de procesos fisiológicos y es de vital importancia en la vida de un
organismo multicelular, ya que se encarga de mantener un equilibrio entre el número de
células que proliferan y las que mueren (homeostasis) [Green, 2003]. Un desequilibrio en
este proceso puede provocar diversos trastornos patológicos, por ejemplo, una apoptosis
excesiva puede dar origen a enfermedades neurodegenerativas como son Alzheimer,
Parkinson o Huntington. De igual forma, puede provocar una disminución de linfocitos,
dando lugar a padecimientos como el síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA)
[Fink y Cookson, 2005; Lockshin y Zakeri, 2007]. Contrariamente, una disminución de la
apoptosis puede ocasionar acumulación de células, induciendo así la formación de
tumores, por lo que éste mecanismo juega también un papel relevante en la regulación
Figura 11. La apoptosis puede ser inducida principalmente mediante dos vías de señalización celular: la vía extrínseca y la vía intrínseca (tomado de Noy, 2010).
Ocádiz-Delgado Rodolfo B. Tesis Dr. en C. 2012
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de la progresión tumoral [Folkman, 2003]. Muchos tipos de cáncer tienen su origen por
infecciones virales, por lo que no es de sorprenderse que muchos virus hayan
desarrollado numerosas estrategias para bloquear la apoptosis [Boya et al., 2004;
Galluzzi et al., 2008]. Entre ellos se encuentra el virus del papiloma humano (HPV), el
cual posee la habilidad de persistir en el huésped por prolongados periodos de tiempo sin
ser eliminados, demostrando de esta manera, los sofisticados mecanismos de evasión
que posee. Gran cantidad de evidencias han sugerido que las oncoproteínas virales E6 y
E7, al igual que E5, pueden inhibir la señalización de los receptores de muerte en puntos
clave [Lagunas et al., 2010]. De esta manera, el HPV es capaz de regular la supervivencia
de las células infectadas para facilitar su replicación y asegurar la producción e
incremento de la progenie [Garnett y Duerksen-Hughes, 2006].
Dentro de la regulación de la vía intrínseca de la apoptosis se han descrito proteínas
asociadas a la membrana de la mitocondria. En general, estas proteínas han sido
clasificadas de acuerdo a su función como anti-apoptóticas (Bcl-2, Bcl-XL, Bcl-W, MCL-1,
BCL2A1, BCL-B) como pro-apoptóticas (Bax, Bak, Bok, Bad, Bid, Bik, Blk, BimL, PUMA,
NOXA, BMF, HRK) [Reed, 2006]. Actualmente, se reconoce a las proteínas Bcl-2 y Bax,
pertenecientes a la familia de proteínas Bcl-2, como reguladores centrales de la vida y la
muerte celular programada; además, es bien conocido que Bcl-2 promueve la
sobrevivencia celular, mientras que Bax promueve la muerte celular [Adams y Cory,
1998], de tal manera que la relación de expresión entre Bcl-2/Bax determina la
sobrevivencia o muerte después de un estímulo apoptótico [Liu et al., 2006]. Con base en
lo anterior, en este trabajo nos hemos enfocado a la determinación de los niveles de
expresión de estas moléculas.
La proteína Bcl-2 pertenece a la familia de proteínas Bcl-2/Bax, con un peso entre
los 25 y 26 kDa. Contiene en su extremo carboxilo terminal aminoácidos hidrofóbicos
necesarios para su inserción en membranas lipídicas. Se localiza en la mitocondria, el
retículo endoplásmico y membranas perinucleares. Bcl-2 pertenece a la familia de los
protooncogenes, pero su capacidad de promover el crecimiento tumoral difiere de otros
oncogenes; esta puede rescatar a células destinadas a morir sin afectar la relación de
proliferación celular. Bcl-2 está implicada en el mantenimiento de la homeostasis del
Calcio en la célula y también puede inhibir la muerte celular mediante el secuestro o la
neutralización de las moléculas con dominios BH1, BH2 y BH3 como Bax. Posiblemente
Ocádiz-Delgado Rodolfo B. Tesis Dr. en C. 2012
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evitando la formación de polímeros de Bax, uniéndose Bcl-2 a ambos extremos de la
cadena en formación [Reed, 2006] (Figura 12). Por otro lado, la proteína Bax pertenece
a la familia de proteínas proapoptóticas Bcl-2/Bax. En esta familia existen dos clases
principales de proteínas [Korsmeyer, 2000] (Figura 12):
1. Aquellas que comparten varias regiones de secuencias homólogas, específicamente los
dominios BH1, BH2 y BH3, llamadas proteínas “multidominio”, (MDPs; del inglés: “multi-
domain proteins”).
2. Aquellas que comparten poca similitud de secuencias, salvo por su dominio BH3
(llamadas proteínas de sólo dominio BH3 (BOPs). Las proteínas BOPs usan sus dominios
BH3 como ligandos para captar otros miembros de la familia Bcl-2/Bax, tanto para
suprimir proteínas antiapoptóticas como Bcl-2 y Bcl-X Bax y Bak.
Figura 12. Participación de Bcl-2 y Bax en la vía intrínseca de la apoptosis (tomado de Cotter, 2009).
Ocádiz-Delgado Rodolfo B. Tesis Dr. en C. 2012
24
2 Antecedentes
El desarrollo del cáncer comúnmente toma décadas para desarrollarse siguiendo un
patrón histopatológico progresivo que involucra la adquisición de múltiples cambios
genéticos y epigenéticos, los cuales están relacionados con la alteración de los perfiles de
expresión génica. Además, existen factores externos tales como las infecciones virales
que pueden cooperar al desarrollo del cáncer. Un subgrupo de de los papilomavirus
(HPVs), los virus denominados de alto riesgo (HR-HPVs), está asociado con el desarrollo
de tumores malignos, incluyendo a la mayoría de los casos de cáncer cervicouterino
(CaCu) [zur Hausen, 1996, 2009; Walboomers et al., 1999]. El CaCu es el segundo tipo
de cáncer más común entre las mujeres, con una elevada mortalidad a pesar de los
esfuerzos de detección temprana a nivel mundial [Sankaranarayanan y Ferlay 2006].
Recientemente, la prevención del CaCu se está realizando mediante el uso de vacunas
profilácticas contra los tipos virales de alto (HR-HPV) y bajo (LR-HPV) riesgo. Sin
embargo, el beneficio potencial clínico de estas vacunas profilácticas será detectable
hasta después de algunas décadas. Además, debido a su alto costo, estas vacunas no
han podido ser usadas ampliamente en países con incidencias altas de tumores asociados
a los HR-HPVs. Por otro lado, actualmente no existen todavía tratamientos antivirales
específicos o vacunas terapéuticas disponibles [McLaughlin-Drubin y Münger, 2009].
2.1 El modelo murino triple transgénico condicional para RXRα / transgénico
para E6/E7 [RXRα (Cvx L-/L-)/E6E7 (tg/0); Tam-RTT]
De acuerdo a lo mencionado anteriormente, el CaCu es un proceso multifactorial por
lo que, con el objetivo de obtener un modelo murino que permita reproducir algunos de
los factores de riesgo relacionados con el CaCu, se llevó a cabo la cruza entre ratones
condicionales para RXRα (deficiencia alimenticia) y ratones que expresan a los oncogenes
E6/E7 (infección persistente por HR-HPV). Esta cruza se llevó a cabo en el Instituto de
Genética y Biología Molecular y Celular de la Universidad Luis Pasteur, en Estrasburgo,
Francia (IGCEB), a cargo del Dr. Eduardo Castañeda del grupo de los Doctores Pierre
Chambon y Daniel Metzger. Proponemos que este modelo tendrá las características de los
dos modelos anteriormente descritos, es decir, expresará las oncoproteínas E6 y E7 del
HPV16 y se le podrá deletar el exón 4 del RXRα en forma espacio-temporal-tejido
específica.
Ocádiz-Delgado Rodolfo B. Tesis Dr. en C. 2012
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Para estudiar el posible efecto cooperador entre la deleción del receptor RXRα y la
expresión de los oncogenes E6E7 para inducir lesiones cervicales malignas, se produjo un
Ratón Triple Transgénico [RTT: condicional para RXRα que expresa a los oncogenes E6 y
E7 del HPV16; RXRα (Cvx L2/L2)/E6E7 (tg/0)]. Previamente habíamos observado que
estos ratones triple transgénicos desarrollan en forma espontánea carcinoma in situ y
ocasionalmente carcinoma invasor. Además, se observó que durante la transformación
celular se modifican los niveles de proliferación celular (Ocádiz-Delgado R, Tesis de
Maestría, PIBioM, ENMyH-IPN, 2009) (Figura 13).
En este trabajo se finalizó la caracterización a nivel molecular e histopatológica del
cérvix obtenido de ratones triple transgénicos después de haber sido tratados con
Tamoxifén (Tam-RTT), determinando los niveles de apoptosis así como el análisis de los
niveles de expresión de genes involucrados en procesos de proliferación celular y
apoptosis. Nuestros hallazgos sugieren que la inducción de cáncer cervical en los ratones
RTT tratados con Tam puede ser un modelo valioso para el estudio del cáncer
cervicouterino.
Este modelo será útil no sólo para identificar cofactores involucrados en la génesis
del cáncer cervical, sino también para identificar biomarcadores tumorales tempranos
para el diagnóstico molecular del Cáncer Cervicouterino.
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Figura 13. Los ratones Triple Transgénicos tratados con Tamoxifén presentan elevados niveles de proliferación celular (determinado mediante la detección del marcador PCNA).
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3 JUSTIFICACION
Es importante determinar la posible cooperación entre alteraciones de los
receptores a retinoides (en particular RXRα) y la expresión de los oncogenes E6 y E7 del
HPV en el desarrollo del CaCu, así como su efecto en los niveles de apoptosis y en los
niveles de expresión de genes involucrados en proliferación celular y apoptosis.
Además, es necesario caracterizar en forma más detallada un modelo murino para el
estudio de la carcinogénesis cervical. Esto nos permitirá proponer posibles mecanismos
moleculares de transformación mediados por al menos dos factores de riesgo para
desarrollar CaCu.
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4 HIPOTESIS
“Si la deleción del receptor a retinoides RXRα y la expresión de los oncogenes E6 y E7 de
HPV cooperan en el desarrollo de lesiones premalignas y malignas del cérvix murino,
entonces disminuirán los niveles de apoptosis en el cérvix de ratones triple transgénicos y
se observará un incremento en los niveles de expresión de C-Myc, p21WAF1 y Bcl-2, así
como una disminución de los niveles de expresión de Bax”
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5 OBJETIVOS
5.1 Objetivo General
Determinar a nivel histopatológico y molecular, si existe un efecto cooperador entre
la deleción del receptor a retinoides RXRα y la expresión de los oncogenes E6 y E7 de
HPV en el desarrollo de lesiones malignas en el cérvix de ratones triple transgénicos
RXRα (Cvx L2/L2)/E6E7 (tg/0).
5.2 Objetivos específicos
5.2.1 Determinar si la expresión de los oncogenes E6 y E7 disminuye o aumenta los niveles de apoptosis en el epitelio cervical de ratones transgénicos bK6E6E7 y de ratones triple transgénicos tratados con Tamoxifén [RXRα (Cvx L-/L-)/E6E7 (tg/0)] 5.2.2 Determinar si la expresión de los oncogenes E6 y E7 disminuye o aumenta los niveles de expresión de los genes C-Myc, Bcl-2, Bax y p21WAF1 en el epitelio cervical de ratones transgénicos E6E7 (tg/0) y de ratones RXRα (Cvx L-/L-)/E6E7 (tg/0) 5.2.3 Establecer la correlación entre la deleción de RXRα y la expresión de los oncogenes E6 y E7 con cambios histopatológicos del cérvix de ratones RXRα (Cvx L-/L-)/E6E7 (tg/0) 5.2.4 Establecer la correlación entre la deleción de RXRα, la expresión de los oncogenes E6 y E7, los cambios en los niveles de apoptosis y los cambios en los niveles de expresión de los genes C-Myc, Bcl-2, Bax y p21WAF1 con el desarrollo de cáncer cervicouterino en ratones RXRα (Cvx L-/L-)/E6E7 (tg/0) 5.2.5 Con base en los resultados obtenidos se propondrá un mecanismo molecular para la carcinogénesis cervical en ratones triple transgénicos tratados con Tamoxifén RXRα (Cvx L-/L-)/E6E7 (tg/0)
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6 ESTRATEGIA EXPERIMENTAL
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7 Materiales y Métodos
7.1 Generación de ratones RXRα condicionales (RXRα L2/L2) tratados con
Tamoxifén [(Cvx L-/L-)], Ratones Triple Transgénicos [RTT; RXRα (Cvx
L2/L2)/E6E7 (tg/0)] y Ratones Triple Transgénicos tratados con Tamoxifén
[Tam-RTT: RXRα (Cvx L-/L-)/E6E7 (tg/0)]
Para llevar a cabo la deleción condicional específica del receptor RXRα, el grupo del
Dr. Pierre Chambon desarrolló una cepa doble transgénica condicional para RXRα en la
que el exón 4 del gen está flanqueado por sitios lox-P (floxed) [Li et al., 2000]. La
genotipificación de estos ratones se realizó mediante el análisis de DNA obtenido de un
fragmento de la cola como se ha descrito previamente [Metzger et al., 2003; Schuler et
al., 2004; Li et al., 2001; Brocard et al., 1997], utilizando el método de DNazol de
acuerdo a las intrucciones del fabricante (Invitrogen, USA). De acuerdo a la construcción
genética de los ratones triple transgénicos, se utilizó Tamoxifén para inducir la actividad
de la CreRecombinasa, la cual reconoce en forma específica los sitios lox-P eliminando
cualquier secuencia de DNA que se encuentre dentro de estas marcas. El tratamiento de
estos ratones con Tamoxifén se realizó de acuerdo a lo descrito por Indra y cols. (2007).
La cepa transgénica que expresa a los oncogenes E6 y E7 del HPV16 [E6E7 (tg/0)] fue
generada por el grupo del Dr. Luis Covarrubias [Escalante-Alcalde et al., 2000; Ocádiz-
Delgado et al., 2009]. Con la finalidad de generar los ratones triple transgénicos RXRα
(Cvx L2/L2)/E6E7 (tg/0), se cruzaron tres parejas reproductoras de ratones RXRα L2/L2
(fondo C57BL/6xSJL) [Feil et al., 1996] con tres parejas E6E7 (tg/0) (fondo CD-1). El
fondo de la línea triple transgénica mostró un fenotipo dominante parecido al fondo CD-1
(Figura 14) [Ocádiz-Delgado et al., 2012]. Los ratones fueron destetados a los 21 días de
edad y alimentados con una dieta diseñada para apoyar la gestación, la lactancia y el
crecimiento de las crías (“Teklad global”; 18% de proteínas; Harlan, Indianápolis, IN,
USA). Los animales fueron alojados individualmente y se mantuvieron bajo ciclos
constantes día-noche (luz de 06:30 a 18:30 horas). Ratones de 4 a 6 semanas de edad
fueron inyectados vía i.p. ya sea con vehículo (etanol) o con 0.01 mg de Tamoxifén
(Tam). Ratones silvestres RXRα (L2/L2; silvestres) fueron utilizados como controles. Los
animales se manejaron y sacrificaron de acuerdo con las normas institucionales del
Instituto de Genética y de Biología Molecular y Celular (IGBMC, Estrasburgo Francia). El
protocolo de manejo de tejidos y muestras de origen murino fue registrado ante la
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Unidad de Producción y Experimentación con Animales de Laboratorio del CINVESTAV-
IPN (Protocolo 212/04; NOM-062-ZOO-1999, México D.F.).
7.2 Genotipificación de los alelos RXRα
La identificación de los alelos RXRα silvestres y deletados se realizó mediante PCR in
vitro y PCR in situ. El DNA genómico se aisló y purificó de acuerdo a protocolos
establecidos previamente [Feil et al., 1996]. La amplificación por PCR se realizó con los
primers ZO243 (5’-TCCTTCACCAAGCACATCTG-3') (localizado en el intrón 3) y ZO244 (5'-
TGCAGCCCTCACAACTGTAT-3') (localizado en el exón 4). Estos primers amplificaron tanto
Figura 14. Imágenes representativas de ratones triple transgénicos sin tratar con Tamoxifén (-Tam) y ratones triple transgénicos tratados con Tamoxifén (+Tam) [RXRα (Cvx L-/L-)/E6E7 (tg/0)]. Los ratones triple transgénicos tratados mostraron un tamaño menor en comparación con los ratones no tratados con Tam.
Ocádiz-Delgado Rodolfo B. Tesis Dr. en C. 2012
33
el alelo silvestre (Wt) como los alelos L2 (650 y 700 pares de bases, respectivamente)
[Ocádiz-Delgado et al., 2008]. El primer UD196 (5'-CAACCTGGACTTGTCACTTAG-3') se
localiza en el intrón 4, lejos de los exones 3 y 4. Cuando este primer es utilizado con el
primer ZO243, tanto en el ratón silvestre como en el ratón condicional sin tratar con
Tamoxifén no se obtiene ningún producto de amplificación debido a la lejanía de las
secuencias. Sin embargo, cuando es inducida la recombinación, y por lo tanto la
eliminación del exón 4 de RXRα, la secuencia reconocida por el primer UD196 se
encontrará más cerca del exón 3 y se obtiene un producto de amplificación de 400 pares
de bases. Con base en lo anterior, el primer UD196 fue utilizado como control positivo de
recombinación tanto en los ensayos de PCR in vitro como de PCR in situ [Ocádiz-Delgado
et al., 2008]. Para verificar la eficiencia de escisión de los alelos “floxed” RXRα en epitelio
cervical, se realizó la amplificación de la región mediante PCR en el buffer de reacción
que contenía Tris-HCl (pH 8.0) 10 mM, KCl 50 mM, MgCl2 1.5 mM, dNTPs 0.2 mM, 0.25
µM de cada primer y 2 unidades de Taq DNA polimerasa (Invitrogen, U.S.A.), utilizando 1
µg de DNA genómico como templado. Después de 35 ciclos (30 seg a 94°C, 30 seg a 59
°C y 30 seg a 72 °C), los productos de amplificación fueron analizados mediante
electroforesis en geles de agarosa al 2.5%, teñidos con bromuro de etidio [Ocádiz-
Delgado et al., 2008; Ocádiz-Delgado et al., 2012]. En todos los experimentos de
genotipificación, la amplificación del gen p21WAF1 fue incluida para confirmar la
integridad de las muestras de DNA genómico.
7.3 Genotipificación de los alelos E6E7
Para identificar a los alelos E6E7 se realizaron experimentos de PCR in vitro y PCR in
situ utilizando primers y condiciones previamente descritos [Fujinaga et al., 1991; Ocádiz-
Delgado et al., 2009; Ocádiz-Delgado et al., 2012]. Para lograr este objetivo se utilizaron
los oligonucleótidos consenso pU-1M (sentido): 5’ TGTCAAAAACCGTTGTGTCC 3’ y pU-2R
(antisentido): 5’ GATCTGTCGCTTAATTGCTC 3’ [Fujinaga et al., 1991]. Tanto el DNA
genómico como las muestras de tejido cervical obtenidos de las diferentes cepas de ratón
fueron analizados utilizando las siguientes condiciones de amplificación: desnaturalización
a 94°C durante un minuto, alineamiento a 55°C por dos minutos y síntesis a 72°C
durante dos minutos. En el caso de PCR in vitro se utilizaron 40 ciclos de amplificación,
mientras que para los ensayos de PCR in situ se utilizaron 18 ciclos. Para evitar falsos
Ocádiz-Delgado Rodolfo B. Tesis Dr. en C. 2012
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positivos, se incluyeron dos controles negativos: muestras obtenidas de ratones silvestres
y una reacción a la cual no se le añadió DNA templado. Los productos de PCR fueron
analizados por electroforesis en geles de agarosa al 2.5 %, teñidos con bromuro de etidio
y visualizados en un transiluminador de luz UV. En el caso de los ensayos de PCR in situ
la señal de amplificación fue detectada mediante el uso de un sistema de desarrollo de
color por medio de una peroxidasa (ver adelante).
7.4 Muestras de tejido cervical
Tejido cervical obtenido a partir de ratones mutantes y controles fue fijado en
paraformaldehído al 3.75% en PBS e incluido en parafina de acuerdo a protocolos
descritos previamente [Sambrook y Maniatis, 1989; Riley et al., 2003] y descritos
brevemente a continuación: Antes de ser sacrificados, los ratones fueron anestesiados
con Avertina al 2.5% y perfundidos a través de la aorta con Paraformaldehído al 3.75%.
El tracto reproductivo fue colocado en casetes de inclusión (Fisher Scientific, USA) con
una esponja para compresión y sometidos a una fijación adicional en paraformaldehído al
3.75%, toda la noche a 4 °C. Esta post-fijación produjo muestras linealmente dispuestas
de tal manera que el corte de los tejidos se pudo realizar en un solo plano [Riley et al.,
2003]. Los tejidos fueron lavados en PBS 1X y posteriormente deshidratados en alcoholes
graduales (70%, 80%, 90% y etanol absoluto; 1 hora en cada solución) y finalmente
aclarados con Alcohol:Xileno y Xileno (1 hora en cada paso). Una vez que el tejido fue
incluido en parafina (1 hora en parafina ultrapura a 55°C, enfriando posteriormente a 4°C
toda la noche), las muestras fueron cortadas en un micrótomo en forma serial (5µm de
grosor). Estos cortes fueron montados en laminillas electrocargadas y fueron utilizados
para la tinción con Hematoxilina y análisis por inmunohistoquímica, PCR in situ y RT-PCR
in situ. Todos los ratones hembra fueron sincronizados mediante la exposición al olor de
ratones machos o a su orina (“Efecto Whitten”) [Whitten et al., 1959]. Los animales
fueron sacrificados en la fase estro del ciclo estral.
7.5 Análisis histopatológico
Todos los tejidos fueron evaluados por un patólogo experto (Dr. Rogelio Hernández-
Pando; Departamento de Patología; Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición
Salvador Zubirán, México, D.F.). El criterio histológico para el análisis del tejido cervical
Ocádiz-Delgado Rodolfo B. Tesis Dr. en C. 2012
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murino, fue estrictamente acorde a lo establecido por la Organización Mundial para la
Salud (WHO). En el análisis se incluyeron muestras de las diferentes cepas murinas:
ratones silvestres RXRα (L2/L2 no Cre); ratones condicionales tratados con Tamoxifén
[RXRα (Cvx L-/L-)]; ratones transgénicos E6E7 (tg/0) y ratones triple transgénicos
tratados con Tamoxifén [Tam-RTT; RXRα (Cvx L-/L-)/E6E7 (tg/0)].
7.6 Inmunohistoquímica
Los cortes de cérvix murino fueron desparafinizados y rehidratados de acuerdo a
protocolos descritos en trabajos similares [Ocádiz-Delgado et al., 2008; Sambrook y
Maniatis, 1989]. La detección de proteínas fue llevada a cabo utilizando un el kit
“Mouse/Rabbit PolyDetector HRP/DAB Detection System” (Bio SB, USA). Inicialmente, los
tejidos fueron rehidratados en PBS y se realizó un procedimiento de recuperación de
antígenos utilizando una solución de citratos (ImmunoRetriever Citrate Solution, Bio SB,
USA) en una olla de presión digital (121 °C, 20 lb de presión, 15 minutos tiempo total).
Las laminillas con los cortes fueron enfriadas a temperatura ambiente durante 30 minutos
y los tejidos fueron tratados con una solución de bloqueo para inhibir las peroxidasas
endógenas (PolyDetector Peroxidase Block quenching buffer; Bio SB, USA). Después de
tres lavados en PBS, los cortes fueron incubados de 12 a 16 horas a 4 °C con uno de los
siguientes anticuerpos monoclonales primarios diluidos 1:50 en buffer de dilución: Tris-
HCl, pH 8.0 1OO mM (concentración final) y NaCl 150 mM (concentración final) en agua
ultrapura: anti-PCNA o anti-Ki67 (marcadores de proliferación celular, anti-HPV16
E6/HPV18 E6 (C1P5), anti-p16INK4A (Santa Cruz Biotechnology, USA); o anti-Caspasa 9
activada (marcador de apoptosis; Cell Signalling, USA). Se realizaron cuatro lavados en
PBS y los cortes fueron incubados durante 30 minutos con un anticuerpo secundario
(PolyDetector HRP label; Bio SB, USA). Después de tres lavados en PBS, los cortes fueron
incubados con el substrato (PolyDetector DAB chromogen; Bio SB, USA), se contratiñeron
con hematoxilina y se montaron en Permount (Fisher Scientific, USA). En todos los
ensayos se incluyeron controles negativos omitiendo el anticuerpo primario.
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7.7 Determinación de los niveles de apoptosis mediante TUNEL
La fragmentación de DNA genómico fue detectada mediante ensayos de TUNEL
(“TdT-mediated dUTP-X Nick End Labeling”) de acuerdo a las especificaciones del
fabricante (Roche, USA). Los cortes de tejido fueron desparafinizados en xilol,
rehidratados en PBS y desproteinizados utilizando Proteinasa K durante 15 minutos a
temperatura ambiente (Proteinasa K, 0.5 mg/ml en PBS; Invitrogen, USA), lavados en
PBS y deshidratados nuevamente en alcoholes seriados (70%, 80%, 90% y etanol
absoluto; 5 minutos en cada solución). Para evitar la fragmentación artificial del DNA, se
utilizaron exclusivamente soluciones libres de nucleasas durante todo el procedimiento. El
marcaje con fluoresceína-dUTP de los extremos 3’-OH del DNA fragmentado se llevó a
cabo utilizando 12.5 U de la enzima deoxinucleotidil transferasa (TdT; Roche, USA),
incubando durante 1 hr a 37 °C en una cámara húmeda. Como control positivo se utilizó
tejido cervical normal el cual fue tratado previamente con DNasa I (4 U/ corte, 10
minutos a temperatura ambiente; Roche USA). Estos controles mostraron señal
fluorescente en el núcleo de la mayoría de las células (Figura 15). En todos los ensayos
se incluyeron tejidos cervicales normales sin la enzima TdT como controles negativos. Las
laminillas fueron analizadas por microscopía de fluorescencia. En total se observaron al
menos 500 células por cada muestra, tomando en cuenta al menos tres áreas diferentes.
Con el propósito de confirmar los resultados, en forma adicional se realizó la detección de
Caspasa 9 activada, mediante ensayos de inmunohistoquímica (ver sección 6.6).
Ocádiz-Delgado Rodolfo B. Tesis Dr. en C. 2012
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7.8. PCR in situ
Con el propósito de demostrar: a) la deleción selectiva del gen RXRα así como la
eliminación del transcrito respectivo en ratones condicionales y b) la presencia del
transgén E6E7 y su transcrito en células epiteliales del cérvix murino de ratones
transgénicos [E6E7 (tg/0)] y triple transgénicos (Tam-RTT), decidimos utilizar tanto la
técnica de PCR in situ como RT-PCR in situ. Estas técnicas combinan la sensibilidad
extrema y especificidad de la amplificación por PCR con la capacidad de localizar ácidos
nucleicos en tejidos proporcionada por la técnica de hibridación in situ, permitiendo
realizar una comparación entre tejido epitelial y el estroma. Con base en lo anterior, en
este trabajo se realizó la técnica de PCR in situ directa de acuerdo a lo descrito
previamente con algunas modificaciones [Nuovo, 2001; Ocádiz-Delgado et al., 2008;
Controles Positivos
Controles Negativos
MB
MB
MB
MB
Figura 15. Controles positivos (tratamiento con DNasa) y negativos (sin incubación con TdT) para el ensayo de TUNEL. MB: Membrana Basal.
Ocádiz-Delgado Rodolfo B. Tesis Dr. en C. 2012
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Ocádiz-Delgado et al., 2009; Ocádiz-Delgado et al., 2012]. Los cortes de tejido
previamente fijados en laminillas electrocargadas fueron incubados en un buffer de lisis
que contenía Tris-HCl 0.1 M pH 8.0, EDTA 50 mM pH 8.0 y Proteinasa K 0.5 µg/ml,
durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las laminillas fueron lavadas
cuidadosamente con agua tratada con DEPC. Después de deshidratar los tejidos con
alcohol absoluto, cada tejido fue cubierto con una solución de amplificación que contenía:
Digoxigenina-11(2’-deoxiuridina-5’)-trifosfato (DIG; Roche, USA). Para reducir la
formación de híbridos entre los primers (dímeros de oligonucleótidos), la solución de PCR
fue precalentada a 70 °C durante 10 minutos antes de añadir 5 U de Taq DNA
polimerasa. En todos los ensayos se incluyeron controles negativos que no contenían
alguno de los primers o no se añadió la enzima Taq. La amplificación mediante PCR in
situ se llevó a cabo utilizando el sistema diseñado por Perkin Elmer (USA). Las laminillas
fueron precalentadas a 70 °C utilizando la herramienta de ensamblaje incluida en el
equipo. Después de depositar 50 µl de la reacción de PCR sobre cada uno de los tejidos,
la reacción fue sellada utilizando los discos y clips AmpliCover (Perkin Elmer, USA).
Después del ensamblaje, las laminillas fueron pre-incubadas a 70 °C en el equipo
“GeneAmp In situ PCR system 1000” (Perkin Elmer, USA) hasta que se inició la
amplificación. La reacción de PCR se llevó a cabo durante 18 ciclos de acuerdo a lo
descrito previamente [Ocádiz-Delgado et al., 2008; Ocádiz-Delgado et al., 2009; Ocádiz-
Delgado et al., 2012]. Los primers utilizados para la amplificación in situ fueron los
mismos que se utilizaron para el análisis cuantitativo de RT-PCR en Tiempo Real
(RTqPCR) (Tabla 1). Una vez que finalizaron los ciclos, los tejidos fueron conservados a
una temperatura de 4 °C hasta el desensamblaje. Los clips y discos AmpliCover fueron
removidos cuidadosamente sin maltratar los tejidos, posteriormente se realizaron dos
lavados de 5 minutos cada uno en PBS a temperatura ambiente y los tejidos fueron
deshidratados en alcohol absoluto durante 3 minutos dejándolos secar al aire.
7.9. RT-PCR in situ
Después de la digestión con Proteinasa K (ver sección 6.8.), los tejidos fueron tratados
con 1 U/muestra de DNasa I libre de RNasa (Roche, USA), durante 48 horas a
temperatura ambiente. Se realizaron al menos 8 lavados con agua tratada con DEPC. Se
realizó la reacción de transcripción reversa utilizando la enzima SuperScript II (Invitrogen,
Ocádiz-Delgado Rodolfo B. Tesis Dr. en C. 2012
39
USA) de acuerdo a las indicaciones del fabricante. La reacción (70 µl volumen final en
agua tratada con DEPC) contenía 2.5 µg de oligo(dT)12-18, una mezcla de dNTPs (10 mM
de cada uno de los deoxinucléotidos dATP, dGTP, dCTP y dTTP), buffer 5X, DTT 0.1 M,
40 U de inhibidor de ribonucleasas recombinante y 100 U/tejido de transcriptasa reversa
(Invitrogen, USA). Las laminillas fueron incubadas a 42 °C durante una hora en una
cámara húmeda sellada. Después de varios lavados, se llevó a cabo la reacción de PCR in
situ directa utilizando primers específicos de acuerdo a lo descrito en la sección 2.8
[Ocádiz-Delgado et al., 2008; Ocádiz-Delgado et al., 2009; Ocádiz-Delgado et al., 2012].
Se incluyeron controles negativos en los cuales uno de las primers fue sustituido con H2O
durante la reacción de PCR u omitiendo la incubación con la enzima transcriptasa reversa.
Tabla 1 Secuencias de oligonucleótidos y condiciones de amplificación utilizados en los ensayos de RT-PCR in situ y RT-PCR cuantitativa en tiempo real
Gen Secuencia 5' → 3'
Tamaño del Producto de Amplificación
(pares de bases; pb) C-Myc Forward
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225 pb
HPRT Forward Reverse
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174 pb
* Las condiciones de amplificación para RT-PCR in situ fueron: 94 °C, 30 seg; 60 °C, 30 seg; 72 °C, 30 seg; 18 ciclos.
Ocádiz-Delgado Rodolfo B. Tesis Dr. en C. 2012
40
7.10 Detección in situ de los productos de amplificación
Para la detección de los productos de PCR se utilizó un anticuerpo primario anti-DIG
(Anti-Digoxigenin Fab fragments; Roche, USA), conjugado a una fosfatasa alcalina.
Previamente se realizó un bloqueo con una solución de albúmina sérica bovina al 5 %
(BSA; Sigma, USA) durante 30 minutos. Después de eliminar la solución de bloqueo por
decantación, se añadió el anticuerpo anti-DIG diluido 1:200 en Tris-HCl 100mM pH 7.4 y
NaCl 150 mN (100 µl de solución por tejido) y se incubó durante 2 horas a temperatura
ambiente. Los controles negativos fueron incubados sin el anticuerpo primario. La
detección de la fosfatas alcalina fue llevada a cabo utilizando el sustrato NBT/BCIP
(Zymed, USA) durante 10 a 30 minutos de incubación a temperatura ambiente. Después
de la detección, las laminillas fueron lavadas dos veces en agua destilada estéril durante
5 minutos cada vez, se dejaron secar al aire antes de montarlas utilizando el medio de
montaje Permount (Fisher Scientific, USA).
7.11. Captura digital de imágenes, análisis y cuantificación de la señal
Se obtuvieron fotomicrografías utilizando un equipo digital DFC290 HD (Leica
Microsystems, USA). Se utilizó el siguiente método para realizar un análisis
semicuantitativo de los resultados obtenidos en ensayos de inmunohistoquímica, PCR in
situ y RT-PCR in situ: Después de la adquisición de imágenes, los archivos de resultados
experimentales fueron post-procesados utilizando el programa PhotoImpact (Ulead
PhotoImpact SE versión 3.02; Ulead Systems, USA). Durante este procesamiento se
obtuvo una señal más homogénea la cual nos permitió el análisis del tejido cervical. Las
regiones seleccionadas fueron analizadas digitalmente utilizando el programa Image-
ProPlus (versión 4.5.0.19; Media Cybernetics, Inc., USA). La cantidad de señal fue
cuantificada calculándola como una matriz de datos en pixels (el color contenido en un
píxel dentro de una imagen en una localización específica). Este procedimiento permitió
incluir pixels adyacentes de color similar con base al píxel índice. Todos los pixels
identificados dentro de los parámetros seleccionados fueron cuantificados y utilizados
para generar una gráfica. El archivo usado como control (cérvix de ratones silvestres) es
generado en forma similar. En el caso del análisis de los resultados para RT-PCR in situ,
los datos obtenidos de la detección de los niveles de expresión constitutiva del gen HPRT,
Ocádiz-Delgado Rodolfo B. Tesis Dr. en C. 2012
41
fueron utilizados para normalizar los resultados experimentales [Ocádiz-Delgado et al.,
2008; Ocádiz-Delgado et al., 2009; Ocádiz-Delgado et al., 2012].
7.12. Aislamiento y purificación de RNA total
El RNA total fue aislado y purificado a partir de tejido cervical murino utilizando el
reactivo TRIzol de acuerdo a las instrucciones del fabricante (Invitrogen, USA). Los
tejidos fueron obtenidos de ratones hembra y almacenados a -80 °C hasta su
procesamiento. La calidad de los RNAs fue determinada mediante electroforesis en geles
de agarosa (2 %) desnaturalizantes, teñidos con bromuro de etidio, esto permitió la
visualización de las bandas correspondientes a las fracciones 18S y 28S del RNA a través
de un transiluminador de luz UV: Las concentraciones del RNA total fueron obtenidas
mediante espectrofotometría. Estas muestras se utilizaron para los ensayos de RT-PCR
cuantitativo en Tiempo Real (RTqPCR).
7.13. Síntesis de cDNA para el análisis cuantitativo por RT-PCR en Tiempo Real
(RTqPCR)
Para la síntesis de cDNA se utilizaron tres microgramos de RNA total en una reacción
de 20 µl (volumen final): La mezcla de reacción contenía buffer 5X para síntesis de la
primera cadena [Tris-HCl 250 mM (pH 8.3), KCl 375 mM, MgCl2 15 mM], dNTPs 0.5 mM,
ditiotreitol 5 mM, 15 U de inhibidor de RNasas (Invitrogen, USA), 2.5 µg de oligo(dT)12-18
y 100 U de la retrotrancriptasa SuperScript II. La reacción se llevó a cabo de acuerdo a
las especificaciones del fabricante con modificaciones menores (2 horas a 42°C;
Invitrogen, USA).
7.14. Cuantificación relativa del mRNA mediante RTqPCR
La cuantificación relativa de los RNAs seleccionados fue llevada a cabo mediante
RTqPCR utilizando un equipo 7300 Real Time PCR System (Applied Biosystems, USA).
Todos los primers fueron diseñados para reconocer secuencias intrónicas y fueron
sintetizados por la empresa Invitrogen (USA) [Ocádiz-Delgado et al., 2008]. Las
secuencias fueron obtenidas a partir de la base de datos GenBank
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/). Previamente se habían establecido las
condiciones óptimas para la amplificación de cada secuencia utilizando el kit de
Ocádiz-Delgado Rodolfo B. Tesis Dr. en C. 2012
42
amplificación SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, USA) [Ocádiz-Delgado et
al., 2008; Ocádiz-Delgado et al., 2012; Tabla 1]. Las condiciones de reacción fueron
optimizadas con el propósito de obtener curvas de amplificación de un solo pico. En
forma adicional, los amplicones fueron analizados mediante electroforesis en geles de
agarosa para confirmar que se obtenía una sola banda del tamaño esperado. Las
reacciones de PCR incluyeron 40 ciclos cada uno de tres pasos: desnaturalización a 95 °C
durante 10 segundos, alineamiento de los primers a 60 °C durante 10 segundos y una
fase de elongación a 72 °C durante 10 segundos. Para una reacción de 25 µl se utilizaron
12.5 µl de la mezcla de SYBR Green la cual contenía: 1.25 U de Taq DNA polimerasa,
buffer de reacción, mezcla de dNTPS y MgCl2 1 mM (concentración final), colorante SYBR
Green, 0.5 mM de cada primer, 1 µg de templado y agua ultrapura. Todos los ensayos se
realizaron por duplicado en una sola corrida. Para normalizar las diferencias entre la
cantidad de cDNA añadido a las reacciones, se utilizaron los niveles de expresión del gen
constitutivo HPRT para normalizar los datos.
Ocádiz-Delgado Rodolfo B. Tesis Dr. en C. 2012
43
8 Resultados
8.1 Eliminación específica del receptor RXRα en epitelio cervical de ratones
triple transgénicos RXRα (Cvx L-/L-)/E6E7 (tg/0) tratados con Tamoxifén
(Tam-RTT)
Previamente se han desarrollado sistemas murinos en los cuales es posible deletar
en forma tejido específica secuencias de interés. Esta estrategia involucra el uso de la
expresión de la Cre recombinasa del bacteriófago P1, el cual escinde segmentos de DNA
flanqueados por sitios “Lox” (LoxP). En forma adicional, el control de la actividad de la
Cre recombinasa ha sido condicionada mediante su fusión con dominios de unión a
ligando mutados para receptores a esteroides [Feil et al., 1996; Kellendonk et al., 1999;
Schwenk et al., 1998; Tannour-Louet et al., 2002]. Por lo tanto, la expresión célula-
específica de tal fusión (Cre-ERT2), cuya actividad es inducida por el compuesto anti-
estrogénico Tamoxifén (Tam), ha permitido una mutagénesis espacio-temporal-específica
eficiente en ratones cuyo gen que codifica para el receptor RXRα es marcado con los
sitios “lox” mencionados anteriormente. La mutagénesis se ha logrado en diferentes
tejidos incluyendo el cérvix [Metzger et al., 2003; Ocádiz-Delgado et al., 2008]. Como se
mencionó previamente, en el laboratorio del Dr. Pierre Chambon se obtuvieron ratones
triple transgénicos RXRα (Cvx L2/L2)/E6E7 (tg/0), de color similar a la cepa CD-1, los
cuales desarrollaron alopecia severa después de ser tratados con Tam [RXRα (Cvx L-/L-
)/E6E7 (tg/0) (Figura 14). Con el propósito de confirmar los resultados obtenidos en los
ensayos de PCR in situ, se llevó a cabo la amplificación de las secuencias de interés
utilizando PCR tradicional en fase líquida. El DNA obtenido de un fragmento de la cola de
los ratones fue genotipificado de acuerdo a lo descrito en la sección de Materiales y
Métodos. Los productos de amplificación para RXRα o para E6E7 fueron analizados
mediante electroforesis en geles de agarosa teñidos con bromuro de etidio. La
recombinación dependiente de Cre produjo un alelo nulo (L-) en ratones condicionales
tratados con Tam [RXRα (Cvx L-/L-)] y en ratones triple transgénicos tratados con Tam
[RXRα (Cvx L-/L-) / E6E7 (tg/0); Tam-RTT] (Figura 16). Por otro lado, mediante ensayos
de PCR in situ se demostró que los alelos RXRαL2 fueron convertidos a alelos RXRαL- en el
epitelio cervical de estos ratones pero no en el estroma (Figura 17), lo que demuestra
que la deleción selectiva de la Cre-ERT2 fue eficiente después del tratamiento con Tam.
Ocádiz-Delgado Rodolfo B. Tesis Dr. en C. 2012
44
Figura 16. Tipificación molecular de la recombinación de los alelos “floxed” para RXRα (L-) después del tratamiento con Tamoxifén (Tam) y de la presencia del transgén E6E7 en cepas de ratones incluidas en este trabajo. Los productos de amplificación obtenidos mediante ensayos de PCR in vitro fueron sometidos a electroforesis en geles de agarosa al 2.5%, teñidos con bromuro de etidio y visualizados en un transiluminador de luz UV. El gen p21WAF1 fue usado como control de amplificación para confirmar la integridad de las muestras de DNA genómico.
Ocádiz-Delgado Rodolfo B. Tesis Dr. en C. 2012
45
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Ocádiz-Delgado Rodolfo B. Tesis Dr. en C. 2012
46
Esta conversión de alelos L2 a L-, no fue detectada en los ratones control sin
tratamiento con Tam o ratones sin sitios loxP (p. ej. Ratones silvestres o “Wild type” (Wt)
y ratones E6E7 (tg/0) (Figura 17). De acuerdo a lo esperado, el RNA mensajero
correspondiente a RXRα no fue detectado en los ratones RXRα (Cvx L-/L-) ni en los Tam-
RTT, en comparación con los ratones control (Figura 17, panel in situ). Los transcritos de
RXRα están presentes solamente en epitelios sin tratar con Tamoxifén.
8.2 El transgén E6E7 en el cérvix de ratones transgénicos E6E7 (tg/0) y
ratones Tam-RTT
Utilizando PCR in vitro, el transgén E6E7 pudo ser detectado solamente en ratones
transgénicos E6E7 (tg/0) y ratones Tam-RTT (Figuras 16 y 17). Con el propósito de
demostrar la presencia del transgén y su correspondiente transcrito, se utilizaron las
técnicas de PCR in situ y RT-PCR in situ. De acuerdo a lo esperado, solamente se detectó
una intensa señal de amplificación, tanto para el transgén E6E7 como su transcrito, en el
epitelio cervical de los ratones transgénicos E6E7 (tg/0) y Tam-RTT (Figura 17). No se
detectó señal de amplificación en el caso de tejido cervical de ratones silvestres o ratones
condicionales RXRα (Cvx L-/L-) (Figura 17).
8.3 Detección de la oncoproteína E6 del HPV-16 y de la expresión de p16INK4A
en tejido cervical de ratones E6E7 (tg/0) y Tam-RTT
Como se mencionó anteriormente, el transgén E6E7 y su correspondiente transcrito
fueron detectados eficientemente en tejido cervical de ratones E6E7 (tg/0) y Tam-RTT.
En forma adicional, se demostró la presencia de la proteína E6 del HPV-16 mediante
ensayos de inmunohistoquímica (Figura 18). Como una forma indirecta de demostrar la
actividad de la oncoproteína E7 del HPV-16, se determinaron los niveles de la proteína
p16INK4A, una proteína supresora de tumores, la cual es utilizada frecuentemente como un
biomarcador en cáncer cervical en humanos [Juric et al., 2010; Bergeron et al., 2010]. El
uso de software especializdo nos permitió analizar en forma semicuantitativa los niveles
relativos (índice de marcaje) de la proteína p16INK4A. La expresión de esta proteína se
detectó principalmente en algunas células de los estratos basales del epitelio cervical de
ratones silvestres (Figura 18). Se detectó un incremento en la expresión de p16INK4A en
los estratos suprabasales del cérvix de ratones condicionales RXRα (Cvx L-/L-) siendo
Ocádiz-Delgado Rodolfo B. Tesis Dr. en C. 2012
47
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Ocádiz-Delgado Rodolfo B. Tesis Dr. en C. 2012
48
más abundante en ratones Tam-RTT. Las muestras cervicales de ratones E6E7 (tg/0) y
Tam-RTT sobre-expresaron la proteína p16INK4A en comparación con muestras control
(Figura 18). Interesantemente, la deleción del receptor RXRα también indujo la sobre-
expresión de p16INK4A (Figura 18).
8.4 Cambios histológicos en cérvix de ratones transgénicos E6E7 (tg/0) y Tam-
RTT
Se analizaron muestras cervicales de las cepas de ratón mencionadas anteriormente.
Los ratones silvestres mostraron una zona de transformación (ZT) normal mostrando el
epitelio cilíndrico (columnar) simple con transición a epitelio estratificado (escamoso). El
cérvix de ratones condicionales RXRα tratados con Tam mostró el desarrollo de
metaplasia epidermoide (Figura 19). Los ratones hembras tenían de 27 a 29 semanas de
edad, en el caso de los ratones transgénicos E6E7 (tg/0) se incluyó un grupo de 44
animales. De manera interesante, estos ratones mostraron una baja frecuencia de
displasia moderada (2/44 ratones; 0.9%) o de displasia severa (3/44 ratones; 1.4%)
(Figura 19; Tabla 2) no observándose casos de carcinoma in situ y/o carcinoma invasor.
Además, con el propósito de establecer si existía una posible cooperación entre la
ausencia del receptor RXRα y la presencia de E6E7 en la carcinogénesis cervical murina,
en el estudio histopatológico se incluyeron muestras de Tam-RTT. El análisis reveló que,
después del tratamiento con Tam, el cérvix de la cepa Tam-RTT mostró un 11% de
displasia moderada y 17% de displasia severa. Además, tanto los ratones E6E7 (tg/0)
como los ratones Tam-RTT mostraron células indiferenciadas e hiperproliferación de los
epitelios. Un hallazgo interesante, a diferencia de lo observado en la cepa E6E7 (tg/0),
fue el encontrar el desarrollo de carcinoma in situ y carcinoma invasor en un 61%
(11/18) y un 11% (2/18) respectivamente, de los animales Tam-RTT (Figura 19; Tabla
2). Es importante mencionar que no se observaron alteraciones histopatológicas en tejido
cervical obtenido de ratones silvestres RXRα (L2/L2 no Cre) o ratones silvestres tratados
con Tamoxifén.
Ocádiz-Delgado Rodolfo B. Tesis Dr. en C. 2012
49
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Tabla 2 Análisis histológico de tejido cervical1
_______________________________________________________________ Genotipo Diagnóstico histopatológico % _______________________________________________________________ Epitelio Normal 84 RXRα (L2/L2) Epitelio queratinizado 8 (n=12) Displasia moderada 8 _______________________________________________________________ Metaplasia epidermoide 47 RXRα (Cvx L-/L-)* Displasia moderada 40 (n=15) Cervicitis 13 _______________________________________________________ E6E7 (tg/0)** Displasia moderada 0.9 (n=44) Displasia severa 1.4 _______________________________________________________
TTM Cancer Invasor 11 RXRα (Cvx L-/L-)/E6E7 (tg/0) Carcinoma in situ 61 (n=18) Displasia severa 17 Displasia moderada 11 _______________________________________________________ 1 Todos los ratones fueron tratados con 0.1 mg de Tamoxifén por día durante cinco días consecutivos. *Los ratones RXRα (Cvx L-/L-) mostraron atrofia cervical en el 60 % (9/15) de los casos. ** En este estudio se muestran resultados de aquellos animales transgénicos E6E7 (tg/0) que mostraron alteraciones cervicales histopatológicas.
Ocádiz-Delgado Rodolfo B. Tesis Dr. en C. 2012
51
8.5 Incremento de los niveles de proliferación celular e inhibición de la
apoptosis en ratones Tam-RTT
En un reporte previo, demostramos que la deleción del gen RXRα induce el aumento
tanto en los niveles de proliferación celular como en los niveles de apoptosis [Ocádiz-
Delgado et al., 2008]. De acuerdo a esto, fue necesario determinar el efecto de la
deleción de RXRα y la presencia de E6 y E7 sobre estos mismos eventos celulares. Se
analizaron tejidos cervicales de ratones E6E7 (tg/0) y Tam-RTT determinándose que los
niveles de PCNA (Figura 19B) y Ki-67 (Figura 20), dos importantes marcadores de
proliferación celular, estaban aumentados en comparación con las otras cepas murinas.
Estos niveles se incrementaron 5.6 y 5.9 veces en ratones Tam-RTT, respectivamente, en
comparación con los ratones control (Figuras 19 y 20). Normalmente, este tipo de señal
se detecta en forma restringida a la capa basal de los epitelios, sin embargo, tanto la
ausencia del receptor RXRα como la expresión de los oncogenes E6 y E7 inducen la
expresión de estos marcadores en las capas suprabasales del epitelio. Aun más, en
algunas muestras de ratones Tam-RTT se detectó la expresión de PCNA o de Ki-67 en el
100% de los estratos, sugiriendo un comportamiento similar al observado en muestras
clínicas diagnosticadas como carcinoma in situ. Se observa además, que existe una
correlación entre el incremento en la proliferación celular y la severidad de la lesión.
Utilizando la determinación de TUNEL y la detección de Caspasa 9 activada,
determinamos los niveles apoptosis o muerte celular programada en el cérvix de las
diferentes cepas murinas. El análisis digital de las imágenes obtenidas de los niveles de
apoptosis en muestras cervicales de ratones (índice de marcaje definido como el
porcentaje de células positivas para TUNEL o Caspasa 9 Activada), nos permitió observar
que tanto los ratones E6E7 (tg/0) como los ratones Tam-RTT mostraron los niveles más
bajos de apoptosis en comparación con las otras cepas incluidas en este estudio. En
general, los niveles más bajos de apoptosis los mostraron los ratones Tam-RTT (Figura
21).
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52
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54
8.6 Determinación de los niveles de expresión de los genes C-Myc, Bax, Bcl-2 y
p21WAF1 en ratones transgénicos E6E7 (tg/0) y Tam-RTT
De acuerdo a los hallazgos relacionados con los niveles de proliferación celular y
apoptosis, se determinaron los niveles de expresión de genes relacionados a estos
procesos (Figura 22). Los resultados mostraron que el incremento en la expresión de C-
Myc se correlaciona directamente con el genotipo de cada cepa. La ausencia del receptor
RXRα en los ratones condicionales RXRα (Cvx L-/L-) indujo un aumento de la expresión
de este proto-oncogén. De manera similar, la expresión de E6 y de E7 aumentó aun más
la expresión de este gen. En el caso de los ratones Tam-RTT, los resultados sugieren que
ambas condiciones cooperaron para la sobre-expresión de C-Myc (Figura 22). Es
importante mencionar que en los ratones condicionales RXRα (Cvx L-/L-) la expresión de
Bcl-2 y p21WAF1 estaba disminuida, sugiriendo que la ausencia de RXRα puede conducir
tanto a un incremento en la proliferación celular como en la apoptosis en tejido cervical,
esto explicaría, al menos en parte, tanto la hiperproliferación del tejido cervical como la
presencia de atrofia en algunos ratones. También fue interesante el hecho de encontrar
un incremento en el mRNA de p21WAF1 en los ratones E6E7 (tg/0) y Tam-RTT; a pesar
de esta sobre-expresión, en estos ratones se observaron niveles disminuidos de
apoptosis.
Ocádiz-Delgado Rodolfo B. Tesis Dr. en C. 2012
55
Figura 22. Expresión relativa (RTqPCR) de genes involucrados en los procesos de proliferación celular y apoptosis en cérvix murino. El nivel de transcripción de un panel de genes seleccionados (C-Myc, p21WAF1, Bcl-2 y Bax) fue determinado utilizando primers específicos. RXRα (L2/L2): Ratones silvestres (Wild type); RXRα(Cvx L-/L-): ratones condicionales para RXRα tratados con Tam; E6E7 (tg/0): ratones transgénicos para E6E7/HPV16; RXRα (Cvx L-/L-)/E6E7 (tg/0): Tam-RTT. * : Estadísticamente significativo (P <0.05). Todos los datos fueron normalizados utilizando la expresión constitutiva del gen HPRT.
Ocádiz-Delgado Rodolfo B. Tesis Dr. en C. 2012
56
9 Discusión
Los retinoides son reguladores poderosos de la diferenciación epitelial y son
esenciales para su mantenimiento [French et al., 2000]. El epitelio cervical contiene dos
fenotipos epiteliales denominados: escamoso estratificado y columnar simple, los cuales
se unen en la zona denominada escamocolumnar o zona de transformación [Darwiche et
al., 1994]. Se han estudiado los niveles de expresión de los diferentes receptores al ácido
retinoico en epitelios cervicales, encontrándose que los receptores RXRα y RARβ son los
receptores que se expresan principalmente en este tejido [Darwiche et al., 1994]. A nivel
celular, los receptores RAR se expresan principalmente en las capas basales y
suprabasales mientras que los receptores RXR lo hacen en las células basales. Las
proteínas RXR son proteínas auxiliares que interaccionan con una amplia variedad de
receptores nucleares formando heterodímeros, por ejemplo con los receptores RAR
[Darwiche et al., 1994; Celli et al., 1996]. El hecho de que los RXR están localizados
principalmente en células basales y células columnares del cérvix, sugiere que estos
receptores juegan un papel central en la homeostasis epitelial, regulando, mediante
interacciones heterodiméricas, la diversidad generada en estas células que proliferan
rápidamente in vivo. Anteriormente, se ha reportado que la deficiencia de Vitamina A en
la dieta puede conducir a alteraciones en la homeostasis de los epitelios incluyendo el
cérvix. Existen modelos animales en los que se ha demostrado que la deficiencia de
Vitamina A puede inducir la aparición de metaplasia cervical, una condición que
usualmente precede a una neoplasia cervical [La Vecchia et al., 1988; Schneidar et al.,
1989; Slattery et al., 1990; Darwiche et al., 1993; Darwiche et al., 1994]. También se ha
reportado, por ejemplo, que la deficiencia en retinol puede contribuir al desarrollo de
lesiones intraepiteliales cervicales en mujeres inmuno-comprometidas [French et al.,
2000]. En conclusión, el estatus de los niveles de Vitamina A o de los receptores para sus
derivados, juega un papel central en el mantenimiento de las características del epitelio
cervical y glandular, y como tal, este estado de deficiencia puede considerarse como un
factor importante para el desarrollo de cáncer cervical.
Ocádiz-Delgado Rodolfo B. Tesis Dr. en C. 2012
57
9.1. La deleción del receptor RXRα incrementa los niveles de apoptosis en el
cérvix de ratones condicionales RXRα (Cvx L-/L-)
Previamente, habíamos reportado al realizar los estudios histológicos del cérvix de
ratones condicionales RXRα (Cvx L-/L-), que el epitelio cervical era más delgado que el
epitelio del cérvix de los ratones control, sugiriendo una condición similar a la atrofia
[Ocádiz-Delgado et al., 2008]. Aunque la deleción de RXRα incrementó los niveles de
proliferación celular (Figuras 13, 19 y 20) [Ocádiz-Delgado et al., 2008]), observamos un
incremento en la activación de la Caspasa 9 (Figura 21). Se ha demostrado que la
activación de la Caspasa 9 es un elemento clave durante la inducción de la apoptosis
mediante la vía intrínseca [Lagunas et al., 2010; Simoni y Tolomeo, 2001]. Estos
resultados sugieren que los niveles altos de apoptosis observados bajo esta condición,
evitan la hiperproliferación epitelial debido a una disminución en el número de capas
subrabasales, conduciendo a un fenotipo similar a la atrofia (Figuras 19-21) [Moss et al.,
1996; Zamolo et al., 2005; Zekarias et al., 2005; Simanainen et al., 2009; Shen y Toser,
2009].
9.2. La expresión de las oncoproteínas E6 y E7 del HPV-16 disminuyen los
niveles de apoptosis en cérvix de ratones transgénicos E6E7 (tg/0) y Tam-RTT
Diversos grupos han propuesto que p21WAF1 es un supresor de tumores y se ha
confirmado que la inactivación de esta proteínas mediada por E7 contribuye en forma
importante a la carcinogénesis cervical, al eliminar diversas señales reguladoras negativas
para el crecimiento celular [Funk et al., 1997; Jones et al., 1997; Shin et al., 2009].
Además, como ya se mencionó anteriormente la oncoproteína E6 tiene la capacidad de
inducir la degradación de p53 y de interferir con proteínas pro-apoptóticas como Bak,
FADD y procaspasa 8 [Ganguly y Parihar, 2009; Lagunas et al., 2010]. En conlusión, las
oncoproteínas E6 y E7 pueden inhibir o interferir en los mecanismos de regulación de la
muerte celular programada. Consistente con estas observaciones, en este trabajo
encontramos que la expresión de las oncoproteínas E6 y E7 inhiben los niveles de
apoptosis en el cérvix tanto de ratones transgénicos E6E7 (tg/0) y ratones triple
transgénicos tratados con Tamoxifén (Tam-RTT), sugiriendo que los mecanismos de
muerte celular programada se encuentran inhibidos en tejido cervical de estos ratones
(Figura 21). Por lo tanto, esta inhibición de la apoptosis pudiera estar cooperando con el
Ocádiz-Delgado Rodolfo B. Tesis Dr. en C. 2012
58
incremento en la proliferación celular inducida por la ausencia de RXRα en el cérvix de los
ratones Tam-RTT. Como se mencionó anteriormente, la proteína Bcl-2 promueve la
sobrevivencia celular, mientras que Bax promueve la muerte celular [Adams y Cory,
1998], de tal manera que la relación de expresión entre Bcl-2/Bax determina la
sobrevivencia o muerte después de un estímulo apoptótico [Liu et al., 2006]. Con base en
esto, la disminución en la relación Bcl-2/Bax observada después de la deleción de RXRα
podría incrementar en forma importante la muerte celular en los ratones condicionales
RXRα. Por otro lado, en ratones E6E7 (tg/0) se observó un aumento en la expresión de
Bcl-2 (antiapoptótico) lo que es acorde con los niveles de apoptosis disminuidos (Figura
22). A pesar de que la ausencia de RXRα induce una disminución de Bcl-2,
sorprendentemente, la expresión de E6 y de E7 fue suficiente para lograr un aumento en
el transcrito de este gen, disminuyendo drásticamente los niveles de muerte celular
programada, como se observa en los ratones Tam-RTT (Figura 22). En contraste, la
relación Bcl-2/Bax se incrementó en los ratones E6E7 (tg/0) y Tam-RTT, lo que explicaría,
al menos en parte, la disminución en los niveles de apoptosis, ya que este incremento fue
solamente del doble en comparación con los ratones RXRα mutantes, lo que difícilmente
explicaría la disminución tan marcada de los índices de apoptosis (Figura 21). Con base
en lo anterior, no es posible obtener una conclusión definitiva debido a que los niveles de
expresión de las proteínas Bcl-2 y Bax pudieran no correlacionar con lo niveles de los
respectivos mRNAs debido a la acción de las oncoproteínas E6 o E7 [Lagunas et al.,
2010; Liu et al., 2008]. En otras palabras, sería necesario establecer si los niveles de
expresión del RNA mensajero correlacionan positivamente con los niveles de las proteínas
Bcl-2 y Bax.
La inactivación de p53 mediada por E6 podría resultar en la sobre-expresión de Bcl-
2 y la regulación negativa de la expresión de Bax and Bak [Aguilar-Lemarroy et al., 2002;
Chakrabarti y Krishna, 2003; Magal et al., 2005; Asadurian et al., 2007; Graupner et al.,
2011; Lagunas et al., 2010;] (Figura 23), contribuyendo de esta manera a la proliferación
celular en el cérvix de los ratones E6E7 (tg/0) y Tam-RTT. Además de promover la
inactivación de p53, la oncoproteína E6 tiene la capacidad de bloquear la citólisis mediada
por TNF en fibroblastos de ratón [Duerksen-Hughes et al., 1999]. Por lo tanto, la
presencia continua de E6 es importante para la viabilidad de células tumorales HPV-
positivas. Por otra parte, la proteína E6 expresada ectópicamente ha sido asociada con la
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59
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60
inhibición de un amplio rango de diferentes reguladores pro-apoptóticos que pertenecen
tanto a la vía extrínseca (p. ej. CD95 o FADD) como a la vía intrínseca mitocondrial (p. ej.
Bax o Bak). También existe la posibilidad de que E6 active moléculas anti-apoptóticas
comunes a ambas vías como son las proteínas c-IAP2 y Bcl-2 [Lagunas et al., 2010; Vogt
et al., 2006; Filippova et al., 2004; Yuan et al., 2005] (Figura 23).
9.3. Los niveles de proliferación celular están incrementados en el epitelio
cervical de los ratones triple transgénicos Tam-RTT
El análisis de la proliferación celular mediante la detección del marcador PCNA,
reveló la presencia abundante de células en proliferación en todas las capas del epitelio
cervical estratificado de los ratones Tam-RTT, mientras que en los ratones silvestres la
señal sólo se detectó en la capa basal. En contraste, se observó un modesto incremento
en el índice de proliferación del tejido cervical de ratones condicionales RXRα (Cvx L-/L-)
mientras que sólo algunos ratones E6E7 (tg/0) mostraron un incremento en estos niveles
de proliferación (Figuras 19 y 20). Esta observación es consistente con los niveles altos
de expresión de PCNA reportados en queratinocitos que expresaban la proteína E7 [Jones
et al., 1997] así como también en muestras cervicales de pacientes positivas para HR-
HPVs [Branca et al., 2007]. Nuestros resultados sugieren que en los ratones Tam-RTT, la
deleción de RXRα y la expresión de E6 y E7 contribuyen en forma sinergística para
aumentar la proliferación celular y posiblemente alterar los mecanismos de diferenciación
terminal del epitelio cervical (Figura 23).
9.4. El biomarcador tumoral p16INK4A está incrementado en ratones
condicionales RXRα (Cvx L-/L-) y ratones Tam-RTT
La sobre-expresión del supresor tumoral p16INK4A está asociada con lesiones
precancerosas de alto grado así como con carcinomas del cérvix, también ha sido
demostrado que la evaluación inmunohistoquímica de esta proteína puede ser útil como
un biomarcador para identificar lesiones de alto grado infectadas con HR-HPVs
[Samarawardana et al., 2010]. La proteína p16INK4A bloquea la fosforilación de pRb
mediada por cdk4 y cdk6, resultando en la inhibición de la transcripción dependiente de
E2F y la progresión del ciclo celular en el punto de chequeo G1 a S [Samarawardana et
al., 2010; Zhang et al., 1999]. Durante la carcinogénesis cervical existe una activación de
Ocádiz-Delgado Rodolfo B. Tesis Dr. en C. 2012
61
E2F y la progresión del ciclo celular debido a la inactivación de pRb por E7 [Zhang et al.,
1999] (Figura 23). En este caso, es posible que la liberación de E2F induzca la activación
del promotor de p16INK4A. Interesantemente, la deleción del gen RXRα en el cérvix de los
ratones condicionales RXRα (Cvx L-/L-) indujo la sobre-expresión de la proteína p16INK4A
(Figura 18). Esto sugiere que la pérdida de este receptor podría estar incrementando la
liberación del factor de transcripción E2F y en consecuencia activando el promotor de
p16INK4A [McLaughlin-Drubin et al., 2008] o induciendo la reprogramación epigenética del
mismo [McLaughlin-Drubin et al., 2008; McLaughlin-Drubin et al., 2011] (Figura 23). Es
bien conocido que en la mayoría de los carcinomas cervicales, la sobre-expresión de
p16INK4A indica de manera indirecta una infección persistente con HR-HPV. De relevancia
en este contexto es la observación del aumento de la expresión de p16INK4A en las
lesiones cervicales presentes en los ratones Tam-RTT (Figura 19), lo cual sugiere que
esta cepa se comporta de manera similar a las infecciones persistentes con HR-HPV en
humanos. Se ha descrito que E7 se asocia e inactiva a E2F6 y Bmi1 (miembros del grupo
de represores transcripcionales “polycomb”), las cuales son represores transcripcionales
de p16INK4A [Trimarchi et al., 2001; Kim et al., 2007; Shin et al., 2009; McLaughlin-Drubin
et al., 2008; McLaughlin-Drubin et al., 2011]; las marcas represoras trimetilo en la lisina
27 de la histona 3 (H3), las cuales son necesarias para la unión del grupo represor
“polycomb”, están disminuidas en células que expresan E7 del HPV-16 y en lesiones
cervicales positivas al HPV. Esta disminución en la metilación de H3K27 es causada por la
inducción transcripcional de la desmetilasa KDM6B específica para H3-lisina-27. Esta
inducción de la expresión de p16INK4A es independiente de la inactivación de pRb y es
mediada por KDM6B [McLaughlin-Drubin et al., 2011]. Esto plantea la interesante
posibilidad de que la deleción de RXRα conduce a la inducción transcripcional de la
desmetilasa KDMB6, cooperando con la sobre-expresión de p16INK4A inducida por E7
(Figura 23).
9.5. Modificación de los niveles de expresión de un grupo de genes asociados
con carcinogénesis cervical
En el presente estudio, analizamos los niveles de expresión a nivel de mRNA de un
grupo de genes que están expresados diferencialmente durante los procesos de
proliferación celular y/o apoptosis, los cuales han sido asociados a la carcinogénesis
Ocádiz-Delgado Rodolfo B. Tesis Dr. en C. 2012
62
cervical. Por ejemplo, se observó un incremento en la expresión de C-Myc en el cérvix de
los ratones condicionales RXRα (Cvx L-/L-), E6E7 (tg/0) y Tam-RTT al compararlos con
los ratones silvestres (Figura 22). Ha sido reportado que los retinoides convierten a E2F
en un supresor transcripcional inhibiendo la transcripción de diferentes genes blanco
incluyendo a C-Myc [Lee et al., 1998] (Figura 23). Luego entonces, el incremento en los
niveles del mRNA de C-Myc mRNA después de la deleción de RXRα en epitelio cervical
puede ser parcialmente debido a la pérdida de la actividad represora de E2F y esto estar
asociado con una proliferación celular descontrolada principalmente en los ratones Tam-
RTT (Figura 23) [Baudino et al., 2003; Pelengaris y Khan, 2003; Secombe et al., 2004;
O’Donell et al., 2005].
Por otro lado, se ha demostrado que la proteína p21WAF1 induce el arresto celular
en G1 mediante la inhibición de cinasas dependientes de ciclinas (CDKs) y se ha
identificado como uno de los genes normalmente activados por la proteína p53 [el-Deiry
et al., 1993; Li et al., 1994]. La represión transcripcional de p21WAF1 observada después
de la eliminación de RXRα (Figura 22), puede explicar al menos en parte el incremento
de la proliferación celular en los ratones condicionales RXRα (Cvx L-/L-), sugiriendo que
la señalización de RXRα es crucial para la regulación negativa del ciclo celular y por lo
tanto para mantener la homeostasis cervical. La oncoproteína E7 puede anular la
inhibición mediada por p21WAF1 de la actividad de CDKs y la síntesis de DNA
dependiente de PCNA [Funk et al., 1997; Shin et al., 2009]. La relación entre E7 y
p21WAF1 es paradójica ya que E7 causa un incremento en los niveles de la proteína
p21WAF1 en humanos y en tejidos/células de ratón [Jones et al., 1997; Balsitis et al.,
2005; Shin et al., 2009] y al mismo tiempo E7 puede inactivar a p21WAF1 [Funk et al.,
1997; Jones et al., 1997; Shin et al., 2009]. Acorde con esto, p21WAF1 está sobre-
expresado en los ratones Tam-RTT debido probablemente a la expresión de la
oncoproteína E7. Estos resultados sugieren que, en el modelo de ratones triple
transgénicos tratados con Tamoxifén, la deleción de RXRα junto con la expresión de E6 y
E7 cooperativamente incrementan la frecuencia de lesiones pre-malignas y malignas
inactivando la función supresora de tumor de p21WAF1 e induciendo la carcinogénesis
cervical (Figura 23).
Ocádiz-Delgado Rodolfo B. Tesis Dr. en C. 2012
63
9.6 Posible mecanismo molecular de la carcinogénesis cervical en ratones
triple transgénicos RXRα (Cvx L2/L2)/E6E7 (tg/0)
Con base en los resultados obtenidos a lo largo de este trabajo, proponemos el siguiente
mecanismo molecular simplificado de la carcinogénesis cervical en ratones triple
transgénicos RXRα (Cvx L2/L2)/E6E7 (tg/0) (Figura 24):
a) La deleción del receptor RXRα incrementa la liberación del factor de transcripción E2F
y en consecuencia se activa el promotor de p16INK4A , además, probablemente induce la
reprogramación epigenética del mismo; por ejemplo, la deleción de RXRα conduce a la
inducción transcripcional de la desmetilasa KDMB6 así como la sobreexpresión de las
Ciclinas D1, E/A y de cdc2. Por otro lado, la ausencia de este receptor induce la pérdida
de la actividad represora de E2F y a su vez, se incrementa la expresión de C-Myc, un
proto-oncogén que tiene la capacidad de inhibir la función de p21WAF1 y por lo tanto
está fuertemente relacionado con la proliferación celular descontrolada y el desarrollo de
cáncer cervicouterino. Además, la deleción de RXRa permite la liberación del complejo
represor que incluye a histona-desacetilasas (HDAC) lo que permite que permanezca la
acetilación de histonas y el reclutamiento de la maquinaria de transcripción de cientos de
genes (Figura 24).
b) La oncoproteína E6 promueve la destrucción de p53 lo que resulta en la sobre-
expresión de Bcl-2 (anti-apoptótica) y la regulación negativa de la expresión de Bax and
Bak (pro-apoptótica). Además, E6 promueve la inhibición de un amplio rango de
diferentes reguladores pro-apoptóticos que pertenecen a la vía extrínseca como TRAIL,
CD95 o FADD como a la vía intrínseca mitocondrial (p. ej. Bax o Bak). E6 también activa
moléculas anti-apoptóticas comunes a ambas vías como son las proteínas c-IAP2 y
Survivina las cuales inhiben a su vez la formación del apoptosoma (compuesto por Apaf-1
y Caspasa 9 activada). Además, E6 tiene la capacidad de bloquear la citólisis mediada por
TNF. Todo lo anterior conduce a la disminución o inhibición de los mecanismos de
apoptosis; por lo tanto, la presencia continua de E6 es importante para la viabilidad de
células tumorales HPV-positivas (Figura 24).
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c) La oncoproteína E7 activa al factor de transcripción E2F y promueve la progresión del
ciclo celular debido a la inactivación de pRb. La liberación de E2F induce la activación del
promotor de p16INK4A. Además, la oncoproteína E7 puede anular la inhibición mediada por
p21WAF1 de la actividad de CDKs y la síntesis de DNA dependiente de PCNA. E7 tiene la
capacidad de disminuir la inducción transcripcional de la desmetilasa KDM6B específica
para H3-lisina-27, las cuales son necesarias para la unión del grupo represor “polycomb”.
Esto promueve un aumento de la expresión de p16INK4A en forma independiente de la
inactivación de pRb. Finalmente, E7 tiene la capacidad de incrementar la actividad de
Histona-acetil-transferasas lo que promueve un incremento en la expresión de genes
relacionados con la proliferación celular.
d) Finalmente, la deleción de RXRα y la expresión de E6 y E7 contribuyen en forma
sinergística para aumentar la proliferación celular y posiblemente alterar los mecanismos
de diferenciación terminal del epitelio cervical, esto conduce a un incremento en la
frecuencia de lesiones pre-malignas y malignas en el tejido cervical de ratones RXRα (Cvx
L2/L2)/E6E7 (tg/0) (Figuras 23 y 24).
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9.7 Consideraciones finales
El estudio del ratón Tam-RTT nos ha permitido proponer un mecanismo molecular de la
carcinogénesis cervical en ratones triple transgénicos RXRα (Cvx L2/L2)/E6E7 (tg/0). Una
vez que los oncogenes E6 y E7 son expresados y el receptor RXRα es deletado, los
subsecuentes eventos que pueden suceder son: 1) La deleción de RXRα induce la
proliferación celular del epitelio cervical, bloquea los mecanismos de diferenciación y
facilita la transformación celular; 2) Las oncoproteínas E6 y E7 pueden cooperar en la
inducción e incremento de la supervivencia celular y el aumento en los niveles de
proliferación celular (Figura 24). En resumen, se propone que el desarrollo de lesiones
malignas cervicales en ratones Tam-RTT es inducido por la alteración de diferentes
mecanismos de control celular. Finalmente, este modelo murino será útil para el estudio
molecular del Cáncer Cervicouterino.
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10 CONCLUSIONES
• El principal hallazgo de este trabajo fue la detección de carcinoma in situ (61%) e
invasor (11%) en el cérvix de los ratones Tam-RTT, sugiriendo que la ausencia del
receptor RXRα acoplada con la expresión de las oncoproteínas virales E6 y E7 están
contribuyendo a la carcinogénesis.
• Este modelo será útil para identificar cofactores involucrados en la génesis del cáncer
cervical.
• El uso de ratones condicionales para el receptor a retinoides que expresan E6E7 del
HPV16 puede ayudar a identificar biomarcadores tumorales tempranos para el
diagnóstico molecular del Cáncer Cervicouterino.
• Nuestros hallazgos sugieren que la inducción de cáncer cervical en los ratones RTT
tratados con Tam puede ser un modelo valioso para el estudio del cáncer
cervicouterino.
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11 PERSPECTIVAS
En este estudio hemos demostrado que la deleción de RXRα y la expresión de E6 y
E7 contribuyen en forma sinergística en el desarrollo de lesiones pre-malignas y malignas
en el tejido cervical de ratones RXRα (Cvx L2/L2)/E6E7 (tg/0). Además, pudimos
establecer los niveles de muerte celular programada (apoptosis) en el cérvix de estos
ratones, así como estudiar la expresión de algunos genes relacionados con proliferación
celular y apoptosis.
Dado que este modelo murino presenta diversas caracterísiticas similares a lo
descrito en pacientes con CaCu y con el propósito de caracterizar en forma más completa
los modelos murinos incluidos en este estudio, sería interesante:
a) Confirmar si la deleción del receptor RXRα induce la reprogramación epigenética del
ratón triple transgénico; por ejemplo, determinar si los patrones de metilación de
ciertos promotores han sido alterados.
b) Determinar los niveles de actividad de desmetilasas de histonas, de acetil-
transferasas de histonas y desacetilasas de histonas.
c) Confirmar si la vía extrínseca de la apoptosis se encuentra alterada.
Este modelo murino triple transgénico podría ser útil para el estudio de la
carcinogénesis cervical lo que permitirá, entre otras cosas, establecer a nivel molecular el
papel de los oncogenes virales durante etapas tempranas de la carcinogénesis cervical.
Además, permitirá la identificación de moléculas blanco de estas proteínas y establecer
patrones y/o vías de señalización relacionadas con la transformación maligna celular así
como estudios relacionados con la inestabilidad genómica. Este modelo también ofrece la
oportunidad de estudiar la inmunobiología del cáncer lo que permitirá desarrollar
estrategias y vacunas terapéuticas.
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13 PRODUCCIÓN CIENTÍFICA DERIVADA DE ESTE TRABAJO
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RXRa deletion and E6E7 oncogene expression are sufficient to induce cervicalmalignant lesions in vivo
Rodolfo Ocadiz-Delgado a,b, Eduardo Castañeda-Saucedo c,1, Arup K. Indra c,g,2, Rogelio Hernandez-Pando d,Pedro Flores-Guizar a, Jose Luis Cruz-Colin a, Felix Recillas-Targa e, Guillermo Perez-Ishiwara b,Luis Covarrubias f, Patricio Gariglio a,⇑a Dept. of Genetics & Molecular Biology, Centro de Investigacion y de Estudios Avanzados del IPN (CINVESTAV-IPN). Av. IPN 2508, Col. San Pedro Zacatenco, 07360. Mexico, DF, Mexicob Molecular Biomedicine, PIBioM, Escuela Nacional de Medicina y Homeopatia-IPN. Guillermo Massieu Helguera 239 Fracc. La Escalera-Ticoman. Mexico, DF, Mexicoc Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire (IGBMC), Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS), Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale(INSERM), Université Louis Pasteur, Illkirch-Cedex, Strasbourg, Franced Dept. of Pathology, Instituto Nacional de Ciencias Medicas y Nutricion Salvador Zubiran (INCMNSZ). Vasco de Quiroga 15, Col. Seccion XVI, Tlalpan, 14000. Mexico, D.F., Mexicoe Departamento de Genética Molecular, Instituto de Fisiología Celular, Universidad Nacional Autónoma de México, Mexicof Institute of Biotechnology, Universidad Nacional Autónoma de México, Mexicog Department of Dermatology, Oregon Health and Science University, Portland, OR 97239, USA
a r t i c l e i n f o
Article history:Received 13 July 2011Received in revised form 23 November 2011Accepted 23 November 2011
Keywords:E6E7HPVRetinoid receptorCervical cancerMurine models
a b s t r a c t
Cervical cancer is the second leading cause of cancer deaths among women worldwide. High-Risk-HumanPapillomaviruses (HR-HPVs) play an important etiologic role in the development of carcinoma of theuterine cervix. However, host factors are important in determining the outcome of genital HPV infectionas most cervical precancerous lesions containing HR-HPVs do not progress to invasive carcinomas. Ret-inoids, acting through nuclear receptors (RARs, RXRs), play a crucial role in cervix development andhomeostasis regulating growth and differentiation of a wide variety of cell types; indeed, they can inhibitcell proliferation, and induce cell differentiation or apoptotic cell death. Here we introduce a mousemodel that develops spontaneously malignant cervical lesions allowing the study of the cooperativeeffect between HPV16E6E7 expression and the lack of RXRa in cervical cancer development. This modelcould be useful to study multistep carcinogenesis of uterine cervix tissue and might improve chemopre-ventive and chemotherapeutic strategies for this neoplasia.
� 2011 Elsevier Ireland Ltd. All rights reserved.
1. Introduction
Cancer development commonly takes decades to arise, and fol-lows a progressive histopathological pattern that involves acquisi-tion of multiple genetic and epigenetic changes, which are relatedto alterations in gene expression profiles. In addition, external fac-tors such as viral infection can cooperate in the development ofcancer. A subset of anogenital human papillomaviruses (HPVs),the high-risk HPVs (HR-HPVs), is associated with malignant
tumors, including the majority of cervical cancers [1–3]. Cervicalcancer is the second most common type of malignant lesion amongwomen, with elevated mortality rates despite the increasedscreening efforts [4]. Prevention has recently been performed byprophylactic vaccines against the most abundant mucosal HR-and low-risk HPV types. However, the potential clinical benefit ofprophylactic vaccines will not be apparent for several decades. Inaddition, due to their high cost, these vaccines have not beenwidely used in countries with the highest incidence of HR-HPVs-associated cancers. On the other hand, no HR-HPV specific antiviraltreatments or therapeutic vaccines are currently available [5].
HR-HPV-associated cervical carcinogenesis is a multistep pro-cess, in which persistently infected cells develop first into precan-cerous lesions known as cervical intraepithelial neoplasia (CIN) [4].A small percentage of these lesions (approximately 3%) progress tocervical carcinomas with more than half of them attributed toinfection with HPV16 [3,6,7]. In HR-HPV associated cancers, E6and E7 oncogenes target critical regulators of several cellular pro-cesses, resulting in alterations such as acquisition of unlimited pro-liferative potential, growth factor independence, evasion of
0304-3835/$ - see front matter � 2011 Elsevier Ireland Ltd. All rights reserved.doi:10.1016/j.canlet.2011.11.031
⇑ Corresponding author. Address: Department of Genetics and Molecular Biology,Centro de Investigación y de Estudios Avanzados del IPN, Av. IPN 2508. Colonia SanPedro Zacatenco, CP 07360, Mexico DF, Mexico. Tel.: +52 55 57 47 3337; fax: +52 5557 47 3931.
E-mail addresses: [email protected], [email protected] (P. Gariglio).1 Present address: Cancer Cell Biology Laboratory, UACQB, Chilpancingo, Gro.,
Mexico.2 Present address: Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy,
OSU; Member, Environmental Health Science Center, OSU, Corvallis, OR 97331; Dept.of Dermatology, OHSU; Member, Knight Cancer Institute, OHSU, Portland, OR 97239,USA.
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Cancer Letters
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apoptosis, lack of sensitivity to cytostatic signals, induction ofinvasive and metastatic properties, and sustained angiogenesis[8–14]. It has been demonstrated that the E6 and E7 oncoproteinsact as potent mitotic mutators, thereby increasing the probabilityof acquiring cellular mutations that contribute to carcinogenic pro-gression during each round of cell division [5]. E6 proteins fromHR-HPVs target the tumor suppressor p53 for degradation, pre-venting cell growth inhibition in both undifferentiated and differ-entiated cells. HPV E7 protein binds to Rb family members andtargets them for degradation. This results in the release and activa-tion of E2F transcription factors that drive expression of S phasegenes [2,5,15–19]. In addition, the in vivo properties of HR-HPVE6 and E7 oncoproteins have been evaluated through the genera-tion and characterization of HPV transgenic mice strains [20–25].
Most cervical precancerous lesions containing HR-HPVs do notprogress to invasive carcinomas, implicating that both genetic (cel-lular oncogenes or tumor suppressor gene mutations) and environ-mental cofactors (low dietary micronutrients such as vitamin A,chronic estrogen intake or other epigenetic regulators) could coop-erate in those cases where cancer progression occurs [2,26–29].
Retinoid-induced differentiation is a cellular response that maybe crucial for protection against cancer development. However,investigation of this process has so far been restricted to culturedcells [30–33] or to a few murine models that have been manipu-lated to conditionally delete RXRa in epidermal keratinocytesof adult mice [34,35]. In this conditional mouse model [RXRa(L-/L-)], temporally controlled epithelia-specific somatic mutagen-esis of RXRa alleles results in severe skin abnormalities includingalopecia, hyperproliferation, skin inflammatory reaction and aber-rant terminal differentiation [36,37]. Moreover, in the same model,RXRa ablation was also demonstrated in cervical epithelial cells ofadult mice, resulting in a simultaneous increase of cell prolifera-tion and apoptosis levels accompanied by alteration in the expres-sion of genes involved in both processes [38].
In order to investigate the role of HR-HPV oncogene expressionin early cervical lesions in vivo, we produced a transgenic mouseexpressing HPV16 E6 and E7 oncogenes from the promoter of thebovine keratin 6 gene [E6E7 (tg/0)]. These transgenic mice displaya fur phenotype characterized by lower hair density and the abilityto regenerate hair much faster than wild-type mice due to theinability to establish a resting telogen phase of hair follicle growthcycle [39], as well as tongue focal epithelial hyperplasia [40]. Thesemice also show a significantly higher number of putative epider-mal stem cells as compared to wild-type mice, contributing to afaster wound re-epithelization [20]. Interestingly, these E6E7(tg/0) mice showed low frequency of moderate and severe dyspla-sia (manuscript in preparation).
To study the possible cooperative effect between RXRa ablationand E6E7 expression to induce cervical malignant lesions, we pro-duced a Triple Transgenic Mouse [TTM: RXRa-null conditional,expressing HPV16 E6E7 oncogenes; RXRa (Cvx L2/L2)/E6E7 (tg/0)]. Here we introduce a mouse model that, after RXRa ablation[RXRa (Cvx L-/L-)/E6E7 (tg/0)], develops spontaneously malignantcervical lesions allowing the study of the cooperative effectbetween HPV16E6E7 expression and the lack of RXRa in cervicalcancer development.
2. Materials and methods
2.1. Generation of Tam-treated RXRa (L2/L2) [RXRa (Cvx L-/L-)], RXRa (Cvx L2/L2)/E6E7(tg/0) mice (TTM) and Tam-treated RXRa (Cvx L-/L-)/E6E7 (tg/0) mice (Tam-TTM)
To carry out the conditional disruption of the RXRa gene in mouse cervical epi-thelia, the RXRa (L2/L2) conditional mouse line was constructed [35], in which theexon 4 is loxP-flanked (floxed) [36]. The generation of this floxed RXRa mouse lineand genotyping using tail DNA have been described previously [35,41–43]. RXRa(L2/L2) conditional mice were Tam-treated as described previously [38] in order
to generate RXRa (L-L-) mice. Three breeding pairs of RXRa (Cvx L2/L2) (C57BL/6xSJL strain) [44] and E6E7 (tg/0) (CD-1 strain) [39,40] mice were bred to producemultiple breeding pairs of RXRa (Cvx L2/L2)/E6E7 (tg/0) (TTM) mice. The geneticbackground of the line was mainly CD-1 strain (Fig. 1A). Mice were weaned at21 days of age and fed with a fixed formula-autoclavable diet designed to supportgestation, lactation, and growth of rodents (Teklad Global 18% Protein Rodent Diet;Harlan Teklad, Indianapolis, IN, USA). Animals were singly housed and kept under
Fig. 1. (A) Representative images of untreated (-Tam) and Tam-treated (+Tam)RXRa (Cvx L-/L-)/E6E7 (tg/0) (Tam-TTM) mice. Tam-treated TTM showed smallersize and severe alopecia in comparison with untreated mice. (B) Evidence of floxedRXRa allele recombination (L-) after Tam treatment and presence of E6E7 transgenein mice strains included in this study. In order to confirm in situ analyses, we haveperformed traditional liquid phase PCR. Tail DNA was genotyped by PCR asdescribed in Materials and Methods. The specific amplification products for RXRa orE6/E7 genes were separated by agarose gel electrophoresis and visualized byethidium bromide staining. Cre-dependent recombination produces a null allele(L-) in Tam-treated RXRa (Cvx L-/L-) and Tam-treated RXRa (Cvx L-/L-)/E6E7 (tg/0)(Tam-TTM) mice. As expected, E6E7 transgene was detected only in E6E7 (tg0) andTam-TTM mice. p21/WAF1: gene was used as amplification control to ensure theintegrity of genomic DNA samples. (C) Tissue-specific RXRa gene ablation andefficient E6E7 oncogene expression. RXRa (PCR) panel: Detection of RXRa deletionby in situ PCR. Arrows indicate intense nuclear signal only in normal cervicalepithelium (Open arrows) and stroma (Solid arrows) as indicated under Materialsand Methods section. RXRa (RT-PCR) panel: Abrogation of RXRa mRNA productionafter RXRa gene ablation in cervix of mutant mice demonstrated by in situ RT-PCR.RXRa transcripts are present only in Tam-untreated epithelial cells (open arrows).As expected, no signal was detected for either RXRa gene (in situ PCR) or transcript(in situ RT-PCR) in epithelium of Tam-treated RXRa (Cvx L-/L-) and Tam-TTM mice.E6E7 (PCR) panel: in situ PCR for the detection of the E6E7 transgene. Open arrowsindicate intense nuclear signal in E6E7 (tg/0) animals. E6E7 (RT-PCR) panel: E6E7mRNA detection in cervix of transgenic mice and Tam-TTM demonstrated by in situRT-PCR. E6E7 transgene and corresponding mRNA was detected only in cervix ofE6E7 (tg/0) and Tam-TTM mice. BM: Basal Membrane. Magnification: 40X. Insets:80 X. RXRa (L2/L2): Wild type mice; RXRa (Cvx L-/L-): Tam-treated RXRaconditional mice; E6E7 (tg/0): E6E7/HPV16 transgenic mice; RXRa (Cvx L-/L-)/E6E7 (tg/0): Tam-TTM. Scale bar, 50 lm.
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constant day-night (lights on 0630-1830) conditions. Four to six weeks-old micewere i.p.-injected with either vehicle (ethanol) or 0.1 mg Tamoxifen (Tam) perday for five consecutive days [35,38]. RXRa conditional animals without Tam treat-ment or Tam-treated Wild Type [RXRa (L2/L2); no Cre] animals were used as con-trols. Animals were sacrificed at least 21–23 weeks after Tam-treatment. All animalexperiments were performed in compliance with the relevant laws and institu-tional guidelines and were approved by local animal ethics committee (UPEAL-CINVESTAV-IPN, Mexico; NOM-062-ZOO-1999).
2.2. Genotyping of the RXRa alleles
Genomic DNA was isolated as described [44]. To identify the recombined RXRaalleles, PCR was performed with primer ZO243 (50-TCCTTCACCAAGCACATCTG-30)(located in intron 3) and 30-primer ZO244 (50-TGCAGCCCTCACAACTGTAT-30)(located in exon 4). These primers amplified Wild type (Wt) and L2 alleles(650 bp and 700 bp fragments, respectively [38]. UD196 primer (50-CAACCTGGACTTGTCACTTAG-30 is located in the intron 4 between Exon 4 and 5; thisallele was used as in situ PCR amplification control [38] and for liquid phase PCR(Fig. 1B). To verify the excision efficiency of floxed RXRa alleles in cervical epithe-lium, PCR amplification was carried out in a buffer containing 10 mM Tris–HCl (pH8.0), 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 0.2 mM dNTPs, 0.25 lM of each primer, and 2 unitsof Taq polymerase (Invitrogen, USA) using 1 lg of genomic DNA as template. After35 cycles (30 s at 94 �C, 30 s at 59 �C and 30 s at 72 �C) the products were analyzedon ethidium bromide-stained 2.5% agarose gels [38]. In all genotyping experimentsit was included the amplification of a constitutive DNA sequence to ensure theintegrity of genomic DNA samples (e.g. p21/WAF1 gene).
2.3. Genotyping of the E6E7 alleles
To identify the E6E7 alleles, both, liquid-phase PCR and in situ PCR were per-formed using E6E7 specific primers as previously described [40,45] (Fig. 1B).
2.4. Cervical tissue samples
Cervical tissue from mutant and control mice was dissected, fixed and paraffin-embedded as described elsewhere [46,47]. Briefly, mice were anesthetized with2.5% Avertin and perfused through the aorta with 3.75% paraformaldehyde. Theentire reproductive tract including parametrial, retroperitoneal soft tissue andlymph nodes were dissected, placed in an embedding cassette (Fisher, USA) withone sponge for compression, and postfixed in 3.75% paraformaldehyde overnightat 4 �C. In-cassette postfixation produced a linear reproductive tract facilitating
subsequent sectioning of the entire organ in one plane [47]. The posterior vaginalwall was removed leaving an intact rim of vulvar tissue, and a 3–5 mm end pieceof plastic pipette tip was inserted into the vagina to keep it open during subsequentprocessing steps. Tissues were washed in 1X PBS, and dehydrated through gradedalcohols and xylene. After pipette tip removal, the reproductive tract was embed-ded with the cut vaginal wall surface oriented downward. The entire reproductivetract was serially sectioned (5 lm/section), and 10–15 sections were collected at75 lm intervals for Hematoxylin staining, immunohistochemistry, in situ PCR andin situ RT-PCR. Five-micrometers-thick longitudinal sections were mounted oncharged slides. All female mice were synchronized by exposure to the odor of amale, or to its urine (‘‘Whitten effect’’) [48]. Animals were sacrificed in estrousphase.
2.5. Histological analysis
For each specimen, 5-micron-thick histological sections were obtained to pre-pare distinct slides for light microscopy. The specimens stained with hematoxylinwere evaluated by a pathologist. The histological criteria determined by the WHOwere strictly followed in the analysis of the murine uterine cervix. The samplesanalyzed were obtained from: Wild type mice RXRa (L2/L2); Tam-treated RXRaconditional mice [RXRa (Cvx L-/L-)]; E6E7/HPV16 transgenic mice [E6E7 (tg/0)]and Tam-treated TTM [RXRa (Cvx L-/L-)/E6E7 (tg/0); Tam-TTM]. No defects ormolecular alterations were observed in Wild type animals that received Tamoxifenor in Tam-untreated RXRa (L2/L2) animals.
2.6. Immunohistochemistry
Sections were deparaffinized and rehydrated as described previously [38,46].Protein detection was performed using the Mouse/Rabbit PolyDetector HRP/DABDetection System (Bio SB, USA). Briefly, tissues were rinsed in PBS and epitoperetrieval was performed in a pressure cooker (121 �C, 20 lb of pressure) using theImmunoRetriever Citrate Solution (Bio SB, USA) during 15 min. Slides were cooledat room temperature (30 min) and tissues were treated for 1 min with PolyDetectorPeroxidase Block quenching buffer (Bio SB, USA). After three washes in PBS, sectionswere incubated 12–16 h at 4 �C with following primary antibodies: PCNA (cell pro-liferation marker) or HPV16 E6/HPV18 E6 (C1P5), mouse monoclonal antibody orp16INK4A (Santa Cruz Biotechnology, USA) or Cleaved Caspase 9 (apoptosis marker;Cell Signaling, USA) following manufacturer’s recommended protocol. Followingfour washes in PBS, slides were incubated for 30 min with a secondary antibody(PolyDetector HRP label; Bio SB, USA). After three washes in PBS, sections were
Fig. 1 (continued)
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incubated with appropriate substrate (PolyDetector DAB chromogen; Bio SB, USA),counterstained with hematoxylin and mounted in GVA-mount reagent (Zymed,USA). Negative controls included omission of primary antibody.
2.7. Apoptosis detection (TUNEL)
DNA fragmentation was assessed by TUNEL [49] according to the specificationsof the manufacturer (Roche, USA). Briefly, paraffin tissue sections mounted oncharged slides (5 lm thick) were deparaffinized with xylol, rehydrated and thendeproteinated for 15 min (0.5 lg/mL Proteinase K in PBS), washed and dehydratedagain. To avoid artificial DNA fragmentation, only nuclease-free solutions were usedduring the whole procedure. The labeling of 30-OH ends of fragmented DNA wasperformed by incubation with fluorescein-dUTP using 12.5 U terminal deoxynu-cleotidyl transferase (TdT) for 1 h at 37 �C in a humidified chamber. As positive con-trol, normal cervical tissue pre-treated with DNase I (4 U/tissue, 10 min at roomtemperature; Roche, USA) displayed nuclear positive reactivity in the majority ofcells, demonstrating the incorporation of the fluorescent nucleotide at 30-OH endsto the fragmented DNA. To estimate non-specific binding and autofluorescence,negative controls were included in all assays where tissue sections were incubatedwithout the TdT enzyme. Slides were analyzed by fluorescence microscopy with awide-band excitation barrier filter suitable for analyzing green (fluorescein labeledfragmented DNA) fluorescence. Three independent observers selected differentoptical fields in a random manner to determine the percentage of TUNEL positivestaining in at least 500 cells for each sample. In addition, immunohistochemicaldetection of Cleaved Caspase 9 was performed as an apoptosis marker (see abovein Section 2.6).
2.8. In situ PCR
In order to demonstrate: first, that RXRa gene, as well as the correspondingtranscript, was ablated specifically in cervical epithelia of Tam-treated RXRa (CvxL-/L-) mice and Tam-TTM and, second, that E6E7 transgene was present and thecorresponding transcript was expressed in cervical epithelial cells of E6E7 (tg/0)mice and Tam-TTM, we decided to use both in situ PCR and in situ RT-PCR. Thesetechniques combine the extreme sensitivity of PCR with the cell localizing abilitysimilar to in situ hybridization and allow comparing epithelia with stroma. Directin situ PCR was performed as previously described with some modifications[38,40,50]. Briefly, dried dewaxed sections on sylanecoated slides were incubatedwith protein lysis buffer (0.1 M Tris–HCl pH 8.0, 50 mM EDTA pH 8.0) containing0.5 lg/ml Proteinase K for 30 min at room temperature. After thoroughly washingwith DEPC-treated water, 50 ll of the PCR master mix solution containing digoxi-genin-11-(20-deoxy-uridine-50)-triphosphate (DIG-11-dUTP; Roche, USA), wereadded. To reduce primer-dimer formation the PCR solution was heated to 70 �Cfor 10 min before Taq DNA polymerase (5 U per reaction) was added. Negative con-trols were made without primers or Taq. In situ PCR was performed using the sys-tem provided by Perkin Elmer (USA). The slides were preheated to 70 �C on theassembly tool included in the in situ Perkin Elmer equipment, 50 ll PCR mastermix was added to each sample and the reaction was sealed using AmpliCover discsand clips (Perkin Elmer, USA). After assembly, slides were placed at 70 �C in theGeneAmp In situ PCR system 1000 (Perkin Elmer, USA) until running was started.PCR amplification was performed running 18 cycles as described previously[38,40]. Same primers were used for in situ amplification and Real Time analysis.After cycling was completed, the temperature was kept at 4 �C until disassembly.Clips were removed and AmpliCover discs were very carefully lifted from the slideswithout moving them sideways and slides were washed for 5 min in PBS followedby 5 min in 100% EtOH before they were air dried.
2.9. In situ RT-PCR
After Proteinase K digestion (see above), tissues were treated with 1 U/sampleof DNase I, RNase-free (Roche, USA) during 48 h at room temperature. After thor-oughly washing with DEPC-treated water, reverse transcription was performedusing the SuperScript II reverse transcriptase (Invitrogen, USA), following the man-ufacturer’s specifications. In brief, 70 ll DEPC-treated water containing 2.5 lg oli-go(dT)12-18, 10 mM dNTP mix (10 mM each dATP, dGTP, dCTP and dTTP at neutralpH), 5X first-strand buffer, 0.1 M DTT, recombinant ribonuclease inhibitor (40 U/ll) and reverse transcriptase (100 U/section) (Invitrogen, USA) were added to eachsection. Slides were incubated at 42 �C for 1 h in a sealed humidified chamber. Afterthorough washes, direct in situ PCR was performed using specific primers as de-scribed previously [38,40]. Negative controls included substituting one of the prim-ers by H2O in the PCR reaction or omission of the reverse transcription reaction.
2.10. Detection of in situ PCR products
An indirect immunolabeling method using a primary Anti-Digoxigenin antibody(Fab fragments; Roche, USA) conjugated to alkaline phosphatase was chosen todetect the PCR product. Briefly, blocking was carried out in 5% BSA (Sigma, USA)in PBS for 30 min. Slides were then drained and an Anti-DIG antibody diluted1:200 in 100 mM Tris–HCl pH 7.4 and 150 mM NaCl, was applied (100 ll per
sample) for 2 h at room temperature. As a negative control the primary antibodywas omitted. Detection of alkaline phosphatase was carried out for 10–30 minusing NBT/BCIP kit (Zymed, USA). After detection, slides were rinsed in distilledwater for 5 min and air dried before mounting in Permount histological mountingmedium (Fisher Scientific, USA).
2.11. Digital image capture, analysis and quantification
All photomicrographs were obtained using a DFC290 HD digital camera (LeicaMicrosystems, USA). The following method of quantification was used for immuno-histochemical analyses. After acquisition of digital images, the experimental imagefiles were opened in the PhotoImpact software (Ulead PhotoImpact SE version 3.02;Ulead Systems, USA). The images were digitally processed in order to obtain thebetter and homogeneous signal and then selected for analysis of relevant regions(cervical epithelium). The selected regions were then digitally analyzed using theImage-ProPlus Analysis Software (Ver 4.5.0.19, Media Cybernetics, Inc., USA). Theamount of signal staining was quantified by calculating it as a pixel matrix data(the color contained within a pixel inside an image at specific location). Therefore,chromogen quantity was determined by calculating the norm of the matrix file forthat image. This allows pixels of similar ‘‘color’’ immediately adjacent to the indexpixel to be included for analysis. All pixels falling within the threshold parametersselected were quantified, recorded and used to generate a graphic. The file for thecontrol image is generated similarly: the control slide is acquired and treated iden-tically as the experimental slide except that negative controls were included (seeabove).
2.12. RNA isolation
Total RNA was isolated from cervical tissue obtained from mutant and controlmice using TRIzol reagent according to the manufacturer’s instructions (Invitrogen,USA). Tissues were obtained from female mice and stored at �80 �C. The quality ofthe total RNAs was examined by denaturing agarose gel electrophoresis and stain-ing with ethidium bromide, and the 18S and 28S RNA bands were visualized by UVillumination. The concentrations of total RNA were quantified spectrophotometri-cally. The RNA preparations were used for quantitative Real-Time PCR (RTqPCR).
2.13. Preparation of cDNA for quantitative Real-Time PCR (RTqPCR)
Three micrograms of total RNA were reverse transcribed in a 20 ll reaction. Thereaction mixture consisted of 5X first strand buffer [250 mM Tris–HCl (pH 8.3),375 mM KCl, and 15 mM MgCl2], 0.5 mM dNTPs, 5 mM dithiothreitol, 15 U RNaseInhibitor (Invitrogen, USA), 2.5 lg oligo(dT)12-18, and 100 U SuperScript II ReverseTranscriptase, following the manufacturer’s specifications (Invitrogen, USA).
2.14. Relative mRNA quantification by RTqPCR
The relative quantification of the investigated mRNAs by RTqPCR was per-formed using a 7300 Real Time PCR System (Applied Biosystems, USA). Oligonucleo-tide primers were designed to be intron spanning and were purchased fromInvitrogen, USA [38]. Sequences were obtained from the GenBank database. Opti-mal PCR reaction for all investigated genes was established using the SYBR GreenPCR Master Mix (Applied Biosystems, USA) according to the manufacturer’s instruc-tions; annealing temperatures and MgCl2 concentrations were optimized to create aone-peak melting curve. Additionally, the amplicons were checked by agarose gelelectrophoresis for a single band of the expected size. PCRs were processed through40 cycles of a 3-step PCR, including 10 s of denaturation at 95 �C, a 10-s primerdependent annealing phase (60 �C), and a 10 s template-dependent elongation at72 �C. A 25 ll reaction consisted of 12.5 ll SYBR Green PCR Master Mix containing:Taq DNA polymerase, reaction buffer, dNTP mix and 1 mM MgCl2 (final concentra-tion), SYBR Green I dye, 0.5 lM of each primer, 1 ll template (1000 ng per reaction)and ultrapure water. The amplification of each template was performed in duplicatein one PCR run. To normalize for differences in the amount of cDNA added to thereactions, quantification of the housekeeping HPRT mRNA was performed as anendogenous control. The differential expression of the investigated genes was cal-culated as the ratio normalized to HPRT mRNA.
2.15. Statistical analysis
Data were compiled as mean ± S.D. For statistical analysis of differences be-tween the groups, an unpaired Student’s t test was performed. p values < 0.05 wereconsidered to indicate significant differences between data sets.
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3. Results
3.1. Efficient ablation of RXRa in the cervical epithelium of Tam-treated RXRa (Cvx L-/L)/E6E7 (tg/0) Triple Transgenic Mice (Tam-TTM)
Previously, spatially controlled targeted somatic mutagenesissystems have been developed in mice by cell-specific expressionof the bacteriophage P1 Cre recombinase, which excises LoxP-flanked (floxed) DNA segments. Additionally, temporal controlof Cre activity was obtained with conditional Cre recombinasesresulting from fusions with mutated ligand binding domains ofsteroid receptors [44,51–53]. Thus, cell-specific expression ofsuch fusion proteins between Cre and mutated ligand bindingdomains of the human estrogen receptor (Cre-ERT2), whose activ-ity is induced by the anti-estrogen Tamoxifen (Tam), has allowedefficient spatiotemporally controlled somatic mutagenesis of flo-xed target genes as RXRa in various cell types and tissues includ-ing cervical tissue [35,38]. We have obtained triple transgenicmice with CD1-like coat color, which developed severe alopeciaafter Tam-treatment (Fig. 1A). In order to detect both the RXRarecombined allele and the tissue-specific RXRa ablation in cervi-cal epithelia we performed liquid phase PCR and in situ PCR anal-yses, respectively. Genotyping analyses showed that RXRa genewas efficiently deleted in RXRa (Cvx L-/L-) conditional miceand Tam-TTM (Fig. 1B). In addition, we demonstrated thatRXRaL2 alleles were converted into RXRaL- alleles in cervical epi-thelium but not in stroma of TTM (Fig. 1C), demonstrating theefficiency of Cre-ERT2 for mediating the selective somatic muta-
tion of floxed RXRa in epithelia after Tam treatment. No L2 toL- allele conversion occurred in controls without Tam treatmentor without loxP sites (e.g. Wild type and E6E7 (tg/0) mice; Fig. 1).As expected, we found that RXRa messenger RNA is absent inTam-TTM in comparison with control mice (Fig. 1C, in situ RT-PCR panel).
3.2. The E6E7 transgene is expressed in cervix of E6E7 (tg/0) transgenicand Tam-TTM
Using liquid phase PCR, E6E7 transgene can be detected only inE6E7 (tg/0) transgenic mice and Tam-TTM (Fig. 1B). In order todemonstrate the presence of both the E6E7 transgene and its cor-respondent transcript in cervical tissue, we have used in situ PCR orin situ RT-PCR. As expected, intense amplification signal wasdetected only in epithelia of the cervix obtained from E6E7 (tg/0)transgenic mice and Tam-TTM (Fig. 1C). No evidence of E6E7sequences was obtained in cervical tissue from wild type or Tam-treated RXRa Cvx L-/L- mice (Fig. 1C).
3.3. HPV-16 E6 oncoprotein detection and p16INK4A expression incervical tissue of E6E7 (tg/0) and TTM
As mentioned above, the E6E7 transgene and correspondingtranscript was efficiently demonstrated in cervical tissue of E6E7(tg/0) and Tam-TTM. In addition, HPV16-E6 protein expressionwas demonstrated in cervical tissue using immunohistochemicalassays (Fig. 2). As indirect evidence of HPV16-E7 oncoprotein activ-
Fig. 2. E6 protein is expressed and p16INK4A protein levels were increased in E6E7 murine cervix. (A) Immunohistochemical detection of E6 oncoprotein and p16INK4A incervical tissue. Open arrows indicate a nuclear HPV E6 or p16INK4A strong positive signal. As expected, neither Tam-treated Wild type nor Tam-treated [RXRa (Cvx L-/L-)]conditional mice showed E6 expression, in comparison with Tam-treated TTM. (B) Relative expression (labeling index) of p16INK4A in cervix of Wild type, Tam-treated mutantmice, E6E7 (tg/0) transgenic mice or Tam-treated TTM. Interestingly, p16INK4A expression increased in Tam-treated RXRa conditional mice and was more abundant in TTM.BM: Basal Membrane. Magnification: 40X. Insets in E6HPV panel: 80X. RXRa (L2/L2): Wild type mice; RXRa (Cvx L-/L-): Tam-treated RXRa conditional mice; E6E7 (tg/0):E6E7/HPV16 transgenic mice; RXRa (Cvx L-/L-)/E6E7 (tg/0): Tam-treated TTM. �: Statistically significant (P < 0.05). Scale bar, 50 lm.
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ity, we determined the levels of p16INK4A, a tumor suppressor pro-tein currently employed as a biomarker in human cervical cancer[54,55]. Cervical samples from E6E7 (tg/0) and Tam-treated TTMoverexpressed p16INK4A as compared to cervical samples from Wildtype control mice (Fig. 2B). Interestingly, RXRa ablation alsoinduced p16INK4A protein overexpression in suprabasal layers(Fig. 2A and B).
3.4. Pathological changes in cervix of E6E7 (tg/0) transgenic mice andTam-TTM
In order to determine histopathological changes associated withE6E7 expression, we performed analyses of cervical tissue obtainedfrom middle age (27–29 weeks old) E6E7 (tg/0) transgenic mice.Interestingly, these mice showed a low frequency of moderate(2/44 mice; 0.9%) or severe (3/44 mice; 1.4%) dysplasia (Fig. 3Aand Table 1). In addition, in order to determine whether RXRaablation and the presence E6E7 played a role in the pathogenesisof cervical cancer, we performed similar histopathological evalua-tion of cervical tissue from Tam-TTM. Histological examinationrevealed that, after Tam treatment, cervix isolated from youngTTM displayed moderate (11%) and severe (17%) dysplasia. Ofinterest, 61% (11/18) and 11% (2/18) of young Tam-TTM developed
in situ carcinoma and invasive carcinoma, respectively (Fig. 3;Table 1).
3.5. Increase of cell proliferation levels and inhibition of apoptosis afterRXRa ablation and E6E7 expression in the cervix of Tam-TTM
Previously, it was demonstrated that RXRa gene ablation in-duces both cell proliferation and apoptosis in cervical tissue [38].Therefore, it was investigated the effect of both RXRa ablationand the presence of HPV E7/E7 on cell proliferation and apoptosislevels in cervix of Tam-TTM. Cell proliferation levels as determinedby PCNA (Fig. 3B) and Ki-67 (not shown) nuclear cell counting, washigher for Tam-TTM than for untreated mice, RXRa (Cvx L-/L-) orE6E7 (tg/0) mice (PCNA and Ki67 levels were increased 5.6 and5.9-fold in Tam-TTM, respectively as compared with Wild typecontrols; Fig. 3, B and D). As described previously, RXRa ablationincreased the label index of apoptotic cells as determined byTUNEL and cleaved-Caspase 9 detection [38] (9.75 and 6.1-fold inRXRa (Cvx L-/L-) mice, respectively, as compared with Wild typecontrols; Fig. 4). Using the same strategy, Tam-TTM displayed thelowest apoptotic label index as compared to Wild type, RXRaTam-treated conditional or E6E7 (tg/0) mice (Fig. 4).
Fig. 3. Histological and proliferative alterations in cervical tissue after RXRa gene ablation and E6E7 viral oncoprotein expression. (A) Hematoxylin-Eosin (H&E) staining ofcervical tissue from Wild Type, RXRa conditional, E6E7 (tg/0) transgenic and Tam-TTM. Wild Type mice [RXRa (L2/L2)] showed normal transformation zone (TZ) includingcylindrical (columnar) single epithelium with transition to stratified (squamous) epithelium. Cervical tissue of Tam-treated RXRa mutant mice showed moderate epidermoidmetaplasia (solid arrows). Interestingly, both E6E7 (tg/0) and Tam-treated TTM showed undifferentiated cells and hyperproliferation of the epithelia. (B) Immunohisto-chemical detection of PCNA as cell proliferation marker in cervix of Wild type, Tam-treated conditional and Tam-treated 7 month-old TTM. Cell proliferation levels wereincreased in RXRa (Cvx L-/L-), E6E7 (tg/0) transgenic and Tam-TTM as compared with controls. (C) Tam-treated TTM showed in situ carcinomas in 56% (10/18) of cervicalsamples and the development of frequent koilocyte-like cells (not shown). In addition, these Tam-treated TTM developed cervical invasive carcinoma after RXRa ablation in11% (2/18) of the samples (red lined-yellow filled arrows). Open arrows: PCNA nuclear signal. BM: Basal Membrane. Magnification: 40X. Insets: magnification 80X. (D) Digitalanalysis of proliferation levels from murine cervical samples. After PCNA immunohistochemical detection, selected regions were digitally analyzed as described in Methods.(I) Relationship between labeling index (defined as percent of PCNA-positive cells) and histopathological diagnosis. It can be observed that there exists a correlation betweenincreases in cell proliferation (that is, labeling index) and severity of the cervical lesions. Interestingly, in (II) we observed that the increase in cell proliferation depends onthe genotype of the mice strain. RXRa (L2/L2): Wild type mice; RXRa (Cvx L-/L-): Tam-treated RXRa conditional mice; E6E7 (tg/0): E6E7/HPV16 transgenic mice; RXRa (CvxL-/L-)/E6E7 (tg/0): Tam-treated TTM. Scale bar, 50 lm.
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3.6. The levels of c-myc, Bax, Bcl-2 and p21WAF1 mRNA in E6E7 (tg/0)transgenic and Tam-TTM
According to the findings related to cell proliferation and apop-tosis, we investigated the expression levels of selected genes byquantitative Real Time PCR (RTqPCR; Fig. 5). We found thatc-myc, p21/WAF1 and Bcl-2 mRNA levels were increased mainlyin Tam-TTM as compared to Tam-treated Wild type, RXRa (CvxL-/L-) or E6E7 (tg/0) mice. In addition, in Tam-treated RXRa condi-tional mice, Bcl-2 and p21WAF1 expression were diminished, sug-gesting that RXRa absence can mediate both a proliferative andapoptotic effect in cervical tissue. Thus, despite the increased levelsof p21/WAF1 expression, the presence of E6 and E7 oncoproteins inE6E7 (tg/0) transgenic mice and Tam-TTM not only increased theproliferative effect in cervical tissue, but also diminished the apop-totic levels. Strikingly, E6E7 oncogene expression was sufficient toabolish the effects of the RXRa ablation, drastically bringing downthe apoptotic levels in Tam-TTM.
4. Discussion
4.1. RXRa gene ablation increases the apoptotic levels in the cervix ofRXRa (Cvx L-/L-) mice
Histological analyses, after Tam induced ablation of RXRa genein cervical epithelia [thereafter RXRa (Cvx L-/L-) mice] revealedthat the cervical epithelium from RXRa mutant mice was thinnerthan control epithelium (atrophy). Although the ablation of RXRagene increases cervical cell proliferation (see later), we haveobserved an increase in the activation of Caspase 9 in cervical epi-thelium of RXRa mutant mice compared with control mice (Fig. 4).It is known that Caspase 9 activation is a key event during theinduction of apoptosis through the intrinsic pathway [17,56].These results suggest that high apoptosis levels observed underthis condition are probably preventing tissue hyperproliferationdue to a decrease in the number of suprabasal layers and leadingto an atrophy-like phenotype (Figs. 3 and 4).
4.2. HPV E6 and E7 expression decrease the apoptotic levels in cervix ofE6E7 transgenic mice and Tam-TTM
Consistent with previous observations [18,57,58], in this workwe found that E6 and E7 expression inhibit apoptosis levels inthe cervix of both E6E7 transgenic mice and Tam-TTM, suggestingthat death programming is abrogated in cervical tissue of Tam-
TTM mice (Fig. 4). Thus, apoptosis inhibition might cooperate withthe increase in cervical cell proliferation induced by RXRa ablationin Tam-TTM. It is well known that Bcl-2 promotes cell survival,whereas Bax promotes cell death [59] and that the ratio of Bcl-2/Bax determines survival or death following an apoptotic stimulus[60]. Thus, decrease of Bcl-2/Bax ratio observed after RXRa abla-tion should dramatically increase cell death in RXRa mutant mice.In contrast, the Bcl-2/Bax ratio was increased in both E6E7 (tg/0)transgenic and Tam-TTM in comparison with Wild type animals.It is noteworthy that in the cervix of E6E7 (tg/0) mice and Tam-TTM, only a twofold increase in Bcl-2/Bax ratio (in comparisonwith RXRa mutant mice) was observed that could hardly explainthe dramatic decrease in cell death. This situation probably con-tributes to the reduction in apoptotic index observed in cervicaltissues from both E6E7 (tg/0) transgenic mice and Tam-TTM(Fig. 5 and 6). It is important to mention that no definitive conclu-sion can be attained since levels of Bcl-2 and Bax proteins may notcorrelate with the mRNA levels due to the effects of E6 or E7 on therespective proteins [17,61].
E6 inactivation of p53 protein might result in overexpression ofBcl-2 and down regulation of Bax and Bak [17,62–67,68–74], con-tributing to continuous cell accumulation in cervix of E6E7 (tg/0)mice and Tam-TTM. In addition, HPV16 E6 blocks TNF-mediatedcytolysis in mouse fibroblasts [75]. Thus, continuous presence ofE6 is important for the viability of HPV-positive cancer cells, defin-ing E6 as a promising target for therapeutic intervention. More-over, ectopically expressed E6 has been associated with theinhibition of a wide range of different proapoptotic regulators thatbelong to the extrinsic death-receptor pathway (e.g. CD95 orFADD) and to the intrinsic mitochondrial pathway (e.g. Bax orBak). It is also possible that E6 activates antiapoptotic moleculescommon to both pathways, such as the c-IAP2 and Bcl-2 proteins[17,74,76,77] (Fig. 6).
4.3. Cell proliferation levels are increased in cervical epithelium ofRXRa (Cvx L-/L-) and Tam-TTM mice
Analyses of cell proliferation levels (PCNA expression) revealedpresence of abundant proliferative cells in all layers of the strati-fied cervical epithelia from Tam-TTM, whereas the signal wasfound essentially in the basal layer of Wild type mice. In contrast,a modest increase in proliferative index was observed in cervicaltissue from RXRa (Cvx L-/L-) mice while only few E6E7 (tg/0) miceshowed an increase in cell proliferation levels (Fig. 3). This obser-vation is consistent with higher levels of PCNA expression reportedin E7-expressing keratinocytes compared to wild-type keratino-cytes [58] and also in HR-HPV positive human cervical samples[78]. Our results suggest that in Tam-TTM, RXRa ablation and E6/E7 expression cooperatively contribute to increased proliferationactivity and possibly to altered terminal differentiation of the cer-vical epithelium (Fig. 3 and 6).
4.4. p16INK4A cervical cancer biomarker is increased in RXRa(Cvx L-/L-) mice and Tam-TTM
Overexpression of tumor suppressor p16INK4A is associated withhigh-grade precancerous lesions and cervical carcinomas, and ithas been demonstrated that immunohistochemical evaluation ofthis protein might be useful biomarker for identifying HR-HPV in-fected high-grade lesions [79]. The p16INK4A protein blocks cdk4and cdk6-mediated pRb phosphorylation, resulting in inhibitionof both E2F dependent transcription and cell cycle progression atthe G1 to S checkpoint [79,80]. During cervical carcinogenesisthere is an activation of both E2F and cell cycle progression sinceE7 inactivates pRb [80]. In this case it seems that the release ofE2F activates the p16INK4A promoter. Interestingly, ablation of
Table 1Histological analysis of cervical tissuesa.
Genotype Histopathological diagnosis %
Normal epithelia 84RXRa (L2/L2) Keratinized epithelia 8(n = 12) Mild dysplasia 8
Epidermoid metaplasia 47RXRa (Cvx L-/L-)b Moderate dysplasia 40(n = 15) Cervicitis 13
E6E7 (tg/0)c Moderate dysplasia 0.9(n = 44) Severe dysplasia 1.4
TTM Invasive cancer 11RXRa (Cvx L-/L-)/E6E7 (tg/0) in situ carcinoma 61(n = 18) Severe dysplasia 17
Moderate dysplasia 11
a All mice were treated with 0.1 mg Tam per day for five consecutive days.b RXRa (Cvx L-/L-) mice showed cervical atrophy in 60% (9/15) of the samples.c For this study it was included only the group of E6E7 (tg/0) transgenic mice that
showed histopathological cervical alterations.
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RXRa gene in cervix of RXRa (Cvx L-/L-) induced p16INK4A proteinoverexpression (Fig. 2), This suggests that the lack of this retinoidreceptor could increase the release of E2F transcription factor acti-vating the p16INK4A promoter [81] or induce epigenetic reprogram-ming of the p16INK4A promoter [81,82]. It is well known that inmost cervical carcinomas, overexpression of p16INK4A indicatespersistent infection with HR-HPV. Of relevance in this context isthe observation that p16INK4A induction was elevated in cervical le-sions arising in Tam-TTM (Fig. 2), which suggests that TTM strainmight resemble persistent HR-HPV infection in humans. It has
been described that E7 associates and inactivates E2F6 and Bmi1(member of the polycomb group transcription repressors), bothproteins being transcriptional repressors of p16INK4A [18,81–84];repressive trimethyl marks on lysine 27 of histone 3 (H3), whichare necessary for binding of polycomb repressive complexes, aredecreased in HPV16 E7-expressing cells and HPV16-positive cervi-cal lesions. This depletion of H3K27 methylation is caused by tran-scriptional induction of the KDM6B H3 lysine 27-specificdemethylase. In addition, it was shown that E7-mediated p16INK4A
induction is independent of pRb inactivation and is mediated by
Fig. 4. Apoptotic levels in cervix of RXRa mutant mice were strongly reduced by E6E7 oncoprotein expression. (A) Apoptotic levels were measured in cervix of Wild type,RXRa (Cvx L-/L-), E6E7 (tg/0) transgenic mice and Tam-TTM, using TUNEL analysis and immunohistochemical detection of Cleaved Caspase 9. As images show, low apoptosislevels were detected in E6E7 (tg/0) and Tam-TTM as compared with either Wild type or RXRa mutant mice. TUNEL Panel: Solid arrows: non-apoptotic cells; Open arrows:apoptotic cells. Cleaved Caspase 9 Panel: Solid arrows: apoptotic cells. BM: Basal Membrane. Magnification 40X. (B) Digital analysis of apoptotic levels in cervical samplesfrom Fig. 4A. After apoptosis determination assays, selected representative regions were digitally analyzed and reported as labeling index (defined as percent of TUNEL orCleaved Caspase 9-positive cells). Diminished apoptosis levels in cervix resected from E6E7 (tg/0) and Tam-TTM were clearly observed; Tam-TTM showed the lowestpercentage of TUNEL and Cleaved Caspase 9 positive cells. RXRa (L2/L2): Wild type mice; RXRa (Cvx L-/L-): Tam-treated RXRa conditional mice; E6E7 (tg/0): E6E7/HPV16transgenic mice; RXRa (Cvx L-/L-)/E6E7 (tg/0): Tam-treated TTM. ⁄: Statistically significant (P < 0.05). Scale bar, 50 lm.
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KDM6B [82]. This raises the interesting possibility that RXRa abla-tion causes the transcriptional induction of the KDMB6 demethyl-ase, cooperating with E7-induced overexpression of p16INK4A.
4.5. Gene expression levels of a set of genes associated with cervicalcarcinogenesis
In the present study, we analyzed the expression of a set ofgenes that are differentially expressed during cell proliferationand/or apoptosis and have a known association with cervical carci-nogenesis [38]. For example, increased C-Myc expression wasobserved in RXRa (Cvx L-/L-) conditional, E6E7 (tg/0) transgenicand Tam-TTM when compared with expression in the wild typemice (Fig. 5). It has been reported that retinoids convert E2F intoa transcriptional suppressor inhibiting the transcription of several
target genes including C-Myc [85]. Increased levels of C-Myc mRNAafter RXRa ablation in cervical epithelia could be partially due tothe lack of E2F repressive activity and can be associated withuncontrolled cellular proliferation in Tam-TTM (Fig. 6) [86–89].p21/WAF1, which has been shown to induce G1 arrest by inhibi-tion of cyclin-dependent kinases, has been identified as one ofthe wild-type p53-activated genes [90,91]. The repression of p21/WAF1 mRNA expression observed after RXRa ablation (Fig. 5),may partially explain the increase in cervical cell proliferation inRXRa (Cvx L-/L-) mice, suggesting that RXRa signaling is crucialfor the negative regulation of the cell cycle and for cervical homeo-stasis. The E7 oncoprotein can override p21/WAF1 inhibition ofboth CDK activity and proliferating cell nuclear antigen (PCNA)-dependent DNA synthesis [18,57]. The relationship between E7and p21WAF1 is paradoxical because E7 causes an increased level
Fig. 5. Relative expression (RTqPCR) of genes involved in cell proliferation and apoptosis, in cervix of mice models. The level of selected transcripts involved in cellproliferation and/or apoptosis (c-myc, p21/WAF1, Bcl-2 and Bax) was assessed by RTqPCR using specific primers. RXRa (L2/L2): Wild type mice; RXRa (Cvx L-/L-): Tam-treated RXRa conditional mice; E6E7 (tg/0): E6E7/HPV16 transgenic mice; RXRa (Cvx L-/L-)/E6E7 (tg/0): Tam-treated TTM. �: Statistically significant (P < 0.05).
Fig. 6. Model for the concerted action of HPV E6/E7 oncogene expression and RXRa ablation in Triple Transgenic Mice. RXRa deletion induces cervical cell proliferation andblocks differentiation mechanisms cooperating with cellular transformation. E6 and E7 oncoproteins can cooperatively induce an increase of cell survival and cellproliferation levels. In sum, it is proposed that the development of in situ carcinoma and invasive cervical cancer in middle age Tam-TTM is induced by alteration of severalcell control mechanisms. For details see Discussion. Up arrows: indicate overexpression or activated pathway. Down arrows: indicate underexpression. �: Molecules orcellular processes analyzed in this work. HAT: Histone acetyltransferase. HDM: Histone demethylase.
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of p21/WAF1 protein in human and mouse cells/tissues [18,58,92]and at the same time E7 can inactivate p21/WAF1 [18,57,58].Accordingly, p21/WAF1 was overexpressed in Tam-TTM cervix ascompared to normal cervical tissue probably due to E7 oncoproteinexpression. These data suggest that, in the Tam-TTM model, RXRaablation and E6 together with E7 expression cooperatively in-creased the frequency of pre-malignant or malignant cervical le-sions inactivating the tumor suppressor function of p21/WAF1and inducing cervical carcinogenesis.
The main finding of this work was the detection of in situ carci-noma (61%) and invasive carcinoma (11%) in the cervix of middleage Tam-treated TTM, suggesting that lack of RXRa retinoid recep-tor coupled with expression of HPV16 E6 and E7 oncoproteins maycontribute to carcinogenesis. Our findings suggest that induction ofcervical cancer in Tam-treated TTM could prove a valuable modelfor the diagnosis and prognosis of cancer. The TTM model can befurther utilized to identify cofactors involved in cervical carcino-genesis. The use of a conditionally expressed retinoid receptor inmice that express HR-HPV16 E6E7 oncoproteins, may improvefuture studies by allowing the identification of early tumoral bio-markers during the development of cervical cancer.
Acknowledgements
We are grateful to Dr. Pierre Chambon and Dr. Daniel Metzger(IGBMC, CNRS, INSERM, Université Louis Pasteur, Illkirch-Cedex,Strasbourg, France) for the kind gift of their invaluable RXRa con-ditional mouse model and for helpful discussions. We would like tothank Dr. Diana Escalante-Alcalde (IBT-UNAM), Biol. ElizabethAlvarez, Biol. Enrique García and Mr. Lauro Macías (CINVESTAV-IPN, Mexico) for technical support. This work was supported byCONACyT (Mexico) and ICGEB, CRP Programme, Trieste, Italy. PGwas supported by a UICC Translational Cancer Research Fellow-ship, funded by Novartis (Switzerland). ECS was supported by thescholarship ‘‘Ligue Contre le Cancer comité de Bas-Rhin’’.
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