1061

EFECTO DEL CO-CULTIVO SOBRE EL DESARROLLOTEMPRANO DE EMBRIONES BOVINOS PRODUCIDOS

IN VITRO

CO-CULTURE EFFECT ON EARLY DEVELOPMENT OF IN VITRO

BOVINE EMBRYOS

Angela López C1*, Zoot, Martha Olivera A1, Dr. Sci. Agr, Tatiana Ruiz C1, Ph.D, ArielTarazona M1,2., M.Sc.

1Universidad de Antioquia. Facultad de Ciencias Agrarias. Grupo Reproducción Fisiologíay Biotecnología Animal. AA 1226, Medellín, Colombia. 1,2DPA/FCA/BIOGEM UniversidadNacional de Colombia, Sede Medellín, Colombia *Correspondencia: angeladir7@gmail

Recibido: Mayo 5 de 2007; Aceptado: Diciembre 15 de 2007

RESUMEN

Objetivo. Estudiar el efecto del cocultivo con células oviductales sobre el porcentajede clivaje 48 horas post inseminación (hpi) de embriones bovinos en bajas tensiones deoxígeno. Materiales y métodos. Se recolectaron ovarios de matadero para la extracciónde los ovocitos que fueron puestos en medio TCM 199 suplementado con hormonas, sefertilizaron con semen criópreservado y se cocultivaron en medio CR1aa con células deoviducto durante 48 horas. Se evaluó el porcentaje de clivaje total y el porcentaje declivaje por estadios de 2-4 células y 5-8 células. La viabilidad de las células para elcocultivo se determinó por observación del movimiento ciliar y observación de monocapa.Los tratamientos fueron T1: células de oviducto + oxígeno 20%; T2: células de oviducto+ oxígeno 7%; T3 y T4 fueron controles sin células para ambas concentraciones deoxígeno. Resultados. En cuanto al porcentaje de clivaje no hubo diferencia significativaentre los cuatro tratamientos, pero hubo una tendencia a mayor clivaje para los embrionescocultivados con células y 20% oxígeno. Conclusiones. La utilización de altas tasas deoxígeno (20%) en los sistemas de cococultivo con células oviductales tienden a mejorarlos porcentajes de clivaje a las 48 hpi.

Palabras clave: Cocultivo, embriones, bovinos, células oviductales.

ABSTRACT

Objective. To study the effect of co-culture with oviductal cells on the cleavage rate48 hours post insemination (hpi) of bovine embryos in low oxygen tensions. Materialsand methods. Slaughterhouse ovaries were collected for the extraction of oocytes puton TCM 199 medium supplemented with hormones, fertilized with semen cryo-preservedand co-cultured in CR1aa medium with oviductal cells during 48 hours. Total cleavage

ORIGINAL

Rev.MVZ Córdoba 12(2): 1061-1067, 2007

rate and cleavage per stages of 2-4 cells and 5-8 cells were evaluated. The viability ofcells for the co-culture was determined by observation of the ciliary movement andmonolayer observation. Treatments were T1: oviduct cells + oxygen 20%; T2: oviductcells + oxygen 7%; T3 and T4 were controls without cells for both oxygen concentrations.Results. For cleavage rate there was not significant difference among the four treatments,but there was a tendency to more cleavage for co-cultured embryos with cells and 20%oxygen. Conclusions. The use of high oxygen rates (20%) in co-culture systems withoviductal cells intend to improve the cleavage percentages to 48 hpi.

Key words: Co-culture, bovines, embryos, oviductal cells.

(10). Los EROs son producidos por lacadena resp i ra tor ia , es tos sonmediadores de procesos fisiológicos yestados pato lóg icos (11) . Lasinvest igac iones actua les es tánorientadas a dilucidar el papel de lamitocondria y del estrés oxidativo en eldesarrollo temprano. Se ha demostradoque bajo condiciones convencionales decultivo se producen EROs (12), debido ala diferencia en la tensión de oxígenoque se presenta entre el fenómeno in

vivo que se encuentra entre 3-9% (13)y la proporcionada in vitro del 20%. Elcocultivo de embriones junto con otraslíneas celulares puede disminuir el estrésoxidativo gracias a los barredores queestas células producen (10). El objetivode este trabajo fue estudiar el efectode los sistemas de cocultivo con célulasde oviducto sobre el desarrollo tempranode embriones bovinos producidos in vitro

en condiciones de baja tensión deoxigeno y oxigeno ambiental, evaluandotasas de clivaje a las 48 y 72 hpi (horaspos inseminación).

MATERIALES Y MÉTODOS

Aislamiento de células de oviductobovino. Los oviductos provenientes deovarios con presencia de cuerposhemorrágicos se obtuvieron en la plantade benéfico local y fueron transportadosa 4ºC en solución salina al 0.9%. En ellaboratorio fueron debridados de su tejidoexterior y lavados en solución salina estéril

INTRODUCCIÓN

Entre las aplicaciones de la producciónde embriones in vitro se encuentra elmejoramiento genét i co con f inesproductivos (1), la investigación conf ines de conservac ión (2 ,3) y lageneración de técnicas de reproducciónas ist ida (4). Por estas razones laproducción de embriones in vitro y enespecial el modelo bovino ha sido motivode múltiples investigaciones para mejorarlas tasas de producción de blastocitosque siguen siendo variables de 5% a 30%(5,6). A nivel de laboratorio los procesosde maduración, fertilización y cultivopueden ser complementados con otrastécnicas como los cocultivos con célulassomát icas (7) . En d iversasinvestigaciones se han usado células deoviducto, ampolla oviductal, granulosa,cé lu las uter inas, y a lgunas l íneasce lu lares como cé lu las Vero (8) ,obteniendo resultados controversialesque sugieren nuevas investigaciones eneste campo para dilucidar las ventajasy desventajas que otorga esta técnica.

Uno de los eventos más estudiado sobrelos porcentajes y calidad de blastocitoses la detención del desarrollo en elestadio de 8-16 células de los embrionesproducidos in vitro (9), del cual se hanpostu lado d i ferentes factores queinvolucran desórdenes en la cromatina,re-arreglos del citoesqueleto, dañosmitocondriales y estrés oxidativo porespecies reactivas de oxigeno (EROs)

1062 REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 12 (2), Julio - Diciembre 2007

al 0.9%. Para la obtención de células sehizo un raspado externo del oviducto conuna lámina estéril desde el extremo útero-tubarico hacia el extremo ováricoobteniendo una sustancia de color amarillola cual se disolvió en 7 mL de Hepes (mediocompuesto por un balance de sales y pHentre 7.3-7.4) y se le realizó 1 minuto devortex para disgregar y lavar las células.Se dejó decantar el tubo 10 min y se retiróel sobrenadante. Se agregó nuevamente7 mL de Hepes y el proceso se repitió dosveces más.

Siembra de células de oviductobovino. Después de la ú l t imaprecipitación se tomaron 100ul del pellet

de células y se colocaron en platos decultivo de 65x10mm con 3.5 mL de mediode cultivo TCM-199 suplementado con10% de SFB (Gibco 1704). La selecciónde células para la siembra se realizóteniendo en cuenta la presencia demovimiento ciliar en los cúmulos decélulas. El cultivo se realizó sincrónicocon la producción de embriones.

Verificación de viabilidad celular parasu uso en cocult ivo . Tres d íaspostsiembra se evaluó la viabilidad deuna pequeña muestra del cultivo decélulas oviductales donde se observótanto la formación de monocapa comoel movimiento c i l iar de células ensuspensión para ser utilizadas en elcocultivo embrionario (Figura 1).

Obtención de los complejos cúmulo-oocito (CCOs). Para la producción deembriones, los ovocitos se obtuvieron apartir de ovarios de hembras bovinassacrificadas en la planta de beneficio local.Los ovarios se lavaron en solución salinaestéril al 0.9% a una temperatura de 35 a38°C. La aspiración de folículos entre 2 y7 mm de diámetro se realizó mediante unajeringa de 10 ml y aguja calibre 18G; ellíquido folicular obtenido se depositó enun tubo Falcon de 50 ml y se dejó decantarpor 20 minutos antes de hacer la selección

de los CCOs aptos para maduración dondese tuvieron en cuenta tres parámetros:ooplasma homogéneo, morfología redonday mínimo tres capas de células degranulosa compactas (14).

Maduración de los CCOs. La maduraciónse realizó en microgotas de medio TCM-199 suplementado con 10% SFB (suerofetal bovino), LH (0,005 mg/ml), FSH(0,02 mg/ml) y 17 â-estradiol (0,005 mg/ml) bajo aceite mineral, se colocaron 10oocitos por gota con 50 µl y se llevarona incubar por 24 h a 5% CO2, 38 ºC, 90%humedad y oxígeno ambiental 20%.

Fert i l ización in v itro . E l semencriopreservado se descongeló a 37ºC porun minuto y se realizó una capacitaciónmediante un gradiente discontinuo dePercoll 90/45 (15), para separar lafracción motil o espermatozoides viables.Mediante conteo en cámara de Neubauerse ajustó la concentración final a 1x106

espermatozoides por ml. Después de 24h de maduración los oocitos fueronlavados en Hepes de trabajo y puestosen medio de fertilización TALP (Tyrode’salbumina lactato piruvato) (16). Seinseminó con 2µl del semen previamenteseleccionado, 2µl heparina y 2µl PHE(penicilina, hipotaurina, epinefrina) yposteriormente se llevaron a incubación

Figura 1. Cultivo de células oviductales:A, formación de monocapa, B, células ensuspensión.

1063López - Efecto del co-cultivo de embriones

por 18 horas para la interacción degametos con 5% CO 2, 38ºC, 90%humedad y oxigeno ambiental 20%.

Cocultivo in vitro. Pasadas 18 horas lospresuntos zigotos se lavaron con Hepes,por medio de una micropipeta para retirarlas células de granulosa y se colocaronen medio de cultivo CR1 + aa (17).Posteriormente, se llevaron a incubaciónbajo la presencia o ausencia de célulasoviductales a 38ºC, 88% N, 5 % CO2,7% O2 y 90 % de humedad ó 5% CO2, 38ºC, 90% humedad y oxigeno ambiental20% según el tratamiento. Para elcocultivo se utilizaron aproximadamenteentre 10 y 12 cúmulos de cé lu lasoviductales por embrión (Figura 2).

El porcentaje de clivaje se evaluó 48 hpimediante observac ión d i recta porestereoscop io ten iendo en cuentaembriones no clivados y estadíos de 2 a4 y 5-8 células. Todos los mediosutilizados fueron tratados con 1% desolución antibiót ica compuesta porpen ic i l ina (S igma P-4687) yestreptomicina (Sigma S-1277).

Análisis estadístico. Se utilizaron 4tratamientos. En la etapa de cultivo delos embriones se consideró la presenciao ausencia de células de oviducto ycambios en la tensión de oxigeno así:

Tratamiento 1: Embriones + célulasov iducta les en 20% de ox ígeno.Tratamiento 2: Embriones + sin célulasov iducta les en 20% de ox ígeno.Tratamiento 3: Embriones + célulasov iducta les en 7% de ox ígeno.Tratamiento 4: Embriones + célulasoviductales en 7% de oxígeno.

Se uti l izó el programa STATISTICAversión 5.0 donde se probó la distribuciónnormal de los datos mediante el test deShapiro-Wilk´s y se realizó el test deLevene para la homogene idad devarianzas. Se utilizó ANOVA y un nivelde significancía de p = 0.05 para elanálisis de los datos.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Una gran diversidad de factores puedenafectar la producción de embriones in

vitro, hasta la obtención de blastocitostransferibles (18), la tasa de produccióntotal puede verse reflejada a las 48horas pos inseminac ión donde laevaluación del número de embrionesclivados y su estadio representa unestimativo de la eficiencia y calidad delos procesos de maduración, fertilizacióny primeros días de cultivo.

En este estudio se encontró que elporcentaje total de embriones clivados48 hpi (37, 32, 31 y 43%) fue similar enlos diferentes tratamientos debido a queno presentó d i ferenc ia estadíst icasignificativa (p> 0.05) (Figura 3).

Sin embargo, se encontró una tendenciade los embriones cocult ivados concélulas de oviducto y 20% de oxígeno, apresentar mejores tasas de clivaje, loque podr ía es tar asoc iado a ladisminución de la producción de EROs,que se da con altas tensiones de oxígenocausando daño a nivel del citoesqueletoy el ADN (10). La inclusión de célulasoviductales en el cultivo embrionario

Figura 2. Cocultivo embrionario con célulasoviductales.

1064 REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 12 (2), Julio - Diciembre 2007

permitiría que éstas metabolicen partedel oxígeno evitando que se de laproducc ión de EROs. Además, lassecreciones de las células oviductalescomo proteínas, carbohidratos y piruvatoalteran la composición del medio (19) yactúan como factores embriotróficospara el embrión en desarrollo (20).

Por o t ra par te , a l cocu l t ivar losembriones con células oviductales a

bajas concentraciones de oxígeno (7%),las células son enfrentadas a un estréscelular mayor donde no realizan sufunción adecuadamente y arrojan mayorcant idad de desechos que puedenresultar tóxicos para los embriones endesarrollo, lo que se ve reflejado en unadisminución del clivaje.

Al observar los clivajes por estadío nose encontraron igualmente diferencias

Figura 3. Tasas de clivaje total a las 48 hpi A: 7% oxígeno sin células oviductales B: 7%oxígeno con células oviductales C: 20% oxígeno sin células oviductales D: 20% oxígenocon células oviductales.

Figura 4. Tasas de clivaje por estadio a las 48 hpi A1: estadio 2-4 células a 7% oxígeno sincélulas oviductales A2: estadio 5-8 células a 7% oxígeno sin células oviductales B1: estadio2-4 células a 7% oxígeno con células oviductales B2: estadio 5-8 células a 7% oxígeno concélulas oviductales C1: estadio 2-4 células a 20% oxígeno sin células oviductales. C2: estadio5-8 células a 20% oxígeno sin células oviductales. D1: estadio 2-4 células a 20% oxígenocon células oviductales. D2: estadio 5-8 células a 20% oxígeno con células oviductales.

1065López - Efecto del co-cultivo de embriones

significativas pero la tendencia de losembriones cocultivados a 20% de oxígenosigue marcando una tendencia a mejorarel numero de embriones clivados conrespecto a los demás tratamientos. Encuanto a la sincronía de cl ivaje seobservó que en todos los tratamientoshubo presencia de embriones sincrónicospresentándose a las 48 hpi estadios de2-4 células y de 5-8 células dentro delos parámetros normales.

Se concluye que al utilizar sistemas decocultivo con células oviductales a 20%de oxígeno hubo una tendencia alaumento de los porcentajes totales dec l iva je a las 48 hp i , deb ido a ladisminución en la producción de EROs quecausan daño a nivel celular. Igualmentela secreción de sustancias embriotróficasa l medio por parte de las cé lu lasov iducta les ayudan a mejorar e l

desarrollo de los embriones en susprimeros estadíos aumentando la tasa declivaje total 48 hpi.

En términos de eficiencia biológica y enrelación con la producción comercial deembriones bovinos in vitro, tanto lasbajas tasas de oxigeno como el co-cultivo con células del epitelio oviductalbov ino permi ten e l desarro l lopre implantator io en proporc ionescomparables.

Se sugiere realizar estudios con el finde eva luar es tad ios de moru la yblastocito en la producción in vitro quepermita establecer si hay un efecto delcocultivo posterior a las 48 hpi, ademásde la realización de pruebas que permitanmedir la cal idad del embrión comomorfología, celularidad, y apoptósis.

1. Kru ip Tham, P ie terse MC,VanBeneden ThH, Vos PLAM, WurthYA, Taverne MAM. A new method forbov ine embryo product ion: apotent ia l a l ternat ive tosuperovulation Vet Rec 1991; 128:208-210.

2. Goodrowe KL, SL, Walker DP,Ryckman GF, Mastromonaco MA, HayHL, Bateman WT, Waddell. Piecingtogether the puzzle of carnivorereproduction. Anim Reprod Sci 2000;61: 389-403.

3. Farstad W. Assisted ReproductiveTechno logy in Can id Spec ies .Theriogenology 2000; 53: 175-1862000.

4. Hewitson Laura. Primate models forassisted reproductive technologiesReproduction 2004; 128: 293-299.

REFERENCIAS

5. Merton JS, APW, de Roos, E Mullaart,L de Ruigh, L Kaal, PLAM Voa S.Dieleman. Factors affecting oocytequality and quantity in commercialapplication of embryo technologiesin the cattle breeding industry.Theriogenology 2003; 59: 651-674.

6. Kruip TAM, MM, Bevers, B, Kemp.Environment of oocyte and embryodetermines health of IVP offspring.Theriogenology 2000; 53: 611-618.

7. Goto KN, Iwa i Y Takuma, YNakanishi. Co-culture of In Vitro

Fert i l ized Bovine Embryos withDiferent Cell Monolayers. J Anim Sci1992; 70:1149-1453.

8. Menck MC, Guayader-Joly C, PeynotN, Le bourhis D, Lobo RB, Renard JP,Heyman Y. Beneficial effects of verocells for developing IVF bovine eggs

1066 REVISTA MVZ CÓRDOBA • Volumen 12 (2), Julio - Diciembre 2007

in two different coculture systems.Reprod Nutr Dev 1997; 37:141-150.

9. Gardner DK, Lane M, Spitzer A, BattPA. Enhanced rates of cleavage anddevelopment for sheep zygotescultured to the blastocyst stage invitro in the absence of serum andsomatic cells: amino acids, vitamins,and culturing embryos in groupsstimulat development. Biol Reprod1994; 50: 390-400.

10. Mermillod P, Vansteenbrugge A, WilsC, Mourmeaux JL, Massip A, DessyF. character i zat ion o f theembriotrophic activity of exogenousprotein-free oviduct conditionedmedium used in culture of cattleembryos. Biol Reprod 1993; 49:582-587.

11. Brookes P. Mitochondrial H(+) leak andROS generation: an odd couple. FreeRadic Biol Med 2005; 38(1):12-23.

12. Tarazona AM, Rodriguez JI, restrepoLF, O l ivera-Ange l M, 2006:Mitochondrial activity, distributionand segregation in bovine oocytesand in embryos produced in vitro.Reprod Dom Anim 2006; 41: 5-11.

13. Ali AA, JF Bi lodeau, MA Sirard.Antioxidant requirements for bovineoocytes var ies dur ing in v i t ro

maturat ion, fe r t i l i za t ion anddevelopment. Theriogenology 2002;59: 939-949.

14. Stojkovic M, Machado SA, StojkovicP, Zakhartchenko V, Hutz ler P,Goncalves PB, Wolf E. Mitochondriald i s t r ibut ion and adenos inetr iphosphate content of bovineoocytes before and after in vitro

maturat ion: cor re la t ion w i th

morpho log ica l c r i te r ia anddevelopmental capacity after in vitro

fertilization and culture. Biol Reprod2001; 64(3): 904-909.

15. Parrish JJ, Krogenaes IA, Susko-Parrish JL. Effect of bovine spermseparation by either swim-up orpercoll method on success of in vitro

fertilization and early embryonicdevelopment. Theriogenology 1995;44: 859-869.

16. Fukui Y. Effect of follicle cells on theacrosome reaction, fertilization, anddeve lopmenta l competence o fbovine oocytes matured in vitro. MolReprod Dev 1990; 26(1): 40-46.

17. Rosenkrans C, Zeng G, MCNamara G,Schoff P, First N. Development ofbovine embryos in vitro affected byenergy substrates. Biol Reprod 1993;49: 459-462.

18. WH Eyestone, NL F i rs t .Characterization of developmentalarrest in early bovine embryoscultured in vitro. Theriogenology1991; 35(3): 613-624.

19. Edwards LJ, PA Batt, F Gandolfi, DKGardner. Modif icat ions Made toCulture Medium by Bovine OviductEp i the l ia l Ce l l s : Changes toCarbohydrates Stimulate BovineEmbryo Development. Mol Reprod Dev1997; 46: 146-154.

20. Nagao Y, Saeki K, Hoshi M, KainumaH. Effects of oxygen concentrationand oviductal epithelial tissue on thedevelopment of in vitro matured andfertilized bovine oocytes cultured inprotein-free medium. Theriogenology1994; 43 (4):751-759.

1067López - Efecto del co-cultivo de embriones