Efectos del solvente y del ambiente - Facultad de...
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Efectos del solvente y del entorno local
sobre la
fluorescencia
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Temario Efectos generales del solvente
Efectos específicos del solvente
Efectos de la temperatura
Transferencia interna de carga y reacciones del estado excitado
Efectos de la transición de fases en biomembranas
Viscosidad
Interacciones entre fluoróforos
Cambios en el rendimiento cuántico
Procesos en el estado excitado
Espectros de emisión resueltos en el tiempo (TRES)
Relajación espectral en proteínas
Relajación espectral en membranas
Relajación en solventes en la escala de los picosegundos
Medidas de relajación multiexponenciales
Distinción de relajación del solvente y la interconversión rotamérica
Espectros de emisión resueltos el tiempo de vida del estado excitado
Corrimientos por excitación en el borde rojo
Transferencia interna de carga y reacciones del estado excitado
C 6
C 7
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Rendimiento cuántico
Vida intrínseca o natural
Vida media (“promedio”)
“Mean lifetime”(Constante de tiempo o
tiempo característico)
( = t1/e)
t ½ = Ln2
Media vida (t½)
Half-life
(también es un “promedio”)
t ½ = Ln2/( +knr)
El solvente y el entorno pueden afectar el rendimiento cuántico
Nº de fotones
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El solvente y el entorno pueden afectar el corrimiento de Stokes
Corrimiento de Stokes
Energía de los fotones
Energía disipada
Ecuación de Planck hchE
Frecuenciac
Número de onda1
)( FAhcE
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Muchos fenómenos, oportunidades …e interpretaciones
Efectos del solvente y del entorno
Cuidadosa inspección de las propiedades moleculares
del fluoróforo y del entorno
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Efectos del solvente y del entorno
k >> 1/
k 1/
Corrimientos de Stokes dinámicos
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Ecuación de Lippert-Mataga
Materiales dieléctricos, conductores y medios biológicos
El fluoroforo es consideredo un dipolo en un medio
continuo de constante dieléctrica (permitividad)
uniforme
Solvatación de iones
Saturación dieléctrica en las cercanías del ión
consta
fhc GE
2
3)(
2
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Momento dipolar eléctrico rq
1 D = 3.33564x10-30 Cm
-e e0.2 Ǻ
Momento dipolar de la transición
Energ
ía
|0>,
|1>,
|2>,
Momento dipolar eléctrico molecular
en el estado basal (0 ó G) y excitadoG
E
0101
Polaridad del solvente y del fluoróforo
01
es importante porque explica acoplamiento: REM, Eint y Ext
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Polarizabilidad, polarización y constante dieléctrica
del entorno
La permitividad relativa o constante dieléctrica relativa ( ) mide el alineamiento
de los dipolos del solvente y la producción de dipolos inducidos por un campo
eléctrico (polarizabilidad del solvente).
Polarizabilidad (tensor )
Polarización EEV
NP
)1(00
D
E
0Constante dieléctrica relativa
(cantidad empírica)
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Se aplica a corrimientos de Stokes estáticos
Se basa en la teoría de campos reactivos de Onsager
Ecuación de Lippert-Mataga
Campo eléctrico reactivoEs el campo eléctrico que
experimenta el fluoróforo
que es fruto de la polarización
de las moléculas del entorno
por el dipolo del fluoróforo
(es paralelo y se orienta en sentido opuesto)
JACS, 1936, 58, p 1486.
La energía de un dipolo (U ó E) Depende de , de E y del cos del ángulo theta
¿En el vacío?
consta
fhc GE
2
3)(
2
AEdipolo 00
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Ecuación de Lippert-Mataga consta
fhc GE
2
3)(
2
Polarizabilidad orientacional ( f)
Polarizabilidad de
alta frecuencia
Espectroscopía de dieléctricos
Polarizabilidad de
baja frecuencia
Se basa el el principio de Franck-Condon
http://en.wikipedia.org/wiki/Image:Dielectric_responses.svg
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Ecuación de Lippert-Mataga consta
fhc GE
2
3)(
2
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Gráfico de Lippert
Determinar la polaridad de un sitio de unión a
una sonda por comparación de la fluorescencia
de la sonda unida con su fluorescencia en
solventes de polaridad conocida.
En vesículas de DPPC
Algunos usos Corrimiento de Stokes
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Determinar constantes de unión de un ligando si
este es fluorescente y su fluorescencia cambia
con la unión o si la fluorescencia intrínseca
cambia por efecto de la unión de un ligando
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Efectos específicos del solvente
P de H
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T, viscosidad
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Transferencia interna de carga
Prodan
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Viscosidad
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Entorno proteico
http://en.wikipedia.org/wiki/Image:Dielectric_responses.svg
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Entorno proteico
Art. S61