EL EMBRIÓN DE POLLO COMO MODELO DE EXPERIMENTACIÓN: VEN Y DESCUBRE LA EMBRIOLOGÍA

XIV Semana de la Ciencia en Madrid. Julio Contreras Rodríguez, Pilar Martínez Sainz, Inmaculada Santos Rodríguez y Concepción

Rojo Salvador. Dpto. Anatomía y Anatomía Patológica Comparadas.

Facultad de Veterinaria. UCM

I. INTRODUCCIÓN

La gran contribución de las aves como modelo de investigación biomédica es

incuestionable. Distintas especies (gallina, codorniz, pato...) han sido utilizadas como

modelos en estudios tanto del desarrollo, como en ciertas patologías o estudios quirúrgicos.

Además, el hecho de ser las aves susceptibles a diversos virus las ha convertido en objeto de

interés para microbiólogos y se han utilizado para el consiguiente desarrollo de vacunas.

El huevo de ave ofrece un mecanismo para el estudio del desarrollo embrionario y la

patología de forma muy accesible y detallada, sirviendo como modelo para el estudio de

múltiples aspectos ontogénicos y teratogénicos.

Existen ventajas importantes para el uso de las aves como modelo de investigación, y

concretamente del embrión de pollo en el que nos centraremos:

1. Los huevos fertilizados de pollo son baratos, se desarrollan en 20-21 días y

pueden ser fácilmente mantenidos en incubadores comerciales, con gran

adaptación al laboratorio, sin necesidad de grandes instalaciones ni

atenciones.

2. A diferencia de otras especies tradicionales de animales de laboratorio, su

mantenimiento es mucho menor y los costes se reducen mucho.

3. Este embrión es accesible y fácilmente manipulable, siendo numerosos los

experimentos en que se intercambian regiones en desarrollo incluso entre

especies (quimeras).

4. Además, células y distintos tejidos del pollo son factibles de ser llevados a

condiciones de cultivo celular, lo que amplía como veremos ampliamente las

posibilidades de trabajar, pues a los posibles tratamientos o modificaciones

in vivo se añaden una gran cantidad de posibilidades de trabajo in vitro.

II. EL HUEVO DE LAS AVES

Debemos conocer y comprender la estructura del huevo para su posterior

manipulación en los distintos experimentos que planteemos. El huevo de un ave es en

realidad un oocito u ovocito gigantesco, con gran cantidad de yema o vitelo y que se va

formando en el tracto reproductivo de la hembra (en el caso que nos ocupa de la gallina). El

huevo de gallina es por tanto macrolecítico y telolecítico (mucho vitelo que se dispone en un

polo o extremo) a diferencia de los mamíferos que será microlecítico e isolecítico (poco

vitelo de distribución homogénea). Esta característica es la que condiciona las fases

tempranas del desarrollo muy diferentes en aves a las de los mamíferos.

El ovario de la gallina contiene muchos folículos que varían en tamaño dependiendo

de la cantidad de yema que acompañe al oocito. El ovocito estará formado por un núcleo o

“vesícula germinal”, un citoplasma formativo o “mancha germinal”, en conjunto por el

“disco germinal”. Además está el vitelo o “yema”, formado por una masa central blanca o

latebra, rodeada por capas concéntricas de vitelo blanco (protéico) y vitelo amarillo

(lipídico).Tras la ovulación el ovocito recubierto por su membrana vitelina, o membrana

secundaria segregada por el ovario (su porción o capa interna), progresa por el oviducto

izquierdo (no hay útero en aves y el oviducto y ovario derecho degeneran tras nacer) donde

se irá recubriendo de las membranas terciarias, cuya misión será proteger al embrión y

contribuir a su nutrición. Estas membranas serán:

-La porción externa de la membrana vitelina. Dicha membrana en su conjunto

parece que juega un importante papel en el intercambio de agua o algunas

sustancias.

-El albumen o albúmina que rodea al ovocito. Tiene dos componentes, uno

denso y otro claro. Además existen unos ligamentos que se condensan alrededor de

la membrana vitelina, las chalazas, que mantienen al ovocito en el centro del

albumen.

-Las membranas testáceas, interna y externa. Formadas por fibras de

queratina entrecruzadas. A nivel del polo obtuso del huevo se separan y dejan entre

ellas un espacio o cámara de aire, que equilibra la presión en el interior del huevo

conforme se evapora el agua que contiene.

-La cáscara o cubierta externa del huevo de carbonato cálcico, que se aplica

directamente contra la membrana testácea externa. Contiene muchos poros de

pequeño diámetro y cerrados por una cutícula proteica.

III. EMBRIOLOGÍA BÁSICA EN AVES

A. Formación de las membranas extraembrionarias

Distintas capas distales al embrión temprano (somatopleura y esplacnopleura) se

extienden sobre el vitelo, más allá del cuerpo del embrión, constituyendo las membranas

extraembrionarias. Lo primero en aparecer será el saco vitelino, y tendrá gran importancia

por la red vascular que lleva asociada (vasos vitelinos). Conforme se limita el cuerpo del

embrión los pliegues laterales que se forman se hacen mayores y tienden a cerrarse por

encima del embrión, conformando el amnios y el corion. Por último tendremos el alantoides,

que aparece como un divertículo del intestino posterior y crece hasta fusionarse con el

corion. Los vasos del alantoides son fundamentales para el intercambio gaseoso del

embrión.

B. Estadios iniciales del desarrollo El conocimiento del desarrollo del embrión de pollo nos ayudará a tener una

perspectiva dinámica de la anatomía al mostrar una visión histórica de la génesis de los

distintos tejidos y órganos del animal, lo que a su vez nos permite comprender con más

facilidad la morfología del ave adulta. De esta manera podremos elegir el momento concreto

del desarrollo en que queremos actuar en nuestra experimentación. Por otro lado,

conociendo la embriología del ave podemos analizar las diferencias con los mamíferos, lo

que será de utilidad a la hora de plantear nuestra investigación, decantándonos por el

modelo animal más apropiado para el experimento concreto a realizar.

La fertilización tiene lugar en el infundíbulo del oviducto de la gallina, que es la

primera porción del mismo. Conforme el huevo progresa por el oviducto, como ya hemos

visto, el embrión sufre en primer lugar los procesos de SEGMENTACIÓN o división ovular.

Esta división será condicionada por el vitelo, y será incompleta o meroblástica, con cuatro o

cinco divisiones con carioquinesis o división del núcleo completas, pero con citoquinesis o

división del citoplasma incompletas. Estas “células abiertas” estarán abiertas a la masa

vitelina. En este momento el disco germinal pasa a denominarse blastodermo o blastodisco.

Alrededor de la segmentación en estadio de 64-células tendremos células como tal,

llamadas blastómeras. Pronto se limitan los elementos celulares y se separan del vitelo

subyacente, apareciendo entre ambos un espacio o cavidad subgerminal. Las blastómeras

que cubren directamente la cavidad son las blastómeras centrales, que al igual que el nudo

embrionario de mamíferos formará las estructuras embrionarias. Las células más periféricas,

las blastómeras marginales, formarán algunas de las membranas extraembrionarias. En este

momento tendremos un blastodermo que presenta externamente dos regiones: el área

pelúcida, o central que se sitúa encima de la cavidad subgerminal, y el área opaca, o

periférica. En el transcurso de la segmentación se establecen los ejes de polaridad del

embrión: primero el eje dorso-ventral y después el craneo-caudal.

Aproximadamente en el momento de la puesta se desprenden células del

blastodermo por un proceso de delaminación, que comienza en el polo caudal,

obteniéndose una BLÁSTULA con células en la superficie, o epiblasto, y células en

profundidad, o hipoblasto. Entre ambas poblaciones tendremos una cavidad o blastocele.

El proceso de GASTRULACIÓN se inicia con un engrosamiento en el polo posterior del

blastodisco, en la zona marginal posterior, por una expansión en esta zona del epiblasto. Se

inicia así un desplazamiento hacia la línea media de las células del epiblasto en una

secuencia caudorrostral, acumulándose células en la línea media caudal. Esta convergencia

progresiva de células en la línea media es la línea primitiva, que marca la situación del futuro

eje longitudinal del embrión. El extremo craneal de ésta línea primitiva se ensancha y

conforma el denominado nudo primitivo o nudo de Hensen.

A partir de la línea primitiva, y concretamente del surco primitivo, células de origen

epiblástico abandonan su localización y por un lado alcanzan el hipoblasto, al que desplazan,

formando el endodermo intraembrionario. Por otro lado, la mayor parte de células que

abandonan el epiblasto por la línea primitiva forman una población mesenquimatosa que

forma el mesodermo. Este proceso que sufren las células epiblásticas se denomina

involución. El resto superficial de epiblasto se transforma en un epitelio que se denomina

ahora ectodermo, con lo que ya tendremos las tres hojas germinales del embrión.

Acompañando a este proceso la línea primitiva, tras llegar a su máximo desarrollo, sufre una

regresión durante la cual se forma el esbozo de la notocorda y el mesodermo paraaxial o

somítico. Este mesodermo forma los somitos, que son bloques pares que irán apareciendo y

que nos servirán, junto con otras características, a asignar al embrión un estadio conforme a

la clasificación de Hamburger y Hamilton (1951). Estos somitos se diferenciarán en

dermatomo (origen de la dermis), miotomo (origen de músculos) y esclerotomo (origen de

estructuras esqueléticas).

A partir de este momento, y contando ya con las tres hojas germinales embrionarias,

comienza el PERIODO ORGANOGENÉTICO. A partir de dichas hojas, aparecen los esbozos de

los órganos. En primer lugar se produce un fenómeno de neurulación inducido por la

notocorda.

C. Neurulación y formación del Sistema Nervioso en aves

Durante la fase de la neurulación tiene lugar la formación del tubo neural, y además

el comienzo del desarrollo del tubo digestivo, del corazón y de la delimitación del cuerpo

embrionario a partir de las tres hojas embrionarias.

La neurulación comienza con un

engrosamiento del ectodermo en la línea

media dorsal, que formará la placa neural, cuyos bordes laterales se elevan dando los

pliegues neurales. Posteriormente la depresión de la placa conforma el canal neural. La

confluencia en la línea media de los pliegues termina en la fusión de los mismos,

formándose el tubo neural. La parte más dorsal de los pliegues dará además la cresta neural.

Los extremos son los últimos en cerrarse, dejando los denominados neuroporo rostral y

caudal. Simultáneamente a la formación del tubo neural, la región cefálica del embrión crece

sobre la superficie del blastodisco y se alarga, formando el pliegue cefálico. El conjunto de

tejidos cefálicos elongados se llaman proceso cefálico.

La porción cefálica del tubo neural, que

presenta en un principio tres vesículas que

rostrocaudalmente son: prosencéfalo, mesencéfalo y

rombencéfalo. La primera de ellas se dividirá a su vez

(estadio 12) en telencéfalo y diencéfalo, y la última en

otras dos (estadio 11): metencéfalo y mielencéfalo.

El sistema nervioso periférico se forma desde

células de la cresta neural que darán, entre otros tipos

celulares, neuroblastos que producirán células

sensoriales y autónomas, que a su vez formarán parte

del sistema simpático y parasimpático. En su conjunto,

la cresta neural produce muy diversos derivados en el individuo, y sufre durante el

desarrollo una interesante migración celular, muy estudiada utilizando el pollo como

modelo.

IV. TÉCNICAS DE ESTUDIO

Existen muchas y variadas técnicas de estudio que utilizan el embrión de pollo como

modelo experimental. A continuación pasaremos a comentar algunos aspectos prácticos de

su uso en una experimentación, aportando ejemplos concretos que muestren las ventajas

que proporciona dicha utilización.

A. Incubación

Comenzaremos hablando sobre cómo obtener embriones de pollo, primer paso a la hora

de plantear cualquier estudio en embrión de ave. Normalmente se trabaja con huevos

fertilizados o embrionados proporcionados por granjas productoras de los mismos o de

pollos de un día, que son los que se venden habitualmente a las granjas para su engorde.

Estos huevos deben mantenerse a una temperatura ideal de 10-12ºC antes de incubar,

tiempo que debe ser el menor posible pues darán mejor resultado los huevos “frescos”.

Huevos conservados por debajo de 4ºC reducen su viabilidad para incubar. Por encima de

27ºC comienza el desarrollo aunque de forma alterada. Utilizaremos un incubador comercial

que consta de una cámara con termostato ajustado a la temperatura idónea, que será de 37-

38ºC, la cual debe mantenerse constante. Debe también evitarse la deshidratación del

embrión, para lo que se dispondrá de un recipiente con agua en la base del incubador, que

asegura una humedad alta. Además, si se realizan experiencias que sobrepasen la semana de

incubación, deberá contar el incubador con un sistema de volteo del huevo que favorecerá

el desarrollo del animal y evitará que éste se pegue a las membranas testáceas o de la

cáscara.

B. Datación del embrión

Es importante conocer “la edad” del embrión en el momento concreto de su

utilización. La mayoría de los procesos embriológicos tienen una historia muy definida y

elegiremos un momento concreto para realizar nuestro experimento. Por ello existen

diversas clasificaciones de los distintos estadios del desarrollo. Estas clasificaciones se

denominan tablas normales, y la más ampliamente utilizada en el caso del pollo es la tabla

de Hamburger y Hamilton (1951, 1992), basada en signos externos apreciables en el

embrión y permite un rápido reconocimiento del estadio a utilizar. En las prácticas

manejaremos estas tablas para familiarizarnos con la datación del embrión. No obstante y

como en algunas edades plantea algún problema de correlación, sobre todo en fases muy

tempranas, y también en relación con las horas para cada estadio, lo mejor es realizar una

tabla personal de horas con el incubador a utilizar y su correlación con la tabla de

Hamburger y Hamilton. Además si trabajamos con animales mayores de 4 días lo normal es

referir cada edad en base al número de días de incubación.

C. Técnicas in ovo

Se pueden realizar muchos experimentos permitiendo que el desarrollo del animal

continúe tras nuestra manipulación, pudiendo comprobar el resultado de nuestra

intervención en el tiempo. En este tipo de experimentos el embrión de pollo es muy

interesante, y la existencia del huevo facilita mucho el manejo y las manipulaciones a

realizar en el embrión.

En esta línea están todas las experiencias de

quimeras, que tantos resultados han

prestado y prestan en la actualidad a la

embriología experimental. Por medio de las

quimeras podemos realizar transplantes de

grupos de células o tejidos en otra especie

que permita una diferenciación del

hospedador y el injerto. Esto es posible con

la codorniz y el pollo. Las células de la

codorniz presentan un gran nucleolo, con

una heterocromatina densa, mientras que

en el pollo normalmente hay dos o más

nucleolos (le Douarin, 1969). De esta forma

se pueden diferenciar los tejidos mediante

la técnica de Feulgen (que marca ADN) o

una modificación del método de

hematoxilina de Harris.

codorniz pollo

Diversos injertos autólogos o heterólogos en la misma especie se pueden también

realizar para comprobar como se desarrolla el injerto en otro lugar diferente al fisiológico. El

grado de implantación y supervivencia en el pollo es muy alto, lo que convierte a esta

especie y al modelo embrionario en el de elección para muchas experiencias con injertos.

Otras técnicas in ovo serán las inyecciones o “duchas” de alguna sustancia como

pueden ser anticuerpos bloqueantes, o las bolitas impregnadas de una molécula a testar, o

transferencia de genes por medio de virus, que permitan sobreexpresar la molécula que nos

interese estudiar.

La secuencia de trabajo en todas estas técnicas será la misma. Tenemos que exponer

el embrión a nuestra manipulación pero de manera que el animal pueda proseguir su

desarrollo y obtener un porcentaje de supervivencia aceptable. Este porcentaje varía según

la técnica realizada, el estadio del que se parte y al que queremos llegar, etc.

D. Otras técnicas de estudio.

Dentro de este epígrafe comentaremos algunas técnicas ampliamente utilizadas que

no se realizan in ovo.

Por un lado hablaremos de técnicas o estudios de expresión, por las que

evidenciaremos aspectos morfológicos (histología e inmunohistoquímica) o bien

analizaremos la expresión del elemento que nos interese estudiar (inmunohistoquímica e

hibridación in situ). La mayoría de experiencias in ovo terminan con un estudio morfológico

en el que se busca encontrar un marcador determinado para evidenciar las modificaciones

provocadas por nuestra actuación. Todas estas técnicas tienen como denominador común la

extracción del embrión en un estadio determinado (tabla de Hamburger-Hamilton) y una

posterior preparación para la realización de la técnica, que habitualmente se inicia con la

fijación del embrión o región del embrión a estudiar.

Otras técnicas serán los estudios in vitro, donde se realizan cultivos de partes u

órganos en formación del embrión, constituyendo un modelo experimental muy interesante

para el estudio de mecanismos del desarrollo.

V. DESARROLLO PRÁCTICO DEL TALLER

Realizaremos el estudio del desarrollo de las primeras fases del embrión de pollo con el

fin de comprender como tienen lugar algunos de los procesos fundamentales en embriología,

así como la utilidad de este modelo en experimentación animal y la importancia de conocer los

distintos fenómenos ontogénicos.

Realizamos la apertura del huevo como si quisiéramos realizar alguna técnica in ovo.

Tenemos que exponer el embrión a nuestra manipulación pero de manera que el animal

pueda proseguir su desarrollo y obtener un porcentaje de supervivencia aceptable. Para

exponer el embrión se realizan dos orificios en los polos del huevo y a continuación se

levanta la cáscara con cuidado, y ayudados por la punta de una tijera, se rasgan las

membranas testáceas y se añade suero o un tampón, que separa el embrión y vitelo de la

cáscara. Ahora se extrae albúmina (“clara”) para conseguir reducir un poco el volumen del

contenido del huevo, y que el embrión “descienda”, quedando un espacio entre las

membranas testáceas y el contenido del huevo. Ahora disecamos las membranas testáceas y

añadimos una solución del colorante rojo neutro al disco embrionario o al embrión, que nos

permitirá visualizar mejor el embrión in toto y el resto de las estructuras. Procederemos a la

datación (clasificación Hamburger y Hamilton, 1951) y estudio de embriones de ave de distintos

estadios HH, que corresponderán a 24, 48, 72, 96 horas de incubación.

También procederemos a aislar el embrión y observarlo detenidamente tras una

sección en “U” de las envueltas del mismo, lo recogeremos con unas pinzas finas sin tocarle.

Posteriormente lo depositaremos en una placa de Petri con una solución tampón o agua, y

bajo lupa realizaremos una disección consistente en eliminar todas las envueltas que

acompañan al embrión (restos de vitelo, membrana vitelina, amnios...) para una mejor

visualización de las distintas estructuras y regiones de interés embrionario.

Embrión de los estadios HH 4-6 (18-24 horas de incubación).

Identificación de las áreas pelúcida y opaca y formación de la línea primitiva, surco

primitivo y nodo de Hensen.

Embrión de los estadios HH 13-15 (48-55 horas de incubación).

Estudio de los derivados de las capas germinales primordiales. Derivados ectodérmicos:

vesículas encefálicas (prosencéfalo, mesencéfalo y rombencéfalo), esbozo de las vesículas

óptica y ótica o auditiva, tubo neural y neuroporo caudal, flexura craneal. Derivados

mesodérmicos: notocorda, somitos. Endodermo: tubo digestivo. Inicio de la vascularización

extraembrionaria (venas vitelinas, área vasculosa y seno terminal). Corazón latiendo y

estableciéndose la circulación embrionaria primitiva. Formación del primer par de arcos

viscerales y arcos aórticos. Cabeza rotada hacia la izquierda y pliegue cefálico amniótico

revistiendo las vesículas encefálicas.

Embrión del estadio HH 20-25 (72-96 horas de incubación).

Establecimiento de los pliegues corporales laterales y rotación del cuerpo. Cierre del

amnios. Esbozo de miembros torácicos y pelvianos. Cuatro-cinco arcos viscerales o branquiales

y arcos aórticos. Flexura cervical y cabeza rotada centralmente. Diferenciación de las vesículas

encefálicas definitivas. Circulación embrionaria y extraembrionaria.

Nivel del corte para

extraer el embrión.

Bibliografía

A series of normal stages in the development of the chick embryo. V. Hamburger and H.L.

Hamilton. J. Morphol. 88, 49-92 (1951). (Reprinted 1992, Develop. Dynamics 195, 231-272)

Atlas of Avian Radiographic Anatomy. S.A. Smith and B.J. Smith, Philadelphia: Saunders,

1992

The Avian Egg: Chemistry and Biology. R.W. Burley and D.V. Vadehra, John Wiley & Sons,

New York, 1989

Genetics and Evolution of the Domestic Fowl. L. Stevens, CambridgeUniversity Press, New

York, 1991

A Stereotaxic Atlas of the Brain of the Chick (Gallus domesticus). W.J. Kuenzel and M.

Masson, The Johns Hopkins University Press,Baltimore, MD; 1988

Essential developmental biology: a practical approach. C.D. Stern and P.W.H. Holland, IRL

Press at Oxford University Press, 1993 (avian embryos, pp.45-54)

The atlas of chick development. R. Bellairs and M. Osmond, Academic Press, 1998

Embriología de los animales domésticos. D.M. Noden y A DeLahunta, Acribia, 1990

An atlas of embriology. Freeman and Bracedirdle, Heinemann educational books, 1972

Developmental biology. W.A. Müller, Springer, 1997

Lecciones de embriología veterinaria. A. Sánchez y I. Von Lawzewitsch, Ed. Hemisferio Sur,

1984

Embriología básica de Patten. B.M. Carlson, Interamericana-McGraw-Ill, 1990.

“Transplantation in avian embryos” C.D. Stern, from Essential developmental biology: a

practical approach, IRL Press at Oxford University Press, 1993.

Atlas y guía de laboratorio de embriología de vertebrados. S. Wischnitzer, Ed. Omega,

1980.

Páginas de interés en la red: Muchas de estas páginas están relacionadas con el desarrollo en general o de aves en particular, y otras tratan exclusivamente del “mundo del ave” http://www.ucalgary.ca/UofC/eduweb/virtualembryo/chick.html http://www.devbio.com/ http://www.vlib.org/Biosciences.html http://sdb.bio.purdue.edu/Other/VL_DB.html http://ag.ansc.purdue.edu/poultry/ http://anatomy.med.unsw.edu.au/cbl/embryo/Embryo.htm http://www.med.unc.edu/embryo_images/ http://www.med.uc.edu/embryology/contents.htm http://prex.las.vet.uu.nl/nca/ http://www.msichicago.org/exhibit/chick/chick.html http://www.urbanext.uiuc.edu/eggs/index.html http://www.msstate.edu/dept/poultry/avianemb.htm http://www.augie.edu/perry/ear/portalaudiology.htm http://www.lehman.cuny.edu/depts/biology/aisemberg/LabGuide.html#four http://www.uoguelph.ca/zoology/devobio/24hrchck/24ckintr.htm http://www.bib.ub.es/www4/4wembrio.htm#ema http://chickscope.beckman.uiuc.edu/resources/weblinks/ http://www.msstate.edu/dept/poultry/avianemb.htm#stages