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154 Revista Facultad de Odontología Universidad de Antioquia - Vol. 27 N.o 1 - Segundo semestre, 2015

Abstract. Introduction: ameloblasts are cells responsible for the production and mineralization of the organic matrix of enamel through several stages: pre-secretory, secretory, transition, and maturation. The organic matrix components are produced in the secretory phase. In the maturation phase, the organic component is removed and the mineralization process starts. This process requires the involvement of matrix metalloproteinase 20 (MMP-20), also called enamelysin. Several studies have shown the presence of MMP-20 in tooth development and its relationship to alterations in enamel formation. The objective was: to classify the different studies and laboratory techniques used to demonstrate the involvement of enamelysin in tooth development and its relation to pathologies during enamel formation. Methods: a systematic review was conducted with the following bibliographic databases: PubMed, Science-Direct, Hinari, and SciELO, in order to classify the different studies related to the involvement of MMP-20 in tooth development and the methods to detect its expression, between the years of 2009 and 2014. Results and conclusions: in vitro models show that MMP-20 has specific cleavage sites for enamel matrix proteins. This process is altered by chemical composition, ions, and the presence of hydroxyapatite. Enamel morphology is altered in the knockout models. In human studies, MMP-20 has been associated with increased susceptibility to dental caries, enamel thickness, and dental agenesis.

Key words: enamel development, tooth development, enamelysin, MMP-20, amelogenesis, amelogenesis imperfecta.

Cuellar E, Pustovrh MC. The role of enamelysin (MMP-20) in tooth developement: systematic review. Rev Fac Odontol Univ Antioq 2016; 27(1): 154-176. DOI: http://dx.doi.org/10.17533/udea.rfo.v27n1a8

RECIBIDO: SEPTIEMBRE 16/2014 - ACEPTADO: JUNIO 16/2015

1 Maestría en Ciencias Biomédicas 2013-2015, Universidad del Valle, Especialización Universidad Nacional de Colombia, Sede Bogotá, Ortodoncia y Ortopedia Maxilar 2015-2017.

2 Profesora Deportamento de Morfología Universidad del Valle. Postdoctorado 2006-2007; Postdoctorado Universidad De Chile 2007-2009, Doctorado Universidad de Buenos Aires, Doctor en Ciencias 2002-2006.

El pApEl dE lA EnAmElisinA (mmp-20) En El dEsArrollo dEntArio. rEvisión sistEmáticA

thE rolE of EnAmElysin (mmp-20) in tooth dEvElopmEnt. systEmAtic rEviEw

Estefanía Cuéllar Rivas1, María Carolina Pustovrh Ramos2

rEsUmEn. Introducción: el ameloblasto es la célula encargada de la producción y mineralización de la matriz orgánica del esmalte. Atraviesa varias etapas: la fase pre-secretora, secretora, de transición y maduración. En la fase secretora se producen los componentes de la matriz orgánica. En la fase de maduración se elimina el componente orgánico y se inicia el proceso de mineralización. Este proceso requiere de la participación de la metaloproteinasa de matriz 20 (MMP-20) o también llamada enamelisina. Diversos estudios demuestran la presencia de MMP-20 en el desarrollo dentario y su relación con alteraciones en la formación del esmalte. El objeto fue clasificar los diferentes estudios y técnicas de laboratorio empleadas que demuestren la participación de enamelisina en el desarrollo dentario y su relación con patologías en la formación del esmalte. Métodos: se realizó una revisión sistemática de la literatura con las siguientes bases bibliográficas: PubMed, Science-Direct, Hinari y SciELO, con el fin de clasificar los diferentes estudios relacionados con la participación de MMP-20 en el desarrollo dental y los métodos utilizados para detectar su expresión, entre los años de 2009 a 2014. Resultados y conclusiones: los modelos in vitro evidencian que MMP-20 tiene sitios específicos de escisión para las proteínas de matriz de esmalte. Este proceso se ve alterado por la composición química, iones, y la presencia de hidroxiapatita. En los modelos knockout la morfología del esmalte está alterada. En los estudios en humanos, se ha relacionado la MMP-20 con una mayor susceptibilidad de caries dental, el grosor completo de esmalte y agenesias dentales.

palabras clave: desarrollo del esmalte, desarrollo dental, enamelisina, MMP-20, amelogenesis, amelogenesis imperfecta.

Cuellar E, Pustovrh MC. El papel de la enamelisina (MMP-20) en el desarrollo dentario: revisión sistemática. Rev Fac Odontol Univ Antioq 2016; 27(1): 154-176. DOI: http://dx.doi.org/10.17533/udea.rfo.v27n1a8

1 Master’s Degree in Biomedical Sciences 2013-2015, Universidad del Valle, Specialization at Universidad Nacional de Colombia, Bogotá, Orthodontics and Maxillary Orthopedics 2015-2017.

2 Professor, Morfological Departament, Universidad del Valle, Postdoctoral Fellow 2006-2007; Postdoctoral Fellow, Universidad de Chile 2007-2009, PhD Universidad de Buenos Aires, Doctor in Sciences 2002-2006.

SUMBITTED: SEPTEMBER 16/2014 - ACCEPTED: JUNE 16/2015

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The role of enamelysin (mmP-20) in TooTh develoPmenT. a sysTemaTic review

Revista Facultad de Odontología Universidad de Antioquia - Vol. 27 N.o 1 - Segundo semestre, 2015

introdUcción

Amelogénesis

La morfogénesis de los órganos dentarios inicia a la sexta semana de vida intrauterina en seres humanos (aproximadamente a los cuarenta y cinco días), y en el ratón inicia en el estadio E12.51. El primer indicio consiste en la diferenciación de la lámina dental o listón dentario, originado del ectodermo que reviste la cavidad oral. El ectomesénquima induce a las células basales del epitelio oral a proliferar y formar dos nuevas estructuras: la lámina vestibular y la lámina dentaria. La lámina vestibular formará el surco vestibular y la lámina dentaria dará origen a los crecimientos epiteliales correspondientes a los futuros dientes; 20 deciduos y 32 gérmenes de dentición permanente. De acuerdo a su morfología, los gérmenes dentales seguirán una evolución en: estadio de brote macizo (o yema), estadio de casquete, estadio de campana y estadio de folículo dentario, terminal o maduro.

Es en el estadio de campana el órgano del esmalte pre-senta una nueva capa, el estrato intermedio, ubicado en-tre el retículo estrellado y el epitelio interno. Al finalizar esta etapa de campana, inicia la histogénesis o aposi-ción de los tejidos duros dentarios (dentina y esmalte). Las células que conforman el epitelio interno, también llamadas preameloblastos, se diferencian en ameloblas-tos jóvenes y serán las encargadas de la producción del esmalte.

El esmalte, también conocido con el nombre de sustan-cia o tejido adamantino, está ubicado en la porción co-ronal cubriendo la dentina subyacente. Se origina del ór-gano del esmalte, y es el tejido más duro del organismo. Está constituido por los prismas de esmalte, los cuales están altamente mineralizados, ubicados desde la cone-xión amelodentinal (CAD) a la superficie externa o libre en contacto con la cavidad oral. La matriz inorgánica del esmalte la conforman los cristales de hidroxiapatita y re-presenta un 95%. Estos están constituidos por fosfato de calcio y se encuentran densamente compactados. La matriz orgánica del esmalte es de naturaleza proteica;

introdUction

Amelogenesis

The morphogenesis of dental organs begins during the sixth week of intrauterine life in humans (approximately at forty-five days), and in mice it begins during the E12.5 stage.1 The first indication is the differentiation of dental lamina or slat tooth, originated from the ectoderm that covers the oral cavity. The ectomesenchyme induces oral epithelial basal cells to proliferate and form two new structures: the vestibular lamina and the dental lamina. The vestibular lamina forms the vestibular groove while the dental lamina generates the corresponding epithelial growth of future teeth: 20 deciduous teeth and 32 germs of permanent teeth. According to their morphology, dental germs will continue their evolution in these stages: stage of massive outbreak (or yolk), cap stage, bell stage, and stage of tooth follicle, either terminal or mature.

It is at the bell stage the enamel organ presents a new layer—the intermediate layer—located between the inner epithelium and the stellate reticulum. Histogenesis or apposition of the dental hard tissues (enamel and dentin) begins at the end of the bell stage. Cells forming the inner epithelium, also called pre-ameloblasts, differentiate from young ameloblasts and will be responsible for enamel production.

Enamel, also known as adamantine substance or tissue, is located in the coronal portion covering the underlying dentin. It originates from the enamel organ, and is the hardest tissue of the body. It consists of enamel prisms, which are highly mineralized, located from the dentin-enamel junction (DEJ) to the external surface in contact with the oral cavity. Hydroxyapatite crystals form the inorganic enamel matrix and represents 95% of it. These are composed of calcium phosphate and are densely compacted. The organic matrix of enamel is protein in nature;

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El papEl dE la EnamElisina (mmp-20) En El dEsarrollo dEntario: rEvisión sistEmática


sin embargo, en su composición química no participa el colágeno. Está en menor proporción y representa el 0,36-2%.

El estadio de campana será de gran importancia para la formación de la morfología coronal por acción de se-ñales específicas del ectomesénquima adyacente sobre este epitelio interno. Este patrón coronal se determinará previo a la aposición y mineralización de los tejidos den-tales.

El ameloblasto es la célula encargada de la secreción de la matriz orgánica, y durante la formación del ger-men dentario atraviesa una serie de etapas o estadios, las cuales se caracterizan por presentar cambios funcio-nales y ultraestructurales que dependen de la actividad celular, de acuerdo a los procesos de formación o ma-duración del esmalte. Por tal motivo encontramos cuatro etapas importantes para el desarrollo del esmalte: la fase pre-secretora, secretora, de transición y maduración.2

El desarrollo del esmalte o amelogénesis comprende dos etapas: la primera es la formación de una matriz orgánica extracelular y la segunda es el proceso de mineralización de esta matriz, la cual comprende a su vez la formación y elongación de los cristales y la eliminación de la matriz orgánica y la maduración de los cristales.

Los ameloblastos se diferencian a partir del epitelio inter-no del órgano del esmalte. Antes de que se lleve a cabo este proceso, se requiere de la presencia de la dentina. A este estadio se le denomina presecretorio, donde antes de la formación mineral se requiere la deposición de predentina por los odontoblastos en la futura unión amelodentinal.

En el estadio secretorio, se caracteriza porque los preameloblastos se transforman en células secretoras, diferenciadas, muy especializada y ha perdido la capacidad de hacer mitosis. Son células cilíndricas de 60 μm de altura aproximadamente. A nivel ultraestructural presenta abundantes mitocondrias, complejo de Golgi, RER distribuido por toda la célula y más desarrollado en el polo proximal. Presenta microfilamentos de tubulina, α-actinina, vinculina y prequeratinas. Además, presenta vesículas llamadas

however, collagen is not involved in its chemical composition, having a reduced proportion representing 0.36-2%.

The bell stage will be of great importance for the formation of the coronal morphology by the action of specific signs of adjacent ectomesenchyme on this inner epithelium. This coronal pattern will be determined prior apposition and mineralization of dental tissues.

Ameloblasts are cells responsible for the secretion of organic matrix, and during the formation of the tooth germ they go through a series of steps or stages, which are characterized by functional and ultrastructural changes dependent on cell activity, according to the formation processes or enamel maturation. This is why there are four important stages in the development of enamel: pre-secretory, secretory, transition, and maturation.2

Enamel development or amelogenesis includes two stages: a) the formation of extracellular organic matrix and b) the process of matrix mineralization, which at the same time includes the formation and elongation of crystals and the elimination of organic matrix and crystals maturation.

Ameloblasts differentiate from the inner epithelium of the enamel organ. For this process to take place, it requires the presence of dentin. This stage is called pre-secretory, which prior to the formation of mineral requires pre-dentine deposition by odontoblasts in the future dentin-enamel junction.

During the secretory stage, pre-ameloblasts are transformed into secretory differentiated cells, which are highly specialized and have lost the ability to undergo mitosis. They are columnar cells of nearly 60 μm in height. At the ultrastructural level, there are abundant mitochondria, Golgi complex, and RER distributed throughout the entire cell and more developed in the proximal pole. It presents microfilaments of tubulin, α-actinin, vinculin, and pre-keratins. In addition, it has vesicles called

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cuerpos ameloblásticos o cuerpos adamantinos, las cuales son formaciones de tipo granular, y son precursores de la matriz orgánica del esmalte. Su contenido no se conoce con exactitud, se cree que son de naturaleza proteica y algunos autores consideran que pueden tener sales minerales cálcicas en forma soluble.

Una vez estos cuerpos ameloblásticos son formados en el complejo de Golgi, migran al polo proximal del ameloblasto, donde se liberan contra la dentina formada. Es así que se forma la primera capa de esmalte aprismático. Los ameloblastos se alejan de la superficie de la dentina y se forman los procesos de Tomes, estructura que se encarga de la formación de los cristales. Mientras esto ocurre, el ameloblasto produce cuatro proteínas diferentes y las secreta en la matriz de esmalte. Tres de estas son proteínas estructurales y una es una proteinasa. La amelogenina (AMELX) representa un 80-90% de la matriz orgánica, y la ameloblastina (AMBN) y enamelina (ENAM) representan el 5% y 3-5% respectivamente, y la proteinasa, que es una metaloproteinasa de matriz-20 (MMP-20, enamelisina), que está en cantidades variables. Finalizando la etapa secretoria, se alcanza el espesor total de la capa de esmalte.

El inicio del estado de transición del diente en desarrollo varía según el diente, al igual que entre las especies. En esta etapa el ameloblasto reduce su tamaño, aumentan su diámetro transversal y complejo de Golgi y su RER disminuye de volumen. El proceso de Tomes desaparece y en el polo proximal aparecen microvellosidades e invaginaciones tubulares. Estas estructuras les permiten tener capacidad absortiva y eliminar agua y matriz orgánica del esmalte. Esto facilita el posterior aumento de componente orgánico y la transformación a un esmalte maduro. En este estadio los ameloblastos sintetizan ATPasa dependiente del calcio y enzimas lisosómicas y fosfatasa alcalina. En la fase de transición muere el 25% de los ameloblastos y en la etapa de maduración muere el otro 25%.

Cuando se ha conformado el esmalte maduro, el ameloblasto entra en estado de regresión,

ameloblastic bodies or enamel bodies, which are granular formations and are precursors of the organic matrix of the enamel. Their content is not known with accuracy, but they are believed to be protein in nature and some authors consider that they can have mineral calcium salts in soluble form.

Once these ameloblastic bodies are formed in the Golgi complex, they migrate to the proximal pole of ameloblast, where they are released towards the formed dentin. This is how the first layer of aprismatic enamel forms. Ameloblasts move away from the surface of the dentin forming the Tomes processes—a structure responsible for the formation of crystals—. While this happens, the ameloblast produces four different proteins and secretes them into the enamel matrix. Three of these are structural proteins and one is a proteinase. Amelogenin (AMELX) represents 80-90% of the organic matrix, while ameloblastin (AMBN) and enamelin (ENAM) represent 5 and 3-5% respectively. Proteinase, which is a matrix metalloproteinase 20 (MMP-20, enamelysin) is in variable amounts. The total thickness of the enamel layer is achieved at the end of the secretory stage.

The beginning of the transitional stage varies among species and according to the developing tooth. At this stage, the ameloblast reduces in size, while it’s transverse diameter and Golgi complex increase and its RER decreases in volume. The Tomes’ process disappears and in the proximal pole there are microvilli and tubular invaginations. These structures allow them to have absorptive capacities and to eliminate water and organic matrix from the enamel. This facilitates the subsequent increase of organic component and the transformation to mature enamel. At this stage, ameloblasts synthesize calcium-dependent ATPase as well as lysosomic enzymes and alkaline phosphatase. 25% of ameloblasts die in the transition phase, and another 25% dies in the maturation stage.

When the mature enamel has formed, the ameloblast enters in a state of regression,

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las células se fusionan con el resto de las capas del órgano del esmalte. Estos estratos conformarán una capa estratificada llamada epitelio reducido del esmalte, cuya función será la protección del esmalte maduro. Si este epitelio se degenera prematuramente, no puede haber erupción dentaria.3

metaloproteinasa de matriz 20 (mmp-20)/

Enamelisina

Las metaloproteinasas de matriz (MMPs) son una familia de proteinasas secretadas como proenzimas o zimógeno inactivo responsables de la degradación de componen-tes de la matriz extracelular (MEC), y su actividad está regulada por sus inhibidores endógenos o TIMPs. Las MMPs participan en procesos normales del desarrollo embrionario, en la reproducción (ciclo endometrial) y el mantenimiento (remodelado del hueso), y en procesos patológicos como la destrucción del tejido (enfermedad periodontal, caries, inflamación pulpar) y enfermedades fibróticas (esclerosis múltiple). Los miembros de esta familia se han clasificado en seis grupos diferentes, de acuerdo a su organización estructural y funcional.4

Al grupo de las colagenasas pertenecen la MMP-1,

MMP-8, MMP-13 y MMP-18. Estas enzimas se encargan

de degradar colágeno intersticial I, II, y III y otros

componentes de la matriz extracelular. El siguiente grupo

son las gelatinasas, la gelatinasa A (MMP-2) y gelatinasa B

(MMP-9). Estas se encargan de la degradación de

colágenos desnaturalizados y laminina. El tercer grupo

son las estromelisinas; estromelisina 1 (MMP-3)

y estromelisina 2 (MMP-10) y degradan diferentes

componentes de la MEC. Entre estos encontramos

fibronectina, laminina, proteoglicanos y colágenos no

fibrilares IV, V, IX, y X. Las matrilisinas se caracterizan por

la ausencia de un dominio de hemopexina, y pertenecen

la matrilisina 1 (MMP-7) y matrilisina 2 (MMP-26). Las

metaloproteinasas tipo membrana (MT-MMPs) son: MMP-

14, MMP-15, MMP-16, MMP-17, MMP-24 y MMP-25.

Por último, encontramos siete MMPs que no han sido

and the cells merge with the rest of the layers of the enamel organ. These strata form a stratified layer known as reduced enamel epithelium, functioning as protection of mature enamel. If this epithelium degenerates prematurely, there can be no tooth eruption.3

matrix metalloproteinase 20 (mmp-20) /

Enamelysin

Matrix metalloproteinases (MMPs) are a family of proteinases secreted as proenzymes or inactive zymogen responsible for the degradation of extracellular matrix (ECM) components, and their activity is regulated by its endogenous inhibitors or TIMPs. MMPs are involved in normal processes of embryonic development, in reproduction (endometrial cycle) and maintenance (bone remodeling), as well as in pathological processes such as the destruction of tissue (periodontal disease, tooth decay, pulp inflammation) and fibrotic diseases (multiple sclerosis). Members of this family have been classified into six groups, according to their structural and functional organization.4

The group of collagenases belong to the MMP-1, MMP-8, MMP-13, and MMP-18. These enzymes are responsible for degrading interstitial collagen I, II, and III and other components of the extracellular matrix. The next group is the gelatinases: gelatinase A (MMP-2) and gelatinase B (MMP-9). These are responsible for the degradation of denatured collagen and laminin. The third group are the stromelysins: stromelysin-1 (MMP-3) and stromelysin 2 (MMP-10), which degrade various components of the MEC. These include fibronectin, laminin, and proteoglycans and non-fibrillar collagens IV, V, IX, and X. Matrilysins are characterized by the absence of hemopexin domain, and include the matrilysin 1 (MMP-7) and matrilysin 2 (MMP-26). Membrane-type Metalloproteinases (MT-MMPs) are: MMP-14, MMP-15, MMP-16, MMP-17, MMP-24, and MMP-25. Finally, there are seven MMPs that have

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clasificadas en ninguno de los grupos mencionados,

entre estas encontramos la enamelisina (MMP-20) que

se encarga de la degradación de la amelogenina.5

En los últimos años se demostró que el componente proteico del esmalte maduro disminuía significativamente en comparación con el esmalte inmaduro. En el proceso de amelogénesis, encontramos los siguientes componentes de la matriz orgánica del esmalte: la tuftelina, o también llamada proteína de flecos, y la sialofosfoproteina dentinaria (DSP) en la unión amelodentinaria. Posteriormente, se producen las amelogeninas, que conforman el 90% de la materia orgánica y van disminuyendo a medida que el esmalte avanza hasta su estado de maduración. La enamelina y la ameloblastina se forman en último lugar, y en este momento participan las MMPs presentes en la fase secretora de los ameloblastos y proteasas de serina, las cuales se asocian en la parte superficial de los cristales de esmalte y en la fase de maduración.

Múltiples investigaciones sugieren que, en el esmalte en desarrollo, las MMPs intervienen en un cambio de los componentes de la matriz orgánica cuando los ameloblastos pasan de la fase secretora a la fase de maduración. Se ha demostrado que la MMP-20 tiene habilidad para escindir la amelogenina y enamelina y es la única MMP durante la fase secretora. También es capaz de escindir la pro-KLK4 (peptidasa relacionada con la calicreína 4) para producir la serinproteasa KLK4 activa. También se demostró que la MMP-20 degrada E-cadherina, caseína y/o gelatina, agrecano, colágeno tipo IV, V, tenascina-C, laminina-1, laminina-5.6

La enamelisina o MMP-20 fue inicialmente clonada del órgano del esmalte de porcino, además por técnicas de hibridación in situ se ha demostrado que tanto los ameloblastos como odontoblastos presentan transcriptos de MMP-20.7 Asimismo, muy pocas líneas celulares expresan MMP-20, como el diente en desarrollo y el intestino grueso, pero no se halló expresión en tejidos como el intestino delgado, riñón, hígado, páncreas, cerebro, pulmón, bazo o estómago.8 Esta MMP fue localizada en algunas condiciones patológicas

not been classified in any of the abovementioned groups, including enamelysin (MMP-20) which is responsible for amelogenin degradation.5

In recent years, it has been shown that the protein component of mature enamel significantly decreases in comparison with immature enamel. During amelogenesis, there exist the following components of the organic matrix of enamel: tuftelin, also known as fringe protein, and dental sialophosphoprotein (DSP) in the amelodentinal junction. Amelogenins appear later, making up 90% of the organic matter and decreasing as the enamel progresses to its maturation stage. Enamelin and ameloblastin form in the last place, with participation of the MMPs that are present in the secretory phase of ameloblasts and serine proteases, which are associated in the superficial part of enamel crystals and the maturation stage.

Several studies suggest that, in developing enamel, MMPs participate in a change of the components of the organic matrix when ameloblasts move from the secretory phase to the maturation phase. It has been shown that MMP-20 has the ability to split amelogenin and enamelin and is the only MMP during the secretory phase. It is also capable of splitting the pro-KLK4 (4 kallikrein-related peptidase) to produce active KLK4 serinprotease. It has also been shown that the MMP-20 degrades E-cadherin, casein and/or gelatin, agrecane, type IV and type V collagen, tenascin-C, laminin-1, and laminin-5.6

Enamelysin or MMP-20 was originally cloned from porcine enamel organ, and by in situ hybridization techniques it has been shown that both ameloblasts and odontoblasts present transcripts of MMP-20.7 Also, very few cell lines express MMP-20, such as tooth development and the large intestine, but its expression has not been found in tissues such as small intestine, kidney, liver, pancreas, brain, lung, spleen, or stomach.8 This MMP was found in some pathological

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como en quistes odontogénicos calcificantes, tumores odontogénicos, células del carcinoma de lengua humana.9-11 Por estas razones, es considerada una MMP específica del diente.

En las últimas décadas se ha destacado la importancia de la enamelisina en el desarrollo dentario, específica-mente en la formación del esmalte, y cómo alteraciones en su expresión pueden llevar a la formación de patolo-gías como la amelogénesis imperfecta.12-13 Por tal moti-vo, el objetivo de esta revisión es clasificar los diferentes estudios y técnicas de laboratorio empleadas, que de-muestren la participación de enamelisina en el desarrollo dentario y su relación con patologías en la formación del esmalte.

mÉtodos

Se realizó una revisión sistemática de la literatura con las siguientes bases bibliográficas: PubMed, Science-Direct, Hinari y SciELO, con las palabras clave enamel develop-ment, tooth development, enamelysin, MMP-20, amelo-genesis imperfecta, con el fin de clasificar los diferentes estudios relacionados con la participación de MMP-20 en el desarrollo dental y los métodos utilizados para de-tectar su expresión, entre los años de 2009 a 2014.

rEsUltAdos

En esta revisión sistemática se presentan los dife-rentes estudios, tanto en modelos in vitro, cultivos celulares, estudios en animales como en humanos, relacionados con enamelisina y desarrollo dentario. Se tuvieron en cuenta 19 referencias. Los resultados se presentan en la tabla 1.

conditions such as calcifying odontogenic cysts, odontogenic tumors, and cells of human tongue carcinoma.9-11 For these reasons, it is considered an MMP specific to tooth.

The importance of enamelysin in tooth development has been highlighted in recent decades, specifically in the formation of enamel, and in how alterations in their expression can lead to the formation of pathologies such as amelogenesis imperfecta.12-13 For this reason, the objective of this review is to classify the different studies and laboratory techniques, showing the participation of enamelysin in tooth development and its relation to pathologies in the formation of enamel.

mEthods

A systematic review was conducted with the following bibliographic databases: PubMed, Science-Direct, Hinari, and SciELO, using these keywords: enamel, tooth development, enamelysin, MMP-20, amelogenesis imperfecta, in order to classify the different studies related to the participation of MMP-20 in tooth development and the methods used to detect its expression, between the years of 2009 and 2014.

rEsUlts

This systematic review presents the different studies in in vitro models, cell cultures, and animal studies as well as in humans, related to enamelysin and tooth development. 19 references were taken into account. The results are listed in table 1.

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Tabl

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1-kD

a y

6-kD

a. M

MP-

20 s

e un

e a

prod

ucto

s de

LRA

P. En

tre e

stos

siti

os d

e un

ión

clav

e,

Klk4

se

pudo

uni

r sol

o de

spué

s de

His

.

Chun

y c

olab

orad

ores

(15)

2010

Prob

ar la

hip

ótes

is q

ue M

MP-

20,

pero

no

Klk4

, pue

den

cata

lizar

las

unio

nes

que

gene

ran

los

prod

ucto

s de

am

elob

last

ina

que

acum

ulan

dur

ante

el

esta

dio

secr

etor

io d

e la

am

elog

énes

is,

y pr

esen

tar u

na h

ipót

esis

sob

re la

pr

ogre

sión

de

la u

nión

de

amel

obla

stin

a pu

ede

ocur

rir in

viv

o

Segu

ndos

mol

ares

no

erup

cion

ados

de

cerd

os d

e 6

mes

es d

e ed

ad

Expr

esió

n, p

urifi

caci

ón y

car

acte

rizac

ión

de a

mel

obla

stin

a re

com

bina

nte

(rAm

bn),

aisl

amie

nto

de M

MP-

20 re

com

bina

nte

( rM

MP-

20),

dige

stió

n de

rAm

bn c

on rM

MP-

20 y

Klk

4, s

ecue

ncia

ción

de

N-te

rmin

al,

elec

trofo

resi

s (S

DS-P

AGE)

, Wes

tern

blo

t, es

pect

rom

etría

de

mas

a, c

rom

atog

rafía

líq

uida

de

alta

efic

acia

MM

P-20

se

une

a ca

da p

éptid

o ex

acto

en

sitio

s co

rres

pond

ient

es d

e un

ione

s de

am

elob

last

ina

cata

lizad

as in

viv

o. L

a M

MP-

20 e

s la

enz

ima

que

proc

esa

la a

mel

obla

stin

a du

rant

e el

est

adio

sec

reto

rio

de la

am

elog

énes

is

Lee

y co

labo

rado

res

(22)

2010

Desc

ubrir

los

mec

anis

mos

mol

ecul

ares

re

spon

sabl

es d

e la

regu

laci

ón d

e la

M

MP-

20

Man

díbu

las

y m

axila

res

de

rato

nes

de 1

6 dí

as d

e ed

ad

Inm

unoh

isto

quím

ica,

RT-

PCR,

cul

tivo

celu

lar A

LC, m

icro

scop

ía d

e flu

ores

cenc

ia,

expr

esió

n y

purifi

caci

ón d

e pr

oteí

nas

ODAM

re

com

bina

nte

de ra

ta(r

odam

, Wes

tern

blo

t, en

sayo

de

luci

fera

sa,

ensa

yo d

e In

mun

opre

cipi

taci

ón d

e la

cr

omat

ina

(CHI

P), z

imog

rafía

de

case

ína,

tin

ción

por

aliz

arin

a

En

la fa

se s

ecre

tora

de

la a

mel

ogén

esis

ODA

Mse

loca

lizó

en e

l núc

leo

y ci

topl

asm

a de

am

elob

last

os y

en

la e

tapa

de

mad

urac

ión

se o

bser

vó e

n el

cito

plas

ma

y en

la in

terf

az e

ntre

am

elob

last

os y

la c

apa

de e

smal

te,

pero

no

en e

l núc

leo.

ODA

M s

e de

tect

ó en

la lí

nea

celu

lar d

el li

naje

am

elob

lást

ico

(ALC

), qu

e co

inci

dió

con

la e

tapa

de

mad

urac

ión

de la

am

elog

énes

is. L

a ex

pres

ión

de R

unx2

y O

DAM

nuc

lear

, cor

rela

cion

an c

on

la e

xpre

sión

de

MM

P-20

en

ALC.

La

expr

esió

n de

MM

P-20

ace

lera

el p

roce

sam

ient

o de

am

elog

enin

a du

rant

e la

min

eral

izaci

ón d

el e

smal

te. S

e su

gier

e qu

e Ru

nx2

regu

la la

exp

resi

ónde

ODA

M y

que

ODA

M n

ucle

ar ti

ene

una

func

ión

regu

lado

ra im

port

ante

en

la m

iner

aliza

ción

del

esm

alte

a

travé

s de

la re

gula

ción

de

la M

MP-

20

Sun

y co

labo

rado

res

(16)

2010

Exam

inar

la h

ipót

esis

de

que

la h

idro

xia-

patit

a (H

AP) p

uede

afe

ctar

la p

rote

ólis

is

de a

mel

ogen

ina

por M

MP-

20 y

KLK

4

Amel

ogen

ina

de c

erdo

re

com

bina

nte

(rP1

72),

MM

P-20

reco

mbi

nant

e de

cer

do

(rpM

MP-

20)

Crom

atog

rafía

líqu

ida

de a

lta e

ficac

ia,

prot

eólis

is e

n pr

esen

cia

de H

AP

Se e

ncon

tró u

na re

laci

ón d

istin

ta d

e do

sis

depe

ndie

nte

entre

la c

antid

ad d

e HA

P, pr

esen

te e

n la

mez

cla

de

prot

eólis

is y

el r

ango

de

degr

adac

ión

por r

pMM

P-20

, m

ient

ras

que

el e

fect

o de

HAP

en

prot

eólis

is d

e rP

172

o rP

148

por r

hKLK

4, fu

e m

enos

pro

min

ente

162



Auto

res

Año

Obje

tivo

del e

stud

ioM

uest

raM

étod

osRe

sulta

dos

Yam

akos

hi y

co

labo

rado

res

(17)

2011

Anal

izar p

rote

ínas

de

esm

alte

y

prot

easa

s en

rato

nes

silv

estre

s, M

MP-

20 n

ulo,

KLK

4 nu

lo y

dob

le n

ulo

de

Mm

p-20

/KLK

4 en

los

prim

eros

mol

ares

m

axila

res

de ra

tón

en e

l est

adio

sec

re-

tor,

esta

dio

de m

adur

ació

n y

ante

s de

la

erup

ción

de

los

dien

tes

Rato

nes

silv

estre

s, k

nock

out

KLK4

, MM

P20

cepa

C5

7BL/

6J, r

aton

es d

oble

nu

los

Mm

p20/

Klk4

Geno

tipifi

caci

ón p

or P

CR, h

isto

logí

a,

inm

unoh

isto

quím

ica,

cro

mat

ogra

fía lí

quid

a de

alta

efic

acia

, zim

ogra

fía, W

este

rn b

lot,

elec

trofo

resi

s co

n ge

l de

polia

crila

mid

a

Solo

am

elog

enin

as in

tact

as y

am

elob

last

ina

fuer

on

obse

rvad

as e

n el

est

adio

sec

reto

r de

esm

alte

par

a el

rató

n nu

lo d

e M

MP-

20, m

ient

ras

que

la m

atriz

del

es

tadi

o se

cret

or d

el ra

tón

nulo

de

KLK4

fue

idén

tico

al ra

tón

silv

estre

. May

or c

onte

nido

de

mat

riz re

sidu

al

fue

obse

rvad

o en

el r

atón

dob

le n

ulo

com

para

do c

on

cual

quie

ra d

e lo

s nu

los

indi

vidu

ales

.

Bart

lett

y co

labo

rado

res

(26)

2011

Dem

ostra

r los

cam

bios

en

esta

dio

secr

etor

de

amel

obla

stos

usa

ndo

un

mod

elo

knoc

kout

de

MM

P-20

Inci

sivo

s de

rató

n ad

ulto

cep

a C5

7BL/

6 M

icro

scop

ía e

lect

róni

ca d

e ba

rrid

o, m

icro

s-co

pía

óptic

a co

n az

ul d

e to

luid

ina

En e

l rat

ón k

nock

out d

e M

MP-

20 s

e en

cuen

tran:

form

a de

nód

ulos

cal

cific

ados

dur

ante

el e

stad

io d

e m

adu-

raci

ón e

n el

esm

alte

en

desa

rrol

lo, l

os a

mel

obla

stos

en

est

e es

tadi

o cu

bren

com

plet

amen

te e

stos

nód

ulos

, el

esm

alte

se

cone

cta

solo

vag

amen

te a

la d

entin

a su

byac

ente

y e

l pat

rón

de lo

s pr

ism

as d

e es

mal

te e

s un

a m

alfo

rmac

ión

seve

ra

Usko

kovi

c y

cola

bora

dore

s

(20)

2011

Obte

ner i

nfor

mac

ión

sobr

e el

mec

anis

-m

o de

am

elog

énes

is a

esc

ala

mol

ecul

ar

invo

lucr

ado

en e

l dis

eño

de u

n si

stem

a de

val

orac

ión

biom

imét

ico

Amel

ogen

ina

de lo

ngitu

d co

mpl

eta

(rH1

74) y

MM

P-20

fuer

on s

inte

tizad

as

prev

iam

ente

vía

exp

resi

ón e

n BL

21(D

E3) p

lysS

Esc

heric

hia

coli

SDS-

PAGE

, MAL

DI-T

OF(d

esor

ción

/ioni

zaci

ón lá

ser a

sist

ida

por

mat

riz)

La p

rote

ólis

is e

jerc

e un

a nu

clea

ción

adi

cion

al y

el

efec

to p

rom

otor

del

cre

cim

ient

o. L

a hi

dról

isis

de

amel

o-ge

nina

de

long

itud

com

plet

a po

r la

MM

P-20

dis

min

uye

el ti

empo

crít

ico

nece

sario

par

a la

pro

teín

a, y

pép

tidos

pa

ra a

dher

irse

y pa

ra c

ubrir

el s

ustra

to

Kuch

ler y

co

labo

rado

res

(32)

2011

Inve

stig

ar la

aso

ciac

ión

posi

ble

entre

M

MP1

, MM

P3 y

MM

P-20

en

la a

gene

-si

a de

ntal

Cien

to s

esen

ta y

sie

te

fam

ilias

nucl

eare

s de

dos

di

fere

ntes

pob

laci

ones

fu

eron

ana

lizad

as, 1

16 d

e Br

asil

y 51

de

Turq

uía.

Los

pa

rtic

ipan

tes

tení

an a

l men

os

un d

ient

e au

sent

e

Mue

stra

s de

DNA

fuer

on o

bten

idas

y

geno

tifica

das

usan

do q

uím

ica

de T

aqm

an.

Adem

ás, M

MP2

0 fu

e se

lecc

iona

da p

ara

reac

ción

de

la c

aden

a de

la p

olim

eras

a en

tie

mpo

real

con

SYB

R Gr

een

en e

l des

arro

-llo

den

tal d

el ra

tón

Asoc

iaci

ones

ent

re la

s ag

enes

ias

dent

ales

y M

MP1

(p

= 0

.007

) y M

MP2

0 (p

= 0

.03)

fuer

on e

ncon

trada

s en

las

fam

ilias

bras

ilera

s

Conc

lusi

ón: M

MP-

1 y

MM

P-20

jueg

an u

n ro

l im

port

ante

en

la a

gene

sia

dent

al e

n hu

man

os

Brom

ley

y co

labo

rado

res

(19)

2012

Usar

la c

alci

ta c

omo

un s

iste

ma

min

eral

pa

ra e

xam

inar

los

efec

tos

de la

dig

es-

tión

de p

rote

ínas

dur

ante

el c

reci

mie

nto

del c

rista

l y, p

or lo

tant

o, p

ropo

rcio

nar

info

rmac

ión

sobr

e el

pap

el p

reci

so d

e la

M

MP-

20 e

n el

des

arro

llo d

e es

mal

te

Amel

ogen

ina

hum

ana

reco

mbi

nant

e (r

hMM

P-20

), am

elog

enin

a re

com

bina

nte

porc

ina

(rP1

72)

Expr

esió

n y

purifi

caci

ón d

e pr

oteí

nas,

el

ectro

fore

sis

en g

el, e

spec

trom

etría

ul

travi

olet

a, v

isib

le, c

rista

lizac

ión

calc

ita, d

i-ge

stió

n am

elog

enin

a po

r rhM

MP2

0 du

rant

e cr

ista

lizac

ión

, mic

rosc

opía

ele

ctró

nica

de

barr

ido

y m

icro

-esp

ectro

scop

ía R

aman

, m

icro

scop

ía d

e fu

erza

ató

mic

a

La a

mel

ogen

ina

de lo

ngitu

d co

mpl

eta

se u

ne fu

erte

-m

ente

, la

amel

ogen

ina

trunc

ada

se u

ne d

ébilm

ente

y

el s

olo

extre

mo

C-te

rmin

al ti

ene

la in

tera

cció

n m

ás

débi

l. En

cua

nto

a cr

ecim

ient

o de

cris

tale

s de

esm

alte

, la

pre

venc

ión

de la

ocl

usió

n en

cris

tale

s de

esm

alte

en

mad

urac

ión

podr

ía s

er u

n gr

an b

enefi

cio

resu

ltant

e de

la e

scis

ión

sele

ctiv

a de

am

elog

enin

a en

el e

xtre

mo

C-te

rmin

al p

or la

MM

P-20

Lee

y co

labo

rado

res

(23)

2012

Inve

stig

ar la

exp

resi

ón c

elul

ar y

loca

-liz

ació

n su

bcel

ular

de

ODAM

en

ame-

lobl

asto

s, o

dont

obla

stos

, ost

eobl

asto

s y

vario

s tip

os d

e cé

lula

s ca

ncer

ígen

as

para

det

erm

inar

las

corr

elac

ione

s en

tre

ODAM

y M

MP-

20, y

defi

nir n

uevo

s ro

les

func

iona

les

de O

DAM

Mol

ares

de

rató

n po

stna

tale

s P0

, P3,

P10

, P14

, cél

ulas

en

culti

vo A

LC, L

S8, M

DPC-

23, M

G-63

, cél

ulas

H12

99,

AGS,

HeL

a, M

CF-7

, cél

ulas

ca

ncer

ígen

as S

K-BR

y c

élul

as

de c

ánce

r epi

telia

l de

mam

a M

CF-1

0A

Inm

unoh

isto

quím

ica,

inm

unofl

uore

scen

cia

indi

rect

a po

r cul

tivo,

Wes

tern

blo

t

ODAM

fue

loca

lizad

a en

am

elob

last

os, o

dont

obla

stos

y

oste

obla

stos

in v

ivo

e in

vitr

o. A

dem

ás, O

DAM

fue

lo-

caliz

ada

en e

l cito

plas

ma

y el

núc

leo

de a

mel

obla

stos

y

odon

tobl

asto

s ex

pres

ando

MM

P-20

, per

o so

lo e

n el

ci-

topl

asm

a de

ost

eobl

asto

s qu

e no

exp

resa

ban

MM

P-20

. Es

tos

resu

ltado

s su

gier

en q

ue e

l pat

rón

de e

xpre

sión

y

loca

lizac

ión

subc

elul

ar d

e OD

AM e

s al

tam

ente

var

iabl

e y

depe

ndie

nte

de lo

s tip

os c

elul

ares

y s

us e

stad

ios

de d

ifere

ncia

ción

, y la

cor

rela

ción

func

iona

l exi

sten

te

entre

ODA

M y

MM

P-20

. Se

prov

ee la

prim

era

evid

enci

a de

ODA

M e

n m

últip

les

com

part

imie

ntos

cel

ular

es d

e di

fere

ncia

ción

odo

ntog

énic

a y

línea

s ce

lula

res

canc

erí-

gena

s co

n im

port

ante

s im

plic

acio

nes

func

iona

les

163



Auto

res

Año

Obje

tivo

del e

stud

ioM

uest

raM

étod

osRe

sulta

dos

Taka

hash

i y

cola

bora

dore

s

(18)

2012

Exam

inar

la d

istri

buci

ón y

la e

xpre

-si

ón d

e am

elog

enin

a, a

mel

obla

stin

a,

MM

P-20

y K

LK-4

des

pués

de

culti

var

en u

na m

ezcl

a de

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ulas

epi

telia

les

de

Mal

asse

z y

fibro

blas

tos

del l

igam

ento

pe

riodo

ntal

par

a ob

tene

r con

tact

o ce

lula

r dire

cto

Terc

eros

mol

ares

fuer

on

cole

ccio

nado

s de

28

indi

vi-

duos

(21-

28 a

ños)

. Cul

tivos

ce

lula

res

de e

xpla

ntes

de

tejid

os d

el li

gam

ento

per

io-

dont

al c

onte

nien

do c

élul

as

epite

liale

s de

Mal

asse

z y

fibro

blas

tos

del l

igam

ento

pe

riodo

ntal

Inm

unoh

isto

quím

ica,

hib

ridac

ión

in s

itu,

RT-P

CR

Los

resu

ltado

s de

inm

unoh

isto

quím

ica

reve

lan

pobr

e ex

pres

ión

de a

mel

ogen

ina,

am

elob

last

ina,

MM

P-20

y

KLK4

en

célu

las

epite

liale

s de

Mal

asse

z co

-cul

-tiv

adas

con

fibr

obla

stos

del

liga

men

to p

erio

dont

al.

La h

ibrid

ació

n in

situ

y R

T-PC

R co

nfirm

an e

xpre

sión

de

mRN

A de

est

os fa

ctor

es e

n cé

lula

s co

-cul

tivad

as

com

para

das

con

las

célu

las

cont

rol.

mRN

A de

MM

P-20

no

se

expr

esó

en la

s cé

lula

s co

ntro

l. Es

tos

resu

ltado

s su

gier

en q

ue la

s in

tera

ccio

nes

epite

lio m

esen

quim

ales

pr

omue

ven

la d

ifere

ncia

ción

de

célu

las

epite

liale

s de

M

alas

sez

hum

anas

y la

intro

ducc

ión

de p

rote

asas

de

mat

riz d

e es

mal

te fa

cilit

an la

deg

rada

ción

de

prot

eína

s de

mat

riz d

e es

mal

te

Tann

ure

y co

labo

rado

res

(29)

2012

Eval

uar l

a as

ocia

ción

ent

re M

MP-

20 y

la

exp

erie

ncia

de

carie

s en

los

niño

s br

asile

ros

Niño

s no

rela

cion

ados

de

5-14

año

s co

n o

sin

carie

s n=

388

Exam

en c

línic

o od

onto

lógi

co, R

T-PC

R,

De 3

88 s

ujet

os, 1

61 fu

eron

niñ

os li

bres

de

carie

s.

No h

ay d

ifere

ncia

s en

tre lo

s ni

vele

s de

car

ies

y la

di

strib

ució

n ge

notíp

ica

en la

coh

orte

tota

l. Di

fere

n-ci

as e

n la

dis

tribu

ción

gen

otíp

ica

fuer

on o

bser

vada

s en

los

niño

s lib

res

de c

arie

s vs

. niñ

os c

on c

arie

s en

ca

ucás

icos

(p=

0,03

). El

aná

lisis

de

regr

esió

n, a

just

ado

para

el g

enot

ipo

y et

nici

dad,

con

firm

a qu

e la

inge

stió

n de

dul

ces

entre

las

com

idas

aum

enta

el r

iesg

o de

pr

esen

tar l

esio

nes

de c

arie

s (p

= 0

,000

01; O

R=2,

33;

95%

CI 1

,53-

3,54

).Se

con

cluy

e qu

e la

var

iaci

ón e

n M

MP-

20 p

uede

est

ar

asoc

iada

con

la e

xper

ienc

ia d

e ca

ries,

prin

cipa

lmen

te e

n su

jeto

s ca

ucás

icos

con

pob

res

hábi

tos

de h

igie

ne o

ral.

Khan

y c

olab

orad

ores

(21)

2013

Estu

diar

la p

rote

ólis

is d

e la

cin

étic

a de

enz

imas

de

MM

P-20

de

la lo

ngitu

d co

mpl

eta

amel

ogen

ina

reco

mbi

nant

e hu

man

a ba

jo d

ifere

ntes

com

posi

cion

es

min

eral

es

Amel

ogen

inas

reco

mbi

nant

es

hum

anas

(rH1

74, r

H163

y

rH14

6)

Elec

trofo

resi

s en

gel

(SDS

-PAG

E) y

MAL

-DI

-TOF

Ms

Se o

bser

vó q

ue lo

s io

nes

min

eral

es a

fect

an e

l pat

rón

de e

scis

ión

y la

cin

étic

a de

las

enzim

as d

e la

hid

rólis

is

de R

h174

. Fue

ra d

e la

s ci

nco

com

posi

cion

es d

e io

nes

min

eral

es s

elec

cion

adas

, MM

P-20

fue

más

efic

ient

e en

alta

s co

ncen

traci

ones

de

calc

io, m

ient

ras

que

fue

el

más

baj

o en

alta

s co

ncen

traci

ones

de

fosf

ato,

y a

ltas

conc

entra

cion

es d

e ca

lcio

y fo

sfat

o. E

stos

est

udio

s in

vi

tro m

uest

ran

que

la q

uím

ica

de la

s so

luci

ones

pro

teí-

nica

s pu

eden

alte

rar s

igni

ficat

ivam

ente

el t

rata

mie

nto

de a

mel

ogen

ina

por M

MP-

20, q

ue p

uede

tene

r efe

ctos

si

gnifi

cativ

os e

n el

ens

ambl

aje

de la

mat

riz in

viv

o y

post

erio

rmen

te e

n la

min

eral

izaci

ón d

e fo

sfat

o de

cal

cio

Yam

akos

hi y

co

labo

rado

res

(25)

2013

Inve

stig

ar la

act

ivac

ión

de K

LK4

por

MM

P-20

y la

inac

tivac

ión

de M

MP-

20

por K

LK4

MM

P-20

nat

iva

de c

erdo

y

KLK4

fuer

on e

xtra

ídas

de

gér-

men

es d

enta

les

de m

olar

es

perm

anen

tes

de m

andí

bula

s de

cer

do d

e 5

mes

es.

MM

P-20

reco

mbi

nant

e hu

man

a (r

hMM

P-20

) y K

LK4

(rh-

proK

LK4)

Zim

ogra

fía e

n ge

l de

case

ína,

den

sito

me-

tría,

cro

mat

ogra

fía lí

quid

a de

alta

reso

lu-

ción

, deg

rada

ción

de

Edm

an, e

lect

rofo

resi

s en

gel

(SDS

-PAG

E), W

este

rn b

lot

Amba

s la

pM

MP2

0 y

rhM

MP2

0 ac

tivan

la rh

-pro

KLK4

po

r esc

isió

n en

la u

nión

pro

- pép

tido-

enzim

a us

ada

in v

ivo.

La

pMM

P-20

fue

inac

tivad

a po

r pKL

K4 b

ajo

cond

icio

nes

fisio

lógi

cas

pero

no

bajo

con

dici

ones

le

vem

ente

áci

das.

Am

bas

pKLK

4, rh

KLK4

, esc

inde

n M

MP-

20 p

rinci

palm

ente

en

dos

sitio

s en

el d

omin

io

cata

lític

o de

MM

P-20

. Con

clus

ione

s: la

MM

P-20

act

iva

proK

LK4

y KL

K4 in

activ

a M

MP-

20 in

vitr

o, y

est

as

acci

ones

es

prob

able

que

ocu

rran

dur

ante

la fo

rmac

ión

de e

smal

te in

viv

o.

164



Auto

res

Año

Obje

tivo

del e

stud

ioM

uest

raM

étod

osRe

sulta

dos

McG

uire

y

cola

bora

dore

s

(30)

2014

Dem

ostra

r que

los

dien

tes

irrad

iado

s pu

eden

con

tene

r met

alop

rote

inas

as d

e m

atriz

act

ivas

Dien

tes

extra

ídos

de

paci

en-

tes

con

cánc

er o

ral t

rata

dos

con

radi

oter

apia

y d

e su

jeto

s sa

nos

Extra

cció

n de

pro

teín

as, c

rom

atog

rafía

lí-

quid

a- e

spec

trom

etría

de

mas

a (L

C-ta

ndem

M

S), W

este

rn b

lot,

zimog

rafía

en

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ína

o en

gel

de

gela

tina,

inm

unop

reci

pite

ción

, in

mun

ofluo

resc

enci

a

MM

P-20

es

un c

ompo

nent

e re

sist

ente

a la

radi

ació

n de

las

coro

nas

dent

ales

mad

uras

, enr

ique

cida

s en

la

dent

ina-

esm

alte

. Se

espe

cula

que

la M

MP-

20 c

atal

iza

la d

egra

daci

ón d

e m

atriz

org

ánic

a en

est

e si

tio y

pue

de

lleva

r a la

del

amin

ació

n de

esm

alte

aso

ciad

a co

n la

ra

diot

erap

ia d

el c

ánce

r ora

l

Horv

ath

y co

labo

rado

res

(31)

2014

Exam

inar

las

prue

bas

de s

elec

ción

po

sitiv

a en

regi

ones

cis

-reg

ulat

oria

s de

AM

ELX,

AM

BN, E

NAM

y M

MP-

20. Y

co

ntra

star

los

cam

bios

en

la s

ecue

ncia

hu

man

os c

on o

tros

hom

ínid

os (c

him

-pa

ncés

, gor

ilas,

ora

ngut

anes

, gib

ones

y

mac

acos

Rhe

sus)

aso

ciad

os e

ntre

la

form

ació

n de

esm

alte

y la

s m

utac

ione

s de

est

os c

uatro

gen

es e

n hu

man

os

Secu

enci

as g

enóm

icas

de

hum

anos

(Hom

o sa

pien

s,

GRCh

/ hg1

9), c

him

panc

és

(Pan

trog

lody

tes,

CHI

MP

2.1.

4), g

orila

s (G

orilla

, gor

illa,

gorG

OR3.

1), o

rang

utan

es

(Pon

go a

belii,

PPY

G2),

gibo

-ne

s (N

omas

cus

leuc

ogen

ys

Nleu

1.0)

y m

acac

o Rh

esus

(M

acac

a M

ulat

ta, M

MUL

_1)

Anál

isis

de

secu

enci

as g

enóm

icas

, PCR

, an

ális

is d

e se

lecc

ión

posi

tiva

No s

e en

cont

ró e

vide

ncia

par

a la

sel

ecci

ón p

ositi

va

en la

s re

gion

es c

odifi

cant

es p

ara

prot

eína

s en

alg

uno

de e

stos

gen

es. E

n co

ntra

ste,

se

enco

ntró

una

fuer

te

evid

enci

a pa

ra s

elec

ción

pos

itiva

en

las

regi

ones

5’ y

3’

de la

s re

gion

es d

e M

MP-

20 y

ENA

M a

lo la

rgo

del l

inaj

e de

los

hum

anos

, y e

n am

bos

el e

xtre

mo

5’ y

3’ d

e la

s re

gion

es d

e M

MP-

20 a

lo la

rgo

del l

inaj

e qu

e lid

era

a lo

s ch

impa

ncés

. Cam

bios

no

codi

fican

tes

y su

pot

enci

al

para

la re

gula

ción

dife

renc

ial p

or fa

ctor

es d

e tra

nscr

ip-

ción

con

ocid

os re

gula

n el

des

arro

llo d

el d

ient

e, p

uede

n of

rece

r una

vis

ión

a lo

s m

ecan

ism

os q

ue p

erm

iten

cam

bios

evo

lutiv

os rá

pido

s en

el g

roso

r del

esm

alte

en

tre e

spec

ies

rela

cion

adas

cer

cana

men

te

Shin

y c

olab

orad

ores

(27)

2014

Dete

rmin

ar s

i la

intro

ducc

ión

de

trans

gene

s qu

e ex

pres

an b

ajos

, med

ios

o al

tos

nive

les

de M

MP2

0 en

el r

atón

kn

ocko

ut p

uede

reve

rtir

el fe

notip

o de

es

mal

te m

urin

o a

la n

orm

alid

ad

RNA

extra

ído

de ó

rgan

o de

l esm

alte

de

inci

sivo

s o

prim

eros

mol

ares

de

rato

nes

post

nata

les

de 5

dí

a, c

epa

C57B

L/6,

rato

nes

trans

géni

cos

MM

P-20

PCR

en ti

empo

real

cua

ntita

tivo

(qPC

R),

inm

unob

lot,

zimog

rafía

, ele

ctro

fore

sis,

to

mog

rafía

mic

roco

mpu

tariz

ada,

mic

ros-

copí

a el

ectró

nica

de

barr

ido,

pru

eba

de

mic

rodu

reza

vic

kers

La e

xpre

sión

de

los

nive

les

de M

MP-

20 d

ebe

esta

r de

ntro

de

un ra

ngo

espe

cífic

o pa

ra e

l des

arro

llo n

orm

al

del e

smal

te. L

a cr

eaci

ón d

e un

a ca

pa d

e es

mal

te d

e gr

osor

nor

mal

pue

de o

curr

ir en

una

am

plia

gam

a de

ni

vele

s de

exp

resi

ón d

e M

MP-

20, p

ero

la a

dqui

sici

ón

de u

na d

urez

a no

rmal

de

esm

alte

tien

e un

rang

o m

ás

estre

cho.

La

sobr

e ex

pres

ión

de M

MP-

20 re

sulta

en

una

dism

inuc

ión

de la

dur

eza

de e

smal

te, e

sto

sugi

ere

que

exis

te u

n ba

lanc

e en

tre la

esc

isió

n y

la lo

ngitu

d co

mpl

e-ta

de

prot

eína

s de

esm

alte

ese

ncia

les

para

la fo

rmac

ión

de u

na c

apa

de e

smal

te a

prop

iada

men

te d

ura

Gao

y co

labo

rado

res

(24)

2014

Expl

orar

el r

ol d

el fa

ctor

-2C

pote

ncia

-do

r de

mio

cito

(MEF

2C),

un fa

ctor

de

trans

crip

ción

cla

ve e

n el

des

arro

llo

cran

eofa

cial

en

la e

xpre

sión

gen

étic

a de

M

MP-

20 in

duci

da p

or e

l TGF

β1

ALCs

(lín

ea c

elul

ar d

e am

elob

last

os)

Ensa

yo d

e ex

pres

ión

de g

enes

repo

rter

os

trans

itoria

en

culti

vo d

e AL

Cs, h

erra

mie

n-ta

s bi

oinf

orm

átic

as, e

nsay

o de

mov

ilidad

el

ectro

foré

tica

e in

mun

opre

cipi

taci

ón d

e cr

omat

ina

TGFB

1 in

duce

la e

xpre

sión

de

MM

P-20

en

ALCs

, fue

re

gula

do p

or e

l siti

o de

uni

ón M

EF2

en e

l pro

mot

or d

e M

MP2

0 y,

por

lo ta

nto,

med

iado

por

la v

ía d

e se

ñaliz

a-ci

ón d

e M

EF2C

Abre

viat

uras

: SDS

-PAG

E (e

lect

rofo

resi

s en

gel

de

polia

crila

mid

a), A

LCs

(Lín

ea c

elul

ar d

e am

elob

last

os),

MAL

DI-T

OF (d

esor

ción

/ioni

zaci

ón lá

ser a

sist

ida

por m

a-tri

z), O

DAM

(pro

teín

a as

ocia

da a

am

elob

last

os o

dont

ogén

icos

), RT

-PCR

: Rea

cció

n en

cad

ena

de la

pol

imer

asa

con

trans

crip

tasa

inve

rsa.

165



Tabl

e 1.

Stu

dies

pub

lishe

d in

the

liter

atur

e on

the

diffe

rent

met

hods

use

d to

det

ect t

he e

xpre

ssio

n of

MM

P-20

in to

oth

deve

lopm

ent

Auto

rsYe

arOb

jetiv

eSa

mpl

eM

etho

dsRe

sults

Shim

ada

and

colla

bora

tors

(28)

2009

Stud

y th

e lo

catio

n of

MM

Ps in

ca

rious

den

tine

5 th

ird h

uman

mol

ars

with

lesi

ons

of c

arie

s of

de

ntin

e in

pat

ient

s ag

ed

32-5

9 ye

ars

Enzy

mat

ic im

mun

olab

elin

g, s

cann

ing

elec

tron

mic

rosc

opy

MM

P-2

is d

istri

bute

d in

nor

mal

den

tin a

nd c

ario

us d

entin

e, in

dice

s of

MM

P-8

and

MM

P-9

leve

ls d

ecre

ased

in in

tern

al c

ario

us d

entin

, co

mpa

red

with

nor

mal

leve

ls o

f den

tin, b

ut in

tens

ified

aga

in in

the

regi

on o

utsi

de o

f too

th d

ecay

. MM

P-20

mar

king

was

hig

her i

n no

rmal

de

ntin

Naga

no a

nd

colla

bora

tors

(14)

2009

Exam

ine

the

abilit

y of

MM

P-20

an

d Kl

k4 to

cat

alyz

e co

nnec

tions

ge

nera

ted

by P

173

and

the

prod

ucts

fro

m th

e un

ion

of L

RAP

that

ac

cum

ulat

e du

ring

the

secr

etor

y st

age

of e

nam

el

Mol

ar p

erm

anen

t ger

ms

in m

andi

bles

and

jaw

s of

pig

s fro

m 6

mon

ths

of a

ge

Purifi

catio

n an

d ch

arac

teriz

atio

n of

LRA

P (p

rote

in L

euci

ne-r

ich

amel

ogen

in),

TRAP

(am

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enin

ty

rosi

ne-r

ich

poly

pept

ide)

, el

ectro

phor

esis

, Klk

4 an

d M

MP-

20(S

DS-P

AGE)

, Wes

tern

blo

t, zy

mog

raph

y, a

nd m

ass

spec

trom

etry

MM

P-20

join

s am

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enin

seq

uenc

es a

fter P

ro, S

er, H

is, A

la, a

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rp.

Thes

e un

ions

gen

erat

e m

ore

prod

ucts

of u

nion

that

acc

umul

ate

in th

e se

cret

ory

stag

e of

por

cine

ena

mel

: am

elog

enin

s 23

kDa,

20-

kDa,

13-

kDa,

11-

kDa

and

6-kD

a. M

MP-

20 jo

ins

LRAP

pro

duct

s. A

mon

g th

ese

key

bind

ing

site

s, K

lk4

coul

d jo

in o

nly

afte

r His

.

Chun

and

co

llabo

rato

rs (1

5)

2010

To te

st th

e hy

poth

esis

that

MM

P-20

, bu

t not

Klk

4, c

an c

atal

yze

join

ts th

at

gene

rate

pro

duct

s of

am

elob

last

in

that

acc

umul

ate

durin

g th

e se

cret

ory

stag

e of

am

elog

enes

is a

nd p

rese

nt a

hy

poth

esis

abo

ut th

e pr

ogre

ssio

n of

th

e un

ion

of a

mel

obla

stin

may

occ

ur

in v

ivo

Seco

nd n

on-e

rupt

ed

mol

ars

of p

igs

from

6

mon

ths

of a

ge

Expr

essi

on, p

urifi

catio

n an

d ch

arac

teriz

atio

n of

rec

ombi

nant

am

elob

last

ine

(rAm

bn),

insu

latio

n of

re

com

bina

nt M

MP-

20 (r

MM

P-20

), di

gest

ion

of rA

mbn

reco

mbi

nant

rM

MP-

20 a

nd K

lk4,

seq

uenc

ing

of th

e N-

term

inal

, ele

ctro

phor

esis

(S

DS-P

AGE)

, Wes

tern

blo

t, hi

gh

perf

orm

ance

liqu

id c

hrom

atog

raph

y,

mas

s sp

ectro

met

ry

MM

P-20

join

s ea

ch e

xact

pep

tide

in c

orre

spon

ding

pla

ces

of jo

ints

of

amel

obla

stin

cat

alyz

ed in

viv

o. M

MP-

20 is

the

enzy

me

that

pro

cess

es

amel

obla

stin

dur

ing

the

secr

etor

y st

age

of th

e am

elog

enes

is.

Lee

and

colla

bora

tors

(22)

2010

Di

scov

er th

e m

olec

ular

mec

hani

sms

resp

onsi

ble

for t

he re

gula

tion

of

MM

P-20

Jaw

s an

d m

andi

bles

of

mic

e of

16

days

of a

ge

Imm

unoh

isto

chem

istry

, RT-

PCR,

ce

ll cu

lture

ALC

, mic

rosc

opy,

flu

ores

cenc

e, e

xpre

ssio

n an

d pu

rifica

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of p

rote

ins

ODAM

rat

reco

mbi

nant

(rod

am, W

este

rn

blot

, tes

t of l

ucife

rase

, tria

l of t

he

chro

mat

in im

mun

opre

cipi

tatio

n (C

HIP)

, cas

ein

zym

ogra

phy,

sta

inin

g by

Aliz

arin

)

In th

e se

cret

ory

phas

e of

am

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enes

is, O

DAM

is lo

cate

d in

the

nucl

eus

and

cyto

plas

m o

f am

elob

last

s an

d th

e st

age

of m

atur

atio

n w

as o

bser

ved

in th

e cy

topl

asm

and

in th

e in

terf

ace

betw

een

amel

obla

sts

and

enam

el la

yer,

but n

ot in

the

nucl

eus.

ODA

M w

as

dete

cted

in th

e am

elob

last

-line

age

cell

line

(ALC

), w

hich

coi

ncid

ed

with

the

stag

e of

mat

urat

ion

of a

mel

ogen

esis

. The

exp

ress

ion

of

Runx

2 an

d nu

clea

r ODA

M c

orre

late

d w

ith th

e ex

pres

sion

of M

MP-

20

in A

LC. T

he e

xpre

ssio

n of

MM

P-20

spe

eds

up th

e pr

oces

sing

of

amel

ogen

in d

urin

g th

e m

iner

aliza

tion

of e

nam

el. I

t is

sugg

este

d th

at

Runx

2 re

gula

tes

the

expr

essi

on o

f ODA

M a

nd th

at n

ucle

ar O

DAM

has

an

impo

rtan

t reg

ulat

ory

role

in th

e m

iner

aliza

tion

of e

nam

el th

roug

h re

gula

tion

of M

MP-

20

Sun

and

colla

bora

tors

(16)

20

10

Exam

inin

g th

e hy

poth

esis

that

hy

drox

yapa

tite

(HAP

) can

affe

ct th

e pr

oteo

lysi

s by

MM

P-20

and

KLK

4 am

elog

enin

Amel

ogen

in o

f re

com

bina

nt (r

P172

), re

com

bina

nt M

MP-

20

pork

of p

ig (r

pMM

P-20

)

Liqu

id c

hrom

atog

raph

y hi

gh

effic

ienc

y, p

rote

olys

is in

the

pres

ence

of

HAP

A di

ffere

nt d

ose-

depe

nden

t rel

atio

nshi

p w

as fo

und

betw

een

the

amou

nt o

f PAH

s pr

esen

t in

the

mix

ture

of p

rote

olys

is a

nd th

e ra

nge

of d

egra

datio

n by

rpM

MP-

20, w

hile

the

effe

ct o

f HAP

in p

rote

olys

is o

f an

y rP

172

or rP

148

by rh

KLK4

was

less

pro

min

ent

Yam

akos

hi a

nd

colla

bora

tors

(17)

2011

Anal

yze

prot

eins

in e

nam

el a

nd

prot

ease

s in

wild

mic

e, n

ull M

MP-

20,

null

KLK4

and

dou

ble

null

of M

mp-

20/K

LK4

in fi

rst m

axilla

ry m

olar

s of

mic

e in

the

secr

etor

y st

age,

the

mat

urat

ion

stag

e an

d be

fore

teet

h er

uptio

n

Wild

mic

e, K

LK4

knoc

kout

, MM

P20

stra

in

C57B

L/6J

, dou

ble

null

mic

e M

mp2

0/Kl

k4

Geno

typi

ng b

y PC

R, h

isto

logy

, im

mun

ohis

toch

emis

try, l

iqui

d ch

rom

atog

raph

y of

hig

h ef

ficie

ncy,

zy

mog

raph

y, W

este

rn b

lot,

poly

acry

lam

ide

gel e

lect

roph

ores

is

Only

inta

ct a

mel

ogen

ins

and

amel

obla

stin

wer

e ob

serv

ed in

the

secr

etin

g st

age

of e

nam

el fo

r the

nul

l mou

se M

MP-

20, w

hile

the

mat

rix o

f the

nul

l mou

se’s

KLK

4 se

cret

ing

stag

e w

as id

entic

al to

that

of

the

wild

mou

se. H

ighe

r con

tent

of r

esid

ual m

atrix

was

obs

erve

d in

th

e do

uble

nul

l mou

se c

ompa

red

with

any

of t

he n

ull i

ndiv

idua

ls.

166



Auto

rsYe

arOb

jetiv

eSa

mpl

eM

etho

dsRe

sults

Bart

lett

and

colla

bora

tors

(26)

2011

Dem

onst

rate

cha

nges

in th

e se

cret

ory

stag

e of

am

elob

last

s us

ing

a kn

ocko

ut m

odel

of M

MP-

20

Inci

sors

of a

dult

mou

se

of C

57BL

/6 s

train

Sc

anni

ng e

lect

ron

mic

rosc

opy,

op

tical

mic

rosc

opy

with

tolu

idin

e bl

ue

The

knoc

kout

mou

se o

f MM

P-20

sho

wed

the

follo

win

g: fo

rmat

ion

of

calc

ified

nod

ules

dur

ing

the

mat

urat

ion

stag

e in

dev

elop

ing

enam

el,

the

amel

obla

sts

in th

is s

tage

com

plet

ely

cove

r the

se n

odul

es, e

nam

el

is o

nly

vagu

ely

conn

ecte

d to

the

unde

rlyin

g de

ntin

, and

the

patte

rn o

f th

e en

amel

pris

ms

is a

nul

l or s

ever

e m

alfo

rmat

ion.

Usko

kovi

c an

d co

llabo

rato

rs (2

0)

2011

Obta

in in

form

atio

n ab

out t

he

mec

hani

sm o

f am

elog

enes

is a

t the

m

olec

ular

leve

l inv

olve

d in

the

desi

gn

of a

sys

tem

of b

iom

imet

ic v

alua

tion

Full

leng

th (r

H174

) am

elog

enin

and

MM

P-20

wer

e pr

evio

usly

sy

nthe

size

d vi

a ex

pres

sion

in B

L21

(DE3

) ply

sS E

sche

richi

a co

li

SDS-

PAGE

, MAL

DI-T

OF(d

esor

ptio

n/io

niza

tion

lase

r mat

rix-

assi

sted

)

Prot

eoly

sis

exer

ts a

dditi

onal

nuc

leat

ion

and

prom

otes

a g

row

th

effe

ct. H

ydro

lysi

s of

full-

leng

th a

mel

ogen

in b

y M

MP-

20 d

ecre

ases

the

criti

cal t

ime

need

ed fo

r pro

tein

and

pep

tides

to a

dher

e an

d to

cov

er

the

subs

trate

.

Kuch

ler a

nd

colla

bora

tors

(32)

2011

Stud

y th

e po

ssib

le a

ssoc

iatio

n be

twee

n M

MP1

, MM

P3 a

nd M

MP-

20

in to

oth

agen

esis

One

hund

red

and

sixt

y-se

ven

nucl

ear f

amilie

s of

tw

o di

ffere

nt p

opul

atio

ns

wer

e an

alyz

ed, 1

16

from

Bra

zil a

nd 5

1 fro

m

Turk

ey. T

he p

artic

ipan

ts

had

at le

ast o

ne m

issi

ng

toot

h

DNA

sam

ples

wer

e ob

tain

ed

and

geno

-typi

fied

usin

g Ta

qman

ch

emis

try. I

n ad

ditio

n, M

MP2

0 w

as

sele

cted

for t

he p

olym

eras

e ch

ain

reac

tion

in re

al ti

me

with

SYB

R Gr

een

in to

oth

deve

lopm

ent o

f mou

se

Rela

tions

hips

bet

wee

n de

ntal

age

nesi

s an

d M

MP1

(p =

0.0

07) a

nd

MM

P20

(p =

0.0

3) w

ere

foun

d in

Bra

zilia

n fa

milie

s

In C

oncl

usio

n: M

MP-

1 an

d M

MP-

20 p

lay

an im

port

ant r

ole

in h

uman

to

oth

agen

esis

.

Brom

ley

and

colla

bora

tors

(19)

2012

Use

calc

ite a

s a

min

eral

sys

tem

to

exam

ine

the

effe

cts

of d

iges

tion

of

prot

eins

dur

ing

crys

tal g

row

th, a

nd

ther

efor

e pr

ovid

e in

form

atio

n ab

out

the

prec

ise

role

of t

he M

MP-

20 in

en

amel

dev

elop

men

t

hum

an re

com

bina

nt

amel

ogen

in (r

hMM

P-20

), po

rcin

e re

com

bina

nt

amel

ogen

in (r

P172

)

Expr

essi

on a

nd p

urifi

catio

n of

pr

otei

ns,

gel e

lect

roph

ores

is,

visi

ble

UV s

pect

rom

etry

, cal

cite

cr

ysta

llizat

ion,

amel

ogen

in d

iges

tion

by rh

MM

P20

durin

g cr

ysta

llizat

ion,

sca

nnin

g el

ectro

n m

icro

scop

y,an

d m

icro

-Ram

an S

pect

rosc

opy,

atom

ic fo

rce

mic

rosc

opy

Full-

leng

th a

mel

ogen

in b

inds

stro

ngly,

trun

cate

d am

elog

enin

bin

ds

wea

kly

and

the

C-te

rmin

al e

nd h

as w

eake

r int

erac

tion.

In te

rms

of

grow

th o

f cry

stal

s of

ena

mel

, the

pre

vent

ion

of o

cclu

sion

in c

ryst

als

of e

nam

el m

atur

ing

coul

d be

a g

reat

ben

efit r

esul

ting

from

the

sele

ctiv

e sc

issi

on o

f am

elog

enin

in th

e c-

term

inal

end

by

MM

P-20

Lee

and

col

labo

rato

rs (2

3)20

12

Stud

y th

e ce

llula

r exp

ress

ion

and

subc

ellu

lar l

ocal

izatio

n of

ODA

M

in a

mel

obla

sts,

odo

ntob

last

s,

oste

obla

sts

and

seve

ral t

ypes

of

can

cer c

ells

to d

eter

min

e th

e co

rrel

atio

ns b

etw

een

ODAM

and

M

MP-

20, a

nd d

efine

new

func

tiona

l ro

les

of O

DAM

Mol

ars

of p

ostn

atal

m

ouse

P0,

P3,

P10

, P1

4, c

ells

in A

LC c

ultu

re,

LS8,

MDP

C-23

, MG-

63,

H129

9, A

GS, H

eLa,

M

CF-7

cel

ls, c

ance

r ce

lls S

K-BR

and

cel

ls o

f ep

ithel

ial b

reas

t can

cer

MCF

-10A

Imm

unoh

isto

chem

istry

, ind

irect

im

mun

ofluo

resc

ence

for c

ultu

re,

Wes

tern

blo

t

ODA

M w

as fo

und

in a

mel

obla

sts,

odo

ntob

last

s, a

nd o

steo

blas

ts in

vi

vo a

nd in

vitr

o. In

add

ition

, ODA

M w

as fo

und

in th

e cy

topl

asm

and

th

e nu

cleu

s of

am

elob

last

s an

d od

onto

blas

ts e

xpre

ssin

g M

MP-

20,

but o

nly

in th

e cy

topl

asm

of o

steo

blas

ts n

ot e

xpre

ssin

g M

MP-

20.

Thes

e re

sults

sug

gest

that

the

patte

rn o

f exp

ress

ion

and

subc

ellu

lar

loca

lizat

ion

of O

DAM

is h

ighl

y va

riabl

e an

d de

pend

ent o

n ce

ll ty

pes

and

stag

es o

f diff

eren

tiatio

n, a

s w

ell a

s th

e fu

nctio

nal c

orre

latio

n be

twee

n OD

AM a

nd M

MP-

20. T

his

prov

ides

the

first

evi

denc

e of

OD

AM in

mul

tiple

cel

l blo

cks

of o

dont

ogen

ic d

iffer

entia

tion

and

canc

er c

ell l

ines

with

impo

rtan

t fun

ctio

nal i

mpl

icat

ions

.

167



Auto

rsYe

arOb

jetiv

eSa

mpl

eM

etho

dsRe

sults

Taka

hash

i and

co

llabo

rato

rs (1

8)

2012

Exam

ine

the

dist

ribut

ion

and

expr

essi

on o

f am

elog

enin

, am

elob

last

in, M

MP-

20 a

nd K

LK-4

af

ter b

eing

cul

tivat

ed in

a m

ixtu

re

of M

alas

sez

epith

elia

l cel

ls a

nd

fibro

blas

ts o

f the

per

iodo

ntal

lig

amen

t to

obta

in d

irect

cel

l con

tact

Third

mol

ars

wer

e co

llect

ed fr

om 2

8 in

divi

dual

s (2

1-28

ye

ars)

. Cel

l cul

ture

of

tissu

e ex

plan

ts o

f the

pe

riodo

ntal

liga

men

t co

ntai

ning

Mal

asse

z ep

ithel

ial c

ells

and

pe

riodo

ntal

liga

men

t fib

robl

asts

Imm

unoh

isto

chem

istry

, in

situ

hy

brid

izatio

n, R

T-PC

R

Imm

unoh

isto

chem

istry

resu

lts re

veal

poo

r exp

ress

ion

of a

mel

ogen

in,

amel

obla

stin

, MM

P-20

, and

KLK

4 in

Mal

asse

z ep

ithel

ial c

ells

co-

cultu

red

with

fibr

obla

sts

of th

e pe

riodo

ntal

liga

men

t. Hy

brid

izatio

n in

si

tu a

nd R

T-PC

R co

nfirm

ed th

e ex

pres

sion

of m

RNA

of th

ese

fact

ors

in c

o-cu

ltiva

ted

cells

com

pare

d w

ith c

ontro

l cel

ls. T

he m

RNA

of

MM

P-20

was

not

exp

ress

ed in

con

trol c

ells

. The

se re

sults

sug

gest

th

at e

pith

elia

l-mes

ench

ymal

inte

ract

ions

pro

mot

e th

e di

ffere

ntia

tion

of h

uman

Mal

asse

z ep

ithel

ial c

ells

, and

intro

duct

ion

of e

nam

el m

atrix

pr

otea

ses

faci

litat

e de

grad

atio

n of

ena

mel

mat

rix p

rote

ins

Tann

ure

and

colla

bora

tors

(29)

2012

To

ass

ess

the

asso

ciat

ion

betw

een

MM

P-20

and

the

hist

ory

of d

ecay

in

Braz

ilian

child

ren

Non-

rela

ted

child

ren

aged

5 to

14

year

s w

ith

or w

ithou

t car

ies

n =

38

8

Dent

al c

linic

al e

xam

inat

ion,

RT-

PCR,

161

out o

f 388

sub

ject

s w

ere

carie

s-fre

e ki

ds. T

here

are

no

diffe

renc

es b

etw

een

the

leve

ls o

f too

th d

ecay

and

gen

otyp

ic

dist

ribut

ion

in th

e to

tal s

ampl

e. D

iffer

ence

s in

gen

otyp

ic d

istri

butio

n w

ere

obse

rved

in c

arie

s-fre

e ch

ildre

n vs

. chi

ldre

n w

ith c

arie

s, in

Ca

ucas

ians

(p =

0.0

3). R

egre

ssio

n an

alys

is, a

djus

ted

for g

enot

ype

and

ethn

icity

, con

firm

s th

at c

onsu

mpt

ion

of s

wee

ts in

bet

wee

n m

eals

in

crea

ses

the

risk

of c

arie

s le

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discUssion

In vitro models

In 2009, Nagano et al.,14 in an in vitro model showed, through the digestion of fluorescent peptides, that MMP-20 is able to digest amelogenin sequences in specific sites. On the other hand, Klk4 (kallikrein-related peptidase 4) has affinity for different excision sites. Therefore, in the development of pig tooth, MMP-20 is the only that presents proteolytic activity in the extracellular space during the secretory phase. This is confirmed by Chun et al.,15 who concluded that MMP-20 —and not Klk4— catalyzes enamel proteins that are processed during the amelogenesis secretory phase. Other authors, such as Sun et al.,16 studied MMP-20 and Klk4. They designed a series of in vitro experiments systematically assessing the effect of HAP (hydroxyapatite) in rP172 (recombinant porcine amelogenin), rPMMP-20 (recombinant pork metalloproteinase 20), and rP148 (recombinant porcine amelogenin lacking 24 hydrophilic C-terminus amino acids) by rhKLK4 (recombinant human kallikrein-related peptidase 4). They found out that the activity of rPMMP-20 against the recombinant porcine amelogenin was more sensitive to the presence of hydroxyapatite crystals compared with the rhKLK4 against rP148, or rhKLK4 against rP172.

This suggests that there is an intimate relationship between the step-by-step degradation of amelogenin in the presence of HAPs in the early stage of enamel mineralization. Similarly, in 2013, Yamakoshi et al17 concluded that MMP-20 activates proKLK4, and KLK4 inactivates MMP-20 in vitro, and these actions can happen in vivo during amelogenesis.

These findings disagree with those by Takahashi et al18 in 2012. These authors designed an in vitro model with cell cultures of tissue explants from periodontal ligament, containing Malassez

discUsión

modelos in vitro

En el 2009, Nagano y colaboradores,14 en un modelo in vitro, demostraron, por medio de la digestión de péptidos fluorescentes, que la MMP-20 es capaz de digerir se-cuencias de amelogenina en sitios específicos. Por otro lado, Klk4 (calicreína relacionada con peptidasa 4) tiene afinidad por sitios diferentes de escisión. Por lo tanto, en el diente en desarrollo del cerdo, la MMP-20 es la única que presenta actividad proteolítica en el espacio extrace-lular durante la fase secretora. Esto es confirmado por Chun y colaboradores,15 donde concluyen que MMP-20 pero no Klk4 cataliza las proteínas de esmalte procesa-das durante la fase secretora de amelogénesis. También otros autores, como Sun y colaboradores,16 estudiaron MMP-20 y Klk4. Estos diseñaron una serie de experi-mentos in vitro que evaluaban sistemáticamente el efec-to de la HAP (hidroxiapatita) en la rP172 (amelogenina porcina recombinante) por rPMMP-20 (Metaloproteinasa 20 recombinante de cerdo) y rP148 (amelogenina por-cino recombinante que carece de los aminoácidos 24 C-terminales hidrófilos) por rhKLK4 (calicreína relacio-nada con peptidasa 4 recombinante humana). Encontra-ron que la actividad de rPMMP-20 contra la amelogenina porcina recombinante, fue más sensible a la presencia de cristales de hidroxiapatita comparados con la rhKLK4 contra la rP148, o rhKLK4 contra la rP172.

Esto sugiere que hay una íntima relación entre la degra-dación paso a paso de la amelogenina en presencia de HAP en el estadio temprano de mineralización del esmal-te. De igual forma, en el 2013, Yamakoshi y colabora-dores17 concluyeron que la MMP-20 activa la proKLK4, y KLK4 inactiva la MMP-20 in vitro, y estas acciones pueden suceder durante la amelogénesis in vivo.

Estos resultados son contrarios a los hallados por Takahashi y colaboradores18 en el 2012. Estos autores realizaron un modelo in vitro con cultivos celulares de explantes de tejidos del ligamento periodontal, conteniendo células epiteliales de Malassez

170



y fibroblastos del ligamento periodontal de terceros molares de 28 individuos entre 21-28 años de edad, con el fin de determinar la expresión de amelogenina, MMP-20, (KLK4) y sus efectos en la interacción entre las células epiteliales de Malassez y fibroblastos del ligamento periodontal. Los resultados por inmunohistoquímica revelaron una expresión débil de amelogenina, ameloblastina, MMP-20 y KLK4 en las células epiteliales de Malassez. Esto puede deberse a que las funciones de estas proteínas de esmalte y sus proteasas, en la formación de las raíces dentales, se desconoce.

Por otro lado, Bromley y colaboradores19 estudiaron el crecimiento de los cristales de calicita en presen-cia de amelogenina de longitud completa y su proteó-lisis por una metaloproteinasa de matriz recombinante (rhMMP-20). La amelogenina recombinante porcina (rP172) altera la forma de los cristales de calcita por in-hibición del crecimiento de los pasos en las caras que se ocluyen dentro de los cristales. Estos autores encontra-ron que, en muestras con rP172-rhMMP-20, la oclusión de la amelogenina en los cristales de calcita disminu-yó drásticamente. La reducción del extremo C-terminal disminuyó la afinidad de la amelogenina a los cristales y, por lo tanto, previó la oclusión, tal como fue hallado en los estudios de Uskokovic y colaboradores,20 donde, en un modelo in vitro, determinaron la capacidad de la amelogenina de promover la nucleación y el crecimiento de los cristales.

Para el proceso de mineralización y formación del esmalte maduro, Khan y colaboradores21 estudiaron la proteólisis de la cinética de enzimas de MMP-20 de longitud com-pleta amelogenina recombinante humana bajo diferentes composiciones minerales. Hallaron que la MMP-20 fue más eficiente en altas concentraciones de calcio, mien-tras que fue más bajo en altas concentraciones de fosfato y altas concentraciones de calcio y fosfato. Estos estudios in vitro demuestran que la química de las soluciones pro-teínicas pueden alterar significativamente el tratamiento de amelogenina por MMP-20, que puede tener efectos signi-ficativos en el ensamblaje de la matriz in vivo y, posterior-mente, en la mineralización de fosfato de calcio.

epithelial cells and fibroblasts of the periodontal ligament of lower third molars of 28 individuals aged 21 to 28 years, in order to determine the expression of amelogenin, MMP-20, (KLK4) and their effects on the interaction between Malassez epithelial cells and fibroblasts of the periodontal ligament. The immunohistochemistry results showed a weak expression of amelogenin, ameloblastin, MMP-20, and KLK4 in Malassez epithelial cells. This may happen because the functions of these proteins in enamel and their proteases in the formation of dental roots are still unknown.

On the other hand, Bromley et al19 studied the growth of calcite crystals in the presence of full-length amelogenin and its proteolysis by a recombinant matrix metalloproteinase (rhMMP-20). Recombinant porcine amelogenin (rP172) alters the shape of calcite crystals by inhibiting the growth of the steps in the sides that are occluded in the crystals. These authors found out that, in samples with rP172-rhMMP-20, occlusion of the amelogenin in calcite crystals decreased drastically. The c-terminal end reduction decreased the affinity of the amelogenin crystals and therefore foresaw the occlusion, as found in studies by Uskokovic et al.,20 who by means of an in vitro model determined the ability of amelogenin to promote the nucleation and growth of crystals.

Concerning the process of mineralization and formation of mature enamel, Khan et al21 studied proteolysis of the kinetics of MMP-20 enzymes of full-length human recombinant amelogenin under different mineral compositions. They found out that MMP-20 was more efficient in high concentrations of calcium, but lower in high concentrations of phosphate and high concentrations of calcium and phosphate. These in vitro studies show that the chemistry of protein solutions can significantly alter the treatment of amelogenin by MMP-20, which can have significant effects in the matrix assembly in vivo and later in the mineralization of calcium phosphate.

171



cultivos celulares

En el 2010, Lee y colaboradores22 estudiaron los me-canismos moleculares responsables de la regulación de la MMP-20, encontrando que la fase secretora de la amelogénesis ODAM (proteína asociada a ameloblastos odontogénicos) se localizó en el núcleo y citoplasma de los ameloblastos, y la etapa de maduración se observó en el citoplasma y en la interfaz entre los ameloblastos y la capa de esmalte, pero no en el núcleo. Se sugiere que Runx2 regula la expresión de ODAM nuclear que tiene una función reguladora importante en la mineralización del esmalte a través de la regulación de la MMP-20. Es-tos resultados son confirmados nuevamente en el 2012 por Lee y colaboradores.23 Estos autores investigaron la expresión de ODAM en ameloblastos, odontoblastos y varios tipos de células cancerígenas, y encontraron que ODAM se localizó en estas células tanto in vivo como in vitro. Estos resultados sugieren que el patrón de expre-sión y la localización subcelular de ODAM es altamente variable y dependiente de los tipos celulares, sus esta-dos de diferenciación y las correlaciones funcionales existentes entre ODAM y MMP-20.

Por otro lado, Gao y colaboradores24 exploraron el rol del factor-2C potenciador de miocito (MEF2C) y el factor de crecimiento transformante beta (TGFβ1) en la expresión genética de MMP-20. Estos autores concluyeron que el TGFβ1 induce la expresión de MMP-20 en ALCs (Línea celular de ameloblastos).

Estudios en animales

Con relación a los estudios realizados en modelos muri-nos, Yamakoshi y colaboradores25 caracterizaron ratones knockout para MMP-20 y KLK4, y doble nulo de MMP-20/KLKL-4. Estudiaron las fases secretoras y de madu-ración por medio de histología, zimografía y Western blot. Solo se encontraron amelogeninas y ameloblasti-nas intactas en la fase secretoria en el ratón knockout para MMP-20, mientras que en la matriz perteneciente a

cell cultures

In 2010, Lee et al,22 studied the molecular mechanisms responsible for the regulation of MMP-20, finding out that the secretory phase of amelogenesis ODAM (odontogenic- ameloblast-associated protein) was located in the nucleus and cytoplasm of ameloblasts, and maturation stage was observed in the cytoplasm and at the interface between the ameloblasts and enamel coating, but not in the nucleus. It is suggested that Runx2 regulates the expression of nuclear ODAM playing an important regulatory role in the mineralization of enamel through regulation of MMP-20. These results were verified in 2012 by Lee et al.23 These authors evaluated the expression of ODAM in ameloblasts, odontoblasts, and several types of cancer cells, finding out that ODAM was located in these cells both in vivo and in vitro. These results suggest that the pattern of expression and subcellular location of ODAM is highly variable and dependent on cell types, their stages of differentiation, and the functional correlations between ODAM and MMP-20.

On the other hand, Gao et al24 explored the role of the myocyte-specific enhancer factor 2C (MEF2C) and transforming growth factor beta 1 (TGFβ1) in the gene expression of MMP-20. These authors concluded that the TGFβ1 induces the expression of MMP-20 in ALCs (ameloblast-lineage cell line).

studies in animals

Concerning studies in mouse models, Yamakoshi et al25 characterized knockout mice for MMP-20, KLK4, and double null MMP-20/KLKL-4. They studied the secretory and maturation phases by histology, zymography, and Western blot. They only found intact amelogenins and ameloblastins in the secretory phase in knockout mouse for MMP-20, while the matrix belonging to the secretory

172



la fase secretoria para el ratón nulo de KLK-4 fue idéntico a lo encontrado en el ratón silvestre.

Más residuos en la matriz se observaron en el ratón doble nulo comparado con los ratones knockout de MMP-20 o KLK-4. Esto lo corroboraron Bartlett y co-laboradores26 y Shin y colaboradores27 donde, con un modelo de ratón knockout para MMP-20, demostraron la importancia de MMP-20 como mediador necesario para el mantenimiento de la superficie de esmalte, una unión amelo-dentinal fuerte y para el establecimiento del patrón de varillas de esmalte. Estos resultados validan lo encontrado en modelos in vitro por Nagano y colabora-dores14 y Chun y colaboradores15.

Estudios en humanos

Con relación a los estudios en humanos, estos men-cionan la importancia que tiene la MMP-20 en la caries dental, el grosor del esmalte y la susceptibilidad a caries por radiación y agenesias dentales.

En primer lugar, Shimada y colaboradores28 estudiaron, por inmunomarcación enzimática, la participación de MMP-2,-8,-9 y 20 en lesiones de caries dentinal en ter-ceros molares humanos de pacientes entre 32-59 años, y hallaron que la MMP-2 estaba distribuida en la denti-na normal y la dentina cariada, los niveles de MMP-8 y MMP-9 estaban significativamente disminuidos en la ca-ries dentinal interna comparada con la dentina normal y la MMP-20 era la más alta en la dentina normal, y decre-ció significativamente hacia la región externa de caries.

Por otro lado, Tannure y colaboradores29 evaluaron la asociación entre MMP-20 y la experiencia de caries en los niños brasileros. De 388 sujetos, 161 fueron niños libres de caries. Estos autores no encontraron diferencias entre los niveles de caries y la distribución genotípica en la cohorte total. Sin embargo, hubo diferencias en la distribución genotípica, observadas en los niños libres de caries vs. niños con caries en caucásicos (p=0,03). Estos resultados sugieren que el desarrollo de la caries es multifactorial y puede estar asociado a genotipos de MMP-20 en mayor proporción

phase for the null mouse KLK-4 was identical to that found in wild mouse.

More matrix remnants were observed in double null mice compared with knockout mice of MMP-20 or KLK-4. This was supported by Bartlett et al26 and Shin et al,27 who by means of a knockout mouse model for MMP-20 showed the importance of MMP-20 as a necessary mediator for the maintenance of enamel surface, a strong dentin-enamel junction, and the establishment of enamel rods pattern. These results validate the findings in in vitro models by Nagano et al14 and Chun et al.15

studies in humans

With regard to studies in humans, they mention the importance of MMP-20 in dental caries, enamel thickness, and susceptibility to caries by radiation and dental agenesis.

By means of immunolabeling enzyme, Shimada et al28 studied the participation of MMP-2, -8, -9, and -20 in dentinal caries lesions in third molars of human patients aged 32 to 59 years, finding out that the MMP-2 was distributed in normal dentin and carious dentin, MMP-8 and MMP-9 levels were significantly decreased in inner dentinal caries compared to normal dentin, and MMP-20 was the highest in normal dentin, significantly decreasing towards the outer region of caries.

On the other hand, Tannure et al29 evaluated the association of MMP-20 and caries history in Brazilian children. 161 out of 388 subjects were caries-free kids. The authors found no differences between the levels of tooth decay and genotypic distribution in the total sample. However, there were differences in genotypic distribution. Differences in genotypic distribution were observed in caries-free children vs. children with caries, in Caucasians (p = 0.03). These results suggest that caries development is multifactorial and may be associated to MMP-20 genotypes, in higher

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proportions among Caucasian individuals with poor oral hygiene habits.

In 2014, McGuire et al,30 by means of mass spectrometry techniques, immunolabeling, and gel zymography, studied the teeth of patients with oral cancer treated with radiotherapy, comparing them against the teeth of healthy individuals. They concluded that MMP-20 is the most abundant matrix metalloproteinase in irradiated and incubated in vitro extracts of mature dental crowns, as in control crowns. In their in vitro studies, they found out that the 23 kDa fragment of MMP-20 is resistant to radiation of mature dental crowns, which indicates that this component can degrade the protein components of the enamel-dentin interface and thus contribute to the pathological delamination observed in oral radiotherapy, which is also associated with high doses of radiotherapy.

In the same year, Horvath et al31 found strong evidence for a positive selection in the 5’ and 3’ regions of MMP-20 and ENAM regions along the lineage of humans, and both 5’ and 3’ regions of MMP-20 along the lineage leading chimpanzees. Non-coding changes and their potential differential regulation by known transcription factors regulate tooth development and can provide insight into the mechanisms that allow quick evolutionary changes in enamel thickness among closely related species.

On the other hand, Kuchler et al32 studied the associations of MMP-1, MMP-3 and MMP-20, and their relations to dental agenesis in 167 nuclear families of two different populations, 116 from Brazil and 51 from Turkey. The participants had at least one missing tooth. These authors found associations among dental agenesis, MMP-1 (p = 0.007) and MMP-20 (p = 0.03) in Brazilian families. These results disagree with those reported by Antunes et al,33 who studied the association of polymorphisms in human genes for MMP-2, MMP-9 and MMP-13 with dental agenesis, in 285 non-related individuals

en individuos caucásicos con pobres hábitos de higiene oral.

En el 2014, McGuire y colaboradores,30 por técnicas de espectrometría de masa, inmunomarcaje y zimografía en gel, estudiaron dientes de pacientes con cáncer oral tratados con radioterapia, y se compararon con dien-tes de individuos sanos. Concluyeron que la MMP-20 es la metaloproteinasa de matriz más abundante en extractos in vitro irradiados e incubados de las coro-nas dentales maduras, como con las coronas control. En los estudios in vitro encontraron que el fragmento de 23 kDa de MMP-20 es resistente a la radiación de las coronas dentales maduras, lo que indica que este componente puede degradar los componentes protei-cos de la interfase esmalte-dentina y contribuir así a la delaminación patológica del esmalte observado en la radioterapia oral, lo cual también se asocia a las do-sis altas de radioterapia.

En el mismo año, Horvath y colaboradores31 encontraron una fuerte evidencia para selección positiva en las re-giones 5’ y 3’ de las regiones de MMP-20 y ENAM, a lo largo del linaje de los humanos, y en ambos el extremo 5’ y 3’ de las regiones de MMP-20 a lo largo del linaje que lidera a los chimpancés. Cambios no codificantes y su potencial para la regulación diferencial por factores de transcripción conocidos regulan el desarrollo del diente y pueden ofrecer una visión a los mecanismos que permi-ten cambios evolutivos rápidos en el grosor del esmalte entre especies relacionadas cercanamente.

Por otro lado, Kuchler y colaboradores32 estudiaron la asociación de MMP-1, MMP-3 y MMP-20, y su relación con agenesias dentales en 167 familias nucleares de dos poblaciones diferentes, 116 de Brasil y 51 de Turquía. Los participantes tenían al menos un diente ausente. Estos autores encontraron asociaciones entre la agenesias dentales, MMP-1 (p= 0,007) y MMP-20 (p= 0,03) en las familias brasileras. Estos resultados son contrarios a los reportado por Antunes y colaboradores,33 en donde estudiaron la asociación de polimorfismos en genes para MMP-2, MMP-9 y MMP-13 en humanos con agenesias dentales, en 285 individuos no relacionados

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(202 controles sin agenesia dental y 83 casos con agenesia dental), donde no encontraron asociación significativa para el genotipo MMP-2, y encontraron una relación significativa de agenesias dentales asociadas a los genotipos de MMP-9 y MMP-13.

conclUsión

Los resultados de esta revisión proveen un soporte sobre la importancia que tiene la MMP-20 para la degradación de diversas proteínas de la matriz orgánica, como ame-logeninas y ameloblastinas en la fase secretora de la for-mación de esmalte. Además de la participación de otras proteasas como la KLK4 que, a diferencia de la MMP-20, participa en la fase de maduración de la amelogénesis. Los modelos in vitro permiten concluir que la MMP-20 tiene sitios específicos de escisión para las proteínas de matriz y que estos difieren para la KLK4. Así mismo, este proceso puede ser alterado por la composición química, iones y la presencia de hidroxiapatita.

Con los modelos knockout se concluye que alteraciones en MMP-20 modifican completamente la morfología del esmalte, a diferencia de lo hallado en el ratón nulo para KLK4. Estos modelos permiten entender las diversas va-riaciones que se presentan en el desarrollo del esmalte, como por ejemplo la amelogénesis imperfecta.

En los estudios realizados en humanos, se ha relaciona-do la MMP-20 en primer lugar; con una mayor suscep-tibilidad de caries dental, en segundo lugar; una relación evolutiva entre humanos y chimpancés y su asociación con el grosor del esmalte, en tercer lugar; una mayor presencia de MMP-20 en la unión amelo-dentinal en dientes sometidos a radioterapia, lo cual se vincula con la delaminación del esmalte. Y, por último, una asocia-ción entre MMP-20 y agenesias dentales.

(202 control individuals without dental agenesis and 83 cases with dental agenesis), finding out no significant association for the MMP-2 genotype, but a significant relationship of dental agenesis associated to MMP-9 and MMP-13 genotypes.

conclUsion

The results of this review highlight the importance of MMP-20 in the degradation of various proteins of organic matrix, such as amelogenins and ameloblastins in the secretory phase of enamel formation, in addition to the involvement of other proteases such as KLK4 which, unlike MMP-20, takes part in the maturation stage of amelogenesis. The in vitro models allow concluding that MMP-20 has specific sites for excision of matrix proteins and that these differ to KLK4. Similarly, this process may be altered by chemical composition, ions, and the presence of hydroxyapatite.

The knockout models allow concluding that alterations in MMP-20 completely alter enamel morphology, unlike the findings in null mice for KLK4. These models allow us to understand the different variations occurring during enamel development, such as amelogenesis imperfecta.

In human studies, MMP-20 has been related to a) increased susceptibility to tooth decay, b) an evolutionary relationship between humans and chimpanzees, as well as an association with enamel thickness, and c) a greater presence of MMP-20 in the amelodentinal junction in teeth subjected to radiation therapy, which is linked to enamel delamination. Finally, there is an association between MMP-20 and dental agenesis.

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conflictos dE intErÉs

Los autores declaran no tener ningún conflicto de interés.

corrEspondEnciA

Estefanía Cuéllar Rivas. [email protected]

María Carolina Pustovrh Ramos. [email protected]

conflicts of intErEst

The authors declare not having any conflict of interest.

corrEspondinG AUthors

Estefanía Cuéllar Rivas. [email protected]

María Carolina Pustovrh Ramos. [email protected]

rEfErEnciAs / rEfErEncEs

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