El presente trabajo se realizó en la Unidad de...

El presente trabajo se realizó en la Unidad de Investigación en Inmunodeficiencias

del Instituto Nacional de Pediatría, bajo la dirección de la Dra. Gabriela López

Herrera. Una parte del trabajo se llevo a cabo en el laboratorio no. 4 del

Departamento de Biomedicina Molecular del Centro de Investigación y Estudios

Avanzados del Instituto Politécnico Nacional, bajo la dirección del Dr. Leopoldo

Santos Argumedo y en el Laboratorio de Inmunoquímica I del Departamento de

Inmunología de la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas, bajo la dirección de la

Dra. Ethel A. García Latorre.

Durante el desarrollo de este trabajo la alumna recibió beca CONACYT, con número

de registro 176353, y el apoyo de CONACYT con el proyecto 58945.

DEDICATORIAS

Se lo dedico a mis hijos por ser lo más importante de mi vida.

A mi madre por toda la ayuda que siempre me dio.

A mi padre por sus sabios consejos.

A mis hermanos por su apoyo incondicional.

A Gaby, Claudia y Eduardo por su amistad y apoyo.

Agradecimientos

Agradezco el apoyo brindado por el M. en C. Héctor Romero Ramírez y el M.

en C. Víctor Hugo Rosales García por las diferentes etapas de este trabajo.

Agradezco la enorme colaboración en este trabajo del Dr. Francisco

Espinosa Rosales y la Dra. Sara Espinosa Padilla.

A la Dra. Ethel A. García Latorre por su apoyo y consejos.

A los miembros del Jurado, por tomarse el tiempo para revisar mi trabajo, por

sus acertadas correcciones y sugerencias:

Dra. Luis Antonio Jiménez Zamudio

Dr. Leopoldo Santos Argumedo

Dra. Maria Lilia Domínguez López

Dra. Elba Reyes Maldonado

Dra. Ethel A. García Latorre

De manera especial quiero agradecer al Dr. Leopoldo Santos Argumedo por

su invaluable apoyo y ejemplo.

A la Dra. Gabriela López Herrera por su enseñanza y confianza.

A mis compañeros de CINVESTAV por la ayuda que siempre me brindaron.

INDICE:

Página Lista de abreviaturas i Índice de figuras iv Índice de tablas v Resumen vii Abstract viii I. Introducción

Inmunodeficiencias Primarias 1

Manifestaciones clínicas 1

Clasificación de IDP 3

Prevalencia 3

Inmunodeficiencias primarias predominantemente de anticuerpo

4

Desarrollo de la células B 5

CVID 7

Síndrome de hiper-IgM 15

Justificación 20 Hipótesis 20 Objetivo general 21 Objetivos particulares 21 II. Material y métodos Tipo de investigación 22 Criterios de inclusión, exclusión y eliminación 22 Obtención de muestra 22 Análisis de poblaciones leucocitarias 23 Análisis de sub-poblaciones de células B 23 Análisis de la expresión de CD40 24 Análisis de la expresión de TACI 24 Análisis de la expresión de CD154 24 Análisis de la expresión de ICOS 24 Adquisición y análisis 25 Extracción de RNA 25 Síntesis de cDNA 25 Amplificación de CD154 por reacción en cadena de la polimerasa 26

Electroforesis de los productos de PCR en geles de agarosa 27 Clonación de productos de PCR, reacción de ligación 27 Transformación de los productos de ligación en Escherichia coli

DH5

28

Selección de colonias positivas por PCR 28 Purificación de plásmidos de colonias positivas 29 Secuenciación y análisis 29 III. Resultados 1.- Características clínicas de los 25 pacientes con Inmunodeficiencia Humoral

30

2.- Análisis de poblaciones de leucocitos. 34 3.- Análisis de poblaciones de linfocitos T, linfocitos B y células NK y sub-poblaciones de células T

39

4.- Determinación de sub-poblaciones de células B 45 5.- Clasificación de 21 pacientes con CVID de acuerdo a su porcentaje de células B de memoria

49

6.- Análisis de la expresión de CD154 50 7.- Análisis de la expresión de CD40 51 8.- Análisis de la expresión de ICOS 57 9.- Análisis de la expresión de TACI 60 10. Análisis de mutaciones en CD154 en el paciente 16, 19, 20 y 22 63 IV. Discusión 70 V. Conclusiones 77 VI. Perspectivas 78 VII. Bibliografía 79 Anexos 87

i

LISTA DE ABREVIATURAS

ALX Agammaglobulinemia ligada al X

AHA Anemia hemolítica autoinmune

AID Activador –inductor de citidina deaminasa de inglés

activation-induced cytidine de aminase

AP-1 Proteína activadora 1 del inglés adaptor-related protein

complex 1

APRIL Ligando que induce proliferación del inglés a proliferation-

inducing ligand

AR Agammaglobulinemia autosómica recesiva

ARJ Artritis reumatoide juvenil

BAFF Factor de activación de células B del inglés B cell-activating

factor

BAFFR Receptor del factor de activación de células B del inglés B

cell-activating factor receptor

BCMA Proteína de maduración de células B del inglés B cell

maturation

BCR Receptor de la célula B del inglés B cell receptor

BLNK Proteína adaptadora de la célula B del inglés B-cell linked

BTK Tirosina Cinasa de Bruton del inglés Bruton tirosin kinase

CAML Modulador de calcio del inglés modulating calcium

CRD Región conservadas de cisteínas

CVID Inmunodeficiencia común variable del inglés común variable

immunodeficiency

ii

DIgA Inmunodeficiencia de IgA del inglés immunodeficiency IgA

EDA-ID Displasia hipohidrótica ectodérmica con inmunodeficiencia

del inglés anhidrotic ectodermal displasia with

immunodeficiency

IDP’S Inmunodeficiencias primarias

ICOS Coestimulador inducible del inglés inducible costimulator

ICOSL Ligando del costimulador inducible de inglés inducible

coestimulator ligand

Ig’s Inmunoglobulinas

LES Lupus eritematoso sistémico

LXP Síndrome linfoproliferativo ligado a X

MHC II Molécula de histocompatibilidad tipo II

NEMO Modulador esencial de NF- B del inglés NF- B essential

modulator

NFAT Factor nuclear de células t activadas del ingles nuclear factor

of activated T-cells

NF B Factor nuclear de B del inglés nuclear factor - B

PI3K Fosfatidilinositol 3 –cinasa del inglés phosphatidylinositol 3-

kinase

PMBC’s Células mononucleares

PTI Púrpura trombocitopenia idiopática

TACI Activador transmembrana e interactor de CAML del inglés

transmembrane activador and calcium-modulating cyclophilin

ligand

TLR Receptores parecidos a toll del inglés toll like receptor

iii

TRAF Factores asociados a receptores TNF del inglés TNF

receptor asociated factor

TNFR Receptores de la familia de TNF del inglés TNF receptor

iv

INDICE DE FIGURAS

Página

Figura 1 Tipos de infecciones y riesgos en enfermedades por inmunodeficiencias primarias.

2

Figura 2 Principales grupos de Inmunodeficiencias, según el registro de la Sociedad de Inmunodeficiencias.

5

Figura 3 Representación esquemática del gene de CD154 y las mutaciones identificadas en pacientes con hiper-IgM tipo 1.

17

Figura 4 Análisis de las poblaciones celulares en sangre periférica.

34

Figura 5 Valores absolutos de las poblaciones de leucocitos, neutrófilos, linfocitos y monocitos de los testigos y los pacientes pareados por edad.

38

Figura 6 Análisis de las poblaciones de células T, B y NK. 39 Figura 7 Porcentaje de células CD8+ y CD4+ en las muestras

de los pacientes y de los testigos. 40

Figura 8 Valores absolutos de las poblaciones de células T CD3+, células B CD19+, células NK CD16+56, células T CD4+ y células T CD8+ de los testigos sanos y los pacientes pareados por edad.

43

Figura 9 Determinación de las sub-poblaciones de células B. 45 Figura 10 Porcentaje de células B CD22+, CD27+ en pacientes

y testigos. 48

Figura 11 Histogramas que muestran la expresión de CD154. 50 Figura 12 Análisis de la expresión de la proteína CD154 en

pacientes y testigos sanos. 52

Figura 13 Histogramas que muestran la expresión de CD40. 53 Figura 14 Análisis de la expresión de CD40 en células B y

monocitos de pacientes y testigos sanos. 56

Figura 15 Histogramas que muestran la expresión de ICOS. 57 Figura 16 Análisis de la expresión de ICOS en células T de

pacientes y testigos sanos. 59

Figura 17 Histogramas que muestran la expresión de TACI. 60 Figura 18 Análisis de expresión de TACI en las células B

maduras de pacientes y testigos sanos. 62

Figura 19 Resultados de la amplificación por PCR de CD154 en los pacientes 16, 20, 19 y 20.

64

Figura 20 Selección de clonas positivas para el gen CD154 en el paciente 19.

65

Figura 21 Mutaciones del gen CD154 en el paciente 16. 66 Figura 22 Mutaciones del gen CD154 en el paciente 19. 67 Figura 23 Mutaciones del gen CD154 en el paciente 22. 68 Figura 24 Mutaciones del gen CD154 en los pacientes 19 y 20. 69

v

INDICE DE TABLAS

Página Tabla 1 Clasificación de las inmunodeficiencias

predominantemente de anticuerpo.

Tabla 2 Valor absoluto de linfocitos B y concentración sérica de inmunoglobulinas en los 25 pacientes con inmunodeficiencia humoral.

32

Tabla 3 Características y manifestaciones clínicas en los 25 pacientes con inmunodeficiencias humorales.

33

Tabla 4 Valores absolutos de leucocitos totales, neutrófilos, linfocitos y monocitos de 17 testigos sanos de 1 a 5 años de edad, representado por la media, la desviación estándar y los límites menor y mayor.

35

Tabla 5 Valores absolutos de leucocitos totales, neutrófilos, linfocitos y monocitos de 17 testigos de 6 a 10 años de edad, representados por la media, la desviación estándar y los límites menor y mayor.

35

Tabla 6 Valores absolutos de leucocitos totales, neutrófilos, linfocitos y monocitos de 30 testigos sanos de 11 a 17 años de edad, representados por la media, la desviación estándar y los límites menor y mayor.

36

Tabla 7 Valores absolutos de leucocitos totales, neutrófilos, linfocitos y monocitos de 19 testigos sanos de edad adulta, representados por la media, la desviación estándar y los límites menor y mayor.

36

Tabla 8 Datos de los valores absolutos de leucocitos, neutrófilos, linfocitos y monocitos de los 25 paciente

37

Tabla 9 Valores absoluto de células TCD3, sub-poblaciones de células T, células B CD19+ y células NK CD16+56+ en 17 testigos sanos de 1 a 5 años, representado por media, desviación estándar y los límites menor y mayor.

40

Tabla 10 Valores absolutos de células T CD3+, sub-poblaciones de células T, células B CD19 + y células NK CD16+56+ en 17 testigos sanos de 6 a 10 años, representado por la media, la desviación estándar y los límites menor y mayor.

41

Tabla 11 Valores absolutos de células T CD3, sub-poblaciones de células T, células B CD19* y células NK CD16+56+ en 30 testigos sanos de 11 a 17 años, representado por la media, la desviación estándar y los límites menor y mayor.

41

Tabla 12 Valores absolutos de células T CD3+, sub-poblaciones de células T, células B CD19+ y células NK CD16+56+ en 19 testigos sanos de

41

vi

edad adulta, representado por la media, la desviación estándar y los rangos menor y mayor.

Tabla 13 Datos de los valores absolutos de células T, sub-poblaciones de células T, células B, células NK de los 25 pacientes.

42

Tabla 14 Porcentaje de células B CD19+, CD22+, CD27+ en 25 pacientes.

46

Tabla 15 Porcentaje de células B CD19+, CD22+, CD27+ en 15 testigos sanos.

47

Tabla 16 Clasificación de los 21 pacientes con CVID de acuerdo al porcentaje de células B de memoria y sus características clínicas.

49

Tabla 17 Porcentaje de expresión de CD154 en 17pacientes con inmunodeficiencias humorales.

51

Tabla 18 Porcentaje de expresión de CD154 en 7 testigos sanos.

51

Tabla 19 Porcentaje de células B que expresan CD40 en 18 pacientes con inmunodeficiencia humoral.

54

Tabla 20 Porcentaje de células B que expresan CD40 en 8 testigos sanos.

54

Tabla 21 Porcentaje de monocitos que expresan CD40 en 14 pacientes con inmunodeficiencia humoral.

55

Tabla 22 Porcentaje de monocitos que expresan CD40 en 6 testigos sanos.

55

Tabla 23 Porcentaje de células T que expresan ICOS en 18 pacientes con inmunodeficiencia humoral.

58

Tabla 24 Porcentaje de células T que expresan ICOS en 5 testigos sanos.

58

Tabla 25 Porcentaje de células B maduros que expresan TACI en 17 pacientes con inmunodeficiencia humoral.

61

Tabla 26 Porcentaje de células B maduras que expresan TACI en 6 testigos sanos.

61

Tabla 27 Resumen de las mutaciones encontradas en el gen de CD154 de los pacientes con Síndrome de hiper-IgM (Tipo 1).

69

vii

RESUMEN

Entre los grupos de Inmunodeficiencias Primarias (IDP’s), las

inmunodeficiencias humorales son las más comúnmente reportadas en el

mundo. Una de las inmunodeficiencias humorales es la Inmunodeficiencia

Común Variable (CVID). El defecto común en los pacientes con CVID es la

disminución en la producción de anticuerpos y los defectos genéticos que la

ocasionan no se conocen completamente, aunque se han identificado diversas

anormalidades como la deficiencia de CD19, defectos en la molécula TACI,

mutaciones en ICOS y BAFFR. Otra inmunodeficiencia humoral es el síndrome

de hiper-IgM que en la mayoría de los casos se hereda de un modo ligado al

cromosoma X (HIGM tipo 1) con mutaciones en la proteína CD154, pero

también se han reportado casos de una forma adquirida que afecta ambos

sexos. En este trabajo de investigación se estudiaron 25 pacientes con

diagnostico de inmunodeficiencia humoral, se determinó el origen de esta

deficiencia inmunológica CVID ó hiper-IgM. El comportamiento de las

poblaciones de leucocitos de los 25 pacientes fue muy irregular, la mayoría de

los pacientes tuvieron disminución de células B, principalmente los pacientes

de edad adulta. Cuatro pacientes no expresaron CD154 y a estos pacientes se

les determinaron las mutaciones en el gen de CD154. Un paciente no expresó

CD40 en monocitos y dos pacientes expresaron un porcentaje muy bajo de

ICOS y son candidatos al estudio molecular. Cuatro pacientes tuvieron menos

del 1% de células B (grupo III) por lo que no se les incluyó en el análisis de

asociación entre células B de memoria y manifestaciones clínicas. De los 17

pacientes restantes, con más del 1% de células B; 47% expresaron menos del

20% de células B de memoria CD22+, CD27+ (grupo I); los demás expresaron

más del 20% de linfocitos B de memoria (grupo II). Los pacientes del grupo II

presentaron una mayor susceptibilidad a procesos infecciosos virales y

tuberculosis, por lo que su defecto pude deberse a una deficiencia combinada

de células B y T. En conclusión estos datos confirman que las manifestaciones

clínicas y el porcentaje de las poblaciones de células B de memoria es

altamente variable de paciente a paciente, indicando que pueden existir

diferentes defectos que lleven a un fenotipo de CVID.

viii

ABSTRACT

Among the different primary immunodeficiencies (PID), the antibody defects are

the most commonly reported. These disorders range from the complete absence

of all classes of antibodies to selective states of deficiency of a single class or

subclasses of antibodies. The most frequent immunodeficiency is the common

variable immunodeficiency (CVID), which is characterized by the decrease in the

production of antibodies. The genetic defects that cause it are not completely

known although various defects as CD19, TACI and ICOS deficiencies have

been identified. Other primary immunodeficiencies of antibodies are the hyper –

immmunoglobulin M (IgM) syndrome (hyper- IgM). The most common for of

hyper-IgM is thought to be x-linked and the consequence of mutations of CD40

ligand (CD154). This work reports the results of studies of leukocyte populations,

the expression of B cell subpopulations, and the expression of some proteins

(ICOS, TACI, CD40 and CD40L), which were determined by flow cytometry,

performed on 25 patients with clinical diagnosis of primary immunodeficiencies of

antibodies; these results were analyzed together with their medical records. It

was found that the behavior of these patients’ leukocyte populations was very

irregular. Most of them had a diminished number of B cells, especially adult

patients. Four patients had less than 1% of B cells (group III); of the 17 remaining

patients, 8 had less than 20% of memory B cells CD22 +, CD27 + (group I) and

the other 9 expressed more than 20% of lymphocyte memory B cells (group II).

Patients from Group II presented a higher number of viral infections or

tuberculosis. The expression of CD40, TACI, CD154 and ICOS were sought in all

the patients. Four patients express a very low percentage of CD154 and we

studied of mutations of this molecule. One patient expressed low percentage of

CD40 and two patients expressed low percentage of ICOS and therefore they

would be candidates for a search of mutations of this molecule. In conclusion,

these data confirm that this disease presents a wide variability in the spectrum of

clinical manifestations and in the number of memory B cells; this suggests that

the phenotype of CVID may be provoked by different genetic defects.

I. INTRODUCCIÓN

Las inmunodeficiencias primarias

Las inmunodeficiencias se producen cuando uno o más componentes del sistema

inmunitario están defectuosos. Estas se clasifican en primarias y secundarias. Las

inmunodeficiencias secundarias o adquiridas son debidas a factores extrínsecos,

como fármacos, radiaciones, desnutrición, infecciones, las malformaciones del

tracto urinario o del sistema respiratorio. Las inmunodeficiencias primarias (IDP’s)

son debidas a defectos intrínsecos de las células que integran el sistema

inmunitario, y en la mayoría de los casos aparecen como consecuencia de

anomalías genéticas. Aunque en muchas IDP se ha podido determinar una causa

genética, en otras la causa permanece desconocida. Las IDP’s, representan un

grupo heterogéneo que se caracteriza por la predisposición a enfermedades

infecciosas, autoinmunitarias y procesos cancerosos (Bonilla y Geha, 2003).

Manifestaciones clínicas

Las inmunodeficiencias primarias se presentan fundamentalmente en forma de

infecciones recurrentes. Según el tipo de infección puede sospecharse la

existencia de la deficiencia inmunitaria, sin embargo, las infecciones son sólo un

elemento de orientación, ya que existe un buen número de casos intermedios y de

formas de difícil definición. La edad de aparición y la gravedad de las infecciones

varían según el tipo de deficiencia, se presentan con mayor frecuencia (60%) en

lactantes o niños, pero pueden aparecer en cualquier etapa de la vida (Smith y col.

1999). El tipo de microorganismo identificado en los pacientes nos da un indicio

del tipo de defecto inmune. Las infecciones bacterianas recurrentes del sistema

respiratorio están asociadas a defectos de células B. Por otro lado, los pacientes

que presentan infecciones con Pneumocystis carinii ó microorganismos

intracelulares pueden tener deficiencias de células T. En la figura 1se muestra

con mayor detalle las complicaciones de las inmunodeficiencias primarias según

los diferentes sistemas de defensa que están involucrados en la enfermedad

(Hassner, 1991).

2

Figura 1. Tipos de infecciones y riesgos en enfermedades por inmunodeficiencias primarias

(Conley y col., 1999)

3

Clasificación de las inmunodeficiencias primarias

El concepto de IDP y su desarrollo comienza con el descubrimiento de la

agammaglobulinemia de Bruton en 1952. A partir de entonces se inicia la

investigación de estas enfermedades que enseguida se relacionan con las

anomalías de la ontogenia del sistema inmunitario. Desde 1950 a 1965 se

describen las IDP más características, sin embargo, el número de IDP ha

incrementado con el tiempo, registrándose 34 formas en 1973, 66 en 1989 y cerca

de un centenar en la actualidad (Stiehm,1992).

Los desórdenes congénitos de la inmunidad son raros. Se han reportado muchas

variedades de IDP. En la mayoría de los casos se trata de enfermedades

hereditarias cuya clasificación sufre una revisión continua a medida que se

generan progresos en la inmunología. Sin embargo llama la atención comprobar

que a pesar de un mejor conocimiento y aplicación de sondas moleculares para la

identificación de los genes involucrados en las IDP’s, la mayor parte de los déficit

inmunitarios todavía se clasifican de acuerdo a sus manifestaciones clínicas y

biológicas.

La clasificación de las inmunodeficiencias primarias más actualizada está bajo

revisión de la Organización Mundial de la salud. La última clasificación se publicó

en 2007 y divide a las inmunodeficiencias conocidas en ocho grupos (Geha y col.,

2007).

Prevalencia

Las inmunodeficiencias predominantemente de anticuerpos ó inmunodeficiencias

humorales son las más frecuentes, ya que representan alrededor del 55% del total

de las IDP, según los datos obtenidos del registro de la Sociedad Europea de

Inmunodeficiencias Primarias (ESID), figura 2.

4

Figura 2. Principales grupos de Inmunodeficiencias, según el registro de la Sociedad de Inmunodeficiencias. Datos obtenidos de la página de Internet www.esid.org.

Las IDP’s con defectos predominantemente de anticuerpos

En este grupo de IDP, el defecto se limita a la formación de anticuerpos, ya sea

por una alteración en el desarrollo intrínseco de las células B, por un fallo en la

respuesta de las células T o defectos que afecten la activación de las células B.

Los defectos moleculares en este grupo de IDP son muy heterogéneos, pudiendo

afectar cualquier elemento de la respuesta humoral, dando lugar a una falta de

producción de todas las clases de anticuerpos o una deficiencia selectiva de una

clase o subclase de anticuerpo (Conley, 2001; Wood, 2009).

http://www.esid.org/

5

Tabla 1. Clasificación de las inmunodeficiencias predominantemente de anticuerpo (Notarangelo y col., 2004).

Desarrollo de las células B en periferia:

Para poder entender los defectos moleculares de las inmunodeficiencias

humorales, es importante conocer el desarrollo de la célula B en humanos y la

interacción que existe con las células T cooperadoras y el micro ambiente en los

órganos linfoides secundarios.

El desarrollo de las células B en el humano es poco conocido. En la médula ósea,

los diferentes estadios del desarrollo de la célula B pueden ser identificados con

base en la expresión de marcadores de superficie y en la caracterización de

rearreglos del loci de las cadenas pesadas y ligeras de las inmunoglobulinas.

Basados en estos datos, las fases tempranas del desarrollo de la célula B son

6

similares en el ratón y el humano (Carsetti y col., 2004). En la célula B la

expresión de una cadena pesada intacta y más tarde la expresión en superficie de

una molécula de inmunoglobulina completa regula activamente la progresión de un

estadio al siguiente, que culmina en la producción de la célula B inmadura

superficie (LeBien, 2000).

Las células B inmaduras migran al bazo en donde se diferencian en linfocitos

maduros ó vírgenes. Las células B inmaduras en la periferia son conocidas como

células transicionales. Sims y col. han identificado y caracterizado a las células B

transicionales humanas, clasificaron a las células B inmaduras en médula ósea

por la expresión de marcadores como CD10 alto, CD44 bajo, CD24 alto, CD38 alto

y el 7 a 8 % expresan IgD. Las células transicionales humanas en sangre de

cordón se presentan en un 14 %, mientras que en sangre periférica en un 2 % y

se pueden identificar por marcadores como CD19 +, CD24 alto, CD38 alto, CD21

bajo, CD23 negativo o bajo, IgM alto, IgD bajo, CD62L bajo. El marcador CD27,

así como la hipermutación somática de sus cadenas pesadas y ligeras está

ausente por lo que no es posible identificarlas como células B de memoria (Sims

y col., 2005).

Las células B vírgenes inician su activación con el reconocimiento del antígeno por

parte del BCR. En estudios recientes, se concluye que éstas requieren de la

integración de tres señales para ser activadas; la primera señal es el

reconocimiento del antígeno por parte del BCR; la segunda señal está dada por la

interacción de la célula T cooperadora y la célula B por medio del contacto entre

CD154 y CD40; y la tercera señal está integrada por los productos bacterianos

que activan los receptores parecidos a Toll (TLRs) (Lanzavecchia y col., 2006).

El siguiente paso de la respuesta adaptativa es la generación de la memoria

inmunológica. La activación de las células B es indispensable para la respuesta

humoral a la infección. Las células B que unen a su antígeno específico son

atrapadas en forma selectiva y las células T cooperadoras las activan, entonces

forman el foco primario de expansión clonal que después de unos días

involuciona. Las células T y B que sobreviven migran a los folículos primarios

donde siguen proliferando y forman el centro germinal. Las células B experimentan

7

una amplia proliferación y mutación somática, expresan un receptor mutado que si

es complementario a los antígenos mostrados por las células dendríticas

foliculares van a ser rescatados temporalmente. Las células B que han captado,

interiorizado y mostrados sus antígenos en las MHCII van a recibir señales

permanentes de rescate por parte de las células T específicas. Entonces van a

entrar en el conjunto de las células B de memoria y quedar disponibles para una

futura estimulación ó bien pueden diferenciarse a células plasmáticas y secretar

inmunoglobulinas con diferentes isotipos (Anderson y col., 2006).

Inmunodeficiencia común variable (CVID):

La Inmunodeficiencia Común Variable (CVID) fue descrita en 1953 (Janeway y

col.,1953), es el síndrome más común de las inmunodeficiencias primarias de

anticuerpos. Los pacientes con CVID presentan los niveles reducidos de IgG e IgA

en suero, mientras que la IgM se encuentra reducida en la mitad de los pacientes,

a pesar de poseer células B en sangre periférica. Los pacientes con CVID

presentan infecciones bacterianas recurrentes, predominantemente en las vías

altas y bajas del tracto respiratorio y gastrointestinal. Afecta tanto a hombres

como a mujeres, con cierto predominio en hombres. Sólo en algunos casos con un

defecto monogénico se ha podido demostrar una transmisión genética de la

enfermedad (autosómica recesiva y autosómica dominante). Los primeros

síntomas pueden aparecer en la infancia, adolescencia o edad adulta. El

diagnóstico se realiza preferentemente en dos picos de edad; uno en la infancia y

otro entre los 20 y 30 años, siendo la IDP que inicia en adultos más

frecuentemente (Hammartön y col., 2000).

Manifestaciones clínicas

Las infecciones pulmonares piógenas recurrentes están presentes prácticamente

en todos los pacientes en el momento del diagnostico, siendo las manifestaciones

clínicas de origen respiratorio las más frecuentes. Estas manifestaciones pueden

ser neumonías, sinusitis, bronquitis, otitis. La bacterias encapsuladas

(Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae y Pseudomona aeruginosa)

8

son los gérmenes responsables de la mayoría de las infecciones respiratorias. Las

complicaciones pulmonares como bronquiectasias, enfisema, fibrosis pulmonar se

desarrollan en cerca del 20 al 30% de los pacientes (Oksenhendler y col., 2008).

Las manifestaciones gastrointestinales son la segunda causa mas frecuente,

siendo las enteritis por Salmonella y Giardia lamblia las mas comunes. Las

manifestaciones gastrointestinales son la diarrea crónica no infecciosa, síndrome

de mala absorción, intolerancia a la lactosa. La enfermedad inflamatoria intestinal

es común, cerca del 30% de los pacientes tiene algún grado de diarrea crónica

(Park y col., 2008).

Los pacientes con CVID tienen predisposición a infecciones por micoplasma

dando lugar a artritis séptica. Las alteraciones neurológicas comunes son las

meningitis bacterianas causadas por neumococos y Haemophilus que crean

complicaciones clínicas como abscesos cerebrales y enfermedad granulomatosa.

Alrededor de un 20 a 30 % de los pacientes presentan trastornos autoinmunes

como: anemia hemolítica autoinmune (AHA), púrpura trombocitopénica idiopática

(PTI), artritis reumatoide (Ar), anemia perniciosa y lupus eritematoso sistémico

(LES). Un tercio de los pacientes presentan esplenomegalia, linfadenopatías;

también las lesiones granulomatosas han sido descritas (Chapel y col., 2008).

Diagnostico diferencial

Otras inmunodeficiencias humorales presentan hipogammaglobulinemia y

síntomas de infecciones recurrentes pulmonares, estas incluyen

agamaglobulinemia ligada al X (ALX), agammaglobulinemia autosómica recesiva

(AR), síndrome linfoproliferativo ligado al X (LXP) y síndromes de hiper IgM; estás

inmunodeficiencias deben ser descartadas para el diagnostico de CVID. Los

criterios aceptados incluyen: la presencia de hipogamaglobulinemia en dos o más

isotipos de inmunoglobulinas (bajo IgG, IgA ó IgM), infecciones sinopulmonares

recurrentes y respuesta irregular de anticuerpos; esta última incluye ausencia de

isohemaglutininas, pobre respuesta a las vacunas polisacáridas (S pneumoniae) y

vacunas contra difteria y tétanos (Park y col., 2008).

9

Etiología

El defecto común en los pacientes con CVID es la formación defectuosa de

anticuerpos. Los defectos genéticos en CVID no se conocen, aunque se han

identificado diversas anormalidades. Las irregularidades incluyen alteraciones de

la proliferación y la activación de las células T, producción irregular de citocinas y

la expresión reducida de moléculas coestimulatorias como CD40L (Farrington y

col., 1994). Sin embargos los defectos más notorios se encuentran en las células

B ya que la diferenciación terminal y la hipermutación somática se encuentran

alterados, además de problemas en la señalización y en el cambio de isotipo

(Salzer y col., 2006).

En los últimos años se han identificado 4 defectos monogénicos en pacientes con

CVID. Estos son TACI, CD19, ICOS y BAFFR (Bacchelli, 2007). Estas moléculas

cobran importancia debido a que forman parte de las señales necesarias para el

desarrollo de la célula B en periferia.

TACI

La proteína TACI (transmembrane activator and calcium-modulator and cyclophilin

ligand interactor, TNFRSF-17)) es una proteína de la superfamilia de los

receptores del factor de necrosis tumoral, los cuales transducen señales

importante para la regulación, tanto de supervivencia como de apoptosis de las

células B. TACI y BCMA ( B-cell maduration protein, TNFRSF17) se unen a dos

ligandos: BAFF (B cell activating factor, TNFSF13B) y APRIL (Proliferation-

inducing ligand, TNFSF13A), mientras que la proteína BAFFR ( BAFF receptor,

TNFRSF13) se une exclusivamente a BAFF. TACI es un receptor transmembranal

tipo III y el gen TNFSF13B (TACI) está situado en el cromosoma 17p11.2 y tiene 5

exones. TACI se expresa en células B vírgenes y activadas y, transduce las

señales vía TRAF, NF B, CAML, NFAT y AP-1. Los ratones TACI -/- presentan

una expansión e hiperactividad de la células B, autoinmunidad, linfoproliferación y

una respuesta alterada timo independiente tipo II (Castigli y col., 2005; Salzer y

Grimbacher, 2006).

10

En el 2005 se describieron 6 diferentes mutaciones, homocigotas y heterocigotas,

en el gen TNFSF13B de pacientes con CVID y con inmunodeficiencia de IgA

(DIgA). En este estudio se describieron dos “hotspots” (C104R y A181E); el

primero corresponde a una cisteína muy conservada (CRD) y el segundo está en

la región transmembranal de TACI. El fenotipo de los pacientes es variable en los

casos descritos, y no se ha encontrado gran similitud con los ratones TACI-/-. Los

pacientes no presentan manifestaciones autoinmunes graves, ni linfoproliferación,

ni expansión de las células B en sangre periférica (Castigli y col., 2005).

Se han identificado mutaciones en el gen que codifica TACI en un 10-15% de los

casos pacientes con CVID, así como en una pequeña fracción de casos con

DIgA (Salzer y col., 2005). Las mutaciones en TACI se asocian a defectos en la

generación y/o mantenimiento de las células B de memoria y células plasmáticas.

Este defecto se manifiesta más plenamente en la respuesta timo independiente.

En estos pacientes el número de células B es normal o se encuentra

discretamente reducido, con reducción variable de células B de memoria CD27+

(Salzer y Grimbacher , 2006).

CD19

Se han reportado también pacientes con CVID y deficiencia de CD19 (Van Zelm

y col., 2006). El desarrollo y diferenciación depende de la transducción de señales

a través del BCR. Los co-receptores asociados al BCR pueden modular la señal

de transducción del BCR positiva o negativamente e influenciar la diferenciación

del linfocito B. CD19, junto con CD21, CD81 y CD225 forman el complejo receptor

que regula la señalización del BCR después de su entrecruzamiento con el

antígeno. CD19 tiene dos dominios extracelulares parecidos a inmunoglobulinas y

un tallo citoplasmático con motivos capaces de unir tirosinas cinasas como Lyn o

la cinasa PI3K (Bacchelli y col 2007). El CD19 juega un papel crucial en la

regulación de la respuesta de la célula B frente al antígeno y en la supervivencia

de estas células. La proteína CD19 se expresa de forma temprana durante el

proceso de diferenciación de la célula B en médula ósea, hasta su diferenciación

a célula plasmática. Los pacientes con mutación en CD19 tienen un desarrollo

11

relativamente normal de células B y la formación de centros germinales, pero el

número de las células B CD27 positivas esta reducido, tienen defectos en el flujo

de calcio seguido de estimulación con IgM y muestran poca proliferación después

de estimulación con Staphylococcus aureus Cowan 1, que resulta de la

incapacidad de montar una respuesta humoral efectiva (van Zelm y col., 2006).

ICOS

ICOS (co-estimulador inducible), es una molécula que esta relacionada estructural

y funcionalmente con CD28 y se ha reportado que es un regulador importante del

sistema inmune (Hutloff y col., 1999). Se expresa en células T activadas que se

encuentran en órganos linfoides secundarios y en la zona clara de los centros

germinales y se une solamente a ICOS-L. En 1999 se descubrió el ligando de

ICOS (ICOS-L), glicoproteína de membrana tipo I que se expresa en células B,

células dendríticas; monocitos y células no linfoides. Este co-estimulador

promueve en las células T la secreción de citocinas como IL 4, IL 5, IL 6 pero

principalmente IL 10 que estimula la diferenciación terminal de células B a células

de memoria y plasmáticas. El gen que codifica ICOS humano está localizado en

el cromosoma 2q33-34, misma región que los genes para CD28 y CTLA-4 (Beiber

y col. 2000).

La deficiencia de ICOS en humanos fue descrita por primera vez en 2003 por

Grimbacher y colaboradores, cuatro pacientes adultos de dos familias no

relacionadas se les encontró una eliminación que resultó de la completa falta de

expresión de la proteína ICOS. Dichos pacientes habían sido diagnosticados como

CVID con hipogammaglobulinemia; con reducción considerable de células B de

memoria y células B “naive”. En otros estudio con 9 pacientes, donde 2 pacientes

eran niños, se determinó que el número de células B en adultos estaba reducido,

mientras en los niños era normal. El fenotipo y función de células T CD4+ era

normal, pero la secreción de IL-10 e IL-17 era irregular (Warnatz K y col. 2006).

Con estos datos es evidente que una función de ICOS es en las células T

activadas, como un regulador de las células B, en el cambio de isotipo, en la

formación de células B de memoria y en la producción de inmunoglobulinas. Se

12

han encontrado mutaciones en ICOS en 5 % de los pacientes con CVID (Warnatz

y col. 2006).

BAFFR

BAFF, APRIL y sus receptores tienen una función inmunológica importante,

especialmente en las células B. El gen TNFSF13B (BAFF) está localizado en el

cromosoma 13q34, tiene 6 exones y existen dos isoformas, una de ellas se

expresa en membrana mientras que la otra, es una proteína soluble, es expresado

por células presentadoras de antígeno, linfocitos T, neutrófilos y células

estromales de médula ósea. Los ratones BAFF-/- presentan un defecto grave en

el desarrollo de células B, por lo que las respuestas timo independiente y

dependiente están alteradas. La expresión de APRIL se ha descrito en células

presentadoras de antígeno, células T y en líneas tumorales. Los ratones

deficientes en APRIL -/- presentan una respuesta de IgA alterada. El gen

TNFRSF13C (BAFFR) está localizado en el cromosoma 22q13.1-13.31, se

expresa en linfocitos B y en una sub-población de linfocitos activados. Las células

plasmáticas presentan una baja expresión de BAFFR en la membrana. Los

ratones BAFFR-/- presentan un fenotipo grave parecido al de los ratones BAFF-/-,

con alteraciones en la presencia de algunas sub-poblaciones de células B y una

respuesta tipo-dependiente deficiente (Bossen y Schneider, 2006). Además de su

papel como factores de supervivencia de células B, BAFF/BAFFR interaccionan en

la regulación de la expresión de CD21 y CD23 y en la diferenciación de las células

B en zonas marginales. En el 2004 se comunicó un paciente con CVID con una

eliminación en el gen TNFRSF13C, que afectaba la región transmembranal del

BAFFR, el patrón de herencia fue autosómico recesivo (Warnatz y col. 2005).

Clasificación de CVID

Desde la primera descripción de CVID se han realizado múltiples estudios con el

fin de obtener conocimientos nuevos sobre esta enfermedad. Se ha descrito esta

patología según la clasificación propuesta por Bryant (Spickett y col., 1997)

(Bryant y col., 1990). En esta clasificación se describe la capacidad de la célula B

13

de secretar IgM, IgG e IgA bajo estimulación in vitro con Staphylococcus aureus

Cowan I, adicionando IL-12, o anti IgM más IL-2. Se establecieron tres grupos:

Grupo A: involucra pacientes que presenta falla en la producción de cualquier

isotipo de Ig’s in vitro; Grupo B: pacientes con producción normal solamente de

IgM; Grupo C: pacientes con una producción similar a individuos sanos de

cualquier tipo de isotipo de Ig’s in vitro, pero niveles bajos de inmunoglobulinas in

vivo.

Los actuales conocimientos sobre maduración y diferenciación de las células B

han permitido definir otras alteraciones en sub-poblaciones de células B en

pacientes con CVID. Las células B “naive” y las células B de memoria en humanos

pueden identificarse usando una combinación de marcadores que incluyen

isotipos de inmunoglobulinas, CD27 el cual es expresado en la mayoría de las

células B de memoria, entre otros marcadores celulares que ayudan a discriminar

entre las diferentes sub-poblaciones de células B. En humanos, las mutaciones en

las regiones V de las inmunoglobulinas correlacionan con la expresión de CD27 en

las células B de memoria (Shi y col., 2003).

Utilizando como marcadores de memoria a CD27, CD21 y CD19 Warnatz y col.,

2002 establecieron una nueva clasificación:

Grupo I: incluye pacientes que poseen células B CD27+ menos de 0.5%

(77% de los pacientes estudiados). Este grupo se subdivide en dos grupos:

o Tipo 1a: con un número incrementado de las células B CD19+CD21-

(células inmaduras);

o tipo 1b: los pacientes que presentan un número normal de células B

CD19+, CD21+;

Los pacientes del tipo 1a también poseen porcentajes muy bajos de células B de

memoria con cambio de isotipo. El 100% de los pacientes del tipo 1a presentó

esplenomegalia y el 60% presentó citopenia del tipo autoinmune, mientras que los

pacientes del grupo 1b sólo el 7.7% se asoció a otros fenómenos autoinmunes

tales como vitiligo y anemia perniciosa.

14

Grupo Tipo II: Incluye pacientes con un alto porcentaje de células B, con

CD27+ mayor al 0.05% y con una producción normal de Ig’s in vitro, pero

con porcentajes bajos de Ig’s in vivo.

Grupo III: incluye pacientes con menos del 1% de células B.

En esta clasificación se concluyó que los pacientes con CVID del grupo I, pueden

tener reacciones irregulares en el centro germinal. Los pacientes con CVID del

grupo II pueden cursar con incremento en la proliferación o decremento en la

apoptosis. Y sí estos pacientes tienen número normal de células B de memoria,

pueden tener una reacción normal de centro germinal, pero fallan en la

producción de anticuerpos in vivo y la hipogammaglobulinemia entonces puede

deberse a fallas en la diferenciación hacia las células plasmáticas. Muchas

interacciones como CD27 y CD70, CD134 y CD134L e IL6 con su receptor

promueven la diferenciación de las células B a células plasmáticas (Agematsu,

2000). Asimismo, la interacción BAFF y BAFFR contribuye a la diferenciación de

las células B de memoria a plasmablastos y la supervivencia de estos, para la

formación de las células plasmáticas (Warnatz y col., 2002).

La clasificación propuesta por el grupo de París (Piqueras y col. 2003), se basa

en la cuantificación de la proporción de sub-poblaciones de células B de memoria

(BM), definidas con base en la expresión de IgD y CD27 y se dividieron a los

pacientes en 3 grupos:

Grupo BM0: pacientes sin células B de memoria (CD27-).

Grupo BM1: pacientes con células B de memoria no funcionales (sin

cambio de isotipo (CD27+ IgD+)

Grupo BM2: pacientes con células B de memoria de ambos tipos (células B

de memoria con cambio de isotipo, CD27+IgD- y células B de memoria sin

cambio de isotipo células B CD27+IgD+) en una proporción igual a la de la

población general.

Se observó una proporción mayor de manifestaciones linfoproliferativas y

granulomatosas. En los pacientes con CVID que pertenecen al grupo BM0, y de

esplenomegalia en los pacientes del Grupo BM0 y BM1 (Piqueras y col. 2003).

15

La última clasificación de los pacientes con CVID es la de EURO class trial, este

ensayo europeo fue iniciado para desarrollar un consenso de 2 esquemas de

clasificación existentes basados en el fenotipo de las células B y el curso clínico.

La evaluación clínica de 303 pacientes con CVID demostró que una reducción

severa de las células B de memoria se asoció a un riesgo alto de esplenomegalia

y enfermedad granulomatosa (Wehr y col., 2008).

Síndrome de Hiper-IgM

En 1961, se describen 2 hermanos con infecciones recurrentes, los cuales,

presentaron la IgG y la IgA en concentraciones muy bajas y elevada la IgM, a este

síndrome se le denominó “dysgammaglobulina” (Rosen y col. 1961). En 1974 la

Organización Mundial de la Salud lo nombró como Síndromes de

Inmunodeficiencias con hiper-IgM. Las observaciones de que bastantes pacientes

con hiper-IgM son susceptibles a infecciones oportunistas hicieron pensar que el

defecto se podría encontrar en las células T. En 1993, 5 grupos independientes

encontraron la mutación en el gen responsable de este síndrome, el cual se

encuentra en la proteína CD154. Recientemente, se han involucrado más genes

con diferentes presentaciones clínicas, lo que condujo a un cambio en el nombre

“Defectos en la recombinación del cambio de isotipos de la Ig’s” (Etzioni y Ochs,

2004).

La hiper-IgM LX suele originarse debido a una mutación del gen que codifica para

el ligando de CD40 (CD154) en las células T y se hereda de un modo ligado al

cromosoma X. Los pacientes que tienen esta mutación se conocen como hiper-

IgM LX ó hiper-IgM tipo1. En la clasificación más reciente de la Organización

Mundial de la Salud (OMS), a este desorden lo agrupan como una deficiencia

combinada severa, pero todavía está incluida en las deficiencias

predominantemente de anticuerpos por que tiene un fenotipo de

agamaglobulinemia (Rosen y col.1997). Las manifestaciones clínicas

predominantes en estos pacientes incluyen, infecciones recurrentes virales y

bacterianas del tracto respiratorio alto y bajo y, enfermedad intersticial del pulmón

causado por Pneumocystis carinii; neutropenia que puede ser crónica ó cíclica;

16

diarrea crónica ó recurrente. La enfermedad se presenta con infecciones piógenas

recurrentes, incluyendo otitis media, neumonía y septicemia. La neumonía

causada por Pneumocystis es una infección inicial muy frecuente. Aquellos que

logran sobrevivir a los 20 años de edad suelen desarrollar enfermedad hepática

crónica o hepatoma (Levy y col. 1997).

El ligando de CD40 (CD154) se expresa en células T cooperadoras activadas e

interactúa con CD40, el cual se encuentra constitutivamente en la superficie de

las células B, monocitos y células dendríticas. La interacción entre las moléculas

CD40 y su ligando (CD154) lleva a numerosas asociaciones que tiene lugar entre

células del sistema inmune innato y adaptativo. CD154 y CD40 pertenecen a una

gran familia de citocinas y receptores de citocinas. CD154 es miembro de la

familia de citocinas TNF y CD40 de receptores TNF (TNFR). CD154 es una

proteína transmembranal tipo II, que se expresa en la superficie celular en forma

trimérica, puede unirse simultáneamente a tres moléculas de CD40. CD154 se

expresa predominantemente en células T CD4+ activadas, se ha identificado en

algunas células T CD8+ y algunas células T (van Krooten y col., 2000). La

expresión de CD154 en células T activadas es transitoria, por 6 a 10 horas según

la estimulación y se pierde después de 24 horas.

La interacción entre células T y B se basa en contactos célula-célula y factores

solubles (citocinas) tienen una función en la maduración de la respuesta de

anticuerpos. La unión de CD40 y su ligando (CD154) es particularmente

importante para promover la supervivencia de las células B y la inducción del

cambio de isotipo. El entrecruzamiento de CD40 en la superficie de la célula B

promueve su proliferación, el rescate de la apoptosis, induce la expresión de

moléculas de adhesión, la hipermutación somática, el cambio de isotipo y la

generación de células plasmáticas de larga vida. La interacción de CD154-CD40

es requerida para la formación de los centros germinales. Diversas rutas de

señalización son activadas después de la interacción de CD154-CD40, como la

secreción de citocinas (IL-2, IL-4 y IL-10) que inducen la activación de las células

B. Como otros miembros de la superfamilia de receptores TNF, el dominio

citoplasmático de CD40 interacciona con factores asociados a receptores TNF

17

(TRAF) 2, 3 y 6. TRAF-2 y TRAF-3 se unen a sitios del tallo citoplasmático de

CD40 y son esenciales para el cambio de isotipo. Las moléculas TRAF actúan

como proteínas adaptadoras y reclutan diferentes proteínas, como la fosfolipasa

C , c-Jun, BTK, entre otras y el resultado es la activación de factores de

transcripción como AP-1 y NF- B (Notarangelo y col., 2006).

La determinación de la expresión de CD154 por citometría de flujo representa un

método importante para el diagnóstico de síndrome de hiper-IgM tipo I, sin

embargo, para la confirmación de esta enfermedad es necesario un estudio

molecular para determinar mutaciones en el gen de CD154. La estructura del

RNA mensajero de CD154, mostrado en la figura 3, se aprecian las mutaciones

identificados en este gen (Notarangelo y col., 2006).

Figura 3: Representación esquemática del gen de CD154 y las mutaciones encontradas en pacientes con hiper-IgM tipo 1 (Notarangelo y col., 2006).

Aunque la mayoría de los pacientes con hiper-IgM tienen defectos en el de gen de

CD154, se han reportado formas autosómicas recesivas y autosómicas

dominantes de esta enfermedad que indica la presencia de otros defectos

18

genéticos. Se han descrito solo 4 familias con deficiencia de CD40. En todos los

casos la enfermedad es autosómica recesiva y se ha diagnosticado con base en la

falta de expresión de CD40 en la superficie de las células B y los monocitos. Los

hallazgos clínicos de estos pacientes son idénticos a los reportados en los

pacientes con deficiencia de CD154, con infecciones recurrentes debido a

bacterias oportunistas. Esta entidad se le clasifica como hiper-IgM tipo 3 (Ferrari y

col. 2001).

El entrecruzamiento de CD40 da como resultado la activación de la ruta de

señalización de NF- B, la cual es crítica para la hipermutación somática y el

cambio de isotipo. Los pacientes afectados con displasia hipohidrótica

ectodérmica (EDA-ID), tienen la característica de niveles bajos en suero de IgG e

IgA, y concentraciones elevadas o normales de IgM y mala respuesta de

anticuerpos particularmente a los antígenos de polisacáridos (Durandy, 2002). En

muchos casos, la EDA-ID está ligada al cromosoma X y la mutación se encuentra

en el modulador esencial de NF- B (NEMO, también llamado IKK- ). Después del

entrecruzamiento de CD40, se activa IKK y da como resultado la fosforilación de

los inhibidores de NF- B (I B), con lo cual NF- B se puede trasportar al núcleo

para transcribir diversos genes involucrados en la hipermutación somática y el

cambio de isotipo (Notarangelo y col., 2006). Los pacientes con EDA-ID ligado al

X muestran defectos es células B de memoria (IgD- CD27+) y un exceso de

células B vírgenes, que expresan IgM e IgD (Döffinger y col., 2001).

Otras formas de síndromes de híper-IgM causan defectos intrínsecos en las

células B. La deficiencia AID (activation induced deaminase) en humanos fue

descrita a través del análisis de familias con síndrome de hiper-IgM con herencia

autosómica recesiva. El mecanismo de acción de AID es todavía debatido, sin

embargo, diversas líneas de investigación indican que AID es una enzima

reparadora de DNA (Durandy y col, 2005). En la mayoría de los casos la

enfermedad se presenta en niños con infecciones recurrentes en las vías altas y

bajas del tracto respiratorio, infecciones gastrointestinales y del sistema nervioso

central. Los pacientes tienen deficiencia profunda de IgG e IgA, y los niveles de

IgM están incrementados o son normales. El número de células B y T es normal,

19

la proporción de células B de memoria (CD27+) es normal, pero sin cambio de

isotipo (IgM+). La deficiencia de AID en pacientes con hiper-IgM se denomina

hiper-IgM tipo 2 (Revy y col., 2000; Imai y col., 2005).

Se han reportado 3 casos de deficiencia de uracilo N-glicosilasa (UNG) en

humanos. Las 4 mutaciones identificadas en estos pacientes están localizadas en

la región catalítica de la proteína que afecta la expresión tanto de UNG1 y UNG2.

UNG media la desglicosilación y remueve los residuos de desoxiuridina. La

deficiencia de UNG lleva a la incapacidad de remover los residuos generados por

AID con lo cual se acumulan lesiones en la replicación del DNA afectando la

recombinación del cambio de isotipo. En ratón y en humanos el gene de UNG

tiene dos isoformas: UNG 1 y UNG 2. UNG1 se expresa en mitocondrias y UNG2

es una proteína nuclear expresada en células en proliferación. UNG2 esta

asociada al complejo de proteínas de reparación de DNA, el cual es importante en

la hipermutación somática y cambio de isotipo (Schrader y col., 2005). El fenotipo

de los pacientes con deficiencia de UNG muestra defectos profundos en el

cambio de isotipo con muy bajos niveles de IgG e IgA y altas concentraciones de

IgM. La activación in vitro de las células B de pacientes con IL-4, falla en inducir

cambio de isotipo. Los pacientes tienen cantidades normales de células de

memoria (CD27+) que expresan sIgM. Los pacientes con hiper-IgM y deficiencia

de UNG se les denominan hiper-IgM tipo 5 (Imai y col., 2003; Notarangelo y col.,

2006).

20

JUSTIFICACIÓN:

En los últimos 20 años se ha tratado de entender los defectos genéticos de las

inmunodeficiencias primarias, para avanzar en las bases moleculares y celulares

de la patogenia de estas enfermedades. En México las inmunodeficiencias

primarias son de difícil diagnóstico debido principalmente a la falta de pruebas de

laboratorio que caractericen a cada tipo de inmunodeficiencia. Así, el diagnóstico

se basa primordialmente en las manifestaciones clínicas que muestra cada

paciente. Por lo tanto, es importante estudiar pacientes con posible diagnóstico de

inmunodeficiencia primaria (humoral) para determinar el origen de su enfermedad

mediante la determinación de las moléculas que estén involucradas en estas

patologías, para clasificar los grupos encontrados y así orientar el defecto

molecular; apoyar el diagnóstico clínico y para ofrecer un tratamiento mas

especifico a cada paciente; finalmente dar un consejo genético a las familias

afectadas.

HIPÓTESIS:

Los pacientes mexicanos con inmunodeficiencias humorales del tipo CVID e hiper-

IgM presentan defectos en alguna de las moléculas de coestimulación TACI,

ICOS, CD40 y CD154 ó en algunas de las enzimas como AID ó UNG.

21

OBJETIVO GENERAL:

Determinar los posibles defectos moleculares que expliquen el fenotipo de CVID ó

hiper-IgM en pacientes mexicanos.

OBJETIVOS PARTICULARES:

Determinar las poblaciones de leucocitos (CD45), linfocitos B (CD19),

linfocitos T (CD3, CD4, CD8), células NK (CD16+56) y monocitos (CD14),

por citometría de flujo en pacientes y en testigos sanos.

Determinar las sub-poblaciones de células B en sangre periférica: célula B

madura (CD22 +, CD27 -) y célula B de memoria (CD22 +, CD27 +), por

citometría de flujo en pacientes y testigos sanos.

Determinar la expresión de ICOS, TACI, CD154, CD40 por citometría de

flujo en pacientes y testigos sanos.

Determinar el tipo de mutación en el gen CD154, en los pacientes que no

expresen la proteína CD154.

Clasificar a los pacientes de acuerdo a los resultados de citometría e

historial clínico, para confirmar el diagnóstico y determinar el tipo de

mutación presente.

22

II. MATERIAL Y MÉTODOS:

Tipo de investigación

Estudio prospectivo, descriptivo, transversal, cuasi experimental de una serie de

pacientes pediátricos con diagnóstico de CVID e hiper-IgM.

Criterios de inclusión

Los pacientes que se incluyeron en este estudio, fueron individuos de

menos de 16 años previamente diagnosticados con la enfermedad de CVID

o hiper-IgM, según los criterios establecidos para Inmunodeficiencias

Primarias (Conley y col., 1999), que asisten para su evaluación al Instituto

Nacional de Pediatría, SSa; ó individuos de edad pediátrica o adultos que

asisten al Centro Médico Nacional “La Raza” del IMSS.

Los padres y/o tutores o el paciente mismo que acepten mediante la firma

de consentimiento informado participar en el estudio, conforme al comité de

ética de 1975 de Helsinki.

Criterios de exclusión

Pacientes en los que se detecten causas secundarias de

hipogammaglobulinemia (ver tabla 1 en Anexo).

Pacientes que reciban fármacos inmunosupresores

Criterios de eliminación

Pacientes en quienes no se puedan obtener las muestras necesarias para

realizar el estudio ó que, decidan retirarse del estudio.

Obtención de de muestras

Se obtuvieron muestras de 20 mL de sangre periférica de los pacientes y

controles sanos, utilizando para ello el sistema Vacutainer® con tubos

heparinizados (Becton Dickison, San José, CA) (BD). De estas muestras se utilizó

23

1mL para la determinación de las poblaciones leucocitarias. El resto de la muestra

se utilizó para la obtención de células mononucleares (PBMC’s) mediante

centrifugación en Histopaque (Sigma, Chemical Co., St Louis, MO).

Análisis de poblaciones celulares en sangre periférica

Se obtuvo una muestra de sangre total de los pacientes y testigos sanos para

realizar una tipificación por citometría de flujo. Se realizaron tinciones para

determinar las proporciones de las diferentes poblaciones celulares, para lo cual

se emplearon 30 l de sangre periférica sin activar y se incubaron durante 20

minutos con 5 µl de las siguientes mezcla de anticuerpo monoclonales (mAB):

antiCD45 FITC/antiCD14 PE(BD); antiCD3 FITC/antiCD19 PE/antiCD45

PerCP(BD); antiCD4 FITC/antiCD8 PE/antiCD3 PerCP(BD); antiCD3

FITC/antiCD16+56 PE/antiCD45 PerCP(BD); control de isotipo antiCD45 PerCP/ 1

FITC/ 1 PE (BD). Las muestras fueron incubadas 20 minutos a temperatura

ambiente en la oscuridad. Después de la incubación, los eritrocitos fueron lisados

con 500 µl de solución de lisis FACS (BD), se incubaron durante 10 minutos más

y posteriormente se lavaron con PBA (PBS con 1% de albúmina sérica humana).

Las células se fijaron con PBS conteniendo 1% de formaldehído. La adquisición y

análisis se describe más adelante.

Análisis de expresión de las sub-poblaciones de células b en sangre

periférica

La expresión de sub-poblaciones de células B se determinó en PBMC’s por

citometría de flujo. Las PBMC’s fueron teñidas con una mezcla de anti-CD19 APC

(BD); anti-CD22 PE-Cy5 (BD) y CD27 PE (BD); se incubaron por 20 minutos a

temperatura ambiente y en oscuridad. Las muestras fueron lavadas con PBA y

fijadas con PBS conteniendo 1% de formalina. La adquisición y análisis se

describe más adelante.

24

Determinación de la expresión de CD40

Para determinar la expresión de CD40, las PBMC’s se incubaron con una los

siguientes anticuerpos: anti-CD40 PE (BD) y anti-CD19 APC (BD) (para analizar la

expresión en células B) y anti-CD40 PE (BD) y anti-CD14 PerCP (BD) (para

analizar la expresión en monocitos). Las células se incubaron 20 minutos a

temperatura ambiente en la oscuridad. Después, fueron lavadas con PBA y fijadas

con PBS conteniendo 1% de formalina. El análisis se describe más adelante.

Determinación de la expresión de TACI

En resumen, las PBMC’s se incubaron con la mezcla de anti-TACI PE (BD) y anti-

CD22 PE-Cy5 (BD) durante 20 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad.

Después, las muestras fueron lavadas con PBA y fijadas con PBS conteniendo 1%

de formalina.

Determinación de la expresión de CD154

La expresión de CD154 se evaluó en células T activadas. Para la determinación

de CD154 las PBMC’s fueron cultivadas por 5 horas a una densidad de 2 X 106

células bajo condiciones estándar (37ºC, 5% CO2) en medio RPMI 1640 (GIBCO–

BRL, Gaithersburg, MO) suplementado con 10% SFB (PAA; Australia), 1mM L-

glutamina, penicilina en 100 unidades/ml y estreptomicina a 10 g/ml (GIBCO) en

presencia de 10 ng/ml de phorbol 12-myristrato 13-acetato (PMA, GIBCO –BRL,

Gaithersburg, MO) y de 1 g/ml de ionomicina (Sigma, St Louis MO). Después,

los PBMC’s se tiñeron con una mezcla de anti-CD3 PerCP(BD), anti-CD154 PE

(BD) y anti-CD69 FITC (BD), se incubaron 20 minutos a temperatura ambiente en

la oscuridad. Posteriormente, las muestras fueron lavadas con PBA y fijadas con

PBS conteniendo 1% de formalina. El análisis se describe más adelante.

Determinación de la expresión de ICOS

Para ICOS, las PBMC’s fueron incubadas toda la noche bajo las condiciones de

activación descritas en la sección anterior. Posteriormente, las PBMC’s fueron

teñidas con una mezcla de anti-CD3 PerCP (BD), anti-ICOS PE (BD) y anti-CD69

25

FITC (BD). Las células se incubaron 20 minutos a temperatura ambiente en la

oscuridad. Finalmente, las muestras fueron lavadas con PBA y fijadas con PBS

conteniendo 1% de formalina. Tanto para la tinción de CD154 como de ICOS se

usaron como testigos negativos células sin activar y para evaluar la activación se

analizó la expresión de CD69. El análisis se describe más adelante.

Adquisición y análisis

Se adquirieron 10,000 eventos para el análisis de las poblaciones leucocitarias en

sangre periférica y 100,000 eventos para los análisis de las moléculas

involucradas en el fenotipo CVID en las PMBC’s. Las muestras fueron leídas en el

FACScalibur® (BD). Los datos se analizaron con el software Flow.Jo 7.2.4 (Tree

Star. Inc. 1997-2009).

TECNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR

Extracción de RNA

La extracción de RNA se realizó a partir de 3x106 células PBMC's, que se lisaron

con Trizol, se adicionaron Cloroformo- alcohol isoamílico, recuperando la fase

acuosa la cual se precipitó con isopropanol. La pastilla de RNA se lavo con etanol

al 75%. La concentración del RNA se llevo acabo determinando, por

espectrofotometría, la absorbancia a 260 y a 280 nm.

Síntesis de cDNA

La síntesis de DNA complementario se realizó utilizando 1 l RNA total en una

mezcla de reacción con un volumen final de 20 L:

Oligo (dT) 1 L

dNTPs (10mM) 1 lL

RNA 1 L

Agua inyectable c.b.p. 13 L

26

Los tubos de reacción se colocaron en el termociclador a 72º C durante 5

minutos y posteriormente se ponen en hielo para permitir el alineamiento del oligo

(dT) con el molde, posteriormente se adiciono los siguientes reactivos:

Regulador de reacción 5x 4 L

DTT 0.1M 2 L

Las muestras se introdujeron nuevamente al termociclador a 42ºC durante 2

minutos para adicionar finalmente 200 unidades de transcriptasa reversa. La

síntesis del cDNA se llevó a cabo incubando las muestras durante 50 minutos a

42ºC, y a 72ºC por 15 minutos más.

Amplificación de CD40L por reacción en cadena de la polimerasa

La amplificación de CD40L se llevo a cabo a partir de las muestras de cDNA, para

esto, empleamos la siguiente mezcla de reacción con un volumen final de 50 µL

(Invitrogen):

Regulador de reacción 10x 5 µL

MgCl2 50mM 1.5 µL

dNTPs 10mM 1 µL

Iniciador 5’ 10pmoles/µl 3 µL

Iniciador 3’ 10pmoles/µl 3 µL

Taq DNA polimerasa 5U/µl 0.4 µL

cDNA molde 2-4 µL

Agua inyectable c.b.p. 50 µL

Las condiciones de la reacción fueron las siguientes:

1 ciclo 95ºC 5 minutos

35 ciclos 95ºC 30 segundos

Tm 30 segundos

72ºC 1 minuto por cada 1000pb

1 Ciclo 72ºC 8 minutos

Iniciadores empleados para amplificar CD40L (Lee W y col. 2005).

27

Sentido Antisentido Tm (oC)

GCCAGAAGATACCATTTC CCGCTGTGCTGTATTATGA 50

Electroforesis de los productos de PCR en geles de agarosa

Los productos de PCR se prepararon con regulador de carga para DNA y se

utilizaron 5 µL de cada muestra para correr electroforesis en geles de agarosa al

1% preparados en TAE 1x (Tris-ácido acético-EDTA) y conteniendo de 0.1 a 0.5

µg/mL de bromuro de etidio. La electroforesis se realizó a 100V durante 45

minutos, para finalmente visualizar los productos amplificados en un

transiluminador de luz ultravioleta (Kodak). El tamaño de los amplificados

obtenidos se determinaron por medio del uso de un marcador de DNA

(Fermentas).

Clonación de productos de PCR

Reacción de ligación

Una vez que se determinó por medio de la electroforesis si los productos de PCR

obtenidos tuvieron una longitud anormal, se procedió a clonarlos para su posterior

secuenciación.

Para esto, los productos amplificados se ligaron con el vector pCR2.1 de acuerdo

al protocolo descrito para el kit de clonación TOPO TA® Cloning (Invitrogen,

Carlsbad CA) en las siguientes condiciones:

Producto de PCR 0.5 a 4 µg

Solución de salina (NaCl) 1 µL


TOPO vector 1 µL

Las reacciones de ligación se incubaron durante 5 minutos a temperatura

ambiente.

28

Transformación de los productos de ligación en Escherichia coli DH5

La transformación se realizó utilizando 5 µL del producto de ligación con 100-200

µl de bacterias competentes, se incubó por 30 minutos a 4ºC, seguido por un

choque térmico a 42ºC por dos minutos y a 4ºC por un minuto más. Las bacterias

transformadas se cultivaron por una hora en 1 mL de medio SOC a 37ºC en

agitación, para finalmente centrifugarlas a 1000g por 5 minutos y resembrar por

espatulado el botón bacteriano resuspendido en 100 µL de medio LB en una placa

de agar LB conteniendo 150 µg/mL de ampicilina y preparada recientemente con

40 µl de IPTG 100mM y X-Gal 40 mg/mL.

Las placas se incubaron a 37ºC durante toda la noche y posteriormente se llevo

acabo la selección de colonias positivas para el producto de PCR clonado.

Selección de colonias positivas por PCR

Se realizó una selección de colonias conteniendo el inserto de interés por PCR.

Para esto, se seleccionaron un promedio de 10 colonias blancas por placa, y se

resembraron en una placa de LB-ampicilina, al mismo tiempo, se resuspendieron

en 6 µl de agua inyectable con la cual se monto una reacción de PCR utilizando

los iniciadores M13 (ver apéndice) que reconocen una secuencia del vector

pCR2.1. La reacción de PCR se llevo acabo bajo las siguientes condiciones:

Regulador de reacción 10x 2.5 µL

MgCl2 50mM 0.75 µL

dNTPs 10mM 0.5 µL

Iniciador 5’ 10pmoles/µl 1.5 µL

Iniciador 3’ 10pmoles/µl 1.5 µL

Taq DNA polimerasa 5U/µl 0.2 µL

Suspensión bacteriana 6 µL


Las condiciones del PCR fueron las siguientes:

1 ciclo 95ºC 5 minutos

35 ciclos 95ºC 30 segundos

29

50ºC 30 segundos

72ºC 1 minuto por cada 1000pb

1 Ciclo 72ºC 8 minutos

Las colonias positivas fueron aquellas que dieron un producto de PCR del tamaño

del inserto de 1000 pb de bases que corresponden a la secuencia del vector.

Purificación de plásmidos a partir de las colonias positivas

Las colonias seleccionadas se resembraron en 5 mL de medio LB + ampicilina a

37ºC durante toda la noche. La purificación del vector bacteriano se realizó

siguiendo el protocolo establecido para el kit QIAprep Miniprep (Quiagen).

Secuenciación y análisis

La secuenciación se realizó a partir de los vectores purificados y empleando tanto

los iniciadores M13 sentido y antisentido. La secuenciación se realizó en la unidad

de secuenciación del Instituto de Fisiología Celular, UNAM en un secuenciador

automatizado (ABI PRISM 310 Genetic analyzer, Perkin-Elmer Applied

Biosystems, Foster City CA). Los resultados de la secuencia se analizaron

empleando el programa Vector NTI (Invitrogen), comparando con las secuencias

reportadas en la página electrónica del GeneBank con número de acceso NM

000074. El uso de este programa nos permite predecir el tipo de cambio que se

origina tanto a nivel de DNA como a nivel de proteína.

30

III. RESULTADOS

1.- Características clínicas de los 25 pacientes con Inmunodeficiencia

Humoral

Los pacientes que se estudiaron en este trabajo fueron compatibles con un

fenotipo de CVID ó hiper-IgM. Los pacientes analizados fueron 15 masculinos y 10

femeninos. La media de edad fue de 15 años en hombres y 19 años en mujeres.

El intervalo transcurrido desde la aparición de los síntomas hasta su diagnóstico

fue tardío, el tiempo promedio entre el inicio de síntomas y el diagnóstico fue de

6.6 años (tabla 3). Todos los pacientes presentaron hipogammaglobulinemia

principalmente de IgG e IgA; la concentración de IgM fue variable, casi todos los

pacientes expresaron células B excepto los pacientes 3, 11, 21 y 23, como se

muestra en la tabla 2. Todos los pacientes presentaron infecciones recurrentes

comunes para inmunodeficiencias primarias humorales. El síntoma más común

fue la neumonía, diarrea crónica y sinusitis como se muestra en la tabla 3. Los

agentes infecciosos mas comunes en estos 25 pacientes fueron el Streptococcus

pneumoniae y el Haemophilus influenzae (datos no mostrados). Revisando los

antecedentes familiares destaca el paciente 6, quien tuvo un hermano que murió a

causa de un linfoma de Hodgkin, el paciente 8 que tiene 3 hermanos con CVID, un

hijo con déficit de IgA y patología tiroidea. Se sospecha consanguinidad en la

familia del paciente 15; los pacientes 16 y 17 son hermanos y ambos presentan

CVID. La madre del paciente 20, presenta esferocitosis; el paciente 21 tiene el

antecedente de un hermano finado por hepatitis fulminante y agamaglobulinemia;

y por último los pacientes 16, 19 y 22 fueron los que tuvieron un inicio de síntomas

a muy temprana edad (meses) con complicaciones clínicas graves y

microorganismos pocos comunes como: Pseudomona aeruginosa, Serratia

marscescens, Klebsiella pneumonie (paciente 16); Cándida albicans (paciente 19);

y Pneumocitis carinii (paciente 22). El paciente 20 a muy temprana edad se le

realizó el diagnóstico por ser hermano menor del paciente 19. Seis pacientes

reportan reacciones alérgicas, destacando la hipersensibilidad a antibióticos beta-

31

lactámicos, de uso común en infecciones secundarias a las inmunodeficiencias

humorales

Tabla 2. Valor absoluto de linfocitos B y concentración sérica de inmunoglobulinas

en los 25 pacientes con inmunodeficiencia humoral.

32

Tabla 3. Características y manifestaciones clínicas en los 25 pacientes con inmunodeficiencias humorales.

33

2.- Análisis de las poblaciones de leucocitos.

Se determinó la proporción de las poblaciones celulares en sangre periférica, tanto

en los pacientes como en testigos sanos, empleando una doble tinción con anti-

CD45-FITC y anti-CD14-PE, como se muestra en la figura 4.

TESTIGO PACIENTE

Figura 4. Análisis de las poblaciones celulares en sangre periférica. La mezcla de anticuerpos empleada fue: anti-CD45-FITC/CD14-PE. Se muestra las gráficas de contorno CD45-FITC vs CD14. Tomada de la población de leucocitos, (R2): población de

polimorfonucleares (PMN); (R3): población de monocitos; y (R1): población de linfocitos.

Con base en los resultados obtenidos en las gráficas de la figura 4 y con los datos

de la cantidad de leucocitos por mm3 en sangre se pudo calcular con la cámara de

Newbauer el número absoluto de cada una de las poblaciones leucocitarias de

sangre periférica por medio de la siguiente fórmula:

34

A los valores absolutos de leucocitos, PMN, linfocitos y monocitos de los testigos

sanos de este estudio se les calculó la media y desviación estándar por rango de

edad como se muestra en las tablas 4, 5, 6 y 7:

Tabla 4. Valores absolutos de leucocitos totales, neutrófilos, linfocitos y monocitos de 17 testigos sanos de 1 a 5 años de edad, representado por la media, la desviación estándar

y los límites menor y mayor.

Tabla 5. Valores absolutos de leucocitos totales, neutrófilos, linfocitos y monocitos de 17 testigos de 6 a 10 años de edad, representados por la media, la desviación estándar y los

límites menor y mayor.

Leucocitos

Totales Neutrófilos Linfocitos Monocitos

MEDIA 6929 3561 2778 493

DS 2055 1303 951 146

LÍMITE MENOR 4874 2258 1827 348

LÍMITE MAYOR 8985 4864 3730 639

Leucocitos Totales Neutrófilos Linfocitos Monocitos

MEDIA 8171 4071 3203 524

DS 2108 1219 1077 171

LÍMITE MENOR 6063 2852 2126 353

LÍMITE MAYOR 10278 5290 4280 695

35

Tabla 6. Valores absolutos de leucocitos totales, neutrófilos, linfocitos y monocitos de 30 testigos sanos de 11 a 17 años de edad, representados por la media, la desviación

estándar y los límites menor y mayor.

Tabla 7. Valores absolutos de leucocitos totales, neutrófilos, linfocitos y monocitos de 19 testigos sanos de edad adulta, representados por la media, la desviación estándar y los

límites menor y mayor.

Leucocitos


MEDIA 7089 4231 2234 437

DS 1326 1066 539 138

LÍMITE MENOR 5763 3165 1695 299

LÍMITE MAYOR 8416 5297 2773 574

Leucocitos


MEDIA 6603 3431 2446 483

DS 1239 955 572 120

LÍMITE MENOR 7843 4385 3018 603

LÍMITE MAYOR 5364 2476 1874 363

36

Tabla 8. Datos de los valores absolutos de leucocitos, neutrófilos, linfocitos y monocitos de los 25 pacientes:

37

Figura 5. Análisis, en valores absolutos de las poblaciones de leucocitos, neutrófilos, linfocitos y monocitos de los testigos y pacientes pareados por edad. Con los datos de leucocitos totales, neutrófilos, linfocitos y monocitos en mm3 de los testigos sanos (n=76) se dividieron en intervalos de edad; 1 a 5 años (n=17), 6 a 10 años (n=17), 11 a 17 años (n=30) y adultos (n=19) y se calculó el promedio y su desviación estándar. Los valores absolutos de los pacientes, divididos por edad, comparados con X±DS de los testigos sanos en su edad correspondiente. El cuadro negro representa la media de los testigos sanos, las líneas verticales representan su desviación estándar.

38

3.- Análisis de las poblaciones de linfocitos T, linfocitos B y células NK y

sub-poblaciones de células T

Para el análisis se llevaron a cabo tinciones triples, por un lado se realizaron

tinciones con los anticuerpos anti-CD3-FITC/anti-CD19-PE/anti-CD45-PerCP y por

otro lado se emplearon los anticuerpos anti-CD3-FITC/anti-CD16+56-PE/anti-

CD45-PerCP como se muestra en la figura 6. La proporción de las poblaciones de

células B, T o NK se hizo dentro de una región de células CD45+, a partir de la

cual se calculó la proporción de células B, T y NK.

Figura 6. Análisis de las poblaciones de células T, B y NK. El análisis de cada población se realizó sobre una región de células CD45+, a partir de la cual se muestra la proporción de las células B (CD19), NK (CD16+56) y T (CD3).

PACIENTE TESTIGO

39

Para el análisis de las sub-poblaciones de células T se llevó a cabo una tinción

triple con los anticuerpos anti-CD4-FITC/anti-CD8-PE/anti-CD3-PerCP. Las

proporciones de células CD4+ y CD8+ se determinaron dentro de una región de

células CD3+, a partir de la cual se calcularon las proporciones de células TCD4+

y células T CD8+, como se muestra en la figura 7.

Figura 7. Porcentaje de células CD8+ y CD4+ en las muestras de los pacientes y de los testigos. Las gráficas que se muestran se realizaron capturando las células dentro en una región CD3+.

Los datos de los linfocitos CD3, CD19+, CD16+56, CD4+ y CD8+ se muestran en

la tabla 9, 10, 11,12 y 13:

Tabla 9. Valores absoluto de células T CD3, sub-poblaciones de células T, células B CD19+ y células NK CD16+56+ en 17 testigos sanos de 1 a 5 años, representado por media, desviación estándar y los límites

menor y mayor.

CD3 CD4 CD8 CD19 CD16+56

MEDIA 2139 1161 799 466 561

DS 694 483 350 175 370

LÍMITE MENOR 1445 679 449 291 190

LÍMITE MAYOR 2833 1644 1149 640 931

PACIENTE TESTIGO

40

Tabla 10. Valores absolutos de células T CD3+, sub-poblaciones de células T, células B CD19 + y células NK CD16+56+ en 17 testigos sanos de 6 a 10 años, representado por la

media, la desviación estándar y los límites menor y mayor.


MEDIA 1884 1035 713 340 394

DS 510 394 235 180 209

LÍMITE MENOR 1374 641 478 159 186

LÍMITE MAYOR 2394 1429 949 520 603

Tabla 11. Valores absolutos de células T CD3, sub-poblaciones de células T, células B CD19* y células NK CD16+56+ en 30 testigos sanos de 11 a 17 años, representado por la

media, la desviación estándar y los límites menor y mayor. .


MEDIA 1682 879 695 294 415

DS 507 233 321 130 233

LÍMITE MENOR 1175 646 374 163 182

LÍMITE MAYOR 2190 1111 1016 424 648

Tabla 12. Valores absolutos de células T CD3+, sub-poblaciones de células T, células B CD19+ y células NK CD16+56+ en 19 testigos sanos de edad adulta, representado por la

media, la desviación estándar y los límites menor y mayor.


MEDIA 1602 911 582 221 449

DS 507 319 245 108 167

LÍMITE MENOR 1095 592 337 113 282

LÍMITE MAYOR 2110 1230 827 329 615

41

Tabla 13. Datos de los valores absolutos de células T, sub-poblaciones de células T, células B, células NK de los 25 pacientes.

42

Figura 8. Valores absolutos de las poblaciones de células T CD3+, células B CD19+, células NK CD16+56, células T CD4+ y células T CD8+ de los testigos sanos y pacientes pareados por edad. Con los datos de las células T CD3+, las células B CD19+, las células NK CD16+56, las células T CD4+ y las células T CD8+ en mm3 de los testigos sanos (n=76) se dividieron en intervalos de edad; 1 a 5 años (n=20), 6 a 10 años (n=21), 11 a 17 años (n=26) y adultos (n=10) y se calculó el promedio y su desviación estándar. Los valores absolutos de los pacientes, divididos por edad, comparados con X±DS de los testigos sanos en su edad correspondiente. El cuadro negro representa la media de los testigos sanos, las líneas verticales representan sus

desviaciones estándar.

43

Los hallazgos mostraron que la población de pacientes adultos tuvo una

importante disminución de sus poblaciones leucocitarias, pero principalmente de

las células TCD4+ y de las células B (fig.5 y 8). Los pacientes que se encontraron

en el rango de edad entre 6 y 10 años y 11 a 17 años tuvieron un comportamiento

parecido, donde los hallazgos que se encontraron es que ambos mostraron una

disminución importante de células B y los pacientes menores de 5 años tuvieron

un comportamiento irregular y en la mayoría de los casos sus concentraciones

leucocitarias se encontraron por arriba de los valores de referencia para su edad.

44

4.- Determinación de las sub-poblaciones de células B

Se determinaron las sub-poblaciones de células B, en la población de células B

CD19+ se analizó la expresión de células B CD22+ y CD27+ que corresponde a

la población de memoria como se muestra en la fig. 9. Los datos del porcentaje

de expresión de los 25 pacientes y 15 testigos sanos se describen en las tablas

14 y 15 respectivamente. El 40% de los pacientes (n=25) tuvieron menos de 20%

de células B de memoria comparado con los testigos sanos (n=15), estos últimos

ese encontraron entre 30% y 60% con una media de 40%.

Figura 9. Determinación de las sub-poblaciones de células B. En la población de células B CD19+, se determinó el porcentaje de células B de memoria (CD22+, CD27+) y células B maduras (CD22+, CD27-)

45

Tabla 14. Porcentaje de células B CD19+, CD22+, CD27+ en 25 pacientes.

46

Tabla 15 Porcentaje de expresión de células B CD19+, CD22+, CD27+ en 15 testigos sanos

47

Figura 10. Porcentaje de expresión de células B CD22+, CD27+. Los porcentajes obtenidos de células B CD22+, CD27+ tanto de pacientes (n= 25) como de testigos sanos (n=15) fueron comparados. La línea negra representa la media correspondiente.

48

5.- Clasificación de los 21 pacientes con CVID de acuerdo a su porcentaje de

células B de memoria

Con los datos de la figura 10 se clasificó a los pacientes con CVID (n=21) de

acuerdo a sus células B de memoria CD27+, CD22+. Pacientes con menos de

20% de células B de memoria se le asignó como grupo 1(n=8); pacientes con

más de 20% células B de memoria se le asignó como Grupo 2 (n=9); pacientes

con menos de 1% de células B se les asignó como grupo 3 (n=4). Estos grupos se

correlacionaron con los hallazgos del expediente clínico como se muestra en la

tabla 16.

Tabla 16. Clasificación de los 21 pacientes con CVID de acuerdo al porcentaje de células B de memoria y sus características cínicas.

49

6.- Análisis de la expresión de CD154

La expresión de CD154 y CD69 (control de activación) se determinó en células T

activadas CD3+, como se muestra en la figura 11. Se analizaron 17 pacientes y 7

testigos sanos. Los resultados en porcentaje de los pacientes y testigos sanos se

describen en las tablas 17 y 18 respectivamente. Los hallazgos del análisis se

muestran en la figura 12. Los pacientes 16, 19, 20 y 22 mostraron una diminución

drástica de la proteína CD154, por lo que fueron analizadas para detectar las

mutaciones en el gen de CD154.

Figura 11. Histogramas que muestran la expresión de CD154. La expresión de CD154 se determinó en células T activadas CD3+ usando CD69 como control de activación.

50

Tabla 17. Porcentaje de expresión de CD154 en 17 pacientes con inmunodeficiencias

humorales.

Tabla 18 Porcentaje de expresión de CD154 en 7 testigos sanos

51

Figura 12. Análisis de expresión de la proteína CD154 en pacientes y testigos sanos. El porcentaje de expresión de CD154 de los pacientes (n= 17) y testigos sanos (n= 7) fue comparada, la línea negra representa la media correspondiente.

52

7.- Análisis de la expresión de CD40

La expresión de CD40 se determinó en las células B (CD19+) y en los monocitos

(CD14+), como se muestra en la figura 13. Se analizó la expresión de CD40 en

células B en 18 pacientes y 8 testigos sanos; y en los monocitos en 14 pacientes

y 5 testigos sanos como se describe en las tablas 19, 20, 21 y 22. Los hallazgos

del análisis se muestran en la figura.14. El paciente 11 expresó de manera muy

disminuida CD40 en monocitos, y en las células B no se determinó ya que tuvo

una cantidad muy disminuida de estas células.

Figura 13. Histogramas que muestran la expresión de CD40. La expresión de CD40 se determinó en células B (CD19+) y en monocitos (CD14+).

53

Tabla 19. Porcentaje de células B que expresan CD40 en 18 pacientes con inmunodeficiencia humoral.

Tabla 20. Porcentaje de células B que expresan CD40 en 8 testigos sanos

54

Tabla 21. Porcentaje de monocitos que expresan CD40 en 14 pacientes con inmunodeficiencia humoral.

Tabla 22 Porcentaje de monocitos que expresan CD40 en 6 testigos sanos.

55

Figura 14. Análisis de la expresión de CD40 en células B y monocitos de pacientes y testigos sanos. La expresión de CD40 se determino en células B (CD19+) y monocitos (CD14+). Se compararon las poblaciones de los pacientes CD19+ (n=18) y CD14+ (n=14) con las de los testigos sanos CD19+ (n= 8) y CD14+ (n=6). La línea negra representa la media correspondiente.

56

8.- Análisis de la expresión de ICOS

La expresión de ICOS y CD69 (control de activación) se determinó en células T

CD3+ activadas como se muestra en la figura 15. Se analizaron 17 pacientes y 7

testigos sanos. Los resultados de los pacientes y controles sanos se describen en

la tabla 23 y 24 respectivamente. Los hallazgos del análisis se muestran en la

figura 16. Los pacientes 21 y 25 expresan un porcentaje muy bajo de ICOS.

Figura 15. Histogramas que muestran la expresión de ICOS. La expresión de ICOS se determinó en células T CD3+activadas usando CD69 como control de activación.

57

Tabla 23. Porcentaje de células T que expresan ICOS en 18 pacientes con inmunodeficiencia humoral

Tabla 24. Porcentaje de células T que expresan ICOS en 5 testigos sanos

58

Figura 16. Análisis de la expresión de ICOS en células T de pacientes y testigos sanos. El porcentaje de expresión de ICOS de los pacientes (n= 18) y testigos sanos (n= 5) fue comparada, la línea negra representa la media correspondiente.

59

9.- Análisis de la expresión de TACI en células B maduras

En las células B CD22+ se analizó la expresión de TACI, como se muestra en la

figura 17. Se analizaron 17 pacientes y 6 testigos sanos. Los resultados en

porcentaje de los pacientes y controles se describen en la tabla 25 y 26

respectivamente. Los hallazgos del análisis de muestran en la figura 18. El

promedio del porcentaje de expresión en los testigos (n= 5) fue de 36% y el

promedio de los pacientes (n=17) fue de 31.

Figura 17. Histogramas que muestran la expresión de TACI. En las células B CD22+ se analizó la expresión de TACI.

60

Tabla 25. Porcentaje de células B maduras que expresan TACI en 17 pacientes con inmunodeficiencia humoral.

Tabla 26. Porcentaje de células B maduras que expresan TACI en 6 testigos sanos

61

Figura 18. Análisis de expresión de TACI en células B maduras de pacientes y testigos sanos. En las células B CD22+ se analizó la expresión de TACI, el porcentaje de expresión en los testigos sanos (n= 6) y el de los pacientes (n= 17) se comparó. La línea negra representa la media.

PACIENTES TESTIGOS

62

10. Análisis de las mutaciones en CD154 en los pacientes 16, 19, 20 y 22

La proteína CD154 es una molécula involucrada con los casos de Hiper-IgM tipo 1.

El análisis de mutaciones se realizó analizando el mRNA de CD154; para esto, se

obtuvo mRNA a partir de PBMC’s de sangre periférica y se amplificó la secuencia

correspondiente a CD154 utilizando los siguientes iniciadores:

Sentido Antisentido Tm (oC)

GCCAGAAGATACCATTTC CCGCTGTGCTGTATTATGA 50

Los productos amplificados se corrieron en geles de agarosa y se revelaron con

bromuro de etidio, de acuerdo a lo descrito en la sección de materiales y métodos.

Como se aprecia en la figura 19, en todos los pacientes se les detectaron mRNA

del tamaño esperado 1000pb. Todos estos transcritos se clonaron en el vector

TOPO TA® para su secuenciación automatizada, con el objetivo de determinar el

tipo de mutación (figura 20).

De los 15 pacientes a los cuales se les determinó la expresión de CD154 por

citometría, únicamente los pacientes 16, 19, 20 y 22 no expresaron CD154 y se

procedió a la caracterización de posibles mutaciones. El paciente 16 presentó un

codón de paro prematuro, originado por el cambio de la C730 por una T, lo cual

origina una proteína que carece de los últimos 42 aminoácidos presentes en su

dominio TNFH (Dominio de homología a TNF); además, presenta una mutación

puntual que se localiza en el dominio extracelular y que a nivel de proteína

produce el cambio de la K52 por una arginina. La mutación C370T, que da origen

al codón de paro prematuro, se encuentra reportada en la base datos para CD154

(Lee W y col. 2005), no así la mutación K52R. El paciente 19 presenta tres

mutaciones puntuales; la primera mutación se localiza en el dominio extracelular y

origina el cambio de la K106 por una metionina, las mutaciones A123E y F177C se

localizan en el dominio TNFH. Solo la mutación A123E ha sido reportada como

causal de síndrome de Hiper-IgM (Prasad M y col. 2005). El paciente 20, es

hermano del paciente 19, pero él solo presenta una mutación A123E, por lo que

ésta puede ser la causa de la inmunodeficiencia. El paciente 22 presenta una sola

63

mutación puntual en el dominio TNFH, en esta mutación se sustituye la histidina

125 por una tirosina. Esta mutación ya ha sido reportada en pacientes con Hiper-

IgM; sin embargo, es la primera vez que se describe la sustitución de la histidina

por tirosina. Los hallazgos encontrados se describen en la tabla 27.

a)

b)

c)

Figura 19. Resultados de la amplificación por PCR de CD154 en los pacientes a) P16, b) P20, 1 c) P19 y P22.

64

Figura 20. Selección de clonas positivas para el gen CD154 en el pacientes 19. El

cuadro negro muestra las clonas seleccionadas para la secuenciación.

65

a)

b)

Figura 21. Mutaciones del gen CD154 en el paciente 16. a) Análisis del cDNA y b) análisis “in silico” para determinar su efecto en la proteína. Las flechas rojas muestran los cambios que existieron con el gen de C154 que se usó como patrón.

66

a)

b)

Figura 22. Mutaciones del gen CD154 en el paciente 19. a) Análisis del cDNA y b) análisis “in silico” para determinar su efecto en la proteína. Los cuadros negros muestran los cambios que existieron con el gen de C154 que se usó como patrón.

67

a)

b)

Figura 23. Mutaciones del gen CD154 en el paciente 22. a) Análisis del cDNA y b) análisis “in silico” para determinar su efecto en la proteína. Los cuadros negros muestran los cambios que existieron con el gen de C154 que se usó como patrón.

68

a)

Figura 24. Mutaciones del gen CD154 en los pacientes 19 y 20 a) Análisis del cDNA. El cuadro negro muestra el cambio que existió con el gen de C154 que se usó como patrón. Tabla 27. Resumen de las mutaciones encontradas en el gen de CD154 de los pacientes con Síndrome de hiper-IgM (Tipo 1).

Pacientes Edad (años)

Sexo Mutación Dominio afectado

Cambio (Proteína)

Referencias

16 2 M cA227 G cC730 T “Codón de paro prematuro”

Extracel. TNFH

K52R Q220X

NR Lee y col.. 2005

19 6 M cA317 T cC368 A cT530 G

Extracel. TNFH TNFH

K106M A123E F177C

NR Prasad y.col.,2005 NR

20 8 m M cC368 A TNFH A123E Prasad y col., 2005

22 5 M cC373 T TNFH H125Y NR

69

IV. DISCUSIÓN:

En el estudio de las IDP’s, es muy importante determinar las poblaciones

leucocitarias (CD3, CD4, CD8, CD19 y CD16+56) por que con estas pruebas se

puede estudiar la presencia y número de células implicadas en la respuesta

inmunitaria. En este trabajo se determinaron las poblaciones leucocitarias a 83

testigos sanos que se dividieron por los rangos de edad 1 a 5 años (n=17); 6 a 10

años (n=17); 11 a 17 años (n=30) y adultos (n=30). A estas determinaciones se les

calculó la media y desviación estándar para obtener intervalos de confianza con

los cuales comparamos a los pacientes con inmunodeficiencias

predominantemente de anticuerpos, como se muestran en las tablas 4 a la 13.

Después del análisis de las poblaciones leucocitarias en los 25 pacientes que se

muestran en la figura 7 y 8, llamó la atención que el grupo de edad adulta

presentó concentraciones bajas en sus leucocitos totales encontrándose la

mayoría por debajo de los valores de referencia; mientras que en los otros grupos

de edad, entraron en los valores de referencia. En cuanto a los valores absolutos

de neutrófilos, los pacientes del grupo de edad de 1 a 5 años, la mayoría se

encontraron en el límite inferior y solo un paciente por debajo de los valores de

referencia, esto se explica por que en este grupo se encuentran todos los

pacientes con hiper-IgM y esta enfermedad se caracteriza por neutropenias

crónicas (Winkelstein y col., 2003). En los otros grupos de edad los valores

absolutos de neutrófilos de los pacientes se encontraron dentro de los valores de

referencia. Los linfocitos totales se encontraron altos en los pacientes de 1 a 5

años, irregulares en los pacientes de 11 a 17 años y bajos en los pacientes de 6 a

10 años y en los adultos. En los monocitos, el comportamiento de los pacientes en

los 4 grupos de edad fue parecido. En células T, sub-poblaciones de células T y

células NK solo los pacientes del grupo de edad adulto estuvieron por debajo del

valor de referencia, esto es debido a que estos pacientes mostraron leucopenias

importantes. En las células B los pacientes de edad adulta se encontraron todos

por debajo de los valores de referencia. Todavía no se explica si la disminución

de las células T ó de las células B es la causa de la inmunodeficiencia o es una

70

causa secundaria por las infecciones repetidas en el paciente inmunodeficiente. El

comportamiento heterogéneo en cuanto a las sub-poblaciones leucocitarias ha

sido previamente reportado en CVID, donde los diferentes defectos genéticos

pueden afectar a diferentes tipos de células (Vlková y col. 2005).

La inmunodeficiencias predominantemente de anticuerpos son un grupo de

desordenes que se caracterizan por la ausencia absoluta de todas las clases de

anticuerpos o la ausencia selectiva de una sola clase o subclase de anticuerpos.

En este grupo se incluyen dos de las más frecuentes IDP’s, el déficit selectivo de

IgA (DIgA) y la CVID. Solo un tercio de los pacientes de DIgA presenta

infecciones, por lo que la CVID pasa a ser la IDP sintomática más frecuente. . El

diagnóstico para esta IDP es difícil y es importante excluir causas secundarias de

hipogammaglobulinemia; también excluir otros defectos primarios como la hiper-

IgM, la agamaglobulinemia ligada a X y la autosómica recesiva; y el Síndrome

linfoproliferativo ligado a X. La característica principal de CVID es la

heterogeneidad; como la edad de presentación de los primeros síntomas y las

manifestaciones clínicas (Chapel, 1994).

En este trabajo se estudiaron 21 pacientes con CVID, estos fueron diagnosticados

clínicamente de acuerdo a los criterios para las IDP’s, publicados en 1999 por el

grupo Panamericano de IDP’s (PAGI) y la sociedad europea de IDP’s (ESID)

(Conley y col. 1999). Estos criterios incluyen las concentraciones séricas de IgG e

IgA de menos de dos desviaciones estándar por debajo de la media para edad la

concentración baja o normal de IgM (tabla 2). Para la CVID es importante la

exclusión de otras causas de hipoagammaglobulinemia (ver anexo). No a todos

los pacientes se les evaluaron la ausencia de isohemaglutininas y la pobre

respuesta a vacunas, por que en el hospital donde se les atiende, no cuentan con

este tipo de pruebas. La edad de inicio de síntomas fue variable en algunos en

edad pediátrica mientras que en otros en edad adulta (tabla 3). A pesar de los

esfuerzos para lograr un mejor entendimiento de las inmunodeficiencias primarias,

el intervalo transcurrido desde la aparición de los síntomas en los pacientes con

71

CVID hasta su diagnóstico es muy prolongado. El tiempo promedio entre el inicio

de infecciones recurrentes y el diagnóstico e inicio del tratamiento en nuestra serie

de pacientes fue en promedio de más de 6 años, como se ve en la tabla 3., lo que

representa un retraso importante que se ve reflejado en muchos casos, en la

presencia de complicaciones crónicas como bronquiectasias. El cuadro clínico de

este grupo de 21 pacientes es similar a lo reportado en otras series, con

infecciones bacterianas recurrentes de vías respiratorias altas y bajas como la

infección mas frecuente. En segundo lugar de frecuencia se encuentran las

infecciones gastrointestinales (tabla 3). A estos 21 pacientes se les realizaron

estudios de expresión de otras moléculas involucradas en CVID (TACI, CD19,

ICOS); también se les analizó la expresión de CD40 y CD154 para descartar

hiper-IgM tipo 3 y hiper-IgM tipo 1 respectivamente. Por último, el análisis de la

expresión de las sub-poblaciones de células B que se les realizó a los 21

pacientes sirvió para clasificarlos y poder correlacionar con su historial clínico y

dar una orientación del posible defecto en ellos.

La determinación de las sub-poblaciones de células B se realizó a los 25

pacientes, como se ve en la tabla 14y se comparó con 15 testigos sanos como se

muestra en la tabla 15. Los porcentajes obtenidos se compararon como se

muestra en la figura 9, donde se aprecia que un porcentaje alto de pacientes

tienen disminuida la población de células B de memoria CD22+, CD27+. De estos

sólo a los 21 pacientes con CVID se les correlacionó la expresión de sus células

B de memoria con los hallazgos clínicos como se ve en la tabla 16. Los cuatro

pacientes con Hiper-IgM no entraron en esté análisis por que el objetivo era

buscar una clasificación de los pacientes con CVID, según la expresión de sus

células B de memoria. De los 17 pacientes que mostraron una expresión mayor

del 1% de células B en sangre periférica, casi la mitad (47%) tenían menos del

20% de células B de memoria (grupo 1), mientras el otro 53% de los pacientes

expresaron más del 20% de estas células (grupo 2), incluyendo un paciente que

expresó 96% de células B con fenotipo de memoria. Las diferencias más

importantes en las manifestaciones clínicas, entre estos dos grupos, fue una

72

mayor incidencia de neuroinfecciones, tuberculosis e infección por CMV en el

grupo 2. Estos datos sugieren como posibles causas: defectos en las células B

(grupo 1) ó defectos tanto en células T como en células B (grupo 2). Los pacientes

con una población disminuida de células B de memoria podrían tener un defecto

en la diferenciación de estas, mientras que en los pacientes con un porcentaje de

células B de memoria igual o mayor al de los testigos sanos, los defectos podrían

encontrarse tanto en células T como en células B. Cuatro pacientes presentaron

menos de 1% de células B (grupo 3). A estos pacientes no se les realizó el análisis

de células B de memoria, por no contar con número suficientes de estás. Estos

pacientes pueden tener un defecto en el desarrollo de la células B en la médula

ósea y, por lo tanto, se les deben realizar estudios de las moléculas involucradas

en agammaglobulinemia LX (BTK) y autosómica recesiva (BLNK, Igα, Igβ, cadena

µ) (Tsukada y col. 1994) (Grunebaum 2001).

Desde el 2003 se han descrito mutaciones genéticas a las que se ha atribuido la

responsabilidad del fenotipo clínico de CVID como son ICOS, TACI, CD19 y

BAFFR (Bacchelli y col. 2007). Los recientes descubrimientos de las mutaciones

en pacientes con CVID, refleja la variabilidad clínica e inmunológica en estos

pacientes, al encontrarse en diferentes genes que transcriben para diferentes

proteínas. Estos 4 defectos moleculares han sido identificados en pocos de los

casos de CVID; sin embargo, los hallazgos clínicos de los pacientes con defectos

ICOS, TACI, CD19 y BAFFR son iguales a los observados en los demás pacientes

en los que aún no se encuentra el defecto molecular (Kopecký y Lukesová 2007).

Sin embargo, el conocer este defecto en los pacientes puede tener implicaciones

en mejores oportunidades terapéuticas. Por ejemplo en las deficiencias de ICOS y

XLP, la hipogammaglobulinemia es causada por la baja producción de interlucina

10 (IL-10). En este contexto, el uso de IL-10 mejora lo función de las células B en

los pacientes con CVID (Zielen y col. 1993). Desde el descubrimiento de la

deficiencia de TACI en humanos, se ha tratado de estimular con BAFF para

restaurar la secreción de inmunoglobulinas y la proliferación de células B en

algunos pacientes con CVID. (Stewart y col. 2003; Nardell y col. 2002).

73

Los antecedentes clínicos de los pacientes adultos con una deficiencia de ICOS

ponen de manifiesto que la mayoría de ellos habían padecido al menos una

neumonía durante la infancia (Grimbacher, 2003). En este trabajo, dos pacientes

tuvieron disminuida drásticamente la expresión de ICOS (figura11) y ambos

presentaron neumonías de repetición, referidas desde la infancia. Los pacientes

21 y 25, que expresaron de manera disminuida ICOS, son candidatos para el

análisis de mutaciones, así como al análisis de la funcionalidad de este receptor,

para confirmar el diagnóstico. TACI se expresa en la superficie de las células B, se

ha visto que tanto las mutaciones homocigotas como heterocigotas del gen

TNFRSF13B, que codifica para TACI, están asociadas con un fenotipo de CVID

(Salzer, 2005). En este estudio todos los pacientes expresaron TACI en porcentaje

parecido al de los testigos sanos (figura 25 y 26); sin embargo, es importante

remarcar que la expresión no significa una proteína funcional, por lo que será

necesario realizar la búsqueda de mutaciones en el gen que codifica para esta

proteína (Warnatz y col. 2005). La proteína CD19 se expresa en células B y

recientemente se han descrito pacientes con una expresión considerablemente

reducida de CD19 (Van Zelm M y col.2006). Sin embargo, dichos pacientes

presentaron un número normal de linfocitos B, lo que se demostró mediante el

marcador CD20 (Van Zelm M y col.2006). En este estudio, los pacientes que no

expresaron CD19, tampoco expresaron el otro marcador de células B que fue

utilizado, el CD22 (tabla 14), lo que sugiere fuertemente que no hubo deficiencias

de CD19. A 18 pacientes se les buscó la expresión de CD40 en células B CD19+

(tabla 19 y 20) y a 14 pacientes en monocitos CD14+ (tabla 21 y 22), con el

objetivo de descartar algún paciente con Hiper-Igm tipo 3. El paciente 11 expresó

1% de CD40 en monocitos (tabla 21) cuando la media de los controles sanos fue

de 95% de expresión en monocitos (tabla 22). Al paciente 11 no se le analizó

CD40 en células B ya que tenía menos del 1% de estas células (grupo 3). En

conclusión, para este paciente es importante descartar tanto agammaglobulinemia

(LX como AR) e hiper-IgM tipo 3.

74

El aumento anormal de la concentración de IgM y, simultáneamente, una falta de

cambio de isotipo en las células B de memoria son característicos de los defectos

de recombinación de cambio de clase o hiper-IgM. En una proporción significativa

de pacientes con defectos de recombinación de cambio de clase, la IgM normal y

la ausencia de IgA e IgG pueden conducir al diagnóstico erróneo de CVID

(Glocker y col. 2007). Por esta razón, en este trabajo se determinó la expresión

de CD154 en la mayoría de los pacientes (tabla 17). El paciente 14, por su edad y

hallazgos clínicos, se orientaba hacia un fenotipo de hiper-IgM, pero luego del

análisis de CD154, donde se encontró una expresión semejante a la de los

testigos sanos (figura 50), se diagnosticó también como CVID; esto hasta que se

descarte por medio del análisis funcional y posibles mutaciones del gen de

CD154, que podría explicar que se está expresando la proteína pero esta no es

funcional. Esta es una razón para incluir a CD154 en la valoración de los pacientes

con diagnóstico de CVID. Otra razón es que existen antecedentes de pacientes

diagnosticados con CVID, cuya expresión de CD154 fue significativamente baja

comparada con los testigos. Así, la baja expresión de CD154 puede ser una

explicación del fenotipo de CVID (Farrington, 1994). A los pacientes 1, 4, 8 y 25

con CVID, que se les realizaron estudios de CD154, expresaron CD154 menor al

15% (tabla 17), contrastando con los testigos sanos que estuvieron por arriba de

15% (tabla 18 y figura 11). La interacción entre CD40 y CD154 es muy importante

para la proliferación, diferenciación y cambio de isotipo en la célula B. De esta

manera los pacientes que tuvieron una reducción en la expresión de CD154,

podrían tener una ineficiente interacción CD40-CD40L, lo que podría explicar el

fenotipo de CVID. Para poder tener una conclusión acertada serían necesarios

estudios funcionales que corroboren que la expresión reducida de CD154 tiene

algún efecto en los fenómenos de activación y diferenciación de las células B. El

paciente 3 mostró alta expresión de CD154 en las células activadas y el paciente

9 tuvo alta expresión de CD154 aún en células no activadas (tabla17); sin

embargo a ninguno de estos pacientes se les ha diagnosticado un síndrome

linfoproliferativo.

75

En este trabajo, como se había dicho anteriormente 4 pacientes expresaron de

manera disminuida CD154. A estos pacientes se les realizaron estudios

moleculares. La búsqueda de las mutaciones, en los pacientes 16, 19, 20 y 22, se

realizó amplificando CD154 por RT-PCR (figura 19). Estas alteraciones fueron

debidas: en el paciente 16 en una eliminación y en los pacientes 19, 20, 22 a

mutaciones puntuales; todas ellas en localizadas en el exón 5, donde se

encuentran la mayoría de las mutaciones reportadas en otros trabajos (figuras 21

a 24) (Notarangelo y col., 2006). Es importante mencionar que de las 4

mutaciones encontradas, la del paciente 16 está descrita (Lee y col., 2005); los

pacientes 19 y 20 al ser hermanos era de esperarse una misma mutación la cual

también está reportada (Prasad y col., 2005) y solo se encontró la mutación del

gen CD154 en el paciente 22 de novo, por lo que es importante hacer un estudio

funcional para poder corroborar la mutación con el fenotipo de hiper-IgM tipo

1(tabla 27). El conocimiento de los defectos genéticos en estos pacientes

proporciona una alternativa para poder brindar un consejo genético a los

familiares.

Para entender las causas que llevan a una patología como la CVID ó hiper-IgM es

necesario el estudio de las poblaciones leucocitarias, la determinación de la

expresión de las moléculas involucradas en el desarrollo de la célula B, así como

el porcentaje de las células B de memoria. En conjunto, estos datos se deben

correlacionar con los hallazgos clínicos. Un análisis de esta naturaleza orienta

sobre los posibles defectos involucrados, lo que permite proponer estudios

moleculares con una guía mejor definida. Los hallazgos encontrados nos permiten

iniciar la búsqueda de tratamientos alternativos y favorecen la posibilidad de

diagnosticar las enfermedades en edades tempranas para evitar las

complicaciones que pudieran poner en riesgo la integridad y vida de los pacientes.

76

V. CONCLUSIONES

Los leucocitos totales de los pacientes adultos, en particular las células B,

fueron mucho más bajos que los valores de referencia de los testigos

sanos pareados por edad.

La cuantificación de las sub-poblaciones de células B es un método útil para

distinguir entre los diferentes fenotipos clínicos de los pacientes con CVID.

Se detectaron 3 diferentes defectos en los pacientes estudiados, atribuibles

a ICOS CD40 y CD154. No se encontraron patologías asociadas a CD19 y

TACI.

Por lo tanto, para llegar a un diagnóstico preciso es necesario determinar

las alteraciones moleculares en ICOS, CD40 y CD154.

Se encontraron 3 mutaciones en el gen de CD154 ya reportadas en la

literatura y una no reportada que deberá explorarse en los casos de hiper-

IgM ligado a X para precisar el diagnóstico molecular.

El estudio molecular es útil también para detectar a posibles portadoras, por

lo que se debe implementar a familiares de los pacientes.

EL CVID puede deberse a múltiples defectos. Nuestros resultados indican

las bases moleculares de algunos de ellos pero es evidente que se

necesita investigar aún más para entender a nivel molecular las causas de

estas patologías.

77

VI. PRESPECTIVAS

Para completar el estudio de las inmunodeficiencias humorales es importante

estandarizar estudios funcionales en las células B, por medio de la activación con

mitógenos específicos para estas células y determinar la producción de

inmunoglobulinas in vitro y la diferenciación a células plasmáticas. Estos estudios

nos darán un panorama más completo de los defectos que puedan estar

implicados en los pacientes. Además se tiene que aumentar el estudio de las

moléculas que están implicadas en el desarrollo de la célula B y que están

descritas como causa del fenotipo de CVID ó hiper-IgM; como BAFFR y AID, entre

otras. Es importante continuar los estudios de biología molecular para detectar las

mutaciones de genes candidatos que puedan estar involucrados en estas

enfermedades. Estos estudios nos van a dar herramientas para poder entender el

mecanismo del desarrollo de la célula B en la diferenciación en los órganos

linfoides secundarios y encontrar los defectos que puedan estar afectando a los

pacientes con inmunodeficiencias humorales.

78

VII. BIBLIOGRAFIA

1. Anderson M S ,Shlomchik M J, Tomayko M M. Intrinsic properties of human

and murine memory B cells. Immunol. Reviews. 2006. Vol. 211: 280.

2. Bacchelli C, Buckridge S, Thrasher A J, Gaspar H B. 2007.Translational

mini-review series on immunodeficiency: Molecular defects in common

variable immunodeficiency. Clin. Exp. Immunol. 149:401-409.

3. Ballow M. 2002. Primary immunodeficiency disorders: antibody deficiency.

J. Allergy Clin. Immunol. 109: 581-597

4. Beirer K, Hutloff A, Dittrich A, Heuck CH, Rauch A, Büchner K, Ludewig B,

Ochs H, Mages H, Kroczek R.2000. Induction, binding specificity and function

of human ICOS. Eur. J. Immuno; 30: 3707.

5. Bonilla F, Geha R. 2003. Primary Immunodeficiency Diseases. J Allergy Clin

Immunol; 111:571-81.

6. Bossen C, Schneider P. 2006. BAFF, APRIL and their receptors: Structure,

function and signaling. Seminars in Immunology; 18: 263-275.

7. Bruton O. C. 1952. Agammaglobulinemia. Pediatrics; 9:722-728.

8. Bryan A, Calver N, Toubi E, Webster A, Farrant J. 1990. Classification of

patients with common variable immunodeficiency by B cell secretion of IgM

and IgG in response to anti-IgM and interleuk-2. Clin Immunol

Immunopathol, 56. 239-48.

9. Carsetti R, Rosado M, Wadermann H. 2004. Peripheral development of

cells in mouse and man. Immunological Reviews 2004. Vol. 197: 179.

10. Castigli E, Wilson S, Scott S, Dedeoglu F, Xu S, Lam K, Bram R, Jaraba H,

Geha R. 2005. TACI and BAFFR mediate isotype switching in cell B. J Exp

Med ; 201:35.

11. van Krooten C, Banchereau J. CD40-CD40 ligand. Journal of Leukocyte

Biology 2000; 67: 2.

12. Chapel H, Lucas M, Lee M, Bjorkander J, Webster D, Grimbache B, Freschi

C, Thon V, Abedi M, Hammarstrom L. 2008. Common variable

79

immunodeficiency disorder: division into distinct clinical phenotypes. Blood;

112(2):277-86.

13. Castigli E, Wilson S, Garibay L, Rachid R, Bonilla F, Schneider L, Geha R.

2005. TACI is mutant in common variable immunodeficiency and IgA

deficiency. Nature Genetic; 37: 829.

14. Conley M.E. 2001. Antibody Deficiencies. In Scriver R. Ch. Beaudet. L. A.

Eds. The Metabolic end Molecular Bases of Inherited Disease. McGraw-Hill

edt. : 4731- 4750.

15. Conley M. E, Notarangelo LD, Etzioni A. 1999. Diagnostic criteria for primary

immunodeficiencies. Clin Immunol ; 93: 190 – 197

16. Durandy A. Hyper-IgM syndromes: a model for studying the regulation of

class switches recombination and somatic hypermutation generation.

Biochemical Society Transctions 2002; 30 part 4 :815-18.

17. Durandy A, Revy P, Imai K, Fisher A. Hyper-immunoglobulin M syndromes

caused by intrinsic B-lymphocyte defects. Immunological Reviews. 2005;

203: 67-79.

18. Döffinger R, Smahi A, Bessia C, Courtois G, Casanova J-L. X-linked

anhidrotic ectodermal dysplasia with immunodeficiency is caused by

impaired NF- B signalling. Nature genetics. 2001; 27: 277-85.

19. Etzioni A, Ochs H. 2004. The hyper IgM syndrome an evolving story. Pediatr

Res; 56(4): 519

20. Farrington M, Grosmaire L, Nonoyama S, Fischer S, Hollenbaugh D,

Ledbetter J, Noelle R, Arufo A, Ochs H. CD40 ligand expression es defective

in a subset of patients with common variable immunedeficiency. Proc. Natl.

Acad. Sci. 1994; 91: 1099

21. Ferrari S, Giliani S, Insalaco A, Al-Ghonaium A, Soresina A, Loubser M,

Avanzini M. Marconi M, Badolato R, Ugazio A, Levy Y, Catalan N, Durando

A, Tbakhi A, Notarangelo LD, Plebani A. Mutation of CD40 gene cause

autosomal recessive formo f immunodeficiency with hyper IgM. PNAS 2001;

100: 12614-19.

80

22. Geha R, Notarangelo L, Casanova J-L, Chapel H, Conley M-E, Fisher A,

Hammarstrôm L, Nonoyama S, Ochs H, Puck J, Roifman CH, Seger R,

Wedgwood J. . 2007. Primary immunodeficiency diseases: An update from

the International Union of Immunological Societies Primary Immunodeficiency

Diseases Classification Committee. J Allergy Clin Immunol; 120(4): 776- 94.

23. Glocker E, Ehl S, Grimbacher B. Common variable immunodeficiency in

children. Curr. Opin. Pediatr. 19(6) (2007): 685-692.

24. Grimbacher B, Hutloff A, Schlesier M, Glocker E, Warnatz K, Dräger R, Eibel

H, Fischer B, Schäfer A, Mages H, Kroczek R, Peter H. Homozygous loss of

ICOS is associated with adult onset common variable immunodeficiency.

Nature. 4(3) (2003): 261-268.

25. Grunebaum E. 2001. Agamaglobulinemia caused by defects other than BTK.

Immunllogy and Allergy Clinics of North America. Vol. 21 No.21: 45- 64.

26. Hammarströn L, Vorechovsky I, Wester D. 2000. Selective IgA deficiency

(SIgAD) and common variable immunodeficiency (CVID). Clin Exp Immunol.

Vol. 120: 225.

27. Hassner A. 1991. Biologic response modifiers in primary immunodeficiency

disordes. Annals of internal medicine; 115: 294- 307.

28. Hutloff A, Dittrich A, Beirer K, Eljaschewitsch B, Kraft R, Anagnostopoulos I,

Kroczek R. 1999. ICOS is an inducible T–cell co estimulador structurally and

functionally related to CD28. Nature; 397: 263.

29. Imai K, Slupphaug G, Lee W, Revy P, Nonoyama S, Catalan N, Yel L,

Forveille M, Kavli B, Krokan H, Ochs H, Fischer A, Durandy A. Human uracil-

DNA glycosylase deficiency associated with profoundly impaired

immunoglobulin class- switch recombination. Nature Immunology. 2003; 4:

1023-28.

30. Imai K, Zhu Y, Revy P, Morio T, Mizutani S, Fischer A, Nonoyama S,

Durandy A. Analysis of class switch recombination and somatic

81

hypermutation in patients affected with autosomal dominant hyper-IgM

syndrome type 2. Clinical Immunology 2005; 115: 277-85.

31. Janeway C A, Apt L, Gitlin D.1953. Agammaglobulinemia. Trans. Assoc.

Am. Physicians. 66: 200-202.

32. Kopecký O, Lukesová S. 2007. Genetic defects in common variable

immunedeficiency. International Journal of Immunogenetics; 34:225-29.

33. Lanzavecchia A, Bernasconi N, Traggiaii E, Ruprecht C R, Corti D, Sallusto

F. 2006. Understanding and making use of human memory B cells.

Immunol. Reviews. Vol. 211: 303.

34. LeBien TW, 2000. Fates of human B cell precursors. Blood. Vol: 96(1): 9.

35. Lee W, Torgerson T, Schumacher M, Yel L, Zhu Q, Ochs H. 2005.

Molecular analysis of a large cohort of patients with the

hyperimmunoglobulin M (IgM) syndrome. Blood; 105 (5): 1881-90.

36. Levy J, Español-Boren T, Thomas C. 1997. Clinical Spectrum of X-linked

Hyper-IgM syndrome. J Pediatr 2000; 131: 47.

37. Nardelli B, More P, Li Y, Hilbert D. 2002. B lymphocyte stimulator (BLyS): a

therapeutic trichotomy for the treatment of B lymphocyte diseases. Leuk

Lymphoma; 43: 1367-73.

38. Notarangelo L, Casanova J, Fisher A, Puck J, Rosen F, Seger R y Geha R.

2004. Primary immunodeficiency diseases: An update. J Allergy Clin

Immunol; 114: 677-87.

39. Notarangelo L D, Lanzi G, Peron S, Durandy A. Defects of class-switch

recombination. J Allergy Clin Immunol. 2006; 117: 855-864.

40. Oksenhendler E, Gérard L, Fieschi C, Malphettes M, Mouillot G, Jaussaud R,

Viallard JF, Gardembas M, Galicier L, Schleinitz N, Suarez F, Soulas-Sprauel

P, Hachulla E, Jaccard A, Gardeur A, Théodorou I, Rabian C, Debré P. 2008.

Infections in 252 patients with common variable immunodeficiency. Clin Infect

Dis. 46(10): 1547-1554.

41. Park M, Li J, Maddox D, Abraham R. 2008. Common variable

immunodeficiency: a new look at an old disease. The Lancet; 372:489-502.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Oksenhendler%20E%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22G%C3%A9rard%20L%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Fieschi%20C%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Malphettes%20M%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Mouillot%20G%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Jaussaud%20R%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Viallard%20JF%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Gardembas%20M%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Galicier%20L%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Schleinitz%20N%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Suarez%20F%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Soulas-Sprauel%20P%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Soulas-Sprauel%20P%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Hachulla%20E%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Jaccard%20A%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Gardeur%20A%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Th%C3%A9odorou%20I%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Rabian%20C%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Debr%C3%A9%20P%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

82

42. Piqueras B, Levenu-Bombled C, Galicier L, Bergeron-van der Cruyssen F,

Mouthon L, Chevret S, Debré P, Schmitt C, Oksenhendler E. 2003.

Common variable immunodeficiency patients classification based on

impared B cell memory differentiation correlates with clinical aspects. J clin

Immunol; 23(5): 385-400.

43. Prasad M, Velickovic M, Weston S, Benson E. 2005. Mutational screening

of the CD40 ligand (CD40L) gene in patients with linked hyper-IgM

syndrome (XHIM) and determination of carrier status in female relatives. J

Clin Pathol., 58(1): 90-2.

44. Revy P, Muto T, Levy Y, Geissmann F, PLebani A, Sanal O. 2000

Activation-induced cytidine deaminase (AID) deficiency causes the

autosomal recessive form Hyper-IgM syndrome (HIGM2). Cell; 102: 565-75.

45. Rosen F, Kevy S, Merler E, Janeway C, Gitlin D. 1961. Recurrent bacterial

infections and dysgamma-globulinemia: deficiency of 7S gamma-globulins

in the presence of elevated 19S gamma-globulins. Report of two cases.

Pediatrics; 28:182-95.

46. Rosen FS, Wedgwood RJ, Eibl M. Primary immunodeficiency diseases.

Report of WHO scientific group. Clin Exp Immunol 1997; 109 (suppl 1):1.

47. Salzer U, Chapel H M, Webster A D, Pan-Hammarström Q, Schmitt-Graeff

A, Schlesier, Peter H H, Rockstroh J K, Schneider P, Schäffer A A,

Hammarström L, Grimbacher B. Mutations in TNFRSF13B encoding TACI

are associated with common variable immunodeficiency in humans. Nature

Genetics. 2005; 37: 820-27.

48. Salzer U & Grimbacher B. Monogenetic defects in common variable

immunodeficiency: what can we learn about terminal B cell differentiation?

Current Opinion in Rheumatology. 2006; 18: 377.

49. Schrader CE, Linehan EK, Mochegova SN, Woodland RT, Stavnezer J.

Inducible DNA break in Ig S regions are dependent on AID and UNG. J. Exp

Med. 2005; 202:561-8

83

50. Shi Y, Agematsu K, Ochs H D, Sugane K. Functional analysis of human

memory B cell subpopulations: IgD CD27 B cells are crucial in secondary

immune response by producing high affinity IgM. Clinic. Immunol. 2003;

108: 128.

51. Sims G P, Ettinger Rachel, Shirota Y, Yarbo Ch H, Illei G G, Lipsky P E.

2005. Identification and characterization of circulating human transitional B

cells. Blood. Vol. 105. No. 11: 4390.

52. Smith E, Baskin B, Humire-Greiff P, Zhou J, Olsson P g, Maniar H, Kjellén P,

Lambris J, Christesson B, Hammarström L, Bentley D, Vetrie D, Islam K,

Vorechovsky y Sideras P. 1999. Genetically Determined Immunodeficiency

Diseases: A Perspective. In Ochs H.D., Punck J.M. eds. Primary

Immunodeficiency Disease: A Molecular and Genetic Aprooach. New York:

Oxford University Press. 5.

53. Spickett G, Farrant J, North E, Zhang J, Morgan L, Webster B. 1997.

Common variable immunodeficiency: how many diseases?. Inmmunology

Today; 8:325-8.

54. Stewart D, MaAvoy M, Hilbert D, Nelson D. 2003. B lymphocytes from

individual’s withcommon variable immunodeficiency respond to B

lymphocyte stimulator (BLyS protein) in vitro. Clin Immunol; 109 137-43.

55. Stiehm ER. 1992. New and old immunodeficiencies. Pediatr Res;

33(supl.1):S2-S8.

56. Tsukada S, Rawlings DJ. 1994. Witte ON. Role of Bruton´s tyrosine kinase in

immunodeficiency. Curr Opin Immunol; 6:623-30.

57. Van Zelm M C, Reisli I, van der Burg M, Castano D, van Noesel C J, Vantol

M J, Woellner C, Grimbacher B, Patino P J, van Dongen J J, Franco J L.

2006. An antibody deficiency syndrome due to mutations in the CD19 gene.

N. Engl. J. Med ; 354: 1874.

58. Vlková M, Thon V, Sárfyová M, Bláha L, Svobodník, J. Lokaj, j Litzman. Age

dependency and mutual relations in T and B lymphocyte abnormalities in

84

common variable immunodeficiency patients. Clin. Exp. Immunol. 143

(2005): 373-379.

59. Warnatz K, Bossaller L, Salzer U, Skrabi-Baumgartner A, Schwinger W, van

der Burg M, van Dongen J, Orlowska-Volk M, Knoth R, Durandy A, Draeger

R, Schlesier, Hartmut H, Grimbacher B. 2006.Human ICOS deficiency

abrogates the germinal center reaction and provides a monogenic model for

common variable immunopdeficiency. Blood; 107: 3045-52.

60. Warnatz K, Denz A, Dräger R, Braun M, Groth CH, Guido W, Hermann E,

Schlesier M, Peter H. 2002. Severe deficiency of switched memory B cells

(CD27 pos IgM- IgD-) in subgroups of patients with common variable

immunodeficiency: a new approach to classify a heterogeneous disease.

Blood. ; 99: 1544-51.

61. Warnatz K, Salzer U, Gutenberg S. 2005. Finally found: human BAFFR

deficiency causes hypogammaglobulinemia. Clin Immunol. Supplement 1: 20.

62. Warnatz K, Schlesier M. 2008. Flow cytometric phenotyping of common

variable immunodeficiency. Citometry B Clin Cytom. 2008 Jun 16.

63. Wehr C, Kivioja T, Schmitt C, Ferry B, Witte T, Eren E, Vlkova M, Hernandez

M, Detkova D, Bos PR, Poerksen G, von Bernuth H, Baumann U, Goldacker

S, Gutenberger S, Schlesier M, Bergeron-van der Cruyssen F, Le Garff M,

Debré P, Jacobs R, Jones J, Bateman E, Litzman J, van Hagen PM, Plebani

A, Schmidt RE, Thon V, Quinti I, Espanol T, Webster AD, Chapel H, Vihinen

M, Oksenhendler E, Peter HH, Warnatz K. 2008. The EUROclass trial:

defining subgroups in common variable immunodeficiency. Blood; 111(1): 77-

85.

64. Winkelstein JA, Marino MC, Ochs H, Fuleihan R, Scholl PR, Geha R,

Stiehm ER, Conley ME. 2003. The X-linked hyper-IgM syndrome: clinical

and immunologic features of 79 patients. Medicine (Baltimore); 82(6):373-84

65. Wood P. 2009.Primary antibody deficiency syndromes. Ann. Clin. Biochem.

46(2): 99-108.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Wehr%20C%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Kivioja%20T%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Schmitt%20C%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Ferry%20B%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Witte%20T%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Eren%20E%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Vlkova%20M%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Hernandez%20M%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus



http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Detkova%20D%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Bos%20PR%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Poerksen%20G%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22von%20Bernuth%20H%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Baumann%20U%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Goldacker%20S%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus



http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Gutenberger%20S%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Schlesier%20M%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Bergeron-van%20der%20Cruyssen%20F%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Le%20Garff%20M%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Debr%C3%A9%20P%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Jacobs%20R%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Jones%20J%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Bateman%20E%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Litzman%20J%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22van%20Hagen%20PM%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Plebani%20A%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus



http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Schmidt%20RE%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Thon%20V%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Quinti%20I%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Espanol%20T%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Webster%20AD%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Chapel%20H%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Vihinen%20M%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus



http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Oksenhendler%20E%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Peter%20HH%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Warnatz%20K%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Winkelstein%20JA%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Marino%20MC%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Ochs%20H%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Fuleihan%20R%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Scholl%20PR%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Geha%20R%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Stiehm%20ER%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Conley%20ME%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus

85

66. Zielen S, Bauscher P, Hoffmann D, Meuer S. 1993. Interlukin-10 and

immune restoration in common variable immunodeficiency. Lancet;

342:750-51.

86

ANEXO I:

TABLA I:

DIAGNOSTICO DEFERENCIAL DE HIPOGAMMAGLOBULINEMIA

DROGAS QUE LA INDUCEN:

agentes anti-malaria

Captopril

Carbamazepina

Glucocorticoides

Fenclofenaco

Sal de oro

Penicilina

Fenintoina

Sulfasalazina

DESORDENES GENETICOS:

Ataxia telangiectasia

Formas autosomales de SCID

Deficiencia de transcobalamina II e hipogammaglobulinemia

Agammaglobulinemia ligada al X

Desorden linfoproliferativo ligado al X ( asociado con EBV)

SCID ligado al X

Algunos desordenes metabólicos

ANOMALIAS CROMOSOMALES:

Síndrome cromosoma 18q

Monosomia 22

Trisomia 8

Trisomia 21

ENFERMEDADES INFECCIOSAS:

HIV

Rubéola congénita

Infección congénita con CMV

87

Infección congénita con Toxoplasma gondii

Virus Epstein –Barr

MALIGNIDAD:

Leucemia crónica linfocítica

Linfoma no Hodgkin

Malignidad de células B

DESORDENES SISTÉMICOS:

Inmunodeficiencia causada por hipercatabolismo de inmunoglobulinas

Inmunodeficiencia causada por excesiva perdida de inmunoglobulinas

88

ANEXO II

PREPARACIÓN DE REACTIVOS.

PBS 10x

NaCl 80g

KH2PO4 2g

NA2HPO4*12H2O 29g

KCl 2g

pH 7.4

Aforar a 1 litro con agua destilada y filtrar en membranas de 0.22 m. Diluir 1:10 antes de comenzar a trabajar.

Solución fijadora.

Paraformaldehído al 1% diluido en PBS.

PBA (PBS-Azida).

Albúmina 0.5%

Azida de sodio 0.05%

Disolver en PBS 1x.

Líquido de Turk

Acido acético glacial 3.0 ml

Agua destilada c.b.p. 100 ml

Adicionar 1 ó 2 gotas de azul de metileno

Tris-ácido acético- EDTA 50X (TAE)

Disolver en 1 L de agua las siguientes sales:

-Tris.base 242 g

-Acido acético glacial 57.1 ml

-EDTA 18.6g

89

TAE 1X

Preparar 1L de una dilución 1:50 de TAE 50X

Regulador TSS 2X

En condiciones estériles, preparar una solución conteniendo los siguientes

reactivos, utilizando medio Luria-Bertani como disolvente:

Polietilen-glicol (3350 ó 8000) 20%

Dimetil-sulfóxido 10%

MgS04 ó MgCl2 70mM

Ajustar el pH a 7.5

Gel de Agarosa

Agarosa 1%

Regulador de desnaturalización (2X)

Sacarosa 20 g

Urea 15 g

Xileno cianol 0.025 g

Azul de Bromofenol 0.025 g


Tris- Acido Bórico- EDTA (TBE) 10X

Tris-base 108 g

Acido bórico 55 g

EDTA 9.3 g

Agua destilada c.b.p. 1L

Regulador de carga para DNA

Sacarosa 20 g

Orange G 0.1 g


El presente trabajo se realizó en la Unidad de...

Documents

Transcript of El presente trabajo se realizó en la Unidad de...