El sistema de expresión coli Expressway

"Cell-Free E. está diseñado para la

transcripción y traducción in vitro de ADN

diana a la proteína en una sola reacción. Este

sistema flexible permite la producción de la

proteína recombinante de interés a partir de

una construcción de expresión en tan poco

como 3 horas. Una vez purificada, la proteína

recombinante resultante es adecuado para su uso en otras aplicaciones posteriores,

incluyendo bioquímica, física, y la

caracterización estructural.

El sistema está disponible en dos

formatos: "Maxi (escalable 20-100

reacciones) y Expressway" Expressway

Mini (20 reacciones).

El sistema de expresión E. Coli libre de

células Expressway "proporciona un

medio para producir altos niveles de

proteína recombinante que pueden ser fácilmente detectados y purificados. Una

vez expresión de la proteína se verifica, la

proteína recombinante puede ser utilizado

para las siguientes aplicaciones.

analizando los mutantes

Verificación de los productos

génicos clonados

La producción de proteínas que

son tóxicas para las células

El sistema Expressway "Cell-Free E.

utiliza un extracto optimizado de E. coli, un tampón de reacción que contiene un

sistema de regeneración de ATP, y amino

ácidos para permitir la síntesis de alto

nivel de su proteína.

Los componentes principales que

contiene Expressway son:

Un extracto optimizado de E. coli para

aumentar la estabilidad de construcciones

de ADN durante la transcripción y la

traducción y aumento de la producción de

proteína soluble Un tampón de reacción

compuesto de un sistema de

regeneración de ATP para

proporcionar una fuente de

energía para la síntesis de

proteínas

Un búfer de alimentación que

contiene sales y otros sustratos

para reponer los componentes

agotados o degradados durante la

síntesis de proteínas, mejorando

así el rendimiento de proteína recombinante

Los aminoácidos (Met)

necesarios para la síntesis de

proteínas que se produzca

La metionina proporciona por

separado para permitir la

producción de la proteína

recombinante radiomarcada, si

se desea

Patentada T7 Enzyme Mix contiene ARN polimerasa de T7

y otros componentes

optimizados para la expresión

basada en T7 a partir de plantillas

de ADN.

El plásmido control pEXP5-NT /

CALML3 (que expresa la

calmodulina humano como

proteína de fusión 3) para su uso

como control positivo para la

síntesis de proteínas (véase la página 33 para más información)

Dos vectores de expresión

optimizados, pEXP5-NT /

TOPO® y pEXP5- CT /

TOPO®, para permitir una

rápida generación de

construcciones de fusión N- o C-

terminales, respectivamente.

El extracto slyD- promueve la alta

expresión de rendimiento de larga

duración, la proteína activa a partir de construcciones de ADN bajo las

condiciones de reacción especificadas en

este manual.

El vectores pEXP5-NT / TOPO® y

pEXP5-CT / TOPO® se suministran con

el kit Expressway ™. Los vectores

contienen todos los elementos reguladores

necesarios en una configuración óptima

para la producción de alto nivel de su

proteína recombinante en el sistema

Además, los vectores permiten la fusión

de su gen de interés con un péptido N- o C-terminal, según el caso, que contiene

una polihistidina (6xHis) etiqueta para la

producción de la proteína que se puede

detectar fácilmente con anticuerpos

disponibles comercialmente, y se purificó

con el metal resina quelatizantes.

El uso exitoso del sistema de expresión

coli Expressway ™ Cell-Free E. para

sintetizar proteína recombinante requiere

la adición de una plantilla de ADN que

contiene el gen de interés colocado dentro

del contexto adecuado de la transcripción

y la traducción elementos reguladores

incluyendo un promotor de ARN

polimerasa del bacteriófago T7 ("promotor T7 "), procariota Shine-

Dalgarno sitio de unión a ribosomas

(RBS), codón ATG de iniciación, codón

de parada, y terminador T7. Sin embargo,

el rendimiento de proteína se puede

mejorar significativamente si la plantilla

de ADN está configurado de manera

óptima.

El rendimiento de proteína

producida en sistemas libres de

células depende generalmente de muchos factores, incluyendo:

Tamaño de la proteína

Secuencia del gen de interés

Posicionamiento del gen de

interés en relación con el

promotor T7 y la Shine-

Dalgarno ribosoma sitio de

unión en el molde de ADN

Expresión de la proteína como

una fusión con una etiqueta de N-

o C-terminal (típicamente añadido para facilitar la

detección y purificación de la

proteína recombinante)

uso de codones optimizado

Calidad de la plantilla de ADN

La estabilidad de mRNA

El vector pEXP5-NT / CALML3 (3194

pb) contiene un gen 3-calmodulina como

humano que ha sido clonado en TOPO®

pEXP5-NT / TOPO® en el marco con la

etiqueta N-terminal. El tamaño de la

proteína de fusión CALML3 es aproximadamente 19,5 kDa.

Gen de interés colocado rio abajo de un

promotor T7 y un sitio de unión al

ribosoma (RBS). El gen de interés debe

contener un codón de iniciación ATG y un

codón de parada.

Secuencia arriba del promotor T7 que

contiene un mínimo de 6-10 nucleótidos

(nt) para promotor eficiente de unión

(requerido para los productos de PCR

lineales). Esta secuencia no necesita ser específico.

Secuencia tras el promotor T7 que

contiene un mínimo de 15 a 20 nt que

forma una estructura de tallo y bucle

potencial como descrito por Studier et al.,

1990 (ver Expressway ™ Vectores

compatibles, página siguiente, para más

información).

Secuencia de 7-9 nt entre el RBS y el codón de iniciación ATG para la eficacia

de traducción óptima de la proteína de

interés. Esta secuencia no necesita ser

específico.

Un terminador T7 situado 4-100 nt aguas

abajo del gen de interés para la

terminación de la transcripción eficiente y

estabilidad mensaje.