El super-organismo humano

Ecología Microbiana del Tracto Gastrointestinal (GI).

400-500 especies bacterianas habitan el tracto intestinal humano.

El 99% de las bacterias totales pertenecen a 30-40 especies.

La mayor población se halla en el colon, con 1014 células bacterianas. (10 veces más que todas las células del cuerpo).

Patógenos intestinales

Diarrea asociada a Clostridium difficile Gastritis y úlceras asociadas a Helicobacter

pylori Enterocolitis asociada a Salmonella,

Escherichia, Pasteurella. Diarreas asociadas a rotavirus. Colitis y mala absorción Giardia intestinalis

(parásito intestinal).

Probióticos Prebióticos

Microorganismos que producen efectos benéficos en la saluddel consumidor. (Bifidobacterias, Lactobacilos)

Compuestos no digeribles que favorecen el desarrollo y establecimiento de la flora bacteriana benéfica en el colon. (galacto-oligosacáridos de leche materna, fructo-oligosacáridos de plantas, sorbitol, xilitol, isomaltosa)

Simbióticos

Empleando leche hervida como medio de cultivo aisló un cultivo puro “Bacterium lactis”. (Lactobacillus, 1901)

Lactobacillus

Lister Joseph (1857)

Estudios originados por la longevidad de ciudadanos búlgaros.

Primeros estudios científicos que respaldan los efectos benéficos en la salud por consumo de leche fermentada con “Bulgarian bacillus” (Lactobacillus bulgaricus).

Producción de compuestos benéficos Exclusión de patógenos en la mucosa intestinal.Estimulación del sistema inmuneEliminación de productos tóxicos

Elías Metchnikoff, 1907

Henry Tissier (1906)

Bifidobacterium

•Observó abundantes bacterias “Y” en heces de niños Observó abundantes bacterias “Y” en heces de niños saludables, y escasas en aquellas de niños con diarreas. saludables, y escasas en aquellas de niños con diarreas. ((Bacillus bifidus).•Nueve de cada diez niños tratados con B bifidus se recuperaron rápidamente de la diarrea.

Microorganismos vivos que después de ser ingeridos en cantidades adecuadas, otorgan beneficios a la salud que superan las inherentes necesidades básicas nutricionales

Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura. Organización Mundial de la Salud (FAO/WHO), 2001

Definición

Lilly & Stilwell, 1965

Sustancias secretadas por un organismo y capaces deestimular el crecimiento de otro.

Guarner & Shaafsma, 1998

Microorganismos vivos que cuando se consumen en cantidades adecuadas como parte de un alimento, confieren al huésped un beneficio para la salud.

Inocuidad (GRAS, QPS). Identificación taxonómica de la cepa

probiótica Estabilidad genética Resistencia frente a antibióticos

Condiciones a cumplir por los microorganismos probióticos

Criterios de seguridad

Kakisu E, 2010

Viabilidad en el producto Factibilidad de reproducción a mayor

escala Resistencia a fagos Si forman parte de un alimento,

estabilidad de propiedades probióticas durante vida útil del mismo

Condiciones a cumplir por los microorganismos probióticos

Criterios tecnológicos

Resistencia a condiciones del tracto GI Viabilidad y eventual proliferación en intestino Capacidad de adherirse y colonizar fácilmente el

tracto gastrointestinal compitiendo con patógenos. Presentar actividad antagónica frente a patógenos

in vitro e in vivo. Sinergismos de cepas probióticas Capacidad comprobable de otorgar beneficios al

huésped

Condiciones a cumplir por los microorganismos probióticos

Criterios funcionales

Criterios de seguridad: Identificación de la cepa probiótica:Resolución taxonómica de las técnicas de uso más frecuente

RFLPPFGERibotipificaciónAFLP, AP-PCR, rep-PCR, RAPD ARDRATipificación mediante bacteriocinas, fagotipificaciónSerotipificaciónZimogramasPatrones electroforéticos de proteínas celulares totalesHibridaciones DNA-DNA% G+CMarcadores quimiotaxonómicosFingerprinting de ácidos grasos celulares Estructura de pared celularFenotipoSecuencia de rRNASondas de DNASecuencias de DNA

Familia

GéneroEspecie

Cepa

Modificado de Vandamme et al., 1996

Prevención y tratamiento de diarreas, úlceras y enfermedades inflamatorias crónicas de tracto GI

Remodelación de las comunidades bacterianas gastrointestinales (Bifidobacterium spp, Lactobacillus reuteri)

Modulación de la respuesta inmune Prevención y disminución de efectos pro-inflamatorios en

alergias Profilaxis y tratamiento de enfermedades urogenitales Aumento de la digestibilidad de la lactosa por aporte de beta

galactosidasa

Efectos hipocolesterolemiantes ? Efectos terapéuticos en el tratamiento del cáncer ?

Criterios funcionales: Efectos benéficos sobre la salud

Criterios funcionales: Efectos benéficos sobre la salud

Lutgendorff et al, 2010

La administración de probióticos reduce la apoptosis intestinal en pancreatitis aguda en ratas. Aumento del antioxidante glutatión (GSH)

Probiótico multicepa: Lactobacillus acidophilus (W70), Lactobacillus casei (W56), Lactobacillus salivarius (W24), Lactococcus lactis (W58), Bifidobacterium bifidum (W23), and Bifidobacterium lactis (W52) (previously classifiedas Bifidobacterium infantis) (EcologicH 641, Winclove Bio Industries, Amsterdam, the Netherlands).

Efecto dosis-respuesta de diferentes cepas probióticas sobre perfiles lipídicos

Ooi & Liong, 2010

Efecto dosis-respuesta de diferentes cepas probióticas sobre perfiles lipídicos: estudios en humanos

Ooi & Liong, 2010

Existen algunos datos controversiales, atribuíbles a diferencias en las cepas empleadas, dosis y duración del tratamiento, grupos contol inadecuados, etc

Efectos inmunológicos

Modulación de la respuesta inmune: aumento de IgA, activación células NK, incremento de la actividad fagocítica, proliferación de linfocitos B, producción de citoquinas (IL2, IL6, IL10) o factor de necrosis tumoral (TNF) (Takeda et al, 2006; Sheih et al, 2001; Kitazawa et al, 2001; Galdeano y Perdigón, 2006; Humen et al, 2005)

Materia fecal

Sangre

Intestino

IgA especifica.

Antígenos específicos de Giardia

IgG esp.

Recuento de Trofozoitos

Enzimas

Histología

Muestras:Muestras:

Giardia intestinalis

Cepa WB clon C6

(5x105 por animal)

Estudio de la cinética de infección Estudio de la cinética de infección en merión. en merión.

Administración de Lactobacillus johnsonii LA1 (108 UFC/animal/día)

Sacrificio y muestreo

Sacrificio y muestreo

Sacrificio y muestreo

Día 0 7 14 21 Día 0 7 14 21 2828

Grupo Tratamiento:

Grupo Placebo: Agua mineral (Humen et al, 2005)

Efectos inmunológicos

Cinética de infección:Cinética de infección:

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

0 10 20 30

time post-inoculation (days)

infe

ctio

n ra

te

La1

Placebo

En el grupo placebo hay un pico de infección al día 7 (p=0.05)En el grupo placebo hay un pico de infección al día 7 (p=0.05)

Days post-inoculationDays post-inoculation

Day 7Day 7 Day 14Day 14 Day 21Day 21

La1La1 PlaceboPlacebo La1La1 PlaceboPlacebo La1La1 PlaceboPlacebo

Infecction rateInfecction rate 3/113/11 10/1210/12 0/120/12 6/146/14 0/60/6 3/63/6

Fisher test (p)Fisher test (p) 0.010.01 0.020.02 0.090.09

Determinación de antígenos específicosDeterminación de antígenos específicos de giardia de giardia (GSA-65)(GSA-65) en en

materia fecalmateria fecal

-0,1

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0 10 20 30

time (days)

rati

o o

f G

SA

65 +

an

imal

s

La1

Placebo

En el grupo Placebo se encontró un aumento en En el grupo Placebo se encontró un aumento en la liberación de antígenos (GSA-65) la liberación de antígenos (GSA-65) dependiente del tiempo. dependiente del tiempo.

El grupo tratamiento mostró una menor El grupo tratamiento mostró una menor liberación de antígeno.liberación de antígeno.

Efectos inmunológicos

Humen et al, 2005

Posibles Mecanismos Probióticos

Actividad anti microbiana/Interferencia con patógenos.

Regulación de la digestión y eliminación de sustancias nocivas.

Efectos inmunológicos.

Ácidos: acético, láctico, propiónico: > pH e inactivan crecimiento bacteriano (E coli, Salmonella, etc.)

H2O2, forma radicales libres atacan membrana lipídica. (Candida, Gardenella).

Bacteriocinas: péptidos anti microbianos. Interaccionan con receptores de la bacteria blanco-produciendo cambios a nivel de membrana que conducen a la muerte bacteriana. (Nisina)

Competencia por sustratos. Competencia por sitios de unión al epitelio, efectos

estéricos.

Actividad anti microbiana/competenciaActividad anti microbiana/competencia

Regulación de la digestión y eliminación de sustancias nocivas

Mejora la absorción de nutrientes. Elimina sustancias tóxicas (derivados fenólicos

de metabolismos de aminoácidos, etc., efectos anti carcinogénicos y anti tumorales).

Facilitan la hidrólisis de lípidos y proteínas liberando aminoácidos y ácidos grasos fácil de absorber.

Aporte de enzimas que ayudan degradar sustancias. Ej. Intolerancia a la latosa (β-galactosidasa).

Aporte de vitaminas.

Identificación Cepa Genotípica y Fenotípicamente.

(Hibridación, PCR, PFEG)

Características FuncionalesTests in vitroEnsayos en Animales

Aseguramiento de la inocuidad (GRAS)In vitro y/o animalFase 1 estudio en humanos (voluntarios sanos)Sin actividad hemolítica ni producción de toxinas, no presentar resistencia a antibióticos, etc.

Ensayos en humanos doble ciego controlado con placebo (Fase2, grupo con patología). Diseño apropiado de experimento. Resultados preliminares

Fase 3. Ensayos efectividad al compararlos con tratamiento estándar de una condición específica.

Rotulado:Contenido: Cepa , especie etcMínimo Nº de bacterias viables del contenidoCondiciones apropiadas de almacenaje

Recomendado un 2º ensayo independiente para confirmar resultados.

Probiótico

Food and Agriculture Organizationof the United Nations World Health Organization. FAO/WHO

Pautas para el desarrollo de un Probiótico

Bacterias del ácido láctico

Gram positivas

No esporulantes

Cocos o bacilos no respiradores

Catalasa negativos

Productoras de ácido láctico

(Hagen et al., 2005)

Estructura

Metabolismo

Aplicaciones biotecnológicas

Composición

Proteína láctea (% w/w)a Mín 2,7%

Grasa láctea (% w/w) Menos del 10%

Acidez valorable, expresada como % de ácido láctico (% w/w)

Mín. 0,6%

Suma de microorganismos que constituyen el cultivo (ufc/g, en total)

Mín. 107

Levaduras (ufc/g) Mín. 104

Etanol No establecido

Alimento obtenido por incubación de leche con gránulos de kefir.Los gránulos, compuestos por una matriz de proteínas y polisacáridos, contienen lactobacilos, lactococos, bacterias del ácido acético y levaduras, responsables de la fermentación.

El kefir

Lactobacillus

L. kefiranofaciens, L. acidophilus, L. alimentarius, L. casei, L. rhamnosus.

Heterofermentadores:

ácido acético

L. brevis, L. buchneri, L. kefir, L. fermentum, L. fructivorans.

Homofermentadores:

Glucosa ácido láctico

etanol

Glucosaácido láctico

QPS (Qualified Presumption of Safe, UE) GRAS (Generally Recognised As Safe, USA)

Bacterial cells S-layer extraction, LiCl 5 M 37 ºC, 2 hs, 180 rpm

Dialysis

S-layer protein Monomers Re-assembling

in suspensionat liquid-surface interfaceson lipid filmson liposomeson solid supports

Subunits are held together and attached to the underlying cell surface by noncovalent

interactions. Monomers have self-assembly ability to form regular layers Interactions can be disrupted in a reversible way by cation substitution or high concentration

of chaotropic agents

S-layer proteins: General aspects

Relatively small size 25 kDa to 71 kDa.

Basic proteins with high pI between 9,0 y 10,4.

Low content of cysteine and methionine

High content of hydrophobic and hydroxyl amino acids.

No SLH motifs have been detected but the attachment of the S-layer protein to the cell

wall seems to involve also secondary cell wall polymers (SCWP).

Presence of S-layer proteins are strain dependent

Adhesive properties were demonstrated in several lactobacilli S-layers

S-layer proteins of lactobacilli: General features

Proposed or identified adhesive surface proteins of Lactobacillus

S-layer protein

Target Species / Strain Reference

S-layer protein Avian intestinal epithelial cells Lactobacillus acidophilus spp.Schneitz et al., 1993

CbSA Collagens, laminin Lactobacilluscrispatus JCM 5810 Toba et al., 1995

SlpA Fibronectin, human epithelial cell line

Lactobacillus brevis ATCC 8287Hynönen et al., 2002

S-layer protein Red blood cells Lactobacillus kefir CIDCA 8321 Garrote et al., 2004

Red blood cells Lactobacillus parakefir CIDCA 8328 Garrote et al., 2004

SlpA Murine ileal epithelial cells Lactobacillus acidophilus M92Frece et al., 2005

S-layer protein human epithelial cells Lactobacillus helveticus R0052Johnson-Henry et al., 2007

S-layer protein Mammalian epithelial cell Lactobacillus amylovorus spp.Jakava-Viljanen et al., 2007

S-layer protein Sacharomyces lipolytica Lactobacillus kefir CIDCA 8315Golowczyc et al., 2009

S-layer proteins of lactobacilli: Adhesive properties

Interacción entre L. kefir y S. lipolytica aisladas de gránulos de kefir

Golowczyc et al, 2009Actividad tipo lectina de la capa S (inhibición de la coagregación con levaduras en presencia de periodato o azúcares)Inhibición de la hemaglutinación por pérdida de capa S

Distribución diferencial de bacterias en el colon

Adaptado de Swidsinki et al. 2009

FISH

Sykora J, Valeckova K, Amlerova J, Siala K, Dedek P, Watkins S, et al. Effects of a specially designedfermented milk product containing probiotic Lactobacillus casei DN-114 001 and the eradication ofH. pylori in children: a prospective randomized double-blind study. J Clin Gastroenterol 2005;39:692.

Ooi & Liong. Cholesterol-Lowering Effects of Probiotics and Prebiotics: A Review of in Vivo and in Vitro Findings. Int. J. Mol. Sci. 2010, 11, 2499-2522

Martín A. Humen,Graciela L. De Antoni, Jalil Benyacoub, María E. Costas, Marta I. Cardozo, Leonora Kozubsky, Kim-Yen Saudan, Angele Boenzli-Bruand, Stephanie Blum , Eduardo J. Schiffrin, and Pablo F. Pérez1,2*Lactobacillus johnsonii La1 Antagonizes Giardia intestinalis In Vivo. Infect Immun. 2005 73(2): 1265–1269.