Electroforesis en Gel de Agarosa y Poliacrilamida
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ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA Y POLIACRILAMIDA
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Es la migración de fragmentos de ADN o ARN por la acción de un campo eléctrico en función de su tamaño.
¡OJO, NO CONFUDIR!
Electro: electricidad
Foresis: Trasladar
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HISTORIAVin Thorne: bioquímico del Instituto de Virología de Glasgow
caracterizar las distintas formas de ADN que se obtenían de partículas purificadas de polyomavirus.
TIPOS DE GELES
Agarosa (ADN) Poliacrilamida (PROTEINAS)
Gelificación térmica Baja Resolución Separan fragmentos de DNA de
entre 300 a 10000pb. Se corren horizonalmente Son mas fáciles de preparar y
manipular
Gelificación química Alta resolución. Separan fragmentos de DNA
<500pb. Se corren de forma vertial Son mas complejos de preparar
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ELEC
TRO
FORE
SIS
EN G
EL
DE
AGAR
OSA
CARACTERISTICAS
La separación de las macromoléculas depende de dos variables: carga y masa.
cuanto más baja es la concentración de agarosa mayor es el tamaño de las moléculas que pueden separarse, y viceversa
Los geles de agarosa son ideales para analizar el producto de digestiones con enzimas de restricción, lo que puede
combinarse con otras técnicas como el Southern blot, así como para analizar los productos de una reacción de PCR.
Agarosacoloide natural que se extrae de las algas (Gelidium gracilaria), es un polisacárido lineal formado por la repetición de la unidad básica, la agarobiosa, que comprende unidades alternadas de galactosa y 3,6- anhidrogalactosa.
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ELEC
TRO
FORE
SIS
EN G
EL
DE
AGAR
OSA
Componentes:
Agarosa
Bufer de carga
Bufer de corrida
Frentes de migración
Muesta de ADN
Bromuro de etidio
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ELEC
TRO
FORE
SIS
EN G
EL
DE
AGAR
OSA
Etapas de la técnica
Preparación de la Muestra
Preparación del gel
Preparación de las muestras con el buffer de carga
Carga de la muestra
Corrida del gel
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ELEC
TRO
FORE
SIS
EN G
EL
DE
AGAR
OSA
Ejercicio: como preparar un gel
de agarosaBromuro de tidio: 2μlADN: 10 μl
Buffer TBE 0,5X
𝑣1=400𝑚𝑙𝐶1=0,5 𝑋
𝐶2=5 𝑋
𝑣1∗𝐶1=𝑣2∗𝐶2
𝑣2=40𝑚𝑙
Agarosa 1% ---- gr
40 gr-------------100% X ------------- 1%
𝐶𝑎𝑔𝑎𝑟𝑜𝑠𝑎=0,4𝑔𝑟
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ELEC
TRO
FORE
SIS
EN G
EL
DE
POLI
ACRI
LAM
IDA
En la preparación del gel, la polimerización de los monómeros de acrilamida produce cadenas lineales. Al incluir bisacrilamida, ésta da lugar a puntos de ramificación en el polímero, lo que permite formar una matriz tridimensional, dando lugar al gel de poliacrilamida. El tamaño de los huecos o poros que forma la retícula del polímero depende de la concentración de acrilamida y del grado de entrecruzamiento
CARACTERÍSTICAS
DesnaturalizanteSDS - PAGE
No Desnaturalizante
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ELEC
TRO
FORE
SIS
EN G
EL
DE
POLI
ACRI
LAM
IDA
N, N, N, N´Tetrametilen-diamina
O Gaal y otros en 1984
PSA: Oxidante; TEMED: reductor
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Polimerización del gel acrilamida• Es sensible al oxígeno
Cubrir el “gel” con agua on-butanol durante lapolimerización previene elcontacto con el oxígeno, asícomo la formación de menisco
Se debe ajustar la cantidad de TEMED y PSA para que lapolimerización no tenga lugar demasiado deprisa, generando asídemasiado calor
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Gel “Stacking” (Empaquetador)
• Menor concentración de acrilamida• Tamaño de poro mayor• pH ácido-neutro
Función: acumular las proteínas a la entrada del gel separador para que salgan al mismo tiempo (“Salida Neutralizada”)
Gel “Separating” (Separador)
• Mayor concentración de acrilamida• Tamaño de poro menor• pH alcalino
Función: separar las proteínas
A mayor concentración del
gel menor es el poro.
0,75 mm grosor
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• El sistema de electroforesis a emplear dependede los objetivos a alcanzar, los más empleados son:
Sistemas de electroforesis
Gel uniforme y tampón homogéneo: la resolución es menor que con los sistemas heterogéneos, porque no hay efecto concentrador en la primera parte de la corrida. Rápidos y sencillos NO GEL EMPAQUETADOR
Gel y tampón heterogéneno: se varían el poro del gel y los iones del tampón, por lo que se puede concentrar la muestra SI GEL EMPAQUETADOR
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La teoría de fue formulada por Jovin.
límite de Kohlraush
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NO DESNATURALIZANTELAS PROTEÍNAS SE SEPARAN POR:
• CARGA ELÉCTRICA
• TAMAÑO y FORMAPuesto que utilizamos unascondiciones de pH alcalinas,la mayoría de las proteínas
van a estarCARGADAS NEGATIVAMENTE
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¿QUIÉN LLEGARÁ ANTES A LA META??
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• separa proteínas en estado nativo• las proteínas siguen siendo funcionales
• permite separar complejos proteicos o proteínas multiméricas como una unidad
• muchas proteínas no migran por no tener carga neta o se pierden por poseer carga neta positiva
• el proceso de separación es muy lento debido a la debilidad de la carga neta de las proteínas
• el proceso de separación no sólo está afectado por el tamaño sino también por la forma de la proteína
VENTAJAS
DESVENTAJAS
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Desnaturalizante (SDS – PAGE)
Se lleva a cabo en condiciones desnaturalizantes:
1.se emplea un agente reductor de puentes –s–s–
generalmente dtt (ditiotreitol) o b-mercaptoetanol
2.se emplea el detergente aniónico sds
(sodium dodecyl sulfate)
3. generalmente también se calienta la muestramuestra
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Los grupos alifáticos dodecil se colocan en el interior, mientras que los grupos sulfato en la superficie
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CÁTODO
ÁNODO
-
+
LAS PROTEÍNAS SE SEPARAN POR:
• TAMAÑO
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PreparaciónPara la preparación del gel separador o inferior (5 ml, grosor = 0,75 mm),
mezclar según el % deseado:
Iniciar la polimerización = add 3 ml de TEMED + 15 ml de persulfato de amonio a la mezcla. Inmediatamente mezclar y
verter la solución en los vidrios (molde), hasta 1/3
eliminar la curvatura (menisco) en la superficie, con una delgada capa (1-2 mm) de agua destilada o de isobutanol (dejar por 15-20 min)
Decantar el exceso de líquido,.
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Mezclar los componentes del gel superior (compactador).
Adicionar la mezcla , colocar el peine y dejar polimerizar.
Preparar las muestras. Estas se pueden analizar en estado reducido o no reducido, mezclándolas con el respectivo amortiguador de muestras..
Cargar las muestras: (5-15 ml, correspondiendo por ej. a 10-30 mg en el caso de mezclas complejas, o 3-10 µg en el caso de proteínas
purificadas).
.Llenar la cámara con el amortiguador de cámara (180 ml en el tanque inferior y 120 ml en el superior). Colocar el gel en la cámara y correr las muestras a 200 v (voltaje constante) hasta que el azul de bromofenol llegue casi al borde inferior del gel (45-60 min).
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Teñir el gel durante 1 hr con azul Coomassie R-250. Eliminar luego el exceso de colorante con varios cambios del decolorador.
Registrar los resultados por fotografía.
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• Separación rápida de las proteínas
• La separación no depende de la forma de la proteína nativa
• Se puede estimar el peso molecular de las proteínas
• Aunque desnaturalizadas, las proteínas pueden usarse para la fabricación de anticuerpos (en la mayoría de los casos)
• Las proteínas separadas están desnaturalizadas• no son funcionales
Ventajas
Desventajas
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BIBL
IOG
RAFÍ
AB . LOMONTE. Electroforesis en gel de poliacrilamida. Cap 13.pp 93.
FIERRO, Francisco. Electroforesis de ADN. Herramientas moleculares aplicadas en ecología.
Aaij C. y P. Borst. 1972. The gel electrophoresis of DNA. Biochimica and Biophysica Acta 269: 192-200.
ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA CON SDS “SDS-PAGE” . Disponible en: file:///D:/Mis%20Documentos/Downloads/practicas%20(1).pdf
GARCÍA. Hilda. Electroforesis en geles de poliacrilamida: fundamentos,actualidad e importancia. Laboratorios BETERÁ. 200
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GRACIAS!