7/18/2019 ELISA en El Diagnóstico Clínico

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ELISA en el diagnóstico clínico

La técnica ELISA es una técnica de inmuno-ensayo en la cual un antígeno inmovilizado se detecta

mediante un anticuerpo enlazado a una enzima capaz de generar un producto detectable, como

cambio de color o algún otro tipo; en ocasiones, con el in de reducir los costos del ensayo, nos

encontramos con !ue e"iste un anticuerpo primario !ue reconoce al antígeno y !ue a su vez es

reconocido por un anticuerpo secundario !ue lleva enlazado la enzima anteriormente mencionada#La aparici$n de colorantes permite medir indirectamente mediante espectrootometría el antígeno

en la muestra#

Se usa en muc%os laboratorios para determinar si un anticuerpo particular est& presente en una

muestra de sangre# Aun!ue el procedimiento es rutinario y sencillo, involucra a un gran número de

variables, tales como selecci$n de reactivo, temperatura, medici$n de volumen y tiempo, !ue si no

se a'ustan correctamente, puede aectar los pasos sucesivos y el resultado de la prueba#

Las cuatro ases de un ensayo ELISA son las siguientes(

)# *on'ugaci$n del anticuerpo o del antígeno con una enzima +pero"idasa, osatasa

alcalina##### .ni$n del antígeno +o del anticuerpo a los pocillos#/# 0ormaci$n de una o m&s capas de inmunocomple'os#1# 2evelado de la reacci$n enzim&tica#

Se %an desarrollado múltiples variantes de ensayos ELISA !ue permiten la cuantiicaci$n de un

antígeno en soluci$n, la detecci$n de un anticuerpo en una soluci$n o la determinaci$n de la

subclase de un anticuerpo# A continuaci$n se describen los m&s comunes#

• ELISA directo( es la orma m&s b&sica de realizar la técnica# *onsiste en recoger una

muestra a estudiar y ponerla en un pocillo +un recipiente pe!ue3o en rente de una

muestra igual pero contaminada con el germen a estudiar, y otra muestra en la !ue se

sabe !ue no %ay germen# Se aplica el anticuerpo con la enzima en los tres pozos y se

compara la muestra a estudio con las otras dos#

• ELISA indirecto( se realiza de orma similar al ELISA directo, pero en este caso se a3ade

primero un anticuerpo sin enzima y después uno con enzima# 4e esa orma, la se3al !ue

emite el enzima es muc%o m&s potente y la prueba es m&s sensible#

• ELISA s&nd5ic%( en este caso en los pocillos primero se a3ade un anticuerpo y después la

muestra, para !ue los antígenos !ueden ya retenidos en el ondo del pozo# 4espués se

a3ade el anticuerpo con la enzima# Es la orma m&s eicaz de realizar la prueba#

• ELIS678( se trata de un tipo de ELISA !ue permite conocer de orma cuantitativa el

antígeno, incluso identiica el número concreto de células donde se encuentra#

9i:ipedia

%ttp(es#5i:ipedia#org5i:iELISA

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9ebconsultas

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La reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

La reacci$n en cadena de la polimerasa, conocida como 6*2 por sus siglas en inglés, es una

técnica de biología molecular desarrollada en )?<> por ary Bullis #Su ob'etivo es obtener un gran

número de copias de un ragmento de A4C particular, partiendo de un mínimo; en teoría basta

partir de una única copia de ese ragmento original, o molde# Esta técnica sirve para ampliicar un

ragmento de A4C#

6ara realizar la técnica se necesitan(

• Los 1 deso"irribonucle$tidos-triosato +dC86#

• 4os cebadores o iniciadores +en inglés, primers#

• Iones divalentes# Se suele usar magnesio +BgD, agregado comúnmente como cloruro de

magnesio +Bg*l, actúan como coactores de la polimerasa#

• Iones monovalentes, como el potasio#

• .na soluci$n tamp$n o buer !ue mantiene el p adecuado para el uncionamiento de la

 A4C polimerasa#

•  A4C polimerasa o mezcla de distintas polimerasas con temperatura $ptima alrededor de

F= G* +la m&s común es la polimerasa 8a!#•  A4C molde, !ue contiene la regi$n de A4C !ue se va a ampliicar#

• 8ermociclador, el aparato !ue mantiene la temperatura necesaria en cada una de las

etapas !ue conorman un ciclo#

*onceptos de la 6*2

• Sensibilidad( se reiere a la cantidad mínima de A4C necesaria para !ue se produzca la

ampliicaci$n, es decir, para obtener una banda# Se relaciona con los alsos negativos, ya

!ue puede !ue una muestra sea positivas pero sea dada como negativa por!ue no se %a

ampliicado por no tener suiciente cantidad de A4C#

• Especiicidad( se reiere a la obtenci$n de un solo producto ampliicado# Hiene determinada

por los oligos y la especiicidad con la !ue se unen al A4C molde# 4e esta orma, si losoligos tienen m&s de un sitio al !ue se pueden unir aparecer& m&s de un producto

ampliicado#

• Eiciencia( se reiere a la ampliicaci$n m&"ima !ue se puede obtener en un número

determinado de ciclos#

• 0idelidad( se reiere a los errores !ue comete la A4C polimerasa durante la ampliicaci$n#

Este concepto es de especial importancia en la secuenciaci$n, pero en otros casos no es

tan importante# .na buena idelidad permite evitar alsos positivos yo negativos#

Se %an dise3ado 6*2 m&s especíicas !ue se pueden elegir según sea la muestra a estudio# Los

dierentes tipos de 6*2, adem&s de la b&sica, son(

• 6*2 anidada( consigue ampliicar muestras mínimas de A4C a miles de millones deragmentos# Es capaz por lo tanto de detectar trazos minúsculos#

• 6*2 in situ( permite la detecci$n de A4C en el mismo lugar de la muestra, sin tener !ue

procesarla primero con técnicas de laboratorio# Se suele utilizar para biopsias o raspados

de células#

• 6*2 múltiple( con este tipo de 6*2 se consiguen detectar varios trazos de A4C a la vez y

con una sola muestra#

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• 6*2 con transcriptasa inversa( en este caso se utilizan cadenas de A2C para detectar

moldes de A4C# Se utiliza la enzima transcriptasa inversa, la misma !ue utiliza el HI entre

otros virus#

• 6*2 en tiempo real o 6*2 cuantitativa( se a3ade un componente luorescente !ue permite

medir la luz# A m&s luz, m&s cantidad del A4C detectado#

9i:ipedia

%ttp(es#5i:ipedia#org5i:i2eacci*/J/nKenKcadenaKdeKlaKpolimerasa

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%ttp(555#5ebconsultas#compruebas-medicaspcr-)/??

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Comparación con la técnica de ELISA

El 6*2 puede determinar tanto si el virus e"iste como si el sistema inmunol$gico est& totalmente

anulado y es incapaz de producir anticuerpos# Co suele emplearse como un test de rastreo, sino

para conirmar otro test o en los an&lisis de la autopsia#

ELISA no puede determinar el material genético# En cambio, puede mostrar si el sistema

inmunol$gico del individuo %a detectado un elemento e"tra3o ante el cual %a generado anticuerpos,

como ocurre en el caso de un virus invasor# 4e modo !ue ELISA busca los anticuerpos, no el

material genético# *onviene utilizarlo como test de rastreo, ya !ue puede detectar si el individuo se

%a encontrado e"puesto a algún virus antes de !ue se maniieste ningún síntoma e"terno de

enermedad# El individuo generar& gran número de anticuerpos incluso si e"iste apenas una

pe!ue3a cantidad de invasores# Sin embargo, este test no resulta útil en un estado de enermedad

muy avanzada, cuando el sistema inmunol$gico probablemente ya %a sido destruido por la

enermedad, ni como conirmaci$n en una autopsia, por!ue los da3os irreversibles del sistema

inmunol$gico conllevan la ausencia total de anticuerpos, de modo !ue el ELISA no podr& encontrar 

ningún anticuerpo +en esta situaci$n, por el contrario, el test 6*2 puede localizar muc%os

invasores#

angorasturcos#es

%ttp(555#angorasturcos#esvetelK6*2#%tm

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Hibridaciones tipo Soutern! "ortern # $estern%

La %ibridaci$n de &cidos nucleicos +A4C o A2C es un proceso por el cual se combinan dos

cadenas de &cidos nucleicos antiparalelas y con secuencias de bases complementarias en una

única molécula de doble cadena, !ue toma la estructura de doble %élice, donde las bases

nitrogenadas !uedan ocultas en el interior# Esto %ace !ue si irradiamos la muestra con la longitud

de onda a la !ue absorben estas bases +>= nm, la absorci$n de energía ser& muc%o menor si la

cadena es doble !ue si se trata de la cadena sencilla, ya !ue en esta última los dobles enlaces de

las bases nitrogenadas, !ue son las !ue captan la energía, est&n totalmente e"puestos a la uente

emisora de energía#

• Si se trata de proteínas, la técnica se llama 9estern blot# Se utilizan anticuerpos marcados

con radioactividad para identiicar cu&l es la banda !ue presenta la proteína !ue meinteresa localizar#

• Si se trata de 4CA, la técnica se llama Sout%ern blot# Se utilizan sondas de 4CA

+moléculas de 4CA marcadas con radioactividad y con una secuencia conocida para

identiicar !ué bandas del gel contienen secuencias complementarias a la de la sonda

• Si se trata de 2CA, la técnica se llama Cort%ern blot# Se utilizan sondas de 2CA

+moléculas de 2CA marcadas con radioactividad y con una secuencia conocida para

identiicar !ué bandas del gel contienen secuencias complementarias a la de la sonda#

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9i:ipedia

%ttp(es#5i:ipedia#org5i:iibridaci*/J/nK<biolog*/A4aKmolecular?

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Slides%are

%ttp(es#slides%are#net*arolinaerrera)@)undamentos-de-tcnicas-blotting-sout%ern-nort%ern-

5estern

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Secuenciación de A&"

La secuenciaci$n del A4C es un con'unto de métodos y técnicas bio!uímicas cuya inalidad es la

determinaci$n del orden de los nucle$tidos +A, *, y 8 en un oligonucle$tido de A4C# La

secuencia de A4C constituye la inormaci$n genética %eredable !ue orma la base de los

programas de desarrollo de los seres vivos +de procariotas, de eucariotas en el núcleo celular, y en

los pl&smidos, en la mitocondria y en cloroplastos de las plantas# Así pues, determinar lasecuencia de A4C es útil en el estudio de la investigaci$n b&sica de los procesos biol$gicos

undamentales, así como en campos aplicados, como la investigaci$n orense# Adem&s, se puede

utilizar la secuenciaci$n del A4C para conocer las mutaciones som&ticas, como las sustituciones

de bases, generadas entre distintos organismos#

9i:ipedia

%ttp(es#5i:ipedia#org5i:iSecuenciaci*/J/nKdelKA4C

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