ENZIMAS EN LA INDSTRIA ALIMENTAR IAAutores:MIGUEL NGEL CERN GONZLEZ. CLAUDIA SALAMANCA. JOHAN CHRISTIAN MARTANUNIVERSIDAD DEL VALLE CALI COLOMBIA 2009CER?N ET ALENZIMAS EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIAPara consultas o comentarios, ponerse en contacto con: Miguel ngel Cern Gonzlez e-mail: miancego@yahoo.esLas opiniones expresadas no son necesariamente opiniones de ReCiTeIA, de sus rganos o de sus funcionarios.Edicin: 2009 ReCiTeIA. Cali Valle Colombia e-mail: reciteia@live.com url: http://revistareciteia.es.tl/ReCiTeIA - v.9 n.1CER?N ET ALENZIMAS EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIAEnzimas en la industria alimentariaMiguel ngel Cern Gonzlez, Claudia Salamanca, Johan Christian Martan. Universidad del ValleRESUMENEste trabajo presenta las enzimas como un amplio tema, de gran importancia en reas como la ingeniera de los alimentos, la qumica, la biotecnologa y la bioqumica. El presente trabajo abarca de manera global el conocimiento sobre enzimas, y se tocan temas entre los cuales se nombran: propiedades generales, nomenclatura, actividad enzimtica, cintica de las reacciones enzimticas, inmovilizacin, y utilizacin e importancia de las enzimas en la industria alimentaria. Se presenta informacin relevante en el tema, de manera que le brinde al lector informacin clara e interesante en el campo de las enzimas con el objetivo que le permita conocer ampliamente del tema o reforzar sus conocimientos en el mismo. Palabras claves: Enzimas / Industria alimentariaTABLA DE CONTENIDO INDICE GENERAL. Pag. RESUMEN. ..................................................................................................................... 3 INTRODUCCIN. ............................................................................................................ 5 1. PROPIEDADES GENERALES DE LAS ENZIMAS. .............................................. 6 2. NOMENCLATURA DE LAS ENZIMAS. ................................................................. 8 2.1 Enzimas Microbianas. ............................................................................... 10 3. PROCEDENCIA COMERCIAL DE LAS ENZIMAS. ........................................... 14 4. EXTRACCION Y PURIFICACION DE ENZIMAS. ............................................. 16 4.1 Extraccin Enzimtica. .................................................................................... 17 4.2 Purificacin Enzimtica. .................................................................................. 20 5. ESPECIFICIDAD ENZIMATICA. ............................................................................ 23 6. FACTORES QUE AFECTAN LA ACTIVIDAD ENZIMTICA. ........................... 25 6.1 Efecto del pH. ................................................................................................... 25 6.2 Efecto de la Temperatura. .................................................................................. 27 6.3 Efecto de la Concentracin de Sustrato. ............................................................ 30 6.4 Efecto de la Actividad de Agua. ........................................................................ 31 6.5 Efecto de otros Agentes en la Actividad Enzimtica. ........................................ 32 7. CINTICA DE LAS REACCIONES ENZIMTICAS. ............................................. 34ReCiTeIA - v.9 n.1CER?N ET ALENZIMAS EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIA8.INMOVILIZACIN DE ENZIMAS. .......................................................................... 38 8.1 Efectos De La Inmovilizacin Sobre La Actividad Enzimtica. ........................ 40 9. IMPACTO ACTUAL EN LA TECNOLOGA DE ALIMENTOS. ............................ 40 10. UTILIZACIN DE LAS ENZIMAS EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIA. ......... 42 10.1 Enzimas De Importancia En Alimentos. ................................................................ 44 11. ASPECTOS PARA POSIBLES INVESTIGACIONES. ............................................ 46 12. CONCLUSIONES. ....................................................................................................... 47 13. BIBLIOGRAFIA. .......................................................................................................... 48 INDICE DE TABLAS. 1. Tabla 1. Compuestos utilizados en tampones de extraccin. ..................................... 20 2. Tabla 2. Caractersticas de algunos cofactores enzimticos. ....................................... 33 3. Tabla 3. Ejemplos de los valores de las constantes catalticas para varias enzimas algunas con ms de un sustrato. ............................................................................................. ... 38 4. Tabla 4 Algunas de las aplicaciones de enzima en la industria de los alimentos. .... ... 44 NDICE DE IMGENES. 1. Figura 1. Secrecin co-tradicional de las protenas bacterianas. ............................. .... 13 2. Figura 2. Secrecin y procesamiento de enzimas en eucariotas. ............................. .... 14 3. Figura 3. Efecto del pH en la actividad enzimtica. ................................................. ... 26 4. Figura 4. Efecto de la temperatura en la actividad cataltica de las enzimas. ......... ..... 28 5. Figura 5. Inactivacin trmica de la polifenol oxidasa de la remolacha sometida a incubacin a diferentes temperaturas. ....................................................................... ... 29 6. Figura 6. Efecto de la concentracin del sustrato en la velocidad de reaccin de las enzimas. ...................................................................................................................... .. 30 7. Figura 7. Velocidad de reaccin enzimtica con respecto a la concentracin de enzima.36 8. Figura. 8 .Mtodos comunes de inmovilizacin de enzimas. ..................................... ... 39ReCiTeIA - v.9 n.1CER?N ET ALENZIMAS EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIAEnzimas en la industria alimentariaINTRODUCCIN. Garcia, Quintero, Lpez-Munguia (2004) explica que: Hoy en da la tecnologa enzimtica ocupa un lugar importante dentro de la biotecnologa y especficamente dentro del sector alimentario. Alrededor de un 65% de las enzimas que se producen industrialmente estn de una u otra manera relacionadas con la industria alimentaria, aunque es conveniente sealar que solo las proteasas alcalinas empleadas en detergentes ocupan 25% del total de esta distribucin, el 10% restante corresponde a aplicaciones en las reas farmacutica y analtica. Desde un enfoque histrico podemos retroceder hasta 1883, cuando Payen y Persoz observaron que un precipitado al alcohol de extracto de malta poda, una vez redisuelto, transformar al almidn en azcar. Ms tarde, en 1878, Kuhne adopto el trmino "enzima", del griego "en la levadura". Lus Pasteur distingui dos tipos de actividades, "fermentos organizados" y "no organizados", que se referan a las enzimas asociadas a las clulas y a las extracelulares, respectivamente. Dentro de este periodo destacan los trabajos de Fischer sobre la complementariedad entre enzima y sustrato (1890) y de Vctor Henri y Leonor Michaelis (1900-1920) sobre cintica enzimtica. Entre 1930 y 1940, Kunitz y Northrop confirmaron la naturaleza proteica de las enzimas, cristalizando las proteasas del sistema digestivo (afortunadamente sin requerimiento de cofactores o metales, lo que hubiese retardado aun mas el desarrollo). Badui, (2006) expone: Una enzima es una protena que acta como catalizador biolgico, llevando a cabo reacciones bioqumicas a muy altas velocidades, no se consume durante la reaccin y en general presenta un elevado grado de especificidad.ReCiTeIA - v.9 n.1CER?N ET ALENZIMAS EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIAEn el sector alimentario, el inters actual de la aplicacin de enzimas en procesos de la tecnologa enzimtica se enfoca a la conservacin de alimentos o de sus componentes (por ejemplo, vitaminas), como tambin en algunos cambios qumicos que sufren los alimentos, cambios que pueden resultar beneficioso (maduracin de frutas) o perjudiciales (oxidacin de cidos grasos y oscurecimiento enzimtico), As mismo el uso ms eficiente de materias primas y el mejoramiento de la calidad sensorial de los alimentos (textura y sabor) se han utilizado enzimas para producir alimentos bajos en caloras y eliminar compuestos antinutricionales de ciertas materias primas. Debido a su naturaleza qumica, a las enzimas les afectan los mismos factores que alteran a las protenas; por esta razn, para actuar en forma optima, cada una requiere de ciertas condiciones de temperatura, de pH, de fuerza inica, etc.; condiciones en las que la estructura tridimensional es estable y la carga optima para interactuar con el sustrato. En la actualidad existen ms de 2000 enzimas perfectamente caracterizadas y registradas, la mayor parte son enzimas responsables de su funcionamiento integral, todas ellas separables analticamente y conocidas desde un punto de vista qumico, fisicoqumico y cintico. (Garca et al 2004).1. PROPIEDADES GENERALES DE LAS ENZIMAS. Conn, (1996) explica: A principios del presente siglo, las reacciones catalizadas por enzimas eran ya tema de anlisis matemticos, pero no fue sino hasta la dcada de 1920 que la naturaleza protenica de las enzimas se hizo evidente. Este resultado se debi a la cristalizacin de la enzima ureasa (que hidroliza la urea) por Sumner y varias enzimas hidrolizantes de protenas por Northrop. Se demostr que las preparaciones de enzimas tenan una relacin constante de actividad enzimtica respecto a la masa de protena a travs deReCiTeIA - v.9 n.1CER?N ET ALENZIMAS EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIAcristalizaciones mltiples, dando pruebas firmes de que las molculas de protena, en vez de constituir un contaminante, son los catalizadores reales. Como el ejemplo de la ureasa, las enzimas y grupos de enzimas se nombran en general agregando el sufijo -asa al nombre o nombre abreviado del compuesto sobre el cual acta la enzima. Las enzimas que causan la ruptura de la cadena polipeptidica al reaccionar con agua se conocen, como grupo, como proteinasas. Las peptidasas muestran una especificidad similar, pero facilitan la hidrolisis de los pptidos ms eficazmente que la hidrolisis de las molculas de protena de mayor tamao y que presentan un plegamiento compacto. Se considera que todas estas enzimas son miembros de un grupo ms grande: el de las "hidrolasas", enzimas que rompen los enlaces por la incorporacin de una molcula de agua. Aunque el sufijo -asa se utiliza ahora ampliamente, muchas de las enzimas ms estudiadas y que se descubrieron primeramente no se nombran de esta forma. Equilibrio (a favor de los productos). 1. Direccin en la cual la reaccin catalizada por la enzima puede analizarse fcilmente in vitro (del sustrato al producto). 2. bien, la direccin probable que sigue la reaccin predominante in vivo (formacin neta de los compuestos que son designados como productos). Los dos ltimos puntos no solo dependen de la constante de equilibrio, sino tambin de las concentraciones relativas de los sustratos y los productos. Las enzimas aumentan la rapidez o velocidad de las reacciones qumicas. En algunos casos, la rapidez de una reaccin particular catalizada por enzimas es tan baja en ausencia de la enzima que no puede detectarse ante la gama de reacciones con las cuales compite. Como todos los catalizadores, una enzima funcionara a una concentracin molar mucho menor que la del(los) reactivo(s) sobre el(los) cual(es) funciona. En estas condiciones, la enzima no altera el equilibrio de la reaccin, y un mol de enzima facilita la conversin de muchos moles del reactivo en producto.ReCiTeIA - v.9 n.1CER?N ET ALENZIMAS EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIAComparadas con la mayora de los catalizadores, las enzimas son especialmente eficaces. Son eficientes, catalizan reacciones a altas velocidades a temperaturas moderadas y en condiciones benignas, haciendo que los extremos de pH, presin, etc. sean innecesarios. Las enzimas son tambin catalizadores particularmente especficos y suelen actuar sobre slo una forma de un compuesto pticamente active aun cuando este se encuentre en una mezcla de formas quirales. Muchas enzimas presentan tambin la capacidad de acoplar dos reacciones qumicas que tienen reactivos y productos muy distintos. Esto permite que una reaccin que no es energticamente favorecida se acople a otra reaccin que si lo es, de modo que se alcance un grado de conversin razonable en el caso de la primera reaccin. Por ultimo, muchas enzimas son controladas en cuanto a su eficiencia cataltica por las concentraciones del sustrato o producto. Tambin pueden ser controladas por compuestos metablicamente importantes que no se asemejen ni a los sustratos ni a los productos de la enzima. Esta propiedad, que es de gran importancia para la regulacin del metabolismo, se denomina "alosterismo. 2. NOMENCLATURA DE LAS ENZIMAS. Badui, (2006) argumenta que: En general se ha nombrado a las enzimas de manera emprica y poco sistemtica; ya que en algunos casos se ha tornado como raz del nombre el del sustrato que reconoce la enzima y se le agrega el sufijo - asa. Por ejemplo, a una enzima que degrada protenas se le llama proteinasa o proteasa. Algunas enzimas tienen nombres asignados antes de adoptar esta conversin, por ejemplo, tripsina, papana, invertasa, diastasa. Posteriormente, hubo la necesidad de asignarles un nombre sistemtico. Miembros de la IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry) y del IUB (International Union of Biochemistry) y posteriormente de la IUBMB (International Union of Biochemistry and Molecular Biology) idearon un sistema de identificacin en el que a cada enzima se le asigna una serie de cuatro dgitos, al que se ha llamado numero de la EC (Enzyme Comission). El primer digito esta correlacionado con la reaccin qumica que cataliza la enzima, de acuerdo al siguiente cdigo:ReCiTeIA - v.9 n.1CER?N ET ALENZIMAS EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIA1. Oxidorreductasas: Catalizan reacciones de oxidorreduccin. En este grupo se incluyen las deshidrogenasas, oxidasas, oxigenasas y peroxidasas. 2. Transferasas: Promueven la transferencia de distintos grupos qumicos entre una molcula donadora y una aceptora. Dentro de las ms estudiadas se incluye a las glicosil transferasas amino transferasas y fosfo transferasas. 3. Hidrolasas: Llevan a cabo la ruptura de enlaces covalentes con la introduccin de una molcula de agua. Las enzimas hidrolticas (que incluyen a las amilasas, esterasas, glicosidasas, lipasas y proteasas, entre otras) son las que se utilizan, con mayor frecuencia, como aditivos en la industria alimentaria. 4. Liasas: Rompen enlaces para la eliminacin de un determinado grupo qumico del sustrato y forman dobles ligaduras sin la introduccin de molculas agua. Entre ellas se encuentran: aldolasas, descarboxilasas, deshidratasas y pectina liasa. 5. Isomerasas: Catalizan el rearreglo espacial de grupos del sustrato sin modificar su composicin qumica; y son: epimerasas y racemasas. 6. Ligasas: Promueven la unin covalente de dos molculas acopladas con la ruptura de un enlace pirofosfato proveniente de ATP, UTP o CTP, como fuente de energa. El termino ligasa es sinnimo de sintetasa. El segundo digito de la nomenclatura corresponde a la subclase de enzima, por ejemplo, en el caso de las hidrolasas se refiere al tipo de enlace que hidroliza: el 3.1 de enlaces ester, el 3.2 de enlaces glucosdicos, el 3.4 de enlaces peptdicos, etc.. El tercer digito es una subdivisin y ofrece ms informacin con respecto al sustrato que utiliza la enzima. Por lo tanto, si se tiene una hidrolasa de uniones ester (3.1), el tercer nmero indicara si se trata de un enlace ester carboxlico (3.1.1), tioster (3.1.2), monofosfato (3.1.3), etc... Finalmente, el cuarto digito indica el nmero serial de la enzima en el grupo correspondiente. Los seis grupos de enzimas indicados corresponden a reacciones importantes en el metabolismo celular; no todas de igual importancia para la industria, el procesamiento o el deterioro de alimentos. Es claro que el grupo de enzimas mas importante, en trminos deReCiTeIA - v.9 n.1CER?N ET ALENZIMAS EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIAsu aplicacin en la tecnologa de alimentos, es el de las hidrolasas. En trminos econmicos y de volumen de enzimas producidas y aplicadas en la industria de la panificacin y en el procesamiento de almidn sobresalen las amilasas; las proteasas sobresalen en varios procesos como son: la elaboracin de cerveza, de pan, el ablandamiento de carne y la produccin de hidrolizados protenicos. Actualmente existe tambin una clasificacin de enzimas por familias y basada en su estructura. 2.1 ENZIMAS MICROBIANAS. Gacesa y Hubble, (1990) explican: Que los microorganismos producen una enorme gama de enzimas potencialmente tiles, muchas de las cuales son segregadas al exterior celular. Por otra parte, son capaces de desarrollarse fcil y rpidamente en su medio de cultivo y la tecnologa al respecto, a gran escala, se encuentra hoy bien establecida. Las enzimas extracelulares poseen tres ventajas. 1. Dado que la molcula es segregada fuera de la clula, no se requieren tcnicas de ruptura celular, tcnicas que a veces son difciles de aplicar a gran escala. 2. El nmero de protenas que se segregan es limitado y por eso es relativamente fcil aislar una enzima concreta a partir de la mezcla. Contrariamente a todo ello, las enzimas intracelulares se han de separar a partir de una mezcla amplia de sustancias, que incluye otras protenas y materiales contaminantes, tales como los cidos nuclicos, por ejemplo. 3. Las enzimas extracelulares suelen presentar una estructura ms compacta y son menos susceptibles a la desnaturalizacin que las correspondientes intracelulares. En consecuencia, los microorganismos particularmente los que segregan enzimas son la materia prima preferente del enzimlogo industrial. Convencionalmente se define a las enzimas extracelulares como aquellas que han cruzado la membrana celular. Es importante establecer este concepto, porque los microorganismos poseen una variedad de estructuras del tipo de la pared celular y en muchos casos la enzima extracelular se encuentra asociada a ellas y no liberada al medio de cultivo.ReCiTeIA - v.9 n.1CER?N ET ALENZIMAS EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIADavis y Tai (Citado en Gacesay Hubble, 1990) durante su sntesis en el interior de la clula bacteriana, ciertas protenas son reconocidas como molculas destinadas a la exportacin mediante la presencia de un pptido serial N-Terminal. Estas enzimas extracelulares se sintetizan parcialmente en los ribosomas libres del citosol, antes de que el complejo (dirigido por el pptido serial) se asocie a la membrana celular. La biosntesis de la enzima prosigue a continuacin, mientras se produce la secrecin de la cadena peptdica en crecimiento (secrecin cotranslacional). El pptido N-Terminal es separado, durante el proceso de secrecin, por medio de una proteinasa ligada a la membrana (Fig. 1). Walter et al (Citado en Gacesa y Hubble, 1990) el proceso de secrecin descrito para las bacterias es esencialmente idntico para los hongos y otros eucariotas. Sin embargo, la cadena peptdica es introducida durante su sntesis en el lumen del retculo endoplasmtico, en vez de ser dirigida hacia la membrana citoplasmtica Desde dicho lumen, la enzima es procesada a travs del aparato de Golgi (Fig. 2) y, finalmente, es exportada en vesculas hacia la membrana celular. Esta complejidad extra del proceso en las clulas eucariotas permite que las enzimas segregadas sean modificadas extensamente durante su paso a travs del retculo endoplasmtico y aparato de Golgi. Freedman y Hawkins (Citado en Gacesa y Hubble, 1990) las modificaciones postranslacionales que pueden incluir glucosilaciones, separacin de pequeos fragmentos peptdicos, introduccin de puentes disulfuro y muchas otras posibilidades suelen tener una influencia importante sobre la estabilidad y propiedades de la enzima. Debe advertirse que, aunque ste es el mecanismo general que opera en los eucariotas, existen ejemplos de ciertos hongos que carecen de aparato de Golgi convencional, en esos organismos el mecanismo de secrecin es desconocido. Las bacterias y los hongos estn rodeados por paredes celulares integradas respectivamente por peptidoglucanos y por complejos de glucano/quitina en unin (1 -> 3). Cuando la enzima ha sido segregada, lo habitual es que pueda difundir libremente a travs de la pared celular y, en el caso de los hongos y bacterias Gram positivas, llegar al medio externo. Alternativamente, algunas enzimas permanecen asociadas a estructuras de la membrana o laReCiTeIA - v.9 n.1CER?N ET ALENZIMAS EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIApared celular. En las bacterias Gram negativas la secrecin de enzimas es ms compleja, debido a la presencia de una membrana externa; por esa causa las enzimas segregadas son retenidas a menudo en el espacio periplsmico (que est situado entre la pared celular y la membrana interna), en vez de ser liberadas al medio de cultivo. Esta membrana extra y la diferente localizacin de las protenas ha restringido el uso de los microorganismos Gram negativos para la obtencin de enzimas extracelulares; de hecho, la nica enzima relevante producida por una bacteria Gram negativa es la pullulanasa, de la Klebsiella pulmoniae.Figura 1. Secrecin co-tradicional de las protenas bacterianas.ReCiTeIA - v.9 n.1CER?N ET ALENZIMAS EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIAFigura 2. de DeDuve (Citado en Gacesa y Hubble, 1990). Secrecin y procesamiento de enzimas en eucariotas. En la parte derecha del diagrama se muestra el itinerario y los procesamientos correspondientes a la secrecin de protenas, desde su sntesis por los ribosomas ligados a membrana hasta su descarga exocitosica. En la parte izquierda se observa que una proteina integral de la membrana que ha sido sintetizada en el vehculo endoplasmico utiliza la misma va para llegar a su destino.3. PROCEDENCIA COMERCIAL DE LAS ENZIMAS. Webb, (Citado en Gacesay Hubble , 1990 ) la edicin ordinaria de la International Union of Biochemistry Handbook of Enzyme Nomenclature comprenda casi 2.500 reacciones diferentes catalizadas por enzimas, las cuales han ido apareciendo en la literatura cientfica. Esta cifra subestima el nmero total de enzimas descubiertas, ya que es frecuente la existencia de una multiplicidad de protenas con propiedades ligeramente distintas catalizando una misma reaccin. De estas 2000 enzimas tipo, alrededor del 15 % son asequibles a travs de los proveedores de productos bioqumicos, en cantidades que oscilan entre los microgramos y kilogramos; son suministradas, esencialmente, para propsitos de investigacin.ReCiTeIA - v.9 n.1CER?N ET ALENZIMAS EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIAGodfrey y Reichelt (Citado en Gacesa y Hubble, 1990), sin embargo, solo unas 40-50 enzimas son fabricadas a escala industrial, es decir, en cantidades que van desde multikilogramos a toneladas anuales. Esta cincuentena de enzimas es producida a partir de microbios, plantas o animales y catalizan, en general, reacciones hidrolticas simples. Gacesa y Hubble (1990) explica: La posibilidad de emplear las enzimas para procesos biosintticos que requieran coenzimas todava constituye un reto importante para la industria, aunque su logro ser ampliamente compensado desde el punto de vista econmico. La mayora de las enzimas que son comercialmente importantes se produce a partir de un nmero limitado de microorganismos. Las especies mas tiles al respecto se han establecido, sobre todo, a partir de las ya conocidas; estas suelen ser las que se emplean en las industrias alimentarias o las que se encuentran, como contaminantes inofensivas, en los comestibles. Tradicionalmente se han obtenido pocas enzimas de origen animal (por ejemplo, lipasa pancretica y tripsina) debido a que estas pueden ser reemplazadas por otras similares derivadas de microorganismos. Sin embargo, los sustitutos microbianos, aunque catalticamente eficaces, presentan sutiles diferencias en sus propiedades que pueden ser cruciales en el proceso de su aplicacin. Los recientes avances en este campo han permitido la adaptacin de las tcnicas del ADN recombinante para posibilitar que ciertos genes de mamferos sean clonados en las bacterias o levaduras idneas, facilitando as la produccin de enzimas originariamente de animales por medio de la tecnologa convencional de la fermentacin. Las plantas tambin han sido fuente tradicional de un cierto nmero de enzimas. A partir del ltex producido por la papaya, higuera, pia y (en menor grado) otras especies, se ha aislado, sobre todo, cistein-proteinasas. Estas plantas tienen la ventaja de que su ltex es fcil de obtener, principalmente a partir de los frutos y utilizando mano de obra no calificada. Por regla general el ltex se deja secar al sol y, si es necesario, puede incluso usarse como preparacin enzimtica cruda.ReCiTeIA - v.9 n.1CER?N ET ALENZIMAS EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIALa cebada malteada constituye otra fuente principal de enzimas vegetales. La industria cervecera ha utilizado tradicionalmente este material crudo para extraer varias proteinasas y glucohidrolasas. En trminos globales, la cebada malteada contribuye de manera relevante al mercado de enzimas. Por otra parte, se han llevado a cabo estudios sobre la produccin de enzimas a partir de cultivos de clulas animales o vegetales. En la actualidad se encuentran bien establecidas las condiciones tcnicas para el crecimiento de estas clulas en grandes cantidades. Sin embargo, desde el punto de vista econmico parece poco probable que en el futuro inmediato lleguen a convertirse en una fuente importante de enzimas. El problema esencial es que el crecimiento de estas clulas es lento y por ello es difcil mantener su esterilidad. En general se considera que para que una enzima obtenida por cultivo celular sea viable econmicamente debe tener un valor intrnseco mil veces superior al producto equivalente elaborado mediante la fermentacin microbiana clsica. La consecuencia principal derivada de la problemtica que plantea el uso de productos de origen vegetal o animal es que los microorganismos contaminan, siendo la fuente primaria de las enzimas industriales. 4. EXTRACCIN Y PURIFICACIN DE ENZIMAS. Colowick y Kaplan,; Scopes, (Citado en Gacesa y Hubble , 1990 ) la extraccin y la purificacin de una enzima presentan al enzimologo frente a una paradoja. Normalmente, es necesario para aislar cada una de las enzimas un proceso de purificacin diferente; sin embargo, existen relativamente un nmero escaso de tcnicas que permiten la separacin de protenas. No obstante, mediante el uso secuencial de un nmero de estas tcnicas y para la explotacin de las utilidades implicadas en la metodologa, ha sido posible aislar un nmero elevado de enzimas en estado puro o prcticamente puro. Uno de los objetivos de este capitulo es el ilustrar los principios esenciales de la purificacin enzimtica e indicar algunas consideraciones sobre el proceso para cuantificar el grado de pureza del producto final. En este punto es necesario preguntarse cuando existe una necesidad para la purificacin completa de una enzima. Esto ha llegado a ser casi axiomtico en bioqumica ya que si una enzimaReCiTeIA - v.9 n.1CER?N ET ALENZIMAS EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIApresenta una elevada importancia entonces, de entrada, ella debera ser purificada hasta homogeneidad (Gacesay Hubble, 1990). Bonnerjea et al, (citado en Gacesa y Hubble, 1990) sin embargo, para muchos propsitos biotecnolgicos esto no es necesario y una amplia variedad de procesos resultaran antieconmicos si la enzima fuese completamente pura. Para la mayora de las aplicaciones probablemente es suficiente un menor grado de purificacin aunque existan algunas actividades contaminantes que no afecten al sustrato(s), al producto(s) o a las enzima(s) involucradas en un proceso especfico. Se ha ideado un nmero amplio de procesos de purificacin para el aislamiento de protenas y diversas enzimas se han purificado satisfactoriamente mediante el uso de ms de un proceso. Los procedimientos de purificacin enzimtica, aunque a primera vista parecen complejos, pueden ser reducidos a una aplicacin secuencial de un nmero mnimo de mtodos simples. En primer lugar ser considerada la extraccin y purificacin a nivel de laboratorio, y posteriormente se describir el proceso a una escala superior. 4.1 EXTRACCION ENZIMATICA. Gacesa y Hubble, (1990) expone: En primer lugar y como mas importante o principal se debe obtener un extracto adecuado del tejido que contiene la enzima. En el caso de muchas enzimas hidroliticas sencillas de origen microbiano, la protena se libera en el medio de cultivo y se separa de las clulas mediante centrifugacin siendo esta la nica etapa necesaria. Esta tcnica es particularmente adecuada para trabajos con bacterias Gram-positivas tales como el Bacillus subtilis (pro-ductor de la proteasa, subtilisina) y en menor grado para organismos gram-negativos como la Klebsiella pneumoniae (productora de la a-1-6 glucosidasa, pululanasa). Sin embargo, la presencia de una membrana externa en organismos Gramnegativos puede conducir a complicaciones y quizs solamente se libere parcialmente la enzima en el medio. En algunos microorganismos eucarioticos, como en el caso de la levadura Kluyveromyces marxianus, la enzima puede localizarse en la parte externa de la membrana celular pero no se libera en el medio de crecimiento. Frecuentemente, la liberacin de la enzima implicaReCiTeIA - v.9 n.1CER?N ET ALENZIMAS EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIAuna destruccin parcial o total de la clula. Por ejemplo, la inulinasa (enzima semejante a la invertasa que degrada a B2 -1 polifructosanos, p.e. inulina) de K. marxianus puede liberarse desde la superficie de la levadura por autolisis de las clulas a 50 C durante 14 horas. Para la obtencin de enzimas intracelulares a partir de microorganismos se pueden producir problemas mayores que los descritos anteriormente. Las tcnicas de lisis celular como es el caso de la disrupcin mecnica (Presin celular, molido con almina), sonicacin tratamiento con detergentes y choque osmtico son entre otros los que se han utilizado como ms adecuados para liberar las enzimas intracelulares. Sin embargo, el extracto enzimtico, contiene, en estos casos, muchos otros componentes celulares y estos sern reconocidos cuando se determinen en las etapas posteriores de la purificacin. En particular, las clulas bacterianas lisadas liberan cantidades superiores de cidos nucleicos, por ello una de las primeras etapas en los procesos de purificacin estn encaminados a la eliminacin de este contaminante. Las tcnicas que se usan para la extraccin de enzimas a partir de tejidos de animales son, en conjunto, similares a las empleadas para la obtencin de enzimas intracelulares de microorganismos eucariontes (p.e levaduras). La homogenizacin del tejido seleccionado en una solucin tampn adecuada es la tcnica ms ampliamente utilizada. Como segundo paso se utiliza, a menudo, la centrifugacin diferencial para seleccionar la subfraccin celular o el orgnulo apropiado. El aislamiento de un orgnulo especfico puede que por si mismo proporcione una purificacin considerable de la enzima, aunque a gran escala esto no pueda realizarse de manera prctica. La extraccin de enzimas a partir de tejidos vegetales presenta un nuevo conjunto de problemas y el numero comparativamente pequeo que han sido aisladas es en parte un reflejo de las dificultades que se van a presentar. Las paredes celulares vegetales son un reto importante para el enzimlogo. Las fuerzas necesarias para destruir esta barrera celular son tan elevadas como para provocar generalmente, durante los procesos, la desnaturalizacin de las enzimas deseadas. Adems, muchos vegetales contienen compuestos fenlicos que son oxidados enzimticamente (polifenol oxidasas) por laReCiTeIA - v.9 n.1CER?N ET ALENZIMAS EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIApresencia de oxigeno molecular formando productos que pueden inactivar rpidamente un numero elevado de enzimas. Sin embargo, existen diversos ejemplos de enzimas tiles que han sido obtenidas a partir de plantas por mtodos sencillos mediante procesos biotecnolgicos, las proteasas bromelaina (pina) y papaina (papaya). El pH, la fuerza inica y la composicin del medio que se utiliza para la extraccin de una enzima son de gran importancia en este proceso y en las etapas posteriores de la purificacin. Existe una clasificacin de reactivos (Tabla 1) que se han usado en los tampones de extraccin ya que minimizan la desnaturalizacin y la degradacin de enzimas, mediante una serie de experiencias piloto se puede llegar a la eleccin de una combinacin apropiada de estos compuestos. Al conseguir un medio de extraccin satisfactorio se ha alcanzado una meta, aunque puede ser que otra combinacin diferente de compuestos fuera mas adecuada. TABLA 1 Compuestos utilizados en tampones de extraccin.Tomado de (Gacesay Hubble, 1990).ReCiTeIA - v.9 n.1CER?N ET ALENZIMAS EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIA4.2 PURIFICACION ENZIMATICA. Gacesa y Hubble, (1990) expone que: Es probable que la enzima que uno desea se encuentre presente en el medio de extraccin solamente en una proporcin mnima frente al total de protenas (generalmente, 0,01 -1 %). Por ello, en las primeras etapas de la purificacin enzimtica deberan encaminarse a la eliminacin de gran parte de sus protenas contaminantes, tanto como sea posible y de la forma ms fcil. Idealmente, podra efectuarse sacando partido de alguna faceta particular de la estabilidad de la enzima bajo condiciones adversas. Fraccionamiento. Puede ser muy efectivo el calentar la muestra o ajustar a valores extremos el pH. Por ejemplo, la aspartato aminotransferasa puede aislarse a partir de corazn de cerdo mediante calentamiento breve (20 minutos) del medio de extraccin a 72 C en presencia del substrato 2-oxoglutarato y del inhibidor competitivo, el succinato Es importante el sealar que cuando el succinato y el 2-oxoglutarato se eliminan durante esta etapa, se pierde la mayor parte de la enzima. Se conoce la razn del incremento de la estabilidad a nivel molecular. Una molcula de succinato es capaz de formar puentes salinos con dos residuos de arginina, introduciendo un enlace cruzado efectivo, en el caso de 2oxoglutarato este induce la formacin reversible de un enlace covalente entre el coenzima, piridoxal fosfato, y la enzima. Por otro lado, la hialuronidasa, una enzima de inters farmacutico, se extrae de forma adecuada a partir de testculos de buey utilizando una mezcla de acido actico/acido clorhdrico a pH de 2,1. Una gran parte de las protenas contaminantes, incluyendo a la B-glucuronidasa, son desnaturalizadas y precipitadas mediante la aplicacin de esta metodologa. El fraccionamiento con sulfato amnico es una etapa extremadamente efectiva en la purificacin proteica. La tcnica tiene la ventaja adicional que reduce el volumen de material, lo cual es normalmente un punto importan-te a considerar a este nivel. EnReCiTeIA - v.9 n.1CER?N ET ALENZIMAS EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIAprincipio, el mtodo depende de la capacidad que presentan las concentraciones elevadas de sulfato amnico para captar las molculas de agua presentes y as evitan de manera efectiva la solvatacin de las protenas. En unas condiciones especficas cada protena podra precipitar en un rango de concentracin caracterstico y estrecho de sulfato amnico. El pH del medio, la temperatura y la concentracin proteica son importantes, debindose mantener con las menores variaciones posibles entre las diferentes muestras si se desea obtener una buena reproductividad. Si una concentracin de sulfato amnico a un cierto valor de pH no es satisfactoria, entonces se puede repetir la experiencia a un nuevo pH y en estas condiciones podra producirse casi con seguridad resultados adecuados. El mtodo tiene dos inconvenientes notables. El sulfato amnico contiene trazas de metales pesados que pueden ser suficientes para inactivar a una enzima; este problema puede evitarse con facilidad mediante el uso de sulfato amnico de gran pureza (grado Analar). La otra desventaja es que la preparacin enzimtica contiene una concentracin elevada de sulfato amnico y normalmente esta sal debe eliminarse mediante dilisis, ultrafiltracin o columnas de desalado antes de continuar con la siguiente etapa de la purificacin. Una alternativa al fraccionamiento con sulfato amnico es la utilizacin de solventes orgnicos, particularmente acetona o alcoholes, para fraccionar protenas. Los solventes deberan ser usados solamente a temperaturas bajas (< 0 C), de otra manera la mayora de las enzimas se desnaturalizaran rpidamente. Adems, la acetona y los alcoholes son altamente inflamables y su aplicacin ha ocasionado en los laboratorios diversos accidentes fatales, por ello una temperatura ms baja que el punto de ignicin del solvente es conveniente para la seguridad. En general, el uso de solventes ha disminuido en los ltimos aos, aunque existen algunos fraccionamientos particularmente adecuados basados en esta metodologa, el fraccionamiento de Cohn para protenas sanguneas utilizando etanol. Para enzimas intracelulares de origen bacteriano, es bastante aconsejable eliminar losReCiTeIA - v.9 n.1CER?N ET ALcidos nucleicos en esta etapa. Estos compuestos pueden ser precipitados con sulfato deENZIMAS EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIAReCiTeIA - v.9 n.1CER?N ET ALENZIMAS EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIAprotamina o, alternativamente, por la unin a una columna de intercambio anionico (p.e. DEAE-celulosa), quedando la enzima libre en la solucin. El cambio ms apreciable despus de la eliminacin de los cidos nucleicos es una reduccin considerable en la viscosidad del extracto. 5. ESPECIFICIDAD ENZIMTICA. (Quintero, 1987) Explica: Una de las caractersticas mis sobresalientes de la catlisis enzimtica es el alto grado de especificidad de la enzima por el o los sustratos de la reaccin. Esta especificidad se limita a una sola molcula o a un rango muy restringido de sustancias qumicamente relacionadas con ella. Los diferentes grupos de enzimas variado mucho su grado de especificidad segn sean el o los sustratos de la reaccin, Algunos, como el de las deshidrogenasas, comprenden enzimas de las mas especificas ya que, en trminos generales, solo aceptan un sustrato como donador de hidr6gcnos y otro como receptor. (Badui, 2006) Plantea: Las enzimas tienen la capacidad de catalizar reacciones qumicas de manera muy especfica; es decir, su intervalo de accin se limita a un determinado tipo de compuesto que debe reunir ciertas caractersticas estructurales para que pueda ser utilizado como sustrato. Su especificidad, propiedad que las hace muy diferentes a muchos catalizadores no biolgicos, se puede abordar de diferentes maneras. La especificidad estereoqumica, se puede explicar a partir de la especificidad de las glucosidasas. La maltosa (O--Dglucopiranosil-(1-4)-O--D-glucopiransido) y la celobiosa (0--D-glucopiranosil-(l-4)O--D-glucopiransido) son disacridos compuestos por dos molculas de glucosa, poseen el enlace glucosdico con configuracin y con respecto al C1, respectivamente, lo que ocasiona una orientacin de los grupos glucosricos diferente. Esto ocasiona que la celobiosa no pueda ser hidrolizada por una -glucosidasa, as como la maltosa no puede ser sustrato de una -glucosidasa. La estereoespecificidad de una enzima define tambinReCiTeIA - v.9 n.1CER?N ET ALENZIMAS EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIAque esta pueda reconocer una forma ptica especfica del sustrato (L-aminocidos o Dazucares). Por otro lado, tambin las enzimas tienen regioespecificidad al reconocer un determinado grupo qumico solo en determinada posicin de una molcula. Sin embargo, existen enzimas con baja especificidad, que se presenta por ejemplo cuando las enzimas atacan un determinado tipo de enlace qumico sin importar la naturaleza del sus-trato; tal es el caso de las lipasas que hidrolizan enlaces ster entre cidos y alcoholes en una gran variedad de compuestos orgnicos, o en algunas proteasas que pueden hidrolizar enlaces peptdicos entre cualquier aminocido. Existe tambin la llamada qumioselectividad o especificidad de grupo que se presenta cuando las enzimas actan sobre un sustrato que contiene un determinado enlace y un grupo qumico especifico al lado de este; el ejemplo de la tripsina es adecuado ya que esta enzima hidroliza los enlaces peptdicos en los que el grupo carboxilo del enlace esta dado por lisina o arginina; igualmente, las proteasas vegetales (papana y ficina) hidrolizan las uniones adyacentes a aminocidos bsicos, leucina o glicina; por su parte, la pepsina acta sobre los enlaces que contienen aminocidos aromticos o cidos dicarboxlicos. (Madrian, 1988) Plantea: Las enzimas se distinguen de los catalizadores no biolgicos por su especificidad. Las enzimas presentan distintos grados de especificidad: 1. Especificidad Estereoqumica. Muchas enzimas muestran preferencia por determinado Ismero ptico o geomtrico. 2. Especificidad Baja. La enzima no discrimina el sustrato y nicamente especificidad hacia el enlace que ataca. 3. Especificidad de Grupo. La enzima es especfica para determinado enlace qumico adyacente a un grupo especfico. 4. Especificidad Absoluta. La enzima puede atacar solo un sustrato y catalizar una sola reaccin. La mayora de las enzimas pertenecen a esta categora. presentaReCiTeIA - v.9 n.1CER?N ET ALENZIMAS EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIA6. FACTORES QUE AFECTAN LA ACTIVIDAD ENZIMTICA. Badui, (2006) Expone: La velocidad a la que las reacciones enzimticas proceden depende de varios factores, dentro de los que destacan el pH del medio de reaccin, la temperatura, la concentracin de sustrato y de enzima, y el agua disponible en el medio, entre los ms importantes. 6.1 Efecto del pH. La actividad de las enzimas depende fuertemente de la concentracin de iones hidronio del medio, ya que esto afecta el grado de ionizacin de los aminocidos de la protena, incluyendo a los del sitio activo, del sustrato (en caso de ser ionizable), o del complejo enzima-sustrato; de hecho el pH influye en la estructura tridimensional de la protena y a su vez, sobre la afinidad que tenga la enzima por el sustrato. La mayora de las enzimas presentan un rango de pH relativamente estrecho en el que presentan una actividad ptima, desactivndose en pHs extremos (figura 3); aunque existen excepciones, como la catalasa bovina o la a-amilasa que presenta un rango de actividad optima muy amplio. En la tabla 1 se muestran los valores de pH ptimo para algunas enzimas. Para su aplicacin en alimentos, hay que considerar que el pH de la mayora de los alimentos varia entre 3.0 y 7.0, solo las frutas y sus derivados tienen un pH mas acido que llega a ser de 2.2. Por obvias razones, se seleccionan enzimas que funcionen bien al pH del alimento, pues este es difcilmente modificable.ReCiTeIA - v.9 n.1CER?N ET ALENZIMAS EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIAFigura 3. Efecto del pH en la actividad enzimtica: (a), pH optimo; (b), intervalo de estabilidad de la enzima; (c), intervalo de inactivacin reversible, y (d), inactivacin irreversible. Tabla 1. pH de actividad optima de algunas enzimas ENZIMA Pepsina (bovina) Catalasa (higado de bovino) Renina (ternero) Catepsinas (higado) Poligalacturonasa (tomate) -amilasa (camote) Ficina (higo) Polifenoloxidasa (durazno) Lipoxigenasa 2 (soya) -amilasa (saliva humana) -quimotripsina (bovina) Lipoxigenasa 1 (soya) pH OPTIMO 2.0 3-10 3.5 3.5-5 4.0 5.0 5.6 6.0 7.0 7.0 8.0 9.0ReCiTeIA - v.9 n.1CER?N ET ALENZIMAS EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIAEn ocasiones, es posible inhibir la actividad enzimtica endgena, si el alimento lo permite, mediante la reduccin del pH adicionando cidos disponibles como aditivos (por ejemplo, adicin de acido ctrico al aguacate). El pH ptimo se debe determinar experimentalmente, y se deben considerar otras variables operacionales como la temperatura, el sustrato y la capacidad amortiguadora de la solucin tampn utilizada. Si la enzima se encuentra en un pH muy alejado del ptimo, se alterara su estructura secundaria y terciaria como consecuencia de la protonacin o desprotonacin de los residuos de asprtico, glutmico, lisina, arginina e histidina, principalmente. La consecuencia ser el desplegamiento o desnaturalizacin permanente o irreversible de la protena. Si el ambiente en el que se encuentra la enzima no esta a un pH extremo, esta puede replegarse y regresar a su conformacin y actividad original, es decir, se puede re naturalizar. 6.2 Efecto de la Temperatura. Como sucede con cualquier otra reaccin qumica, la velocidad de las reacciones enzimticas se incrementan con la temperatura, al aumentar la energa cintica de las molculas, pero solo en el intervalo en que la enzima es estable y retiene su capacidad cataltica; en casos extremos, cuando el incremento es muy grande, se favorece la desnaturalizacin y consecuentemente la protena pierde su capacidad cataltica. Existen varios factores que, adems de la estabilidad conformacional, tambin afectan la actividad enzimtica al aumentar la temperatura, y son: la solubilidad de gases (oxigeno), el pH de la solucin amortiguadora, la afinidad de la enzima por el sustrato, por activadores o inhibidores; as como la presencia de reacciones de competencia. Por esta razn, cada enzima tiene un intervalo optimo de temperatura en el cual se logra la mayor actividad, para la mayora esta entre 30 y 45C, y se inactiva a mas de 60C, a esta temperatura la energa introducida en el sistema sobrepasa la energa de las fuerzas que mantienen la estructura activa de la enzima (figura 4).ReCiTeIA - v.9 n.1CER?N ET ALENZIMAS EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIAFigura 4. Efecto de la temperatura en la actividad cataltica de las enzimas. El trmino Q10 se utiliza para medir el efecto de la temperatura en la velocidad de reacciones qumicas; se expresa como una relacin entre dos velocidades a dos temperaturas con una diferencia de 10C entre ellas:En el caso de enzimas, en rangos entre 20 y 40 C se obtienen valores de Q10 cercanos a 2, lo que indica que la velocidad de reaccin se duplica por cada 10 C de aumento en la temperatura, dentro del intervalo en el que la enzima es estable. En la industria alimentaria se utilizan comnmente los tratamientos trmicos como mtodo de conservacin, con los que no solo se eliminan los microorganismos, sino tambin se desactivan las enzimas que llegan a causar cambios indeseables, como se ejemplifica en la figura 5., ya que aun en alimentos congelados pueden llevarse a cabo reacciones enzimticas, aunque a una velocidad muy baja. El objetivo especfico del proceso de escaldado es eliminar la actividad de enzimas endgenas que oxidan alimentos de origen vegetal.ReCiTeIA - v.9 n.1CER?N ET ALENZIMAS EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIAFigura 5. Inactivacin trmica de la polifenol oxidasa de la remolacha sometida a incubacin a diferentes temperaturas. Cabe mencionar que actualmente se dispone de enzimas obtenidas de microorganismos extremo-filos aislados de regiones de la Tierra que se encuentran a muy altas temperaturas y presiones como las chimeneas marinas, los volcanes o los geisers. Estas enzimas funcionan de manera ptima a temperaturas muy altas, incluso arriba de los 100 C que aunque no son frecuentes en el procesamiento de alimentos, son importantes para la biotecnologa moderna. Este es el caso de la ADN polimerasa obtenida de Thermus aquaticus, esencial para llevar a cabo la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR); o de lipasas obtenidas de Thermotoga spp. Las enzimas termfilas extremas tienen un potencial de aplicacin en el campo alimentario si consideramos que se necesitan enzimas que resistan condiciones drsticas de operacin, por ejemplo, en el procesamiento de almidn o que operen a temperaturas que limiten los riesgos de contaminacin microbiana. Es importante recordar que los procesos qumicos se desarrollan generalmente a altas temperaturas. 6.3 Efecto de la Concentracin de Sustrato. Una enzima funciona de manera ms eficiente cuando la concentracin de sustrato esta en exceso en: relacin con la concentracin de enzima. Esto se debe a que las colisionesReCiTeIA - v.9 n.1CER?N ET ALENZIMAS EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIA"exitosas" con el reactivo son ms frecuentes, asegurando as que la mayor cantidad de enzima se encuentre activa. En estas condiciones, el producto se obtiene a la mxima velocidad posible para la cantidad de enzima presente. En caso de que la concentracin de sustrato sea menor, la velocidad de reaccin disminuye generalmente de acuerdo con un comportamiento como el que se muestra en la figura 6 Este aspecto es muy importante en la caracterizacin cintica de una enzima, como se ver ms adelante. Por otra parte, la accin de una enzima a nivel industrial debe ser ptima tanto en trminos de costo como de eficiencia cataltica, por lo que la reaccin se debe llevar a cabo en la medida de lo posible a la mxima velocidad.Figura 6. Efecto de la concentracin del sustrato en la velocidad de reaccin de las enzimas. 6.4. Efecto de la Actividad del Agua. Los alimentos se deshidratan para evitar el crecimiento microbiano; sin embargo, aun en estas condiciones perdura la accin de muchas enzimas. Las verduras y las frutas deshidratadas estn sujetas a reacciones de deterioro cuando no se inactivan sus enzimasReCiTeIA - v.9 n.1CER?N ET ALENZIMAS EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIAcon un tratamiento de escaldado. Algunas enzimas llegan a actuar con un mnimo de agua, como ocurre con las lipasas que contienen los aceites puros. En ambos casos, la amplia disponibilidad del sustrato hace que las reacciones se logren aun en condiciones de baja actividad del agua (Aa). De hecho, existe evidencia, obtenida por resonancia magntica nuclear (RMN), de que enzimas globulares fijan de 0.2 a 0.3 g de agua en los grupos polares de la superficie, a partir de la cual pueden empezar a funcionar como catalizadores. En otros casos, podra ser necesaria la aplicacin de enzimas en medios con bajo contenido de agua, para la sntesis de compuestos en medios orgnicos, condicin frecuente en procesos de qumica orgnica. En este sentido, se ha demostrado ampliamente que las enzimas hidrolticas pueden catalizar la biosntesis de esteres, amidas, pptidos y carbohidratos en medios con bajo Aa al invertir las condiciones de equilibrio definidas para un medio acuoso. Para alcanzar valores de Aa bajos, la enzima liofilizada se puede equilibrar en un ambiente con menor Aa, como podra ser en disolventes orgnicos no miscibles con el agua (por ejemplo, n-butanol, hexano, ciclohexano, etc.), o reemplazar agua con disolventes miscibles como el glicerol. Contrariamente a lo que se podra pensar, algunas enzimas son ms estables en disolventes orgnicos, sobre todo no polares, que en solucin acuosa, este es el caso de la lisozima, la subtilisina y las lipasas. Algunas de las aplicaciones ms importantes de enzimas en medios no acuosos incluyen la produccin de aspartamo; la reestructuracin de triacilgliceroles, por reacciones de transesterificacin, para la obtencin de lpidos con mejores caractersticas industriales (fusin, solubilidad) y nutricionales (con cidos grasos insaturados). Tambin en medio orgnico es posible sintetizar alquilglucosidos u otros agentes tensoactivos para mejorar las propiedades espumantes y emulsificantes en los alimentos o para facilitar la incorporacin de aditivos insolubles, como algunos saborizantes, colores o agentes antioxidantes. 6.5 Efecto de Otros Agentes en la Actividad Enzimtica.ReCiTeIA - v.9 n.1CER?N ET ALENZIMAS EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIAPor su naturaleza qumica, las enzimas se ven afectadas por todos los factores que influyen en las propiedades fsicas y qumicas de las protenas. En el caso de la fuerza inica, esta altera su estructura tridimensional, lo que trae consigo modificaciones del sitio active Por otra parte, los iones de metales pesados, como mercurio, plata y plomo, generalmente inhiben la accin enzimtica, mientras que varios cationes y aniones actan como activadores; tal es el caso de los cationes de calcio, magnesio, cobre, cobalto, sodio, nquel, potasio, manganeso, hierro y cine, as como aniones de cloro, bromo, yodo. Para cada enzima, deber analizarse la necesidad de alguna de estas especies, o bien, el dao que pudieran ocasionar. El efecto activador se debe a que: En ocasiones forman parte del sitio activo, se requieren para la interaccin de la enzima con el sustrato o ayudan a mantener la conformacin tridimensional, interactuando con alguna regin de la enzima. Algunas enzimas requieren de otros cofactores para poder presentar la actividad cataltica. En la tabla 2 se presentan algunos ejemplos de enzimas y sus correspondientes cofactores. Se trata por lo general de enzimas clave en el metabolismo debido a su importancia en reacciones de sntesis y de oxidoreduccin. La necesidad de producir y regenerar los cofactores ha sido una limitante en la aplicacin industrial de este tipo de enzimas. Tabla 2. Caractersticas de algunos cofactores enzimticos.Por otro lado, muchos productos de origen animal y vegetal contienen protenas capaces de inhibir la actividad cataltica de algunas enzimas; su funcin biolgica est relacionada con mecanismos reguladores para evitar la activacin prematura de proenzimas o comoReCiTeIA - v.9 n.1CER?N ET ALENZIMAS EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIAdefensa contra las enzimas que emplean insectos o microorganismos como elemento de ataque. Entre los inhibidores ms conocidos estn los que evitan la accin de las proteasas, que se encuentran en las leguminosas y cereales. En la soya existen dos tipos de inhibidores de naturaleza protenica, conocidos como "de Kunitz" (21 kDa), especfico para tripsina, y "de Bowman-Birk" (8.3 kDa) que inhibe tanto tripsina como quimotripsina. En otras leguminosas se producen preferentemente inhibidores del tipo Bowman-Birk. Ambos tipos de protenas son termoresistentes, debido a que poseen hasta 7 puentes disulfuro. Dado que estos inhibidores causan un detrimento en la calidad nutricional, se deben inactivar, lo que se logra con el cocimiento por un tiempo aproximado de 1 hora a las temperaturas normales de coccin. Existen otros inhibidores de proteasas, como el ovomucoide (especfico para tripsina) y el ovoinhibidor de la clara del huevo, que tiene un espectro de inhibicin mayor, pues inhiben tripsina, quimotripsina y subtilisina. Los cereales contienen inhibidores de amilasas, cuya funcin es tambin proteger al grano contra los depredadores, impidiendo la degradacin del almidn. Adems, se han identificado inhibidores de invertasa, lipasas y de algunas enzimas ppticas. 7. CINTICA DE LAS REACCIONES ENZIMTICAS. Badui, (2006) expone que: Existen varios modelos que explican el funcionamiento de una enzima como catalizador, siendo uno de los ms aceptados el desarrollado por Michaelis y Menten en 1913 (figura 6). Este modelo considera que cuando el reactivo o sustrato (S) esta en contacto con la enzima (E), rpidamente se combinan para formar un complejo enzima-sustrato (ES). Posteriormente, de este complejo se liberan tanto el producto como la enzima, dejndola disponible para combinarse con una nueva molcula de sustrato. Lo anterior se representa en la siguiente ecuacin general para una reaccin en la que participa un solo sustrato:ReCiTeIA - v.9 n.1CER?N ET ALENZIMAS EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIASegn lo indica el sentido de las flechas, tanto la formacin del complejo enzima-sustrato como su consumo para liberar al producto, pueden ser procesos reversibles. Los coeficientes k1, k-1, k2 y k-2 representan las constantes de velocidad para cada reaccin. La formacin del complejo es generalmente rpida, mientras que su descomposicin en producto y enzima libre es un paso lento, (k2 < k1), mientras que k2 es generalmente mucho mayor que k-2. Sin embargo, bajo ciertas condiciones, una reaccin catalizada enzimticamente puede proceder en cualquier direccin. Por ejemplo, y como se ha sealado ya, algunas reacciones enzimticas que proceden en direccin hacia la hidrlisis en un medio acuoso, pueden proceder en sentido inverso en un medio con baja disponibilidad de agua. Durante los primeros instantes de la reaccin, la velocidad de formacin de producto (AP/At) se define como velocidad inicial, v y es, de acuerdo con la (Ec.3), proporcionarte la concentracin del complejo ES. La concentracin de enzima total (ET), en cualquier momento es igual a [E] + [ES] (enzima libre + enzima en forma de complejo (Ec. 4)). Cuando [S][E] la enzima est totalmente saturada, esto es, se encuentra formando el complejo con el sustrato (Ec. 5), por lo que se encuentra a su mxima velocidad (Vmax), como se expresa en la Ec. 6. Vn = k2 [ES] [E]T = [E] + [ES] Si [S][E], entonces [E]T = [ES] Vn = k2 [E]T = Vmax Ec. 5 Ec. 6 Ec. 3 Ec. 4Es importante recordar que existe una relacin entre la concentracin de los reactivos con la velocidad de reaccin, lo que define el orden de una reaccin qumica. Se ha mencionado que en el caso de una reaccin enzimtica la concentracin de sustrato se debe mantener muy alta con relacin a la concentracin de enzima, de tal forma que se trate de una reaccin de orden cero (figura 6). As, la velocidad de reaccin, a pH yReCiTeIA - v.9 n.1CER?N ET ALENZIMAS EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIAtemperatura constantes, ser independiente de la concentracin de sustrato y depender solamente de la concentracin de la enzima, como lo muestra la figura 7 y la Ec. 6.Figura 7. Velocidad de reaccin enzimtica con respecto a la concentracin de enzima. La lnea punteada es la relacin terica (Ec.6), y la lnea solida la relacin observada. Por otra parte, en la figura 6 se observa que en concentraciones bajas de sustrato, la velocidad Vi en los inicios de la reaccin es proporcional a la concentracin de sustrato y, por lo tanto, se establece un sistema de primer orden; a medida que se incrementa [S], la velocidad se vuelve de orden fraccionario y posteriormente de orden cero; en este ultimo caso Vi es independiente de la concentracin del sustrato, la enzima alcanza su saturacin y se obtiene la mxima velocidad, como ya se menciono anteriormente. A la relacin entre k1 k-1 y k2 se le conoce con el nombre de constante de MichaelisMenten o Km.Ec. 7 La Km, junto con k2, tambin conocida como constante cataltica (fccat) o numero de recambio, son especficas para cada enzima y la relacin fccat/Km determina la eficiencia cataltica de la enzima para un determinado sustrato (Tabla 3).ReCiTeIA - v.9 n.1CER?N ET ALENZIMAS EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIALa ecuacin de Michaelis-Menten (Ec. 8) representa una hiprbola (Figura 6) y describe la variacin del orden de reaccin en funcin de la concentracin del sustrato: en condiciones de saturacin, la Ec.8 se transforma en Vi = Vmax que representa una ecuacin de velocidad de orden ce-ro. Por otra parte, cuando [S]0Km, entonces la ecuacin de Michaelis se puede simplificar a Vi = Vmax ([S](/Km), que puede simplificarse como v = k' [S], donde k' equivale a una constante de primer orden, como se seala en la misma figura 6. En general:Ec. 8 Aparentemente en la igualdad de Michaelis-Menten no existe ningn termino que incluya la concentracin de la enzima [E]T; sin embargo, esta se encuentra implcita en Vmax ya que es igual a k2[E]T, como se preciso en la Ec. 6. De la Ec. 8 se puede deducir una relacin importante, ya que cuando Vi = 1/2 Vmax, se obtiene que Km = [S]; es decir, la relacin de constantes de velocidad definida en la Ec.7, es igual a la concentracin del sustrato a la cual la velocidad observada en la reaccin es la mitad de la velocidad mxima. El valor de Km no es absoluto, depende del pH, la temperatura y del tipo de sustrato, mas no de su concentracin. La Km es un ndice de la afinidad que tiene una enzima por un determinado sustrato: los valores bajos indican que la enzima requiere de bajas concentraciones de sustrato para alcanzar la saturacin; por el contrario, los valores altos representan enzimas con poca afinidad hacia el sustrato, ya que es necesaria una elevada concentracin de este para que se saturen. Por ejemplo, en la tabla 3 se observa que la quimotripsina hidroliza varios sustratos con diferentes velocidades, dependiendo de la afinidad que tenga hacia cada uno de ellos, se observa que la N-benzoiltirosinamida es el mejor sustrato para esta enzima y que el tamao del grupo unido a la tirosina determina la afinidad de la enzima hacia cada sustrato, lo que se refleja en el valor de Km.ReCiTeIA - v.9 n.1CER?N ET ALENZIMAS EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIATabla 3. Ejemplos de los valores de las constantes catalticas para varias enzimas algunas con ms de un sustrato.8. INMOVILIZACIN DE ENZIMAS. Goldstein y Katchalski-Katzir, (Citado en Gacesa y Hubble, 1990). Considerando las propiedades de las enzimas es tambin importante examinar las implicaciones de cualquier modificacin hecha en la estructura enzimtica. Desde el punto de vista de un proceso puede ser deseable inmovilizar la enzima para permitir su retencin en un reactor Esta inmovilizacin esta dirigida a inducir cambios en el medio ambiente de la enzima y por lo tanto provoca cambios en las propiedades observadas. El tipo y la magnitud de estos cambios dependen de la enzima y del mtodo de inmovilizacin utilizado. Gacesa y Hubble, (1990) describen que: En 1972 la proliferacin en la metodologa de inmovilizacin condujo a un intento de racionalizar la clasificacin de los sistemas de enzimas inmovilizadas. Los principales grupos descritos estn representados en la Fig. 8. Las tcnicas para la inmovilizacin de enzimas estn ahora bien establecidas y hay una literatura muy extensa que describe este tema. Aqu se suministra una breve descripcin de los principales tipos de inmovilizacin.ReCiTeIA - v.9 n.1CER?N ET ALENZIMAS EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIAFigura. 8 .Mtodos comunes de inmovilizacin de enzimas. Las enzimas pueden ser adsorbidas sobre la superficie de un soporte. Este proceso resulta de interacciones fsicas ms que qumicas (e.g. efectos de carga e interacciones hidrofobicas) y la flexibilidad de este tipo de inmovilizacin reduce al mnimo las posibilidades de distorsin estructural de la enzima. Se considera que la adsorcin es anloga a lo que ocurre en las enzimas unidas a membranas in vivo. La naturaleza de las interacciones es tal que la adsorcin es generalmente un proceso reversible y cambios en las condiciones del proceso, e.g. pH y fuerza inica, pueden causar desercin. A pesar de este inconveniente la adsorcin ha sido utilizada para algunos procesos industriales (e.g. la glucosa isomerasa en DEAE-celulosa se ha utilizado comercialmente). La unin covalente de enzimas solubles a un soporte insoluble es el mtodo mas comn para la inmovilizacin de enzimas habindose utilizado una amplia gama de tcnicas y soportes para este propsito. Aunque parte de la actividad pueda perderse durante el proceso de acoplamiento es improbable la lixiviacin de la enzima a partir del soporte en preparaciones unidas covalentemente, asegurando una mayor estabilidad del material cataltico. Messing, 1985; Woodward, (Citado en Gacesa y Hubble, 1990) aunque han sido estudiados otros mtodos de inmovilizacin (e.g. membranas ultrafiltrantes), la adsorcin y la unin covalente representan las principales metodologas. Revisiones mas detalladas de los mtodos de inmovilizacin han sido presentadas por otros autores. 8.1 Efectos de la inmovilizacin sobre la actividad enzimtica. Goldstein, (Citado en Gacesa y Hubble, 1990), Cuando una enzima es inmovilizada la actividad de la preparacin es siempre diferente a la de la forma natural. Las razones para elloReCiTeIA - v.9 n.1CER?N ET ALENZIMAS EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIAson muchas pero es posible identificar las tres principales influencias, a saber, efectos conformacionales, de particin y difusionales. Gacesa y Hubble, (1990) describen: La inmovilizacin puede causar perturbaciones estructurales en la protena, reduciendo la eficacia cataltica de la enzima. Adems, la inmovilizacin puede limitar el acceso del reactivo al centro activo de la enzima, reduciendo nuevamente la actividad. Ambos fenmenos pueden ser descritos como efectos conformacionales. Los efectos de particin ocurren cuando las concentraciones de reactivo o de otros compuestos relacionados con la actividad de la enzima pueden ser diferentes en la superficie del soporte matriz de las observadas en el grueso de la solucin. Estos efectos pueden surgir por interacciones electrostticas o hidrofobicas, y dependiendo de el(los) componente(s) implicado(s), los efectos de particin pueden intensificar o rebajar la velocidad de la reaccin observada. 9. IMPACTO ACTUAL EN LA TECNOLOGA DE ALIMENTOS. Garcia et al, (2004) explica que: Las enzimas intervienen en prcticamente todas las reas involucradas en la tecnologa de alimentos, por lo que el enzimologo debe aprender a caracterizar y aplicar enzimas exgenas, a activar o inhibir, dependiendo del alimento, enzimas endgenas, a aprovechar su termoestabilidad para asociar su desactivacin con tratamientos trmicos y emplearlas como parmetros de control de calidad o simplemente, aprovecharlas como herramienta analtica.. Es conveniente sealar algunas caractersticas y limitaciones relativas a la aplicacin de enzimas en alimentos: La experiencia ha demostrado que se requieren de 5 a 10 aos para la realizacin industrial de un desarrollo enzimtico novedoso.ReCiTeIA - v.9 n.1CER?N ET ALENZIMAS EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIALa evolucin de este sector ha sido lenta y caracterizada frecuentemente por sustituciones ms que por verdaderas innovaciones: hidrolisis de almidn, inversin de sacarosa, sustitucin de quimosina por "cuajos microbianos", etc..Son escasos los procesos que realmente pueden llamarse enzimticos (produccin de glucosa y de jarabes de fructosa), ya que en la mayor parte de los casos las enzimas fungen un papel de aditivos con funciones como disminuir la viscosidad, mejorar la filtracin, evitar la turbidez, clarificar, mejorar la digestibilidad, mejorar la textura, evitar la cristalizacin y mejorar las caractersticas organolpticas, entre otras.Por razones fundamentalmente toxicolgicas, un gran nmero de enzimas industriales son producidas por un nmero reducido de microorganismos (los reconocidos generalmente como seguros por la Administracin de Alimentos y Medicamentos de Estados Unidos).Por razones de ndole energtica (no requiere cofactores), las reacciones enzimticas industriales son en su mayora de hidrlisis. Las reacciones de sntesis siguen siendo no viables fuera de la clula, ante la dificultad de producir y regenerar cofactores econmicamente, aunque existen varios desarrollos a nivel piloto. Por otro lado y aprovechando el conocimiento sobre las propiedades catalticas de las enzimas, as como su relacin con la temperatura y el pH, encontraremos con frecuencia casos en la enzimologa alimentara en los que se promueve o se reprime la accin de enzimas propias del alimento. Finalmente, un mercado en plena expansin lo representan los reactivos analticos. En efecto, mediante el uso de una enzima o el acoplamiento de dos o ms de ellos es posible cuantificar mas de 30 sustancias , algunas de ellas de importancia en el control de calidad de alimentos; por ejemplo los cidos ascrbico, lctico ctrico, succnico, almidn, colesterol, lactosa, lecitina, maltosa, sorbitol, rafinosa, glucosa, fructosa etc.ReCiTeIA - v.9 n.1CER?N ET ALENZIMAS EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIA10. UTILIZACIN DE LAS ENZIMAS EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIA. Badui, (2006) describe que: De las miles de enzimas conocidas, solo algunas decenas se producen a escala industrial, para emplearse en la manufacture tanto de alimentos como de materias primas. Cada da aumenta el numero de reacciones industriales que se efectan por rutas enzimticas, principalmente debido a la posibilidad que existe hoy en dia de expresar cualquier gene en microorganismos modificados genticamente. El empleo de enzimas tiene muchas ventajas: a) son muy especificas en su manera de actuar, por lo que no propician reacciones secundarias indeseables; b) funcionan en condiciones moderadas de temperatura y de pH y no requieren de condiciones de procesamiento drsticas que puedan alterar la naturaleza del alimento, ni de equipo muy costoso; c) actan en muy bajas concentraciones, entre 10"8 y 10"6 M; d) su velocidad puede ser controlada al ajustar el pH, la temperatura y la concentracin de enzima, y e) son fcilmente inactivadas una vez alcanzado el grado de transformacin desea-do.41 En algunos casos es deseable operar a las enzimas en ambientes extremos, como en el caso de la hidrlisis del almidn, que se gelatiniza a 110-120C o en sntesis orgnica en presencia de solventes y en ambientes de baja disponibilidad de agua. Una limitante importante para el uso de enzimas es que algunas de ellas son muy caras por su baja disponibilidad, sin embargo, es conveniente hacer un balance de los costos y las ventajas que trae consigo llevar a cabo una determinada reaccin con enzimas, para definir la viabilidad. Cabe indicar que en este sentido hay muchas innovaciones tecnolgicas que estn logrando hacer mas econmicos estos catalizadores, como es el caso de la ingeniera gentica que permite transformar microorganismos y plantas para aumentar la sntesis de enzimas o bien, la reutilizacin de estas cuando se encuentran inmovilizadas en un soporte, lo que constituye un biocatalizador. Al igual que cualquier otro aditivo alimenticio, las enzimas deben cumplir con determinadas especificaciones de calidad, sobre todo en cuanto a su toxicidad, o a la del microorganismo que la produce, en caso de que sea de origen microbiano.35 Debido a que las enzimas que se emplean en la industria, no son puras (resulta muy costosa su purificacin completa), es preciso tomar en consideracin todos los materiales adicionalesReCiTeIA - v.9 n.1CER?N ET ALENZIMAS EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIAque pudieran contener; por esta razn, una preparacin enzimatica comercial es en realidad una mezcla de protenas, entre las que se encuentra la que presenta la actividad deseada. Una de las ventajas que ofrece la obtencin de enzimas por fermentacin es que muchos microorganismos las producen extracelularmente, es decir, las segregan de la clula, lo que hace que su recuperacin sea sencilla. Sin embargo, en otros casos las enzimas son intracelulares y es precise romper las clulas para su extraccin. En ambos casos el extracto crudo se disuelve en un amortiguador acuoso y las enzimas se precipitan por la adicin de disolventes orgnicos, como etanol o acetona, c con sales como sulfate de amonio; los precipitados se recuperan por filtracin o centrifugacin y se secan al vaci o se liofilizan. La recuperacin de las enzimas se debe llevar a cabo en condiciones tales que no provoquen perdida de la actividad cataltica. Cuando se desea obtener enzimas mas puras se recurre a mtodos cromatograficos mediante los cuales las protenas se separan de acuerdo con su carga, tamao, interacciones hidrofobicas e incluso su especificidad. Dado que la presencia de la enzima no necesariamente implica que este activa (puede estar presente en forma desnaturalizada), los productos enzimticos se comercializan de acuerdo con si: potencia cataltica; generalmente se estandarizan a una cierta actividad y se les aaden agentes estabilizantes (propilenglicol, sorbitol, glicerol). Tambin se les pueden adicionar cloruro de sodio o benzoatos para evitar el crecimiento microbiano y conservarlos en el almacenamiento.10.1 ENZIMAS DE IMPORTANCIA EN ALIMENTOS. Badui, (2006) menciona: Algunos de los aspectos ms relevantes de las enzimas cuyas actividades son importantes en la conservacin y procesamiento de alimentos o en la produccin de materias primas. Se revisaran a las enzimas que hidrolizan carbohidratos, enzimas que hidrolizan protenas, a las que hidrolizan lpidos y otras reaccionesReCiTeIA - v.9 n.1CER?N ET ALENZIMAS EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIAenzimticas que son importantes en sistemas alimenticios. En el cuadro 5.10 se presenta un resumen de las aplicaciones mas importantes de enzimas en alimentos. Tabla 4. Algunas de las aplicaciones de enzima en la industria de los alimentos.ReCiTeIA - v.9 n.1CER?N ET ALENZIMAS EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIATomado de Badui, (2006). 11. ASPECTOS PARA POSIBLES INVESTIGACIONES. La manipulacin gentica del ADN tiene un aspecto muy importante en la produccin de enzimas a travs de microorganismos. Ya la clonacin consiste en obtener el gen que codifica para la protena de inters. Ahora una vez el gen clonado puede ser sometido a modificaciones en su secuencia con el fin de aumentar la termo estabilidad, mejorar la eficiencia cataltica o modificar la especificidad enzimtica. Teniendo en cuenta estos aspectos la modificacin gentica puede traer varios avances a la ingeniera de alimentos en donde manipulando enzimas como la proteasa alcalina, Amilasa, Lipasa, pueden traer grandes avances hacia los alimentos.ReCiTeIA - v.9 n.1CER?N ET ALENZIMAS EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIA12. CONCLUSIONES. 1. Las enzimas son catalizadores de origen biolgico que cumplen muchos requisitos para impulsar nuevas industrias qumicas. 2. Los procesos enzimticos tienen mltiples aplicaciones, como fabricacin de alimentos, los progresos que estn realizando actualmente la ingeniera gentica y la biotecnologa permiten augurar el desarrollo cada vez mayor del uso de las enzimas. 3. La utilizacin de enzimas en los alimentos presentan una serie de ventajas, adems de las de ndole econmico y tecnolgico. 4. Las enzimas utilizadas dependen de la industria y del tipo de accin que se desee obtener. 5. Las fuentes de enzimas pueden ser de origen vegetal, animal o microbiano. 6. se puede manipular genticamente, la biosntesis de enzimas para optimizar los procesos, pero se debe tener en cuenta, las respectivas normas. 7. La produccin de enzimas a gran escala tiene su principal aplicacin en la industria de la fermentacin.ReCiTeIA - v.9 n.1CER?N ET ALENZIMAS EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIA13. BIBLIOGRAFIA. (1) Badui, S. (2006), Qumica de los Alimentos. Pearson,(4 Ed). Mexico, (pp. 301-362). (2) Gacesa, P. & Hubble, J. (1990). Tecnologa de las Enzimas. Acribia S.A . Espaa. (pp 15 115). (3) Garcia, M.& Qintero, R & Lopez- Mungria , A. (2004). Biotecnologa Alimentara. Limusa S.A. . Mxico D:F. (4) Madrian. C. (1988) .Qumica de Alimentos. Facultad de Ingeniera Universidad del Valle. Colombia. (pp 301-341). (5) Quintero. A. (1987). Tecnologa Enzimtica Aplicacin en Alimentos y Medicina. Universidad Nacional Autnoma de Mxico. Mxico.(pp 17-27). (6) Conn E, & Stumpf P. K. . (1996) Bioqumica fundamental Mxico Limusa S. A., (4 ed.) Mxico.ReCiTeIA - v.9 n.1