ENZIMAS DE RESTRICCINBetzaidaJimnez-Francisco1, Hctor Javier Argello-Hernndez2, Francisco A. Cigarroa-Vzquez2 y Nicols Gregorio Martnez-Jacinto3Programa de posgrado en Botnicajimenez.betzaida@colpos.mx.2Posgrado en Ganadera. 3Posgrado en Entomologa y Acarologa. Colegio de Postgraduados Campus Montecillo. Km. 36.5 Carretera Mxico-Texcoco edo. deMxico. CP 56230.1

INTRODUCCIN En 1970, Arber, Smith y Hamilton descubren, como parte del esfuerzo encaminado a entender ms detalladamente las funciones de regulacin y organizacin gentica, las llamadas enzimas de restriccin, que son protenas que cortan el DNA en sitios especficos, como tijeras moleculares y que reconocen secuencias especficas de nucletidos en el DNA. El tratamiento de un DNA con enzimas de restriccin permite generar fragmentos especficos a partir del DNA original. Es importante recalcar que esta tcnica hace posible que este tipo de experimento se repita siempre con los mismos resultados (para el mismo DNA), ya que los sitios de reconocimiento de las endonucleasas son secuencias especficas en el DNA (Bolvar-Zapata, 2004).

Son enzimas que cortan los dos enlaces fosfodiester en la doble hebra del material gentico a partir de una secuencia caracterstica de nucletidos que reconocen dentro de la molcula de DNA, llamados sitio o diana de restriccin, o tambin pueden cortar en un sitio no muy lejano a este, dependiendo de la enzima. Los sitios de restriccin tienen de 4 a 12 pares de bases, por las que son reconocidos por la enzima de restriccin. Las enzimas de restriccin tambin son conocidas como endonucleasas de restriccin (Ausubel et al. 1992). La prctica tuvo como objetivo, obtener una digestin completa de un ADN conocido (fago ) que sirvi como marcador molecular mediante enzimas de restriccin as como la determinacin del nmero de sitios reconocidos por las endonucleasas en ADN de platas de chile Capsicumannuum.

MATERIALES Y METODOS Material biolgico

Para la realizacin del ensayo, se us DNA de plantas de chile (C.annuum) y del fago Lambda ( ). Las enzimas de restriccin que se usaron, son dos, la Hae IIIy el Hind III. La primera corta en una secuencia de cuatro pares de nucletidos y la segunda reconoce una secuencia de AAGCTT. Se realizaron cuatro diferentes tratamientos, pero aqu solo describiremos al primero (equipo 5).

En un tubo de PCR nuevo y etiquetado, se realiz el buffer en el cual se llev a cabo la digestin. Inicialmente se colocaron 2 L del Buffer 10X; posteriormente se colocaron 12 L de agua destilada. Despus se adicionaron 5 L de DNA de plantas de chile (C. annuum) y por ltimo se adicion 1 L de las enzimas Hae III de restriccin para obtener un volumen final de 20 L.Despus el tubo se coloc en un termoblock a una temperatura de 37 C por 2 h. Posteriormente se le dio un pulso en la centrifuga y se coloc en hielo. Observacin de la digestin

Para la observacin de la digestin del DNA, se tomaron con una micropipeta 5 L del DNA de chile digerido el cual se mezcl con 2 L de buffer de carga. Tambin se coloc una muestra usada como testigo el cual eran 5 L del DNA del chile sin digerir que se mezclaron con 2 L de buffer de carga. Las muestras, se colocaron pocillos separados en donde se emple un gel de agarosa al 2% el cual se corri a 1h a 80 V.

RESULTADOS Y DISCUSIN Los marcadores de peso molecular para DNA son reactivos comunes en la biologa molecular, ya que son tiles para determinar el tamao de fragmentos de DNA de inters. Un mtodo para generar un marcador de peso molecular de DNA es la digestin de DNA proveniente del fago , con una enzima de restriccin apropiada para generar fragmentos de tamaos especficos, dependiendo de la enzima de restriccin utilizada (Hartley, 2006).Esto es posible desde que el genoma entero de este bacterifago se secuenci, por lo tanto podemos conocer exactamente donde corta una enzima de restriccin en el DNA viral, as como el tamao de los fragmentos generados (Danielset al., 1980). Se observ digestin del DNA del fago cuando se utiliz la enzima Hae III, mientras que

la enzima Hind III no tuvo actividad esto es evidente al observar la banda en la zona de alto peso molecular que corresponde al DNA genmico del bacterifago (Figura 1). Esto posiblemente a que la enzima estaba degradada o contaminada, ya que tampoco se observ actividad al digerir DNA proveniente de chile. De la digestin con la enzima Hae III, se lograron identificar 13 bandas ya que la intensidad y definicin de las mismas era muy baja. Algunas de las cuales coinciden con un patrn ya estandarizado (http.//tools.neb.com/REBsites/index.php), otras no fueron posible identificarlas (Cuadro 1). Por lo que si se quiere crear un marcador de peso molecular utilizando esta enzima, es necesario realizar ms ensayos para corroborar el patrn de bandeo. En nuestra opinin la actividad de restriccin de esta enzima genera fragmentos cuyos pesos son muy similares en la zona comprendida en la zona de los 100 a los 500 pb, y esto ocasionara dificultad al determinar pesos moleculares de fragmentos comprendidos en este intervalo de peso molecular.

1pbHae III1* 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

2

12 13

Figura 1 Gel de agarosa al 2 %. Carril 1) DNA del fago digerido con la enzima Hae III y Carril 2) DNA del fago lambda que se incub con la enzima Hind III donde no se observa digestin. *Nmeros de fragmentos que fue posible identificar.

Cuadro 1 Peso aproximado en pb, de los principales fragmentos obtenidos de la digestin de DNA de fago con la enzima Hae III.Fragmento 1 2 3 4 5 6 7 8 pb (aproximado) 4500 2800 2300 1900 1500 100 800 750

Por otro lado, la actividad endonucleasa de la enzima Hae III fue evidente en el DNA de chile, aunque solo se observa un barrido. Esto puede justificarse considerando que el genoma del chile esmuy grande (Jo et al., 2011) comparado con el de los procariontes de los cuales provienen estas endonucleasas, por lo que da origen a numerosos fragmentos tras la digestin con una enzima de restriccin. La presencia de barrido esporque hay fragmentos de diferentes longitudes que se fusionan. De esta manera se podra inferir que una de las limitaciones de esta tcnica es el tamao del genoma. Adems no se observ fragmentacin del DNA cuando se utiliz la enzima Hind III, tomando como referencia el DNA que no fue tratado con la enzima., igual a lo sucedido con el DNA del fago .

1 2 3 4 5 6

Figura 2 Gel de agarosa al 2% 1y 6) Marcador molecular 1 Kb de Fermentas 2) producto de digestin del DNA de chile con la enzima Hae III. 3) DNA de chile sin digerir. 4) producto de digestin de DNA de chile con la enzima Hind III. 5) DNA de chile sin digerir.

Los

marcadores

moleculares

que

se

usan

a

partir

de

RFLP

(Restrictionfragmentlengthpolimorphism) se les ha considerado como polimrficos de DNA, lo que quiere decir que pueden ser identificados en el propio y en cualquier parte del DNA. Presentan la desventaja con relacin a aquellos que son a partir de PCR (PolimeraseChainReaction) ya que estos si se conoce la secuencia especfica, de esta reaccin se obtendrn secuencias nicas en el genoma e identificaran la localizacin exacta del polimorfismo (Plomin, et al., 2009).

CONCLUSION Se logro obtener una digestin completa de un ADN del fago lambda ( ) que sirvi como marcador molecular mediante enzimas de restriccinobteniedo bandas conocidas. Por otro lado se logr tambin la determinacin del nmero de sitios que fueron reconocidos por las endonucleasas en ADN de platas de chile Capsicumannuum. As tambin observamos que si el fago si no es tratado con enzimas de restriccin al no ser digerido, queda todo el

DNA en la parte superior, mostrando una sola banda gruesa.

LITERATURA CITADA

Ausubel, F. M., R. Brent., R. E. Kingston., D. D. Moore, J. G. Seidman, J. A. Smith and K. Struhi. 1992. Current protocols in molecular biology. Vol. 1 y 2.John Wiley and sons. New York, USA.

Bolvar-Zapata, F. 2004. Fundamentos y casos exitosos de la biotecnologa moderna. El Colegio Nacional. Mxico D. F. 733 pp. Daniels, L. D., J. R. de Wet y F. R. Blattner. 1980. New map of bacteriophage lambda DNA. Journal of Virology 33:390-400. Hartley J. L. 2006. Nucleic acid marker ladder for estimating mass. US Patent no. 7, 132, 520. Jo, D. Y; J. Park; J. Kim; W. Song; C. G. Hur; Y. H. Lee and B. C. Kang. 2011. Complete sequencing and comparative analyses of the pepper (Capsicum annuum L.) plastome revealed high frequency of tandem repeats and large insertion/deletions on pepper plastome. Plant.Cell.Rep. 30:217229. Plomin, R; J. C. DeFries. G. E. McClear and P. McGuffin. 2009. Behavioral genetics 4thed. W. H. Freeman and Company, New York and Basingstoke. 470 pp.