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“Síntesis y estudio teórico de
aductos Diels-Alder derivados de
los ácidos maleico y fumárico, y su
actividad biológica sobre la enzima
aminotransferasa del GABA”
T E S I S
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE:
DOCTOR EN CIENCIAS QUIMICOBIOLÓGICAS
P R E S E N T A:
M. en C. Juan Alberto Guevara Salazar
Directores de tesis:
Dr. Hugo Alejandro Jiménez Vázquez
Dr. José Guadalupe Trujillo Ferrara
México, D.F. DICIEMBRE DEL 2010
Instituto Politécnico Nacional
Escuela Nacional de Ciencias Biológicas
ii
iii
iv
v
ÍNDICE
Pág.
I. ÍNDICE DE TABLAS vii
II. ÍNDICE DE FIGURAS x
III. ACRÓNIMOS Y ABREVIATURAS xvii
Pág.
RESUMEN 1
ABSTRACT 2
1. INTRODUCCIÓN 3
1.1 Panorama histórico y diseño de fármacos 3
1.2 Docking 6
1.3 Farmacología de los fármacos que actúan en el sistema nervioso central 11
1.4 Sinapsis GABAérgica y enzima aminotransferasa de GABA 15
1.5 Actividad encefálica: ondas cerebrales 18
1.5.1 Epilepsia 20
1.5.2 Farmacología de las epilepsias 23
1.5.2.1 Convulsiones parciales. Aspectos moleculares 25
1.5.2.2 Convulsiones generalizadas. Aspectos moleculares 28
2. ANTECEDENTES 31
2.1 Vigabatrina 31
2.2 Cicloadiciones [4+2] tipo Diels-Alder 32
2.2.1 Regioselectividad de la reacción Diels-Alder 33
2.2.2 Estereoquímica de la reacción Diels-Alder 34
2.2.3 Mecanismo de reacción 35
3. JUSTIFICACIÓN 36
4. HIPÓTESIS 37
V. OBJETIVOS 38
5.1 Objetivo General 38
5.2 Objetivos particulares 38
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 40
6.1 SÍNTESIS 40
6.2 DOCKING 84
vi
6.3 CINÉTICA ENZIMÁTICA 108
6.4 MODELO IN VIVO DE LAS CONVULSIONES INDUCIDAS CON
PENTILENTETRAZOL
166
7. CONCLUSIONES 124
8. PARTE EXPERIMENTAL 127
8.1 Instrumentación 127
8.2 Reactivos 128
8.3 Síntesis 130
8.4 Análisis conformacional y metodología de los cálculo teóricos para el aducto
Diels-Alder 4b
149
8.5 Estudios de interacción ligando-enzima asistido por computadora 150
8.5.1 Preparación de los ligandos 150
8.5.2 Preparación de la enzima aminotransferasa del GABA 150
8.5.3 Preparación de los archivos de la proteína y los ligandos 152
8.5.4 Preparación de los scripts de la proteína y los ligandos 153
8.5.5 Realización de los estudios de interacción ligando-enzima (Docking) 155
8.6 Cinética enzimática sobre la aminotransferasa del GABA de Pseudomonas
fluorescens
155
8.7 Modelo in vivo de las convulsiones inducidas con pentilentetrazol (PTZ) 157
8.7.1 Animales 157
8.7.2 Determinación de la dosis mínima efectiva de PTZ 157
8.7.3 Determinación del efecto protector de los aductos Diels-Alder que hayan
resultado inhibidores de la GABA-AT
159
9. REFERENCIAS 160
vii
I. ÍNDICE DE TABLAS
TABLA Pág.
Tabla 1. Eventos históricos relevantes en el desarrollo de la química
farmacéutica
5
Tabla 2. Receptores de GABA 17
Tabla 3. Clasificación y tratamiento farmacológico de las epilepsias 24
Tabla 4. Características físicas de los ácidos N-fenilmaleámicos 5a-d 41
Tabla 5. Caracterización de los ácidos N-fenilmaleámicos 5a-d por
espectrofotometría IR (pastilla de KBr)
42
Tabla 6. Caracterización por RMN de 1H (300 MHz) y
13C (75 MHz) en
DMSO-d6 de los ácidos N-fenilmaleámicos 5a-d
43
Tabla 7. Caracterización por RMN de 1H (500 MHz) y
13C (125 MHz) en
CDCl3 de los aductos Diels-Alder 4a-d derivados de isopreno
48
Tabla 8. Ángulos diedros (, °) y constantes de acoplamiento calculadas (3J,
Hz) derivadas de la optimización de los confórmeros de bote (b) y media-silla
(hc) del aducto 4b al nivel B3LYP/6-31+G(d,p). Se muestran los valores
experimentales de 3J (exp), así como los valores estimados de la distribución
de Boltzmann (avg)
51
Tabla 9. Rendimientos obtenidos de los ácidos N-fenilmaleámicos 5a-d y para
los aductos 4a-d obtenidos en dos pasos sintéticos y bajo una MCR
53
Tabla 10. Condiciones de reacción en la investigación de la secuencia de pasos
por la que se lleva a cabo la reacción MCR. La reacción se llevó a cabo con
AcOEt como disolvente
54
Tabla 11. Caracterización por RMN de 1H (500 MHz) y
13C (125 MHz) en
DMSO-d6 de la mezcla de regioisómeros de los aductos Diels-Alder 6a y 7a
derivados
57
Tabla 12. Características físicas de los aductos Diels-Alder 8, 10a, 10b y 13 59
Tabla 13. Caracterización de los aductos Diels-Alder 8, 10a y 13 por
espectrofotometría IR obtenidas en pastilla de KBr
60
Tabla 14. Caracterización por RMN de 1H (300 MHz) y
13C (75 MHz) en
CDCl3 de los aductos Diels-Alder 8, 10a, 10b y 13 derivados del anhídrido
maleico
61
viii
Tabla 15. Características físicas de la mezcla de regioisómeros de los aductos
Diels-Alder 6a-d y 7a-d derivados de isopreno
64
Tabla 16. Caracterización de la mezcla de regioisómeros de los aductos Diels-
Alder 6a-d y 7a-d derivados de isopreno por espectrofotometría IR obtenidas
en pastilla de KBr
65
Tabla 17. Caracterización por RMN de 1H (300 y 500 MHz) y
13C (75 y 125
MHz) en DMSO-d6 de la mezcla de regioisómeros de los aductos Diels-Alder
6a-d y 7a-d derivados de isopreno
67
Tabla 18. Características físicas de los aductos Diels-Alder 11a-d derivados de
ciclopentadieno
68
Tabla 19. Caracterización por RMN de 1H (500 MHz) y
13C (125 MHz) en
DMSO-d6 de los aductos Diels-Alder 11a-d derivados de ciclopentadieno
71
Tabla 20. Características físicas de los aductos Diels-Alder 14a-d derivados de
furano
72
Tabla 21. Caracterización de los aductos Diels-Alder 14a-d derivados de
furano por espectrofotometría IR obtenidas en pastilla de KBr
73
Tabla 22. Caracterización por RMN de 1H (500 MHz) y
13C (125 MHz) en
DMSO-d6 de los aductos Diels-Alder 14a-d derivados de furano
75
Tabla 23. Características físicas de los ácidos N-fenilfumarámicos 16a-d 76
Tabla 24. Caracterización de los ácidos N-fenilfumarámicos 16a-d por
espectrofotometría IR obtenidas en pastilla de KBr
78
Tabla 25. Caracterización por RMN de 1H (500 MHz) y
13C (125 MHz) en
DMSO-d6 de los ácidos N-fenilfumarámicos 16a-d
79
Tabla 26. Caracterización por RMN de 1H (300 MHz) y
13C (75 MHz) en
DMSO-d6 de la mezcla de regioisómeros de los aductos Diels-Alder 17a-d y
18a-d derivados de isopreno
83
Tabla 27. Análisis de homología de la enzima GABA-AT de P. fluorescens
comparada con las especies E. coli, M. musculus, S. scrofa y H. sapiens.
Comparación de los aminoácidos del sitio activo que cambian en cada uno con
respecto a P. fluorescens
89
Tabla 28. Criterio de selección del modelo 92
Tabla 29. Optimización por mecánica molecular de la GABA-AT modelada
con PLP como coenzima
93
ix
Tabla 30. Constantes de disociación (KD) y radio (KD1/KD2) de cada uno de los
aductos Diels-Alder derivados de los ácidos maleico y fumárico con isopreno
94
Tabla 31. Constantes de disociación (KD) y radio (KD1/KD2) de cada uno de los
aductos Diels-Alder derivados de los ácidos maleico y fumárico con
ciclopentadieno
100
Tabla 32. Constantes de disociación (KD) y radio (KD1/KD1) de cada uno de los
aductos Diels-Alder derivados de los ácidos maleico y fumárico con furano
103
Tabla 33. Cernimiento de actividad inhibitoria de los aductos Diels-Alder
sintetizados, comparados con GABA a una concentración de 0.8 mM
111
Tabla 34. Parámetros cinéticos de la mezcla de regioisómeros sobre la enzima
GABA-AT
112
Tabla 35. Propósitos que persiguen los modelos animales para la evaluación
de sustancias nuevas o conocidas
115
Tabla 36. ensayo preliminar de determinación de la DE95 de PTZ 117
Tabla 37. Efectos de la VGB en el modelo de las convulsiones inducidas con
PTZ (D = 110 mg/kg)
119
Tabla 38. Efectos de la VGB en el modelo de las convulsiones inducidas con
PTZ (D = 75 mg/kg)
120
Tabla 39. Bioensayo sobre los compuestos 6b y 7b utilizando como control
positivo a VGB contra la dosis de PTZ de 75 mg/kg
139
Tabla 40. Volúmenes utilizados de cada reactivo en la determinación de la
actividad enzimática de GABA-AT con y sin inhibidor
156
x
II. ÍNDICE DE FIGURAS
FIGURA Pág.
Figura 1. Etapas fundamentales para llevar a cabo un estudio de Docking 7
Figura 2. Selección del sitio de unión a ligando 8
Figura 3. Diagrama de energía-radio para el modelo de fuerzas de Van der
Waals. reqm = Equilibrio de separación internuclear
10
Figura 4. Clasificación de los tipos de receptores más importantes que
participan en el SNC
13
Figura 5. Canales iónicos dependientes de ligando y canales iónicos
dependientes de voltaje
14
Figura 6. Canales metabotrópicos que regulan canales iónicos dependientes de
voltaje en el SNC
14
Figura 7. Tres estados eléctricos de una neurona 16
Figura 8. Biosíntesis de GABA. PLP: Fosfato de Piridoxal; GAD: Glutamato
Descarboxilasa
16
Figura 9. Sinapsis GABAérgica. Biosíntesis, liberación, transmisión,
regulación y degradación. GABA-T: Aminotransferasa de GABA; GAD:
Glutamato descarboxilasa; GDP: Difosfato de guanosina; SSA: Semialdehído
succínico; SSADH: Semialdehído succínico deshidrogenasa
17
Figura 10. Función bioquímica de la enzima GABA-AT 18
Figura 11. Patrón eléctrico de los distintos tipos de ondas cerebrales (, , y
) registradas en un EEG
19
Figura 12. Electroencefalogramas de los diferentes tipos de epilepsia 21
Figura 13. Mecanismo de acción de los fármacos antiepilépticos. (+):
Activación; (-): inhibición
25
Figura 14. Estructura de los bloqueadores de canales de Na+ voltaje-
dependientes en período refractario
27
Figura 15. Mecanismo de acción de los fármacos bloqueadores de canales de
Na+ voltaje- dependientes
27
Figura 16. Estructura de los moduladores de GABA durante la sinapsis 28
Figura 17. Transmisión sináptica incrementada del GABA 28
xi
Figura 18. Estructuras de los principales fármacos bloqueadores de los canales
de Ca2+
tipo T
29
Figura 19. Reducción de la corriente de Ca2+
tipo T inducida por
anticonvulsivos
30
Figura 20. Mecanismo de reacción de la inhibición irreversible de la
vigabatrina con la Lys329 del sitio activo de la enzima aminotransferasa de
GABA
31
Figura 21. Estructura de la vigabatrina R y S 32
Figura 22. Interacción HOMO-LUMO de las especies involucradas en una
reacción de Diels-Alder
33
Figura 23. Regioselectividad de la reacción Diels-Alder. Los estereoisómeros
no se muestran
33
Figura 24. Posibles mecanismos de reacción por los cuales se podría lleva a
cabo una cicloadición. a: concertado; b: dirradical; c: iónico
35
Figura 25. Analogía estructural de los aductos Diels-Alder propuestos con el
ácido -aminobutírico (GABA). Se muestran los derivados con sustitución en
meta
37
Figura 26. Reacción general de síntesis de los ácidos N-fenilmaleámicos 5a-d 40
Figura 27. Reacción de formación del los aductos Diels-Alder 4a-d 44
Figura 28. Espectro de RMN de 1H del compuesto 4b 45
Figura 29. Espectro bidimensional de acoplamiento 1H-
1H COSY del aducto
4b. a = H7, b = H4, c = H4, d = H7
46
Figura 30. Espectro bidimensional de acoplamiento 1H-
13C a tres enlaces
HSQC para 4b
47
Figura 31. Geometrías optimizadas al nivel B3LYP/6-31+G(d,p). Se muestran
las energías relativas calculadas (G a 25°C, kcal/mol) y las proporciones de
cada confórmero asumiendo una distribución de Boltzmann para los botes y las
sillas del aducto 4b
50
Figura 32. Síntesis general de los aductos Diels-Alder 4a-d a través de una
MCR
52
Figura 33. Síntesis de la mezcla de regioisómeros 6a y 7a a partir de 5a y 2 54
Figura 34. Mezcla de regioisómeros 6a y 7a obtenidos a 60 °C por 120 h a
agitación constante con AcOEt como disolvente
55
xii
Figura 35. Secuencia de eventos que ocurren durante la reacción
multicomponente para el aducto 4a
56
Figura 36. Reacciones generales de síntesis de los aductos Diels-Alder 6a-d,
7a-d, 11a-d y 14a-d a partir de los aductos 8, 10a y 13
58
Figura 37. Reacciones generales de síntesis de los aductos Diels-Alder 6a-d,
7a-d, 11a-d y 14a-d a partir de los aductos 8, 10a y 13
62
Figura 38. Mezcla de regioisómeros 6b y 7b obtenidos a partir del aducto 8 63
Figura 39. Diagrama de obtención del aducto 11b por medio de dos rutas
sintéticas
68
Figura 40. Espectro de RMN de 1H para el aducto 11b obtenido bajo el primer
método (a partir de 5b y 2 en acetona, a 40°C por 96h)
69
Figura 41. Espectro de RMN de 1H para el aducto 11b obtenido bajo el
segundo método (a partir de 10a y 3b en THFanh., a t.a. por 16h)
70
Figura 42. Espectro de RMN de 1H para el aducto 14b 74
Figura 43. Reacción general de síntesis de los ácidos N-fenilfumarámicos 16a-d 76
Figura 44. Reacción general de síntesis de la mezcla de regioisómeros de los
aductos Diels-Alder 17a-d y 18a-d
80
Figura 45. Espectro de RMN 1H para las mezcla de regioisómeros de los
aductos 17b y 18b
81
Figura 46. Alineamiento de GABA-AT de Pseudomonas fluorescens vs Homo
sapiens. *: aminoácidos idénticos, : : aminoácidos diferentes pero que puede
sustituirse, . : aminoácidos con cierta homología, Amarillo: aminoácidos
idénticos del sitio activo para las dos secuencias. Verde: aminoácidos
diferentes que no son homólogos en el sitio activo
85
Figura 47. Alineamiento de GABA-AT de Pseudomonas fluorescens vs Sus
scrofa. *: aminoácidos idénticos, : : aminoácidos diferentes pero que puede
sustituirse, . : aminoácidos con cierta homología, Amarillo: aminoácidos
idénticos del sitio activo para las dos secuencias. Verde: aminoácidos
diferentes que no son homólogos en el sitio activo
86
xiii
Figura 48. Alineamiento de GABA-AT de Pseudomonas fluorescens vs Mus
musculus. *: aminoácidos idénticos, : : aminoácidos diferentes pero que puede
sustituirse, . : aminoácidos con cierta homología, Amarillo: aminoácidos
idénticos del sitio activo para las dos secuencias. Verde: aminoácidos
diferentes que no son homólogos en el sitio activo
87
Figura 49. Alineamiento de GABA-AT de Pseudomonas fluorescens vs
Escherichia coli. *: aminoácidos idénticos, : : aminoácidos diferentes pero que
puede sustituirse, . : aminoácidos con cierta homología, Amarillo:
aminoácidos idénticos del sitio activo para las dos secuencias. Verde:
aminoácidos diferentes que no son homólogos en el sitio activo
88
Figura 50. Estructura tetramérica tridimensional determinada por difracción de
rayos X de la GABA-AT de Escherichia coli
90
Figura 51. Gráfico de Ramachandran 90
Figura 52. Ángulos de torsión y del enlace peptídico 90
Figura 53. A: Secuencia molde 1sffC de E. coli. B: Modelo de P. fluorescens.
Determinados en Swiss Model
91
Figura 54. A: Secuencia molde 1sf2A de E. coli. B: Modelo de P. fluorescens.
Determinados en I-Tasser
91
Figura 55. A: (gris) molde 1sffC de E. coli; (rojo): modelo de P. fluorescens
generado por Swiss-Model. B: (gris) molde 1sf2A de E. coli; (azul) modelo de
P. fluorescens generado por I-Tasser
92
Figura 56. Enzima GABA-AT modelada y optimizada a 1500 con la coenzima
PLP
93
Figura 57. Comparación de las constantes de disociación (KD) de cada uno de
los enantiómeros de los aductos Diels-Alder derivado de isopreno. 6a-d y 7a-
d: corresponden a la mezcla de regioisómeros derivados de ácido maleico
obtenidos experimentalmente. 17a-d y 18a-d: corresponden a la mezcla de
regioisómeros derivados del ácido fumárico obtenidos experimentalmente
95
Figura 58. A: p-COOEt-RS-Amec-Acax-IP (KD = 505.77 M); B: p-COOEt-
SR-Amec-Acax-IP (KD = 662.82 M); C: p-COOEt-RS-Amec-Acax-IP (KD
= 291.62 M); D: p-COOEt-SR-Amec-Acax-IP (KD = 138.07 M)
96
xiv
Figura 59. A: p-COOEt-RR-Amec-Acec-IP (KD = 56.12 M); B: p-COOEt-
SS-Amec-Acec-IP (KD = 96.00 M); C: p-COOEt-RR-Amec-Acec-IP (KD =
136.49 M); D: p-COOEt-SS-Amec-Acec-IP (KD = 14.28 M)
97
Figura 60. Comparación de las constantes de disociación (KD) de cada uno de
los enantiómeros de los aductos Diels-Alder derivado de ciclopentadieno. 11a-
d: corresponden a los compuestos sintetizados
99
Figura 61. A: p-COOEt-RS-exo-CP (KD = 37.05 M); B: p-COOEt-SR-exo-
CP (KD = 239.73 M); C: p-COOEt-RS-endo-CP (KD = 137.35 M); D: p-
COOEt-SR-endo-CP (KD = 424.08 M)
101
Figura 62. A: p-COOEt-RR-Amexo-Acendo-CP (KD = 84.79 M); B: p-COOEt-
SS-Amexo-Acendo-CP (KD = 137.71 M); C: p-COOEt-RR-Amendo-Acexo-CP (KD
= 144.22 M); D: p-COOEt-SS-Amendo-Acexo-CP (KD = 150.88 M)
102
Figura 63. Comparación de las constantes de disociación (KD) de cada uno de
los enantiómeros de los aductos Diels-Alder derivado de furano. 14a-d:
corresponden a los compuestos sintetizados
104
Figura 64. A: p-COOEt-RS-exo-Fur (KD = 8.42 M); B: p-COOEt-SR-exo-Fur
(KD = 254.97 M); C: p-COOEt-RS-endo-CP (KD = 18.34 M); D: p-COOEt-
SR-endo-CP (KD = 22.37 M)
104
Figura 65. Interacción del GABA en el sitio activo de la GABA-AT 106
Figura 66. A. Interacción con la R-vigabatrina. B. Interacción con la S-
vigabatrina
107
Figura 67. Reacción enzimática acoplada llevada a cabo en la determinación
de la actividad de GABA-AT de P. fluorescens
108
Figura 68. Gráfico que muestra la actividad de la enzima GABA-AT a
distintas concentraciones de sustrato en función del tiempo
109
Figura 69. Representación de la actividad enzimática de GABA-AT como
función de la concentración de GABA. Curva de Michaelis-Menten
109
Figura 70. Determinación de los parámetros cinéticos de la GABA-AT por el
método de Hanes-Wolff
110
xv
Figura 71. Análisis del tipo de inhibición de la mezcla de regioisómeros 6b y
7b por el método de la doble recíproca de Lineweaver-Burk: (1/r0) =
(Km/rmáx)(1/[S]) + 1/rmáx; donde r0 es la rapidez a cierta concentración de
sustrato, [S] es la concentración de sustrato. Análisis de regresión lineal por
mínimos cuadrados. Parámetros analizados con la prueba t de Student. n = 6.
Los coeficientes de regresión lineal (r) y las pendientes (B) fueron
estadísticamente significativas (p < 0.001). Las ordenadas al origen (A) no
difieren de cero (p > 0.20), excepto para la línea recta con [I] = 0.00 mM con p
< 0.001
112
Figura 72. Determinación de la Ki por el método de Schild: log[(B’/B)-1] =
nHlog[I] – nHlogKi. B’: pendiente en presencia de inhibidor, B: pendiente sin
inhibidor, nH: coeficiente de Hill, Ki: constante de inhibición. Análisis de
regresión lineal por mínimos cuadrados. Parámetros analizados con la prueba t
de Student. El coeficiente de regresión lineal (r), la pendiente (B) y la ordenada
al origen (A) fueron estadísticamente significativos (p < 0.02)
113
Figura 73. Gráfica de Michaelis mente descrita por la enzima GABA-AT
según la ecuación:
r0 = (rmáx [S])/ (Km + [S])
113
Figura 74. Pentilentetrazol (PTZ) 116
Figura 75. Picrotoxina: psicoestimulante que aumenta los niveles de actividad
motriz y cognitiva, refuerza la vigilia, el estado de alerta y la atención, y se ha
utilizado como antídoto para la intoxicación con barbitúricos, ya que la
picrotoxina es un antagonista no competitivo del receptor GABAA
116
Figura 76. Curva dosis respuesta cuantal de crisis convulsivas para la
determinación de la DE95 de PTZ bajo el método logit
118
Figura 77. Efecto de la VGB sobre la latencia a la primera crisis convulsiva
tónico-clónica. ANOVA de una vía, el análisis de medias fue realizado por el
método de Duncan; * p < 0.005
120
Figura 78. Gráfico que muestra el efecto sobre la latencia a la primera crisis
convulsiva para las distintas dosis de VGB (rojo), aductos (amarillo) en
comparación con el grupo control (verde). Se muestran barras que
corresponden a la media + EEM. Los datos fueron analizados con la prueba t
de Student. Todos los resultados presentaron una p > 0.05
122
xvi
Figura 79. Diagrama de flujo para la preparación de la enzima GABA-AT y
generar el archivo *.pdbqt
152
Figura 80. Diagrama de flujo para la preparación de los ligandos y generar los
archivos *.pdbqt
153
Figura 81. Diagrama de flujo para la preparación de los archivos *.gpf 154
Figura 82. Diagrama de flujo para la preparación de los archivos *.dpf 154
Figura 83. Administración subcutánea (s.c.) practicada en ratones 158
Figura 84. A: Convulsión tónica; B: Convulsión clónica 158
xvii
III. ACRÓNIMOS Y ABREVIATURAS
a.C.: Antes de Cristo
AcOEt: Acetato de etilo
Act: Actividad enzimática
AM1: Austin Model 1 (modelo 1 de Austin)
Amec-Acec: Amida en posición alfa-ecuatorial y ácido carboxílico en posición beta-
ecuatorial
Amec-Acax: Amida en posición beta-axial y ácido carboxílico en posición alfa-
ecuatorial
Amendo-Acexo: Amida con esteroquímica endo y ácido carboxílico con estereoquímica exo
Amexo-Acendo: Amida con estereoquímica exo y ácido carboxílico con estereoquímica
endo
AMPA: Ácido α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolepropiónico
AMPC: Monofosfato de adenosina cíclica
anh.: Anhidro
ANOVA: Análisis de variancia
B3LYP: Becke, three-parameters, Lee-Yang-Parr
°C: Grados Celsius
CC: Con convulsiones
CHARMM: Chemistry at Harvard Molecular Mechanics
CICATA: Centro de Investigación en Ciencia Aplicada y Tecnología Avanzada
CINVESTAV: Centro de Investigaciones Avanzadas
COSY: Correlation Spectroscopy
CP: Ciclopentadieno
d.C.: Después de Cristo
DCM: Diclorometano
DE75: Dosis efectiva 75, a la cual el 75 % de los sujetos experimentales responde
DE95: Dosis efectiva 95, a la cual el 95 % de los sujetos experimentales responde
D.F.: Distrito Federal
DMSO-d6: Dimeltilsulfóxido deuterado
DNA: Ácido desoxirribonucleico
DRX: Difracción de rayos X
DVGB: Dosis de vigabatrina
xviii
: Coeficiente de absortividad molar
EEG: Electroencefalograma
EEM: Error estándar de la media
EI: Electronic impact (impacto electrónico)
EMBL-EBI: The European Molecular Biology Laboratory- European Bioinformatics
Institute
EM: Espectrometría de masas
ENCB: Escuela Nacional de Ciencias Biológicas
ESM: Escuela Superior de Medicina
FES: Facultad de Estudios Superiores
FMO: Frontier Molecular Orbital (Orbitales moleculares frontera)
Fur: Furano
g: Gramos
GAD: Glutamato descarboxilasa
GABA: Ácido -aminobutírico
GABAA: Receptor a GABA tipo A
GABAB: Receptor a GABA tipo B
GABAC: Receptor a GABA tipo C
GABA-AT: Aminotransferasa de GABA
GAT-1: Transportado de GABA tipo 1
GDP: Difosfato de guanosina
HF: Hartree-Fock
HOMO: Highest-Occupied Molecular Orbital (Orbital Molecular Ocupado de más alta
energía)
HRMS: High Resolution Mass Spectrometry (espectrometría de masas de alta resolución)
HSQC: Heteronuclear single quantum coherence
Hz: Hertz
[I]: Concentración de inhibidor
i.p.: Vía intraperitoneal
IP: Isopreno
IPN: Instituto Politécnico Nacional
3Jcis: Constante de acoplamiento vecinal entre hidrógenos en configuración cis
3JH-H: Constante de acoplamiento vecinal entre hidrógenos
xix
3Jgem: Constante de acoplamiento geminal o a dos enlaces entre hidrógenos
3Jo: Constante de acoplamiento vecinal entre hidrógenos en posición orto
3Jtrans: Constante de acoplamiento vecinal entre hidrógenos en configuración trans
k: Constante experimental de rapidez
kcal: Kilocalorías
KD: Constante de disociación
kg: Kilogramo
Ki: Constante de inhibición
Km: Constante de Michaelis-Menten
IR: Infrarrojo
máx: Longitud de onda máxima
LUMO: Lowest-Unoccupied Molecular Orbital (Orbital Molecular Desocupado de menor
energía)
MCR: Multicomponent reaction (reacción multicomponentes)
MeOH: Metanol
MES: Maximal electroshock (electrochoque máximo)
mg: Miligramo
MHz: Megahertz
min: Minuto (s)
mM: Concentración milimolar
MMFF: Merck Molecular Force Field (campo de fuerza molecular Merck)
mmol: Milimol
mL: Mililitro
L: Microlitro
mol: mol
n: Tamaño muestral
máx: Número de onda máximo
-NADP+: Beta-fosfato de dinucleótido de nicotinamida y adenina oxidado
-NADPH: Beta-fosfato de dinucleótido de nicotinamida y adenina reducido
NAMD: Nanoscale Molecular Dynamics
ND: No determinado
xx
nH: Coeficiente de Hill
nm: Nanómetros
PDB: Protein Data Bank
P.f.: Punto de fusión
PLP: Fosfato de piridoxal
PMP: 5’-fosfato de piridoxamina
ppm: Partes por millón
PPSE: Potencial posináptico excitador
PPSI: Potencial presináptico inhibidor
PTZ: Pentilentetrazol
QSAR: Quantitative Structure-Activity Relationship (Relación Cuantitativa Estructura-
Actividad)
r0: Rapidez enzimática a cierta concentración de sustrato
Rf: Retention factor (factor de retención)
rmáx: Rapidez máxima de actividad enzimática
RMN: Resonancia Magnética Nuclear
RNA: Ácido ribonucleico
[S]: Concentración de sustrato
s.c.: Vía subcutánea
SSA: Semialdehído succínico
SSADH: Semialdehído succínico deshidrogenasa
SNC: Sistema nervioso central
t.a.: Temperatura ambiente
THF: Tetrahidrofurano
UNAM: Universidad Nacional Autónoma de México
UV: Ultravioleta
UV-Vis: Espectrofotometría ultravioleta-visible
VGB: Vigabatrina
1
RESUMEN
El ácido -aminobutírico (GABA) es el principal neurotransmisor inhibidor del
sistema nervioso central (SNC), y es responsable de muchos procesos de regulación
fisiológica en los mamíferos; entre ellos, regula los procesos de excitación-inhibición de
las neuronas. Cuando la actividad del GABA está alterada se pierde el balance y
aumenta de manera sustancial el proceso excitatorio sobre el inhibitorio y sobreviene
una crisis convulsiva. En este trabajo se presenta la síntesis de aductos Diels-Alder
derivados de los ácidos maleico y fumárico cuyas estructuras poseen una analogía
estructural con el GABA. El propósito de esto es inhibir a la enzima aminotransferasa
del GABA (GABA-AT) y con ello retrasar la degradación bioquímica del
neurotransmisor, incrementando la concentración de GABA en el espacio sináptico.
Todos los compuestos sintetizados fueron caracterizados espectroscópicamente.
Además, fueron evaluados biológicamente, in vitro sobre la enzima GABA-AT de
Pseudomonas fluorescens, in vivo con el modelo de las convulsiones inducidas con
pentilentetrazol (PTZ) e in silico con la evaluación de la interacción ligando-enzima de
cada uno de los aductos a través del modelado de la GABA-AT de P. fluorescens,
tomando como molde la secuencia de la enzima de Escherichia coli cuya estructura
tridimensional ha sido resuelta por difracción de rayos X (DRX). Los resultados
obtenidos mostraron que la mezcla de regiosisómeros 6a y 7a induce inhibición sobre
GABA-AT con aproximadamente 10 veces más afinidad que la vigabatrina (VGB,
principal inhibidor de la enzima), y con una ligera tendencia a la protección contra las
convulsiones inducidas con PTZ a la dosis de 75 mg/kg. La evaluación de la interacción
ligando-enzima por Docking mostró que los aductos se unen en el sitio activo de la
enzima con una afinidad en promedio más alta que el neurotransmisor GABA y la
vigabatrina.
2
ABSTRACT
The -aminobutyric acid (GABA) is the main central nervous system (CNS) inhibitory
neurotransmitter; responsible of several physiological processes on mammals; among
them, it regulates the control of the excitation-inhibition processes of neurons. When the
activity of GABA is altered, the equilibrium is lost, a fact that causes an increase of the
excitatory process over the inhibitory, leading to seizure crisis. In this work, the
synthesis of Diels-Alder adducts of maleic and fumaric acids is presented; these adducts
possess a certain structural analogy with GABA. It is expected that they would inhibit
the GABA aminotransferase enzyme (GABA-AT), leading to an increase in the
concentration of GABA at the synapsis. All compounds synthesized were characterized
spectroscopycally. The compounds were also biologically evaluated, in vitro on the
GABA-AT of Pseudomonas fluorescens, in vivo with the pentylenetetrazole-induced
seizure model in mice, and in silico on the evaluation of the ligand-enzyme interaction
by means of docking, GABA-AT protein of P. fluorescens taking the sequence of the
enzyme of Escherichia coli as template, the structure of which has been determined by
X-ray diffraction. The results showed that the regioisomer mixture of 6a and 7a
inhibited GABA-AT with an affinity approximately ten times higher than vigabatrin
(VGB: main inhibitor of GABA-AT), it also showed a light tendency on the blocking
PTZ-induced seizures at a dose of 75 mg/kg. Finally the evaluation of the ligand-
enzyme interaction by means of Docking showed that adducts bind to the active site
with an average affinity higher than GABA and vigabatrin.
3
1. INTRODUCCIÓN
Las crisis epilépticas son un trastorno transitorio del comportamiento causado por la
activación desordenada, sincrónica y rítmica de poblaciones enteras de neuronas
cerebrales.1 Por lo tanto, a un trastorno de la función cerebral que se caracteriza por
surgimiento periódico e impredecible de crisis, se le denomina epilepsia.
La epilepsia es una enfermedad que afecta aproximadamente al 1%2 de la población
mundial con una incidencia de 1000 a 100 0003 nuevos casos por año; en México,
representa un problema de salud pública, ya que el 1.8% de la población la padece,4 y
más del 80% de las personas afectadas son menores de 15 años. Sin embargo, existen
diferentes estrategias para tratar y controlar a la enfermedad, las cuales incluyen una
terapia tanto psicológica como farmacológica.
En la actualidad existen diferentes fármacos con acción antiepiléptica que actúan de
diferente manera sobre las células neuronales; la gran mayoría de ellos actúan sobre
canales iónicos (de conductancia a Na+, K
+, Ca
2+ y Cl
-),
1,5 seguidos por aquellos que
actúan sobre la recaptura de neurotransmisores1 y enzimas regulatorias de las sinapsis
(Aminotransferasa del GABA).1
Hoy por hoy, se buscan nuevos fármacos más selectivos hacia blancos biológicos. Por
tal motivo, en este trabajo se pretenden sintetizar una serie de aductos tipo Diels-Alder
derivados de los ácidos carboxifenilmaleámicos y carboxifenilfumarámicos, con el fin
de inhibir a la enzima aminotransferasa del GABA que está involucrada en la
biotransformación del ácido -aminobutírico (GABA).
1.1 Panorama histórico y diseño de fármacos
Los fármacos pueden ser considerados como el descubrimiento más importante del
siglo XX ya que la vida del hombre está estrechamente relacionada con su uso; tan es
así que actualmente la humanidad cuenta con una gran serie de sustancias que se han
desarrollado a partir de un prototipo molecular6 denominado ―cabeza de serie‖. La
búsqueda de estos prototipos y las modificaciones moleculares que pueden sufrir los
mismos es el objetivo de la química farmacéutica también conocida como química
medicinal.
4
La historia del descubrimiento de los fármacos se encuentra relacionada con el
desarrollo de las ciencias experimentales, sobre todo de la química orgánica y la
biología molecular, sin dejar de hacer mención del desarrollo de los métodos
instrumentales de análisis y la aplicación de la informática que han sido la piedra
angular de la dilucidación de la estructura de las proteínas y el establecimiento de la
relación estructural de los fármacos con su actividad biológica.
Cabe mencionar que el uso de sustancias relacionadas con el restablecimiento de la
salud se conoce desde la antigüedad pasando por el uso de metales y sus sales por la
influencia ejercida por Hipócrates (460-370 a.C.) hasta Galeno (131-200 d.C.) en la
Europa occidental. De la misma manera en Medio Oriente y en algunas regiones de
Asia como China e India también utilizaron por muchísimo tiempo los minerales en el
campo de la terapéutica. No fue sino hasta finales del siglo XV con Paracelso (1493-
1541) que comienza propiamente la química farmacéutica al utilizar las plantas frente a
los minerales. Asimismo civilizaciones indoamericanas (incas, aztecas, etc.) ya
utilizaban las plantas con fines medicinales en el mismo período. A partir del siglo XVII
después del descubrimiento de América por los españoles, los exploradores habían
estudiado las sustancias de las plantas, y una de las más representativas fue la corteza
del árbol de la quina (Cinchona pubescens); este período estuvo marcado por el uso de
plantas medicinales y la organización de las primeras expediciones sistemáticas de
clasificación botánica (Linnaeus 1707-1778) y su relación con sus efectos biológicos.
Para el siglo XVIII predominó el pensamiento de relacionar la acción de las sustancias
activas de las plantas en diferentes órganos.
El siglo XIX es considerado el ―comienzo de la era de los fármacos‖ con el
advenimiento de la anestesia general y la resolución del problema del dolor; así mismo
se inició la síntesis química de compuestos que trataban de resolver el mismo problema.
Al mismo tiempo fueron purificados distintos extractos vegetales y se realizaron
aproximaciones de su dilucidación estructural.
En el siglo XX se inició con la utilización del ácido acetilsalicílico y la síntesis de la
adrenalina, así como de algunos otros fármacos bactericidas, anticoagulantes,
antihistamínicos, el aislamiento de hormonas (esteroides, insulina) y la determinación
de la función de la acetilcolina, etc. La edad de oro de la introducción de nuevos
fármacos corresponde al período comprendido de 1940 a 1960, en gran parte por el
inicio de la segunda guerra mundial (1939-1945).
5
Tabla 1. Eventos históricos relevantes en el desarrollo de la química farmacéutica.
Descubridor Descubrimiento Período
Cullen Primeros intentos para relacionar la acción de las sustancias
activas de las plantas con distintos órganos
1712-1790
Sertürner Aislamiento de la morfina de Papaver somniferum 1806
Pelletier, Dumas
y Caventou
Extracción de la quinina de la corteza peruana de la Cinchona
pubescens
1823
Mein Aislamiento de la atropina de la planta Atropa belladona 1831
Niemann Utilización de la cocaína como anestésico local 1860
Davy Descubrimiento del N2O (óxido nitroso) como anestésico 1778-1829
Long Utilización del éter etílico como anestésico 1815-1875
Simpson Utilización del cloroformo como anestésico 1811-1870
Knorr Síntesis de la antipirina para tratar el dolor 1883
Dreser Síntesis del hedonal como hipnótico 1889
E. Fischer y von
Mering
Síntesis del primer barbitúrico (veronal) 1903
Paul Ehrlich Fundador de la quimioterapia. Planteó las relaciones estructura
química con la actividad biológica de los fármacos, así como,
el planteamiento del concepto de receptor.
1854-1915
Hoffman Inicio de la utilización del ácido acetilsalicílico 1898
Stolz y Dakin Síntesis de la adrenalina 1904
Gelmo Síntesis de las sulfanilamidas 1908
McLean y
Howell
Se consideró a la heparina como anticoagulante natural 1916-1922
Loewi Se determinó la función de la acetilcolina como mediador en
la transmisión nerviosa
1921
Banting y Best Aislamiento de la insulina para el tratamiento de la diabetes 1921
Zilva y Szent-
Györgyi
Aislamiento de la vitamina C 1918-1928
Bovet y Staub Síntesis de los antihistamínicos 1937
Florey y Chain Se demostró la actividad bacteriostática y manufactura de la
penicilina
1940
6
La tragedia de la talidomida supuso una llamada de atención a las autoridades
sanitarias de todo el mundo que reforzaron los requisitos necesarios para la
introducción en el mercado de nuevos medicamentos (Tabla 1).
Actualmente descubrir y desarrollar un fármaco implica encontrar un compuesto con
cierta actividad biológica que eventualmente pueda hacerse más selectiva y potente, al
modificar ciertos parámetros fisicoquímicos que permitan a la molécula tener mejor
selectividad hacia su blanco biológico vía reconocimiento, o una farmacocinética
adecuada que permita encontrar una mejor eficacia, así como disminuir su toxicidad.6
Encontrar el fármaco ideal es difícil; sin embargo, existen distintas metodologías
como la modificación química de la estructura de moléculas con potencial biológico o
fármacos probados, las cuales se han ido mejorando y creando compuestos prototipo o
líderes. Los compuestos líderes se pueden desarrollar de una manera racional y dirigida
con la ayuda de métodos computacionales como el Docking con el fin de sintetizar
nuevos compuestos con gran afinidad, potencia y eficacia hacia receptores específicos.
1.2 Docking
Como se mencionó anteriormente la mayoría de los fármacos conocidos han sido
aislados de los productos naturales, por síntesis o serendipia, así como sus análogos y
derivados químicos; sin embargo, hoy en día se dispone de tecnología más avanzada y
sofisticada para encontrar nuevas moléculas para uso terapéutico a través de búsquedas
sistemáticas empleando métodos computacionales7.
Para iniciar con la búsqueda es necesario encontrar un blanco biológico y molecular en
el cual será el punto de enfoque; entre los blancos más comunes destacan las proteínas
(receptores, enzimas, canales iónicos y receptores nucleares), las hormonas y factores, y
finalmente el RNA y el DNA7.
Cabe mencionar que cuando se trabaja con proteínas y en particular con enzimas es
importante considerar tres aspectos fundamentales: especificidad y selectividad por la
enzima, afinidad con la cual se une el sustrato a la proteína y la geometría del sitio
activo.
Una vez escogido el blanco o receptor de estudio es necesario escoger una serie de
compuestos para identificar de ellos una molécula líder o cabeza de serie6, a los cuales
se les hace pasar por pruebas a microescala o rastreo para seleccionar aquellas
moléculas que tengan la mejor actividad biológica sobre el blanco escogido; para
7
eventualmente sintetizar nuevos análogos y probarlos biológicamente con el fin de
establecer una relación cuantitativa estructura-actividad6,7
(QSAR). Esta es la forma
tradicional de hallar nuevas moléculas activas; sin embargo, este trabajo requiere de
mucho tiempo y de recursos. Por esto se han ideado metodologías más rápidas,
eficientes y menos costosas, como la simulación de la interacción ligando-receptor
asistido por computadora (Docking); a este tipo de ensayos se les denomina estudios in
silico.
La metodología Docking consta de una serie de etapas; la primera de ellas es disponer
de la estructura tridimensional de la molécula blanco; la segunda consiste en tener una
numerosa serie de ligandos potenciales con estructura tridimensional conocida; y la
tercera etapa consiste en un algoritmo de computadora que toma cada uno de los
ligandos y los hace interaccionar con la molécula blanco en el sitio de unión
previamente escogido (Figura 1).
Figura 1. Etapas fundamentales para llevar a cabo un estudio de Docking
Para hacer un estudio de docking, es necesario tener la estructura de la macromolécula
en tercera dimensión determinada por difracción de rayos X, por Resonancia Magnética
Nuclear (RMN) o modelado molecular (folding). La fuente principal de estructuras
tridimensionales de proteínas es el Protein Data Bank (PDB), el cual es de acceso
gratuito a través de la página web http:www.pdb.org. Las proteínas que se obtienen de
esta base de datos generalmente no pueden ser utilizadas directamente para realizar un
estudio de interacción con algún ligando; antes de este proceso es necesario realizar un
tratamiento previo que consiste en la adición de átomos de hidrógeno que constituyen
casi la mitad de los átomos de la proteína, remover las moléculas de agua y las
8
moléculas ajenas a la proteína, exceptuando a los grupos prostéticos o coenzimas que
están ocupando el sitio de unión del receptor, y por último la asignación de cargas
eléctricas formales y parciales a los átomos de los aminoácidos que componen a la
proteína de acuerdo al pH en la simulación.
Una vez realizado el tratamiento, se escoge una región de la proteína para la
exploración con los ligandos, siempre y cuando se conozca el sitio activo o algún sitio
alostérico al cual se unan los ligandos; sin embargo, también es posible explorar toda la
proteína para encontrar posibles sitios de unión con moléculas nuevas, aunque ello
requiere más tiempo de cómputo y por lo tanto el cálculo se hace un poco más
complicado. En relación a lo anterior existen dos alternativas para delimitar la selección
de la región a explorar; una de ellas consiste en revisar la superficie molecular con
ciertas características de tamaño, hidrofobicidad y grupos funcionales. La otra
alternativa es meramente experimental y sugiere determinar los sitios en donde las
moléculas de disolvente orgánico se albergan; y su determinación se hace constar con la
proteína cristalizada y visualizada en difracción de rayos X7. La ubicación del
disolvente sobre la proteína se consideran como sitios potenciales de unión a ligando.
En general, a este tipo de búsqueda de sitios de unión a ligando se le conoce como
mapeo por rejillas (celdas) o ―Grid Maps‖, el cual consiste en una celosía tridimensional
de puntos centrados y alrededor de la región de interés. Las distancias entre cada punto
varían desde 0.02 hasta 0.1 nm
Cada punto en la celda debe tener coordenadas tridimensionales nx, ny y nz, las cuales
representan una energía potencial para cada átomo o grupo funcional estudiado en la
proteína (Figura 2).
Figura 2. Selección del sitio de unión a ligando.
9
Por otro lado, es importante definir lo que entendemos por ligandos, los cuales son
una serie de moléculas que tienen ciertas características químicas capaces de
interaccionar sobre una molécula blanco; estos ligandos pueden estar definidos como la
cabeza de serie o líder y sus derivados. Cada una de estas moléculas deben pasar por un
tratamiento computacional previo a la interacción con la diana biológica, y esto consiste
en minimizar u optimizar la estructura de cada molécula, para obtener su confórmero
más estable y de menor energía8; así como añadir átomos de hidrógeno, estimación de
cargas formales y parciales, asignación del número de enlaces de rotación libre, masa
molar, hidrofobicidad, etc.
Ya preparados tanto la proteína como los ligandos, el siguiente paso es hacer
interaccionar el ligando con la región del blanco previamente seleccionada; el programa
computacional toma al ligando haciéndolo explorar dentro del sitio de unión, mediante
esquemas numéricos de puntaje en función de la orientación adoptada por el ligando en
una interacción. Durante una interacción el ligando adopta una orientación con un cierto
número de contactos con la macromolécula; si estos contactos son permisibles y
positivos para la interacción tendrá un alto puntaje, de lo contrario esa orientación e
interacción son desechadas, es decir, el programa selecciona aquellas interacciones con
el más alto número de contactos permisibles (en función de las distancias y cargas)
hasta encontrar la mejor; a este tipo de esquema numérico se le conoce como
metodología Simplex7.
Una de las formas para obtener puntajes confiables es tener programas de
regularización de geometría empleando ecuaciones de la física clásica que determinen la
energía no covalente de la unión ligando-receptor como función de las distancias
atómicas entre moléculas; por ejemplo se puede utilizar la ecuación de Coulomb, la cual
calcula la energía electrostática entre dos átomos cargados:
E = k [(q1.q2)/(r1-2)2]
Donde k, es una constante (1/(40)), q1 es la carga de un átomo del blanco y q2 la
carga de un átomo del ligando, y r es la distancia entre ambos átomos7.
Cuando se trata de una interacción con distancias cercanas entre los átomos, la ecuación
de la energía potencial de van der Waals es calculable:
10
E = (Ae-br
/r) – (C6/r6)
Donde (Ae-br
/r) representa el intercambio de energía repulsiva y – (C6/r6) representa la
dispersión de energía atractiva entre los átomos. En general el término (Ae-br
/r) es
aproximadamente (C12/r12
), quedando la ecuación:
E = (C12/r12
) – (C6/r6) E = (Cm/r
m) – (Cn/r
n)
Donde C12 y C6, son constantes que dependen de la intensidad de energía y la
separación de equilibrio entre los núcleos de los átomos. 6 y 12, son los parámetros de
Lennard-Jones (m = 12, n = 6), que se refieren al modelo de las fuerzas de van der
Waals (Figura 3).
Figura 3. Diagrama de energía-radio para el modelo de fuerzas de Van der Waals. reqm = Equilibrio de
separación internuclear.
En un análisis de docking, existen algoritmos con los cuales es posible correr la
interacción entre el ligando y el receptor, entre los más comunes se encuentran el
método Monte Carlo que simula el reconocimiento, así como los algoritmos genéticos y
el algoritmo genético Lamarckiano. En la actualidad los algoritmos genéticos son los
más socorridos para un análisis de docking y se basan en el lenguaje de evolución
natural genética y biológica. En el caso de docking los arreglos espaciales de los
11
ligandos y la proteína pueden ser definidos por el establecimiento de valores descritos
para la traslación, orientación y conformación del ligando con respecto a la proteína; es
decir, los ligandos poseen estados variables que corresponden a un gen dentro del
algoritmo genético. El estado del ligando corresponde al genotipo, y sus coordenadas
atómicas corresponden a su fenotipo.9
El algoritmo toma un par de individuos (genes) que son cruzados por un proceso de
entrecruzamiento para generar nuevos individuos con genes heredados del padre y la
madre; sin embargo, durante este proceso la progenie puede sufrir mutaciones productos
de la gran cantidad de aleatorizaciones ocurridas. Por tal motivo, es necesario que el
algoritmo haga una selección de la progenie basada en el anclado de los individuos9.
El docking molecular o fitness es la energía de interacción total del ligando con la
proteína, y es evaluado a través de funciones de energía.
Además de obtener información de tipo cualitativo como los residuos de aminoácidos
de unión con el ligando, información sobre como mejorar la estructura del ligando, etc.,
también es posible generar información cuantitativa que relacionen los parámetros de
dicha unión con la actividad biológica.6 La situación más ambiciosa es la que pretende
estimar la constante de disociación (Kd) de cada ligando mediante el modelado teórico
de la correspondiente G que se relacionan con la siguiente ecuación:
G = -RT lnKeq
Donde G es la energía libre de Gibbs de la interacción ligando-proteína, R es la
constante de los gases ideales, y Keq es la constante de equilibrios (constante de
disociación).
1.3 Farmacología del sistema nervioso central2
Entre los primeros fármacos descubiertos por los humanos de la antigüedad se
encuentran los que actúan en el sistema nervioso central (SNC), que siguen siendo el
grupo farmacológico de mayor uso.
No siempre se han comprendido claramente los mecanismos por los cuales diversos
fármacos actúan en el SNC; sin embargo, en los últimos 30 años se han logrado grandes
avances en la metodología farmacológica del SNC, a tal grado que actualmente es
posible estudiar la acción de un fármaco en células individuales e incluso en simples
canales iónicos dentro de las sinapsis. La información obtenida de estos estudios es la
base de importantes avances en el entendimiento del SNC:
12
1) La mayoría de los fármacos con efectos en el SNC actúan en receptores
específicos que modulan la transmisión sináptica. Muy pocos fármacos
pueden tener acciones inespecíficas en las membranas, incluso estas acciones
no mediadas por receptores causan cambios demostrables en la transmisión
sináptica.
2) Los fármacos se encuentran entre las herramientas más importantes para el
estudio de todos los aspectos fisiológicos del SNC, desde el mecanismo de
las convulsiones hasta el establecimiento de recuerdos a largo plazo. Tanto
los agonistas que se asemejan a los neurotransmisores naturales como los
antagonistas son extremadamente útiles en estos estudios.
3) Descifrar las acciones de los fármacos con eficacia clínica reconocida ha
conducido a algunas de las hipótesis más sobresalientes sobre los
mecanismos de las enfermedades. Por ejemplo, la información acerca de la
acción de los antipsicóticos en los receptores dopaminérgicos, ha
proporcionado la base de importantes hipótesis sobre la fisiopatología de la
esquizofrenia. De la misma manera, los estudios de los efectos de una
diversidad de agonistas y antagonistas en los receptores del ácido -
aminobutírico (GABA), están aportando nuevos conceptos que conciernen a
la fisiopatología de diversas enfermedades, incluyendo la ansiedad y la
epilepsia.
Las membranas de las células nerviosas contienen dos tipos principales de receptores
de membrana denominados receptores ionotrópicos y receptores metabotrópicos (Figura
4). Los primeros son receptores que permiten pasar iones a través de ellos provocando
cambios rápidos en la permeabilidad de la membrana por medio de un cambio eléctrico
en la membrana. Los segundos son receptores de repuesta más lenta que los canales
iónicos, y con la diferencia que actúan a través de proteínas que activan ciertas proteínas
o enzimas, muchos de ellos generan moléculas llamadas segundos mensajeros que son
elementos importantes en la transducción de señales para provocar un cambio
bioquímico en las células que se traduce a un cambio fisiológico total.
13
Figura 4. Clasificación de los tipos de receptores más importantes que participan en el SNC.
Los canales iónicos están definidos en función de los mecanismos que controlan sus
compuertas (apertura y cierre), los cuales son dependientes de voltaje, y canales
dependientes de ligando (Figura 5). Los canales dependientes de voltaje responden a
cambios en el potencial de la membrana de la célula. En las células nerviosas, estos
canales están concentrados tanto en el segmento inicial como en el axón, y son
responsables de la acción rápida del potencial, el cual transmite la señal desde el cuerpo
celular hasta la terminal nerviosa.
Los canales de unión a ligando se abren mediante la acción de neurotransmisores; este
tipo de receptores están constituidos por subunidades y el canal es una parte integral del
complejo receptor. Estos receptores son responsables de una transmisión sináptica típica
de vías jerárquicas en el SNC.
Por otro lado, los receptores acoplados a proteínas G modulan canales dependientes de
voltaje (Figura 6), en general canales de K+ y Ca
2+. Cuando las proteínas G interactúan
con los canales de Ca2+
inhiben la función del canal; por lo tanto este mecanismo se
considera una inhibición presináptica que sucede con receptores metabotrópicos
presinápticos, mientras que con los receptores metabotrópicos postsinápticos se activan
los canales de K+ ocasionando una inhibición postsináptica lenta.
RECEPTORES
Ionotrópicos Metabotrópicos
Dependientes de
voltaje
Dependientes de
ligando
Acoplados a
proteínas G
14
Figura 5. Canales iónicos dependientes de ligando y canales iónicos dependientes de voltaje.
Figura 6. Canales metabotrópicos que regulan canales iónicos dependientes de voltaje en el SNC
En relación a la activación e inhibición de canales iónicos y su transmisión es
importante destacar que el primer análisis sistemático de los potenciales sinápticos en el
SNC se realizó a principios del decenio de 1950 por Eccles et al., quienes los
registraron de manera intracelular a partir de las motoneuronas espinales. Cuando un
microelectrodo entra en una célula, ocurre un cambio súbito en el potencial registrado
por el electrodo, el cual suele ser cerca de unos -70 mV (potencial de membrana en
reposo). Existen dos vías de incidencia en la motoneurona que se denominan excitadora
e inhibidora; la vía excitadora cuando se estimula registra una pequeña despolarización
o potencial posináptico excitador (PPSE). Este potencial se debe al transmisor excitador
que actúa en el receptor ionotrópico, incrementando la permeabilidad del Na+ y K
+. Su
duración es muy breve, regularmente menor a 20 ms. El cambio de la intensidad del
estímulo a la vía y, por tanto, a la cantidad de fibras presinápticas activadas, cambia de
manera gradual la magnitud de la despolarización. Esto indica que la contribución que
una sola fibra hace al PPSE es muy pequeña. Cuando se activa una cantidad suficiente
15
de fibras excitadoras, el PPSE despolariza la célula posináptica hasta alcanzar el umbral
y se genera un potencial de acción de todo o nada.
Por el contrario, cuando se estimula la vía inhibidora, la membrana posináptica es
hiperpolarizada, produciendo un potencial posináptico inhibidor (PPSI). Deben
activarse conjuntamente una cantidad de sinapsis inhibitorias para modificar el potencial
de membrana notablemente. Esta hiperpolarización se debe a un aumento selectivo en la
permeabilidad de la membrana a los iones Cl- que fluyen dentro de la célula durante la
PPSI.
Por último, es importante destacar que existen una gran variedad de moléculas
(neurotransmisores) que generan acciones en el SNC interaccionando con sus receptores
respectivos generando PPSE o PPSI. Los neurotransmisores más conocidos son los
siguientes: Glicina, ácido -aminobutírico (GABA), glutamato, acetilcolina, serotonina,
etc.
1.4 Sinapsis GABAérgica y enzima aminotransferasa de GABA
Las sinapsis inhibidoras por lo general abren canales iónicos de Cl− y favorecen la
entrada de los mismos. Es importante recordar que una neurona en reposo tiene un
potencial eléctrico de −65 mV, y este eventualmente va a cambiar cuando una fuerza
externa mediada por iones aumentan o disminuyen tal voltaje,10
es decir, cuando la
neurona es excitada el voltaje se hace más positivo, y cuando es inhibida se hace más
negativo (Figura 7).
Como se puede apreciar en esta figura, la inhibición de una neurona se puede llevar a
cabo por dos mecanismos, por salida de iones K+ y por entrada de iones Cl
−, con el
único fin de hiperpolarizar a la célula generándose un voltaje más negativo o PPSI.
El PPSI se puede generar de dos maneras, una de ellas es la hiperpolarización de la
membrana dependiente de voltaje, ya sea por apertura de canales de K+ o apertura de
canales de Cl−; la otra forma es la apertura de canales iónicos dependiente de ligandos
tales como lo son la glicina y el GABA.
16
Figura 7. Tres estados eléctricos de una neurona10
El ácido -aminobutírico es un neurotransmisor biosintetizado a partir de ácido
glutámico por medio de la enzima glutamato descarboxilasa (GAD), dependiente del
cofactor fosfato de piridoxal (PLP) (Figura 8).
O
O
NH3
O
O
CO2
O
O
NH3GAD
Glutamato Ácido -aminobutírico
PLP
Figura 8. Biosíntesis de GABA. PLP: Fosfato de Piridoxal; GAD: Glutamato Descarboxilasa
Una vez sintetizado el neurotransmisor es almacenado en vesículas en la neurona
presináptica, para finalmente fusionarse con la membrana de la célula bajo un estímulo
excitador y liberar el GABA al espacio sináptico y así, ejercer su acción sobre
receptores específicos para este neurotransmisor.
Los receptores de GABA se clasifican como: ionotrópicos (GABAA y GABAC) y
metabotrópicos (GABAB) (Tabla 2); los primeros son canales iónicos de conductancia a
Cl−, y el segundo acoplado a proteínas G.
17
Tabla 2. Receptores de GABA.11
Receptor Distribución Mecanismo de Acción
GABAA Corteza cerebral, hipocampo, cerebelo Canal iónico de conductancia
a Cl-
GABAB
Corteza cerebral, hipocampo, cerebelo
Acoplado a proteína Gi.
Inhibición de adenilato
ciclasa (disminución de
AMPC), Inhibición de canales
de Ca2+
y apertura de canales
de K+)
GABAC
Retina
Canal iónico de conductancia
a Cl-
El sistema de regulación sináptica del GABA consiste en la recaptura del
neurotransmisor por medio de un sistema de transportación presináptica o en células
gliales; una vez recapturado el neurotransmisor puede almacenarse nuevamente en
vesículas o degradado a semialdehído succínico (SSA) por medio de la enzima
aminotransfersasa de GABA en las mitocondrias neuronales (Figura 9).
Figura 9. Sinapsis GABAérgica. Biosíntesis, liberación, transmisión, regulación y
degradación. GABA-AT: Aminotransferasa de GABA; GAD: Glutamato descarboxilasa; GDP:
Difosfato de guanosina; SSA: Semialdehído succínico; SSADH: Semialdehído succínico
deshidrogenasa.5
La aminotransferasa del GABA (GABA-AT) es una enzima dependiente de fosfato de
piridoxal que se encarga principalmente de desaminar al GABA y transformarlo en
semialdehído succínico. Esta misma enzima también tiene la capacidad de transformar
18
al 2-oxoglutarato a L-glutamato dependiendo del cofactor 5’-fosfato de piridoxamina
(PMP)12
(Figura 10).
O
O
O
O
O
H
O
O
O
PMP
H3N
O
O
H3N
O
O
OO
GABA-AT
PLP
L-Glutamato -cetoglutarato
GABA Semialdehído Succínico
GABA-AT
Figura 10. Función bioquímica de la enzima GABA-AT12
Esta enzima está ampliamente distribuida en la matriz mitocondrial de las neuronas y
células gliales, debido a la formación de SSA a partir del GABA, y su transformación
posterior (oxidación) a ácido succínico que fácilmente es incorporado al Ciclo de Krebs
en la misma mitocondria.
La estructura tridimensional de la GABA-AT de cerdo y su sitio activo se han
determinado por difracción de rayos X,13,14,15
así como la de la Escherichia coli.16, 17
Los datos cinéticos de la GABA-AT de humano muestran una actividad específica
que oscila entre 17.518
a 18.719
[g GABA /min mg proteína] y una Km de 1.27 mM16
mientras que para la GABA-AT de cerdo es de 1.1 mM.19
; de igual forma se ha
reportado la actividad de la GABA-AT de Pseudomonas fluorescens (0.79 mM) la cual
se utiliza de manera rutinaria en estudios cinéticos.20,21
1.5 Actividad encefálica: ondas cerebrales
La actividad eléctrica del cerebro es continua, es la conclusión a la que han llegado
diversos investigadores al analizar los registros eléctricos tanto de la superficie cerebral
como de la superficie exterior de la cabeza. Dentro de sus análisis han observado que la
intensidad y los patrones eléctricos están determinados por el nivel de excitación del
cerebro resultante del sueño, vigilia o de enfermedades cerebrales como la epilepsia o
psicosis.7
19
La intensidad de las ondas cerebrales sobre la superficie del cuero cabelludo varía
entre 0 y 200 V, y su frecuencia desde una cada varios segundos hasta 50 ó más por
segundo. La mayor parte del tiempo las ondas cerebrales son irregulares y en el
electroencefalograma (EEG) no se discierne un patrón general; sin embargo, en algunas
ocasiones se pueden diferenciar y en otras hay características ondulatorias en anomalías
específicas del cerebro, como en el caso de la epilepsia.
Para entender los patrones eléctricos de la epilepsia es importante conocer los estados
eléctricos normales del encéfalo, y para ello se estudian los distintos tipos de ondas
cerebrales que se presentan en las personas sanas y que se clasifican en: ondas alfa,
beta, theta y delta (Figura 11).
Figura 11. Patrón eléctrico de los distintos tipos de ondas cerebrales (, , y ) registradas
en un EEG.
Las ondas alfa son rítmicas con una frecuencia de entre 8 y 13 Hz y su intensidad es
aproximadamente 50 V y se encuentran en los EEG de las personas adultas sanas y
despiertas con un estado mental tranquilo y en reposo. Estas ondas se acentúan en la
región occipital, pero suelen presentarse también en zonas parietales y frontales del
cuero cabelludo. Como se mencionó antes, estas ondas se presentan en estado mental
tranquilo, pero, cuando la atención de la persona despierta y se dirige a algún tipo de
actividad mental, las ondas alfa son sustituidas por ondas beta asíncronas, de mayor
frecuencia y menor intensidad.10
Las ondas beta tienen una frecuencia mayor a 14 Hz, pero suelen alcanzar hasta los 80
Hz. Su mayor distribución se registra en las regiones parietal y frontal del cuero
cabelludo, durante la activación extraordinaria del sistema nervioso central o durante
los estados de tensión.10
20
Las ondas theta tienen frecuencia de entre 4 y 7 Hz y se observan de ordinario en las
regiones parietales y temporales de los niños, pero también en el transcurso del estrés
emocional de algunos adultos, en especial con el desánimo y la frustración. Con
frecuencia este tipo de ondas también se presentan en estados de degeneración cerebral.
Finalmente, las ondas delta comprenden todas las ondas del EEG con una frecuencia
menor a 3.5 Hz, mientras su voltaje suele duplicar a cuadruplicar el de casi todos los
tipos de ondas. Se producen con el sueño muy profundo, en la lactancia y en
enfermedades orgánicas graves del cerebro. Así pues, las ondas delta corresponden
únicamente a la corteza con independencia de la actividad de las regiones inferiores del
cerebro.
Cabe mencionar que el origen general de las ondas cerebrales se debe a la descarga
sincrónica de muchos miles o millones de neuronas o fibras; sólo así sumarán los
potenciales de las neuronas o fibras individuales para su registro a través del cráneo, ya
que de manera individual jamás podrían ser registradas en el EEG. Por lo tanto, la
intensidad de las ondas cerebrales registradas en el cuero cabelludo depende
principalmente del número de neuronas y fibras que descarguen sincronizadas entre sí, y
no del nivel total de actividad eléctrica del cerebro. De hecho, las señales nerviosas
fuertes y asíncronas se suelen anular en el registro debido a su polaridad opuesta.
1.5.1 Epilepsia
La epilepsia se caracteriza por una actividad excesiva e incontrolada de una parte o de
todo el sistema nervioso central. Una persona con predisposición a la epilepsia sufre
ataques cuando el nivel basal de excitabilidad del sistema nervioso se eleva por encima
de un umbral crítico.10
La epilepsia puede clasificarse en tres grandes categorías:
epilepsia de gran mal, epilepsia de pequeño mal y epilepsia focal.
Desde el punto de vista fisiológico y electroencefalográfico la epilepsia de gran mal se
caracteriza por descargas neuronales extremas de todas las áreas del encéfalo, es decir,
de la corteza de las partes profundas del cerebro, e incluso del tronco encefálico y del
tálamo. Por otra parte, las descargas transmitidas a lo largo de la médula espinal
producen casi siempre crisis tónicas generalizadas de todo el cuerpo, seguidas al final
del ataque de contracciones tónicas que alternan con sacudidas musculares
espasmódicas denominadas convulsiones tonicoclónicas, que es el tipo de convulsiones
generalizadas. Este tipo de crisis dura comúnmente desde algunos segundos hasta 3 ó 4
21
minutos. Se caracteriza por una depresión poscrítica de todo el sistema nervioso; por lo
tanto, la persona permanece después de la crisis en un estado de estupor que dura de uno
a varios minutos, y con frecuencia queda muy fatigada y dormida durante varias horas.7
En la Figura 12 se muestra el registro EEG de las convulsiones de gran mal
(tonicoclónicas), pequeño mal (crisis de ausencia) y focales (psicomotora).
Figura 12. Electroencefalogramas de los diferentes tipos de epilepsia10
En el registro es posible apreciar el EEG típico de las convulsiones tonicoclónicas, en
el que las descargas son de alto voltaje y sincrónicas y ocurren en toda la corteza
cerebral. Estas descargas se producen en los dos hemisferios cerebrales a la vez, lo que
demuestra que los circuitos neuronales anómalos responsables del ataque afectan en
gran medida a las regiones basales del cerebro que estimulan de forma simultánea
ambos hemisferios cerebrales.
Lo anterior, se ha demostrado experimentalmente al administrar en animales de
laboratorio estimulantes neuronales como el pentilentetrazol (PTZ), así como la
inducción de hipoglucemia insulínica o el paso directo de corriente por el cerebro.10
Una vez analizado el gran mal, cabe mencionar cómo se desencadena dicha crisis, la
cual consiste en su mayoría en predisposición hereditaria a la epilepsia que se da
aproximadamente en 1 de cada 50 a 100 personas. Sin embargo, existen otros factores
que pueden aumentar la excitabilidad del circuito epileptógeno como son: 1) los
estímulos emocionales intensos, 2) alcalosis desencadenada por hiperventilación, 3)
fármacos, 4) fiebre y 5) ruidos intensos o destellos luminosos. Por otro lado, las
personas no genéticamente predispuestas pero con determinadas lesiones traumáticas de
casi cualquier parte del encéfalo, pueden mostrar excitabilidad excesiva en zonas
localizadas del cerebro.
22
La epilepsia de pequeño mal afecta al sistema básico activador talamocortical y se
caracteriza por inconsciencia o disminución de la conciencia durante 3 a 30 s. En este
período la persona experimenta varias pequeñas sacudidas de los músculos,
normalmente de la cabeza y en particular, de los ojos; luego reaparece la conciencia y se
reanudan las actividades previas. Esta secuencia total de características se denomina
síndrome de ausencia o crisis de ausencia que es un tipo de epilepsia generalizada. El
paciente puede sufrir un ataque una vez cada varios meses, o raramente puede sufrir la
crisis de manera secuencial una tras otra con ataques rápidos.
En la Figura 12 se muestra, también, el registro ondulatorio (con frecuencia de 3 Hz)
para las crisis de ausencias que describe un patrón de punta-cúpula. La punta y la cúpula
se registran en casi toda la corteza cerebral, lo que indica que la convulsión afecta a la
totalidad del sistema activador talamocortical. Estudios con animales de laboratorio
sugieren que es el resultado de la oscilación de un sistema de neuronas que implica: 1)
neuronas reticulares talámicas inhibidoras (neuronas inhibidoras productoras de
GABA), y 2) neuronas excitadoras talamocorticales y corticotalámicas.
En lo que respecta a la epilepsia focal, esta consiste en la afectación de cualquier parte
del encéfalo, ya sea regiones concretas de la corteza cerebral o estructuras más
profundas del cerebro y del tronco encefálico. Casi siempre la epilepsia focal es
consecuencia de alguna lesión orgánica o anomalía funcional, como tejido cicatricial del
encéfalo que tracciona la neuronas contiguas, tumores que comprimen una zona del
encéfalo, un área destruida del tejido encefálico, o una alteración congénita de los
circuitos locales. Estas lesiones pueden provocar descargas extremadamente rápidas de
las neuronas locales; cuando su rapidez de descarga se eleva por encima de unas 1000
veces por segundo, las ondas sincrónicas comienzan a diseminarse por las regiones
contiguas de la corteza. Estas ondas son consecuencia de circuitos reverberantes
localizados que gradualmente reclutan zonas contiguas de la corteza hacia el foco de
descarga epiléptica. El proceso se extiende a las regiones adyacentes de forma muy
lenta, a escasos milímetros por minuto, o muy rápida, de varios centímetros por
segundo. Cuando esta onda de excitación se extiende por la corteza motora, origina un
frente progresivo de contracciones musculares en el lado contrario del cuerpo,
comenzando, en los casos más característicos, por la boca y avanzando progresivamente
hacia las piernas, pero en otras ocasiones la secuencia es la inversa. Esta crisis se
denomina epilepsia jacksoniana (convulsiones parciales).
23
La Figura 12 muestra también el trazado ondulatorio de una convulsión focal
psicomotora, la cual describe una onda rectangular de baja frecuencia (2 a 4 Hz) y con
ondas superpuestas de 14 Hz.
1.5.2 Farmacología de las epilepsias
Durante un tiempo se pensó que podría desarrollarse un fármaco para el tratamiento
de todas las formas de epilepsia, pero las causas de esta enfermedad son diversas como
ya se ha mencionado anteriormente, las cuales incluyen alteraciones genéticas y del
desarrollo, procesos patológicos infecciosos, traumáticos, neoplásicos y degenerativos.
La farmacoterapia actual proporciona poca evidencia de especificidad etiológica; sin
embargo, hay una especificidad de acuerdo con el tipo de convulsión (Tabla 3), entre las
que se encuentran: crisis parciales y las crisis generalizadas.
En términos generales, la fisiopatología de las crisis o epilepsias se debe a una función
defectuosa de la sinapsis entre neuronas; es decir, que la reducción de la actividad
sináptica inhibidora y el fomento de la actividad sináptica excitadora desencadenan una
crisis. Molecularmente, los neurotransmisores que median de manera global la
transmisión sináptica en el cerebro del mamífero son aminoácidos, el ácido -
aminobutírico (GABA) y glutamato que son los principales neurotransmisores
inhibidores y excitadores respectivamente.
Es importante señalar que los receptores involucrados en las convulsiones son los
GABAA, NMDA, AMPA/Kainato, así como canales de Ca2+
tipo T, canales de Na+ y
canales de K+. La Figura 13 ilustra una sinapsis entre neuronas donde se encuentran los
blancos moleculares de los distintos fármacos antiepilépticos.
24
Tabla 3. Clasificación y tratamiento farmacológico de las epilepsias.1,2
Tipo de Convulsión Características Anticonvulsivos
CRISIS PARCIALES
Parciales simples
Duración de 20 a 60 s.
No hay pérdida del conocimiento
La manifestación depende de la parte de
la corteza afectada.
Carbamazepina,
fenilhidantoína, valproato,
gabapentina, lamotrigina,
levetiracetam, tiagabina,
topiramato, zonosamida y
vigabatrina
Parciales complejas Pérdida del conocimiento por 0.5 a 2.0
min, aunada a movimientos propositivos
Los mismo que los anteriores
Parcial con
convulsiones tónico-
clónicas
generalizadas de
manera consecutiva
Pérdida del conocimiento con
contracciones sostenidas de los músculos
del todo el cuerpo, seguido de períodos
de relajación (convulsiones clónicas).
Duración de 1 a 2 min
Los mismos que los
anteriores, además,
primidona, fenobarbital
CRISIS GENERALIZADAS
Crisis de ausencia
Inicio repentino de pérdida del
conocimiento, mirada fija e interrupción
de las actividades que se estaban
efectuando; la crisis dura menos de 30s
Etosuximida, valproato,
lamotrigina
Convulsión
mioclónica
Contracción muscular breve de tipo
choque eléctrico, ya sea circunscrita a
parte de una extremidad, o generalizada
Valproato, lamotrigina,
topiramato
Convulsión tónico-
clónica
Manifestaciones similares a las parciales
con convulsiones tónico-clónicas, pero
hay ausencia de convulsiones parciales
Carbamazepina, fenobarbital,
fenilhidantoína, primidona,
valproato, lamotrigina,
topiramato
25
Figura 13. Mecanismo de acción de los fármacos antiepilépticos. (+): Activación; (-):
inhibición.5
Es importante señalar aspectos generales de los mecanismos moleculares durantes los
distintos tipos de crisis convulsivas, así como los blancos farmacológicos clave para el
tratamiento de la enfermedad.
1.5.2.1 Crisis parciales. Aspectos moleculares1
La comprensión de los mecanismos de la epileptogénesis en términos celulares y
moleculares proporcionaría un marco para la creación de nuevos métodos terapéuticos.
La disponibilidad de modelos animales brinda una oportunidad para investigar los
mecanismos base; uno de ellos es el denominado ―activación inducida‖, el cual consiste
en la estimulación eléctrica periódica, breve y de baja intensidad a las amígdalas u otras
estructuras límbicas. Tales estimulaciones desencadenan una crisis breve registrada en
el EEG, sin cambio de comportamiento, pero las estimulaciones repetidas dan por
resultado intensificación progresiva de las crisis, lo cual culmina en crisis
tonicoclónicas. A pesar de la propensión extrema a crisis intensas, no ocurren crisis
espontáneas o un padecimiento en verdad epiléptico, sino hasta que se han administrado
100 a 200 estimulaciones. Es de importancia saber que el inicio del control de la
actividad inducida, es de manera gradual, con lo cual facilita el estudio experimental
para cuantificar la epiletogénesis que desencadenan las crisis convulsivas. Los estudios
farmacológicos han demostrado que las intervenciones que limitan la activación del
26
receptor de NMDA de glutamato, o el subtipo trkB del receptor de neurotrofina, inhiben
la epileptogénesis en este modelo.
Por otra parte, a partir de estudios recientes de las últimas dos décadas se han obtenido
datos importantes acerca de los mecanismos de acción de los fármacos que son eficaces
contra las convulsiones parciales. Estas observaciones se deben a los estudios
electrofisiológicos de modelos in vitro relativamente simples, como neuronas aisladas
del SNC del mamífero y conservadas en cultivo primario.
Los análisis electrofisiológicos de neuronas individuales durante una crisis convulsiva
parcial muestran que las neuronas presentan despolarización y potenciales de acción de
activación a frecuencias altas. Este modelo de activación neuronal es característico de
las crisis y no es frecuente durante la actividad neuronal fisiológica; por tanto, cabría
esperar que la inhibición selectiva de este modelo de activación redujera crisis con
efectos indeseables mínimos. Los fármacos carbamazepina, lamotrigina, fenilhidantoína
y ácido valproico inhiben la activación de alta frecuencia a concentraciones que son
eficaces para limitar las convulsiones en seres humanos. La inhibición de la activación
de alta frecuencia se considera mediada por el decremento de la capacidad de los
canales de Na+ para recuperarse de dicha activación; es decir, se requiere la abertura
desencadenada por la despolarización de los canales de Na+ en la membrana axoniana
de una neurona, para que se origine un potencial de acción.
Después de la apertura los canales de Na+ quedan inactivados una vez generado el
potencial de acción; a esta inactivación se le denomina período refractario, en el cual los
canales no pueden generar otro potencial de acción hasta que pase un período de tiempo
para que se vuelvan a recuperar para poder generar nuevamente un potencial de acción.
Este fenómeno es importante, ya que el decremento de la rapidez de recuperación de los
canales limitaría la capacidad de las neuronas para generar frecuencias altas y por tanto,
de controlar las crisis convulsivas. Los fármacos que tienen la capacidad de limitar a las
neuronas bajo este mecanismo lo constituyen las carbamazepina, lamotrigina,
fenilhidantoína, topiramato, ácido valproico y zonisamida (Figuras 14 y 15).
27
HN
NH
O
O
N
NH2O
OH
O
H3C
N
NN
Cl
Cl
H2N NH2
O
O
O O
O
H3C
CH3
CH3
CH3
OSO2NH2
N
O
SO2NH2
Fenilhidantoína Carbamazepina
Ácido valproico
Lamotrigina
Topiramato ZonisamidaCH3
Figura 14. Estructura de los bloqueadores de canales de Na+ voltaje-dependientes en período
refractario.
Figura 15. Mecanismo de acción de los fármacos bloqueadores de canales de Na+ voltaje-
dependientes.1
De la misma manera, se han realizado estudios acerca de los mecanismos que
incrementan la inhibición sináptica mediada por GABA que reduce la excitabilidad
neuronal y a su vez aumenta el umbral convulsivo. Diversos fármacos bloquean las
convulsiones al regular la inhibición sináptica mediada por GABA a través de sus
receptores GABAA en sitios distintos de la sinapsis, cuyos mecanismos de acción sean
la base de la eficacia de estos compuestos contra las convulsiones parciales y
tonicoclónicas en el humano. Existen tres mecanismos principales de regulación
GABAérgica, el primero de ellos consiste en la modulación alostérica de las
benzodiazepinas y barbitúricos en sitios específicos del receptor GABAA (Figuras 16 y
17). El segundo mecanismo consiste en el incremento del neurotransmisor GABA por
inhibición de la enzima aminotransferasa de GABA que degrada a la molécula para
inactivarla, y su principal inhibidor el fármaco -vinilGABA (vigabatrina) que se une a
28
la enzima de forma irreversible1 (Figura 16 y 17). El último mecanismo también
consiste en aumento de la concentración de GABA en la sinapsis, pero esta vez es por el
bloqueo del sistema de recaptura mediado por el transportador de GABA (GAT-1),1
cuyo principal bloqueador es la tiagabina (Figuras 16 y 17).
N
N
R1R2
R3
R7
R2'
N NH
OO
aR5 R5b
O
R3
S
OH
O
H2N
H2C
N COOH
H
S
S
H3C
CH3
Benzodiazepinas
o
**
Barbitúricos
Vigabatrina
Tiagabina
Figura 16. Estructura de los moduladores de GABA durante la sinapsis.
Figura 17. Transmisión sináptica incrementada del GABA1
1.5.2.2 Convulsiones generalizadas. Aspectos moleculares1
A diferencia de las crisis parciales, originadas en regiones circunscritas de la corteza
cerebral, las de inicio generalizado se producen en la activación recíproca del tálamo y
la corteza. De las convulsiones generalizadas, las más analizadas son las denominadas
29
crisis de ausencia. La sincronía sobresaliente en la aparición de las descargas neuronales
en zonas diseminadas de la neocorteza dio origen a la idea de que sincronizaba estas
descargas neuronales una estructura situada en el tálamo, el tallo encefálico o en ambos.
La estimulación de baja frecuencia de las estructuras talámicas de la línea media
desencadena un ritmo en el EEG en la corteza, semejantes a las descargas de ondas en
espiga características de las crisis de ausencia. Los registros intracerebrales con
electrodos mostraron afectación talámica y neocortical en la descarga de ondas y
espigas propias de las crisis de ausencia.
Estos ritmos de baja frecuencia son posibles por una combinación de factores como
conexiones sinápticas excitadoras recíprocas entre la neocorteza y el tálamo, lo mismo
que propiedades intrínsecas de las neuronas del tálamo. Dichas propiedades consisten en
una función central en la generación de espigas y ondas con una frecuencia de 3 Hz, es
una forma particular de corriente de Ca2+
regulada por voltaje, la corriente de umbral
bajo tipo T.
Las descargas de potenciales de acción en el tálamo son mediadas por canales de Ca2+
tipo T; y la corriente eléctrica que se genera cumple una función amplificadora en las
variaciones talámicas, y la oscilación corresponde a la espiga y la onda de 3 Hz
característica de las crisis de ausencia. Por lo tanto, estos canales constituyen un blanco
farmacológico importante para una serie de fármacos inhibidores de los canales de Ca2+
tipo T en el tálamo, cuyos exponentes son: la etosuximida y el ácido valproico (Figuras
18 y 19).
OH
O
H3C
Ácido valproico
HN OO
CH3
CH3
EtosuximidaCH3
Figura 18. Estructuras de los principales fármacos bloqueadores de los canales de Ca2+
tipo T
30
Figura 19. Reducción de la corriente de Ca2+
tipo T inducida por anticonvulsivos.1
31
2. ANTECEDENTES
2.1 Vigabatrina
Las investigaciones que buscan fármacos para aumentar los efectos del GABA
incluyen esfuerzos para encontrar agonistas y profármacos del GABA, los cuales
incluyen a aquellos que inhiben la recaptura del neurotransmisor, así como la inhibición
de la enzima GABA-AT.
La vigabatrina (-vinil-GABA) es uno de los fármacos que ha sido comercializado
ampliamente en Europa y América del Sur, y que es un inhibidor irreversible de la
aminotransferasa del GABA (GABA-AT), lo que provoca una potenciación en la acción
del neurotransmisor ya que el fármaco evita su degradación. En la Figura 20 se muestra
el mecanismo de reacción de inhibición de la vigabatrina al sitio activo de la enzima
GABA-AT.14
RHNNHR
O
NH2
NH
CH3
OH
OH
OP
O
O O
Lys N
PLP H2N COO
Lys NH2
Lys NH2
NH
H
PLP
COO
B H
Lys NH2
Lys NH
NH
PLP
COO
Lys NH
NH
PLP
COO
NH COO
PLP
RHN
O
NHR
N
NH
OH
CH3
OP
O
O O
HN
PLP
COO
Lys NH
NH
PLP
COO
Lys329 de la
GABA-AT
5'-Fosfato de piridoxal (PLP)
Generación de la base
de Schiff en el sitio
activo de la enzima
GABA-T
329329
329329
329329
329
Figura 20. Mecanismo de reacción de la inhibición irreversible de la vigabatrina con la Lys329
del sitio activo de la enzima aminotransferasa de GABA.11
32
Adicionalmente se conoce que la vigabatrina se comercializa como racemato, en el
que el enantiómero S-(+) es activo, y se sospecha que el enantiómero R-(−) es inactivo6
(Figura 21).
(R)
OH
O
NH2
HO(S)
O
NH2
Figura 21. Estructura de la vigabatrina R y S.
La vigabatrina es utilizada para el tratamiento de crisis parciales y el síndrome de
West. Las reacciones adversas del compuesto van desde somnolencia, mareos y
aumento de peso, hasta agitación, confusión y psicosis. Recientemente los estudios de
farmacovigilancia han demostrado que el uso a largo plazo del fármaco provoca
alteraciones irreversibles en el campo visual.6 De la misma manera, se han descrito
otros inhibidores de la GABA-AT que muestran inhibición irreversible, los cuales son:
-fluorometil-GABA6 y la gabaculina; esta última es una neurotoxina aislada de
Streptomyces toxacaenis.6
Hoy en día, la vigabatrina es el único fármaco inhibidor de la GABA-AT en el
mercado, de tal suerte que no existen otras opciones que resulten más ventajosas; sin
embargo, los científicos tratan de obtener análogos rígidos de la vigabatrina utilizando
ciclohexenos22
y ciclopentenos23
sustituidos, así como algunos metabolitos secundarios
aislados de fuentes naturales como Gastrodia elata,24
entre otras.
2.2 Cicloadiciones [4+2] tipo Diels-Alder
En una reacción de cicloadición [4+2] tipo Diels-Alder entre un dieno y un dienófilo
se producirá un anillo de 6 miembros; esta reacción se caracteriza generalmente por ser
una reacción rápida y sencilla. Es importante señalar que la predicción de la reactividad
entre el dieno y dienófilo puede ser posible haciendo un análisis de las energías de
(Highest-Occupied Molecular Orbital) HOMO y (Lowest-Unoccupied Molecular Orbital)
LUMO de las especies involucradas (Figura 22).25
33
HOMO
LUMO
Figura 22. Interacción HOMO-LUMO de las especies involucradas en una reacción de Diels-
Alder.
Existen diferentes tipos de dienófilos, que van desde alquenos simples (dienófilos
pobres), hasta aquellos que están sustituidos, con el fin de enriquecer su reactividad y
selectividad.25
Los dienos también pueden ser alquenos simples o sustituidos, además de
estar en forma alifática, endocíclica, exocíclica y mixta.25
2.2.1 Regioselectividad de la reacción Diels-Alder
En términos generales, cuando se adiciona un dieno asimétrico con un dienófilo
asimétrico, hay 2 posibles productos regioisoméricos (Figura 23). La regioselectividad
de este tipo de reacciones por lo general está dada para los isómeros para y orto;
mientras que el isómero meta es el menos favorecido en los dos casos.
La teoría de orbitales moleculares frontera (FMO) explica que la interacción de
reactivos asimétricos durante la reacción de Diels-Alder depende del efecto electrónico
de los sustituyentes tanto en el dieno como en el dienófilo. De esta idea deriva que la
interacción más favorable será aquella en donde la magnitud de los coeficientes de los
orbitales HOMO y LUMO sea más similar.
R
+
X
R
X
+
R
XPRODUCTOMAYORITARIO
+
XX
+
X
PRODUCTOMAYORITARIO
RR R
Figura 23. Regioselectividad de la reacción Diels-Alder. Los estereoisómeros no se
muestran.25
34
2.2.2 Estereoquímica de la reacción Diels-Alder
1) Si el dienófilo tiene configuración Z ó cis; en el producto de Diels-Alder la
relación de estos sustituyentes será syn.
CO2CH3
CH3
H
H
+
CO2CH3
CH3
H
H(Z)-Butanoato de metilo 1, 3-Butadieno
Producto syn
2) Con respecto a dienos 1,4 disustituidos, la reacción es estereoespecífica para el
isómero syn también.
3) Una condición importante es que el dieno debe estar en una conformación
―cisoide‖, ya que si está en forma ―transoide‖ la reacción de cicloadición no se
lleva a cabo.
Cisoide Transoide
4) Cuando el dieno es cíclico, hay 2 posibles vías en la cual la adición puede
ocurrir si el dienófilo es asimétrico. El lado más sustituido del dienófilo puede
estar bajo el dieno (adición endo), o puede estar en el lado opuesto (adición exo).
Por lo regular se favorece la adición endo sobre la exo ya que a decir de muchos
autores en la adición endo hay una mayor sobreposición de los orbitales
interaccionantes entre átomos que no participan de manera directa en la
reacción. A esto se le denomina interacciones secundarias.
HOOCH
HH
COOH
HCOOH
HH
H
H
COOH
Adición endo
Adición exo
5) Como hemos visto, las cicloadiciones [4+2] tipo Diels-Alder pueden ser regio y
estereoselectivas; pero en algunos casos pueden ser también enantioselectivas,
35
aunque en estos casos es necesario que se presente quiralidad en alguno de los
componentes de la reacción.
6) Para reacciones que ocurren bajo condiciones de Demanda Electrónica Normal,
es decir, reacciones que ocurren con dienos como nucleófilos (HOMO) y
dienófilos como electrófilos (LUMO), en donde se ha demostrado que
sustituyentes electrodonadores en el dieno aceleran la reacción; mientras que los
electroatractores la retardan. En el caso del dienófilo sucede lo contrario: los
electrodonadores desaceleran la reacción y los electroatractores la aceleran. A
fin de cuentas, uno de los reactivos en la reacción actúa como donador de
electrones y el otro como aceptor.
2.2.3 Mecanismo de reacción
En general se habla de tres posibles mecanismos de reacción por los cuales se llegan a
los aductos Diels-Alder; el primero de ellos involucra un estado de transición cíclico de
seis centros; este tipo de reacción es concertada y sucede en un solo paso (Figura 24a).
Otro mecanismo propone la formación de un dirradical que conlleva la unión del dieno
y dienófilo (Figura 24b). El tercer mecanismo involucra la formación de un zwiterión
por movimientos de electrones (Figura 24c).
a
b
c
Figura 24. Posibles mecanismos de reacción por los cuales se podría lleva a cabo una cicloadición.
a: concertado; b: dirradical; c: iónico.
Las investigaciones sugieren que el mecanismo (a) es el más sustentable ya que
la reacción es estereoespecífica para el dieno y dienófilo.
36
3. JUSTIFICACIÓN
La epilepsia es una condición neurológica que afecta entre 0.5 y 1.0 % de la población
mundial,2,26
por tal motivo, esta enfermedad constituye un problema de salud pública,
ya que solo en México el 1.8 % de la población la padece.4
La terapéutica actual contra la epilepsia en general, y en particular con la epilepsia de
tipo parcial resulta ser eficaz; sin embargo, aproximadamente el 30 % de la población
tratada con antiepilépticos de primera elección no responde.26
Por este motivo se ha
incluido de manera cuidadosa el uso de vigabatrina (indicada normalmente para el
tratamiento de espasmos infantiles o síndrome de West) para tratar a aquellos pacientes
que presentan crisis parciales resistentes al tratamiento; a dicha resistencia también se le
conoce como epilepsia refractaria. Un estudio sistemático ha mostrado que el uso de la
vigabatrina en pacientes que presentan epilepsia refractaria ha resultado eficaz;26
sin
embargo, los efectos adversos del fármaco van desde aquellos relativamente leves
(somnolencia, mareos y aumento de peso, agitación, confusión y psicosis) hasta los más
graves, como el desarrollo de alteraciones del campo visual2,6,26
que resulta irreversible
en la terapia a largo plazo con el medicamento.
Por lo anterior, es justificable la búsqueda de nuevos compuestos para inhibir a la
enzima aminotransferasa del GABA (GABA-AT) diseñándolos a través de un enfoque
molecular, que involucre la interacción y análisis de las estructuras de los compuestos a
sintetizar con el blanco biológico, con el único fin de obtener compuestos más
selectivos y menos tóxicos de una manera sistemática y racional para un futuro manejo
adecuado de la enfermedad.
37
4. HIPÓTESIS
La aminotransferasa del GABA es una enzima que depende del fosfato de piridoxal, el
cual es esencial para el funcionamiento de la proteína, ya que este catalizador transfiere
el grupo amino del GABA al -cetoglutarato; por tal motivo son esenciales para el
reconocimiento tanto del GABA como de la vigabatrina.13-17
Así, en el presente trabajo
se pretende obtener aductos Diels-Alder derivados de los ácidos N-fenilmaleámico y N-
fenilfumarámico, sustituidos estratégicamente con un grupo carboxilo o carboetoxi en
posición meta o para del anillo aromático mismos que le conferirían una cierta analogía
al neurotransmisor GABA (Figura 25). Se espera que esto permita el reconocimiento de
estos sustratos sintéticos en el sitio activo, inhibiendo a la enzima GABA-AT de forma
competitiva.
NH
OH
O
O
OR
O
NH
OH
O
O
OR
O
O
NH
OH
O
O
OR
O
O
NH
OH
O
O
OR
O
H2N
OH
O
O
NH
OH
O
OR
O
H3C
O
NH
OH
O
O
ORH3C
GABA
R = -H, -CH2CH3
Figura 25. Analogía estructural de los aductos Diels-Alder propuestos con el ácido -
aminobutírico (GABA). Se muestran los derivados con sustitución en meta.
38
5. OBJETIVOS
5.1 Objetivo General
De acuerdo a lo anterior, en este trabajo se propone la síntesis de aductos de Diels-
Alder que tengan analogía estructural con el neurotransmisor GABA, mismos que se
obtendrían a partir de la reacción entre dienófilos derivados de los ácidos N-
fenilmaleámico y N-fenilfumarámico y los dienos isopreno, ciclopentadieno y furano.
Los dienófilos tendrían como sustituyente un grupo carboxilo o carboetoxi en la
posición para o meta del grupo N-fenilo. Los aductos así obtenidos se probarían como
anticonvulsivantes por técnicas in vivo e in vitro, además de llevar a cabo también la
exploración de la interacción ligando-receptor entre ellos y la enzima GABA-AT, con el
objeto de evaluarlos como inhibidores de la misma. Esto se llevaría a cabo por estudios
computacionales de tipo Docking, sobre las diferentes posibilidades conformacionales
de los aductos.
5.2 Objetivos particulares
Explorar la selectividad de la interacción ligando-enzima por Docking de la
conformación más estable de cada uno de los aductos Diels-Alder propuestos,
con el fin de observar el sitio de unión de dichos compuestos sobre la enzima.
Sintetizar los ácidos N-fenilmaleámicos y N-fenilfumarámicos monosustituidos
con el propósito de obtener los precursores (dienófilos) a la reacción de Diels-
Alder.
Sintetizar los aductos Diels-Alder a partir de los dienófilos obtenidos de acuerdo
al punto anterior, al hacerlos reaccionar con los dienos isopreno, furano y
ciclopentadieno bajo condiciones térmicas, los cuales constituirán los productos
a probar sobre la enzima GABA-AT in vitro.
Caracterizar a todos y cada uno de los compuestos por distintas técnicas
espectroscópicas: Espectrofotometría de Infrarrojo (IR), Espectroscopía de
Resonancia Magnética Nuclear (RMN) de 1H y
13C, Espectrometría de Masas
(EM) para asegurar su obtención y pureza.
Evaluar la capacidad inhibitoria in vitro de los compuestos sintetizados sobre la
enzima GABA-AT de Pseudomonas fluorescens con el fin de caracterizar el tipo
de inhibición que presentan.
39
Evaluar in vitro como anticonvulsivos a aquellos compuestos que presentaron
actividad sobre la enzima, a través del modelo de las convulsiones inducidas con
pentilentetrazol (PTZ), con el propósito de correlacionar la inhibición enzimática
con la actividad antiepiléptica.
40
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
6.1 SÍNTESIS
Como se mencionó en los objetivos, se prepararon en primera instancia los dienófilos
(ácidos N-fenilmaleámicos 5a-d) que preceden a los aductos Diels-Alder
correspondientes. Estos productos (5a-d) fueron sintetizados a partir del anhídrido
maleico (1) y las anilinas mono sustituidas (3a-d) (Figura 26).
NH2
R1
R2
a: R1 = COOH, R2 = H
b: R1 = COOEt, R2 = H
c: R1 = H, R2 = COOH
d: R1 = H, R2 = COOEt
O
O
O
+
NH
R1
R2
OH
O
OTHF, ta, 16 h
1 3a-d 5a-d
Figura 26. Reacción general de síntesis de los ácidos N-fenilmaleámicos 5a-d.
El objetivo de haber sintetizado los dienófilos 5a-d fue el tener desde esta porción
estructural, la analogía con el neurotransmisor GABA obteniendo el aducto
correspondiente del ácido maleico; sin embargo, el equivalente molecular del ácido
maleico utilizado fue el anhídrido, ya que las aminas aromáticas (3a-d) son menos
básicas o menos nucleofílicas que las aminas alifáticas que poseen un pKa más alcalino
que las hace más reactivas27
; este tipo de reacciones son bastante sencillas y los
rendimientos son buenos, como se observa en el caso de los compuestos (3a-d) que
fueron de moderados a muy buenos (Tabla 4).
41
Tabla 4. Características físicas de los ácidos N-fenilmaleámicos 5a-d
NH
OH
O
O
OH
O
12
3 4 1'2'
3'
4'
5'
6'
5a
NH
OH
O
O
O
O
12
3 4 1'2'
3'
4'
5'
6' CH3
5b
NH
OH
O
O
12
3 4 1'2'
3'
4'
5'
6'
OH
O
5c
NH
OH
O
O
12
3 4 1'2'
3'
4'
5'
6'
O
O
CH3
5d
Rendimiento
(%)
90.3 89.0 95.8 77.7
Punto de
fusión (°C)
215-216 177-179 215-217 155-158
Rf
(AcOEt/MeOH
1:1)
0.64 0.74 0.53 0.75
La reacción genera una amida aromática muy característica y fácilmente identificable
tanto en el espectro de infrarrojo (IR) como en resonancia magnética nuclear de protón
(RMN 1H).
Para estos compuestos las bandas características en IR corresponden a las vibraciones
de estiramiento N-H (alrededor de 3300 cm-1
) y C=O de los ácidos , insaturados
(alrededor 1620 cm-1
) como se muestran en la Tabla 5.
42
Tabla 5. Caracterización de los ácidos N-fenilmaleámicos 5a-d por espectrofotometría IR (pastilla
de KBr).
NH
OH
O
O
OH
O
12
3 4 1'2'
3'
4'
5'
6'
5a
NH
OH
O
O
O
O
12
3 4 1'2'
3'
4'
5'
6' CH3
5b
NH
OH
O
O
12
3 4 1'2'
3'
4'
5'
6'
OH
O
5b
NH
OH
O
O
12
3 4 1'2'
3'
4'
5'
6'
O
O
CH3
5d
-NH 3316, 1176 3302, 1177 3304, 1123 3312, 1112
-OH 3018 3213 No se observa No se observa
-CH2=CH2- No se observa 3113 No se observa No se observa
-CH3 y
-CH2-
-------- 2920 2883 No se observa
-C=O ,-
insaturado
1626 1638 1624 1683
OHO
1694 -------- 1713 --------
OO
-------- 1709 -------- 1724
HN-C=O 1581 1584 1556 1592
-CO-O -------- No se observa -------- No se observa
O-C-C -------- 1272 -------- 1289
p-di
1543
1550, 867, 853,
772
--------
--------
m-di
--------
--------
1555, 850, 757
1580, 848, 761
Del mismo modo, la evidencia de la presencia de los productos en los espectros de
RMN de 1H corresponden a la señal simple del hidrógeno de la amida (-NH) alrededor
de 10.60 ppm; otras señales importantes corresponden a las dos señales dobles de los
hidrógenos vinílicos (entre 6.30 y 6.50 ppm). Estas señales también demuestran que los
43
ácidos maleámicos obtenidos son derivados del ácido maleico, puesto que las constantes
de acoplamiento en los 4 casos tienen un valor aproximado de 3J = 12.00 Hz, que
corresponde a una constante cis (Tabla 6). Cabe mencionar que en los casos de los
compuesto 5a y 5b las señales correspondientes a los hidrógenos aromáticos presentan
acoplamientos típicos de sustitución para con constantes orto típicas alrededor de 8.00-
9.00 Hz. En relación a los compuestos 5c y 5d muestran señales características de
sustitución meta.
Tabla 6. Caracterización por RMN de 1H (300 MHz) y
13C (75 MHz) en DMSO-d6 de los ácidos N-
fenilmaleámicos 5a-d.
NH
OH
O
O
OH
O
12
3 4 1'2'
3'
4'
5'
6'
5a
NH
OH
O
O
O
O
12
3 4 1'2'
3'
4'
5'
6' CH3
5b
NH
OH
O
O
12
3 4 1'2'
3'
4'
5'
6'
OH
O
5c
NH
OH
O
O
12
3 4 1'2'
3'
4'
5'
6'
O
O
CH3
5d
Posición 1H (ppm)
3JH-H (Hz)
13C
(ppm)
1H (ppm)
3JH-H (Hz)
13C
(ppm)
1H (ppm)
3JH-H (Hz)
13C
(ppm)
1H (ppm)
3JH-H (Hz)
13C
(ppm)
1 12.00 – 13.00
br
167.45 12.00 – 13.00
br
167.65 12.00 – 13.00
br
167.46 12.00 – 13.00
br
167.68
2 6.33 d
(11.87)
130.73 6.33 d
(12.00)
131.01 6.32 d (12.04) 130.77 6.32 d (12.00) 131.02
3 6.50 d
(11.87)
132.30 6.48 d
(12.00)
132.22 6.48 d (12.04) 132.25 6.47 d (12.00) 131.44
4 -------- 164.23 -------- 164.39 -------- 164.03 -------- 164.19
1’ -------- 126.15 -------- 125.38 -------- 139.40 -------- 139.68
2’ 7.74 d (8.76) 119.30 7.75 d (8.70) 119.51 8.29 s 120.67 8.28 s 120.54
3’ 7.92 d (8.76) 130.98 7.91 d (8.70) 130.92 -------- 131.89 -------- 132.16
4’ -------- 143.24 -------- 143.68 7.66 d (7.92) 125.12 7.66 d (7.80) 124.51
5’ 7.92 d (8.76) 130.98 7.91 d (8.70) 130.92 7.99 t 129.63 7.46 t 129.96
6’ 7.74 d (8.76) 119.30 7.75 d (8.70) 119.51 7.83 d (7.92) 124.79 7.86 d (7.80) 125.03
-NH 10.61 br -------- 10.63 br -------- 10.53 br -------- 10.56 br -------
-COO 12.90 br 167.45 -------- 166.00 12.90 br 167.64 -------- 166.22
-CH2- -------- ------- 4.27 q 61.19 -------- -------- 4.30 q 61.80
-CH3 -------- -------- 1.29 t 14.86 -------- -------- 1.30 t 14.50
s: señal simple, d: señal doble, t: señal triple, q: señal cuádruple, m: señal múltiple, br: señal ancha
Una vez sintetizados los dienófilos del sistema se iniciaron los primeros experimentos
de síntesis de los aductos Diels-Alder con isopreno (2). Esta reacción fue llevada a cabo
44
bajo condiciones térmicas a 160 °C en un tubo de presión con tolueno como disolvente.
La reacción se dejó bajo estas condiciones 96 h; después de este tiempo el producto fue
obtenido y analizado espectroscópicamente; dicho análisis mostró que la reacción [4+2]
de cicloadición se había realizado; sin embargo, los aductos obtenidos no fueron los
esperados (Figura 27).
NH
R1
R2
a: R1 = COOH, R2 = H
b: R1 = COOEt, R2 = H
c: R1 = H, R2 = COOH
d: R1 = H, R2 = COOEt
Tolueno,
160 °C, 96 h
5a-d
+
H3C
2
H3C
N R1
R2
O
O
6a-d
OH
O
O NH
OH
O
O
R1
R2
H3C
Tolueno,
160 °C, 96 h
4a-d
Figura 27. Reacción de formación del los aductos Diels-Alder 4a-d.
Al realizar el análisis de RMN de 1H se esperaba la señal del hidrógeno del grupo
amida (-NH) aproximadamente en 10.10 ppm característico de los compuestos 6a-d
comparable con los dienófilos 5a-d; sin embargo, los espectros mostraban la ausencia
de dicha señal, pero con la sorpresa que la cicloadición sí se había efectuado debido a
que las señales que se presenta a campos altos en el espectro, corresponden a los
hidrógenos saturados del anillo de ciclohexeno, resultado de la cicloadición, las cuales
muestran una multiplicidad característica. Otra evidencia de la formación del aducto,
fue una señal ancha obtenida aproximadamente en 5.60 ppm correspondiente al
hidrógeno vinílico de la posición 6 de la molécula (Figura 28). Pensando en la
formación de estos compuestos fueron analizados con más detalle cada uno de los
espectros y aparentemente se estaba frente a compuestos distintos a los esperados (6a-
d). Los espectros sugerían la formación de un nuevo ciclo en la molécula (además del
45
ciclohexeno) correspondiente a un heterociclo de 5 miembros; es decir, la formación de
una imida, puesto que este grupo funcional carece de hidrógeno en el nitrógeno.
H6
H3’
H5’
H2’
H6’
-CH2-
-CH3
-CH3
H7a H3a
H7? H4?
H4? H7?
Figura 28. Espectro de RMN de 1H del compuesto 4b.
La asignación de cada hidrógeno y carbono de la molécula en los espectros de RMN
en 1H y
13C para cada molécula se realizó con ayuda de los espectros bidimensionales
COSY (1H-
1H) y HSQC (
13C-
1H) del compuesto 4b (Figuras 29 y 30).
46
Figura 29. Espectro bidimensional de acoplamiento 1H-
1H COSY del aducto 4b. a = H7, b = H4, c =
H4, d = H7
El espectro de COSY de la Figura 29 muestra los acoplamientos entre hidrógenos más
significativos de la molécula; se muestran dos señales dobles (H3’-H5’ y H2’-H6’) que
se encuentran a campos bajos correspondientes a los acoplamientos entre los hidrógenos
aromáticos con sustitución para. Un acoplamiento importante corresponde al hidrógeno
vinílico (H6) que se encuentra a 5.61 ppm con los hidrógenos H7, H7 y los
hidrógenos del metilo (-CH3) del ciclohexeno que son hidrógenos que se encuentran a 3,
3 y 4 enlaces respectivamente. Cabe mencionar que los hidrógenos H3a y H7a
correlacionan con los protones de las posiciones 4 y 7 respectivamente. El espectro de la
Figura 28 muestra los acoplamientos asociados a estas correlaciones.
47
Figura 30. Espectro bidimensional de acoplamiento 1H-
13C a tres enlaces HSQC para 4b.
Una vez asignados los protones, fueron asignados inequívocamente los carbonos del
sistema con ayuda del espectro HSQC de correlación 1H-
13C en donde se observan las
correlaciones existentes entre los protones y el carbono que los sustenta (Figura 28). A
campos bajos se puede observar que H5 (vinílico) correlaciona con la señal en 129.29
ppm que corresponde al carbono C5; de la misma manera los protones H3a y H7a
correlacionan con 2 señales que se encuentran alrededor de 39.00 ppm. Las señales
correspondientes a los hidrógenos de las posiciones 4 y 7 del ciclohexeno, se observa
para cada hidrógeno de cada posición 2 contornos que correlacionan con un solo
carbono; así pues, los hidrógenos H4 y H4 correlacionan con un mismo carbono (C4)
a campo más alto que el carbono (C3) que sustenta a los hidrógenos H7 y H7.
En la siguiente Tabla 7 se encuentra la asignación para 1H y
13C de cada unos de los
aductos obtenidos (4a-d).
El análisis conformacional de estos aductos inició con la determinación de las
constantes de acoplamiento de cada aducto, la porción molecular de interés fue
evidentemente los dos anillos fusionados producto de la cicloadición y los hidrógenos
que los conforman.
48
Tabla 7. Caracterización por RMN de 1H (500 MHz) y
13C (125 MHz) en CDCl3 de los aductos
Diels-Alder 4a-d derivados de isopreno.
1
2
3
4
1'
2' 3'
4'
5'6'
N
H3C
O
O
OH
O
5
6
7
7a
3a
4a
1
23
4
1'
2' 3'
4'
5'6'
N
H3C
O
O
O
O
5
6
7
7a
CH3
3a
4b
1
2
3
4
1'
2' 3'
4'
5'6'
N
H3C
O
O
5
6
7
7a
OH
O
3a
4c
12
3
4
1'
2' 3'
4'
5'6'
N
H3C
O
O
5
6
7
7a
O
O
CH3
3a
4d
Posición 1H (ppm)
3JH-H (Hz)
13C
(ppm)
1H (ppm)
3JH-H (Hz)
13C
(ppm)
1H (ppm)
3JH-H (Hz)
13C
(ppm)
1H (ppm)
3JH-H (Hz)
13C
(ppm)
1 -------- 179.25 -------- 179.97 -------- 179.49 -------- 179.34
2 -------- -------- -------- -------- -------- -------- -------- --------
3 -------- 179.04 -------- 178.18 -------- 179.26 -------- 179.16
3a 3.25 ddd
(9.51, 7.50,
2.50)
39.58
3.21 ddd
(9.38, 7.25,
2.50)
39.54
3.26 ddd
(8.20, 7.94,
2.75)
39.58
3.12 ddd
(9.38, 7.13,
2.50)
39.47
4 2.33 m
29.10
2.35 m
29.08
2.34 dd
(15.38, 7.94)
29.08
2.20 dd
(15.50, 7.13)
28.97
4 2.60 dd
(15.50, 2.50)
2.58 dd
(15.50, 2.50)
2.61 dd
(15.38, 2.75)
2.48 dd
(15.50, 2.50)
5 -------- 129.29 -------- 130.50 -------- 130.76 -------- 131.76
6 5.63 br 120.39 5.61br 120.38 5.65 br 120.42 5.54 br 120.36
7 2.28 m
24.75
2.28 m
24.71
2.30 m
24.73
2.16 m
24.61 7 2.66 ddd
(15.50, 6.68,
2.50)
2.64 ddd
(15.50, 6.62,
2.50)
2.67 ddd
(15.50, 7.25,
2.62)
2.54 ddd
(15.62, 6.80,
2.50)
7a 3.30 ddd
(9.51, 6.68,
2.50)
40.03
3.28 ddd
(9.38, 6.62,
2.50)
39.98
3.32 ddd
(8.20, 7.25,
2.62)
40.03
3.18 ddd
(9.38, 6.80,
2.50)
39.91
-CH3 1.78 s 23.71 1.77 s 23.69 1.80 s 23.74 1.69 s 23.65
1’ -------- 136.85 -------- 136.21 -------- 136.85 -------- 136.70
2’ 7.42 d (8.50) 126.47 7.36 d (8.75) 126.31 8.01 s 128.45 7.86 s 127.76
3’ 8.20 d (8.50) 131.24 8.12 d (8.75) 130.54 -------- 132.71 -------- 132.62
4’ -------- 137.04 -------- 136.80 8.13 d (7.50) 130.40 7.98 d (9.15) 129.63
5’ 8.20 d (8.50) 131.24 8.12 d (8.75) 130.54 7.58 t 131.90 7.45 t 131.01
6’ 7.42 d (8.50) 126.47 7.36 d (8.75) 126.31 7.51 d (8.55) 129.58 7.36 d (9.15) 129.31
-COO 12.00 – 13.00
br
171.23 -------- 165.94 12.00 – 13.00
br
170.98 -------- 163.67
-CH2- -------- -------- 4.38 q 61.43 -------- -------- 4.29 q 61.47
-CH3 -------- -------- 1.39 t 14.52 -------- -------- 1.30 t 14.47
s: señal simple, d: señal doble, t: señal triple, q: señal cuádruple, m: señal múltiple, br: señal ancha
49
La determinación de las constantes de acoplamiento se inició a partir de las señales
que se encuentran en el intervalo comprendido entre 3.20 y 3.40 ppm correspondientes a
los hidrógenos H3a y H7a que se encuentran más desprotegidos debido a que se
encuentran más cerca de los carbonilos de la imida. Estas señales muestran una
multiplicidad coherente con sus hidrógenos vecinos (H4H4 y
H7H7respectivamente); es decir, cada hidrógeno se acopla con dos hidrógenos
vecinos generando dos señales traslapadas correspondientes dos señales doble de doble
de dobles (ddd). Realizando las relaciones y operaciones pertinentes fue posible
determinar las constantes de acoplamiento a tres enlaces, obteniendo las siguientes: para
H3a se obtuvieron 9.38 Hz para el acoplamiento H3a-H7a, 7.25 Hz para el
acoplamiento H3a-H4 y 2.50 para H3a-H4; de la misma manera se establecieron las
constantes para el hidrógeno H7a, el primero fue de 9.38 Hz para el acoplamiento H7a-
H3a, 6.62 Hz para H7a-H7 y 2.50 para H7a-H7.
Posteriormente fueron analizadas las señales comprendidas en el intervalo de 2.50 a
2.65 ppm correspondientes a los hidrógenos H7 y H4El hidrógeno H7muestra un
patrón de acoplamiento coherente, ya que describe una señal doble de doble de dobles
bien definida con baja intensidad; es decir, este hidrógeno se acopla con otros tres
hidrógenos vecinos. Fueron obtenidas las constantes de acoplamiento de la siguiente
manera: 15.50 Hz para el acoplamiento gem de los hidrógenos H7 H7, 6.62 Hz
para el acoplamiento H7-H6 y 2.50 Hz para H7-H7a. Asimismo, el análisis del
hidrógenoH4generó una señal doble de dobles, es decir, solo se acopla con 2
hidrógenos, debido a que en la posición 5 se encuentra el grupo –CH3. Las constantes de
acoplamiento de este sistema se asignaron de la siguiente manera: 15.50 Hz
correspondiente al acoplamiento gem entre H4 H4 y 2.50 Hz para H4H3a.
En relación a las señales que se encuentran en el intervalo 2.20-2.30 ppm que
corresponden a los hidrógenos H4yH7 el análisis de las constantes de acoplamiento
no se pudo realizar debido a la imprecisión existente en la determinación, debido a que
las señales estaban traslapadas y además ancha por el acoplamiento de H7 con H6
(vinílico). El conjunto de estas señales integran para dos hidrógenos.
A propósito del párrafo anterior, cabe mencionar que para los compuestos 4c y 4d fue
posible discernir las constantes de acoplamiento solo para el hidrógeno H4 que no se
acopla con H6. En ambos casos se observa una señal doble de dobles (acoplamiento con
dos hidrógenos). En el caso de 4c las constantes fueron: 15.50 Hz para el acoplamiento
50
gem entre H4 H4, y 7.13 Hz para H4H3a. En el caso de 4d sucedió algo similar
(Tabla 7).
El estudio de análisis conformacional a través de cálculos teóricos para el compuesto
4b fue realizado por medio de un análisis conformacional inicial para obtener los
confórmeros más estables, de ellos, fueron escogidos los cuatro de menor energía que
fueron tomados como punto de partida para realizar una optimización al nivel de cálculo
ab initio HF-STO/3G. Las estructuras fueron reoptimizadas siguiendo una secuencia de
optimizaciones sucesivas hasta llegar al nivel más alto (HF/3-21G, HF/6-31+G(d,p) y
B3LYP/6-31+G(d,p)). Sobre las geometrías más estables se llevó a cabo el análisis
vibracional para corrección de las energías electrónicas con los valores calculados de
energía libre. Estas estructuras fueron ocupadas también para obtener de ellas los
ángulos diedros entre los átomos involucrados en las constantes de acoplamiento
vecinales.
De esta manera fueron obtenidos cuatro confórmeros más estables correspondientes a
dos botes (b-syn y b-anti) y dos medias sillas (hc-1 y hc-2) (Figura 31).
Figura 31. Geometrías optimizadas al nivel B3LYP/6-31+G(d,p). Se muestran las energías relativas
calculadas (G a 25°C, kcal/mol) y las proporciones de cada confórmero asumiendo una distribución de
Boltzmann para los botes y las sillas del aducto 4b.
51
En la Figura 31 se pueden apreciar las energías relativas calculadas a 25 °C en orden
creciente, donde se puede observar que las conformaciones de bote son las más estables
que las conformaciones de media silla. De las dos geometrías más estables, el
confórmero b-syn es el de menor energía y es la estructura que posee mayor estabilidad
debido a que los carbonos carbonilos tienen una geometría axial que se puede explicar
en términos de una menor tensión torsional de la interacción de estos carbonos con los
carbonos C4 y C7 con respecto al confórmero b-anti. En el mismo sentido, las
proporciones de abundancia de estos confórmeros correlaciona con las energías
relativas; es decir, a medida que la energía relativa aumenta (disminuye estabilidad) la
proporción disminuye.
Por otro lado, cabe mencionar que en el análisis no fueron exploradas las
conformaciones del fenilo ni del grupo carboetoxi, ya que la geometría de los anillos
fusionados es independiente de ellos, además esta misma porción molecular es la de
interés y es donde precisamente fueron determinadas las constantes de acoplamiento de
en RMN de 1H.
Como se mencionó anteriormente, de las geometrías más estables fueron
determinados los ángulos diedros con el propósito de estimar las constantes de
acoplamiento vecinales utilizando la ecuación de Haasnot-de Leeuw-Altona28
implementado en el programa ALTONA.29
(Tabla 8). Además, se estimaron las
constantes de acoplamiento promedio asumiendo una distribución de Boltzmann de los
confórmeros, de acuerdo a sus energías relativas66
.
Tabla 8. Ángulos diedros (, °) y constantes de acoplamiento calculadas (3J, Hz) derivadas de la
optimización de los confórmeros de bote (b) y media-silla (hc) del aducto 4b al nivel B3LYP/6-
31+G(d,p). Se muestran los valores experimentales de 3J (exp), así como los valores estimados de la
distribución de Boltzmann (avg).
Confórmeros
H3a-
H7a
3J
H3a-
H7a
H3a-
H4
3J
H3a-
H4
H3a-
H4
3J
H3a-
H4
H7a-
H7
3J
H7a-
H7
H7a-
H7
3J
H7a-
H7
b-syn 2.0 11.14 -45.9 5.20 69.7 1.80 42.4 5.90 -72.9 1.50
b-anti 0.4 11.20 43.0 6.00 158.6 11.05 -42.5 6.10 -158.1 10.90
Hc-1 35.6 7.27 -16.3 9.56 97.8 1.36 -37.1 6.95 -151.8 10.07
Hc-2 -35.3 7.46 38.1 6.78 152.7 10.22 15.6 9.56 -98.6 1.44
exp 9.40 7.25 2.50 6.60 2.50
avg 10.70 5.69 3.65 6.20 3.46
52
Se pueden observar que las constantes de acoplamiento experimentales son muy
similares a las estimadas para el confórmero b-syn; sin embargo, fue más preciso
considerar el promedio de las 3J estimadas y la similitud es aun mayor, pudiendo
concluir en este aspecto que la conformación de bote syn (b-syn) es la más estable tanto
en fase gas como en disolución.
Los resultados obtenidos hasta el momento habían sido muy interesantes puesto que
normalmente las N-arilimidas son sintetizadas normalmente a partir de los ácidos N-
arilmaleámicos utilizando ciertos catalizadores
y temperatura,
30,31 otras metodologías
incluyen el uso de sustratos diferentes a los ácidos N-arilmaleámicos con o sin
catalizadores.32,33
En relación a las reacciones de cicloadición de Diels-Alder entre
maleimidas N-sustituidas utilizadas como dienófilos se han llevado a cabo con distintos
dienos y bajo diferentes metodologías;25
algunos han reportado su síntesis utilizando
catalizadores quirales,34,35
no quirales,36,37
ácidos de Lewis,38
así como otras reacciones
realizadas bajo condiciones térmicas38
o no térmicas39,40
. En el mismo sentido se han
utilizado técnicas que incluyen la cicloadición utilizando disoluciones buffer acuosas41
y
otras con aceleradores físicos como son el uso de microondas42
con buenos resultados
en cuanto al tiempo de reacción se refieren.
Basado en los antecedentes y resultados obtenidos, se propuso sintetizar las mismas
moléculas pero bajo una reacción de multicomponentes (MCR); es decir, formar los
aductos Diels-Alder 4a-d en un sistema de 3 componentes (anhídrido maleico (1),
isopreno (2) y las anilinas 3a-d). La reacción se llevó a cabo bajo condiciones térmicas
a 160 °C en un tubo de presión por 96 h (Figura 32). Después del tiempo de reacción y
purificados los compuestos se caracterizaron espectroscópicamente; el análisis de las
constantes físicas (puntos de fusión y Rf) fueron iguales que los anteriores; de igual
manera que las señales de RMN de 1H y
13C, IR y UV también fueron las mismas.
NH2
R1
R2
a: R1 = COOH, R2 = H
b: R1 = COOEt, R2 = H
c: R1 = H, R2 = COOH
d: R1 = H, R2 = COOEt
O
O
O
+
Tolueno,
160 °C, 96h
1 3a-d
+
H3C
2
H3C
N R1
R2
O
O
4a-d
Figura 32. Síntesis general de los aductos Diels-Alder 4a-d a través de una MCR
53
Al comparar los rendimientos de las reacciones llevadas a cabo en dos pasos y por
MCR se observa que para los compuestos 4a y 4d existe una diferencia aproximada del
15 % a favor de la MCR al comparar el rendimiento global en dos pasos con la MCR
(Tabla 9). De manera general ambos métodos no se diferencian en cuanto al
rendimiento se refiere.
Tabla 9. Rendimientos obtenidos de los ácidos N-fenilmaleámicos 5a-d y para los aductos 4a-d
obtenidos en dos pasos sintéticos y bajo una MCR.
Productos Rendimiento (%)
Rendimiento
global (%) Rendimiento (%)
Obtenidos en dos pasos
5a 90.3 — —
5b 89.0 — —
5c 95.8 — —
5d 77.7 — —
4a 76.8 69.4 90.7
4b 82.7 73.6 71.9
4c 90.2 86.4 76.9
4d 64.2 49.9 96.2
Los siguientes experimentos relacionados con estas reacciones fue la investigación de
la secuencia de pasos por la cual los aductos 4a-d se formaban a partir del sistema de
tres componentes; para ello se tomó como prototipo al compuesto 5a y se hizo
reaccionar con 2 con el propósito de obtener un intermediario anterior al aducto de N-
carboxifenilmaleimida (Figura 33).
54
NHO
AcOEt,
60 °C, 120 h
+
2
H3C
5a
NH
OH
O
O
O
OH
OHO
NH
OH
O
O
H3C
H3C
OH
OH
O
O
+
6a
7a
20 %
H3C
N
O
O4a
+
O
OH
Figura 33. Síntesis de la mezcla de regioisómeros 6a y 7a a partir de 5a y 2.
La reacción se llevó a cabo en un matraz bola con acetato de etilo (AcOEt) como
disolvente ya que el dienófilo no es soluble en otros disolventes como CH2Cl2, hexano,
tolueno, etc. La reacción se realizó bajo diferentes condiciones, como se muestra en la
Tabla 10.
Tabla 10. Condiciones de reacción en la investigación de la secuencia de pasos por la que se lleva a
cabo la reacción MCR. La reacción se llevó a cabo con AcOEt como disolvente.
Temperatura (°C) Tiempo (h) Reacción
Ambiente (~25 °C) 48 No reaccionó
40 48 No reaccionó
60 48 No reaccionó
60
120
Se obtuvieron 4a y la
mezcla de regioisómeros
6a y 7a
55
Como se puede apreciar en la tabla, la materia prima no reaccionó a las temperaturas
ambiente, 40 °C y 60 °C por 48 h. Únicamente se observó reacción cuando se dejó por
72 h más a 60 °C, sumando un tiempo total de 120 h. La c.c.f. reveló que se había
formado el aducto 4a y otro producto más polar que éste. El nuevo producto fue
purificado por diferencia de polaridad utilizando CH2Cl2 (el aducto 4a es soluble) y
hexano frío. Una vez separado el compuesto fue caracterizado por RMN de 1H (Figura
32) y 13
C y sorprendentemente mostró que se trataba de la mezcla de regioisómeros
correspondiente a los aductos Diels-Alder entre el isopreno y el ácido N-arilmaleámico
en una proporción aproximada de 45:55. (Figura 34). Es importante señalar que la
reacción dio un rendimiento muy bajo, que fue del 20 %.
NH
OH
O
O
OH
O
1
23
3a4
5
67a
1'2'
3'
4'
5'
6'
7
NH
OH
O
O
OH
O
1
23
3a4
5
6 7a
1'2'
3'
4'
5'
6'
7
H3C
H3C
H2
H6
H2
H5
H3’
H5’
H2’
H6’
-CH3
H7a
H3a
H4
H7
Figura 34. Mezcla de regioisómeros 6a y 7a obtenidos a 60 °C por 120 h a agitación constante con
AcOEt como disolvente.
Con este resultado se pudo plantear la propuesta de la secuencia de pasos por la que
se lleva a cabo la reacción multicomponente; el primer paso consiste en la formación del
ácido N-carboxifenilmaleámico (5a) que reacciona con el isopreno (2) para formar la
mezcla de regioisómeros (6a 7a) que eventualmente reacciona intramolecularmente
56
para formar el anillo de 5 miembros (N-arilimida 4a) por pérdida de una molécula de
agua (Figura 35).
NH2
O
O
O
+
NH
OH
O
OTHF, ta
1 3a-d
5a
OHO
NH
OH
O
O
NH
OH
O
O
H3C
H3C
OH
OH
O
O
+
7a
6a
H3C
2
H3C
N
O
O
4a
O
OH-H2O
OHO
Figura 35. Secuencia de eventos que ocurren durante la reacción multicomponente para el aducto 4a.
Se analizaron de manera general los espectros de RMN de 1H y
13C para realizar la
asignación de las señales para la mezcla de regioisómeros de los productos (6a 7a)
(Tabla 11). En el espectro de 1H se pueden apreciar que las señales correspondientes al
hidrógeno sobre el nitrógeno de la amida está doble, al igual que los hidrógenos
aromáticos correspondientes al sistema de acoplamiento AA’-BB’, para los que fue
posible determinar las constantes de acoplamiento orto que fueron de 8.5 y 9.0 Hz. En
el mismo sentido también es posible observar las señales alrededor de 5.30 ppm que son
dos señales anchas que corresponden a los hidrógenos de las posiciones 5 ó 6
(hidrógenos vinílicos). Las señales que se encuentran a campos más altos corresponden
a los hidrógenos del anillo de ciclohexeno, las cuales aparecen como multipletes; las
señales que se encuentran entre 2.8 y 3.0 ppm corresponden a los hidrógenos 3a y 7a
que están adyacentes a los carbonilos del ácido o amida. Las señales que se encuentran
57
en el intervalo entre 2.1 y 2.5 corresponden a los hidrógenos de las posiciones 4 y 7. Por
último, cabe señalar que la señal ancha que se encuentra aproximadamente a 1.6 ppm
corresponde a los grupos metilo ya sea de la posición 5 o 6.
Tabla 11. Caracterización por RMN de 1H (500 MHz) y
13C (125 MHz) en DMSO-d6 de la mezcla de
regioisómeros de los aductos Diels-Alder 6a y 7a derivados.
H3C
NH
OH
O
O
OH
O
1
23
3a4
5
67a
1'2'
3'
4'
5'
6'
7
4a
Posición
1H (ppm)
3JH-H (Hz)
13
C (ppm)
1 12.00 – 13.00 (br) 173.38, 173.31
2 10.03 (1H, s); 10.02 (1H, s) --------
3 -------- 167.66
3a 2.87 (2H, m) Traslapado
4 y 7 2.13-2.51 (8H, m) 31.63, 31.13, 27.51, 26.73
5 ó 6 5.32 (1H, br); 5.30 (1H, br) 133.07, 131.69, 120.23
7a 3.03 (2H, m) 41.65
-CH3 1.61 (6H, br) 26.01, 23.92
1’ -------- 146.37
2’ 7.67 (2H, d, 9.00); 7.66
(2H, d, 8.50) 119.05, 118.99
3’ 7.85 (2H, d, 9.00); 7.84
(2H, d, 8.50) 130.94
4’ -------- 125.40, 125.37
5’ 7.85 (2H, d, 9.00); 7.84
(2H, d, 8.50) 130.94
6’ 7.67 (2H, d, 9.00); 7.66
(2H, d, 8.50) 119.05, 118.99
-COO 12.00 – 13.00 (br) 175.46, 175.41 s: señal simple, d: señal doble, m: señal múltiple, br: señal ancha
Hasta este momento se habían obtenidos aductos de la N-arilmaleimida 4a-d,
mientras que los aductos de la serie 6a-d o 7a-d sólo fueron preparados como mezcla de
regioisómeros ya que la reacción bajo las condiciones experimentales no es
regioselectiva; además la reacción de síntesis requirió mucho tiempo y sobre todo el
rendimiento fue demasiado bajo (20.0 %). Por la razones anteriores se propuso una
nueva estrategia para preparar los aductos derivados de isopreno, así como también los
derivados de ciclopentadieno y furano; la cual consistió en preparar los aductos Diels-
58
Alder entre el anhídrido maleico (1) como dienófilo y su correspondiente dieno:
isopreno (2), ciclopentadieno (9) y furano (12) (Figura 36).
O
O
O
H3C
O
O
O
O
O
O
O
8
10a
13
+
+
+
THF, 16h, t.a.
THF, 16h, t.a.
THF, 16h, t.a.
NH
OH
O
O
R1
R2
O
NH
OH
O
O
R1
R2
NH
OH
O
O
R1
R2
H3C
Mezcla 6a-d y 7a-d
11a-d
14a-d
R1
R2
NH2
3a-d
R1
R2
NH2
3a-d
R1
R2
NH2
3a-d
a: R1 = COOH, R2 = H
b: R1 = COOEt, R2 = H
c: R1 = H, R2 = COOH
d: R1 = H, R2 = COOEt
Figura 36. Reacciones generales de síntesis de los aductos Diels-Alder 6a-d, 7a-d, 11a-d y 14a-d a partir
de los aductos 8, 10a y 13.
Los aductos derivados de isopreno (8), ciclopentadieno (10a) y furano (13) fueron
preparados en condiciones de reacción similares36, 39
. Este tipo de reacciones son
relativamente sencillas y no requieren mucho tiempo para su preparación; sin embargo,
los rendimientos fueron moderados. Los puntos de fusión no son muy altos y en
relación a sus Rf el único que se pudo obtener fue el aducto 13, ya que el resto no
observa en la placa cromatográfica cuando se ilumina con luz UV a 254 nm (Tabla 12).
59
Tabla 12. Características físicas de los aductos Diels-Alder 8, 10a, 10b y 13.
O
O
O
H3C
1
23
3a4
5
6
7
7a
8
O
O
O
Ha Hb
12
33a
4
5
6
7
8
7a
10a
O
O
O
12
3
4
5
6
Ha Hb
77a
3a
8
10b
O O
O
O
1
23
3a
4
5
6
7
7a
13
Rendimiento
(%)
66.0 59.0 Comparativo* 51.4
Punto de fusión
(°C)
58-60 155-157 140-142 110-114
Rf
(AcOEt/MeOH
1:1)
No absorbe
No absorbe
No absorbe
0.80
*Producto 10b se utilizó con fines comparativos para 10a.
Estos compuestos fueron identificados por IR y RMN de 1H y
13C. En relación a la
identificación por IR, la banda característica de 8 es la banda en 840 cm-1
que
corresponde al sistema monoprótico vinílico; en cuanto a las bandas características de
los compuestos 10a y 10b corresponden a las bandas de 1430 y 1480 cm-1
del
norborneno respectivamente, y por último, la banda característica de 13 es la de 1220
cm-1
, 1210 cm-1
de la vibración de estiramiento del enlace C-O del biciclo (Tabla 13).
Las demás bandas son atribuidas a metilos, metilenos, dobles enlaces y el grupo
anhídrido.
Del mismo modo, los espectros de RMN muestran la presencia de cada uno de los
aductos preparados.
En relación al aducto 8 es importante señalar que el espectro de 1H muestra las
señales relacionadas con los hidrógenos del anillo de ciclohexeno formado durante la
reacción de Diels-Alder (Tabla 14). Los hidrógenos 3a y 7a muestran un acoplamiento
dobles de dobles de dobles, al igual que los hidrógenos de las posiciones 4 y 7 que
también muestran el mismo tipo de acoplamiento. Los hidrógenos 4 y 7 están
traslapados y muestran señales múltiples. Las constantes de acoplamiento son similares
a las analizadas para los aductos 4a-d en la Tabla 7. Por lo anterior, aparentemente se
tiene la conformación b-syn que es la geometría que muestra menos interacciones y
tensión.
60
Tabla 13. Caracterización de los aductos Diels-Alder 8, 10a y 13 por espectrofotometría IR
obtenidas en pastilla de KBr.
O
O
O
H3C
1
23
3a4
5
6
7
7a
8
O
O
O
Ha Hb
12
33a
4
5
6
7
8
7a
10a
O
O
O
12
3
4
5
6
Ha Hb
77a
3a
8
10b
O O
O
O
1
23
3a
4
5
6
7
7a
13
-CH2=CH2- 3050 3020 3010 3030
-CH3 y -CH2- 2940 2970 2970 2970
O
O
O
1860, 1710 1855, 1690 1865, 1770 1860, 1790
-------- 1430 1480 --------
C-O -------- -------- -------- 1220, 1210
H
840 -------- -------- --------
Se sintetizó el aducto 10a que, bajo las condiciones utilizadas para prepararlo, genera la
estereoquímica endo24
. El espectro de 1H muestra a 6.32 ppm una señal triple
correspondiente a los hidrógenos 5 y 6 vinílicos, seguida de la señal a 3.59 ppm con
multiplicidad doble de dobles correspondientes a los hidrógenos 3a y 7a; muy cerca
(3.51 ppm) se observa una señal doble de doble de dobles que corresponden a los
hidrógenos de las posiciones 4 y 7. Las señales de los hidrógenos de la posición 8
muestran dos señales dobles-múltiples debido a que esos hidrógenos son
diastereotópicos.
61
Tabla 14. Caracterización por RMN de 1H (300 MHz) y
13C (75 MHz) en CDCl3 de los aductos
Diels-Alder 8, 10a, 10b y 13 derivados del anhídrido maleico.
O
O
O
H3C
1
23
3a4
5
6
7
7a
8
O
O
O
Ha Hb
12
33a
4
5
6
7
8
7a
10a
O
O
O
12
3
4
5
6
Ha Hb
77a
3a
8
10b
O O
O
O
1
23
3a
4
5
6
7
7a
13
Posición 1
H (ppm)
3JH-H (Hz)
13C
(ppm)
1H (ppm)
3JH-H (Hz)
13C
(ppm)
1H (ppm)
3JH-H (Hz)
13C
(ppm)
1H (ppm)
3JH-H (Hz)
13C
(ppm)
1 -------- 172.18 -------- 171.52 -------- 171.82 -------- 167.63
2 -------- -------- -------- -------- -------- -------- -------- --------
3 -------- 172.02 -------- 171.52 -------- 171.82 -------- 167.63
3a
3.33 ddd
(9.86, 7.27,
2.66)
37.12 3.59 dd
(3.15, 1.65) 52.98
3.01 d
(1.50) 49.00 3.19 s 46.37
4 -------- --------
3.51 ddd
(6.75, 3.30,
1.65)
47.30 3.46 qu
(3.52, 1.72) 47.10
5.57 d
(0.90) 79.88
4 2.28 m
21.19
-------- -------- -------- -------- -------- --------
4
2.50 dd
(15.60,
2.66)
-------- -------- -------- -------- -------- --------
5 -------- 134.31 6.32 t
(1.95) 135.77
6.34 t
(3.60, 1.80)
(1.95)
138.19 6.59 d
(0.90) 134.66
6 5.63 m 117.84 6.32 t
(1.95) 135.77
6.34 t
(1.95) 138.19
6.59 d
(0.90) 134.66
7 -------- --------
3.51 ddd
(6.75, 3.30,
1.65)
47.30 3.46 qu
(3.52, 1.72) 47.10
5.57 d
(0.90) 79.88
7 2.23 m
21.76
-------- -------- -------- -------- -------- --------
7
2.58 ddd
(16.12,
6.82, 2.94)
-------- -------- -------- -------- -------- --------
7a
3.40 ddd
(9.86, 7.05,
2.94)
37.75 3.59 dd
(3.15, 1.65) 52.98
3.01 d
(1.50) 49.00 3.19 s 46.37
8a -------- -------- 1.79 dt
(8.70, 1.65)
46.35
1.68 dqu
(10.35,
3.60, 1.65) 44.35
-------- --------
8b -------- -------- 1.58 dm
(9.00)
1.45 dsep
(10.35,
3.60, 1.95)
-------- --------
-CH3 1.76 s 26.08 -------- -------- -------- -------- -------- -------
s: señal simple, d: señal doble, dd: señal doble de dobles, dt: doble de triples, ddd: señal doble de doble de dobles, dqu: doble
de quíntuples, dsep: doble de séptuples, t: señal triple, qu: señal quíntuple, m: señal múltiple.
62
Con fines comparativos, se adquirió el aducto exo de 10a (10b), y es posible observar
algunas diferencias en el espectro de 1H, sobre todo en las posiciones 3a y 7a donde las
multiplicidades y los desplazamientos químicos cambian: doble de dobles en 3.01 ppm,
y quíntuple 3.46 ppm, respectivamente. Los hidrógenos diasterotópicos también difieren
un poco en desplazamiento químico y en multiplicidad (Tabla 14).
Por último, el aducto derivado de furano (13) muestra 3 señales relacionadas con los
hidrógenos del sistema; sólo es posible apreciar la multiplicidad en la señal de los
hidrógenos vinílicos (5 y 6) correspondientes a un doble de dobles con acoplamiento
con los hidrógenos de las posiciones 4 y 7 con una constante de acoplamiento de 0.90
Hz.
Es importante señalar que el aducto 13 corresponde a una estereoquímica exo según
las condiciones utilizadas y las evidencias reportadas con anterioridad.43
Una vez sintetizados los aductos 8, 10a y 13 fueron sintetizados a partir de ellos los
aductos 6a-d, 7a-d, 11a-d y 14a-d, respectivamente (Figura 37).
O
O
O
H3C
O
O
O
O
O
O
O
8
10a
13
+
+
+
THF, 16h, t.a.
THF, 16h, t.a.
THF, 16h, t.a.
NH
OH
O
O
R1
R2
O
NH
OH
O
O
R1
R2
NH
OH
O
O
R1
R2
H3C
Mezcla 6a-d y 7a-d
11a-d
14a-d
R1
R2
NH2
3a-d
R1
R2
NH2
3a-d
R1
R2
NH2
3a-d
a: R1 = COOH, R2 = H
b: R1 = COOEt, R2 = H
c: R1 = H, R2 = COOH
d: R1 = H, R2 = COOEt
Figura 37. Reacciones generales de síntesis de los aductos Diels-Alder 6a-d, 7a-d, 11a-d y 14a-d a partir
de los aductos 8, 10a y 13.
63
Las reacciones efectuadas con el aducto 8 y sus correspondientes anilinas (3a-d)
generaron la mezcla de regioisómeros en una proporción 55:45; es decir, que la reacción
volvió a ser no regioselectiva bajo este procedimiento (Figura 38); sin embargo, los
rendimientos fueron más altos que los obtenidos con la mezcla de regioisómeros 6a y
7a ya que están por encima del 40 % (Tabla 15).
NH
OH
O
O
O
O
1
23
3a4
5
67a
1'2'
3'
4'
5'
6'
7
NH
OH
O
O
O
O
1
23
3a4
5
6 7a
1'2'
3'
4'
5'
6'
7
H3C
H3C
6b
7b
CH3
CH3
H2
H6
H2
H5
H3’
H5’H2’
H6’
-CH3
H7a
H3a
H4
H7
-CH3
-CH2-
Figura 38. Mezcla de regioisómeros 6b y 7b obtenidos a partir del aducto 8.
64
Tabla 15. Características físicas de la mezcla de regioisómeros de los aductos Diels-Alder 6a-d y 7a-
d derivados de isopreno.
H3C
NH
OH
O
O
OH
O
1
23
3a4
5
67a
1'2'
3'
4'
5'
6'
6a y 7a
H3C
NH
OH
O
O
O
O
1
23
3a4
5
6
77a
1'2'
3'
4'
5'
6' CH3
6b y 7b
H3C
NH
OH
O
O
OH
O1
23
3a4
6
5
77a
1'2'
3'
4'
5'
6'
6c y 7c
H3C
NH
OH
O
O
O
O1
23
3a4
6
5
77a
1'2'
3'
4'
5'
6'
CH3
6d y 7d
Rendimiento
(%)
81.6 42.5 99.4 89.6
Punto de
fusión (°C)
182-184 110-112 144-146 Líquido
Rf
(AcOEt/Me
OH 1:1)
0.84 0.90 0.49 0.89
En cuanto a la caracterización por IR, es importante destacar que aparece una banda
aproximadamente en 3400-3300 cm-1
que corresponde a las vibraciones de estiramiento
del enlace N-H (Tabla 16), mismas que carecen los aductos 4a-d que poseen un grupo
imida.
65
Tabla 16. Caracterización de la mezcla de regioisómeros de los aductos Diels-Alder 6a-d y 7a-d
derivados de isopreno por espectrofotometría IR obtenidas en pastilla de KBr.
H3C
NH
OH
O
O
OH
O
1
23
3a4
5
67a
1'2'
3'
4'
5'
6'
6a y 7a
H3C
NH
OH
O
O
O
O
1
23
3a4
5
6
77a
1'2'
3'
4'
5'
6' CH3
6b y 7b
H3C
NH
OH
O
O
OH
O1
23
3a4
6
5
77a
1'2'
3'
4'
5'
6'
6c y 7c
H3C
NH
OH
O
O
O
O1
23
3a4
6
5
77a
1'2'
3'
4'
5'
6'
CH3
6d y 7c
-NH 3420, 1170 3415, 1170 3400, 1180 3461
-OH 3200 3360 3295 3285
-CH2=CH2- No se observa No se observa No se observa 3102
-CH3 y -
CH2-
2990 2910 2970 2974
-COOH 1690 1690 1710 1692
OO
-------- 1710 -------- 1653
OHO
1595 -------- 1590 --------
HN-C=O 1530 1600 1550 1549
-CO-O -------- 1280 -------- No se observa
O-C-C -------- 1240 -------- 1243
o-di
850, 780 870, 780 -------- --------
m-di
-------- -------- 820, 800, 775,
695
762, 753, 705
Básicamente el espectro es muy similar a aquel obtenido de la reacción realizada en
la investigación de la secuencia de pasos que ocurren en la reacción MCR llevada a
cabo en AcOEt (Figura 34). Es posible apreciar en el espectro de RMN de 1H las dos
señales a campo bajo correspondientes a las hidrógenos de cada grupo amida del
regioisómero correspondiente en aproximadamente 10.10 ppm. Se pueden apreciar dos
66
señales complejas que corresponden al traslape de los dos pares de señales dobles de los
sistemas AA’-BB’ de los hidrógenos aromáticos de cada regioisómero. Las dos señales
anchas de los hidrógenos vinílicos de las posiciones 5 ó 6. Las señales correspondientes
a los hidrógenos 3a y 7a, así como los hidrógenos de las posiciones 4 y 7 en el intervalo
2.18-2.57 ppm como señales múltiples (Tabla 17). Es importante señalar que los
aductos que se obtuvieron son derivados cis, ya que ambos grupos sustituyentes se
encuentran del mismo lado en el anillo de ciclohexeno.
Por otro lado, fueron preparados los aductos 11a-d, para los que es de suponer que los
compuestos obtenidos fueron aquellos con estereoquímica endo, puesto que se partió
del aducto 10a que de inicio tenía dicha estereoquímica. Los rendimientos de la
reacción entre 10a y las anilinas 3a-d van de moderados a muy buenos, tienen puntos de
fusión un poco más altos que el aducto 10a, además de que son compuestos más polares
(Tabla 18).
67
Tabla 17. Caracterización por RMN de 1H (300 y 500 MHz) y
13C (75 y 125 MHz) en DMSO-d6 de la
mezcla de regioisómeros de los aductos Diels-Alder 6a-d y 7a-d derivados de isopreno.
H3C
NH
OH
O
O
OH
O
1
23
3a4
5
67a
1'2'
3'
4'
5'
6'
7
6a y 7a
H3C
NH
OH
O
O
O
O
1
23
3a4
5
6
77a
1'2'
3'
4'
5'
6' CH3
6b y 7b
H3C
NH
OH
O
O
OH
O1
23
3a4
6
5
77a
1'2'
3'
4'
5'
6'
6c y 7c
H3C
NH
OH
O
O
O
O1
23
3a4
6
5
77a
1'2'
3'
4'
5'
6'
CH3
6d y 7d
Posición 1
H (ppm) 3JH-H (Hz)
13C
(ppm)
1H (ppm)
3JH-H (Hz)
13C
(ppm)
1H (ppm)
3JH-H (Hz)
13C
(ppm)
1H (ppm)
3JH-H (Hz)
13C
(ppm)
1 11.50 –
12.50 (br)
175.64,
175.56
11.50 –
12.50 (br)
173.48,
173.40
11.50 –
12.50 (br)
173.13,
173.05
11.50 –
12.50 (br)
175.50,
175.27
2
10.07 (1H, s); 10.09
(1H, s)
-------- 10.12 (1H, s); 10.10
(1H, s)
-------- 9.94 (1H, s); 9.92
(1H, s)
-------- 9.96 (1H, s);
9.97 (1H, s) --------
3 -------- 169.89 -------- 166.08 -------- 167.94 -------- 166.95
3a 2.87 (2H,
m) Traslapada
2.88 (2H, m)
39.36 2.87 (2H,
m) 39.38 2.84 (2H, m) 39.26
4 y 7 2.12-2.57
(8H, m)
33.89,
33.22,
29.67, 28.82
2.18-2.59
(8H, m)
31.62,
31.06,
27.53, 26.70
2.12-2.58
(8H, m)
31.65,
31.13,
27.53, 26.73
2.12-2.51
(8H, m)
31.35, 31.00,
29.11, 26.48,
5 ó 6
5.35 (1H,
br); 5.31
(1H, br)
135.26,
133.85,
122.44
5.36 (1H,
br); 5.31
(1H, br)
133.11,
131.66,
120.30
5.36 (1H,
br); 5.32
(1H, br)
133.07,
131.78,
120.26
5.74 (2H, br) 133.46, 131.32
7a 3.03 (2H,
m) 43.42
3.05 (2H,
m) 41.26
3.01 (2H,
m) 41.17 3.02 (2H, m) 39.90
-CH3 1.62 (6H,
br) 26.14
1.62 (6H,
br) 23.98 1.63 (3H, s) 23.98
1.63 (3H, s);
1.60 (3H, s) 24.50, 23.94
1’ -------- 146.37 -------- 144.54 -------- 140.33 -------- 140.48
2’
7.67 (2H, d, 8.70); 7.66
(2H, d,
9.00)
121.23,
121.16
7.71 (2H, d, 9.00); 7.70
(2H, d,
9.00)
119.10,
119.04
8.24 (2H,
br) 118.99
8.24 (1H, s);
8.25 (1H, s)
119.92,
118.93
3’
7.86 (2H, d,
8.70); 7.85
(2H, d, 8.70)
133.16
7.88 (2H, d,
8.70); 7.87
(2H, d, 9.00)
130.31 -------- 129.53 -------- 129.71,
129.55
4’ -------- 127.53,
127.49 --------
124.44,
124.40
7.27-7.89
(2H, m)
123.94,
123.87 128.00
5’
7.86 (2H, d,
8.70), 7.85 (2H, d,
8.70)
133.16
7.88 (2H, d,
8.70); 7.87 (2H, d,
9.00)
130.31
7.39 (1H, t,
6.90); 7.38 (1H, t,
6.90)
124.37 7.79 (1H, t) 124.14
6’
7.67 (2H, d,
8.70); 7.66
(2H, d,
9.00)
121.23,
121.16
7.67 (2H, d,
8.70); 7.66
(2H, d,
9.00)
119.10,
119.04
7.59 (1H, d,
8.10); 7.58
(1H, d,
8.10)
120.66,
120.57
7.66 (1H, d,
7.80); 7.60 (1H, d, 7.50)
120.71,
120.22
-COO 12.00 – 13.00
177.72, 177.67
-------- 175.51, 175.45
12.00 – 13.00
175.53, 175.48
-------- 179.92, 179.80
-CH2- -------- -------- 4.26 (4H, q,
7.05) 61.10 -------- --------
4.33 (2H, q,
6.90); 4.25
(2H, q, 7.20)
61.05
-CH3 -------- -------- 1.29 (6H, t,
7.20) 14.89 -------- --------
1.31 (3H, t,
7.20); 1.28
(3H, t, 6.90)
14.87
s: señal simple, d: señal doble, dd: señal doble de dobles, ddd: señal doble de doble de dobles, t: señal triple, q: señal
cuádruple, m: señal múltiple, br: señal ancha.
68
Tabla 18. Características físicas de los aductos Diels-Alder 11a-d derivados de ciclopentadieno.
NH
OH
O
O
OH
O
1
23
4
5
6
1'2'
3'
4'
5'
6'
3a
77a
Ha Hb8
NH
OH
O
O
O
O
1
2
3
4
5
6
1'2'
3'
4'
5'
6' CH3
7
3a
7a
Ha Hb8
NH
OH
O
O
1
23
4
5
6
1'2'
3'
4'
5'
6'
OH
O
7
3a
7a
Ha Hb8
NH
OH
O
O
1
23
4
5
6
1'2'
3'
4'
5'
6'
O
O
CH3
77a
3a
Ha Hb8
Rendimiento
(%)
87.2 79.3 91.4 58.9
Punto de
fusión (°C)
175-176 158-160 160-161 132-134
Rf
(AcOEt/MeO
H 1:1)
0.56 0.92 0.41 0.93
Es importante decir que los primeros intentos de formación de estos aductos se
llevaron a cabo de la misma forma que con isopreno (2); es decir, en este caso
particular, se hizo reaccionar el ácido N-fenilmaleámico 5b con 2 para obtener 11b, y en
efecto se consiguió generar dicho compuesto con bajo rendimiento. En la Figura 39 se
muestran las condiciones de reacción por las que se llevaron a cabo las reacciones de
obtención de 11b por ambas rutas sintéticas.
NHOH
O
O
COOEt
O
O
ONH2
COOEt
NH
OH
O
O
COOEt
NH
OH
O
O
COOEt
+Acetona
Tubo cerrado
40°C, 96 h
+THFanh.
t.a., 16 h
5b
9
11b
11b10a 3b
(23.8 %)
(79.3 %)
Figura 39. Diagrama de obtención del aducto 11b por medio de dos rutas sintéticas.
69
La conclusión de esta sección fue la misma que se comentó anteriormente, se decidió
preparar los aductos por la segunda ruta, es decir a partir del aducto 10a por razones de
peso, que consistieron la generación del mismo aducto (Figuras 40 y 41), mejoría
sustancial en el rendimiento y menor tiempo de reacción.
H2
H3’
H4’
H2’
H6’
H4 H5
-CH2-
H8b
-CH3
H7a
H3a
H7
H4
Figura 40. Espectro de RMN de 1H para el aducto 11b obtenido bajo el primer método (a partir de 5b y 2
en acetona, a 40°C por 96h).
70
H2
H3’
H4’
H2’
H6’
H4 H5
-CH2-
H8b
-CH3
H7a
H3a
H7
H4
H8a
Figura 41. Espectro de RMN de 1H para el aducto 11b obtenido bajo el segundo método (a partir de 10a
y 3b en THFanh., a t.a. por 16h).
Como se mencionó anteriormente, ambos espectros muestran el mismo patrón de
señales y desplazamientos químicos (Tabla 19). Los espectros muestran una señal
simple a campo bajo correspondiente al hidrógeno de la amida en aproximadamente
10.20 ppm; seguido del sistema AA´-BB’ de sustitución para de los hidrógenos
aromáticos con una 3Jo = 8.70 Hz; después las señales correspondientes a los
hidrógenos vinílicos que en esta molécula son diferentes y muestran dos señales dobles
de dobles en el intervalo 6.04-6.17 ppm con 3J = 2.70 Hz y
3J = 2.85 Hz con
acoplamiento con los hidrógenos de las posiciones 4 y 7, respectivamente; mientras que
la 3J = 5.40 Hz resulta del acoplamiento entre los hidrógenos vinílicos. Los hidrógenos
de las posiciones 4 y 7 son dos señales anchas que se encuentran en el intervalo 3.00-
3.06 que no muestran constantes de acoplamiento ya que se están acoplando con los
vinílicos.
71
Tabla 19. Caracterización por RMN de 1H (500 MHz) y
13C (125 MHz) en DMSO-d6 de los aductos
Diels-Alder 11a-d derivados de ciclopentadieno.
NH
OH
O
O
OH
O
1
23
4
5
6
1'2'
3'
4'
5'
6'
3a
77a
Ha Hb8
11a
NH
OH
O
O
O
O
1
2
3
4
5
6
1'2'
3'
4'
5'
6' CH3
7
3a
7a
Ha Hb8
11b
NH
OH
O
O
1
23
4
5
6
1'2'
3'
4'
5'
6'
OH
O
7
3a
7a
Ha Hb8
11c
NH
OH
O
O
1
23
4
5
6
1'2'
3'
4'
5'
6'
O
O
CH3
77a
3a
Ha Hb8
11d
Posición 1
H (ppm)
3JH-H (Hz)
13C
(ppm)
1H (ppm)
3JH-H (Hz)
13C
(ppm)
1H (ppm)
3JH-H (Hz)
13C
(ppm)
1H (ppm)
3JH-H (Hz)
13C
(ppm)
1 11.50 - 12.00
br 171.04
11.50 – 12.00
br 171.53
11.50 – 12.00
br 173.34
11.50 –
12.00 br 173.41
2 10.22 s -------- 10.25 s -------- 10.08 s -------- 10.11 s --------
3 -------- 167.35 -------- 166.17 -------- 170.20 -------- 168.64
3a 3.23 dd
(3.30, 10.20) 49.06
3.23 dd
(3.30, 10.35) 49.46
3.22 dd
(3.30, 10.20) 51.58
3.22 dd
(3.30, 10.20) 51.58
4 3.00 br 46.97 3.00 br 47.37 2.99 br 49.56 3.06 br 49.55
5 6.03 dd
(2.85, 5.25) 134.33
6.04 dd
(2.70, 5.40) 134.76
6.03 dd
(2.85, 5.25) 136.90
6.04 dd
(2.70, 5.40) 136.95
6 6.17 dd
(2.85, 5.55) 135.17
6.17 dd
(2.85, 5.40) 135.58
6.17 dd
(2.85, 5.55) 137.73
6.17 dd
(2.85, 5.55) 137.73
7 3.06 br 48.42 3.06 br 48.84 3.05 br 51.03 3.05 br 51.05
7a 3.37 dd
(3.00, 10.20) 49.51
3.37 dd
(3.00, 10.20) 49.93
3.35 dd
(3.15, 10.05) 52.00
3.35 dd
(3.30, 10.20) 52.02
8a 1.25 d (9.75)
45.79
1.34 d (9.00)
46.22
1.33 d (7.80)
48.34
Traslapado
48.37
8b 1.33 d (7.35) Traslapado 1.25 d (8.70) Traslapado
1’ -------- 143.85 -------- 144.55 -------- 142.53 -------- 142.67
2’ 7.60 d (8.85) 118.44 7.63 d (8.70) 118.91 8.21 s 122.61 8.22 s 122.13
3’ 7.83 d (8.85) 130.55 7.85 d (8.70) 130.79 -------- 133.88 -------- 133.05
4’ -------- 124.71 -------- 124.25 7.65 d (8.10) 126.44 7.68 d (8.55) 127.50
5’ 7.83 d (8.85) 130.55 7.85 d (8.70) 130.79 7.36 t (8.10) 131.70 7.39 t (7.95) 131.88
6’ 7.60 d (8.85) 118.44 7.63 d (8.70) 118.91 7.56 d (7.80) 125.95 7.57 d (7.05) 126.21
-COO 11.50 – 12.50 173.73 -------- 174.14 11.50 – 12.50 176.40 -------- 176.39
-CH2- -------- -------- 4.24 q (6.90) 61.16 -------- -------- 4.28 q (6.90) 63.72
-CH3 -------- -------- 1.27 t (6.90) 14.86 -------- -------- 1.28 t (6.90) 17.05
s: señal simple, d: señal doble, dd: señal doble de dobles, ddd: señal doble de doble de dobles, t: señal triple, q: señal
cuádruple, m: señal múltiple, br: señal ancha.
Los hidrógenos de las posiciones 3a y 7a son dos señales con multiplicidad doble de
dobles, ya que se están acoplando entre ellas con 3J = 3.00 Hz, y con los hidrógenos 4 y
7, respectivamente, con 3J = 10.30 Hz aproximadamente. Los hidrógenos del puente
(posición 8) muestran una señal doble de dobles que se traslapa con la señal triple del
grupo- CH3 del éster. Estas señales se pueden apreciar mejor en los espectros de los
aductos 3a y 3c.
72
En relación a los aductos 14a-d el análisis se realizó de la misma manera que los
anteriores, iniciando por los puntos de fusión, Rf y rendimientos, los cuales fueron de
moderados a buenos (Tabla 20).
Tabla 20. Características físicas de los aductos Diels-Alder 14a-d derivados de furano.
O
NH
OH
O
O
OH
O
1
23
4
5
6
1'2'
3'
4'
5'
6'
3a
77a
14a
NH
OH
O
O
O
O
1
2
3
4
5
6
1'2'
3'
4'
5'
6' CH3
O
7
3a
7a
14b
O
NH
OH
O
O
1
23
4
5
6
1'2'
3'
4'
5'
6'
OH
O
7
3a
7a
14c
O
NH
OH
O
O
1
23
4
5
6
1'2'
3'
4'
5'
6'
O
O
CH3
77a
3a
14d
Rendimiento
(%)
57.5 75.5 87.8 ND
Punto de
fusión (°C)
196-198 182-184 192-194 ND
Rf
(AcOEt/MeO
H 1:1)
0.16 0.43 0.16 ND
ND: No determinado por impurezas
Los espectros de IR muestran bandas relevantes para las vibraciones C-O del biciclo
(Tabla 21). El resto de las bandas corresponden a los carbonilos, a los aromáticos,
metilos y metilenos, etc.
73
Tabla 21. Caracterización de los aductos Diels-Alder 14a-d derivados de furano por
espectrofotometría IR obtenidas en pastilla de KBr.
O
NH
OH
O
O
OH
O
1
23
4
5
6
1'2'
3'
4'
5'
6'
3a
77a
14a
NH
OH
O
O
O
O
1
2
3
4
5
6
1'2'
3'
4'
5'
6' CH3
O
7
3a
7a
14b
O
NH
OH
O
O
1
23
4
5
6
1'2'
3'
4'
5'
6'
OH
O
7
3a
7a
14c
O
NH
OH
O
O
1
23
4
5
6
1'2'
3'
4'
5'
6'
O
O
CH3
77a
3a
14d
-NH 3300, 1180 3420, 1180 3325, 1180 ND
-OH No se observa No se observa No se observa ND
-CH2=CH2- No se observa No se observa 3050 ND
-CH3 y -
CH2-
2990 2940 No se observa ND
-COOH 1710 1640 1735 ND
OO
-------- 1710 -------- ND
OHO
1680 -------- 1695 ND
HN-C=O 1595 1610 1595 ND
O
1520, 1315 1520 1540, 1305,
1280
ND
-CO-O -------- 1290 -------- ND
O-C-C -------- 1270 -------- ND
o-di
860, 820, 785 870, 830, 780 -------- ND
m-di
-------- -------- 940, 915, 897 ND
ND: No determinado por impurezas
En cuanto a la caracterización de los espectros de RMN, se tomó como ejemplo de
análisis al aducto 14b (Figura 42).
74
H2
H3’
H4’
H2’
H6’H4 H5
-CH2-
-CH3
H7aH3aH7 H4
Figura 42. Espectro de RMN de 1H para el aducto 14b.
Al igual que los casos anteriores, se observa en el espectro de 1H a campos bajos la
señal del hidrógeno de la amida en 10.20 ppm, el sistema AA’-BB’ de los hidrógenos
aromáticos con una constante de acoplamiento orto de 8.70 Hz. Se puede observar una
señal doble de dobles en 6.48 ppm correspondientes a los hidrógenos vinílicos que se
acoplan entre ellos con una 3J = 1.35 Hz. Las señales correspondientes a los hidrógenos
de las cabezas de puente del biciclo están desplazadas a campos bajos (5.03-5.12 ppm)
debido a la cercanía del átomo de oxígeno; estas señales son anchas debido al
acoplamiento con los hidrógenos vinílicos. Por último se encuentran dos señales dobles
correspondientes a los hidrógenos de las posiciones 3a y 7a con una 3J = 9.30 Hz (Tabla
22).
75
Tabla 22. Caracterización por RMN de 1H (500 MHz) y
13C (125 MHz) en DMSO-d6 de los aductos
Diels-Alder 14a-d derivados de furano.
O
NH
OH
O
O
OH
O
1
23
4
5
6
1'2'
3'
4'
5'
6'
3a
77a
14a
NH
OH
O
O
O
O
1
2
3
4
5
6
1'2'
3'
4'
5'
6' CH3
O
7
3a
7a
14b
O
NH
OH
O
O
1
23
4
5
6
1'2'
3'
4'
5'
6'
OH
O
7
3a
7a
14c
O
NH
OH
O
O
1
23
4
5
6
1'2'
3'
4'
5'
6'
O
O
CH3
77a
3a
14d
Posición 1
H (ppm) 3JH-H (Hz)
13C
(ppm)
1H (ppm)
3JH-H (Hz)
13C
(ppm)
1H (ppm)
3JH-H (Hz)
13C
(ppm)
1H (ppm)
3JH-H (Hz)
13C
(ppm)
1 11.50 –
12.00 br 170.52
11.50 –
12.00 br 170.58
11.50 –
12.00 br 172.76 ND ND
2 10.15 s -------- 10.09 s -------- 10.01 s -------- ND --------
3 -------- 167.31 -------- 165.73 -------- 170.11 -------- ND
3a 2.70 d (9.60)
47.15 2.70 d (9.30)
47.16 2.69 d (9.00)
49.65 ND ND
4 5.03 br 79.44 5.03 br 79.46 5.04 br 82.00 ND ND
5 6.49 (3.50,
2.50) 136.86
6.48 s
(1.35) 136.85 6.48 s 139.48 ND ND
6 6.47 (3.00,
2.00) 137.72
6.48 s
(1.35) 137.26 6.48 s 139.83 ND ND
7 5.24 br 80.69 5.12 br 80.70 5.12 br 83.27 ND ND
7a 2.82 d
(9.60) 47.76
2.82 d
(9.30) 47.75
2.80 d
(9.00) 50.26 ND ND
1’ -------- 143.50 -------- 143.79 -------- 142.24 -------- ND
2’ 7.63 d
(8.70) 118.66
7.65 d
(8.70) 118.71 8.21 s 122.61 ND ND
3’ 7.86 d (8.70)
130.61 7.88 d (8.70)
130.44 -------- 133.99 -------- ND
4’ -------- 125.09 -------- 124.24 7.70 d
(8.40) 126.76 ND ND
5’ 7.86 d
(8.70) 130.61
7.88 d
(8.70) 130.44
7.41 t
(8.10) 131.79 ND ND
6’ 7.63 d
(8.70) 118.66
7.65 d
(8.70) 118.70
7.60 d
(7.50) 126.14 ND ND
-COO 11.50 – 12.00 br
172.98 -------- 172.97 11.50 – 12.00 br
175.61 ND ND
-CH2- -------- -------- 4.27 q
(7.35) 60.78 -------- -------- ND ND
-CH3 -------- -------- 1.28 t
(7.35) 14.44 -------- -------- ND ND
s: señal simple, d: señal doble, dd: señal doble de dobles, ddd: señal doble de doble de dobles, t: señal triple, q: señal
cuádruple, m: señal múltiple, br: señal ancha. ND: No determinado por impurezas.
Con esta parte se concluye la síntesis de los aducto derivados del ácido maleico; por
tanto, la siguiente sección corresponde al análisis de los derivados del ácido fumárico.
La primera etapa de síntesis fue la síntesis de los dienófilos; es decir, los ácidos N-
fenilfumarámicos 16a-d a partir de las anilinas monosustituidas 3a-d y el cloruro de
76
fumarilo (15). La reacción se llevó a cabo en condiciones anhidras con un equivalente
de cada reactivo con posterior inactivación de los cloruros de ácidos excedentes (Figura
43).
NH2
R1
R2
a: R1 = COOH, R2 = H
b: R1 = COOEt, R2 = H
c: R1 = H, R2 = COOH
d: R1 = H, R2 = COOEtNH
R1
R2
O
1) THF, t.a., 16 h
2) H2O, t.a., 3 h
3a-d 16a-d
Cl
Cl
O
O
+ + 2 HCl (g)
15
OHO
Figura 43. Reacción general de síntesis de los ácidos N-fenilfumarámicos 16a-d.
Los compuestos obtenidos tuvieron puntos de fusión más altos que sus isómeros 5a-
d, con polaridad similar y de rendimientos que va de buenos a muy buenos (Tabla 23).
Tabla 23. Características físicas de los ácidos N-fenilfumarámicos 16a-d.
NH
O OH
O
1 2
3 4 1'2'
3'
4'
5'
6'
O
HO
16a
NH
O O
O
1 2
3 4 1'2'
3'
4'
5'
6' CH3
O
HO
16b
NH
O
1 2
3 4 1'2'
3'
4'
5'
6'
OH
O
O
HO
16c
NH
O
1 2
3 4 1'2'
3'
4'
5'
6'
O
O
CH3
HO
O
16d
Rendimiento
(%)
95.0 68.1 82.1 68.4
Punto de
fusión (°C)
280-285
(ennegrece)
228-231 298-300 225-228
Rf
(AcOEt/MeOH
1:1)
0.36 0.59 0.31 0.61
Los espectros de IR (Tabla 24) y RMN de 1H y
13C (Tabla 25) no difieren mucho de
sus isómeros. La diferencia sustancial de los aductos 16a-d se encuentra en el espectro
de 1H para los hidrógenos de las posiciones 2 y 3, es decir, los hidrógenos vinílicos que
77
presentan una constante de acoplamiento trans con respecto a la constante de
acoplamiento cis de los aductos 5a-d. Las constantes vecinales trans son más grandes
debido al ángulo diedro de 180°, que en este caso específico se encuentran alrededor de
3Jtrans = 15.00 Hz (Tabla 25), mientras que para sus isómeros que tienen un ángulo
diedro de 0° muestran una constante de 3Jcis = 12.00 Hz.
78
Tabla 24. Caracterización de los ácidos N-fenilfumarámicos 16a-d por espectrofotometría IR
obtenidas en pastilla de KBr.
NH
O OH
O
1 2
3 4 1'2'
3'
4'
5'
6'
O
HO
16a
NH
O O
O
1 2
3 4 1'2'
3'
4'
5'
6' CH3
O
HO
16b
NH
O
1 2
3 4 1'2'
3'
4'
5'
6'
OH
O
O
HO
16c
NH
O
1 2
3 4 1'2'
3'
4'
5'
6'
O
O
CH3
HO
O
16d
-NH 3300, 1180 3320, 1185 3280, 1170 3360, 1150
-OH 2960 No se observa 3000 3280
-CH2=CH2- No se observa 3020 3090 3100
-CH3 y
-CH2-
No se observa 2990 No se observa 2985
-C=O ,-
insaturado
1670 1680 1660 1700
OHO
1690 -------- 1700 --------
OO
-------- 1705 -------- 1720
HN-C=O 1598 1597 1595 1600
-CO-O -------- 1280 -------- 1298
O-C-C -------- 1240 -------- 1280
o-di
1520, 855,
770
1540, 880, 780 -------- --------
m-di
-------- ------- 1550, 980, 945,
798
1500, 815, 780
79
Tabla 25. Caracterización por RMN de 1H (500 MHz) y
13C (125 MHz) en DMSO-d6 de los ácidos
N-fenilfumarámicos 16a-d.
NH
O OH
O
1 2
3 4 1'2'
3'
4'
5'
6'
O
HO
16a
NH
O O
O
1 2
3 4 1'2'
3'
4'
5'
6' CH3
O
HO
16b
NH
O
1 2
3 4 1'2'
3'
4'
5'
6'
OH
O
O
HO
16c
NH
O
1 2
3 4 1'2'
3'
4'
5'
6'
O
O
CH3
HO
O
16d
Posición 1H (ppm)
3JH-H (Hz)
13C
(ppm)
1H (ppm)
3JH-H (Hz)
13C
(ppm)
1H (ppm)
3JH-H (Hz)
13C
(ppm)
1H (ppm)
3JH-H (Hz)
13C
(ppm)
1 12.50 – 13.00
br
167.52 12.50 – 13.00
br
166.90 12.50 – 13.00
br
166.95 12.50 –
13.00 br
166.95
2 6.67 d
(15.50)
132.07 6.67 d
(15.50)
132.13 6.67 d (15.00) 132.11 6.68 d
(15.75)
131.79
3 7.13 d
(15.50)
137.30 7.12 d
(15.00)
137.39 7.11 d (15.50) 137.50 7.18 d
(15.75)
137.48
4 -------- 162.77 -------- 162.83 -------- 162.57 -------- 162.58
1’ -------- 126.61 -------- 125.71 -------- 139.45 -------- 139.58
2’ 7.76 d (9.00) 119.57 7.77 d (9.00) 119.65 8.30 s 120.81 8.33 s 120.49
3’ 7.90 d (8.50) 131.21 7.91 d (8.50) 130.95 -------- 131.68 -------- 131.15
4’ -------- 143.18 -------- 143.45 7.66 d (8.50) 125.44 7.68 d (7.50) 125.28
5’ 7.90 d (8.50) 131.21 7.91 d (8.50) 130.95 7.45 t 129.88 7.48 t 130.05
6’ 7.76 d (9.00) 119.57 7.77 d (9.00) 119.65 7.86 d (8.50) 124.25 7.91 d (9.30) 124.48
-NH 10.77 br -------- 10.79 br -------- 10.67 br -------- 10.78 br -------
-COO 12.50 – 13.00
br
166.90 -------- 165.96 12.50 – 13.00
br
167.71 -------- 166.17
-CH2- -------- ------- 4.25 q 61.23 -------- -------- 4.30 q 61.57
-CH3 -------- -------- 1.27 t 14.82 -------- -------- 1.31 t 14.81
s: señal simple, d: señal doble, dd: señal doble de dobles, ddd: señal doble de doble de dobles, t: señal triple, q: señal
cuádruple, m: señal múltiple, br: señal ancha.
Esta característica estructural es de suma importancia en la generación de los aductos
Diels-Alder debido a que la estereoquímica de los productos generados dependerá en
gran medida de la configuración de los dienófilos; es decir, cuando un dienófilo tiene
configuración Z el cicloaducto tendrá a sus sustituyentes del mismo lado, mientras si la
configuración es E los aductos estarán de distinto lado obteniendo isómeros con
geometrías diferentes.
La reacción para formar los aductos derivados de isopreno se realizó en un tubo de
presión a 160 °C por 48 h (Figura 44).
80
a: R1 = COOH, R2 = H
b: R1 = COOEt, R2 = H
c: R1 = H, R2 = COOH
d: R1 = H, R2 = COOEtNH
R1
R2
O
Tolueno,
160 °C, 48 h
17a-d y 18a-d
+
2
OHO
H3C
16a-dNH
OH
R1
R2
O
O
NH
OH
R1
R2
O
O
+
H3C
H3C
Figura 44. Reacción general de síntesis de la mezcla de regioisómeros de los aductos Diels-Alder 17a-
d y 18a-d.
Los resultados obtenidos fueron muy interesantes; bajo las condiciones de reacción se
lograron obtener los aductos Diels-Alder. Sin embargo, dichas reacciones no fueron
regioselectivas obteniendo una proporción aproximada de la mezcla de 45:55. Como se
mencionó antes, la reacción procedió en el tubo de presión a una temperatura alta;
observándose que no hubo la formación de la imida (Figura 45) como sucedió con los
ácidos N-fenilmaleámicos 5a-d que formaron los respectivos aductos 4a-d; por lo tanto,
en los compuestos derivados del ácido maleico en los que los sustituyentes se
encuentran con estereoquímica cis, se favorece a esa temperatura la formación del anillo
de 5 miembros, mientras que con los compuestos derivados del ácido fumárico al
encontrarse los mismos sustituyentes con geometría trans la reacción de ciclización
intramolecular no fue favorecida.
81
-COOH
-NH
H3’
H5’
H2’
H6’
H6
H5
-CH2-
-CH3
-CH3
H7a
H3a
H4
H7
H3C
NH
OH
O
O
O
O
1
23
3a4
5
6
77a
1'2'
3'
4'
5'
6' CH3
Figura 45. Espectro de RMN 1H para las mezcla de regioisómeros de los aductos 17b y 18b.
Se analizaron los espectros de RMN de los aductos; en particular, a manera de
ejemplo, se discutirá la mezcla de regioisómeros 17b y 18b. A campos altos es posible
observar una señal ancha aproximadamente en 10.30 ppm que corresponden a los 2
hidrógenos de la amida de los dos regioisómeros; sin embargo, no se observan dos
señales; pero en el caso de los hidrógenos aromáticos que describen un acoplamiento
AA’-BB’ se pueden observar las dos señales dobles de cada regioisómero con una 3Jo =
8.70 Hz (Tabla 26). En 5.41 ppm es una señal ancha que corresponde a los hidrógenos
de las posiciones 5 ó 6 del regioisómero correspondiente; a campos más altos entre 2.0
y 3.0 ppm se pueden apreciar varias señales múltiples que corresponden con los
hidrógenos del anillo de ciclohexeno, exceptuando los vinílicos.
Es interesante hacer notar que los hidrógenos de las posiciones 3a y 7a que son
átomos que están más desprotegidos que los de las posiciones 4 y 7, no describen una
multiplicidad clara, sino que son señales anchas, a diferencia de los que se muestra en la
Figura 38 (espectro de 1H de la mezcla de regioisómeros 6b y 7b) que muestran para las
mismas posiciones un par de señales mejor definidas y diferenciadas; lo mismo sucede
para los hidrógenos de las posiciones 4 y 7. Esta diferencia en el espectro de 1H
evidencia la diferencia en la geometría entre los aductos derivados de ácido maleico
82
(aductos cis 6a-d y 7a-d) y los derivados del ácido fumárico (aductos trans 17a-d y
18a-d) cuyos hidrógenos están del mismo y diferente lado respectivamente, lo que le
confiere distinta geometría al anillo de ciclohexeno y por tanto, los acoplamientos
vecinales son diferentes.
83
Tabla 26. Caracterización por RMN de 1H (300 MHz) y
13C (75 MHz) en DMSO-d6 de la mezcla de
regioisómeros de los aductos Diels-Alder 17a-d y 18a-d derivados de isopreno.
H3C
NH
OH
O
O
OH
O
1
23
3a4
5
67a
1'2'
3'
4'
5'
6'
17a y 18a
H3C
NH
OH
O
O
O
O
1
23
3a4
5
6
77a
1'2'
3'
4'
5'
6' CH3
17b y 18b
H3C
NH
OH
O
O
OH
O1
23
3a4
6
5
77a
1'2'
3'
4'
5'
6'
17c y 18c
H3C
NH
OH
O
O
O
O1
23
3a4
6
5
77a
1'2'
3'
4'
5'
6'
CH3
17d y 18d
Posición 1
H (ppm) 3JH-H (Hz)
13C
(ppm)
1H (ppm)
3JH-H (Hz)
13C
(ppm)
1H (ppm)
3JH-H (Hz)
13C
(ppm)
1H (ppm)
3JH-H (Hz)
13C
(ppm)
1 12.20 – 12.40 br
174.73, 174.58
12.20 – 12.40 br
179.54, 179.38
ND ND 12.20 – 12.40 br
174.50, 174.34
2 10.34 (2H,
br) --------
10.37 (2H,
br) -------- ND ND
10.30 (2H,
br) --------
3 -------- 167.64 -------- 170.76 -------- ND -------- 166.24,
165.72
3a 2.66 (2H,
m)
42.08,
41.55
2.62-2.72
(2H, m) 46.81 ND ND
2.94-3.03
(2H, m) Traslapada
4 y 7 1.96-2.52
(8H, m)
33.98, 33.29,
29.48, 28.81
1.98-2.35
(8H, m)
38.01,
34.21 ND ND
2.27-2.32
(8H, m) 29.96, 25.05
5 ó 6 5.41 (2H,
br)
132.93,
132.83,
119.88
5.41 (2H, br)
137.59, 124.61
ND ND
5.49 (1H,
br); 5.48
(1H, br)
133.66, 133.01
7a 2.82 (2H,
m) 44.01, 43.49
2.72-2.82 (2H, m)
48.23 ND ND 3.04-3.12 (2H, m)
43.38, 42.91
-CH3 1.65 (6H,
br) 23.47
1.66 (6H,
br) 28.22 ND ND 1.73 (6H, br) 24.12
1’ -------- 144.02 -------- 149.08 -------- ND -------- 140.25
2’ 7.70 (2H, d,
8.85)
119.50,
118.87
7.73 (2H, d, 8.70); 7.72
(2H, d,
8.70)
123.72 ND ND 8.28 (1H, s);
8.27 (1H,s) 120.04
3’ 7.88 (2H, d,
8.85) 131.06
7.90 (2H, d, 8.70); 7.89
(2H, d, 8.70)
135.65 -------- ND -------- 130.95,
130.02
4’ -------- 125.55 -------- 129.36 ND ND
7.66 (1H, d,
7.80); 7.61
(1H, d, 8.10)
124.00
5’ 7.88 (2H, d,
8.85) 131.06
7.90 (2H, d,
8.70); 7.89
(2H, d, 8.70)
135.65 ND ND 7.43 (1H, t);
7.39 (1H, t) 124.29
6’ 7.70 (2H, d,
8.85)
119.50,
118.87
7.67 (2H, d,
8.70); 7.66
(2H, d, 9.00)
123.72 ND ND 7.98 (1H, d, 7.50); 7.97
(1H, d, 7.50)
121.44
-COO 12.20 –
12.40 br
176.83,
176.70
12.20 –
12.40 br 181.44 -------- ND --------
176.57,
176.54
-CH2- -------- -------- 4.27 (4H,
q) 65.84 -------- --------
4.33 (2H, q);
4.30 (2H, q) 61.74, 61.41
-CH3 -------- -------- 1.30 (6H, t) 19.63 -------- -------- 1.32 (3H, t); 1.28 (3H, t)
14.83
s: señal simple, d: señal doble, dd: señal doble de dobles, ddd: señal doble de doble de dobles, t: señal triple, q: señal
cuádruple, m: señal múltiple, br: señal ancha.
84
6.2 DOCKING
La primera parte de este trabajo fue realizar estudios de acoplamiento molecular
(Docking) sobre la enzima aminotransferasa del GABA (GABA-AT) de Pseudomonas
fluorescens debido a que los ensayos de cinética enzimática se realizaron sobre esta
enzima.
Es importante señalar que las estructuras tridimensionales reportadas por difracción de
rayos X son únicamente las de Escherichia coli y de cerdo (Sus scrofa). Debido a esta
situación, de inicio no fueron escogidas estas estructuras para realizar los estudios de
Docking dado que los datos experimentales son en la GABA-AT de Pseudomonas
fluorescens, por lo que se efectuó un modelado comparativo usando como secuencia
molde las reportadas. Para iniciar el estudio comparativo se obtuvieron las secuencias
de aminoácidos de la enzima de diferentes especies con distancia filogenética
considerable con el fin de analizar las diferencias y sobre todo las similitudes en el sitio
activo de la proteína. Las especies utilizadas fueron: Homo sapiens (humano), Sus
scrofa (cerdo), Mus musculus (ratón), Escherichia coli (bacteria) y Pseudomonas
fluorescens (bacteria). Las secuencias de aminoácidos fueron descargadas del servidor
Swiss prot44
en formato FASTA.
Una vez obtenidas las secuencias de aminoácidos de las cuatro especies, la secuencia
de Pseudomonas fluorescens fue alineada contra las secuencias de las otras tres especies
utilizando el servidor EMBL-EBI.45
Los resultados de este alineamiento se realizaron en función de la homología sobre
toda la proteína, se compararon las secuencias alineadas de las diferentes especies
contra la de Pseudomonas fluorescens. Se buscaron los aminoácidos que conforman el
sitio activo para determinar si las proteínas lo tienen conservado. Los aminoácidos que
conforman el sitio activo son los siguientes: Ile51, Gln80, Ser113, Tyr139, Arg142,
Tyr156, Gly211, Asp240, Val242, Gln243, Lys269, Ser270, Gly296, Thr298, Leu389 y
Arg399.16
A continuación se presentan los resultados de alineamiento de la secuencia de
Pseudomonas fluorescens contra las otras especies (Figuras 46, 47, 48 y 49).
85
Figura 46. Alineamiento de GABA-AT de Pseudomonas fluorescens vs Homo sapiens. *: aminoácidos
idénticos, : : aminoácidos diferentes pero que puede sustituirse, . : aminoácidos con cierta homología,
Amarillo: aminoácidos idénticos del sitio activo para las dos secuencias. Verde: aminoácidos diferentes
que no son homólogos en el sitio activo.
86
Figura 47. Alineamiento de GABA-AT de Pseudomonas fluorescens vs Sus scrofa. *: aminoácidos
idénticos, : : aminoácidos diferentes pero que puede sustituirse, . : aminoácidos con cierta homología,
Amarillo: aminoácidos idénticos del sitio activo para las dos secuencias. Verde: aminoácidos diferentes
que no son homólogos en el sitio activo.
87
Figura 48. Alineamiento de GABA-AT de Pseudomonas fluorescens vs Mus musculus. *: aminoácidos
idénticos, : : aminoácidos diferentes pero que puede sustituirse, . : aminoácidos con cierta homología,
Amarillo: aminoácidos idénticos del sitio activo para las dos secuencias. Verde: aminoácidos diferentes
que no son homólogos en el sitio activo.
88
Figura 49. Alineamiento de GABA-AT de Pseudomonas fluorescens vs Escherichia coli. *: aminoácidos
idénticos, : : aminoácidos diferentes pero que puede sustituirse, . : aminoácidos con cierta homología,
Amarillo: aminoácidos idénticos del sitio activo para las dos secuencias. Verde: aminoácidos diferentes
que no son homólogos en el sitio activo.
El resultado del alineamiento fue muy interesante y al mismo tiempo esperado; la
homología de la GABA-AT de Pseudomonas fluorescens fue del 73 % con la de
Escherichia coli debido a que ambas enzimas provienen de bacterias, es decir la
distancia filogenética no es demasiada, por lo tanto, las menores homologías de la
primera con Homo sapiens, Sus scrofa y mus musculus fueron de 23, 23 y 24 %,
respectivamente (Tabla 27), ya que la diferencia en la escala filogenética es mayor.
89
Tabla 27. Análisis de homología de la enzima GABA-AT de P. fluorescens comparada con las
especies E. coli, M. musculus, S. scrofa y H. sapiens. Comparación de los aminoácidos del sitio
activo que cambian en cada uno con respecto a P. fluorescens.
Especie
Homología de P.
fluorescens vs. Especie
(%)
Aminoácidos
diferentes en el sitio
activo
Escherichia coli 73 Ninguna
Mus musculus 24 Gln80 por Gly80,
Gly296 por Phe 296
Sus scrofa 23 Gln80 por Gly80,
Gly296 por Phe 296
Homo sapiens 23 Gln80 por Gly80,
Gly296 por Phe 296
Sin embargo, es interesante el análisis de los aminoácidos que conforman el sitio
activo, con E. coli el sitio activo es idéntico, y únicamente dos aminoácidos marcan la
diferencia con las especies (ratón, cerdo y humano), cuyos cambios consisten en la
sustitución de la glutamina-80 (Gln80) por una glicina (Gly80) y la glicina-296
(Gly296) por una fenilalanina (Phe296).
Con estos resultados podemos decir que el sitio activo está altamente conservado en la
escala filogenética (Tabla 27) y, por lo tanto, es posible realizar el modelado
comparativo para obtener la proteína de interés en forma tridimensional de la GABA-
AT de P. fluorescens tomando como secuencia molde la de E. coli debido a su alta
homología, y sobre todo porque el sitio activo está conservado tanto en dicha bacteria
como en los humanos.
La GABA-AT de Escherichia coli es un tetrámero con cuatro monómeros idénticos16
(Figura 50), de tal manera que únicamente el modelado fue realizado para un solo
monómero. Una vez escogido la secuencia molde (E. coli), la GABA-AT de
Pseudomonas fluorescens fue modelada en dos servidores diferentes: 1) El monómero
1SFFC16
de E. coli en Swiss model46
y el monómero 1SF2A16
de E. coli en I-Tasser.47
90
Figura 50. Estructura tetramérica tridimensional determinada por difracción de rayos X de la GABA-AT
de Escherichia coli
Una vez obtenidos los resultados de ambos servidores, cada uno de los modelos
generados fue evaluado con el propósito de elegir aquel modelo de mejor calidad
estructural con respecto a la estructura en DRX de la GABA-AT de E. coli. La
evaluación de cada modelo consistió en un análisis de la calidad de la estructura
terciaria de la GABA-AT con el gráfico de Ramachandran que evalúa los residuos de
aminoácidos que adoptan la conformación de la secuencia molde (Figuras 51 y 52).
Figura 51. Gráfico de Ramachandran. Figura 52. Ángulos de torsión y del enlace peptídico
91
La interpretación del gráfico de Ramachandran consiste en observar en qué región del
gráfico se encuentran los ángulos diedros de los residuos de aminoácidos del modelo,
entre más concentrados estén en las áreas más oscuras, su energía es más optima para la
estructura secundaria proveniente de los ángulos y En el mismo sentido, aquellos
aminoácidos que estén fuera de las áreas oscuras repercute en detrimento de la calidad
del modelo puesto que los ángulos formados son de alta energía. El criterio anterior no
es aplicable para los aminoácidos glicina (Gly) y prolina (Pro).
A continuación se muestra los gráficos de Ramachandran de la secuencia molde de
1sffC de E. coli (Figura 53A) y el modelo de P. fluorescens (Figura 53B) calculados en
el servidor Swiss Model; y el molde 1sf2A de E. coli (Figura 54A) y el modelo de P.
fluorescens (Figura 54 B) calculados en el servidor I-Tasser.
A B
Figura 53. A: Secuencia molde 1sffC de E. coli. B: Modelo de P. fluorescens. Determinados en Swiss
Model.
C D
Figura 54. A: Secuencia molde 1sf2A de E. coli. B: Modelo de P. fluorescens. Determinados en I-Tasser.
El análisis de los gráficos de Ramachandran sugieren que el modelo generado en I-
Tasser es el de mejor calidad ya que solo 4.0 % de los aminoácidos se encuentran en las
áreas no permitidas de conformación, a comparación del modelo generado en Swiss
Model que presentó un 9.35 % de aminoácidos fuera de las áreas permitidas (Tabla 28).
92
Los moldes presentan un porcentaje de aminoácidos fuera de área alrededor del 10.11
%.
Tabla 28. Criterio de selección del modelo.
Porcentaje de aminoácidos
fuera de área Swiss-Model I-Tasser
Molde 10.11 10.82
Modelo 9.35 4.00
En la determinación del porcentaje fueron excluidos la Gly y Pro que se encontraron fuera de área.
En las figura 55A y 55B se muestran las estructuras de los modelos y de su secuencia
molde sobrepuestas, y a simple vista se notan muy similares entre sí.
Figura 55. A: (gris) molde 1sffC de E. coli; (rojo): modelo de P. fluorescens generado por Swiss-
Model. B: (gris) molde 1sf2A de E. coli; (azul) modelo de P. fluorescens generado por I-Tasser.
Escogido el modelo de I-Tasser, era de esperarse que no tuviera a la coenzima PLP
que es esencial en la actividad catalítica de la enzima dado que estos servidores solo
modelan los residuos de aminoácidos. Como se mencionó anteriormente este PLP está
unido covalentemente formando una base de Schiff a la Lys269; por tal motivo, las
coordenadas del PLP se tomaron de la proteína que se usó como molde y se insertaron
en el modelo obtenido por I-Tasser. Sin embargo, la distancia entre el nitrógeno del
grupo –NH2 de la Lys269 y el carbono carbonilo del aldehído del PLP no era la óptima,
por tal motivo la geometría de este nuevo archivo con la GABA-AT-PLP fue
minimizada por mecánica molecular usando los campos de fuerza CHARMM
implementados en el programa NAMD a 1500, 2000 y 4000 pasos. Después de cada
optimización fue analizada la distancia entre los átomos involucrados (Tabla 29).
93
Tabla 29. Optimización por mecánica molecular de la GABA-AT modelada con PLP como
coenzima.
Pasos de optimización Distancia (NLys269-CPLP) (nm)
Normal 0.392
1500 0.315
2000 0.298
4000 0.286
Cuando fue insertado el PLP la distancia entre los átomos en estudio fue de 0.392 nm
que es una distancia alejada y no óptima; la distancia escogida fue de 0.315 nm (Figura
56) debido a que las optimizaciones a 2000 y 4000 pasos generaron traslapes del PLP
con aminoácidos de la periferia.
Figura 56. Enzima GABA-AT modelada y optimizada a 1500 con la coenzima PLP.
El complejo molde enzima-coenzima fue utilizada para realizar la interacción con
cada uno de los aductos Diels-Alder propuestos (ligandos), que fueron construidos y
optimizados tomando en cuenta su estereoquímica. El análisis de los resultados de
interacción asistida por computadora consistió en obtener las energías libres (kcal/mol)
de unión ligando-enzima que se convirtieron las respectivas constantes de afinidad en el
sitio activo de la enzima.
94
En la información que se presenta a continuación (Tabla 30, Figura 57) se muestran
las constantes de disociación derivadas del ensayo de Docking para los derivados de
isopreno.
Tabla 30. Constantes de disociación (KD) y radio (KD1/KD2) de cada uno de los aductos Diels-Alder
derivados de los ácidos maleico y fumárico con isopreno.
Configuración Estereoquímica Sustitución KD (M) R =KD1/KD2
RS Amec-Acax
6a
p-COOH
843.87 5.62
SR 150.02
RS Amec-Acax
6b
p-COOEt
505.77 0.76
SR 662.82
RS Amec-Acax
6c
m-COOH
37.52 0.14
SR 263.30
RS Amec-Acax
6d
m-COOEt
86.07 0.74
SR 116.20
RS Amec-Acax
7a
p-COOH
77.37 1.51
SR 51.19
RS Amec-Acax
7b
p-COOEt
291.62 2.11
SR 138.07
RS Amec-Acax
7c
m-COOH
50.20 0.13
SR 392.02
RS Amec-Acax
7d
m-COOEt
38.03 1.58
SR 24.02
RR Amec-Acec
17a
p-COOH 123.03 10.40
SS 11.82
RR Amec-Acec
17b
p-COOEt 56.12 0.58
SS 96.00
RR Amec-Acec
17c
m-COOH 41.00 0.97
SS 42.07
RR Amec-Acec
17d
m-COOEt 40.83 0.49
SS 82.91
RR Amec-Acec
18a
p-COOH 12.99 0.16
SS 78.38
RR Amec-Acec
18b
p-COOEt 136.49 9.56
SS 14.28
RR Amec-Acec
18c
m-COOH 37.05 0.26
SS 142.63
RR Amec-Acec
18d
m-COOEt 72.86 1.35
SS 53.98
RS, SR, RR y SS: Configuraciones de cada molécula. Amec-Acax: amida--ecuatorial con ácido--axial
para cada regioisómero. Amendo-Acexo: amida-endo con ácido-exo. R = es la relación entre constantes de
disociación entre el enantiómeros con ―menor‖ afinidad sobre la enzima con respecto a de mayor; cuanto
mayor sea el valor de R, es tanta veces es más afín un enantiómero sobre el otro.
95
Tanto en la Tabla como en la gráfica se puede ver que no hay una correlación muy
marcada entre la afinidad entre pares enantioméricos; es decir, que en realidad la
afinidad no está sesgada hacia un enantiómero; sin embargo, en la gráfica se puede
apreciar bastante bien que los aductos Diels-Alder derivados del ácido fumárico (RR y
SS) tienen más afinidad sobre la GABA-AT en el sitio activo que los derivados del
ácido maleico (RS y SR).
0.0
100.0
200.0
300.0
400.0
500.0
600.0
700.0
800.0
900.0
RS SR RS SR RS SR RS SR RS SR RS SR RS SR RS SR RR SS RR SS RR SS RR SS RR SS RR SS RR SS RR SS
Pares enantioméricos
KD (
M)
H3C
NH
OH
O
O
R1
R2
NH
OH
O
O
R1
R2
H3C
H3C
NH
OH
O
O
R1
R2
NH
OH
O
O
R1
R2
H3C
6a-d
7a-d
17a-d 18a-d
Figura 57. Comparación de las constantes de disociación (KD) de cada uno de los enantiómeros de los
aductos Diels-Alder derivado de isopreno. 6a-d y 7a-d: corresponden a la mezcla de regioisómeros
derivados de ácido maleico obtenidos experimentalmente. 17a-d y 18a-d: corresponden a la mezcla de
regioisómeros derivados del ácido fumárico obtenidos experimentalmente.
Tomando como ejemplo la comparación de los pares enantioméricos RS y SR del
compuesto 6b (regioisómeros con –CH3 del lado del grupo amida) se puede apreciar
que el enantiómero RS es un poco más afín que el SR puesto que el primero establece
interacciones intermoleculares de tipo van der Waals entre el anillo de ciclohexeno del
aducto con la ILE51 y la otra corresponde a una de tipo ión-dipolo entre el carboxilato
sustituyente del ciclohexeno con el hidrógeno de la ARG142 (ión-dipolo); en contraste
con la del enantiómero SR donde únicamente se establece una interacción de tipo
puente de hidrógeno entre el hidrógeno de la ARG142 con el oxígeno al carbonilo del
grupo éster del anillo; además es importante hacer hincapié en la forma en que la
molécula está acomodada en el sitio activo; en el isómero RS la interacción con la
96
ILE51 y la ARG142 es del lado del anillo de ciclohexeno y en le isómero SR la
interacción es del lado del anillo aromático (Figuras 58A y 58B).
Por otro lado la comparación de los pares enantioméricos de los productos 7b
(regioisómeros con –CH3 del lado del ácido carboxílico) la afinidad de ambos mejora
por lo menos casi al doble que los regioisómeros 6b. En cuanto a la interacciones que se
establecen entre el aducto con los aminoácidos del sitio activo, el isómero RS forma dos
puentes de hidrógeno, el primero de ellos es entre el hidrógeno del grupo –OH de la
TYR156 con el carbono carbonilo del grupo amida del aducto, y el segundo entre un
hidrógeno del grupo –NH2 de la ARG142 con el carbono carbonilo del grupo éster del
anillo aromático del aducto; mientras que con el isómero SR es posible apreciar un
puente de hidrógeno entre el hidrógeno del –NH2 de la ARG142, pero en este caso se
establece con el oxígeno al carbonilo del grupo amida. Es importante comentar que la
constante de disociación es dos veces mejor en el compuesto SR que en RS, aunque en
realidad no es una diferencia tan importante.
A B
C D
Figura 58. A: p-COOEt-RS-Amec-Acax-IP (KD = 505.77 M); B: p-COOEt-SR-Amec-Acax-IP (KD =
662.82 M); C: p-COOEt-RS-Amec-Acax-IP (KD = 291.62 M); D: p-COOEt-SR-Amec-Acax-IP (KD
= 138.07 M).
97
A B
C D
Figura 59. A: p-COOEt-RR-Amec-Acec-IP (KD = 56.12 M); B: p-COOEt-SS-Amec-Acec-IP (KD =
96.00 M); C: p-COOEt-RR-Amec-Acec-IP (KD = 136.49 M); D: p-COOEt-SS-Amec-Acec-IP (KD
= 14.28 M).
Las interacciones mostradas por los siguientes dos pares de regioisómeros derivados
esta vez del ácido fumárico es la siguiente: en las Figuras 59A y 59B (regioisómeros
con el grupo –CH3 del lado de la amida) se muestran el par de enantiómeros RR y SS
respectivamente, el primero de ellos interacciona con cuatro aminoácidos del sitio
activo, lo que le confiere una afinidad buena con la enzima (56.12 M), es posible
apreciar el puente de hidrógeno entre el oxígeno del grupo –OH de la TYR156 con el
hidrógeno del grupo –NH de la amida del aducto; otra unión importante la constituye
una interacción de tipo ión-dipolo establecida entre el hidrógeno del grupo –NH2 de la
ARG142 con el carboxilato del anillo de ciclohexeno que estabiliza mejor a la molécula
en el sitio activo; de igual manera se pueden observar otras interacciones débiles con el
ciclohexeno que contribuyen a la afinidad como aquellas formadas entre el –CH3 de la
ILE51 y la interacción tipo entre el anillo aromático de la TYR139 con el doble
enlace del anillo. En contraste con su enantiómero SS la molécula forma interacciones
98
similares; sin embargo, el ligando se acomoda en el sitio activo de distinta manera la
cual le confiere una afinidad un poco menor (96.00 M) a su isómero aunque su
diferencia no es tan importante; por ejemplo la interacción ión-dipolo entre la ARG142
y el carboxilato del anillo se perdió debido a que se encuentra del lado opuesto con
respecto al isómero RR, y dicha interacción fue sustituida por un puente de hidrógeno
entre este aminoácido (ARG142) con el grupo –NH de la amida. Esta vez la TYR156
interacciona vía puente de hidrógeno con el carbono carbonilo del grupo éster. Es
importante mencionar que pudiese formarse bastante bien una interacción tipo
(―sándwich‖) entre los anillos aromáticos del la TYR139 y el aducto, aunque en la
imagen están en posición perpendicular, el ligando podría rotar el enlace entre la amida
y el carbono ipso del anillo.
En relación al siguiente par enantiomérico (regioisómeros con el grupo –CH3 del
ciclohexeno del lado del carboxilato) también muestra buena afinidad en el sitio activo
(Figuras 59C y 59B), de hecho mejor que su isómeros derivados del ácido maleico, y
esto es debido a la formación de interacciones importantes como la de tipo puente de
hidrógeno entre la TYR156 y el oxígeno al carbonilo del éster; otra interacción
corresponde a la formada entre la ILE51 y el anillo aromático. Cabe mencionar que
existe una interacción bastante energética correspondiente a una de tipo ión-dipolo entre
el carboxilato del ciclohexeno y la LYS269 que le confiere buena afinidad del ligando
hacia la enzima; sin embargo, hay que ser cuidadosos con esta interacción porque a
pesar de ser un aminoácido clave en la actividad enzimática, de manera natural se
encuentra como base de Schiff con el PLP lo que cambiaría su polaridad y la geometría
de esa porción en el sitio.
Por otro lado, el isómero SS mejora su afinidad con respecto al anterior debido a la
interacción ión-dipolo entre la ARG142 y el carboxilato; a la interacción entre la ILE51
y el ciclohexeno; y aquella formada entre el doble enlace del mismo anillo con la
TYR139. De igual manera, cabe mencionar que la LYS269 está interaccionando con un
puente de hidrógeno con el grupo éster del aducto.
Del mismo modo fueron analizados los aductos derivados de ciclopentadieno (Figura
60, Tabla 31) donde es posible apreciar de manera general un patrón de afinidad similar,
es decir, para el caso de los derivados del ácido maleico los enantiómeros RS tienden a
tener una mayor afinidad hacia el sitio activo de la enzima en comparación con su par
99
enantiomérico; lo mismo sucede en el caso de los derivados del ácido fumárico donde
los enantiómeros RR tienen más afinidad que los SS.
0.0
50.0
100.0
150.0
200.0
250.0
300.0
350.0
400.0
450.0
RS SR RS SR RS SR RS SR RS SR RS SR RS SR RS SR RR SS RR SS RR SS RR SS RR SS RR SS RR SS RR SS
Pares enantioméricos
KD (
M)
NH
OH
R1
R2
O
O
NH
OH
R1
R2
O
O
NH
OH
R1
R2
O
O
NH
OH
R1
R2
O
O11a-d
Figura 60. Comparación de las constantes de disociación (KD) de cada uno de los enantiómeros de los
aductos Diels-Alder derivado de ciclopentadieno. 11a-d: corresponden a los compuestos sintetizados.
De manera particular el análisis sobre los aductos Diels-Alder con sustitución con
éster etílico en posición para, es importante señalar que tanto para los derivados exo y
endo (Figura 60) que la afinidad se conserva en la tendencia general, es decir, los
isómeros RS tienen más afinidad sobre los SR.
Entre los productos exo (Figura 61A, 61B) se puede apreciar que la afinidad del
isómero RS es mayor que la del SR aproximadamente 6.50 veces, y esto es debido a que
el isómero RS interacciona en el sitio activo con aminoácidos propios de él, por ejemplo
el carbono carbonilo del grupo éster forma un puente de hidrógeno con el grupo –OH de
la TYR156, además de establecer una interacción de de tipo del anillo aromático
del aducto con el anillo de la TYR139; en contraste con su isómero SR las interacciones
se modifican siendo la interacción principal con la ARG142 al establecer un puente de
hidrógeno entre el carbono carbonilo del éster del aducto con el hidrógeno del grupo
amina del aminoácido el aducto. Es importante señalar que por ser el enantiómero la
disposición espacial de la parte aromática del aducto SR está del otro lado con respecto
100
al RS lo que provoca la pérdida de la interacción con la TYR139; por tal motivo la
afinidad se pierde de manera importante.
Tabla 31. Constantes de disociación (KD) y radio (KD1/KD2) de cada uno de los aductos Diels-Alder
derivados de los ácidos maleico y fumárico con ciclopentadieno.
Configuración Estereoquímica Sustitución KD (M) R =KD1/KD2
RS exo p-COOH 34.40 1.07
SR 36.68
RS exo p-COOEt 37.05 6.47
SR 239.73
RS exo m-COOH 22.90 7.35
SR 168.44
RS exo m-COOEt 11.13 7.04
SR 78.44
RS endo p-COOH
11a
12.75 5.36
SR 68.41
RS endo p-COOEt
11b
137.35 3.08
SR 424.08
RS endo m-COOH
11c
153.64 1.75
SR 270.34
RS endo m-COOEt
11d
36.68 1.22
SR 44.79
RR Amexo-Acendo p-COOH 43.47 3.11
SS 135.11
RR Amexo-Acendo p-COOEt 84.79 1.62
SS 137.61
RR Amexo-Acendo m-COOH 37.70 1.61
SS 60.64
RR Amexo-Acendo m-COOEt 19.01 0.79
SS 15.11
RR Amendo-Acexo p-COOH 19.83 0.92
SS 18.35
RR Amendo-Acexo p-COOEt 144.22 1.04
SS 150.88
RR Amendo-Acexo m-COOH 45.92 1.56
SS 71.56
RR Amendo-Acexo m-COOEt 337.95 0.11
SS 34.41
RS, SR, RR y SS: Configuraciones de cada molécula. Amexo-Acendo: amida-exo con ácido-endo. Amendo-
Acexo: amida-endo con ácido-exo. R = es la relación entre constantes de disociación entre el enantiómeros
con ―menor‖ afinidad sobre la enzima con respecto a de mayor; cuanto mayor sea el valor de R, es tanta
veces más afín un enantiómero sobre el otro.
En relación a los isómeros endo (Figuras 61C y 61D) se puede apreciar entre
enantiómeros que la afinidad del RS es aproximadamente 3 veces mayor que el SR como
101
sucedió con los productos exo. El producto RS muestra una interacción importante con
la ARG142 al establecer un puente de hidrógeno con el oxígeno del éster del aducto con
el hidrógeno del grupo –NH2 de la ARG142, en contraste con el producto SR donde
dicho puente se pierde por la disposición espacial del aducto solo interaccionando
primordialmente con la ILE51 con la parte alifática del grupo etilo del éster; de tal
manera que la afinidad se pierde. Es importante señalar que entre los productos exo y
endo los primeros muestran mejor afinidad que los segundos; entre los compuestos RS,
la diferencia sustancial está en la posición de los sustituyentes del biciclo; es decir, la
estereoquímica exo favorece la interacción con la TYR139, mientras que con la
endo se pierde dicha interacción, por ello se pierde la afinidad. En relación a los
productos SR la interacción se pierde y solo interaccionan de manera importante
para el producto exo con la ARG142 y para el endo con la ILE51.
A B
C D
Figura 61. A: p-COOEt-RS-exo-CP (KD = 37.05 M); B: p-COOEt-SR-exo-CP (KD = 239.73 M); C: p-
COOEt-RS-endo-CP (KD = 137.35 M); D: p-COOEt-SR-endo-CP (KD = 424.08 M).
102
Con respecto a los aductos derivados del ácido fumárico donde los sustituyentes del
biciclo están de distinto lado, se encontró una relación estructural importante, y esta se
refiere a la interacción con la TYR139 con el isómero RR cuando el grupo amida
está en estereoquímica exo y el grupo –COOH en estereoquímica endo se establece
dicha interacción (Figura 62A); mientras que las demás combinaciones está interacción
no está presente (Figuras 62B, 62C y 62D); es decir, la estereoquímica exo favorece esta
interacción cuando la configuración es R en ese sustituyente. Además, el compuesto RR
es el más afín de los cuatro.
A B
C D
Figura 62. A: p-COOEt-RR-Amexo-Acendo-CP (KD = 84.79 M); B: p-COOEt-SS-Amexo-Acendo-CP (KD =
137.71 M); C: p-COOEt-RR-Amendo-Acexo-CP (KD = 144.22 M); D: p-COOEt-SS-Amendo-Acexo-CP (KD
= 150.88 M).
En relación a los aductos Diels-Alder derivados de furano evaluados por Docking es
importante mencionar que aparentemente no existe una relación entre la afinidad y los
pares enantiómericos, es decir, no hay mucha diferencia entre la afinidad de uno sobre
otro, salvo algunas excepciones (Tabla 32, Figura 63).
103
En este caso se comenta únicamente a los aductos derivados del ácido maleico con
sustitución con éster etílico en posición para.
Tabla 32. Constantes de disociación (KD) y radio (KD1/KD1) de cada uno de los aductos Diels-Alder
derivados de los ácidos maleico y fumárico con furano.
Configuración Estereoquímica Sustitución KD (M) R =KD1/KD2
RS exo p-COOH
14a
57.51 0.82
SR 69.58
RS exo p-COOEt
14b
8.42 0.03
SR 254.97
RS exo m-COOH
14c
208.03 1.15
SR 180.68
RS exo m-COOEt
14d
310.96 3.41
SR 91.03
RS endo p-COOH
9.37 0.55
SR 17.04
RS endo p-COOEt
22.37 1.22
SR 18.34
RS endo m-COOH
157.55 0.63
SR 250.04
RS endo m-COOEt
74.05 0.60
SR 122.91
RR Amexo-Acendo p-COOH 69.98 0.41
SS 170.22
RR Amexo-Acendo p-COOEt 230.31 0.51
SS 451.09
RR Amexo-Acendo m-COOH 495.92 1.44
SS 343.05
RR Amexo-Acendo m-COOEt 110.81 1.09
SS 101.75
RR Amendo-Acexo p-COOH 97.27 0.48
SS 200.59
RR Amendo-Acexo p-COOEt 185.89 0.92
SS 201.71
RR Amendo-Acexo m-COOH 295.30 1.20
SS 244.74
RR Amendo-Acexo m-COOEt 49.38 4.19
SS 11.78
RS, SR, RR y SS: Configuraciones de cada molécula. Amexo-Acendo: amida-exo con ácido-endo. Amendo-
Acexo: amida-endo con ácido-exo. R = es la relación entre constantes de disociación entre el enantiómeros
con ―menor‖ afinidad sobre la enzima con respecto a de mayor; cuanto mayor sea el valor de R, es tanta
veces más afin un enantiómero sobre el otro.
104
Figura 63. Comparación de las constantes de disociación (KD) de cada uno de los enantiómeros de los
aductos Diels-Alder derivado de furano. 14a-d: corresponden a los compuestos sintetizados.
A B
C D
Figura 64. A: p-COOEt-RS-exo-Fur (KD = 8.42 M); B: p-COOEt-SR-exo-Fur (KD = 254.97 M); C: p-
COOEt-RS-endo-CP (KD = 18.34 M); D: p-COOEt-SR-endo-CP (KD = 22.37 M).
105
Con respecto a los enantiómeros RS y SR correspondientes a los compuestos exo hay
una diferencia importante entre la afinidad entre ellos, el primero (RS) es casi 300 veces
más afín que el SR, y esto es debido a las interacciones intermoleculares que se forman
en el sitio activo de la GABA-AT. El isómero RS muestra un puente de hidrógeno entre
el carbono carbonilo de la amida con la ARG142 además de mostrar otra interacción
con el mismo aminoácido con el carboxilato del biciclo; una interacción tipo entre
el anillo aromático del aducto y la TYR139, interacciones más débiles entre la ILE51 y
el anillo aromático (Figura 64 A). Es importante mencionar que también se presenta
otro puente de hidrógeno entre el carbonilo del grupo éster y la LYS269, cuya
interacción fue discutida anteriormente. El isómero SR pierde afinidad porque solo
establece ahora un puente de hidrógeno entre el carbonilo del éster y la ARG142, una
interacción ión-dipolo entre la TYR156 y el carboxilato del biciclo, así también muestra
interacción con grupo etilo del éster con la ILE51 (Figura 64B). En este caso la LYS269
y el aducto no comparten alguna interacción. Dependiendo de la rotación del anillo
aromático del aducto y su facilidad para hacerlo pudiese establecer una interacción
con al TYR139 que se encuentra perpendicular a dicho anillo.
Por otro lado, en el caso del compuesto RS-endo sucede algo similar que con el
compuesto exo; es decir, se puede observar en la Figura 64C un puente de hidrógeno
con la LYS269 y el carbonilo de éster, así como el puente formado entre el carbonilo de
la amida y la ARG142 y la interacción ión-dipolo entre la misma ARG142 y el
carboxilato del biciclo del aducto. También es posible apreciar la interacción tipo
―sándwich‖ () entre los anillos aromáticos del aducto y la TYR139; así como la
interacción del grupo etilo con la ILE51. La molécula SR tiene menos afinidad con
respecto a su isómero RS por que solo establece interacciones con el grupo etilo y la
ILE51, y la interacción ión-dipolo entre la ARG142 y el carboxilato (Figura 64D).
De manera muy general se ha discutido el tipo de interacciones intermoleculares
débiles que se establecen en el sitio activo de la GABA-AT con algunos ejemplos de los
aductos Diels-Alder evaluados y su relación con la constante de disociación KD; sin
embargo, es importante mencionar que a pesar que la forma en como se acomodan los
ligandos en el sitio activo es visiblemente diferente en algunos casos, es importante
resaltar el tipo de aminoácidos que participan en la interacción los cuales son muy
frecuentes. Se ha observado de manera general que la ILE51 puede establecer
interacciones de tipo van der Waals con el anillo aromático, el ciclohexeno o con el
106
éster; los puentes de hidrógeno se establecen con la TYR156 y ARG142; otra
interacción interesante en algunos casos es la de ión-dipolo con la ARG142 y los
carboxilatos del ciclohexeno o biciclos. Además las interacciones de tipo que
estabilizan mucho a los aductos y en general están relacionadas con el antagonismo de
receptores farmacodinámicos o inhibición enzimática.6
Por otro lado, fue evaluado bajo la misma metodología la interacción entre el GABA
y la enzima GABA-AT, ya que el neurotransmisor corresponde al sustrato natural de la
enzima. En la figura 65 es posible apreciar los aminoácidos que participan o que están
directamente relacionados con el sitio activo, que interesantemente son los mismos que
intervienen en la interacción con los aductos Diels-Alder. Es importante destacar que el
GABA interacciona directamente con la LYS269 y la coenzima fosfato de piridoxal
(PLP), ambos importantes en la transaminación del GABA. La constante de disociación
del GABA fue de 672.86 M, cuyo valor coincide con el valor experimental reportado
que es de 790 + 110 M21
, y el determinado en este trabajo que fue de 847.4 + 73.5 M.
Figura 65. Interacción del GABA en el sitio activo de la GABA-AT.
De la misma manera que fue analizado el GABA fueron probados el par
enantiomérico de la vigabatrina (Figuras 66A y 66B). Como se puede apreciar en la
Figura 66A que corresponde a la vigabatrina-R está relativamente cerca del PLP y la
LYS269 con los cuales reacciona para formar un aducto de tipo covalente con la enzima
inhibiéndola de manera irreversible. Los mismo sucede con el isómero vigabatrina-S
(Figura 66B), aunque este ligando aparece un poco más alejado del PLP y la LYS269;
sin embargo, no hay una diferencia muy grande entre ellas, de hecho para la (R)-VGB
su KD es de 195.97 M, mientras que para la (S)-VGB es de 78.92 M.
107
A B
Figura 66. A. Interacción con la R-vigabatrina. B. Interacción con la S-vigabatrina.
108
6.3 CINÉTICA ENZIMÁTICA
Para la determinación de la actividad de la enzima aminotransferasa del GABA
(GABA-AT) de Pseudomonas fluorescens in vitro, fue utilizada una reacción
enzimática acoplada con la enzima semialdehído succínico deshidrogenasa (SSDH),
monitoreando el incremento de la concentración del NADPH (Dinucleótido de
nicotinamida y adenina fosfato) producido en la reacción (Figura 67), y seguida por
espectrofotometría UV-Vis.20, 21,48
H3N
O
O
OO
H
O
O
O
H3N
O
O
NADP
PMP
SSDH
O
O
O
O
H
O
O
O
O
O
O
O
O
GABA-AT
PLP
L-Glutamato -Cetoglutarato
GABA Semialdehído Succínico
GABA-AT
Semialdehído Succínico Succinato
NADPH + H
Figura 67. Reacción enzimática acoplada llevada a cabo en la determinación de la actividad de GABA-
AT de P. fluorescens.
Al inicio de los ensayos de cinética enzimática se evaluó la actividad de la enzima y
se normalizaron las condiciones de experimentación, esencialmente el tiempo de
incubación para la temperatura de 25 °C a pH = 8.6. Se probaron diferentes
concentraciones de sustrato (GABA) en escala logarítmica (0.2, 0.4, 0.8, 1.6, 3.2 y 6.4
mM) a una concentración final de GABA-AT de 0.0209 mg/mL.
Se monitoreó el incremento de la concentración de NADPH en función del tiempo
para cada una de las concentraciones (Figura 68).
109
A = 0,0041t - 0,0018
r2 = 0,9981
A = 0,0093t + 0,0085
r2 = 0,9992
A = 0,0135t - 0,0047
r2 = 0,9995
A = 0,0287t - 0,0257
r2 = 0,9994
A = 0,0305t - 0,0289
r2 = 0,9996
A = 0,0303t - 0,044
r2 = 0,9992
-0.10
0.00
0.10
0.20
0.30
0.40
0.50
0.60
0.70
0.80
0.90
1.00
0 5 10 15 20 25 30 35
tiempo (min)
Ab
so
rba
nc
ia GABA 0.2 mM
GABA 0.4 mM
GABA 0.8 mM
GABA 1.6 mM
GABA 3.2 mM
GABA 6.4 mM
Lineal (GABA 0.2 mM)
Lineal (GABA 0.4 mM)
Lineal (GABA 0.8 mM)
Lineal (GABA 1.6 mM)
Lineal (GABA 3.2 mM)
Lineal (GABA 6.4 mM)
Figura 68. Gráfico que muestra la actividad de la enzima GABA-AT a distintas concentraciones de
sustrato en función del tiempo.
Los resultados fueron los esperados, es decir, según la teoría enzimática de Michaelis-
Menten49
muestra que la actividad enzimática aumenta de manera lineal con una
cinética de orden uno como función de la concentración de sustrato hasta que la
cantidad de enzima se satura y la actividad permanece constante siguiendo una cinética
de orden cero. Fueron determinadas las regresiones lineales por mínimos cuadrados de
cada recta y obtenida la pendiente que corresponde a la constante experimental de
rapidez. Estas constantes fueron graficadas como función de la concentración de
sustrato y fue obtenida la curva típica de tipo Michaelis-Menten (Figura 69).
0
0.005
0.01
0.015
0.02
0.025
0.03
0.035
0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0
[GABA] (mM)
k
Curva de Michaelis- Menten
Figura 69. Representación de la actividad enzimática de GABA-AT como función de la concentración de
GABA. Curva de Michaelis-Menten.
110
Para estimar la constante de Michaelis-Menten se usó el método de Hanes-Wolff
(Figura 70): 49
([S]/Act) = [S](1/rmáx) + (Km/rmáx)
Donde [S] es la concentración de sustrato, Act es la actividad enzimática, rmáx es la
rapidez máxima y Km la constante de Michaelis-Menten.
(C/k) = 26.75C + 30.96
r² = 0.964
0.0
50.0
100.0
150.0
200.0
250.0
0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0
[GABA] (mM)
[GABA]/k Hanes-Wolff
Lineal (Hanes-Wolff)
Figura 70. Determinación de los parámetros cinéticos de la GABA-AT por el método de Hanes-Wolff.
Realizando los cálculos pertinentes se obtuvieron los siguientes valores: rmáx = 0.0373
y Km = 1.1573 mM muy cercano al valor reportado.21
Una vez determinada la actividad de GABA-AT y determinado el tiempo de
incubación, se probaron los aductos Diels-Alder sintetizados (la mezcla de
regioisómeros 6a-d y 7a-d, 11a-d, 14a-d y la mezcla de regioisómeros 17a-d y 18a-d)
y vigabatrina como control positivo.
Los primeros ensayos fueron a manera de rastreo, es decir, se comparó la
concentración de 0.8 mM de GABA (control) contra 0.8 mM de cada aducto o
vigabatrina. El criterio que se utilizó fue que aquellos compuestos que inhibieran a la
enzima por arriba del 40 % se estudiarían más a fondo obteniendo una cinética completa
a distintas concentraciones del inhibidor. Los resultados obtenidos se muestran en la
Tabla 33.
111
Tabla 33. Cernimiento de actividad inhibitoria de los aductos Diels-Alder sintetizados, comparados
con GABA a una concentración de 0.8 mM.
Compuesto % inhibición + EEM
6a y 7a 28.18 + 4.82
6b y 7b 57.39 + 0.67
6c y 7c 37.79 + 0.25
6d y 7d ND
11a 38.35 + 7.03
11b 27.40 + 8.78
11c 27.53 + 7.00
11d 38.74 + 7.77
14a 9.10 + 1.78
14b 13.82 + 1.40
14c 13.84 + 1.59
14d ND
17a y 18a No inhibe
17b y 18b 19.44 + 1.17
17c y 18c ND
17d y 18d ND♠
Vigabatrina 49.19 + 0.66
*EEM: Error Estándar de la Media para n = 6. ND: no determinado. ND♠
: no determinado por
insolubilidad en el medio
Los resultados obtenidos muestran una inhibición por arriba del 40% para la mezcla
de regioisómeros 6b y 7b derivados de isopreno, mismo que muestran una inhibición 7
% más alta que la vigabatrina, por lo que esta mezcla resultó interesante, por lo que fue
realizado un estudio cinético más profundo a diferentes concentraciones (0.25, 0.50,
1.00 y 2.00 mM) para determinar el tipo de inhibición que presenta dicha mezcla y su
constante de inhibición Ki.
La mezcla de regioisómeros muestra una inhibición competitiva debido a que la
rapidez máxima (rmáx) no cambia sustancialmente en presencia del inhibidor (Figura
71); es decir, por lo menos alguno de los regioisómeros se une en el sitio activo de la
GABA-AT.
112
(1/Act) = 0.5821(1/[S]) + 0.6869
r = 0.9422
(1/Act) = 1.1116(1/[S]) + 0.4923
r = 0.7852
(1/Act) = 1.8007(1/[S]) + 0.3806
r = 0.8840
(1/Act) = 2.3163(1/[S]) + 0.5067
r = 0.9227
(1/Act) = 5.2345(1/[S]) + 0.4986
r = 0.8567
-5.00
0.00
5.00
10.00
15.00
20.00
25.00
30.00
35.00
-1.00 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00
1/[GABA] (1/mM)
1/A
ct
(mg
.min
/
mo
l)
[I] = 0.00 mM
[I] = 0.25 mM
[I] = 0.50 mM
[I] = 1.00 mM
[I] = 2.00 mM
Lineal ([I] = 0.00 mM)
Lineal ([I] = 0.25 mM)
Lineal ([I] = 0.50 mM)
Lineal ([I] = 1.00 mM)
Lineal ([I] = 2.00 mM)
Figura 71. Análisis del tipo de inhibición de la mezcla de regioisómeros 6b y 7b por el método de la
doble recíproca de Lineweaver-Burk: (1/r0) = (Km/rmáx)(1/[S]) + 1/rmáx; donde r0 es la rapidez a cierta
concentración de sustrato, [S] es la concentración de sustrato. Análisis de regresión lineal por mínimos
cuadrados. Parámetros analizados con la prueba t de Student. n = 6. Los coeficientes de regresión lineal
(r) y las pendientes (B) fueron estadísticamente significativas (p < 0.001). Las ordenadas al origen (A) no
difieren de cero (p > 0.20), excepto para la línea recta con [I] = 0.00 mM con p < 0.001.
Después de este análisis se determinaron los parámetros cinéticos (Km, rmáx y Ki)
(Tabla 34) para la mezcla de regioisómeros 6b y 7b. La Ki fue determinada por el
método de Schild49
(Figura 72).
Tabla 34. Parámetros cinéticos de la mezcla de regioisómeros sobre la enzima GABA-AT.
Parámetros Valor + EEM
rmáx (mol/mg.min) 1.4558 + 0.1756
Km (mM) 0.8474 + 0.0735
Ki (mM) 0.2703 + 0.0262
nH 0.9915 + 0.0828
EEM: Error estándar de la media.
Es importante señalar que los valores obtenidos para la mezcla de regioisómeros, la
rapidez máxima (rmáx) y la constante de Michaelis (Km) son valores esperados según la
teoría que dice que el valor de Km es la mitad de la rmáx (Figura 73).
113
[(B'/B)-1] = 0.9915 log[I] + 3.5378
r = 0.9859
-0.20
0.00
0.20
0.40
0.60
0.80
1.00
-4.00 -3.50 -3.00 -2.50 -2.00 -1.50 -1.00 -0.50 0.00
log [I] (M)
[(B
'/B
)-1]
Aductos 6b y 7b
Lineal (Aductos 6b y 7b)
Figura 72. Determinación de la Ki por el método de Schild: log[(B’/B)-1] = nHlog[I] – nHlogKi. B’:
pendiente en presencia de inhibidor, B: pendiente sin inhibidor, nH: coeficiente de Hill, Ki: constante de
inhibición. Análisis de regresión lineal por mínimos cuadrados. Parámetros analizados con la prueba t de
Student. El coeficiente de regresión lineal (r), la pendiente (B) y la ordenada al origen (A) fueron
estadísticamente significativos (p < 0.02).
Cinética de Michaelis-Menten de la mezcla de regioisómeros
6b y 7b
0.00
0.20
0.40
0.60
0.80
1.00
1.20
1.40
1.60
0 1 2 3 4 5 6 7
[GABA] (mM)
Act
( m
ol/
mg
.min
)
Aductos 6b y 7b
rmáx
Km
Figura 73. Gráfica de Michaelis mente descrita por la enzima GABA-AT según la ecuación:
r0 = (rmáx [S])/ (Km + [S])
De igual manera se pudo corroborar que la mezcla de regioisómeros 6b y 7b
representa un inhibidor competitivo de la enzima GABA-AT con una afinidad 3 veces
mayor que su sustrato (GABA) aproximadamente. El valor de nH indica el número de
114
sitios de unión que posee la enzima, es decir, solo una molécula puede unirse al sitio
activo de la enzima.
Por otra parte, es importante destacar el valor de Km obtenido es reproducible ya que
coincide con el reportado en la literatura21
que es de 0.79 + 0.11 mM, y aparentemente
la mezcla de regioisómeros inhibe de manera más eficaz a la enzima que la vigabatrina
(Tabla a) puesto la Ki es de 26 + 3 mM, mientras que para 6a y 7a es de 0.27 + 0.0262
mM, es decir, es aproximadamente 10 veces más potente que la primera.
115
6.4 MODELO IN VIVO DE LAS CONVULSIONES INDUCIDAS CON
PENTILENTETRAZOL
Los modelos animales en el laboratorio son de gran utilidad para evaluar los efectos
farmacológicos de sustancias nuevas y conocidas, en investigación sobre epilepsia, sin
embargo, para que sean útiles al investigador es importante que cumplan con ciertos
propósitos50
(Tabla 35).
Tabla 35. Propósitos que persiguen los modelos animales para la evaluación de sustancias nuevas o
conocidas50
.
PROPÓSITOS PROPÓSITOS ANTICONVULSIVOS
1° Búsqueda de nuevas sustancias antiepilépticas
2° Evaluación de las posibles eficacias específicas de aquellos
compuestos nuevos que han mostrado la actividad anticonvulsiva
sobre los distintos tipos de crisis o epilepsias
3° Estos modelos pueden emplearse para clasificar la eficacia preclínica
de nuevos compuestos durante la administración a largo plazo
4° Se usan para la determinación del mecanismo de acción por el cual
los agentes anticonvulsivos nuevos o conocidos ejercen sus efectos
farmacológicos
5° Ciertos modelos pueden usarse para estudiar los mecanismos de
resistencia a los fármacos en la epilepsia
6° Los modelos con animales epilépticos son de utilidad para estudiar si
la epileptogénesis altera el potencial de efectos adversos de un
fármaco dado, debido a que la disfunción cerebral crónica pueda
conducir a una alteración de la sensibilidad
7° Estudiar la fisiopatología de la epilepsia y las crisis epilépticas
Los modelos animales más comúnmente utilizados para probar nuevos compuestos
son el de convulsiones inducidas con electrochoque máximo (MES) y el de inducción
de crisis convulsivas con pentilentetrazol (PTZ).
Se piensa que la prueba MES, en el que las contracciones clónicas de la pantorrilla
son inducidas por la estimulación eléctrica corneal bilateral o transauricular puede ser
predictivo de la eficacia anticonvulsiva contra las convulsiones tónico-clónicas
116
generalizadas; mientras que la prueba de inducción química de convulsiones con PTZ,
en la cual las convulsiones mioclónicas y clónicas generalizadas son inducidas por la
administración (generalmente subcutánea) sistémica de dosis convulsionantes de PTZ,
representa un modelo válido para la ausencia generalizada y/o las convulsiones
mioclónicas en humanos pero su validez predictiva está muy lejos de lo deseable.50
Además de estos modelos animales el modelo kindling (estimulación eléctrica breve y
periódica de la amígdala del lóbulo temporal) ha predicho correctamente el efecto
clínico de los fármacos antiepilépticos utilizados actualmente contra la enfermedad.
El pentilentetrazol (cardiazol, Figura 74) es un fármaco analéptico cardiorrespiratorio6
clasificado como un estimulante general inespecífico del S.N.C. por bloqueo de la
inhibición neuronal1; sin embargo, estudios recientes muestran que el PTZ se une
específicamente al sitio de picrotoxina (Figura 75) del receptor GABAA al demostrar su
unión al receptor GABAA recombinante.51
N
N
N
N
Figura 74. Pentilentetrazol (PTZ).
CH3
H
O
O
H
HO
H
H
O
CH3
CH2
O
O
Figura 75. Picrotoxina: psicoestimulante que aumenta los niveles de actividad motriz y cognitiva,
refuerza la vigilia, el estado de alerta y la atención, y se ha utilizado como antídoto para la intoxicación
con barbitúricos, ya que la picrotoxina es un antagonista no competitivo del receptor GABAA.
La determinación de la dosis mínima efectiva del PTZ, es de suma importancia debido
a que tal dosis asegura que prácticamente el total de la población utilizada en los
ensayos (controles y muestras) presente las crisis convulsivas inducidas con PTZ y
poder hacer de manera más precisa (minimizando errores) el análisis del efecto
protector de los compuestos a utilizar sobre las convulsiones de inducción química en
general.
117
Para realizar la prueba del efecto protector de sustancias anticonvulsivantes conocidas,
así como de compuestos de los que no se conoce su actividad, se determinó la dosis
efectiva mínima cuya metodología está ampliamente descrita en la literatura sobre la
determinación de la dosis efectiva 95 (DE95).52,53,54
De acuerdo con lo anterior se realizó una curva dosis-respuesta cuantal para la
determinación de la DE95 utilizando las dosis de 35, 50, 65, 80, 95, 110 y 125 mg/kg de
PTZ. Al realizar este ensayo fueron contabilizados el número de ratones que
presentaron crisis convulsivas del tipo tónico-clónicas, así como el número de crisis
convulsivas presentadas (Tabla 36).
Tabla 36. ensayo preliminar de determinación de la DE95 de PTZ.
DPTZ
(mg/kg)
35 50 65 80 95 110 125
No. de
CC
totales
0
1
14
20
22
11
17
Muerte
(%)
0 0 0 0 0 80 100
CC: crisis convulsiva. n = 10 para cada una de las dosis de 35 a 95 mg/kg. n = 5 para las dosis de 110 y
125 mg/kg.
El ensayo preliminar permitió observar que a dosis bajas como la de 35 mg/kg, ningún
ratón presentó alguna crisis convulsiva, y en contraste a las dosis más altas (110 y 125
mg/kg) los ratones presentaron crisis convulsivas y muerte.
La curva dosis respuesta cuantal fue construida por el método logit con las dosis de 35
a 95 mg/kg que fueron aquellas dosis en donde no fue observada la muerte. (Figura 76).
118
log [p/(1-p)] = 8.9046 logD - 16.22
r2 = 0.902
-3.00
-2.00
-1.00
0.00
1.00
2.00
3.00
0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50
log D (mg/kg)
p/(
1-p
)
PTZ
Lineal (PTZ)
Figura 76. Curva dosis respuesta cuantal de crisis convulsivas para la determinación de la DE95 de PTZ
bajo el método logit.
Derivado de este análisis fue determinada la DE95 que fue de 92.3 mg/kg, sin
embargo, normalmente, la literatura recomienda utilizar la dosis entre 100 y 110
mg/kg55
sobre todo para aquellos fármacos ampliamente probados y que usualmente se
utilizan como estándares o moléculas nuevas con mucha actividad; no obstante, fue
escogida una dosis menor a las antes mencionadas con el propósito de observar si los
aductos, en particular la mezcla 6b y 7b (que inhiben a la enzima GABA-AT) presentan
actividad anticonvulsiva con una dosis moderada de PTZ (DE75 = 75 mg/kg).
Los primeros experimentos fueron de estandarización, para ello se inició con la
vigabatrina (VGB) como control positivo, puesto que es el principal inhibidor de
GABA-AT14
y utilizado como anticonvulsivo de segunda elección para tratamiento de
convulsiones parciales y el síndrome de West.26
Fue de suma importancia realizar los experimentos con VGB puesto que es inhibidor
de la GABA-AT y es un fármaco que se utiliza actualmente; sin embargo, la literatura
menciona ciertas controversias sobre la VGB y su efectividad en el modelo in vivo de
las convulsiones con PTZ, algunas mencionan que es inefectiva48
, mientras que otros
estudios demuestran su actividad de protección contra convulsiones inducidas en este
modelo52,56
y otras su efectividad clínica contra convulsiones parciales pero no crisis
generalizadas.57
119
Inicialmente fueron probadas las dosis de VGB de 1, 3, 5, 7 y 9 mmol/kg por este
modelo con un tiempo de pretratamiento con el fármaco de 240 min. La administración
se realizó vía intraperitoneal (ip). Posteriormente se administró el PTZ por vía
subcutánea (sc) a la dosis de 110 mg/kg. Los resultados de este experimento sobre los
ratones fueron los siguientes (Tabla 37):
Tabla 37. Efectos de la VGB en el modelo de las convulsiones inducidas con PTZ (D = 110 mg/kg).
DVGB
(mmol/kg)
CC (%) No. de CC
totales
Latencia + EEM
(min)
Protección por
latencia (%)
Control 100 9 0.66 + 0.12 0.00
1.0 100 12 2.90 + 0.40 77.15
3.0 100 14 3.81 + 0.51 82.62
5.0 80 7 6.28 + 0.65 89.45
7.0 80 6 7.33 + 2.15 90.94
9.0 60 8 9.86 + 5.09 93.27
CC: Crisis convulsivas. EEM: Error Estándar de la media. Los porcentajes fueron obtenidos con una n =
5 para cada dosis.
Estos resultados muestran que prácticamente la VGB no protege contra el número de
crisis convulsivas tónico-clónicas inducidas con el PTZ salvo la dosis de 9 mmol/kg que
protege al 40 %; sin embargo, el efecto global muestra que no hay diferencia
significativa en el número de crisis presentadas de manera general comparado con el
grupo control; no obstante, puede observarse un efecto interesante de la VGB, el cual
consistió en incremento de latencia a la primera crisis convulsiva con respecto al
control, cuyo efecto es dependiente de la dosis (Figura 77).
120
0.0
2.0
4.0
6.0
8.0
10.0
12.0
14.0
16.0
Control 1 3 5 7 9
DVGB (mmol/kg)
La
ten
cia
(m
in)
Latencia
**
*
*
*
Figura 77. Efecto de la VGB sobre la latencia a la primera crisis convulsiva tónico-clónica. ANOVA de
una vía, el análisis de medias fue realizado por el método de Duncan; * p < 0.005
Los resultados del efecto dosis-dependiente de la VGB sobre la latencia a la primera
crisis convulsiva tónico-clónica inducida con PTZ son satisfactorios, sin embargo, no
fue suficiente, puesto que se requería un efecto protectivo contra el número de crisis
convulsivas. Por tal motivo se realizó un ensayo preliminar a la dosis de 75 mg/kg
(DE75) de PTZ para inducir las crisis (Tabla 38).
Tabla 38. Efectos de la VGB en el modelo de las convulsiones inducidas con PTZ (D = 75 mg/kg).
DVGB
(mmol/kg)
CC (%) No. de CC totales Latencia + EEM (min)
Control 100 6 7.54 + 1.45
1.0 20 1 11.80
3.0 0 0 SCC
5.0 0 0 SCC
7.0 0 0 SCC
9.0 0 0 SCC
CC: Crisis convulsivas; SCC: Sin crisis convulsivas durante el período de observación. EEM: Error
Estándar de la Media.
Este ensayo mostró que las dosis utilizadas de VGB contra las convulsiones inducidas
con PTZ son efectivas desde 1.0 a 9.0 mmol/kg, como puede apreciarse en la tercera
121
columna; mientras que en la cuarta, para la menor dosis (1.0 mmol/kg) el tiempo de
retardo del ratón que presentó la crisis convulsiva fue a los 11.80 min, casi 4 min
después de la primera crisis convulsiva que presentó el grupo control.
Determinada la efectividad de la VGB contra el número de crisis convulsivas se
realizó el bioensayo con la mezcla de 6b y 7b tomando como control positivo a la VGB
a la misma dosis, midiéndose de igual manera el número de crisis convulsivas tónico-
clónicas presentada por los sujetos experimentales y el tiempo de latencia a la primera
crisis convulsiva (Tabla 39).
Tabla 39. Bioensayo sobre los compuestos 6b y 7b utilizando como control positivo a VGB contra la
dosis de PTZ de 75 mg/kg.
D (mmol/kg) CC (%) No. de CC totales Latencia + EEM (min)
Control 94.1 16 5.49 + 0.76
0.2 (6b y 7b)* 100.0 18 4.77 + 0.35
0.5 (6b y 7b)♠ 52.9** (15.0)
♣ 9 3.92 + 0.39
1.0 (6b y 7b)♠ 57.1 (53.3)
♣ 4 7.91 + 2.91
0.2 (VGB) 83.3 5 4.99 + 0.76
0.5 (VGB) 25.0** 3 5.78 + 0.91
1.0 (VGB) 26.7** 4 7.84 + 1.88
CC: Crisis convulsivas. EEM: Error Estándar de la Media. *Bioensayo realizado en disolución de los
aductos; ♠ bioensayos realizados en suspensión de los aductos,
♣ porcentaje de ratones muertos a la dosis
indicada. ** Estadísticamente significativo con respecto al control bajo la prueba exacta de Fisher p <
0.01
En esta tabla fueron analizados el número de ratones que presentaron crisis convulsiva
contra aquellos que no las presentaron, la dosis de VGB 1.0 mmol/kg mostró diferencia
significativa con respecto al control, por lo que este fármaco demuestra que hay una
disminución en el número de convulsiones inducidas con PTZ; en el mismo sentido
pueden apreciarse las diferencias significativas entre los experimentos probados a la
dosis de 0.5 mmol/kg tanto de VGB como de los aductos (6b y 7b) con respecto al
control en la protección de las convulsiones inducidas con PTZ; no obstante, es
necesario mencionar que no hay diferencia significativa entre VGB y 6b-7b (prueba
exacta de Fisher mostró p = 0.1030) lo que significa que por lo menos uno de los
122
aductos de la mezcla 6b-7b muestra actividad sobre la protección de crisis convulsivas
comparable con la VGB; es decir, tiene un una actividad anticonvulsiva similar. Estos
experimentos sugieren que la actividad anticonvulsiva mostrada por los aductos Diels-
Alder 6b-7b pudieran estar asociados a su actividad inhibitoria sobre la enzima
aminotransferasa del GABA.
Por otro lado, es importante destacar que la mezcla de regioisómeros 6b-7b mostró
cierta toxicidad en la dosis de 0.5 y 1.0 mmol/kg cuya manifestación fue la muerte de
los sujetos experimentales en una relación aparente dosis-dependiente.
El siguiente análisis que se llevó a cabo fue la comparación de la latencia a la primera
crisis convulsiva (Figura 78).
0.00
2.00
4.00
6.00
8.00
10.00
12.00
Control VGB=0.2 VGB=0.5 VGB=1.0 Aductos=0.2 Aductos=0.5 Aductos=1.0
Dosis (mmol/kg)
Late
ncia
(m
in)
Control
VGB=0.2
VGB=0.5
VGB=1.0
Aductos=0.2
Aductos=0.5
Aductos=1.0
Figura 78. Gráfico que muestra el efecto sobre la latencia a la primera crisis convulsiva para las distintas
dosis de VGB (rojo), aductos (amarillo) en comparación con el grupo control (verde). Se muestran barras
que corresponden a la media + EEM. Los datos fueron analizados con la prueba t de Student. Todos los
resultados presentaron una p > 0.05.
Estos resultados no mostraron alguna diferencia significativa sobre la latencia para
provocar alguna crisis convulsiva tanto de la VGB como de los aductos (6b-7b); es
importante señalar para el caso de los aductos, sobre todo a la dosis de 0.5 mmol/kg la
gráfica muestra una tendencia a la baja en la latencia en la generación de la primera
crisis convulsiva, es decir, aparentemente hay una sensibilización a la generación de la
crisis.
123
Resulta de interés el efecto mostrado con los aductos a la 1.0 mmol/kg, que a pesar de
ser muy tóxica, tiene una tendencia ascendente en el tiempo de retardo, es decir, que
retrasa la generación de la crisis convulsiva con respecto al grupo control; sin embargo,
esta dosis resultaría difícil trabajarla debido a su alta toxicidad.
Por último, las observaciones hechas hacia los ratones en el período de pre-
tratamiento con los aductos (6b-7b) a la dosis de 0.5 mmol/kg, entre los minutos 3 a 5
presentaron letargo con temblores en la extremidades anteriores, cabeza y cola, así
como parpadeo frecuente.
124
7. CONCLUSIONES
Se sintetizaron con buenos rendimientos los ácidos N-fenilmaleámicos 5a-d que
corresponden a los dienófilos de las reacciones de Diels-Alder.
Al intentar sintetizar los aductos Diels-Alder 6a-d y/o 7a-d derivados de
isopreno (2) bajo condiciones térmicas, se generaron otros compuestos
correspondientes a aductos derivados de la N-fenilmaleimida 4a-d.
Los productos 4a-d se analizaron detenidamente a través de los espectros de
RMN en una y dos dimensiones, y se llegó a la conclusión de que se trataba de
los aductos Diels-Alder derivados de la N-fenilmaleimida 4a-d.
Se llevó a cabo el análisis conformacional de los aductos 4a-d, por estimación
de las constantes de acoplamiento de los confórmeros más estables determinados
por cálculos teóricos, mismas que se compararon con las constantes
experimentales, llegando a la conclusión de que el confórmero más estable para
los compuestos 4a-d es el bote-syn.
De acuerdo con lo anterior se propuso una reacción multicomponentes (MCR)
con los reactivos anhídrido maleico (1), isopreno (2) y las anilinas 3a-d bajo las
misma condiciones térmicas, generando los aductos 4a-d.
Bajo distintas condiciones de reacción fue posible dilucidar la secuencia de
pasos que toma la MCR para generar los aductos 4a-d, observando que la
primera reacción corresponde a la formación de los ácidos N-fenilmaleámicos
5a-d, el segundo paso corresponde a la formación de la mezcla de regioisómeros
6a-d y 7a-d, seguida de la tercera reacción por ciclización intramolecular por
pérdida de una molécula de agua.
A consecuencia de las reacciones anteriores se propuso una ruta sintética alterna
para sintetizar los aductos Diels-Alder propuestos (6a-d, 7a-d, 11a-d y 14a-d),
que consistió en generar en primer lugar los aductos Diels-Alder entre anhídrido
maleico (1) y los distintos dienos: isopreno (2), ciclopentadieno (9) y furano
(12); la estereoquímica de los aductos de 2 y 9 fue endo y exo, respectivamente.
Se sintetizaron y caracterizaron los aductos 6a-d, 7a-d, 11a-d y 14a-d bajo el
método propuesto, con rendimientos de moderados a buenos, con la mención de
que no hubo regioselectividad en la obtención de los aductos derivados de
isopreno.
125
Se sintetizaron y caracterizaron los ácidos N-fenilfumarámicos (16a-d) con
rendimientos buenos, constatando que se trataba de los compuestos con
configuración E.
Se sintetizaron y caracterizaron bajo condiciones térmicas los aductos Diels-
Alder derivados de isopreno a partir de los ácidos 16a-d obteniéndose la mezcla
de regioisómeros 17a-d y 18a-d. A diferencia de los dienófilos Z, la reacción
generó los aductos esperados, puesto que la configuración de los dienófilos 16a-
d al formarse el aducto no permite la ciclización intramolecular para formar la
imida.
El análisis de alineación mostró que la secuencia de Pseudomonas fluorescens
tiene alta homología con la GABA-AT de Escherichia coli, y con menor
homología con la de Mus musculus, Sus scrofa y Homo sapiens; sin embargo, el
sitio activo en todas las especies está altamente conservado.
Se modeló la GABA-AT de Pseudomonas fluorescens tomando como secuencia
molde la GABA-AT de Escherichia coli, cuya estructura ha sido resuelta por
difracción de rayos X.
La estructura modelada se minimizó con la coenzima PLP para generar las
mejores condiciones de interacción ligando-enzima.
Se construyeron todos y cada uno de los posibles aductos Diels-Alder derivados
de isopreno, ciclopentadieno y furano de los ácidos N-arilmaleámicos y N-
arilfumarámicos, obteniendo la estructura de mínima energía al nivel HF/3-21G.
Se realizaron los estudios de Docking de los aductos sobre la GABA-AT
modelada, así como del GABA y de la VGB. Los aductos Diels-Alder, GABA y
VGB se unen al sitio activo de la enzima GABA-AT, teniendo relevancia las
interacciones con los aminoácidos ILE51, TYR139, ARG142 y TYR156, que
más frecuentemente aparecen en los estudios de Docking y que se relacionan
estrechamente con la constante de disociación.
Los aductos derivados de isopreno mostraron buena interacción en el sitio activo
de la enzima, siendo los derivados de ácido fumárico más afines que los del
ácido maleico. En relación a los aductos derivados de ciclopentadieno, de
manera general los isómeros con configuraciones RS y RR fueron más afines al
sitio activo que sus respectivos enantiómeros SR y SS, respectivamente.
126
La interacción ligando-enzima asistida por computadora mostró la interacción
del GABA en el sitio activo con una KD = 672.86 M, mientras que la Km
experimental fue de 847.4 M cuyos valores presentan una buena correlación.
Se evaluaron los aductos sintetizados a la concentración 0.8 mM contra GABA
0.8 mM contra la enzima GABA-AT de Pseudomonas fluorescens, siendo la
mezcla de regioisómeros 6a-d y 7a-d la más activa de todos, mostrando una
inhibición del 57 %.
De acuerdo a lo anterior la mezcla de regioisómeros 6a-d y 7a-d mostró una
inhibición de tipo competitiva hacia la enzima, deduciendo que estos
compuestos se unen en el sitio activo de la proteína con una Ki de 0.27 mM,
cuya afinidad es 10 veces mayor que la VGB.
La mezcla de regioisómeros 6b y 7b mostró una actividad anticonvulsiva
comparable con la de la vigabatrina en términos de la protección de las
convulsiones inducidas con PTZ a la dosis de 0.5 mmol/kg.
La dosis de 1.0 mmol/kg de la mezcla de regioisómeros 6b y 7b muestra alta
toxicidad, puesto que aproximadamente la mitad de los sujetos experimentales
presentaron muerte.
127
8. PARTE EXPERIMENTAL
8.1 Instrumentación
Las materias primas, reactivos y productos se pesaron en balanzas analíticas Sartorius
CP224 S y Scientech SP500. Las reacciones se llevaron a cabo en las parrillas de
agitación y calentamiento Fisher, y Corning. Las reacciones de Diels-Alder térmicas, se
llevaron a cabo en un tubo de presión ACE Glass Incorporated. La concentración de los
productos se realizó en un evaporador rotatorio Yamato Rotary Evaporator RE50. Los
puntos de fusión tanto de las materias primas como productos se determinaron en un
aparato de punto de fusión Mel-Temp II Laboratory Devices Inc. U.S.A.; los puntos de
fusión no están corregidos. Para la determinación del Rf de las materias primas y
productos se emplearon cromatofolios de aluminio ALUGRAM SIL 20×20 cm
recubiertos con gel de sílice 60F254 (Micherey-Nagel). El revelado se realizó con una
lámpara de UV UVP modelo UVS-18.
La determinación de los espectros de ultravioleta (UV), y la medición de la
absorbancia de los experimentos de cinética enzimática se midieron en un
espectrofotómetro UV-Vis Beackman Coulter DU 650. Los espectros de infrarrojo (IR)
se determinaron en un espectrofotómetro Spectrum One FT-IR de Perkin Elmer. Los
espectros de resonancia magnética nuclear de 1H,
13C y bidimensionales se obtuvieron
de un espectrómetro Varian VNMRS-500 a 500 MHz (125.787 MHz para 13
C), o en un
espectrómetro Varian Mercury a 300 MHz (75 MHz para 13
C). Los espectros de masas
de alta resolución se obtuvieron de un espectrómetro de masas de impacto electrónico
JEOL GCmateTM
II (EI, 70eV).
Los valores de pH de las disoluciones buffer de fosfatos se obtuvieron de un
potenciómetro Hanna Instruments pH 211 Microprocessor pH Meter. Las disoluciones
de productos a probar en cinética enzimática y en el modelo de convulsiones inducidas
con PTZ se agitaron con un vórtex Constant Speed Mixer, marca Lab-Line. Las
muestras ensayadas en cinética enzimática fueron incubadas en un baño de agua Termo-
Baño Felisa. Se emplearon jaulas de acrílico para observación de los ratones.
Los estudios computacionales se llevaron a cabo en computadoras disponibles en los
grupos de investigación correspondientes en la ENCB y la ESM.
128
8.2 Reactivos
Se utilizaron los siguientes reactivos para la síntesis de todos los compuestos,
purificación y determinación espectral: ácido para-aminobenzoico (Aldrich), ácido
meta-amino benzoico (Aldrich), 4-aminobenzoato de etilo (Aldrich), 3-amino benzoato
de etilo (Aldrich), anhídrido maleico (Sigma), cloruro de fumarilo (Aldrich),
tetrahidrofurano (THF) destilado (ver procedimiento), hexano destilado por destilación
fraccionada, isopreno (Sigma-Aldrich), diciclopentadieno (Aldrich) (ver procedimiento
de obtención de ciclopentadieno), furano (Aldrich), hexano, acetona, metanol y
diclorometano (CH2Cl2, DCM) destilados por destilación fraccionada, tolueno
(Analytyka), agua destilada, sulfato de calcio anhidro (CaSO4, Drierite), nitrógeno (N2,
Infra), bromuro de potasio (KBr, Merck), dimetilsulfóxido deuterado (DMSO-d6,
Aldrich), cloroformo deuterado (CDCl3, Aldrich)
Para los experimentos de cinética enzimática se utilizaron los siguientes reactivos:
fosfato dibásico de potasio (K2HPO4, Reactivos Químicos Monterrey S.A. de C.V.),
fosfato monobásico de potasio (KH2PO4, J.T. Baker), glicerol (Productos Químicos
Monterrey S.A. de C.V.), pirofosfato de potasio (K4P2O7, Productos Químicos
Monterrey S.A. de C.V.), ácido clorhídrico concentrado (HClconc., J.T. Baker), ácido 2-
cetoglutárico (Merck), dinucleótido de nicotinamida y adenina sódico oxidado (-
NADP, Sigma), dinucleótido de nicotinamida y adenina fosfato reducido (-NADPH,
Sigma), ácido -aminobutírico (GABA, Merck-Schuchardt), complejo gabasa-
semialdehído succínico deshidrogenasa de (GABA-AT-SSDH, EC de Pseudomonas
fluorescens, polvo liofilizado con 1.1 U/mgprot., Sigma), dinucleótido de nicotinamida y
adenina reducido (-NADPH, Sigma), vigabatrina (tabletas, ver procedimiento de
aislamiento, con agradecimiento por la donación del medicamento a Sandoz S.A. de
C.V. para el desarrollo de este proyecto), agua bidestilada.
Para los experimentos del modelo de convulsiones inducidas con pentilentetrazol
(PTZ) en ratones se utilizaron los siguientes reactivos: Aductos Diels-Alder
previamente sintetizados y purificados, pentilentetrazol (Sigma), vigabatrina (tabletas,
ver procedimiento de aislamiento, Sandoz), cloruro de sodio (NaCl, J.T. Baker), agua
bidestilada.
Todos los reactivos utilizados durante el proyecto tienen grado analítico de pureza.
129
Procedimiento de destilación de tetrahidrofurano (THF)
El THF se dejó en agitación por 12 h en hidruro de litio y aluminio (LiAlH4) bajo
atmósfera de nitrógeno; una vez transcurrido el tiempo se destiló. Después del proceso
de destilación el THF se sometió a reflujo y agitación constante con sodio metálico
(Na°) y benzofenona hasta la aparición de una coloración azul oscura. Posterior a este
proceso de eliminación de oxígeno y humedad, el disolvente se destiló para su uso.58
Procedimiento para la obtención del ciclopentadieno, a partir del
diciclopentadieno
El diciclopentadieno es un dímero obtenido por la cicloadición espontánea de Diels-
Alder de dos moléculas de ciclopentadieno. La reacción ocurre en la dirección opuesta
por calentamiento a alta temperatura, aproximadamente a 140 °C, liberando el
ciclopentadieno, el cual debe emplearse dentro de un período relativamente corto. Así,
entre 20 y 30 mL de ciclopentadieno se colocaron en un matraz bola de 100 mL y se
montaron en un sistema para destilación fraccionada. El calentamiento del matraz
produjo una fracción de ciclopentadieno que destiló aproximadamente a 45 °C, el cual
se recogió en un baño de hielo.59
El ciclopentadieno que no fue empleado
inmediatamente se almacenó a -20 °C por un período máximo de una semana.
Procedimiento de aislamiento de la vigabatrina a partir de tabletas que contienen
500 mg de principio activo
Se tomaron de 2 a 3 tabletas de 500 mg, las cuales se pesaron y trataron de manera
independiente. Cada tableta se colocó en un mortero limpio y seco y se trituró hasta
obtener un polvo fino, el cual se colocó en un vaso de precipitados de 100 mL con 50
mL de agua bidestilada y se dejó en agitación constante durante un período de 3 horas a
temperatura ambiente. La vigabatrina es un producto soluble en agua,60
mientras que el
excipiente es insoluble. Una vez pasado el tiempo, el ingrediente activo fue filtrado a
gravedad de 3 a 4 veces para eliminar el exceso de excipiente. Se redujeron 2/3 del
volumen de agua en el rotaevaporador, y el resto se dejó evaporar a temperatura
ambiente hasta obtener el producto puro. Se determinó el porcentaje de recuperación y
se obtuvieron el punto de fusión y los espectros de RMN de 1H y
13C para identificarla.
130
8.3 Síntesis
Procedimiento general de síntesis de los ácidos N-fenilmaleámicos61,62,63
Se pesaron 2.0 g de las anilinas monosustituidas (3a–d) y aproximadamente 1.1
equivalentes de anhídrido maleico (1), los cuales se disolvieron disueltos por separado
en 20 mL de THF anhidro vía cánula en matraces de bola de 100 mL. La disolución de
1 se adicionó al matraz que contenía la anilina vía cánula, lo cual se llevó a cabo en un
baño de hielo a 0 °C. La reacción se dejó en agitación constante por 16 h a temperatura
ambiente. Después del tiempo de reacción el producto se filtró al vacío con 20 mL de
hexano frío y se caracterizó espectroscópicamente. El producto no sufrió una
purificación posterior.
Ácido N-(4-Carboxifenil)maleámico 5a
NH
OH
O
O
OH
O
12
3 4 1'2'
3'
4'
5'
6'
Para esta reacción se siguió el método general, Se pesaron 2.0 g de
3a (0.0146 mol) y 1.57 g (0.0163 mol) de anhídrido maleico (1); la reacción generó un
polvo amarillo con un 90.3% de rendimiento (3.10 g, 0.0132 mol). P.f. 215–216 °C. Rf
= 0.64 (AcOEt/MeOH 1:1). UV-vis (disolución de MeOH): máx = 291.2 + 1.2 nm, con
= 12202.3 M-1
·cm-1
. IR (pastilla de KBr): max 3316, 3018, 1694, 1626, 1581, 1543,
1176 (cm-1
); 1H RMN (300 MHz, DMSO-d6) (ppm)COO-H (2H,
br)10.61 (1H, s), H-3’ y H-5’ 7.92 (2H, d, 3J = 8.76 Hz), H-2’ y H-6’ 7.74 (2H, d
3J = 8.76 Hz), H-3 6.50 (1H, d,
3J = 11.87 Hz), H-2 6.33 (1H, d,
3J = 11.87 Hz);
13C
RMN (75 MHz, DMSO-d6) (ppm) Ar-C-OOR 167.5, C-1 167.4, C-4 164.2, C-4’
143.2, C-3 132.3, C-3’ y C-5’ 131.0, C-2 130.7, C-1’126.1, C2’ y C-6’ 119.3.
Ácido N-(4-Carboetoxifenil)maleámico 5b
NH
OH
O
O
O
O
12
3 4 1'2'
3'
4'
5'
6' CH3
Para esta reacción se siguió el método general, Se pesaron 2.0 g
de 3b (0.0146 mol) y 1.30 g (0.0163 mol) de anhídrido maleico (1); la reacción produjo
un polvo blanco en un 89.0% de rendimiento (2.84 g, 0.0107 mol). P.f. 177-179 °C. Rf =
0.74 (AcOEt/MeOH 1:1). UV-vis (disolución de MeOH): máx = 294.4 + 1.7 nm, con
131
= 15691.8 M-1
·cm-1
. IR (pastilla de KBr): max 3302, 3213, 3113, 2920, 1709, 1638,
1584, 1550, 1272, 1177, 867, 853, 772 (cm-1
); 1H RMN (300 MHz, DMSO-d6)
(ppm)COO-H 12.00-13.00 (1H, br), N-H 10.63 (1H, s), H-3’ y H-5’ 7.91 (2H, d, 3J =
8.70 Hz), H-2’ y H-6’ 7.75 (2H, d 3J = 8.70 Hz), H-3 6.48 (1H, d,
3J = 12.00 Hz), H-2
6.33 (1H, d, 3J = 12.00 Hz), C-H2 4.27 (2H, q), C-H3 1.29 (3H, t);
13C RMN (75 MHz,
DMSO-d6) (ppm) C-1 167.6, Ar-C-OOR 166.0, C-4 164.4, C-4’ 143.7, C-3 132.2, C-2
131.0, C-3’ y C-5’ 130.9, C-1’ 125.4, C-2’ y C-6’ 119.5, C-H2 61.2, C-H3 14.9.
Ácido N-(3-Carboxifenil)maleámico 5c
NH
OH
O
O
12
3 4 1'2'
3'
4'
5'
6'
OH
O
Se siguió el método general de síntesis. Se pesaron 2.0 g de 3c
(0.0146 mol) y 1.57 g (0.0163 mol) de anhídrido maleico (1), la reacción generó un
producto color beige en 95.8 % de rendimiento (3.05 g, 0.0116 mol). P.f. 215–217 °C.
Rf = 0.53 (AcOEt/MeOH 1:1). UV-vis (disolución de MeOH): máx = 211.2 + 1.6 nm,
con = 29078.8 M-1
·cm-1
. IR (pastilla de KBr): max 3304, 2883, 1713, 1624, 1556,
1555, 1123, 850, 757 (cm-1
); 1H RMN (300 MHz, DMSO-d6) (ppm)COO-H 12.00-
13.00 (2H, br), N-H 10.53 (1H, s), H-2’ 8.29 (1H, s), H-5’ 7.99 (1H, t), H-6’ 7.83 (1H,
d, 3J = 7.92 Hz), H-4’ 7.66 (1H, d,
3J = 7.92 Hz), H-3 6.48 (1H, d,
3J = 12.04 Hz), H-2
6.32 (1H, d, 3J = 12.04 Hz);
13C RMN (75 MHz, DMSO-d6) (ppm) Ar-C-OOR 167.6,
C-1 167.5, C-4 164.0, C-1’ 139.4, C-3 132.2, C-3’ 131.9, C-2 130.8, C-5’ 129.6, C-4’
125.1, C-6’ 124.8, C-2’ 120.7.
Ácido N-(4-Carboetoxifenil)maleámico 5d
NH
OH
O
O
12
3 4 1'2'
3'
4'
5'
6'
O
O
CH3
Se siguió el método general para esta reacción. Se pesaron 2.0 g
de 3d (0.0121 mol) y 1.30 g (0.0133 mol) de anhídrido maleico (1), la reacción generó
un polvo color blanco en 77.7 % de rendimiento (2.47 g, 0.0094 mol). P.f. 155–158 °C.
Rf = 0.75 (AcOEt/MeOH 1:1). UV-vis (disolución de MeOH): máx = 291.2 + 1.2 nm,
con = 12202.3 M-1
·cm-1
. IR (pastilla de KBr): max 3312, 1724, 1683, 1592, 1580,
1289, 1112, 848, 761 (cm-1
); 1H RMN (300 MHz, DMSO-d6) (ppm)COO-H 12.00-
13.00 (1H, br), N-H 10.56 (1H, s), H-2’ 8.28 (1H, s), H-6’ 7.86 (1H, d, 3J = 7.80 Hz),
132
H-4’ 7.66 (1H, d 3J = 7.80 Hz), H-5’ 7.46 (1H, t), H-3 6.47 (1H, d,
3J = 12.00 Hz), H-2
6.32 (1H, d, 3J = 12.00 Hz), C-H2 4.30 (2H, q), C-H3 1.30 (3H, t);
13C RMN (75 MHz,
DMSO-d6) (ppm) C-1 167.7, Ar-C-OOR 166.2, C-4 164.2, C-1’ 139.7, C-3’ 132.2,
C-3 131.4, C-2 131.0, C-5’ 129.9, C-6’ 125.0, C-4’ 124.5, C-2’ 120.5, C-H2 61.8, C-H3
14.5.
Procedimiento general de síntesis de los aductos Diels-Alder derivados de
anhídrido maleico 8, 10a y 1336,39
Se pesaron 5.0 g de anhídrido maleico (1) y colocados en un matraz bola de 100 mL y
disueltos con 20 o 30 mL de dietil éter o AcOEt previamente destilados; por otro lado se
midieron 2.0 equivalentes de los dienos isopreno (2), ciclopentadieno (9) o furano (12),
los cuales se disolvieron por separado en 20.0 mL de dietil éter o AcOEt en una probeta.
La disolución del dieno se adicionó al matraz poco a poco. La reacción se dejó por un
período de 24 h a temperatura ambiente en agitación constante. Una vez terminada la
reacción, el disolvente se evaporó al vacío en el rotaevaporador, se redisolvió en la
mínima cantidad de CH2Cl2 y se precipitó con hexano frío. El producto se filtró a
gravedad y se lavó con 30 mL de hexano. El producto no sufrió una purificación
posterior y se caracterizó espectroscópicamente.
Síntesis de aducto Diels-Alder 8
O
O
O
H3C
1
23
3a4
5
6
7
7a
Se llevó a cabo el método general de síntesis. Se pesaron 5.0 g de 1
(0.0509 mol) y 10.2 mL (0.1019 mol) de 2, la reacción generó un producto color blanco
en 66.0 % de rendimiento (5.60 g, 0.0336 mol). P.f. 58-60 °C. IR (pastilla de KBr): max
3050, 2940, 1860, 1710, 840 (cm-1
); 1H RMN (300 MHz, CDCl3) (ppm)H-
6m), H-7a 3.40 (1H, ddd, 3J = 9.86 Hz,
3J = 7.05 Hz,
3J = 2.94 Hz), H-3a
3.33 (1H, ddd, 3J = 9.86 Hz,
3J = 7.27 Hz,
3J = 2.66 Hz), H-7 2.58 (1H, ddd,
3J = 16.12
Hz, 3J = 6.82 Hz,
3J = 2.94 Hz), H-4 2.50 (1H, dd,
3J = 15.60 Hz,
3J = 2.66 Hz), H-4
2.28 (1H, m), H-7 2.23 (1H, m), C-H3 1.76 (3H, s); 13
C RMN (75 MHz, DMSO-d6)
(ppm) C-3 172.2, C-1 172.0, C-5 134.3, C-6 117.8, C-7a 37.7, C-3a 37.1, C-H3 26.1, C-
7 21.8, C-4 21.2.
133
Síntesis de aducto Diels-Alder 10a
O
O
O
Ha Hb
12
33a
4
5
6
7
8
7a
Se llevó a cabo el método general de síntesis. Se pesaron 5.0 g de 1
(0.0509 mol) y 8.5 mL (0.1019 mol) de 9, la reacción generó un producto color blanco
en 59.0 % de rendimiento (4.93 g, 0.0300 mol). P.f. 155-157 °C. IR (pastilla de KBr):
max 3020, 2970, 1855, 1690, 1430 (cm-1
); 1H RMN (300 MHz, CDCl3) (ppm) H-5 y
H-6 6.32 (2H, dd, 3J = 1.95 Hz), H7a 3.59 (2H, dd
3J = 3.15 Hz,
3J = 1.65Hz), H-4 3.51
(2H, ddd, 3J = 6.75 Hz,
3J = 3.30 Hz,
3J = 1.65 Hz), H-8a 1.79 (1H, dt,
3J = 8.70 Hz,
3J
= 1.65 Hz), H-8b 1.58 (1H, dm, 3J = 9.00 Hz);
13C RMN (75 MHz, DMSO-d6) (ppm)
C-1 y C-2 171.5, C-5 y C-6 135.8, C-7a 53.0, C-7 47.3, C-8 46.3.
Síntesis de aducto Diels-Alder 13
O O
O
O
1
23
3a
4
5
6
7
7a
Se llevó a cabo el método general de síntesis. Se pesaron 5.0 g de 1
(0.0509 mol) y 7.5 mL (0.1019 mol) de 12, la reacción generó un producto color blanco
en 51.4 % de rendimiento (4.35 g, 0.0262 mol). P.f. 110-114 °C. Rf = 0.80
(AcOEt/MeOH 1:1). IR (pastilla de KBr): max 3030, 2970, 1860, 1790, 1220, 1210 (cm-
1);
1H RMN (300 MHz, CDCl3) (ppm) H-5 y H-6 6.59 (2H, d,
3J = 0.9 Hz), H-4 y H-7
5.57 (2H, d, 3J = 0.9 Hz), H-3a y H-7a 3.19 (2H, s);
13C RMN (75 MHz, DMSO-d6)
(ppm) C-1 y C-3 167.6, C-5 y C-6 134.7, C-4 y C-7 79.9, C-3a y C-7a 46.4.
134
Procedimiento general de preparación de los aductos Diels-Alder 4a-d a través de
una reacción multicomponente (MCR)
Se pesaron 250 mg de las anilinas (3a–d), 1 equivalente de anhídrido maleico (1) y 2
equivalentes de isopreno (2), los cuales se colocaron en un tubo de presión de 20 mL
con 9.0 mL de tolueno como disolvente. El tubo se cerró y se introdujo en un baño de
arena a 160°C, en agitación constante por 96 horas. Después del tiempo de reacción el
producto se precipitó con hexano frío, se filtró a gravedad y se lavó 2 veces con 20 mL
de hexano a temperatura ambiente. El producto se purificó y caracterizó
espectroscópicamente.
(3aR*,7aS*)-2-(4-Carboxifenil)-5-metil-1,3,3a,4,7,7a-hexahidroisoindol-1,3-diona
4a (MCR).
12
3
4
1'
2' 3'
4'
5'6'
N
H3C
O
O
OH
O
5
6
7
7a
3a
Se siguió el método general, y se pesaron 250 mg (1.823 mmol)
de 3a, 178.8 mg (1.823 mmol) de anhídrido maleico 1 y 0.37 mL (3.646 mmol) de 2; el
producto se recristalizó de una mezcla de CH2Cl2/hexano fría, dicho compuesto fue de
color blanco con un rendimiento de 90.7 % (471.7 mg, 1.653 mmol). P.f. 178–180°C. El
Rf = 0.15 (hexano/AcOEt 6:4). UV-vis (disolución de CH2Cl2): máx = 245.3 + 0.8 nm,
con = 13765.8 M-1
·cm-1
. IR (pastilla de KBr): max 3437, 2935, 1712, 1608, 1456, 791
(cm-1
); 1H RMN (500 MHz, CDCl3) (ppm)COO-H 12.00-13.00 (1H, br), H-3’ y H-5’
(2H, d, 3J = 8.50 Hz), H-2’ y H-6’ 7.42 (2H, d,
3J = 8.50 Hz), H-6 5.63 (1H, br), H-
7a 3.30 (1H, ddd, 3J = 9.51 Hz,
3J = 6.68 Hz,
3J = 2.50 Hz), H-3a 3.25 (1H, ddd,
3J =
9.51 Hz, 3J = 7.50 Hz,
3J = 2.50 Hz), H-7 2.66 (1H, ddd,
2J = 15.50 Hz,
3J = 6.68 Hz,
3J = 2.50 Hz), H-4 2.60 (1H, dd,
2J = 15.50 Hz,
3J = 2.50 Hz), H-4 2.33 (1H, m), H-7
2.28 (1H, m), C-H3 1.78 (3H, s); 13
C RMN (125 MHz, CDCl3) (ppm) C-1 179.2, C-3
179.0, C-OOH 171.2, C-4’ 137.0, C-1’ 136.8, C-3’ y C-5’ 131.2, C-5 129.3, C-2’ y C-6’
126.5, C-6 120.4, C-7a 40.0, C-3a 39.6, C-4 29.1, C-7 24.7, C-H3 23.7; HRMS (EI) m/e
calculada para C16H15NO4 [M+] 285.1001, encontrada 285.0978.
135
(3aR*,7aS*)-2-(4-Carboetoxifenil)-5-metil-1,3,3a,4,7,7a-hexahidroisoindol-1,3-
diona 4b (MCR).
1
23
4
1'
2' 3'
4'
5'6'
N
H3C
O
O
O
O
5
6
7
7a
CH3
3a
Se siguió el método general de síntesis, y se pesaron 250 mg
(1.513 mmol) de 3b, 148.4 mg (1.513 mmol) de anhídrido maleico (1) y 0.30 mL (3.027
mmol) de 2; el producto se recristalizó de una mezcla de CH2Cl2/hexano fría, y se
obtuvo un polvo color blanco con rendimiento de 71.9 % (341.0 mg, 1.088 mmol). P.f.
139–140 °C. El Rf = 0.55 (hexano/AcOEt 6:4). UV-vis (disolución de CH2Cl2): máx =
243.4 + 0.1 nm, con = 14641.8 M-1
·cm-1
. IR (pastilla de KBr): max 3450, 2940, 1709,
1455, 1609, 1279, 755 (cm-1
); 1H RMN (500 MHz, CDCl3) (ppm)H-3’ y H-5’
(2H, d, 3J = 8.75 Hz), H-2’ y H-6’ 7.36 (2H, d,
3J = 8.75 Hz), H-6 5.61 (1H, br), C-H2
4.38 (2H, q), H-7a 3.28 (1H, ddd, 3J = 9.38 Hz,
3J = 6.62 Hz,
3J = 2.50 Hz), H-3a 3.21
(1H, ddd, 3J = 9.38 Hz,
3J = 7.25 Hz,
3J = 2.50 Hz), H-7 2.64 (1H, ddd,
2J = 15.50 Hz,
3J = 6.62 Hz,
3J = 2.50 Hz), H-4 2.58 (1H, dd,
2J = 15.50 Hz,
3J = 2.50 Hz), H-4 2.35
(1H, m), H-7 2.28 (1H, m), C-H3 1.77 (3H, s), C-H3 1.39 (3H, t); 13
C RMN (125 MHz,
CDCl3) (ppm) C-1 180.0, C-3 178.2, C-OOR 166.0, C-4’ 136.8, C-1’ 136.2, C-3’ y C-
5’ 130.6, C-5 130.5, C-6’ 126.3, C-6 120.4, C-H2 61.4, C-7a 40.0, C-3a 39.5, C-4 29.1,
C-7 24.7, C-H3 23.7, C-H3 14.5; HRMS (EI) m/e calculada para C18H19NO4 [M+]
313.1314, encontrada 313.1324.
(3aR*,7aS*)-2-(3-carboxifenil)-5-metil-1,3,3a,4,7,7a-hexahidroisoindol-1,3-diona 4c
(MCR).
1
2
3
4
1'
2' 3'
4'
5'6'
N
H3C
O
O
5
6
7
7a
OH
O
3a
De acuerdo al general, se pesaron 250 mg (1.823 mmol) de 3c,
178.8 mg (1.823 mmol) de anhídrido maleico (1) y 0.37 mL (3.646 mmol) de 2; el
producto se recristalizó de una mezcla de CH2Cl2/hexano fría, y se obtuvo un polvo
color blanco con rendimiento de 76.9 % (399.9 mg, 1.402 mmol). P.f. 197–199 °C. El
Rf = 0.15 (hexano/AcOEt 6:4). UV-vis (disolución de CH2Cl2): máx = 234.4 + 1.5 nm,
con = 10199.5 M-1
·cm-1
. IR (pastilla de KBr): max 3451, 2929, 1706, 1454, 780, 750,
720 (cm-1
); 1H RMN (500 MHz, CDCl3) (ppm)COO-H 12.00-13.00 (1H, br), H-4’
(1H, d, 3J = 7.50 Hz), H-2’ 8.01 (1H, s), H-5’ 7.58 (1H, t), H-6’ 7.51 (1H, d,
3J =
136
8.55 Hz), H-6 5.65 (1H, br), H-7a 3.32 (1H, ddd, 3J = 8.20 Hz,
3J = 7.25 Hz,
3J = 2.62
Hz), H-3a 3.26 (1H, ddd, 3J = 8.10 Hz,
3J = 7.94 Hz,
3J = 2.62 Hz), H-7 2.67 (1H, ddd,
2J = 15.38 Hz,
3J = 7.25 Hz,
3J = 2.25 Hz), H-4 2.61 (1H, dd,
2J = 15.38 Hz,
3J = 7.94
Hz), H-4 2.34 (1H, dd, 2J = 15.50 Hz,
3J = 7.50 Hz), H-7 2.30 (1H, m), C-H3 1.80
(3H, s); 13
C RMN (125 MHz, CDCl3) (ppm) C-1 179.5, C-3 179.3, C-OOH 171.0, C-
1’ 136.8, C-3’ 132.7, C-5’ 131.9, C-5 130.8, C-4’ 130.4, C-6’ 129.6, C-2’ 128.4, C-6
120.4, C-7a 40.0, C-3a 39.6, C-4 29.1, C-7 24.7, C-H3 23.7; HRMS (EI) m/e calculada
para C16H15NO4 [M+] 235.1001, encontrada 285.1001.
(3aR*,7aS*)-2-(3-Carboetoxifenil)-5-metil-1,3,3a,4,7,7a-hexahidroisoindol-1,3-
diona 4d (MCR).
12
3
4
1'
2' 3'
4'
5'6'
N
H3C
O
O
5
6
7
7a
O
O
CH3
3a
Siguiendo el método general se pesaron 250 mg (1.513 mmol)
de 3d, 148.4 mg (1.513 mmol) de anhídrido maleico (1) y 0.30 mL (3.027 mmol) de 2;
el producto se disolvió con CH2Cl2 y se filtró por percolación con gel de sílice. El
disolvente se evaporó al vacío en el rotaevaporador, obteniendo un líquido translúcido
color amarillo en un 96.2 % de rendimiento (456.2 mg, 1.456 mmol). El Rf = 0.54
(hexano/AcOEt 6:4). UV-vis (disolución de CH2Cl2): máx = 231.3 + 1.4 nm, con =
10965.1 M-1
·cm-1
. IR: (disolución de CHCl3) max 3451, 2938, 1712, 1277, 1450, 754,
689 (cm-1
); 1H RMN (500 MHz, CDCl3) (ppm)H-4’ (1H, d,
3J = 9.15 Hz), H-2’
7.86 (1H, s), H-5’ 7.45 (1H, t), H-6’ 7.36 (1H, d, 3J = 9.15 Hz), H-6 5.54 (1H, br), C-H2
4.29 (2H, q), H-7a 3.18 (1H, ddd, 3J = 9.38 Hz,
3J = 6.80 Hz,
3J = 2.50 Hz), H-3a 3.12
(1H, ddd, 3J = 9.38 Hz,
3J = 6.80 Hz,
3J = 2.50 Hz), H-7 2.54 (1H, ddd,
2J = 15.62 Hz,
3J = 6.80 Hz,
3J = 2.50 Hz), H-4 2.48 (1H, dd,
2J = 15.50 Hz,
3J = 2.50 Hz), H-4 2.20
(1H, dd, 2J = 15.50 Hz,
3J = 7.13 Hz), H-7 2.16 (1H, m), C-H3 1.69 (3H, s), C-H3 1.30
(3H, t); 13
C RMN (125 MHz, CDCl3) (ppm) C-1 179.3, C-3 179.2, C-OOR 163.7, C-
1’ 136.7, C-3’ 132.6, C-5 131.8, C-5’ 131.0, C-4’ 129.6, C-6’ 129.3, C-2’ 127.8, C-6
120.4, C-H2 61.5, C-7a 39.9, C-3a 39.5, C-4 29.0, C-7 24.6, C-H3 23.6, C-H3 14.5;
HRMS (EI) m/e calculada para C18H19NO4 [M+] 313.1314, encontrada 313.1324.
137
Procedimiento general de preparación de los aductos Diels-Alder 4a-d a partir de
los ácidos N-fenilmaleámicos 5a-d.
Se pesaron 250 mg del ácido N-fenilmaleámico correspondiente (5a–d) y adicionados
2 equivalentes de isopreno (2) y 9.0 mL de tolueno, los cuales fueron depositados en un
tubo de presión ACE de 20 mL. El tubo fue cerrado y se introdujo en un baño de arena a
160°C en agitación constante por un período de 96 h. Después del tiempo de reacción,
el producto fue precipitado con hexano frío y filtrado a gravedad y lavado 2 veces con
20 mL de hexano a temperatura ambiente. El producto fue purificado y caracterizado
espectroscópicamente.
Aducto Diels-Alder 4a. Siguiendo el método general se pesaron 250 mg (1.063 mmol)
de 5a y 0.21 mL (2.13 mmol) de 2; el producto fue recristalizado de una mezcla de
CH2Cl2/hexano fría, obteniéndose un polvo color blanco en un 76.8 % de rendimiento
(232.9 mg, 0.816 mmol).
Aducto Diels-Alder 4b. Siguiendo el método general se pesaron 250 mg (0.950 mmol)
de 5b y 0.19 mL (1.90 mmol) de 2; el producto fue recristalizado de una mezcla de
CH2Cl2/hexano fría, obteniéndose un polvo color blanco con un rendimiento del 82.7 %
(246.2 mg, 0.786 mmol).
Aducto Diels Alder 4c. Siguiendo el método general se pesaron 250 mg (1.063 mmol)
de 5c y 0.21 mL (2.13 mmol) de 2; el producto fue recristalizado de una mezcla de
CH2Cl2/hexano fría, obteniéndose un polvo color beige en un 90.2 % de rendimiento
(273.5 mg, 0.959 mmol).
Aducto Diels-Alder 4d. Siguiendo el método general se pesaron 250 mg (0.950 mmol)
de 5d y 0.19 mL (1.90 mmol) de 2; el producto fue disuelto con CH2Cl2 y filtrado por
percolación con gel de sílice. El disolvente fue evaporado al vacío en el rotaevaporador
obteniéndose un líquido translúcido color amarillo con un rendimiento de 64.2 % (231.2
mg, 0.738 mmol).
Método general de preparación de los aductos Diels-Alder 6a-d, 7a-d, 11a-d y 14a-
d a partir de los aductos 8, 10a y 13
Fue pesado 1 equivalente de las anilinas monosustituidas (3a–d) correspondientes y
aproximadamente 1.1 equivalentes de los aductos 8, 10a o 13 correspondiente, los
cuales fueron disueltos por separado en 20.0 mL de THF anhidro vía cánula en matraces
de bola de 100 mL. El matraz que contenía la disolución a los aductos (8, 10a o 13) fue
138
adicionada al matraz que contenía la anilina correspondiente vía cánula. La adición del
aducto a la anilina fue hecha en un baño de hielo a 0 °C. La reacción se dejó en
agitación constante por 16 h a temperatura ambiente. Después del tiempo de reacción el
producto fue filtrado al vacío con 20 mL de hexano frío y fue caracterizado
espectroscópicamente. El producto no sufrió una purificación posterior.
Mezcla de regioisómeros de los aductos Diels-Alder 6a y 7a
H3C
NH
OH
O
O
OH
O
1
23
3a4
5
67a
1'2'
3'
4'
5'
6'
7
Para esta reacción se siguió el método general. Se pesaron
0.83 g de 3a (6.054 mmol) y 1.10 g (6.620 mmol) del aducto (8); la reacción generó un
polvo blanco con un 81.6% de rendimiento (1.49 g, 4.91 mmol). P.f. 182-184 °C. El Rf
= 0.84 (AcOEt/MeOH 1:1). IR (pastilla de KBr): max 3420, 3200, 2990, 1690, 1595,
1530, 1170, 850, 780 (cm-1
); 1H RMN (300 MHz, DMSO-d6) (ppm) COO-H 11.50-
12.50 (4H, br), N-H 10.09 (1H, s), H-2 10.07 (1H, s), H-3’ y H-7’ 7.86 (2H, d, 3J = 8.70
Hz), H-3’ y H-7’ 7.85 (2H, d, 3J = 8.70 Hz), H-2’ y H-6’ 7.67 (2H, d,
3J = 8.70 Hz), H-
2’ y H6’ 7.66 (2H, d 3J = 9.00 Hz), H-5 o H-6 5.35 (1H, br), H-5 o H-6 5.31 (1H, br),
H7a 3.03 (2H, m), H3a 2.87 (2H, m), H4 y H7 2.12-2.57 (8H, m), C-H3 1.62 (6H, br);
13C RMN (75 MHz, DMSO-d6) (ppm) C-OOH 177.7, C-OOH 177.6, C-1 175.64, C-1
175.56, C-3 169.9, C-1’ 146.4, C-5 o C-6 135.3, C-5 o C-6 133.8, C-3’ 133.2, C-4’
127.53, C-4’ 127.49, C-5 o C-6 122.4, C-2’ 121.23, C-2’ 121.16, C-7a 43.4, C-4 o C-7
3 3.9, C-4 o C-7 33.2, C-4 o C-7 29.7, C-4 o C-7 28.8, C-H3 26.1.
Mezcla de regioisómeros de los aductos Diels-Alder 6b y 7b
H3C
NH
OH
O
O
O
O
1
23
3a4
5
6
77a
1'2'
3'
4'
5'
6' CH3
Para esta reacción se siguió el método general. Se pesaron
1.01 g de 3b (6.140 mmol) y 1.10 g (6.620 mmol) del aducto (8); la reacción generó un
polvo blanco con un 42.5% de rendimiento (0.85 g, 2.56 mmol). P.f. 110-112 °C. El Rf
= 0.90 (AcOEt/MeOH 1:1). IR (pastilla de KBr): max 3415, 3360, 2910, 1710, 1690,
1600, 1280, 1240, 1170, 870, 780 (cm-1
); 1H RMN (300 MHz, DMSO-d6) (ppm)
COO-H 11.50-12.50 (2H, br), H-2 10.12 (1H, s), H-2 10.10 (1H, s), H-3’ y H-5’ 7.88
(2H, d, 3J = 8.70 Hz), H3’ y H-5’ 7.87 (2H, d,
3J = 9.00 Hz), H-2’ y H-6’ 7.71 (2H, d,
3J
139
= 9.00 Hz), H-2’ y H-6’ 7.70 (2H, d, 3J = 9.00 Hz), H-5 o H-6 5.36 (1H, br), H-5 o H-6
5.31 (1H, br), C-H2 4.26 (4H, q, 3J = 7.05 Hz), H-7a 3.05 (2H, m), H-3a 2.88 (2H, m),
H4 y H7 2.18-2.59 (8H, m), C-H3 1.62 (6H, br), C-H3 1.29 (6H, t, 3J = 7.20 Hz);
13C
RMN (75 MHz, DMSO-d6) (ppm) C-OOR 175.5, C-OOR 175.4, C-1 173.5, C-1
173.4, C-3 166.1, C-1’ 144.5, C-5 o C-6 133.1, C-5 o C-7 131.7, C-3’ y C-5’ 130.3, C-
4’ 124.44, C-4’ 124.40, C-5 o C-6 120.3, C-2’ y C-6’ 119.1, C-2’ y C-6’ 119.0, C-H2
61.1, C-7a 41.3, C-3a 39.4, C-4 y C-7 31.6, C-4 y C-7 31.1, C-4 y C-7 27.5, C-4 y C-7
26.7, C-H3 24.0, C-H3 14.9.
Mezcla de regioisómeros de los aductos Diels-Alder 6c y 7c
H3C
NH
OH
O
O
OH
O1
23
3a4
6
5
77a
1'2'
3'
4'
5'
6'
Para esta reacción se siguió el método general. Se pesaron 0.84
g de 3c (6.140 mmol) y 1.10 g (6.620 mmol) del aducto (8); la reacción generó un polvo
color café claro con un rendimiento de 99.4% (1.81 g, 5.97 mmol). P.f. 144-146 °C. El
Rf = 0.49 (AcOEt/MeOH 1:1). IR (pastilla de KBr): max 3400, 3295, 2970, 1710, 1590,
1550, 1180, 820, 800, 775, 695 (cm-1
); 1H RMN (300 MHz, DMSO-d6) (ppm) COO-
H 11.50-12.50 (4H, br), H-2 9.94 (1H,s), H-2 9.92 (1H, s), H-2’ 8.24 (2H, br), H-6’
7.59 (2H, d, 3J = 8.10 Hz), H-6’ 7.58 (2H, d,
3J = 8.10 Hz), H-5’ 7.39 (2H, t,
3J = 7.90
Hz), H-5’ 7.38 (2H, t, 3J = 6.90 Hz), H-4’ 7.27-7.89 (2H, m), H-5 o H-6 5.36 (1H, br),
H-5 o H-6 5.32 (1H, br), H-7a 3.01 (2H, m), H-3a 2.87 (2H, m), H-4 y H-7 2.12-2.58
(8H, m), C-H3 1.63 (3H, s); 13
C RMN (75 MHz, DMSO-d6) (ppm) C-OOH 175.53, C-
OOH 175.48, C-1 173.1, C-1 173.0, C-3 167.9, C-1’ 140.3, C-5 o C-6 133.1, C-5 o C-6
131.8, C-3’ 129.5, C-5’ 124.4, C-4’ 123.94, C-4’ 123.87, C-6’ 120.7, C-6’ 120.6, C-2’
119.0, C-7a 41.2, C-3a 39.4, C-4 y C-7 31.6, C-4 y C-7 31.1, C-4 y C-7 26.7, C-4 y C-7
27.5, C-H3 24.0.
Mezcla de regioisómeros de los aductos Diels-Alder 6d y 7d
H3C
NH
OH
O
O
O
O1
23
3a4
6
5
77a
1'2'
3'
4'
5'
6'
CH3
Para esta reacción se siguió el método general. Se midieron
1.40 mL de 3d (0.0091 mol) y 1.60 g (0.0096 mol) del aducto (8); la reacción generó un
líquido amarillo ámbar con un rendimiento de 89.6 % (2.69 g, 8.11 mmol). El Rf = 0.89
140
(AcOEt/MeOH 1:1). IR (pastilla de KBr): max 3461, 3285, 3102, 2974, 1692, 1653,
1549, 1243, 762, 753, 705 (cm-1
); 1H RMN (300 MHz, DMSO-d6) (ppm) COO-H
11.50-12.50 (2H, br), H-2 9.97 (1H, s); H-2 9.96 (1H, s); H-2’ 8.25 (1H, s); H-2’ 8.24
(1H, s); H-5’ 7.79 (1H, t); H-6’ 7.66 (1H, d, 3J = 7.80 Hz); H-6’ 7.60 (1H, d,
3J = 7.50
Hz); H-5 o H-6 5.74 (2H, br); C-H2 4.33 (2H, q, 3J = 6.90 Hz); C-H2 4.25 (2H, q,
3J =
7.20 Hz); H-7a 3.02 (2H, m); H-3a 2.84 (2H, m); H-4 y H-7 2.12-2.51 (8H, m); C-H3
1.63 (3H, s); C-H3 1.60 (3H, s); C-H3 1.31 (3H, t, 3J = 7.20 Hz); C-H3 1.28 (3H, t,
3J =
6.90 Hz); 13
C RMN (75 MHz, DMSO-d6) (ppm) C-OOR 179.9, C-OOR 179-8, C-1
175.5, C-1 175.3, C-3 166.9, C-1’ 140.9, C-5 o C-6 133.5, C-5 o C-6 131.3, C-3’ 129.7,
C-3’ 129.5, C-4’ 128.0, C-5’ 124.1, C-6’ 120.7, C-6’ 120.2, C-2’ 119.9, C-2’ 118.9, C-
H2 61.0, C-7a 39.9, C-3a 39.3, c-4 y C-7 31.3, C-4 y C-7 31.0, C-4 y C-7 29.1, C-4 y C-
7 26.5, C-H3 24.5, C-H3 23.9, C-H3 14.9.
Aducto Diels-Alder 11a
NH
OH
O
O
OH
O
1
23
4
5
6
1'2'
3'
4'
5'
6'
3a
77a
Ha Hb8
Para esta reacción se siguió el método general. Se pesaron 0.84 g
de 3a (6.140 mmol) y 1.10 g (6.700 mmol) del aducto (10a); la reacción generó un
polvo color blanco con un rendimiento de 87.2% (1.60 g, 5.31 mmol). P.f. 175-176 °C.
El Rf = 0.56 (AcOEt/MeOH 1:1). IR (pastilla de KBr): max 3420, 3270, 3090, 2960,
1710, 1695, 1595, 1530, 1170, 790, 730 (cm-1
); 1H RMN (500 MHz, DMSO-d6)
(ppm)COO-H 11.50-12.50 (2H, br), H-2 10.22 (1H, br), H-3’ y H-5’ 7.83 (2H, d, 3J =
8.85 Hz), H-2’ y H-6’ 7.60 (2H, d, 3J = 8.85 Hz), H-6 6.17 (1H, dd,
3J = 2.85 Hz,
3J =
5.55 Hz), H-5 6.03 (1H, dd, 3J = 2.85 Hz,
3J = 5.25 Hz), H-7a 3.37 (1H, dd,
3J = 3.00
Hz, 3J = 10.20 Hz), H-3a 3.23 (1H, dd,
3J = 3.30 Hz,
3J = 10.20 Hz), H-7 3.06 (1H, br),
H-4 3.00 (1H, br) H-8b 1.33 (1H, d, 3J = 7.35 Hz), H-8a 1.25 (1H, d,
3J = 9.75 Hz);
13C
RMN (125 MHz, DMSO-d6) (ppm) C-OOH 173.7, C-1 171.0, C-3 167.3, C-1’ 143.8,
C-6 135.2, C-5 134.3, C-3’ y C-5’ 130.5, C-4’ 124.7, C-2’ y C-6’ 118.4, C-7a 49.5, C-
3a 49.1, C-7 48.4, C-4 47.0, C-8 45.8.
141
Aducto Diels-Alder 11b
NH
OH
O
O
O
O
1
2
3
4
5
6
1'2'
3'
4'
5'
6' CH3
7
3a
7a
Ha Hb8
Para esta reacción se siguió el método general. Se pesaron
1.02 g de 3b (6.215 mmol) y 1.10 g (6.700 mmol) del aducto (10a); la reacción generó
un polvo color blanco con un rendimiento de 79.3% (1.59 g, 4.82 mmol). P.f. 158-160
°C. El Rf = 0.92 (AcOEt/MeOH 1:1). IR (pastilla de KBr): max 3420, 3210, 3100, 2995,
1710, 1700, 1600, 1545, 1190, 780, 730, 690 (cm-1
); 1H RMN (500 MHz, DMSO-d6)
(ppm) COO-H 11.50-12.50 (1H, br), H-2 10.25 (1H, br), H-3’ y H-5’ 7.85 (2H, d, 3J=
8.70 Hz), H-2’ y H-6’ 7.63 (2H, d, 3J = 8.70 Hz), H-6 6.17 (1H, dd,
3J = 2.85 Hz,
3J =
5.40 Hz), H-5 6.04 (1H, dd, 3J = 2.70 Hz,
3J = 5.40 Hz), C-H2 4.24 (2H, q,
3J = 6.90
Hz), H-7a 3.37 (1H, dd, 3J = 3.00 Hz,
3J = 10.20 Hz), H-3a 3.23 (1H, dd,
3J = 3.30 Hz,
3J = 10.35 Hz), H-7 3.06 (1H, br), H-4 3.00 (1H, br), H-8a 1.34 (1H, d,
3J = 9.00 Hz),
C-H3 1.27 (3H, t, 3J = 6.90 Hz);
13C RMN (125 MHz, DMSO-d6) (ppm) C-OOH
174.1, C-1 171.5, C-3 166.2, C-1’ 144.5, C-6 135.6, C-5 134.8, C-3’ y C-5’ 130.8, C-4’
124.2, C-2’ y C-6’ 118.9, C-H2 61.2, C-7a 49.9, C-3a 49.5, C-7 48.8, C-4 47.4, C-8
46.2, C-H3 14.9.
Aducto Diels-Alder 11c
NH
OH
O
O
1
23
4
5
6
1'2'
3'
4'
5'
6'
OH
O
7
3a
7a
Ha Hb8
Para esta reacción se siguió el método general. Se pesaron 0.85
g de 3c (6.215 mmol) y 1.10 g (6.700 mmol) del aducto (10a); la reacción generó un
polvo color café con un rendimiento de 91.4% (1.68 g, 5.56 mmol). P.f. 160-161 °C. El
Rf = 0.41 (AcOEt/MeOH 1:1). IR (pastilla de KBr): max 3430, 3320, 3080, 2985, 1710,
1695, 1590, 1545, 1190, 780, 730, 690 (cm-1
); 1H RMN (500 MHz, DMSO-d6) (ppm)
COO-H 11.50-12.50 (2H, br), H-2 10.08 (1H, br), H-2’ 8.21 (1H, s), H-4’ 7.65 (1H, d,
3J = 8.10 Hz), H-6’ 7.56 (1H, d,
3J = 7.80 Hz), H-5’ 7.36 (1H, t,
3J = 8.10 Hz), H-6 6.17
(1H, dd, 3J = 2.85 Hz,
3J = 5.55 Hz), H-5 6.03 (1H, dd,
3J = 2.85 Hz,
3J = 5.25 Hz), H-
7a 3.35 (1H, dd, 3J = 3.15 Hz,
3J = 10.05 Hz), H-3a 3.22 (1H, dd,
3J = 3.30 Hz,
3J =
10.20 Hz), H-7 3.05 (1H, br), H-4 2.99 (1H, br), H-8a 1.33 (1H, d, 3J = 7.80 Hz), H-8b
1.25 (1H, d, 8.70 Hz); 13
C RMN (125 MHz, DMSO-d6) (ppm) C-OOH 176.4, C-1
142
173.3, C-3 170.2, C-1’ 142.5, C-6 137.7, C-5 136.9, C-3’ 133.9, C-5’ 131.7, C-4’ 126.4,
C-6’ 125.9, C-2’ 122.6, C-7a 52.0, C-3a 51.6, C-7 51.0, C-4 49.6, C-8 48.3.
Aducto Diels-Alder 11d
NH
OH
O
O
1
23
4
5
6
1'2'
3'
4'
5'
6'
O
O
CH3
77a
3a
Ha Hb8
Para esta reacción se siguió el método general. Se midieron
0.93 mL de 3d (6.091 mmol) y 1.10 g (6.700 mmol) del aducto (10a); la reacción
generó un polvo color blanco con un rendimiento de 58.9% (1.18 g, 3.59 mmol). P.f.
132-134 °C. El Rf = 0.93 (AcOEt/MeOH 1:1). IR (pastilla de KBr): max 3350, 2990,
1710, 1690, 1590, 1525, 1290, 1220, 1190, 750, 730, 695, 620 (cm-1
); 1H RMN (500
MHz, DMSO-d6) (ppm) COO-H 11.50-12.50 (1H, br), H-2 10.11 (1H, br), H-2’ 8.22
(1H, s), H-4’ 7.68 (1H, d, 3J = 8.55 Hz), H-6’ 7.57 (1H, d,
3J = 7.05 Hz), H-5’ 7.39 (1H,
t, 3J = 7.95 Hz), H-6 6.17 (1H, dd,
3J = 2.85 Hz,
3J = 5.55 Hz), H-5 6.04 (1H, dd,
3J =
2.70 Hz, 3J = 5.40 Hz), C-H2 4.28 (2H, q,
3J = 6.90 Hz), H-7a 3.35 (1H, dd,
3J = 3.30
Hz, 3J = 10.20 Hz), H-3a 3.22 (1H, dd,
3J = 3.30 Hz,
3J = 10.20 Hz), H-4 3.06 (1H, br),
H-7 3.05 (1H, br), C-H3 1.28 (3H, s, 3J = 6.90 Hz); 13
C RMN (125 MHz, DMSO-d6)
(ppm) C-OOR 176.4, C-1 173.4, C-3 168.6, C-1’ 142.7, C-6 137.7, C-5 136.9, C-3’
133.0, C-5’ 131.9, C-4’ 127.5, C-6’ 126.2, C-2’ 122.1, C-H2 63.7, C-7a 52.0, C-3a 51.6,
C-7 51.0, C-4 49.5, C-8 48.4, C-H3 17.0.
Aducto Diels-Alder 14a
O
NH
OH
O
O
OH
O
1
23
4
5
6
1'2'
3'
4'
5'
6'
3a
77a
Para esta reacción se siguió el método general. Se pesaron 0.83 g
de 3a (6.080 mmol) y 1.10 g (6.620 mmol) del aducto (13); la reacción generó un polvo
color rosa claro con un rendimiento de 57.5% (1.05 g, 3.46 mmol). P.f. 196-198 °C. El
Rf = 0.16 (AcOEt/MeOH 1:1). IR (pastilla de KBr): max 3300, 2990, 1710, 1680, 1595,
1520, 1315, 1180, 860, 820, 785 (cm-1
); 1H RMN (500 MHz, DMSO-d6) (ppm)COO-
H 11.50-12.50 (2H, br), H-2 10.15 (1H, br), H-3’ y H-5’ 7.86 (2H, d, 3J = 8.70 Hz), H-
2’ y H-6’ 7.63 (2H, d, 3J = 8.70 Hz), H-5 6.49 (1H, dd,
3J = 3.50 Hz,
3J = 2.50 Hz), H-6
6.47, (1H, dd, 3J = 3.00 Hz,
3J = 2.00 Hz), H-7 5.24 (1H, s), H-4 5.03 (1H, s), H-7a 2.82
(1H, d, 3J = 9.60 Hz), H-3a 2.70 (1H, d,
3J = 9.60 Hz);
13C RMN (125 MHz, DMSO-d6)
143
(ppm) C-OOH 173.0, C-1 170.5, C-3 167.3, C-1’ 143.5, C-6 137.7, C-5 136.9, C-3’ y
C-5’ 130.6, C-4’ 125.1, C-2’ y C-6’ 119.7, C-7 80.7, C-4 79.4, C-7a 47.8, C-3a 47.1.
Aducto Diels-Alder 14b
NH
OH
O
O
O
O
1
2
3
4
5
6
1'2'
3'
4'
5'
6' CH3
O
7
3a
7a
Para esta reacción se siguió el método general. Se pesaron
1.01 g de 3b (6.142 mmol) y 1.10 g (6.620 mmol) del aducto (13); la reacción generó un
polvo color amarillo claro con un rendimiento de 75.5% (1.51 g, 4.54 mmol). P.f. 182-
184 °C. El Rf = 0.43 (AcOEt/MeOH 1:1). IR (pastilla de KBr): max 3420, 2940, 1710,
1640, 1610, 1520, 1290, 1270, 1180, 870, 830, 780 (cm-1
); 1H RMN (500 MHz, DMSO-
d6) (ppm)COO-H 11.50-12.50 (1H, br), H-2 10.09 (1H, br), H-3’ y H-5’ 7.88 (2H, d,
3J = 8.70 Hz), H-2’ y H-6’ 7.65 (2H, d,
3J = 8.70 Hz), H-5 y H-6 6.48 (2H, br), H-7 5.12
(1H, s), H-4 5.03 (1H, s), C-H2 4.27 (2H, q, 3J = 7.35 Hz), H-7a 2.82 (1H, d,
3J = 9.30
Hz), H-3a 2.70 (1H, d, 3J = 9.30 Hz), C-H3 1.28 (3H, t,
3J = 7.35 Hz);
13C RMN (125
MHz, DMSO-d6) (ppm) C-OOR 173.0, C-1 170.6, C-3 165.7, C-1’ 143.8, C-6 137.3,
C-5 136.8, C-3’ 130.4, C-4’ 124.2, C-2’ 118.7, C-7 80.7, C-4 79.5, C-H2 60.8, C-7a
47.7, C-3a 47.2, C-H3 14.4.
144
Aducto Diels-Alder 14c
O
NH
OH
O
O
1
23
4
5
6
1'2'
3'
4'
5'
6'
OH
O
7
3a
7a
Para esta reacción se siguió el método general. Se pesaron 0.84 g
de 3c (6.142 mmol) y 1.10 g (6.620 mmol) del aducto (13); la reacción generó un polvo
color café claro con un rendimiento de 87.8% (1.60 g, 5.29 mmol). P.f. 192-194 °C. El
Rf = 0.16 (AcOEt/MeOH 1:1). IR (pastilla de KBr): max 3325, 3050, 1735, 1695, 1595,
1540, 1305, 1280, 1180, 940, 915, 897 (cm-1
); 1H RMN (500 MHz, DMSO-d6)
(ppm)COO-H (2H, br), H-2 10.01 (1H, br), H-2’ 8.21 (1H, s), H-4’ 7.70 (1H, d, 3J =
8.40 Hz), H-6’ 7.60 (1H, d, 3J = 7.50 Hz), H-5’ 7.41 (1H, t,
3J = 8.10 Hz), H-5 y H-6
6.48 (2H, br), H-7 5.12 (1H, s), H-4 5.04 (1H, s), H-7a 2.80 (1H, d, 3J = 9.00 Hz), H-3a
2.69 (1H, d, 3J = 9.00 Hz);
13C RMN (125 MHz, DMSO-d6) (ppm) C-OOH 175.6, C-1
172.8, C-3 170.1, C-1’ 142.2, C-6 139.8, C-5 139.5, C-3’ 134.0, C-5’ 131.8, C-4’ 126.8,
C-6’ 126.1, C-2’ 122.6, C-7 83.3, C-4 82.0, C-7a 50.3, C-3a 49.6.
Aducto Diels-Alder 14d
Para esta reacción se siguió el método general. Fueron medidos 1.40 mL de 3d (9.080
mmol) y 1.60 g (9.631 mmol) del aducto (13); la reacción generó un polvo color
amarillo; sin embargo, los espectros de RMN de 1H y 13C mostraron que el aducto se
formó, aunque tenía impurezas; se trató de purificar el producto por par de disolventes y
por percolación con gel de sílice, no obstante, no pudo ser purificado.
Método general de preparación de los ácidos N-fenilfumarámicos 16a-d
Se pesó 1 equivalente de las anilinas monosustituidas (3a–d) correspondientes y
aproximadamente entre 1.03 y 1.10 equivalentes de cloruro de fumarilo (15), los cuales
se disolvieron por separado en 20.0 mL de THF anhidro vía cánula en matraces de bola
de 100 mL. El contenido del matraz que contenía las anilinas (3a-d) se adicionó a la
disolución que contenía al cloruro de fumarilo vía cánula. La adición se hizo en un baño
de hielo-sal a -10°C. La reacción se dejó en agitación constante por un período de 16 h a
temperatura ambiente. Después del tiempo de reacción se adicionaron 5.0 mL de agua
bidestilada para desactivar el cloruro de fumarilo excedente y se dejó en agitación por 1
h. Pasando el tiempo de, se adicionó hexano frío con el fin de precipitar completamente
el producto, el cual, posteriormente se filtró al vacío y lavado dos veces con 20 mL de
145
hexano frío. Una vez que el producto quedó libre de de disolvente fue pulverizado en un
mortero y lavado con 250 mL de agua destilada en un vaso de precipitados en agitación
constante a temperatura ambiente por 3 h con el fin de eliminar algún excedente de
anilina no reaccionante y ácido fumárico formado. Una vez lavado el producto se filtró
al vacío y se lavó dos veces con 20 mL de agua destilada. El producto se caracterizó
espectroscópicamente.
Ácido N-(4-Carboxifenil)fumarámico 16a
NH
O OH
O
1 2
3 4 1'2'
3'
4'
5'
6'
O
HO
Para esta reacción se siguió el método general. Se pesó 1.0 g de
3a (7.294 mmol) y se midió 0.92 mL (8.444 mmol) de cloruro de fumarilo (15); la
reacción generó un polvo rosa con un 95.0% de rendimiento (1.22 g, 5.188 mmol). P.f.
280-285 °C (ennegrece). El Rf = 0.36 (AcOEt/MeOH 1:1). IR (pastilla de KBr): max
3300, 2960, 1690, 1670, 1598, 1520, 1180, 855, 770 (cm-1
); 1H RMN (500 MHz,
DMSO-d6) (ppm) COO-H 12.50-13.00 (2H, br), N-H10.77 (1H, br), H-3’ y H-5’ 7.90
(2H, d, 3J = 8.50 Hz), H-2’ y H-6’ 7.76 (2H, d
3J = 9.00 Hz), H-3 7.13 (1H, d,
3J =
15.50 Hz), H-2 6.67 (1H, d, 3J = 15.50 Hz);
13C RMN (125 MHz, DMSO-d6) (ppm)
C-1 167.5, C-OOH 166.9, C-4 162.8, C-4’ 143.2, C-3 137.3, C-2 132.1, C-3’ 131.2, C-
1’ 126.6, C-2’ y C-6’ 119.6.
Ácido N-(4-Carboetoxifenil)fumarámico 16b
NH
O O
O
1 2
3 4 1'2'
3'
4'
5'
6' CH3
O
HO
Para esta reacción se siguió el método general. Se pesaron
3.0 g de 3b (0.0181 mol) y medidos 2.20 mL (0.0197 mol) de cloruro de fumarilo (15);
la reacción produjo un polvo blanco en un 68.1% de rendimiento (3.25 g, 0.0123 mol).
P.f. 228-231 °C. El Rf = 0.59 (AcOEt/MeOH 1:1). IR (pastilla de KBr): max 3320,
3020, 2990, 1705, 1680, 1597, 1540, 1280, 1240, 1185, 880, 780 (cm-1
); 1H RMN (500
MHz, DMSO-d6) (ppm) COO-H 12.50-13.00 (1H, br), N-H10.79 (1H, br), H-3’ y H-
5’ 7.91 (2H, d, 3J = 9.00 Hz), H-2’ y H-6’ 7.77 (2H, d
3J = 8.50 Hz), H-3 7.12 (1H, d,
3J
= 15.00 Hz), H-2 6.67 (1H, d, 3J = 15.50 Hz), C-H2 4.25 (2H, q), C-H3 1.27 (3H, t);
13C
RMN (125 MHz, DMSO-d6) (ppm) C-1 166.9, C-OOR 166.0, C-4 162.8, C-4’ 143.4,
146
C-3 137.4, C-2 132.1, C-3’ y C-5’ 130.9, C-1’ 125.7, C-2’ y C-6’ 119.6, C-H2 61.2, C-
H3 14.8.
Ácido N-(3-Carboxifenil)fumarámico 16c
NH
O
1 2
3 4 1'2'
3'
4'
5'
6'
O
O
CH3
HO
O Se siguió el método general de síntesis. Se pesaron 3.0 g de
3c (0.0218 mol) y se midieron 2.60 mL (0.0237 mol) de cloruro de fumarilo (15), la
reacción generó un producto color café en 82.1% de rendimiento (4.22 g, 0.0179 mol).
P.f. 298–300 °C. El Rf = 0.31 (AcOEt/MeOH 1:1). IR (pastilla de KBr): max 3280,
3090, 3000, 1700, 1600, 1595, 1550, 1170, 980, 945, 798 (cm-1
); 1H RMN (500 MHz,
DMSO-d6) (ppm) COO-H 12.50-13.00 (2H, br), N-H10.67 (1H, br), H-2’ 8.30 (1H,
s), H-6’ 7.86 (1H, d, 3J = 8.50 Hz), H-4’ 7.66 (1H, d,
3J = 8.50 Hz), H-5’ 7.45 (1H, t),
H-3 7.11 (1H, d, 3J = 15.00 Hz), H-2 6.67 (1H, d,
3J = 15.50 Hz);
13C RMN (125 MHz,
DMSO-d6) (ppm) C-OOH 167.7, C-1 166.9, C-4 162.6, C-1’ 139.4, C-3 137.5, C-2
132.1, C-3’ 131.7, C-5’ 129.9, C-4’ 125.4, C-6’ 124.2, C-2’ 120.8.
Ácido N-(4-Carboetoxifenil)fumarámico 16d
NH
O
1 2
3 4 1'2'
3'
4'
5'
6'
O
O
CH3
HO
O Se siguió el método general para esta reacción. Se midieron
1.90 mL de 3d (0.0125 mol) y 1.45 mL (0.0133 mol) de cloruro de fumarilo (15), la
reacción generó un polvo color blanco en 68.4 % de rendimiento (2.18 g, 0.0083 mol).
P.f. 225–228 °C. El Rf = 0.61 (AcOEt/MeOH 1:1). IR (pastilla de KBr): max 3360,
3280, 3100, 2985, 1720, 1700, 1600, 1500, 1298, 1280, 1150, 815, 780 (cm-1
); 1H RMN
(500 MHz, DMSO-d6) (ppm) COO-H 12.50-13.00 (1H, br), N-H10.78 (1H, br), H-2’
8.33 (1H, s), H-6’ 7.91 (1H, d, 3J = 9.30 Hz), H-4’ 7.68 (1H, d
3J = 7.50 Hz), H-5’ 7.48
(1H, t), H-3 7.18 (1H, d, 3J = 15.75 Hz), H-2 6.68 (1H, d,
3J = 15.75 Hz), C-H2 4.30
(2H, q), C-H3 1.31 (3H, t); 13
C RMN (125 MHz, DMSO-d6) (ppm) C-1 166.9, C-OOR
166.2, C-4 162.6, C-1’ 139.6, C-3 137.5, C-2 131.8, C-3’ 131.1, C-5’ 130.0, C-4’ 125.3,
C-6’ 124.5, C-2’ 120.5, C-H2 61.6, C-H3 14.8.
147
Procedimiento general de preparación de la mezcla de regioisómeros de los
aductos Diels-Alder 17a-d y 18a-d a partir de los ácidos N-fenilfumarámicos 16a-d
Se pesaron 500 mg del ácido N-fenilfumarámico correspondiente (16a–d) y se
adicionaron 2 equivalentes de isopreno (2) y 9.0 mL de tolueno, los cuales se
depositaron en un tubo de presión ACE de 20 mL. El tubo se cerró y se introdujo en un
baño de arena a 160 °C en agitación constante por un período de 48 h. Después del
tiempo de reacción, el producto se precipitó con hexano frío y se filtró a gravedad y se
lavó 2 veces con 20 mL de hexano a temperatura ambiente. El producto purificado se
caracterizó espectroscópicamente.
Mezcla de regioisómeros de los aductos Diels-Alder 17a y 18a
H3C
NH
OH
O
O
OH
O
1
23
3a4
5
67a
1'2'
3'
4'
5'
6'
Para esta reacción se siguió el método general. Se pesaron 0.25
g de 16a (1.06 mmol) y medidos 0.22 mL (2.15 mmol) de (2); la reacción generó un
polvo amarillo claro con un 82.7% de rendimiento (0.28 g, 0.93 mmol). P.f. 214-217
°C. El Rf = 0.86 (AcOEt/MeOH 1:1). IR (pastilla de KBr): max 3400, 3295, 2970, 1695,
1660, 1597, 1170, 850, 780 (cm-1
); 1H RMN (300 MHz, DMSO-d6) (ppm) COO-H
12.20-12.40 (2H, br), H-2 10.34 (2H, br), H-3’ y H-5’ 7.88 (4H, d, 3J = 8.85 Hz), H-2’
y H-6’ 7.70 (4H, d, 3J = 8.85 Hz), H-5 o H-6 5.41 (2H, br), H-7a 2.82 (2H, m), H-3a
2.66 (2H, m), H-4 y H-7 1.96-2.52 (8H, m), C-H3 1.65 (6H, br); 13
C RMN (75 MHz,
DMSO-d6) (ppm) C-OOH 176.8, C-OOH 176.7, C-1 174.7, C-1 174.6, C-3 167.6, C-
1’ 144.0, C-5 o C-6 132.9, C-5 o C-6 132.8, C-3’ y C-5’ 131.1, C-4’ 125.5, C-5 o C-6
119.9, C-2’ y C-6’ 119.5, C-2’ y C-6’ 118.9, C-7a 44.0, C-7a 43.5, C-3a 42.1, C-3a
41.5, C-4 y C-7 34.0, C-4 y C-7 33.3, C-4 y C-7 29.5, C-4 y C-7 28.8, C-H3 23.5.
Mezcla de regioisómeros de los aductos Diels-Alder 17b y 18b
H3C
NH
OH
O
O
O
O
1
23
3a4
5
6
77a
1'2'
3'
4'
5'
6' CH3
Para esta reacción se siguió el método general. Se pesaron
0.50 g de 16b (1.900 mmol) y se midieron 0.40 mL (4.000 mmol) de (2); la reacción
generó un polvo blanco con un 57.0% de rendimiento (0.36 g, 1.04 mmol). P.f. 179-180
°C. El Rf = 0.94 (AcOEt/MeOH 1:1). IR (pastilla de KBr): max 3300, 3040, 2980, 1710,
148
1660, 1525, 1280, 1180, 1110, 850, 780 (cm-1
); 1H RMN (300 MHz, DMSO-d6)
(ppm) COO-H 12.20-12.40 (1H, br), H-210.37 (2H, br), H-3’ y H-6’ 7.90 (2H, d, 3J =
8.70 Hz), H-3’ y H-5’ 7.89 (2H, d, 3J = 8.70 Hz), H-2’ y H-6’ 7.73 (2H, d,
3J = 8.70
Hz), H-2’ y H-6’ 7.72 (2H, d, 3J = 8.70 Hz), H-5 o H-6 5.41 (2H, br), C-H2 4.27 (4H,
q), H-7a 2.72-2.82 (2H, m), H-3a 2.62-2.72 (2H, m), H4 y H7 1.98-2.35 (8H, m), C-H3
1.66 (6H, br), C-H3 1.30 (6H, t); 13
C RMN (75 MHz, DMSO-d6) (ppm) C-OOH
181.4, C-1 179.5, C-1 179.4, C-3 170.8, C-1’ 149.1, C-5 o C-6 137.6, C-3’ y C-5’
135.6, C-4’ 129.4, C-5 o C-6 124.6, C-2’ y C-6’ 123.7, C-H2 65.8, C-7a 48.2, C-3a
46.8, C-4 y C-7 38.0, C-4 y C-7 34.2, C-H3 28.2, C-H3 19.6.
Mezcla de regioisómeros de los aductos Diels-Alder 17c y 18c
H3C
NH
OH
O
O
OH
O1
23
3a4
6
5
77a
1'2'
3'
4'
5'
6'
Para esta reacción se siguió el método general. Se pesaron 0.50
g de 16c (2.13 mmol) y medidos 0.40 mL (4.00 mmol) de (2); la reacción generó un
polvo color café claro, la espectroscopía mostró que el aducto se había formado, aunque
presentó impurezas, se trató de purificar por recristalización y por percolación con gel
de sílice; sin embargo, las impurezas no pudieron ser removidas.
Mezcla de regioisómeros de los aductos Diels-Alder 17d y 18d
H3C
NH
OH
O
O
O
O1
23
3a4
6
5
77a
1'2'
3'
4'
5'
6'
CH3
Para esta reacción se siguió el método general. Se pesaron
0.50 g de 16d (3.02 mmol) y se midieron 0.40 mL (4.00 mmol) de (2); la reacción
generó un polvo color blanco con un rendimiento de 54.3 % (0.342 g, 1.03 mmol). P.f.
345-347 °C. El Rf: = 0.94 (AcOEt/MeOH 1:1). IR (pastilla de KBr): max (cm-1
); 1H
RMN (300 MHz, DMSO-d6) (ppm) COO-H 12.20-12.40 (1H, br), H-2 10.30 (2H, br),
H-2’ 8.28 (1H, s), H-2’ 8.27 (1H, s), H-6’ 7.98 (1H, d, 3J = 7.50 Hz), H-6’ 7.97 (1H, d,
3J = 7.50 Hz), H-4’ 7.66 (1H, d,
3J = 7.61 Hz), H-4’ 7.61 (1H, d,
3J = 8.10 Hz), H-5’
7.43 (1H, t), H-5’ 7.39 (1H, t), H-5 o H-6 5.49 (1H, br), H-5 o H-6 5.48 (1H, br), C-H2
4.33 (2H, q), C-H2 4.30 (2H, q), H-7a 3.04-3.12 (2H, m), H-3a 2.94-3.03 (2H, m), H-4 y
H-7 2.27-2.32 (8H, m), C-H3 1.73 (6H, br), C-H3 1.32 (3H, t), C-H3 1.28 (3H, t); 13
C
RMN (75 MHz, DMSO-d6) (ppm) C-OOR 176.6, C-OOR 176.5, C-1 174.5, C-1
149
174.3, C-3 166.2, C-3 165.7, C-1’ 140.2, C-5 o C-6 133.7, C-5 o C-6 133.0, C-3’ 130.9,
C-3’ 130.0, C-5’ 124.3, C-4’ 124.0, C-6’ 121.4, C-2’ 120.0, C-H2 61.7, C-H2 61.4, C-7a
43.4, C-7a 42.9, C-4 y C-7 29.9, C-4 y C-7 25.0, C-H3 24.1, C-H3 14.83.
8.4 Análisis conformacional y metodología de los cálculo teóricos para el aducto
Diels-Alder 4b
Los cálculos fueron llevados a cabo con el programa Gaussian 9464
. La optimización
fue llevada a cabo utilizando la opción TIGHT; de la misma manera, los cálculos al
nivel DFT se llevaron a cabo utilizando la opción INT(GRID=99590). Los cuatro
confórmeros obtenidos del aducto 4b fueron construidos en el programa Molden65
. y
optimizados por un método ab initio a un nivel de teoría HF/STO-3G. Las geometrías
resultantes fueron utilizadas como puntos de partida para realizar optimizaciones
subsecuentes a los niveles HF/3-21G, HF/6-31+G(d,p) y B3LYP/6-31+G(d,p). Se llevó
a cabo el análisis vibracional (25°C, 1 atm) para aquellos resultados obtenidos al nivel
más alto de teoría, con el propósito obtener las correspondientes correcciones de energía
libre a las energías electrónicas; (no se aplicaron factores de corrección a las frecuencias
vibracionales). Para todas las geometrías optimizadas únicamente se obtuvieron
frecuencias vibracionales reales. Los ángulos diedros relacionados con las constantes de
acoplamiento en estudio fueron determinados con el programa Molden sobre las
geometrías optimizadas al nivel más alto de teoría.
Para los cuatro confórmeros de 4b, como fue mencionado anteriormente, fueron
determinados los ángulos diedros más relevantes, y de ellos fueron estimadas las
constantes de acoplamiento vecinales de acuerdo a la ecuación de Haasnot-de Leeuw-
Altona,28
implementada en el programa computacional ALTONA.29
Además, de los
valores de las constantes de acoplamiento y energías relativas calculadas fue posible
estimar el promedio de las constantes de acoplamiento asumiendo una distribución de
Boltzmann de los confórmeros, de acuerdo a la metodología descrita en otros trabajos.66
150
8.5 Estudios de interacción ligando-enzima asistido por computadora
8.5. 1 Preparación de los ligandos
Se utilizó el programa PC Spartan Pro67
para construir todos y cada uno de los
posibles aductos Diels-Alder derivados tanto del ácido maleico, como del ácido
fumárico con sus respectivos estereo y regioisómeros (aductos fusionados con los
dienos isopreno (2), ciclopentadieno (9) y furano (12).
Una vez dibujados los aductos se realizó un análisis conformacional utilizando un
campo de fuerzas MMFF. Una vez terminado el cálculo todos los confórmeros
generados fueron optimizados por un método semiempírico al nivel AM1 de teoría en el
mismo programa (PC Spartan Pro). Obtenidos los resultados de la optimización, la
moléculas más estables o de menor energía (energía relativa = 0), fueron ionizadas en
donde corresponda para un pH = 7.4, las cuales fueron reoptimizadas por un método
ab-initio a un nivel de teoría HF-3-21G utilizando como disolvente H2O en el programa
Gaussian 94.64
Por otro lado, los estándares a utilizar para la evaluación en docking corresponden al
sustrato principal de la enzima GABA-AT correspondiente al ácido -aminobutírico
(GABA), y a su principal inhibidor (Vigabatrina).
De igual manera estos ligandos fueron construidos en PC Spartan Pro, a los cuales se
les realizó un análisis conformacional por un método de mecánica molecular con el
campo de fuerzas MMFF. Una vez terminado el análisis, el conjunto de confórmeros
fue optimizados en el mismo programa por un método ab initio HF-3-21G en Gaussian
94.
Todos los aductos y estándares construidos fueron utilizados para evaluar la
interacción ligando-enzima por Docking.
8.5.2 Preparación de la enzima aminotransferasa del GABA
Alineamiento
Inicialmente fueron obtenidas las secuencias de aminoácidos de la enzima
aminotransferasa del GABA de Pseudomonas fluorescens, Escherichia coli, mus
musculus, Sus scrofa y homo sapiens en formato FASTA, de la base de datos Swiss
151
prot.44
Una vez obtenidas las secuencias, la enzima de Pseudomonas fluorescens fue
alineada contra la de las demás especies en el servidor EMBL-EBI.45
Una vez alineadas las secuencias de la especies con respecto a la de Pseudomonas
fluorescens, fueron analizadas las secuencias y se tomó la decisión de utilizar una de
ellas como secuencia molde.
Derivado del análisis se tomó la decisión de utilizar la secuencia de la enzima de
Pseudomonas fluorescens que tuvo mucho más homología a la GABA-AT de
Escherichia coli que a la de las demás especies. Cabe mencionar que las únicas GABA-
AT cristalizadas y caracterizadas por DRX son aquellas derivadas de las especies
Escherichia coli y Sus scrofa.
Modelado de la proteína GABA-AT de Pseudomonas fluorescens tomando como
secuencia molde la GABA-AT de Escherichia coli
La aminotransferasa del GABA de Escherichia coli es un tetrámero con monómeros
idénticos16
, de tal manera que únicamente el modelado fue realizado para un solo
monómero. Una vez escogida la secuencia molde (E. coli), la GABA-AT de
Pseudomonas fluorescens fue modelada en dos servidores diferentes: 1) El monómero
1SFFC16
de E. coli en Swiss model46
y el monómero 1SF2A16
de E. coli en I-Tasser.47
Una vez obtenidos los resultados de los servidores fue evaluado el mejor modelo de P.
fluorescens comparándolo con el molde de E. coli tomando como criterio el porcentaje
de aminoácidos con ángulos de torsión o conformación espacial ―no permitida‖ excepto
para los aminoácidos glicina (Gly) y prolina (Pro). El análisis se llevó a cabo a través
del gráfico de Ramachandran. La visualización y el análisis fueron llevados a cabo en el
programa VMD.68
El modelo mejor evaluado (I-Tasser) le fue insertado en su molécula la coenzima
fosfato de pirodoxal (PLP) necesario para la actividad de la enzima. El PLP fue
insertado en el modelo de P. fluorescens juntando el archivo de salida del modelo con
las coordenadas del PLP de E. coli. Esta nueva proteína con PLP fue optimizada a 1500,
2000 y 4000 pasos por un método de mecánica molecular steped descendant
minimization en el servidor de I-Tasser47
para verificar que la distancia entre el carbono
carbonilo del PLP y el grupo –NH2 de la Lys269 sea la óptima, debido a la inserción
152
―artificial‖ del PLP puesto que el modelo no fue generado en su forma natural, es decir;
con la base de Schiff entre la Lys269-PLP.
8.5.3 Preparación de los archivos de la proteína y los ligandos
Preparación del archivo *.pdbqt de la proteína
Con el programa Autodocktools 1.5.0.69
fueron colocados los hidrógenos polares y no
polares a la proteína, así como las correspondientes cargas de Kollman. La proteína
preparada es fundamental para realizar los estudios de interacción ligando-enzima
(Docking). La preparación de la enzima genera un archivo de salida *.pdbqt (Figura 79).
Figura 79. Diagrama de flujo para la preparación de la enzima GABA-AT y generar el archivo *.pdbqt
Preparación de los archivos *.pdbqt de los ligandos
De la misma forma que la enzima, los ligandos fueron preparados de manera
individual e independiente con el propósito de asignar enlaces donde la molécula pueda
rotar de manera libre para favorecer la unión con la enzima durante el estudio de
Docking (Figura 80). La preparación de los ligandos se realizó en el programa
Autodocktools 1.5.0. para obtener los archivos *.pdbqt.
Autodocktools
2) Edit 3) Edit 4) Edit 5) Edit
1) File
Read molecule
Abrir archivo de
la enzima
Hydrogens
Add
Polar only
Charges
Add Kollman
charges
Accept
Charges
Compute
Gasteiger
Accept
Atoms
Assign AD4 type
6) File
Save
Write PDBQT
(CONECT, Browse,
Guardar OK)
153
Figura 80. Diagrama de flujo para la preparación de los ligandos y generar los archivos *.pdbqt
8.5.4 Preparación de los scripts de la proteína y los ligandos
Preparación de los archivos *.gpf (grid parameters files)
En este paso se escogió la GABA-AT modelada y minimizada con el fin de
seleccionar el espacio de exploración del ligando hacia la enzima para establecer la
mejor interacción (comúnmente denominado caja de Grid). Fue seleccionada toda la
proteína para evaluar posibles sitios alostéricos. Así también, fue insertado un archivo
con una librería de átomos necesarios que no posee la enzima, por ejemplo, el fósforo
necesario del PLP (Figura 81).
Autodocktools
1) Ligand
2) Ligand
3) Ligand
4) Ligand
5) Ligand
Input
Open…
Accept
Torsion tree
Detect root…
Torsion tree
Choose
torsions
Done
Torsion tree
Set number
of torsions
Dismiss
Output
Save as
PDBQT
Guardar
*.pdbqt
154
Figura 81. Diagrama de flujo para la preparación de los archivos *.gpf
Preparación de los archivos *.dpf (docking parameters files)
Este paso consistió en la generación de los archivos *.dpf (docking parameters files)
con el propósito de asignar rigidez a la proteína y escoger el algoritmo por el cual se
llevó a cabo la interacción (algoritmo genético Lamarckiano). El algoritmo seleccionado
fue de: runs = 100; population = 100; Evaluation = 10 000 000; No. de generaciones =
100 (Figura 82).
Figura 82. Diagrama de flujo para la preparación de los archivos *.dpf
Autodocktools
1) Grid 2) Grid
3) Grid
4) Grid
5) Grid
Macromolecule
Open or Choose
Selection
Yes, accept
Set map types
Open ligand
―Nombre del
archivo‖
Grid box… center
Center on
macromolecule
File
Close saving
current
Other options
Parameters of
library (AD4.1-
bound.dat)
Output
Save GPF
Colocar *.gpf
Autodocktool
s
2) Docking
3) Docking
4) Docking
Macromolecule
Set rigid
filename
Escoger
proteína
*.pdbqt
Ligand
Choose…
Escoger
proteína
(*.pdbqt)
Search
parameters
Genetic
algorithm
Runs 100, Populations
100, Evaluation 10 000
000, Generations 100
Output
Lamarckian GA
Guardar
archivo *.dpf
Accept
155
La preparación tanto de los archivos *.gpf y *.dpf fueron realizados en el programa
Autodocktools 1.5.0.
8.5.5 Realización de los estudios de interacción ligando-enzima (Docking)
Una vez generados todos los archivos, se llevó a cabo la interacción de ligando-
enzima para todos y cada uno de los ligandos en el programa Autodock.70
Terminado el proceso las interacciones entre el ligando y la enzima fueron analizadas
obteniendo las energía libre de unión y sus correspondientes constantes de disociación,
así como los aminoácidos con los cuales interacciona cada ligando. El análisis se llevó a
cabo en el programa Autodocktools 1.5.2.71
8.6 Cinética enzimática sobre la aminotransferasa del GABA de Pseudomonas
fluorescens
Para la determinación de la actividad de la enzima aminotransferasa del GABA
(GABA-AT) de Pseudomonas fluorescens in vitro, fue utilizada cinética de medición
indirecta derivada de una reacción acoplada con la enzima semialdehído succínico
deshidrogenasa (SSDH), monitoreando el incremento de la concentración del NADPH
(Dinucleótido de nicotinamida y adenina fosfato) producido en la reacción, y seguida
por espectrofotometría UV-Vis.20,21,48
Antes de iniciar con el estudio enzimático fue necesario preparar las siguientes
disoluciones:
1) Buffer de pirofosfato de potasio (K4P2O7) 0.1 M a pH = 8.6. El pH fue ajustado
con ácido clorhídrico concentrado (HClconc.).
2) Disolución stock de ácido 2-cetoglutárico 0.04 M. La concentración final en la
cinética enzimática fue de 2.0 mM.
3) Disolución stock de -NADP 0.05 M. La concentración final en la cinética
enzimática fue de 1.25 mM.
4) Disolución stock de GABA 0.32 M. Se realizó una serie de diluciones sucesivas
a partir de la disolución stock para obtener las concentraciones siguientes: 0.128,
0.064, 0.032, 0.016, 0.008 y 0.004 M para obtener una concentración final de
GABA en el estudio de 6.4, 3.2, 1.6, 0.8, 0.4 y 0.2 mM, respectivamente.
156
5) Disolución stock de GABA-AT 3.14 mg/mL. El disolvente del polvo liofilizado
que contiene a la enzima consistió en una disolución buffer de fosfatos 0.0075
M, pH = 7.2 con glicerol al 25 % V/V. La concentración final de la enzima en el
estudio fue de 0.0209 mg/mL.
6) Disoluciones stock de inhibidores (aductos y VGB) 0.020, 0.010, 0.005 y 0.0025
M. Las disoluciones fueron preparadas por diluciones sucesivas. Las
concentraciones finales fueron: 2.00, 1.00, 0.50 y 0.25 mM, respectivamente.
Fueron establecidos los siguientes volúmenes de cada reactivo para evaluar la
actividad de la enzima GABA-AT de Pseudomonas fluorescens sin inhibidor y con
inhibidor (Aductos y VGB) en el orden que aparece en la siguiente tabla (Tabla 40).
Tabla 40. Volúmenes utilizados de cada reactivo en la determinación de la actividad enzimática de
GABA-AT con y sin inhibidor.
Reactivo Sin inhibidor (L) Con inhibidor (L)
Inhibidor 0.00 70.00
Buffer de pirofosfato de
potasio (K4P2O7) 0.1 M a
pH = 8.6
607.84
537.84
Ácido 2-cetoglutárico 35.00 35.00
-NADP 17.50 17.50
GABA 35.00 35.00
GABA-AT 4.66 4.66
Volumen total (L) 700.00 700.00
La reacción enzimática se llevó a cabo a pH = 8.6 a 25°C (en un baño de agua) por un
período de incubación de 30 min.
La reacción de reducción acoplada fue monitoreada por espectrofotometría UV-Vis
midiendo la absorbancia, la cual está relacionada con el incremento de la concentración
de NADPH a partir de NADP. La reacción enzimática fue llevada a cabo en una celda
de cuarzo con un paso óptico de 0.5 cm, monitoreando la absorbancia de NADPH a
157
máx = 340 nm por 45 min en el caso de la cinética en función del tiempo, y por un
período de 30 min en el caso de la cinética enzimática en función de la concentración.
De manera preliminar los aductos de Diels-Alder (6a-d, 7a-d, 11a-d, 14a-d y 17a-d,
18a-d) fueron probados para determinar su potencial actividad inhibitoria de la enzima
GABA-AT utilizando una concentración para cada uno (0.8 mM) vs. GABA a la misma
concentración (0.8mM) bajo las mismas condiciones. Como control positivo fue
utilizada la vigabatrina (VGB).
A los aductos que tuvieron una inhibición mayor al 40%, les fue determinada una
cinética completa a concentraciones que variaron desde 0.25 a 2.0 mM en escala
geométrica.
Las absorbancias obtenidas fueron convertidas a concentración de -NADPH a partir
de una curva patrón de -NADPH con valores de concentración: 0.05, 0.10, 0.20, 0.40,
0.80, 1,60, 3.20 y 6.40 mM.
La determinación de los parámetros cinéticos sin inhibidor (Km y rmáx) fueron
analizadas a través de los métodos de Lineweaver-Burk49
o Hanes-Wolff49
. La
determinación de la Ki fue a través del método de Schild49
. El análisis estadístico fue
llevado a cabo a través de la prueba t de Student para una regresión lineal por mínimos
cuadrados. Un valor de p < 0.05 fue tomado como significativo.
8.7 Modelo in vivo de las convulsiones inducidas con pentilentetrazol (PTZ)
8.7.1 Animales
Todos los experimentos se realizaron con ratones albinos adultos, machos de la cepa
Swiss CD1 con un peso entre 22-26 g52,53
, los cuales estuvieron bajo las mismas
condiciones de trato, las cuales consistieron en libre acceso a alimento y agua (ad
libitum), un ciclo natural de luz-oscuridad a una temperatura de 22 + 1 °C, así como un
tiempo mínimo (4 días) de adaptación de los animales a las condiciones del laboratorio.
8.7.2 Determinación de la dosis mínima efectiva de PTZ
Se realizó una curva dosis-respuesta cuantal, formando 6 grupos con 6-8 animales
cada uno, 5 de ellos fueron de utilidad para construir la curva dosis-respuesta para PTZ
para un intervalo de dosis de 35-125 mg/kg, mientras que el 6° grupo sirvió como grupo
158
control que solo recibió el vehículo (disolución salina isotónica con NaCl al 0.9 %
m/V). La administración del PTZ y del vehículo fue aplicada por vía subcutánea (s.c.)55
con un volumen de inyección de 1mL/100g. La administración s.c. se practicó en el
pliegue de la piel de la parte posterior del cuello del ratón (Figura 83).
Figura 83. Administración subcutánea (s.c.) practicada en ratones.
Una vez administrado el PTZ, en una caja de acrílico cada ratón será observado
durante de 30 min, en este período se contaron el número de crisis convulsivas
generadas y la muerte en aquellos casos en donde se presenten.
Se consideró una crisis convulsiva aquella en donde el ratón presente convulsiones
tónico-clónicas con una duración mínima de 3s.
Nota: El criterio de actividad anticonvulsiva es la protección total contra las
convulsiones de algún tipo. La convulsión está caracterizada por la extensión rígida
verdadera de las extremidades del animal (convulsión tónica)72
(Figura 84A); mientras
que movimientos cíclicos continuos de las extremidades es característica de la
convulsión clónica72
(Figura 84B).
Figura 84. A: Convulsión tónica; B: Convulsión clónica11
159
8.7.3 Determinación del efecto protector de los aductos Diels-Alder que hayan
resultado inhibidores de la GABA-AT
Se formaron de 6-8 grupos de 5-8 ratones cada uno de la cepa Swiss (machos, entre
22-26g de peso), que hayan estado bajo las condiciones antes mencionadas.
Los aductos Diels-Alder, en particular la mezcla de regioisómeros 6b y 7b fueron
probados en disolución en el caso de la dosis de 0.2 mmol/kg, y en suspensión las dosis
de 0.5 y 1.0 mmol/kg en buffer de pirofosfato de potasio (K4P2O7) 0.1 M, pH = 8.6. Fue
utilizada la VGB en disolución en el mismo vehículo como control positivo a las
mismas dosis (0.2, 0.5 y 1.0 mmol/kg). El grupo control solo recibió vehículo.
La primera etapa del ensayo consistió en un pretratamiento por grupo de 4 h52
con el
vehículo, aductos y VGB. La administración se practicó en todos los casos por vía
intraperitoneal (i.p.) con un espacio de tiempo entre grupos de 30 min. Una vez pasado
el tiempo de pretratamiento fue administrada la dosis mínima efectiva de PTZ (75
mg/kg) por vía subcutánea (en disolución salina isotónica) y cada ratón fue observado
en un período de 1 h. En dicho período se observaron el número de crisis convulsivas
tónico-clónicas generadas, así como el tiempo de latencia entre la administración del
PTZ y las crisis consecutivas.
Todos los experimentos fueron analizados por análisis de variancia (ANOVA) de una
vía con el método de Duncan, o por análisis estadístico de t de Student no pareada. La
evaluación del número de ratones que presentaron crisis convulsivas tónico-clónicas
contra el número que no las tuvieron fue analizada con la prueba exacta de Fisher. Un
valor de p < 0.05 fue tomado como significativo.
160
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