Estandarizando muestras - BioCision · 2012-02-10 · CoolBox CFT30 para el enfriamiento sin hielo...

Standardizing SamplesTM 1

CoolCell Overview Enero 2012

Sangre, sangre umbilical, suero, células, células madre, células T, células B, células dendríticas, bacterias, virus, esputo, folículos, dientes, huesos, biopsia, tumor, tejido, orina, saliva, líquido raquideo , piel……..

Estandarizando muestras


Problema: Falta de estandarización

•  Ejemplos de esfuerzos mundiales para desarrollar nuevos estándares para la adquisición, manipulación y procesamiento pre-analítico de muestras (sangre, tejido, tumor, otras muestras biológicas):

•  EU: http://www.devicelink.com/ivdt/archive/09/04/003.html •  NCI/NIH: http://biospecimens.cancer.gov/practices/default.asp •  NIH Office of Biorepositories and Biospecimen Research 2010 Symposium: http://

www.brnsymposium.com/meeting/brnsymposium/2010/ •  BioCoR: http://biocor.umn.edu/ •  Duke: http://web.genome.duke.edu/cores/biorepository/protocols/ •  Molecular Epidemiology Workshop, Shanghai, 2008

“…La falta de estandarización, y de alta calidad de bio-muestras ha sido reconocida como el impedimento más importante en el progreso de la investigación de la enfermedad del cáncer…” NIH / NCI / OBBR


CoolCell®

Congelación celular a velocidad controlada


Congelación de células a velocidad controlada de -1oC/min

Máxima reproducibilidad vs. otros métodos Máxima viabilidad celular

Velocidad controlada sin alcohol

•  Velocidad de congelación de -1oC/minuto en congelador de -80oC.

•  Perfiles idénticos de congelación •  Formato: Criotubos 1ml – 5ml o viales inyectables ? •  Líneas celulares, PBMC, células primarias, células

madre, levaduras, algas •  Sin necesidad de isopropanol, sin líquidos •  No hay costos adicionales •  No deja residuos tóxicos •  No hay variabilidad a causa de los niveles de alcohol


Congelación controlada vs. no-controlada Controlada (-1oC/min)

No controlada/ inconsistente

Viabilidad al descongelar

Minimiza la alteración celular e incrementa la viabilidad de una manera reproducible.

Resulta en función y viabilidad celular variable con resultados impredicibles de lote a lote.

Artefactos de congelación

Reduce la selección de subpoblaciones de células y/o biomarcadores.

Selecciona subpoblaciones de células que son más resistentes a las condiciones de congelación.

Expresión y función de genes y biomarcadores

Asegura la recuperación de células y la consistencia en la función biológica de una manera predecible (muy importante cuando se trabaja con muestras pequeñas o escasas).

La recuperación de células es impredecible y la función biológica es inconsistente.

Terapia celular & diagnóstico

Esencial para terapia celular y diagnóstico

Impide un diágnostico consistente y un adecuado resultado clínico


Formatos múltiples–Función idéntica Congelación consistente de -1oC/min

Para criotubos de 1 y 2ml 12 tubos


- El soporte de tubos puede ser transferido fácilmente a

una caja para almacenamiento


Para tubos de suero de 2ml

12 tubos


¿Que es un CoolCell?

Congelación pasiva y controlada de células*

•  El intercambio térmico radial asegura perfiles de enfriamiento uniformes en todos los tubos.

•  El material HD (alta densidad) es utilizado en la industria aeroespacial por ser liviano y por su propiedad aislante.

•  Núcleo altamente termoconductor. •  Control de ventilación por conducción

y/o micro-convección (FTS30).

* Patente pendiente


CoolCell: Consistencia en termodinámica Congelación consistente y resultados reproducibles

Cinco ciclos consecutivos de congelamiento en un congelador de -80oC utilizando un CoolCell (12 tubos, criotubo 2ml). El perfil de enfriamiento y cambio de fase es idéntico cada vez.


Ventajas del CoolCell CoolCell Recipiente con isopropanol

Sin isopropanol/Sin necesidad de mantenimiento • Sin líquidos • No hay necesidad de enfriamiento previo • Sin residuos tóxicos

100% Isopropanol • Necesita mantenimiento y compra de isopropanol constante. Resulta en residuos tóxicos a causa de la degradación del isopropanol • Peligro de enfriar alcohol en refrigeradores

Sin variabilidad • Perfil idéntico de congelación en cada experimento • El diseño simétrico radial asegura la consistencia de congelación en cada sesión

Velocidad de congelación inconsistente • Cada sesión es ligeramente diferente a causa de la degradación del isopropanol. • Dos filas paralelas resulta en un enfriamiento desigual en los tubos.

Sin costos escondidos • Una vez comprado no hay más gastos!!

~350&USD al año en mantenimiento por unidad • Requiere cambio de isopropanol cada 5 usos, y resulta en residuos tóxicos

La tapa se abre fácilmente • La tapa no se traba al congelar • Material altamente resistente y no daña las manos aunque esté congelado

Dificultad de abrir la tapa cuando congelada • Necesidad de utilizar guantes protectores al sacar la unidad del congelador. • El recipiente es altamente frío, resbaladizo y se rompe fácilmente.

Máxima viabilidad y función celular al descongelar

Listo para ser re-utilizado en 5 minutos Toma >1 hora para volver a temperatura ambiente y poder ser re-utilizado

Bajo impacto termodinámico para el congelador • Utiliza 1/3 del calor comparado con los recipientes que usan alchohol

La alta carga térmica tiene alto impacto en el congelador • La alta capacidad térmica necesaria para enfriar el isopropanol tiene un impacto en las muestras aledañas


0%

20%

40%

60%

80%

100%

HeLa CHO-K K562 NIH3T3

% GFP transfection efficiency

Mr.Frosty

CoolCell (12 samples)


Rendimiento de lineas celulares Comparación I

0%

20%

40%

60%

80%

100%

HeLa CHO-K K562 NIH3T3

% Viability

Mr.Frosty



Experimentos realizados por una entidad independiente (LONZA/Alemania) • La eficacia de transfección y viabilidad al congelar/descongelar células son idénticas • El CoolCell es más duradero que Mr. Frosty (e.j.. El CoolCell no se quiebra al congelarse)


Comparación II CoolCell vs. “Mr. Frosty”

0

1

2

3

4

5

6

HeLa CHO-K1 K562 NIH3T3

ATP RLU (ViaLight)

Growth performance after 24 hours post-thaw

Mr Frosty



Experimentos realizados por una entidad independiente (LONZA/Alemania) • La proliferación celular medida 24h post-descongelacion es idéntica • La congelación y descongelación es mas fácil y conveniente con el CoolCell (sin isopropanol)


0 20 40 60 80 100

Alcohol-based

CoolCell

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94%

82%

HUVEC

0 20 40 60 80 100

Alcohol-based

CoolCell

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92%

89%

PBMC

Rendimiento de células primarias CoolCell vs. “Mr. Frosty”

Figure 1. Post freeze viability, PBMC. 2x107 PBMC cells total were isolated and split into two vials, at 1x107 cells per vial, in Human Sera with 10% DMSO. One vial was frozen overnight using a BioCision CoolCell and one in a commercial IPA-based freezing system (“Mr. Frosty”). Following long term storage in LN2, cells were thawed and viability counts for each vial were obtained by the trypan blue stain method.

Experimento realizado por una entidad independiente • La congelación de células primarias humanas como PBMC (células mononucleares de sangre periférica) o HUVEC (células de sangre de cordón umbilical) utilizando el CoolCell resulta en >90% de células viables al descongelar sin tener que usar isopropanol (producto químico inflamable y tóxico)

Figure 2. Post freeze viable cell count, HUVEC (n=5). Cells were resuspended in freezing medium at a concentration of 2x106 cells per ml. 1ml aliquots were proportioned into 1.8ml cryo vials and frozen at -1oC/minute in either a BioCision CoolCell or in an alcohol-filled freezing unit. Five vials frozen by either method were rapidly thawed and resuspended in growth media. Live cell counts were obtained by the trypan blue exclusion method.


Células madre CoolCell vs. otros métodos comunes

Métodos comunes no estandarizados de criopreservación de células madre:

•  Cajas de espuma de poliestireno •  Aislación con paños de papel

Comparación del rendimiento con el CoolCell: •  Se inició una evaluación independiente del rendimiento de

criopreservación del CoolCell los Laboratorios Roslin (Renombrado instituto de investigación en células madres).

•  Se evaluó el efecto de varios métodos de congelación/descongelación críticos para el crecimiento de células madre (viabilidad).


Experimento realizado por una entidad independiente (Roslin Cellab/Reino Unido) • La criopreservación en un CoolCell resulta en menos células muertas al descongelar (P<0.05). • El CoolCell asegura menor variabilidad entre muestras al congelar múltiples viales.

Muerte celular al descongelar CoolCell vs. otros métodos comunes

Figura 1. Conteo de células R C 1 0 ( c é l u l a s m a d r e e m b r i ó n a r i a s h u m a n a s ) muer tas a l desconge lar. Cuantificación por Alamar Blue. Comparación de 3 métodos de congelación (n=3).

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Comparación morfológica en células madre CoolCell vs. otros métodos comunes

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CoolCell Caja de poliestireno Paño de papel

Experimento realizado por una entidad independiente (Roslin Cellab/Reino Unido) • La morfología célular se ve mejorada cuando se compara los resultados del CoolCell con otros métodos de congelación. Estos datos son complementarios a los anteriores donde se obtuvo mayor viabilidad y capacidad proliferativa cuando se utiliza el CoolCell.

Figura 2. Células madre humanas RC10 observadas bajo un microscopio con un aumento 10x 24h post-descongelación. Comparación de 3 métodos diferentes de congelación.


Experimento realizado por una entidad independiente (Roslin Cellab/Reino Unido) • El CoolCell demuestra un incremento significativo en el conteo de viabiilidad celular (P<0.001)

1 millón de células (33%) más que otros métodos • Impacto directo en resultados de varios experimentos (e.j. detección de proteínas de baja expresión) • Reducción en la cantidad/volúmen de muestra del paciente necesaria para diagnóstico, tratamiento o investigación.

Proliferación de células madre CoolCell vs. otros métodos comunes

Figura 3. Conteo de células RC10 por Alamar Blue a 3 días post-descongelación utilizando m é t o d o s d i f e r e n t e s d e congelación (n=3)

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Experimento realizado por una entidad independiente (Roslin Cellab/Reino Unido) • La descongelación de células madre criopreservadas por un método estandarizado y de temperatura

controlada se recuperan mejor y exhiben una velocidad de proliferación mucho mayor.

Proliferación de células madre a lo largo del tiempo

Figura 4. Conteo de células RC10 por Alamar Blue a 0 y 3 días post-descongelación. Comparación de tres métodos de congelación. Promedio de 3 muestras.

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CoolCell vs. otros métodos comunes


CoolSystem® CRYO Kit para preparación de viales para la congelación de células sin la necesidad de usar hielo ó alcohol

CoolSystem CRYO (Item #BCS-142) Incluye:

CoolBox CFT30 para el enfriamiento sin hielo durante la preparación de las células en la campana de flujo laminar

CoolCell recipiente para congelación a velocidad controlada para 12 tubos de 2ml


TruCool™: Tubos criogénicos Tapa que evita el derrame de líquidos y código de barras individual

•  La empaquetadura fusionada térmicamente evita el derrame de líquidos y la contaminación del O-ring (anillo)

•  Lost tubos vienen estériles y están hechos de polipropileno de grado médico que no se decolora al ser esterilizados en el autoclave

•  Lost tubos vienen codificados con código de barras individuales evitando tener que usar etiquetas (Código de barras son de 128 y 10 caracteres)

•  Opciones de enroscado interno ó externo


Opiniones del cliente John Gardner – Roslin Cellab, Reino Unido “…CoolCell es sin duda la mejor nueva tecnología en el campo de la criopreservación de células en las últimas décadas…” Rohit G. - Stanford University, E.E.U.U. “…Mantenemos un registro de procesamiento de grandes cantidades de células mononucleares de sangre periférica procesadas para criopreservación de largo tiempo. Sin duda, CoolCell ha roto esquemas y ha resultado ser el nuevo estándar para criopreservación…” Sam Knight - Ceramisphere (Australia) “…Pasé casi un año obteniendo una viabilidad muy baja de congelación de células en hielo seco (con un equipo con alcohol) y almacenamiento en nitrógeno líquido, usando células HeLa que son normalmente fácil de almacenar. Luego compré el CoolCell y ahora obtengo casi 100% de viabilidad al descongelar las células!...”


CoolCell: Resumen §  Criopreservación controlada resulta en:

§  mejor viabilidad (menos células muertas) §  mejor recuperación en “función” celular (mayor velocidad de

proliferación)

§  Máxima reproducibilidad entre muestras §  Menor selección de subpoblaciones celulares §  Necesidad de menos muestra (muestra o biopsias de

pacientes, células dificiles de transfectar, selección de células por citometría de flujo, generación de células primarias)

§  Fácil de usar, no genera residuos tóxicos, fácil de transportar


La manipulación de muestras ha tomado mucha importancia • Incremento de compañías multinacionales, laboratorios y experimentos • Incremento en la utilización de biomarcadores y métodos analíticos ultra sensibles

BioCision = Consistencia. Reproducibilidad. Estandardización. • Ensayo a ensayo • Investigador a Iinvestigador • Laboratorio a laboratorio • Sitio a sitio

Mire nuestro VIDEO

BioCision: Resumen Estandarización de muestras pre-analíticas


Genentech Amgen Pfizer Roche Harvard MIT CalTech UCSF Glaxo Bristol Myers Squibb Novartis Translational Genomics Gilead Sciences Merck MedImmune ATCC Genpharm Elan Pharmaceuticals Centocor Boehringer Ingelheim Oncomed NIH/NCI Takeda Pharmaceuticals CDC Covance XOMA Quest Diagnostics Otsuka America Pharmaceuticals Salk Institute Burnham Institute Scripps Institute Stanford University Yale Genzyme EMD Serono Shire HGT Alnylam Wyeth Cell-Systems Jackson Labs Beth Israel Deaconess Hospital HHMI Whitehead Institute Harvard Systems Biology Exelixis Charles River Labs Sanofi Pasteur Penn State Lawrence Berkeley Lab Batelle UC Berkeley Cedars Sinai Hospital Cleveland Clinic IDEXX Biogen Perkin Elmer Genetics Blood Systems Research Inst.

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