ESTRUCTURA, PROPIEDADES, PURIFICACIN Y ACTIVIDAD ENZIMTICA DE LA ENZIMA LACTATO DESHIDROGENASA DE MSCULO ESQUELTICO DE POLLO.

IntroduccinLa lactato deshidrogenasa o LDH es una L-lactato: NAD+ oxidoreductasa, y su clasificacin es EC 1.1.1.27. Es una enzima importante en el metabolismo anaerobio de la glucosa para la regeneracin del ATP. La actividad de la LDH es alta durante la actividad fsica intensa, cuando la tensin de oxgeno disminuye y la demanda de ATP es alta. Bajo condiciones aerobias, la enzima cataliza de manera reversible la conversin de lactato a piruvato (vase Fig. 1). Cuando disminuye el O2 celular o bien el pH es cercano a 7.0 la enzima cataliza la reaccin reversa, regenerndose el NAD+ permitiendo que el flujo de la va glucoltica contine.La LDH es un tetrmero cuyas subunidades tienen un peso molecular de 35 kD cada una.

Fig. 1. Reaccin que cataliza la enzima lactato deshidrogenasa. La reduccin del piruvato para formar lactato es reversible y dependiente de la presencia de la coenzima.La cromatografa es una tcnica utilizada para separar y purificar protenas segn sus propiedades. La cromatografade intercambio inico, se basa en la carga elctrica. La matriz solida tiene una carga opuesta a la de la protena que se quiere purificar. Para eluir la protena se usa una sal que contenga cargas positivas y negativas de tal manera que la protena se separe de la matriz y quede el ion contrario (en este caso Cl-) en la matriz. Aqu se utilizaron diferentes concentraciones de NaCl.El mtodo de Bradford se usa para la cuantificacin de protenas. Este mtodo se basa en la unin del colorante (Coomassie Blue G-250) a los residuos (Arg, Trp, Phe Tyr, His) de las protenas, produciendo una absorbancia mxima a 595 nm. Es un mtodo simple, rpido, barato y sensible. Primero se realiza una curva patrn con las absorbancias de concentraciones conocidas de BSA y de la ecuacin se puede calcular la concentracin de protenas de cualquier muestra.La electroforesis es una tcnica para la separacin de molculas segn la movilidad de estas en un campo elctrico a travs de una matriz porosa, la cual finalmente las separa por tamaos moleculares y carga elctrica.Las enzimas son catalizadores proteicos que aceleran la velocidad de una reaccin y no se consumen o modifican durante esta. Una de sus propiedades es su alto grado de especificidad. La LDH (enzima) requiere una coenzima (NAD+) el cual funciona como un cosustrato. Para comprobar que se tiene una protena purificada se pone a reaccionar y por ello se realizan los ensayos de cintica (actividad especfica), el cual involucra el seguimiento de la concentracin del sustrato o producto que se usa o forma durante un intervalo de tiempo. Si la fraccin recolectada en la cromatografa de intercambio inico se obtiene una mayor cantidad de protena purificada entonces obtendremos una mayor actividad enzimtica, en comparacin con las dems fracciones que contienen menor cantidad de protena purificada.Los objetivos de esta prctica son extraer y purificar la enzima lactato deshidrogenasa de msculo esqueltico de pollo mediante Cromatografa de exclusin molecular y Cromatografa de intercambio inico; monitorear el proceso de purificacin por medio de una Electroforesis en un gel de poliacrilamida-SDS y la determinacin la concentracin, pureza, rendimiento, actividad enzimtica total y especfica de la enzima LDH.Materiales y mtodosPara realizar la obtencin de la enzima LDH se parti de 70.82 gramos de pechuga de pollo previamente congelada y se llev a cabo el procedimiento para la extraccin y precipitacin por salado descrito en el manual de Practicas de Bioqumica Experimental (pg. 8-11), posteriormente se realiz el desalado del extracto proteico utilizando tubos de ultrafiltracin y por ltimo se purifico con la ayuda de una columna de intercambio inico siguiendo el procedimiento del manual (pg. 16).En cada paso de la purificacin de recolectaron diferentes volmenes de cada proceso llamados F1, F2, F3, F4, FPA, FPB y FPC.Con la obtencin de estas fracciones se determin la concentracin de protena presente en cada una por el mtodo colorimtrico de Bradford siguiendo el procedimiento del manual (pg. 18-21).Para el monitoreo del proceso de purificacin se realiz una electroforesis utilizando un gel de poliacrilamidaSDS (vase manual pg. 23-26).Por ltimo se determin la actividad enzimtica de la LDH monitoreando el cambio de absorcin del NADH y el NAD+ a 340 nm por la metodologa descrita en el manual (pg. 29-31).Resultados y discusinTabla 1. Rendimiento proteico durante las diferentes fases de la purificacin de la LDH.FraccinPromedio (g protena/L)Volumen total en la fraccin (L)Protena total de la fraccin (mg)

0---

18.117525000202.938

27.609726100201.657

330.2249220066.494

4120.52231800216.940

FPA0.0082915000.0124

FPB18.7305150028.096

FPC20.11150030.165

Fig. 2 Revelado del gel de poliacrilamida-SDS que contiene las diferentes fracciones obtenidas, las flechas marcan las posibles bandas donde se puede encontrar la LDH Se puede observar que la FPC es la que contiene mayor cantidad de protena purificada, era de esperarse ya que es la fraccin que se obtuvo de agregar la mayor concentracin de NaCl para poder separar la LDH de la columna de intercambio inico. No se puede asegurar que esa fraccin contenga solamente a la LDH porque muchas protenas pueden tener propiedades similares a esta y por lo tanto modificar la cantidad de protena purificada.Para eso se realiz una electroforesis en un gel de poliacrilamida-SDS para ver qu tan purificada estaba en las diferentes fracciones, como se puede ver en la figura 2, de la F1 a FPA se nota una gran cantidad de bandas pertenecientes a diferentes tipos de protenas, en el caso de la FPB y FPC se notan bandas muy grandes debido a que la muestra cargada en estos carriles era mucha y no se logran diferencias bien las bandas, aun as la existencia de ms de una banda nos quiere decir que hay otras protenas diferentes de la LDH que lograron adherirse a la columna de intercambio inico y salieron junto con la LDH al agregar el NaCl. La actividad enzimtica de la LDH se determin midiendo la absorbancia de NADH a 340 nm, ya que el NAD+ no absorbe a esta longitud de onda, porque la reaccin que cataliza esta enzima necesita al NADH para convertir el piruvato a lactato y conforme transcurra el tiempo la NADH se consume por lo que la absorbancia disminuye y con estos datos se puede construir curvas temporales para cada fraccin como se muestran en la figura 3, con estas curvas se calcula la pendiente y posteriormente la actividad enzimtica de la LDH en cada fraccin.

Fig. 3. Curvas de la actividad enzimtica de la LDH para cada una de las fracciones; solo se tomaron las regiones lineales de cada curva para el clculo de las pendientes de cada curva. Tabla 2. Tabla de purificacin de la LDH de msculo esqueltico de pollo.FRACCINProtena total en la fraccin (mg)Actividad total(mmol min-1)Actividad enzimtica especfica(mmol min-1mg-1)Grado de pureza o veces de purificacinRendimiento(%)

F1202.9385.1230.02531100

F2201.6575.0170.02490.9897.9212

F366.4952.8700.04321.7056.025

F4216.941.4140.00650.2627.599

FPA1.0121.276x10-40.01030.410.0025

FPB28.09586.777x10-30.00030.00950.1322

FPC30.1650.6490.02150.859512.6612

La actividad especfica de la fraccin FPA es alta, por lo que sugerimos se tiene una pequea porcin de la enzima LDH, esto puede deberse a que la columna de intercambio inico fue saturada, de tal manera que la enzima, no se retuvo por la columna, dando una mayor actividad especfica con respecto a FPB, que fue mucho ms pequea, ya que en esta se tiene una actividad baja y una gran cantidad de protenas, pero en esta se tiene en una menor medida a la LDH con respecto a la cantidad de protena total de esa fraccin, esto se puede observar en los porcentajes de rendimiento ya que el que tiene el menor rendimiento es la FPA, la FPC es en la que se tiene mayor cantidad de protena, actividad especfica y porcentaje de rendimiento, puesto que esta fraccin que contiene LDH en su forma ms purificada posible por el mtodo de Cromatografa de intercambio inico.ConclusionesSe obtuvieron tres fracciones purificadas de LDH en la Cromatografia de intercambio ionico llamadas FPA, FPB, FPC, de las cuales la FPC contiene una mayor cantidad de LDH purificada y posee una mayor actividad enzimatica especifica de las otras dos fracciones. Para saber si la actividad enzimatica es solamente de la LDH y no de otras deshidrogenasas que pudieran quedar se recomienda hacer una cromatografia de afinidad y tener una mayor pureza de esta.ResferenciasManual de prcticas de Bioqumica experimental (0141). Semestre 2013-1. Departamento de Bioqumica, Facultad de Qumica. UNAM. http://javeriana.edu.co/Facultades/Ciencias/neurobioquimica/libros/celular/electroforesis.html