CENTRO DE INVESTIGACIÓN Y ESTUDIOS AVANZADOS DEL INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

Unidad de Biotecnología e Ingeniería Genética de Plantas Departamento de Ingeniería Genética

ESTUDIO DE LA EXPRESIÓN DIFERENCIAL DE GENES INVOLUCRADOS EN LA

MADURACIÓN DEL FRUTO DE BANANO (Musa acuminata cv. “Gran Enano”)

Tesis que presenta:

M. Sc. Sandra Mabel Manrique Trujillo

para obtener el grado de Doctor en Ciencias

En la especialidad de Biotecnología de Plantas

Director de Tesis: Dr. Miguel Ángel Gómez Lim

Irapuato, Guanajuato, México Agosto, 2006

El presente trabajo fue desarrollado en el Laboratorio de Manipulación Genética de Plantas Tropicales, Departamento de Ingeniería Genética del Centro de Investigación y Estudios Avanzados del Instituto Politécnico Nacional, bajo la asesoría del Dr. Miguel Ángel Gómez Lim.

DEDICATORIAS

A MIS PADRES Ramón y Nelly

por su cariño y apoyo incondicional

A MI TATI siempre presente en mi corazón

AGRADECIMIENTOS

A la Secretaría de Relaciones Exteriores del Gobierno de México (SRE)

por la beca otorgada para la realización de mis estudios de doctorado.

A todo el personal del Centro de Investigación y Estudios Avanzados del

IPN – Unidad Irapuato por la ayuda brindada.

Al Dr. Miguel Ángel Gómez Lim por permitirme formar parte de su

laboratorio y brindarme la asesoría y facilidades para la ejecución de este

trabajo.

A los doctores John Délano Frier, June Simpson Williamson, Cristina

Reynaga Peña y Rodolfo López Gómez, miembros de mi Comité de

Sinodales, por sus acertadas sugerencias durante el desarrollo de este

trabajo y la revisión analítica de este documento.

Al Biol. Fernando Hernández por sus enseñanzas en el manejo de la

radiactividad y en la técnica de despliegue diferencial.

Al laboratorio de Secuenciación por su apoyo en la secuenciación de

todas las clonas obtenidas en este trabajo y la impresión de los

macroarreglos.

Al Dr. Octavio Martínez de la Vega y al IBQ. Juan Caballero por su ayuda

y orientación para el manejo de la base de datos MAZORKA y por sus

acertadas sugerencias.

Al Dr. Andrés Cruz, al M. en C. José Antonio Vera y a la M. en C. Corina

Hayano por compartir conmigo sus conocimientos y experiencia sobre el

manejo y cuantificación de la radiactividad así como los procedimientos

para realizar las hibridaciones de los macroarreglos.

Al IBQ. Enrique Ibarra Laclette por su orientación y valioso apoyo en el

análisis de las secuencias y la interpretación de los macroarreglos.

A la IBQ. Ana Cecilia Ramírez por colaboración y constante apoyo

durante las diferentes etapas de este trabajo y por su amistad.

A todos los compañeros del Laboratorio de Manipulación Genética de

Plantas Tropicales (L-15) con los que compartimos diversas vivencias

durante mi estancia allí.

A todos los profesores y compañeros de quienes aprendí algo durante mi

estancia académica en el CINVESTAV.

ÍNDICE GENERAL

Pág.

- ÍNDICE GENERAL i

- ÍNDICE DE FIGURAS vi

- ÍNDICE DE TABLAS ix

- ABREVIATURAS x

- RESUMEN 1

- ABSTRACT 2

I. INTRODUCCIÓN 3

I.1. Los frutos climatéricos y no climatéricos 3

I.2 Maduración de los frutos climatéricos 3

I.3 El etileno 4

I.4 La respiración climatérica 5

I.5 Producción e importancia del cultivo de banano 5

I.6 El fruto de banano 6

I.7 Expresión de genes involucrados en la maduración del

banano 12

I.8 Técnicas moleculares para el estudio de la expresión génica 13

I.8.1 Despliegue diferencial 14

I.8.2 Hibridación por supresión sustractiva 16

I.8.3 Arreglos de DNA 17

I.8.3.1 Macroarreglos 18

I.8.3.2 Microarreglos 19

I.8.4 Secuenciación de ESTs 19

I.8.4.1 Ensamblaje de ESTs 20

I.8.5 Análisis bioinformáticos 21

- i -

I.8.6 Justificación del trabajo 22

II. OBJETIVOS 24

II.1. OBJETIVO GENERAL 24

II.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS 24

III. MATERIALES Y MÉTODOS 25

III.1. Material vegetal 25

III.2. Extracción de RNA 25

III.3. Tratamiento con DNasa I 26

III.4. Despliegue diferencial 26

III.4.1. Oligonucleótidos empleados en el despliegue

Diferencial 28

III.4.2. Transcripción reversa de mRNA 28

III.4.3. Marcaje radiactivo de los oligos 29

III.4.4. Amplificación por PCR 29

III.4.5. Marcaje radiactivo del marcador de tamaño 30

III.4.6. Resolución del cDNA amplificado 30

III.4.7. Preparación del gel de acrilamida 6%, urea 8 M 31

III.4.8. Electroforesis 32

III.4.9. Análisis del gel de despliegue diferencial 32

III.4.10. Recuperación de fragmentos de cDNA 33

III.5. Construcción de la biblioteca sustractiva de cDNA 35

III.5.1. Síntesis de la primera cadena de cDNA de las 85

muestras y “Control SMART”

III.5.2. Síntesis de la primera cadena de cDNA del 86

“Control PCR-Select”

III.5.3. Síntesis de la segunda cadena de cDNA del 38

“Control PCR-Select”

III.5.4. Síntesis de la segunda cadena de cDNA de las 39

muestras y “control SMART”

- ii -

III.5.5. Cromatografía en columna del “Tester”, “Driver” 40

y “Control SMART”

III.5.6. Digestión del “Tester”, “Driver” y “Control SMART” 42

con Rsa I

III.5.7. Purificación de la digestión de cDNAs 42

III.5.8. Digestión del “Control PCR-Select” con Rsa I 43

III.5.9. Ligación de los adaptadores 44

III.5.10. Análisis de la ligación 46

III.5.11. Primera hibridación 47

III.5.12. Segunda hibridación 48

III.5.13. Primera PCR 48

III.5.14. Segunda PCR 49

III.6. Clonación de los fragmentos diferenciales reamplificados 50

III.7. Confirmación de la clonación 51

III.8. Resiembra de las clonas diferenciales y almacenamiento 51

de réplicas

III.9. Secuenciación y análisis de secuencias 52

III.10. Escrutinio diferencial 53

III.10.1. Amplificación de insertos por PCR 53

III.10.2. Preparación de los controles 54

III.10.3. Impresión de las membranas de nylon 54

III.10.4. Preparación de sondas 55

III.10.4.1. Reacción de síntesis de la primera y 55

segunda cadena de cDNA de las sondas

III.10.4.2. Marcaje de las sondas 55

III.10.4.3. Purificación y cuantificación de las 56

sondas

III.10.5. Prehibridación e hibridación de las membranas 56

III.10.6. Análisis de los resultados de la hibridación 57

III.11. Análisis northern blot 57

- iii -

IV. RESULTADOS 59

VI. 1 Extracción de RNA total 59

VI. 2 Despliegue diferencial 59

VI.2.1 Pruebas preliminares 60

VI.2.2 Comparación de dos métodos de recuperación de 61

bandas

VI.2.3 Experimentos definitivos de despliegue diferencial 62

VI.3. Construcción de la biblioteca sustractiva de cDNA 66

VI.4 Secuenciación y análisis de secuencias 72

VI.4.1 Ensamblaje de ESTs 73

VI.4.2 Anotación de los unigenes y análisis derivados 74

VI.5 Escrutinio diferencial 77

VI.6 Análisis de ensamblaje y alineamiento 97

VI.7 Análisis de la expresión diferencial 100

V. DISCUSIÓN 107

V.1 Despliegue diferencial 107

V.2 Construcción de la biblioteca sustractiva de cDNA 108

V.3 Ensamblaje de ESTs 109

V.4 Anotación y clasificación funcional 110

V.5 Escrutinio diferencial 112

V.6 Distribución funcional de los unigenes con expresión 113

diferencial confirmada

V.7 Análisis de la expresión diferencial a lo largo de la 116

maduración de los unigenes seleccionados

VI. CONCLUSIONES 123

VII. PERSPECTIVAS 125

VII. REFERENCIAS 126

- iv -

VIII. ANEXOS 146

ANEXO 1. Método para aislamiento de RNA total de tejido de 147

fruto de banano

ANEXO 2. Método simple y eficiente para aislamiento de RNA total 149

de arboles de pino

ANEXO 3. Preparación de soluciones 151

ANEXO 4. Ensamblado de secuencias y alineamientos manuales 152

• Pectato liasa 2 152

• Disulfuro oxidoreductasa dependiente de piridín

nucleótidos 156

• Tiorredoxina 158

• Beta-glucosidasa 161

• Citocromo P450 164

• Precursor d ela proteína GASA2 regulado por giberelinas 168

• Orcinol O-metil transferasas 169

- v -

ÍNDICE DE FIGURAS

Pág.

Figura 1. Estadios de maduración del fruto de banano según 9

el índice de color de la cáscara

Figura 2. Diagrama de flujo de la metodología empleada para la 27

identificación y análisis de los transcritos de expresión

diferencial durante la maduración de banano

Figura 3. Diagrama de flujo de la construcción de la biblioteca 37

sustractiva de cDNA del estadio PCI 5 de maduración de

banano con respecto al PCI 1

Figura 4. Gel de electroforesis comparando los dos métodos de 61

recuperación y reamplificación de bandas:

Wang et al. (1998) y Verástegui-Peña (1999)

Figura 5. Gel de despliegue diferencial de cDNAs de pulpa de banano 63

Figura 6. Secciones ampliadas de las autoradiografías obtenidas de 64

geles de despliegue diferencial donde se observan los

diferentes patrones de bandeo

Figura 7. Determinación del número óptimo de ciclos de PCR para 67

la síntesis de la segunda cadena de cDNA

Figura 8. Análisis de la purificación de los productos de PCR por 68

cromatografía en columna

Figura 9. Análisis de la digestión con Rsa I 69

Figura 10. Análisis por electroforesis en gel de agarosa de la eficiencia 70

de la sustracción y amplificación de productos

Figura 11. Análisis de la amplificación para la ligación 71

- vi -

Figura 12. Confirmación de la clonación de los fragmentos de la 72

biblioteca sustractiva de cDNA

Figura 13. Clasificación funcional de los unigenes anotados producto 76

del despliegue diferencial

Figura 14. Clasificación funcional de los unigenes anotados producto 76

de la biblioteca sustractiva de cDNA

Figura 15. Clasificación funcional de todos los unigenes anotados 77

conformados por ESTs provenientes de la construcción de

la biblioteca sustractiva de cDNA y del despliegue diferencial

Figura 16. Primer experimento de escrutinio diferencial 81

Figura 17. Reproducibilidad de las señales de hibridación 82

Figura 18. Segundo experimento de escrutinio diferencial realizado con 83

el juego de membranas A

Figura 19. Segundo experimento de escrutinio diferencial realizado con 84

el juego de membranas B

Figura 20. Análisis de frecuencia de las intensidades de señal de las 173 85

clonas seleccionadas como positivas, producto del escrutinio

diferencial

Figura 21. Patrones de expresión observados durante la maduración de 86

banano

Figura 22. Perfiles de expresión en tejido de pulpa de banano, de 102

cuatro clonas seleccionadas positivas en el escrutinio

diferencial

Figura 23. Perfiles de expresión en tejido de pulpa, cáscara, hoja y raíz, 103

de siete clonas seleccionadas positivas en el escrutinio

diferencial

- vii -

Figura 24. Perfiles de expresión en los siete estadios de maduración de 104

pulpa y cáscara de banano, así como en tejido de hoja,

nervadura, bráctea, órganos reproductivos, cormo y raíz, de

siete clonas seleccionadas positivas en el escrutinio

diferencial

- viii -

ÍNDICE DE TABLAS

Pág.

Tabla 1. Producción de bananos y plátanos a nivel mundial según 8

las estadísticas de la FAO

Tabla 2. Resultados preliminares del despliegue diferencial 60

Tabla 3. Cuadro comparativo de los resultados obtenidos en el 65

despliegue diferencial

Tabla 4. Expresión de los 158 fragmentos diferenciales clonados y 66

secuenciados

Tabla 5. Resultados de la secuenciación de los fragmentos obtenidos 73

por las dos técnicas de análisis de expresión diferencial de

genes empleadas

Tabla 6. Resumen comparativo de los resultados del ensamblaje de 74

ESTs de la biblioteca sustractiva de cDNA y del

despliegue diferencial

Tabla 7. ESTs representativos de los contigs seleccionados como 87

diferencialmente expresados durante la maduración del

banano, agrupados por categorías funcionales

- ix -

ABREVIATURAS • ACC Ácido 1-aminociclopropano-1-carboxílico

• BLAST Basic Local Alignment Search Tool

(de sus siglas en inglés)

• cDNA Ácido desoxirribonucleico complementario

• cDNA-AFLP cDNA-Amplified Fragment Length Polymorphism

(de sus siglas en inglés)

• Ci Curies

• cm Centímetros

• DD Despliegue diferencial

• DEPC Dietilpirocarbonato

• DNA Ácido desoxirribonucleico

• dNTP Desoxirribonucleótidos trifosfatados

• DTT Ditiotreitol

• EDTA Ácido etilendiaminotetraacético

• EFE Enzima formadora de etileno

• EST Expressed Sequence Tag (de sus siglas en inglés)

• BrEt Bromuro de etidio

• g Gramos

• h Horas

• IPTG Isopropil-tio-β-D-galactopiranósido

• Kb Kilopares de bases

• L Litros

• LB Medio de cultivo Luria-Bertani

• LD-PCR Reacción en cadena de la polimerasa de larga

distancia (de “Long Distance Polymerase Chain

Reaction”)

• M Molar

• min Minutos

- x -

• Minipreps Extracción de DNA plasmídico a pequeña escala

• ml Mililitros

• mm Milimetros

• mM Milimolar

• mmol Milimoles

• Mpb megapares de bases

• mRNA Ácido ribonucleico mensajero

• ng Nanogramos

• ºC Grados centígrados

• Oligos Oligonucleótidos

• Oligos-dT Oligonucleótidos de cola poli T

• pb Pares de bases

• PCI Índice de color de la cáscara (de “peel color

index”)

• PCR Reacción en cadena de la polimerasa

• Poli A Región poliadenilada

• RNA Ácido ribonucleico

• rpm Revoluciones por minuto

• RT Transcriptasa reversa

• RT-PCR Transcripción reversa - reacción en cadena de la

polimerasa

• S-AdoMet S-adenosil L-metionina

• SDS Dodecil sulfato de sodio

• S Segundos

• SOC medio de cultivo Luria-Bertani enriquecido con

glucosa

• SSC Solución de citrato de sodio

• SSH Hibridación sustractiva por supresión

• TAE Solución Tris-ácido acético-EDTA

• TBE Solución Tris-Borato-EDTA

- xi -

• TE Solución Tris-EDTA

• TNE Solución Tris sodio-EDTA

• U Unidades de actividad enzimática

• UDP Uridín difosfato

• UV Ultravioleta

• v/v Volumen por volumen

• X-Gal 5-bromo-4-cloro-3-indol-β-D-galactósido

• μg Microgramo

• μl Microlitros

• μM Micromolar

- xii -

- 1 -

RESUMEN

El banano (Musa acuminata, subgrupo Cavendish ‘Gran Enano’) es un

fruto climatérico de gran importancia mundial con una fuerte

problemática de comercialización debido a su alta actividad metabólica

postcosecha, la cual conduce a una corta vida de anaquel. A nivel

molecular, existen muy pocos trabajos realizados sobre el estudio de la

maduración de los bananos y éstos se han enfocado solo en los primeros

estadios de maduración.

En el presente trabajo se empleó el despliegue diferencial comparando

los estadios PCI 1, PCI 5 y PCI 7, y se construyó una biblioteca

sustractiva de cDNA del estadio PCI 5 para la identificación y aislamiento

de genes de expresión diferencial durante la maduración del fruto de

banano. Los fragmentos de cDNAs diferenciales provenientes de ambas

técnicas fueron secuenciados y las 545 secuencias resultantes fueron

ensambladas en contigs, mismos que fueron luego analizados con

diferentes bases de datos para asignarles una identificación putativa. La

expresión diferencial de 173 ESTs fue confirmada por medio de

macroarreglos y un alineamiento de las secuencias consenso de los

contigs de estos ESTs, con similitud hacia la misma proteína dio como

resultado 160 transcritos con expresión diferencial confirmada, dentro de

los cuales la clase funcional más representada fue la de metabolismo de

carbohidratos y producción de energía. Para 18 de los transcritos

diferenciales confirmados se obtuvieron los perfiles de expresión en los

siete estadios de maduración de fruto así como en otros tejidos,

encontrando que cinco de ellos presentaron expresión específica de pulpa

y cáscara de banano. Los resultados obtenidos constituyen un aporte a

la comprensión de los procesos metabólicos involucrados en la

maduración.

- 2 -

ABSTRACT

Banana (Musa acuminata, subgroup Cavendish ‘Grand Nain’) is a climacteric

fruit economically important, with a short shelf-life due to high postharvest

metabolic activity which causes the main trading problems for this crop fruit.

Nowadays there are few studies about banana ripening at the molecular level

and those are focused on early ripening stages only.

In the present work, mRNA differential display was employed to compare PCI

1, PCI 5 and PCI 7 banana ripening stages, and a cDNA subtraction library

was constructed from PCI 5 to identify and isolate differentially expressed

genes during banana ripening. Differential cDNA fragments obtained from

both approaches were sequenced, and the resulting sequences were

assembled into 545 contigs, which were analized through sequence

alignments with different databases to assign a putative identification.

Differential expression of 173 ESTs was confirmed by cDNA arrays, and

further alignment of contigs annotated with the same protein showed 160

transcripts with confirmed differential expression. The most represented

functional class was carbohydrate metabolism and energy production.

Expression profiles of 18 transcripts were obtained at the seven banana fruit

ripening stages, as well as in other banana tissues. Transcripts analyzed by

northern blot correspond to functional categories of defense, stress response

and detoxification, amino acid metabolism, carbohydrate metabolism and

energy, protein metabolism, secondary metabolism, cell wall, transcription,

transport and other with unknown or no annotated function.

Besides providing an overview of gene expression programmes and metabolic

pathways in the later stages of banana fruit ripening, this study contributes

to increase the available information of banana fruit ESTs, which can be

useful for quality improvement approaches.

- 3 -

I. INTRODUCCIÓN

I.1. Los frutos climatéricos y no climatéricos

La maduración de los frutos involucra una serie de procesos altamente

diversos con marcadas variaciones entre los diferentes tipos de frutos. De

manera general, los frutos han sido clasificados en dos grupos: climatéricos y

no climatéricos, dependiendo del modelo respiratorio y de síntesis de etileno

que presenten durante la maduración (Tucker y Grierson, 1987; Giovannoni,

2001).

El banano, así como el tomate y la manzana, son frutos climatéricos y se

distinguen de los no climatéricos (como los cítricos, la fresa y la uva) por su

incremento en la respiración y biosíntesis de etileno durante la maduración.

En los frutos no climatéricos puede haber producción de etileno, pero éste no

es requerido en el proceso de maduración del fruto (Giovannoni, 2001).

I.2 Maduración de los frutos climatéricos

En los frutos climatéricos el etileno actúa como un regulador del inicio de la

maduración, desencadenando cambios en el color, aroma, textura y sabor de

los frutos (Deikman, 1997; Lelièvre et al., 1997). En la etapa preclimatérica

este compuesto se produce de manera constante y en muy baja

concentración, pero al inicio de la maduración la síntesis de etileno se eleva

considerablemente, seguida por un incremento en la actividad respiratoria

(Seymour et al., 1993; Nakatsuka et al., 1998; Borja-Flores et al., 2001).

La transición metabólica que tiene lugar durante la maduración está dictada

por una serie de cambios en la expresión de genes, lo cual requiere de la

presencia de nuevos mRNAs para la síntesis de proteínas de novo (Brady,

1987; Bleecker y Kende, 2000).

- 4 -

Se han empleado diferentes estrategias para el estudio de la expresión de

genes involucrados en la maduración, usando como modelo principal dentro

de los frutos climatéricos al tomate y dentro de los no climatéricos a la fresa

(Giovannoni, 2004). Se han aislado numerosos genes relacionados con el

proceso de desarrollo y maduración de frutos. La tecnología antisentido ha

sido ampliamente utilizada en tomate para estudiar la expresión de genes

relacionados con el ablandamiento del fruto, la biosíntesis de etileno y la

biosíntesis de carotenoides (Gray et al., 1992; Fray y Grierson, 1993). La

biosíntesis de etileno y el ablandamiento del fruto han sido los procesos que

mayor atención han recibido, realizándose extensivas investigaciones sobre

los genes que intervienen en éstos (Melotto et al., 1994; Lelièvre et al., 1997).

También se han hecho estudios sobre la expresión diferencial de genes

implicados en el proceso de la maduración en respuesta al etileno en frutos

como aguacate (Christoffersen et al., 1982), tomate, (Grierson et al., 1985;

Pear et al., 1989), durazno (Callahan et al., 1989), manzana (Lay-Yee et al.,

1990), pera (Wilson et al., 1990), pera japonesa, (Itai et al., 2000), mango

(López-Gómez y Gómez Lim, 1992), kiwi (Ledger y Garner, 1994) y melón

(Aggelis et al., 1997; Hadfield et al., 2000), resultando en la identificación de

componentes de rutas bioquímicas involucradas en la biosíntesis de etileno,

transducción de señales de etileno, metabolismo de carbohidratos,

modificaciones de la pared celular y cambios en la pigmentación del fruto

(Gray et al., 1992; Hadfield et al., 2000; Karakurt y Huber, 2004).

I.3 El etileno

En las plantas superiores, el mecanismo de síntesis de etileno ha sido

ampliamente estudiado. La molécula clave para el inicio de este proceso es la

metionina, precursor de la S-adenosil L-metionina (S-AdoMet), principal

donadora de grupos metilo en plantas, sobre la cual actúa la enzima ACC

sintasa para producir el ácido 1-aminociclopropano-1-carboxílico (ACC), que

- 5 -

se transforma en etileno por acción de la enzima formadora de etileno (EFE) o

ACC oxidasa (Kende, 1993; Wang et al., 2002).

Existe una serie de factores que pueden inducir la síntesis de etileno; dentro

de ellos, uno de los más importantes es el etileno mismo, que actúa

regulando su propia síntesis. Además, se ha demostrado que el control de la

síntesis de etileno es un proceso muy complejo (Yang y Hoffman, 1984;

Lelièvre et al., 1997).

I.4 La respiración climatérica

La maduración es un proceso metabólico que requiere de energía para la

síntesis de mRNAs y proteínas. Esta energía es proporcionada por la

respiración. En los frutos climatéricos el etileno induce la actividad

respiratoria. El pico de actividad respiratoria que se presenta durante la

maduración de los frutos climatéricos es característico de este grupo (Brady,

1987; Tucker, 1993).

Los carbohidratos y los ácidos orgánicos son los principales sustratos

utilizados en la respiración climatérica mediante la vía glicolítica, el ciclo

oxidativo de las pentosas fosfato, el ciclo de Krebs y la oxidación del ácido

málico (Tucker y Grierson, 1987).

Una evidencia clara de la utilización de los carbohidratos durante la

respiración climatérica consiste en la actividad incrementada de dos enzimas

clave dentro de la vía glicolítica: la fosfofructoquinasa y la piruvato quinasa

(Tucker y Grierson, 1987).

I.5 Producción e importancia del cultivo de banano

Los bananos, incluidos los plátanos y otros tipos de bananos de cocción, son

considerados como alimento básico y contribuyen a la seguridad alimentaria

- 6 -

de millones de personas en gran parte del mundo en desarrollo,

proporcionando además ingresos y empleo a las poblaciones rurales. Como

producto de exportación, el banano contribuye de forma decisiva a las

economías de muchos países entre los que figuran India, Brasil, China,

Ecuador, Filipinas, Indonesia, Costa Rica, México y Tailandia, entre otros. Es

la fruta fresca más exportada del mundo en cuanto a volumen y valor (Arias

et al., 2004; FAOSTAT, 2005).

Los bananos y plátanos son cultivos perennes que crecen con rapidez y

pueden cosecharse durante todo el año. En el año 2005, la superficie

cultivada mundial de bananos y plátanos fue de cerca de diez millones de

hectáreas, con una producción global de alrededor de 105 millones de

toneladas. Estas cifras corresponden a aproximaciones realizadas por la

FAOSTAT, ya que una considerable proporción de la producción de bananos

y plátanos procede de parcelas relativamente pequeñas y huertos familiares

de los cuales no hay datos estadísticos (FAOSTAT, 2005).

El subgrupo Cavendish, conocido como banano para postre y que constituye

el 47% de la producción mundial, es el principal subgrupo de banano

comercializado en el mundo. Los principales países productores de bananos

de este subgrupo se encuentran en África, Asia, América Latina y el Caribe.

La producción de banano Cavendish en México corresponde al 4% de la

producción mundial, según los promedios de producción mundial de los años

1998-2002, esto lo ubica en el séptimo lugar en la producción de este tipo de

bananos, conjuntamente con Filipinas (Arias et al., 2004).

I.6 El fruto de banano

El banano Musa sp. cv. ¨Gran Enano¨, pertenece al grupo AAA, subgrupo

Cavendish y es actualmente considerado como el principal cultivar de

exportación por las características de su fruto, su resistencia al volcamiento y

- 7 -

a enfermedades tales como el ¨Mal de Panamᨠ(Angarita-Zerda y Perea-

Dallos, 1991; Robinson, 1996).

En la postcosecha, los frutos de banano pasan por tres etapas de desarrollo

fisiológico: la preclimatérica o de vida verde, la climatérica, y el estado

maduro (Robinson, 1996).

El período preclimatérico o fase de almacenaje verde abarca desde la cosecha

del fruto hasta el inicio de la respiración climatérica y se caracteriza por una

actividad metabólica muy baja; en esta fase los frutos permanecen firmes,

verdes y sin cambios significativos en el color de la cáscara, textura o

composición. Después del período preclimatérico se desencadena la

producción de etileno, señalando el inicio del período climatérico (Robinson,

1996; Dadzie, 1997).

Asociados al período climatérico se encuentran numerosos procesos

bioquímicos y de desarrollo, tales como un incremento transitorio y rápido de

la producción de etileno (Moya-León y John, 1995; López-Gómez et al., 1997;

Liu et al., 1999), un acelerado incremento de la actividad respiratoria

(Karikari et al., 1979; Beaudry et al., 1987, 1989; Kanellis et al., 1989), el

amarillamiento de la piel como resultado de la degradación de la clorofila

(Drury et al., 1999), cambios en la pared celular (Domínguez-Puigjaner et al.,

1997; Pathak y Sanwal, 1998; Pua et al., 2001; Marín-Rodríguez et al.,

2003), disminución de los polifenoles que son los responsables de la

astringencia del fruto inmaduro (Robinson, 1996), ablandamiento del fruto

(Kojima et al., 1994), incremento de la síntesis de isoamil acetato, principal

componente del aroma característico del fruto (Harada et al., 1985;

Beekwilder et al., 2004) y la degradación del almidón en glucosa (Hill y ap

Rees, 1994; Cordenunsi y Lajolo 1995; Oliveira do Nascimento et al., 1997,

2000; Prabha y Bhagyalakshmi, 1998; da Mota et al., 2002). Todos estos

procesos ocasionan cambios en el color, textura, sabor y aroma de la fruta.

- 8 -

2005 - Bananos

Países Superficie cultivada (Ha)

Rendimiento (Hg/Ha)

Producción (Mt)

India 680,000 247,353 16,820,000 Brasil 494,462 135,557 6,702,760 China 274,200 233,042 6,390,000

Ecuador 209,027 281,200 5,877,830 Filipinas 430,000 134,884 5,800,000

Indonesia 315,000 69,083 4,503,467 Costa Rica 45,700 485,777 2,220,000

México 72,645 278,974 2,026,610 Tailandia 153,000 130,719 2,000,000 Burundi 300,000 53,333 1,600,000

Colombia 62,000 258,065 1,600,000 Viet Nam 95,000 131,579 1,250,000

Guatemala 19,040 525,210 1,000,000 Otros 1,287,596 16,067,960 14,637,895

2005 - Plátanos

Países Superficie cultivada (Ha)

Rendimiento (Hg/Ha)

Producción (Mt)

Uganda 1,670,000 59,281 9,900,000 Colombia 413,000 82,324 3,400,000 Ruanda 361,251 71,781 2,593,080 Ghana 281,192 84,670 2,380,858 Nigeria 389,000 54,062 2,103,000

Perú 136,000 124,265 1,690,000 Costa de Marfil 390,000 34,615 1,350,000

Camerún 200,000 60,000 1,200,000 Congo, Rep Dem del 265,603 44,918 1,193,024

Ecuador 144,942 69,871 1,012,720 Otros 994,749 4,378,251 6,585,539

2005 Superficie

cultivada (Ha) Rendimiento

(Hg/Ha) Producción

(Mt) Bananos 4,437,670 19,032,736 72,428,562 Plátanos 5,245,737 5,064,038 33,408,221

Total 9,683,407 24,096,774 105,836,783

Tabla 1. Producción de bananos y plátanos a nivel mundial, según las estadísticas de la FAO (FAOSTAT, 2005). Los cuadros A y B muestran la producción anual de bananos y plátanos por países para el 2005, respectivamente. El cuadro C muestra la producción global de bananos y plátanos en el 2005.

A

B

C

- 9 -

El grado de madurez de los bananos ha sido correlacionado con los cambios

en el color de la piel. Con base en esto, a nivel comercial se maneja una

escala de índice de color de la piel (PCI) del banano que consta de siete

etapas:

PCI 1 ó FG : frutos totalmente verdes

PCI 2 ó TY : verdes con trazas de amarillo

PCI 3 ó MG : frutos de coloración más verde que amarillo

PCI 4 ó MY : de color más amarillo que verde

PCI 5 ó GT : frutos con solo los extremos verdes

PCI 6 ó FY : totalmente amarillos

PCI 7 ó YB : frutos amarillos con pintas marrones

Figura 1. Estadios de maduración del fruto de banano según el índice de color de la cáscara (PCI).

PCI 1 PCI 2 PCI 3

PCI 4 PCI 5 PCI 6 PCI 7

- 10 -

Esta escala comercial (PCI 1 a PCI 7), elaborada por la empresa Chiquita

Brands Inc., de Cincinnati, OH. EUA, se corresponde con la clasificación

establecida por Stover y Simmonds (1987), también referida al color de la piel

del fruto (FG a FY). Los cambios a nivel del color de la piel además han sido

correlacionados con otros parámetros fisiológicos de la maduración del

banano, correspondiendo el pico de producción de etileno a la etapa PCI 2 y

la máxima actividad respiratoria a la etapa PCI 4 (Agravante et al., 1991).

Durante la maduración del banano la concentración de intermediarios

glicolíticos se incrementa en respuesta a la rápida conversión de almidón en

azúcar y CO2, alcanzando una elevación de la actividad respiratoria de 50 a

100 veces mayor durante el pico climatérico de respiración (Beaudry et al.,

1989). La fosfofructoquinasa, enzima clave en el control de la glicólisis, se ha

purificado y se han identificado múltiples formas, estableciéndose una

correlación entre el proceso de maduración y la conversión de la forma

oligomérica de la fosfofructoquinasa a formas monoméricas más activas (Iyer

et al., 1989a, 1989b; Surendranathan et al., 1990). También se ha observado

que los niveles de fructosa 2,6-bisfosfato pueden servir como un buen

indicador en el cambio de preferencia metabólica entre gluconeogénesis y

flujo glicolítico del carbono puesto que una baja concentración de fructosa

2,6-bisfosfato coincide con un estado de actividad gluconeogénica

incrementada mientras que un nivel incrementado de fructosa 2,6-bisfosfato

es asociado con períodos de relativamente alta actividad glicolítica y baja

actividad gluconeogénica (Beaudry et al., 1987, 1989).

Los ácidos orgánicos juegan un papel importante en el proceso de la

gluconeogénesis; por esta vía, los lípidos de reserva son transformados en

carbohidratos. En relación con la gluconeogénesis, en frutos maduros de

banano se ha identificado la presencia de transcritos que codifican para la

malato sintasa, enzima clave en la síntesis de ácido málico, involucrada en el

ciclo del glioxilato (Pua et al., 2003).

- 11 -

El proceso de degradación de carbohidratos está muy relacionado con el

proceso de respiración. Durante la maduración, el almidón es degradado

rápidamente a sacarosa, glucosa y fructosa, siendo la sacarosa el azúcar

predominante. En este proceso están involucradas enzimas hidrolíticas y

fosforolíticas (García y Lajolo, 1988). Dentro de las enzimas de degradación

de almidón y síntesis de sacarosa, aisladas en banano, se encuentran la

amilasa y glucosidasa (García y Lajolo, 1988), almidón fosforilasa (da Mota et

al., 2002), sacarosa fosfato sintasa (Cordenunsi y Lajolo, 1995; Oliveira do

Nascimento et al., 1997), sacarosa sintasa, UDP glucosa pirofosforilasa e

invertasa (Terra et al., 1983; Oliveira do Nascimento et al., 2000; Pua et al.,

2000).

Simultáneamente a la degradación del almidón, ocurren cambios en la pared

celular, lo que da como resultado el ablandamiento del fruto (Kojima et al.,

1994; Hill y ap Rees, 1994). La degradación de la pared celular tiene lugar

debido a cambios en la fracción péctica de la lamela media y la pared, los

cuales son atribuidos principalmente a la acción de varias enzimas tales

como la poligalacturonasa, la pectin metilesterasa y la pectato liasa

(Brownleader et al., 1999). En el caso del banano, estos cambios de textura

ocurren muy rápidamente provocando un período muy corto de vida

postcosecha, característico en este tipo de frutos.

La mayoría de los trabajos realizados sobre degradación de pectinas durante

la maduración han sido realizados en tomate. En este fruto la principal

enzima de degradación de la pectina de la pared celular ha resultado ser la

poligalacturonasa, seguida por la pectin metilesterasa (Fischer y Bennett,

1991). La poligalacturonasa cataliza la ruptura hidrolítica de los enlaces -(1-

4) de los residuos desmetilados de ácido galacturónico y la pectin

metilesterasa cataliza la desesterificación de ésteres metílicos de pectina

(Tieman et al., 1992; Sitrit y Bennett, 1998).

La poligalacturonasa es la principal enzima en la degradación de pectina

durante la maduración de varios frutos. En banano, se ha identificado la

- 12 -

presencia de poligalacturonasa, pectin metilesterasa y pectato liasa. No

obstante, los niveles de poligalacturonasa son más bien bajos, siendo la

pectato liasa la enzima de degradación de pectina más abundante

(Domínguez-Puigjaner et al., 1997; Pathak y Sanwal, 1998; Pua et al., 2001;

Marín-Rodríguez et al., 2003).

I.7 Expresión de genes involucrados en la maduración del banano

Se han realizado algunos trabajos dirigidos al aislamiento y caracterización

de genes específicos involucrados en el proceso de maduración, que codifican

para enzimas como la quitinasa ácida clase III (Clendennen et al., 1998), la

UDP-glucosa pirofosforilasa (Pua et al., 2000), la pectato liasa (Domínguez-

Puigjaner et al., 1997; Pua et al., 2001), la polifenol oxidasa (Gooding et al.,

2001), la malato sintasa (Pua et al., 2003) y la citocromo P450 (Pua y Lee,

2003). En estos trabajos, las metodologías empleadas para el aislamiento de

genes involucran, en su mayoría, la construcción de bibliotecas de cDNA de

frutos en maduración y el uso de sondas degeneradas del gen específico

elaboradas con base en la similitud de secuencias con genes aislados en

otras especies.

A la fecha, tan sólo dos estudios que analizan la expresión diferencial de

genes involucrados en la maduración del banano han sido reportados: el de

Clendennen y May (1997) y el de Medina–Suárez et al. (1997).

En la investigación realizada por Clendennen y May (1997) se llevó a cabo el

escrutinio diferencial de dos bibliotecas de cDNA de pulpa de banano, una

del estadio PCI 1 y otra del PCI 3. De este escrutinio se aislaron once grupos

de mRNAs no redundantes, expresados diferencialmente, de los cuales dos

codificaron para proteínas involucradas en el metabolismo de carbohidratos,

mientras que los otros transcritos codificaron para proteínas asociadas con

senescencia, patogénesis y respuesta de las plantas al estrés. Sin embargo,

no se encontraron los transcritos que codifican para una serie de proteínas

- 13 -

como fosfofructoquinasa, sacarosa fosfato sintasa, almidón fosforilasa,

amilasa e invertasa, las cuales incrementan sus niveles de actividad

enzimática antes y durante el pico máximo de la respiración climatérica.

Medina–Suárez et al. (1997), usando pulpa de banano, construyeron una

biblioteca de cDNA de frutos tratados con etileno por 24 horas y realizaron el

escrutinio confrontándola con cDNAs de frutos preclimatéricos sin

tratamiento con etileno y cDNAs de frutos cinco días después de haber sido

tratados con etileno. Ellos lograron identificar 25 grupos de clonas no

redundantes relacionadas con la maduración; estos grupos de clonas

codificaron para enzimas involucradas en la biosíntesis de etileno,

respiración, metabolismo del almidón, degradación de la pared celular y otros

eventos metabólicos.

Si bien los trabajos anteriores contribuyeron al conocimiento de los

mecanismos moleculares de los procesos que tienen lugar durante la

maduración del banano, sólo incluyeron los tres primeros estadios de la

maduración y además, en ambos casos, no se detectaron los genes de una

serie de enzimas directamente relacionadas con el proceso de maduración.

I.8 Técnicas moleculares para el estudio de la expresión génica

En las últimas décadas, el desarrollo de diversas tecnologías para la

evaluación de la expresión de genes ha progresado significativamente. La

caracterización de los perfiles de expresión de genes específicos de tejido, o

transcriptomas, permiten evaluar de manera global la expresión de los genes

proporcionando los mecanismos necesarios para la identificación inicial y

agrupamiento de secuencias de genes nuevos en relación con la función

asignada (Moody, 2001; Cheval et al., 2002; Alba et al., 2004).

La identificación de mRNAs diferencialmente expresados se viene empleando

actualmente no sólo para ayudar a la comprensión de la función de un único

- 14 -

gen, sino mas bien para contribuir al entendimiento de los mecanismos

moleculares de un proceso biológico particular, como lo son el control del

ciclo celular, la transducción de señales o la maduración de frutos (Wan et

al., 1996).

Dentro de los métodos disponibles, desarrollados para el estudio global de los

genes que presentan diferencias de expresión al compararlos entre diferentes

muestras experimentales, tenemos el despliegue diferencial, el cDNA-AFLP, la

hibridación sustractiva, la secuenciación de ESTs, el análisis serial de la

expresión de genes (SAGE), los arreglos de cDNA (macroarreglos,

microarreglos y chips de oligonucleótidos), entre otros (Moody, 2001; Alba et

al., 2004). Además, la tecnología de secuenciación automatizada y el gran

número de secuencias de ácidos nucleicos de diferentes especies disponibles

en los bancos de datos, son herramientas clave para el análisis de la función

de los grupos de genes identificados (Martin, 1998; Venter y Botha, 2004).

I.8.1 Despliegue diferencial

La técnica de despliegue diferencial fue introducida por Liang y Pardee

(1992), para determinar la expresión diferencial de genes en dos o más tejidos

o en condiciones distintas. La estrategia empleada consiste en utilizar un

número limitado de oligonucleótidos (oligos) arbitrarios cortos en

combinación con oligos-dT anclados para realizar un RT-PCR a partir de RNA

total donde los cDNAs resultantes son separados en un gel de secuenciación.

Inicialmente, los oligos arbitrarios empleados fueron decámeros y los oligos-

dT anclados presentaban dos bases adicionales; sin embargo, en estudios

posteriores se determinó que los tamaños de oligos más apropiados para la

formación de los subgrupos de mRNAs correspondían a oligos arbitrarios de

trece bases y oligos-dT anclados de tan sólo una base adicional (Liang et al.,

1994; Ayala et al., 1995).

- 15 -

Cada combinación de oligos empleados está diseñada para amplificar una

sub-fracción de los mRNAs presentes en el extracto. Por ello, se requiere el

uso de numerosas combinaciones de oligos para asegurar que cada mRNA

presente en el extracto esté representado en el producto de amplificación por

RT-PCR (Callard et al., 1994).

Dentro de las principales ventajas de la técnica de despliegue diferencial

tenemos las siguientes: no requiere de una costosa inversión en equipo

específico ni de información previa de las secuencias de los genes, trabaja a

partir de pequeñas cantidades de RNA total, es razonablemente sensible en la

detección de mensajeros diferencialmente expresados y permite la

comparación de varios tratamientos de un experimento de manera

simultánea (Cheval et al., 2002; Brosché et al., 2002).

Esta técnica ha sido exitosamente usada para el análisis de la expresión

diferencial de genes tolerantes a polietilenglicol en células de Capsicum

annuum (Verástegui-Peña, 1999), el aislamiento de genes regulados por

etileno en frutos de tomate (Zegzouti et al., 1999), la identificación de

transcritos de abundancia incrementada durante la maduración de fresa

(Wilkinson et al., 1995), la identificación de genes de Prunus armeniaca

expresados en respuesta a infección con fitoplasmas (Carginale et al., 2004),

el aislamiento de genes de aclimatación a frío en hojas de Citrus unshiu (Lang

et al., 2005), el estudio de la señalización de lípidos en plantas de Solanum

chacoense (O’Brien et al., 2005), entre otros.

A pesar de las aplicaciones mencionadas, la técnica de despliegue diferencial

presenta una serie de problemas como son: el alto número de falsos

positivos, la redundancia, la cuestionada capacidad para la detección de los

mensajeros poco abundantes, el hecho de que los fragmentos obtenidos

usualmente no contienen regiones codificantes, el tedioso proceso de

verificación el cual, además de consumir un tiempo considerable, requiere de

gran cantidad de RNA y de insumos (Wan y Erlander, 1997). Por ello, se han

- 16 -

diseñado varias modificaciones a la técnica con el propósito de disminuir

estos problemas (Wan et al., 1996; Bosch et al., 2000).

I.8.2 Hibridación por supresión sustractiva (SSH)

La hibridación por supresión sustractiva permite comparar dos poblaciones

de mRNAs y llevar a cabo la clonación de genes expresados en una población

pero no en la otra. Desarrollada por Diatchenko et al. (1996), esta

metodología combina los pasos de normalización y supresión en un solo

procedimiento. La normalización equipara la abundancia de cDNAs dentro de

la población, enriqueciendo aquellos cDNAs provenientes de mRNAs poco

abundantes, y la sustracción excluye las secuencias comunes entre las dos

poblaciones en estudio.

Este método está basado en una forma específica de PCR que permite una

amplificación exponencial de los cDNAs que difieren en abundancia,

suprimiendo la amplificación de las secuencias comunes a las dos

poblaciones en estudio (von Stein et al., 1997).

De manera general, la técnica de SSH involucra la síntesis de cDNAs de dos

poblaciones de mRNA (“Tester” y “Driver”). Ambos grupos de cDNAs son

fragmentados por digestión y al grupo de cDNAs del “Tester” se les coloca por

ligación unos adaptadores en ambos extremos. Posteriormente se realiza la

hibridación de estos dos grupos quedando disponibles para su amplificación

por PCR solo aquellos fragmentos no hibridados del “Tester” que cuentan

con sus adaptadores a los lados. Las secuencias de estos adaptadores son

empleadas como oligos para la amplificación por PCR (Ahmed, 2002; Brosché

et al., 2002).

Las ventajas de la SSH radican en que permite el aislamiento de genes sin

conocimiento previo de sus secuencias, los fragmentos obtenidos son de buen

tamaño promedio, pudiendo incluso encontrarse mensajeros completos, los

- 17 -

fragmentos producto de la digestión contienen las regiones codificantes y

permiten una mejor representación de los genes individuales, el nivel de

enriquecimiento de los mRNAs raros es alto, el ruido de fondo es minimizado

y no se requiere de equipo especializado para el desarrollo de esta técnica

(Diatchenko et al., 1996; Moody, 2001; Brosché et al., 2002).

Esta técnica ha sido empleada en plantas para la identificación de genes

inducidos por exposición a ozono en arveja (Sävenstrand et al., 2000),

relacionados con defensa en arroz (Xiong et al., 2001), diferencialmente

expresados durante la maduración del melón (Choi et al., 2004), de manzana

sensibles a Venturia inaequalis (Degenhardt et al., 2005), con expresión

diferencial entre células huevo y células centrales de maíz (Lê et al., 2005),

relacionados con el crecimiento en raíces de maíz (Bassani et al., 2005), entre

otros.

Una de las principales dificultades que ha presentado la SSH ha sido la

cantidad de mRNA requerido en este procedimiento; sin embargo, este

problema ha quedado resuelto empleando metodologías de transcripción

reversa y LD-PCR para la amplificación de los cDNAs antes de la aplicación

de la SSH (Moody, 2001).

I.8.3 Arreglos de DNA

Todos los tipos de arreglos de DNA se basan en el principio de los métodos de

hibridación. El poder de estos métodos radica en la facultad para analizar, a

partir de los patrones de hibridación, los niveles de expresión de numerosos

genes de manera simultánea (Brosché et al., 2002; Cheval et al., 2002).

En todos estos métodos, las secuencias de DNA usadas como sonda se

encuentran arregladas de manera ordenada sobre una matriz sólida, y

difieren entre sí en la naturaleza de la matriz, el número de fragmentos de

DNA que es posible colocar en ellas, la cantidad de sonda requerida para la

- 18 -

hibridación, la densidad de los arreglos y el modo de detección de los eventos

de hibridación (Brosché et al., 2002; Cheval et al., 2002).

I.8.3.1 Macroarreglos

Los macroarreglos, también conocidos como filtros de hibridación de alta

densidad, son los antecesores de la tecnología de microarreglos y de los chips

de DNA (Cheval et al., 2002).

La matriz sólida empleada en los macroarreglos corresponde a membranas de

nylon de 12 x 8 cm2 y la cantidad de sondas que pueden ser arregladas en

estas membranas depende de la densidad del arreglo, pudiendo imprimirse

de 10 a 1000 sondas de cDNA a baja densidad, o de 1000 hasta 4000 sondas

de cDNA a una alta densidad. Los fragmentos de cDNA usados como sonda

pueden corresponder a DNA plasmídico o insertos amplificados por PCR, los

cuales luego de ser impresos en la membrana son fijados a ella por radiación

ultravioleta. El tamaño promedio de las sondas impresas es de 200 a 600 pb

(Baldwin et al., 1999; Brosché et al., 2002; Cheval et al., 2002; Jokhadze et

al., 2003).

En la preparación de la sonda de hibridación se puede emplear RNA total

(>25 μg) o mRNA (>1 μg) para la síntesis de cDNA de cadena sencilla, el cual

es posteriormente marcado radiactivamente con 32P ó 33P. Cada muestra

usada como sonda es hibridada con una membrana por separado y luego

lavada para retirar la sonda radiactiva no hibridada. La detección de la señal

de hibridación se lleva a cabo empleando pantallas de fósforo y la

cuantificación de la señal puede realizarse utilizando el software específico.

La sensibilidad de esta técnica permite detectar más de 100 copias de mRNAs

por célula (Baldwin et al., 1999; Cheval et al., 2002; Jokhadze et al., 2003).

- 19 -

I.8.3.2 Microarreglos

Los microarreglos fueron reportados por primera vez en ensayos para el

análisis de expresión diferencial en Arabidopsis. Este método emplea como

matriz láminas de vidrio para microscopía de 25 mm x 75 mm. Las sondas

que se imprimen en esta matriz provienen de productos de PCR resultantes

de la amplificación directa de DNA genómico, o de la amplificación de

insertos provenientes de bibliotecas de cDNAs o de otro tipo de bibliotecas.

Antes de ser impresos, los productos de amplificación deben ser purificados y

concentrados (Brosché et al., 2002; Cheval et al., 2002; Aharoni y O’Connell,

2002; Xiang y Brownstein, 2003).

La cantidad de muestras que pueden ser impresas en un microarreglo es del

orden de hasta 50,000 fragmentos de DNA (Xiang y Brownstein, 2003). La

fijación de los fragmentos impresos en la matriz se realiza por tratamientos

físico-químicos (Cheval et al., 2002).

En la preparación de las sondas, dos muestras son separadamente reverso-

transcritas a partir de sus mRNAs (1-2 μg) en presencia de nucleótidos

fosforescentes. Después de la hibridación las láminas son lavadas, secadas y

escaneadas utilizando microscopía confocal o de fluorescencia. Las imágenes

obtenidas son analizadas y ajustadas para cada uno de los fluoróforos

empleados con la ayuda de programas específicos. La sensibilidad de la

técnica es de aproximadamente cinco veces mayor que la obtenida en los

macroarreglos (Cheval et al., 2002; Aharoni y O’Connell, 2002; Xiang y

Brownstein, 2003; Smyth et al., 2003).

I.8.4 Secuenciación de ESTs

El desarrollo y automatización de la tecnología de secuenciación de alta

capacidad de procesamiento abre nuevas oportunidades para el

descubrimiento de genes. Están en marcha muchos proyectos de

- 20 -

secuenciación de genomas, orientados a la identificación de catálogos

completos de genes dentro de un organismo, independientemente de los

niveles de expresión de éstos. Adicionalmente, la secuenciación de clonas

provenientes de bibliotecas de cDNA viene aportando información sobre la

expresión de genes en determinados estados del desarrollo de tejidos

específicos (Moody et al., 2001; Moyle et al., 2005).

El concepto de EST (Expressed Sequence Tag) está basado en la

secuenciación parcial de transcritos de genes aislados al azar, provenientes

de una biblioteca de cDNAs de un tejido o población celular específico. Fue

introducido a inicios de los años 90 para caracterizar la expresión de miles de

genes de manera rápida (Cheval et al., 2002; Alba et al., 2004).

Cada EST representa tan solo una porción de un gen y tienen un tamaño

promedio de entre 200 a 500 pb. Varios ESTs del mismo gen pueden estar

presentes dentro de una biblioteca, sobre todo cuando se trata de mRNAs

abundantes dentro de la misma, es así que los mRNAs abundantes están en

correspondencia con la redundancia de ESTs. El análisis global de todos los

ESTs producidos en la biblioteca proporciona información útil para el

descubrimiento de nuevos genes y la mejor comprensión de su interrelación

en un proceso dado (Moody et al., 2001; Cheval et al., 2002; Alba et al.,

2004). Los ESTs redundantes pueden ser usados para el ensamblaje de

secuencias consenso las cuales proporcionan una mayor información sobre el

gen (Cheval et al., 2002).

I.8.4.1 Ensamblaje de ESTs

El agrupamiento de ESTs es una poderosa estrategia para la identificación de

genes y los estudios de expresión de los mismos. El agrupamiento y

ensamblaje de los ESTs permite mejorar la longitud y calidad de la secuencia

y es un proceso necesario para remover la redundancia presente en las

- 21 -

bibliotecas de cDNA (Huang y Madan, 1999; Kalyanaraman et al., 2003;

Schneeberger et al., 2005).

Diversos programas han sido diseñados para automatizar el proceso de

agrupamiento y ensamblaje de ESTs, siendo uno de los más usados el CAP3

Assembler (Kalyanaraman et al., 2003; Schneeberger et al., 2005).

El fundamento del proceso de ensamblaje consiste en que las secuencias que

pueden ser agrupadas y que se traslapan entre sí estarían correspondiendo

al mismo gen (Huang y Madan, 1999).

Uno de los primeros pasos en los algoritmos de ensamblaje consiste en

eliminar de los extremos 5’ y 3’ las regiones de la secuencia que posean una

baja calidad para evitar así errores en el ensamblaje. Posteriormente,

múltiples alineamientos de las secuencias son realizados hasta encontrar las

mejores secuencias consenso (Huang y Madan, 1999). Los grupos de ESTs

que resultan del proceso de ensamblaje son conocidos como clusters o

contigs y se encuentran representando un gen tentativo o genes únicos,

también llamados unigenes (Wang et al., 2004).

I.8.5 Análisis bioinformáticos

El análisis bioinformático de los ESTs es una herramienta muy importante en

la identificación de la función potencial de un gen, conocida como anotación.

La anotación de una secuencia es posible gracias a los avances en la

tecnología de secuenciación y la tecnología informática, que han permitido la

creación de bases de datos internacionales de secuencias (Stekel, 2003).

Las bases de datos que contienen toda la información de las secuencias

reportadas son tres: GenBank (de iniciativa estadunidense), EMBL (del

European Molecular Biology Laboratory) y DDBJ (de iniciativa japonesa). Las

tres bases de datos se encuentran en colaboración, de tal forma que todas las

secuencias enviadas a una de ellas son automáticamente remitidas a las

- 22 -

otras dos. El número de secuencias que se publican en estas bases de datos

está creciendo de manera exponencial. En enero de 2006, GenBank tenía

reportadas más de 32 millones de secuencias de diferentes organismos.

El alineamiento de ESTs proporciona una eficaz herramienta para el hallazgo

de genes por homología. El algoritmo BLAST detecta regiones de similitud con

otras proteínas, lo cual proporciona información importante para determinar

la función de proteínas no caracterizadas. Los algoritmos BLASTX y BLASTN

permiten cruzar información entre diferentes tipos de entradas y secuencias

de bases de datos (Fassler et al., 2000).

I.8.6 Justificación del trabajo

El cultivo del banano (Musa spp.) es muy importante a nivel económico y

social. Constituye una apreciable fuente de carbohidratos, base de la

alimentación de millones de personas, especialmente en los países de los

trópicos. En términos de producción y consumo, los bananos representan el

principal frutal a nivel mundial y son, a su vez, el quinto cultivo comercial de

mayor importancia, después del maíz, trigo, arroz y tomate (FAOSTAT, 2005).

Una fuerte problemática en la comercialización de los bananos se debe a la

alta actividad metabólica postcosecha, que conduce a una corta vida de

anaquel; por ello, el transporte y la comercialización se dificultan ya que la

madurez de los bananos puede ser controlada sólo en un estrecho rango de

tiempo (Seymour et al., 1993).

La maduración de los frutos es un proceso sumamente complejo que

involucra una serie de cambios fisiológicos y bioquímicos causados por la

activación e inactivación de todo un grupo de genes (Pua et al., 2003). Los

bananos representan un modelo de estudio atractivo debido a su importancia

económica, su potencial como alimento básico, así como al hecho de poseer

uno de los genomas haploides mas pequeños dentro de las monocotiledóneas

- 23 -

(alrededor de 600 Mpb) y de contarse con diversos estudios sobre la

caracterización fisiológica del fruto (Kamaté et al., 2001; Vilarinhos et al.,

2003; Aert et al., 2004). Sin embargo, los estudios fisiológicos y bioquímicos

realizados a la fecha no han logrado resolver satisfactoriamente la

problemática en la postcosecha y es poco lo que se conoce sobre las bases

moleculares del complejo proceso de desarrollo y maduración del fruto del

banano. Aunque se han hecho algunos estudios sobre la expresión de genes

diferenciales en la maduración de banano, éstos han sido muy preliminares,

puesto que si bien se ha logrado determinar los genes que codifican para

algunas de las enzimas involucradas en la maduración, aun faltan por

determinar los genes de una amplia gama de enzimas que también participan

en este proceso (Medina-Suárez et al., 1997).

El desarrollo actual de estrategias moleculares que permiten la evaluación de

la expresión de genes, la automatización de las tecnologías de secuenciación,

el aumento de la información disponible en los bancos de datos, así como las

modernas herramientas bioinformáticas, nos proporcionan la oportunidad

para incrementar nuestros conocimientos sobre el complejo proceso de la

maduración de los frutos (Moody, 2001; Giovannoni, 2004; Santos et al.,

2005; Coemans et al., 2005).

El presente trabajo pretende estudiar la expresión diferencial de los genes

involucrados en el proceso de maduración del fruto de Musa acuminata cv.

“Gran Enano” en etapas avanzadas de la maduración, cuando el fruto está

maduro para consumo, y así contribuir a dilucidar los eventos moleculares

asociados con este proceso. Los conocimientos que se aporten podrían ser

utilizados en trabajos posteriores, para mejorar la calidad de la fruta y

regular el proceso de maduración incrementando así su vida de anaquel.

- 24 -

II. OBJETIVOS

II.1. OBJETIVO GENERAL

Identificar, clonar y analizar la expresión diferencial de genes

involucrados en la maduración del fruto de banano (Musa acuminata

cv. “Gran Enano”).

II.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

1. Identificar transcritos de genes expresados diferencialmente en fruto

maduro de Musa acuminata. cv. “Gran Enano”.

2. Realizar pruebas confirmatorias de expresión diferencial de los

genes identificados.

3. Obtener las secuencias de los cDNAs diferenciales y realizar el

análisis bioinformático de las mismas.

4. Analizar la expresión diferencial de los genes de interés

identificados, en los diferentes estadios de maduración del fruto de

Musa acuminata cv. “Gran Enano” y evaluar su especificidad de

tejido.

- 25 -

III. MATERIALES Y MÉTODOS

La estrategia de trabajo diseñada para cumplir los objetivos propuestos en

este estudio se presenta en el diagrama de flujo de la figura 2.

III.1. Material vegetal

Se colectaron frutos de banano (Musa acuminata, subgrupo Cavendish cv.

“Gran Enano”) de las plantaciones del Instituto Nacional de Investigaciones

Forestales Agrícolas y Pecuarias (INIFAP, Tecomán - México). Los frutos

fueron cosechados en un estado de desarrollo de 90 a 100 días post antesis y

su maduración fue inducida por tratamiento con etileno exógeno (100 μl/L

por 24 h a 20ºC).

Los estadios de maduración del fruto fueron clasificados de acuerdo al índice

de color de la cáscara (“peel color index” = PCI) desde 1 (muy verde) hasta 7

(amarillo con manchas marrones) según la escala descrita anteriormente. Se

colectó tejido de pulpa y cáscara de cada uno de los siete estadios de

maduración (PCI 1 al PCI 7), así como de hoja, raíz, órganos reproductivos y

cormo. Estos tejidos fueron congelados en nitrógeno líquido y almacenados a

-70ºC hasta su utilización.

III.2. Extracción de RNA

El RNA de pulpa de banano utilizado para las pruebas de despliegue

diferencial, así como para la construcción de la biblioteca sustractiva de

cDNA, fue extraído utilizando el método reportado por Liu et al. (1998) (anexo

1).

Para las pruebas de northern blot, el RNA de todas las muestras fue extraído

empleando el método descrito por Chang et al. (1993) (anexo 2).

- 26 -

El uso de dos métodos diferentes para la extracción de RNA se debió a que

para las pruebas de despliegue diferencial y la construcción de la biblioteca

sustractiva se requiere de poca cantidad de RNA de muy alta calidad y

pureza, mientras que para los análisis northern blot se requiere de gran

cantidad de RNA de buena calidad pero no tan alta como en el caso anterior.

III.3. Tratamiento con DNasa I

Las muestras de RNA total extraídas anteriormente fueron tratadas con

DNasa I (Invitrogen, Carlsbad, CA) siguiendo las especificaciones del

fabricante, para eliminar todo rastro de DNA que pudiera actuar como

contaminante en la reacción de RT-PCR.

III.4. Despliegue diferencial

Las pruebas de despliegue diferencial fueron realizadas según el método

descrito por Liang y Pardee (1997), comparando el estadio PCI 1 contra los

estadios PCI 5 y PCI 7 de maduración del fruto de banano. Los oligos

empleados en las pruebas de despliegue diferencial corresponden a los oligos

empleados por Verástegui-Peña (1999) y los oligos de la casa comercial

GenHunter (GenHunter Corporation, Nashville, TN) Cada muestra fue

procesada por duplicado y de manera independiente para disminuir la

presencia de falsos positivos.

- 27 -

Colecta de material vegetal de Musa sp. cv. “Gran Enano”

Inducción de la maduración delos frutos con etileno exógeno

Extracción RNA total

Despliegue diferencial de losestadios PCI 1, PCI 5 y PCI 7

Construcción de la biblioteca sustractiva de cDNA del

estadio PCI 5 de maduración

Secuenciación de las clonasdiferenciales y confirmación de su expresión diferencial

Análisis de la expresión diferencialen los 7 estadios de maduración

y en otros tejidos

Ensamblaje de secuenciasy análisis BLAST

Clonación de fragmentos

Figura 2. Diagrama de flujo de la metodología empleada para la identificación y análisis de los genes de expresión diferencial durante la maduración de banano.

- 28 -

III.4.1. Oligonucleótidos empleados en el despliegue diferencial

Oligos anclados: Verástegui-Peña 1999

(85.8 ng/ μl) “GenHunter” (2 μM)

dT11CA H-T11A dT11CC H-T11C dT11CG H-T11G

Oligos arbitrarios:

Verástegui-Peña 1999 (85.8ng/ μl)

“GenHunter” (2 μM)

A : 5’- TACAACGAGG -3’ 1 : 5’- AAGCTTGATTGCC -3’ (H-AP1) B : 5’- GACTAGCACG -3’ 2 : 5’- AAGCTTCGACTGT -3’ (H-AP2) C : 5’- CTGACCTGAC -3’ 3 : 5’- AAGCTTTGCTCAG -3’ (H-AP3) D : 5’- GCAGTTAGTC -3’ 4 : 5’- AAGCTTCTCAACG -3’ (H-AP4) E : 5’- TCGACTATAG -3’ 5 : 5’- AAGCTTAGTAGGC -3’ (H-AP5)

6 : 5’- AAGCTTGCACCAT -3’ (H-AP6)

III.4.2. Transcripción reversa de mRNA

El RNA total extraído y purificado fue cuantificado y su concentración fue

ajustada a 150 ng/μl.

La transcripción reversa se llevó a cabo empleando la siguiente mezcla, para

un volumen de 20 μl de reacción por muestra:

Agua destilada 7 μl Buffer 5X primera cadena 4 μl DTT (0.1 M) 2 μl dNTPs (250 μM) 2 μl Oligo anclado 2 μl RNA (150 ng/μl) 2 μl Volumen total de reacción 19 μl

La muestra de RNA fue incubada a 65°C por 5 min antes de ser mezclada con

los demás reactivos. Luego de incorporar el RNA a cada mezcla de reacción,

los tubos fueron incubados a 65°C por 5 min y a 37°C por 10 min.

- 29 -

Seguidamente, se adicionó a cada reacción 1 μl de transcriptasa reversa (200

U/μl), se mezcló y se colocó a incubar a 37°C por 50 min y a 95°C por 5

min. Los productos de la reacción fueron almacenados a –20°C.

III.4.3. Marcaje radiactivo de los oligos

Los oligos con poli (T), también llamados oligos anclados, fueron marcados

radiactivamente con 32P. La mezcla de reacción para la fosforilación de oligos

fue la siguiente:

Agua destilada 3 μl Buffer forward 5X 8 μl Oligo anclado 26 μl Cinasa T4 (10 U/μl) 1 μl [γ-32P]dATP (6,000 Ci/mmol) 2 μl Volumen total de reacción 40 μl

Esta mezcla de reacción fue preparada para cada uno de los oligos a

fosforilar. La reacción se incubó a 37°C por 60 min y a 65°C por 10 min.

Terminada la reacción, las muestras se guardaron a –20°C hasta su posterior

uso en la reacción de PCR.

III.4.4. Amplificación por PCR

Para la amplificación por PCR se preparó la siguiente mezcla de reacción por

cada muestra:

Agua destilada 5.0 μl MgCl2 1.5 μl Buffer 10X 2.0 μl dNTPs (250 μM) 2.0 μl Oligo arbitrario 2.0 μl Oligo anclado fosforilado 2.0 μl Mezcla de reacción de RT 5.0 μl DNA Taq polimerasa (5 U/μl) 0.5 μl Volumen total de reacción 20.0 μl

- 30 -

La reacción de PCR se llevó a cabo en las siguientes condiciones: 94°C por 30 s

40°C por 2 min 40 ciclos 72°C por 30 s 72°C por 7 min

Terminada la reacción, las muestras fueron almacenadas a –20°C hasta su

uso.

III.4.5. Marcaje radiactivo del marcador de tamaño

El marcador de tamaño empleado fue el “DNA Ladder” de 25 pb (Invitrogen)

que contiene fragmentos de 25-500 pb. La reacción de fosforilación del

marcador se preparó como sigue:

Agua destilada 6.0 μl Marcador de 25 pb (1 μg/μl) 2.5 μl Buffer exchange 5X 2.5 μl [γ-32P]dATP (6,000 Ci/mmol) 1.0 μl Cinasa T4 (10 U/μl) 0.5 μl Volumen total de reacción 12.5 μl

La reacción se incubó en el termociclador a 37°C por 1 h, al término de la

cual se adicionó 1 μl de EDTA (0.5 M) para detenerla. Seguidamente, se

adicionaron 25 μl de buffer de carga (formamida 98%, xilencianol 0.1%, azul

de bromofenol 0.1% y EDTA 10 mM) y 15 μl de agua destilada. El marcador

ya fosforilado fue almacenado a –20°C.

III.4.6. Resolución del cDNA amplificado

Los fragmentos de cDNA producto de la amplificación por PCR fueron

corridos en gel de poliacrilamida de alta resolución (poliacrilamida 6%, urea 8

- 31 -

M). El método para la preparación de las soluciones requeridas se describe en

el anexo 3. El tamaño del gel fue de 35 x 45 cm.

III.4.7. Preparación del gel de acrilamida 6%, urea 8 M

Para la preparación del gel, los vidrios fueron lavados con Dextrán y

enjuagados con agua corriente. Luego de escurrirlos se les aplicó etanol al

95% para finalmente secarlos con papel toalla. Uno de los vidrios fue tratado

con el antiadherente dicloro dimetilsilano, el cual fue esparcido

uniformemente sobre la cara del vidrio que se colocaría en contacto con el

gel, y se dejó secar.

A continuación, se procedió al ensamblaje del sistema colocando el separador

inferior y los dos laterales ligeramente húmedos sobre uno de los vidrios,

enseguida se colocó el otro vidrio y se sujetó con pinzas.

El gel de acrilamida 6% urea 8 M se preparó adicionando:

70 ml de solución de acrilamida al 6% 40 μl de TEMED 410 μl de persulfato de amonio 1 M (1 g en 10 ml de H2O)

Esta solución fue vertida entre los vidrios cuidando de no dejar burbujas.

Seguidamente, se colocó el peine y se dejó polimerizar por aproximadamente

1 h.

Una vez polimerizado el gel, se procedió a retirar las pinzas, el separador

inferior y el peine. El resto del sistema fue colocado en la cámara de

electroforesis vertical y se realizó la limpieza de los pozos utilizando para ello

una jeringa con buffer TBE 0.5X. Esta operación de limpieza fue repetida

después de la pre-corrida.

- 32 -

III.4.8. Electroforesis

Para la electroforesis se empleó el buffer TBE 0.5X y antes de cargar el gel, se

dejó pre-correr a 2000 voltios por aproximadamente 30 min, hasta que se

estabilizó el amperaje. A cada tubo de reacción de PCR se le agregaron 14 μl

de buffer de carga (0.7 μl de buffer de carga por cada μl de reacción de PCR).

Las muestras fueron desnaturalizadas en el termociclador, a 95ºC por 5 min

y luego se colocaron en hielo por 5 min. Después de la pre-corrida se

limpiaron los pozos del gel con el mismo buffer TBE 0.5X y se procedió a

cargar 5.5 μl de cada muestra y 3 μl del marcador fosforilado. La

electroforesis se corrió a 2000 voltios por aproximadamente 2.5 h.

Transcurrido este tiempo, se procedió a retirar el gel de la cámara de

electroforesis colocándolo sobre una mesa y con ayuda de una espátula se

procedió a retirar el vidrio superior el cual había sido tratado con el

antiadherente, de tal forma que el gel quedó adherido al vidrio inferior. Sobre

el gel se colocó una hoja de papel Whatman 3MM cortado a la medida y sobre

ella nuevamente se colocó el vidrio superior presionándolo ligeramente para

adherir el gel al papel. Luego, los vidrios fueron retirados y se cubrió con una

película plástica el lado del papel Whatman que tenía adherido el gel. El

secado del gel se realizó al vacío a 80ºC por 15 min. El gel seco adherido al

papel Whatman fue colocado en un cassette de exposición con una película

de rayos X, de 24 a 48 h a -70ºC para luego revelarlo en el equipo Kodak X-

OMAT M20 Processor.

III.4.9. Análisis del gel de despliegue diferencial

La selección de fragmentos diferenciales se realizó confrontando los tres

estadios de maduración y comparando presencia vs. ausencia de banda, o

bien con una muy marcada diferencia en intensidad de banda entre alguno

de ellos. Se seleccionaron sólo los fragmentos mayores de 150 pb. Con el

- 33 -

propósito de disminuir la presencia de falsos positivos, sólo se consideraron

aquellas bandas cuyo patrón para cada tratamiento fuese igual en ambas

réplicas. Los fragmentos fueron cortados del gel con ayuda de un bisturí y

almacenados en tubos eppendorf, debidamente rotulados a -20ºC, hasta su

uso.

III.4.10. Recuperación de fragmentos de cDNA

Se emplearon dos métodos para la recuperación del cDNA de las bandas

cortadas del gel de poliacrilamida. En primer lugar se empleó el método de

Wang et al. (1998) con ligeras modificaciones, y con aquellas bandas en las

que este método no fue muy eficiente, se empleó el método descrito por

Verástegui-Peña (1999).

Para la recuperación de bandas por el primer método citado (Wang et al.,

1998) se adicionaron 90 μl de agua destilada desionizada estéril a los tubos

eppendorf conteniendo los fragmentos de gel adheridos al papel Whatman, se

dejó remojar 10 min a temperatura ambiente y luego se centrifugó por 2 min

a 10,000 rpm. El sobrenadante fue recuperado en otro tubo y fue utilizado

para hacer la reamplificación por PCR. El tubo con el trozo de banda cortado

fue nuevamente almacenado a -20ºC, hasta verificar la recuperación de la

banda.

Para las bandas recuperadas con el segundo método (Verástegui-Peña, 1999),

se adicionaron 100 μl de agua destilada desionizada estéril a los tubos

conteniendo el fragmento de gel cortado, y se dejó remojar por 10 min.

Seguidamente, fueron calentados a 95°C por 15 min para luego dejarlos

enfriar y centrifugarlos a 12,000 rpm por 2 min. El sobrenadante fue

recuperado en otro tubo y se le agregaron 10 μl de acetato de sodio 3 M, 2.5

μl de glicógeno (20 mg/ml) y 450 μl de etanol absoluto. Se dejó precipitando

toda la noche a -20ºC y posteriormente se centrifugó a 12,000 rpm por 20

min a 4ºC. Se retiró el sobrenadante y la pastilla fue lavada con 200 μl de

- 34 -

etanol al 70%, se la dejó secar y se resuspendió en 20 μl de agua destilada

desionizada estéril. Con este cDNA recuperado se procedió a realizar la

reamplificación por PCR.

La mezcla de reacción de PCR que se empleó para la recuperación de las

bandas fue la misma para ambos métodos.

Mezcla de reacción de PCR: Agua destilada 21.5 μl MgCl2 3.0 μl Buffer 10X 5.0 μl dNTPs (250 μM) 4.0 μl Oligo arbitrario 5.0 μl Oligo anclado fosforilado 5.0 μl cDNA recuperado del gel 6.0 μl DNA Taq polimerasa (5 U/μl) 0.5 μl Volumen total de reacción 50.0 μl Nota: los oligos arbitrario y anclado empleados en cada reacción se refieren a los

mismos con los cuales fue producida cada banda diferencial extraída del gel. Condiciones de la reacción de PCR según el método de Wang et al., (1998): 94°C por 3 min 94°C por 30 s

40°C por 2 min 40 ciclos 72°C por 1 min seguido de:

94°C por 30 s 55°C por 30 min 20 ciclos

72°C por 1 min 72°C por 7 min Condiciones de la reacción de PCR según el método de Verástegui-Peña

(1999):

94°C por 30 s 40°C por 2 min 30 ciclos 72°C por 30 s 72°C por 7 min

- 35 -

Para confirmar la recuperación y reamplificación de los fragmentos así como

su tamaño esperado, los productos de PCR fueron corridos en un gel de

agarosa al 3% conjuntamente con el marcador de 25 pb. En aquellos casos

en que se observó más de una banda, se aisló la banda del tamaño esperado.

Para la purificación de las bandas se empleó el kit comercial “GFX™ PCR

DNA and Gel Band Purification” (Amersham Biosciences UK Limited, Little

Chalfont, UK), según las especificaciones del fabricante.

III.5. Construcción de la biblioteca sustractiva de cDNA

La construcción de la biblioteca se hizo comparando dos estadios de

maduración del fruto de banano, empleando como “Driver” el RNA total de

PCI 1 y como el “Tester” RNA total de PCI 5. Para ello se emplearon 2 kits: el

“SMART™ PCR cDNA Synthesis Kit” para la producción de cDNA de alta

calidad a partir de RNA total y el “PCR–Select cDNA Subtraction Kit” (ambos

de BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA) para la construcción de la

biblioteca sustractiva. En la figura 3 se muestra esquemáticamente el

proceso seguido para la construcción de la biblioteca sustractiva de cDNA.

III.5.1. Síntesis de la Primera Cadena de cDNA de las muestras y

“Control SMART”

Se diluyó el RNA total de las muestras a 1.0 μg/μl y se prepararon 3 tubos de

reacción (“Tester”, “Driver” y “Control del SMART”) con la siguiente mezcla:

1 Rx RNA diluido a 1.0 μg/μl 1 μl 3´ SMART CDS primer IIA (12 μM) 1 μl oligo “BD SMART IIA” (12 μM) 1 μl Agua destilada estéril 2 μl Volumen total 5 μl

- 36 -

Luego de mezclar por pipeteo el contenido de cada tubo de PCR, fueron

centrifugados y puestos a incubar a 70ºC por 2 min en el termociclador.

Seguidamente, a cada tubo se le adicionó lo siguiente:

5X buffer primera cadena 2 μl DTT (20 mM) 1 μl Mezcla de dNTPs (10 mM) 1 μl BD Power Script RT (100 U/μl) 1 μl

Nuevamente se mezcló por pipeteo cada muestra, se centrifugó y se colocó a

incubar a 42ºC por 1 h en el termociclador.

El producto de la reacción de primera cadena fue diluido adicionando

40 μl de TE y las diluciones se calentaron a 72ºC por 7 min. Terminada la

reacción las muestras fueron almacenadas a -20ºC.

III.5.2. Síntesis de la primera cadena de cDNA del “Control PCR-Select”

La siguiente mezcla se preparó en un tubo de PCR: RNA poli A de músculo esquelético humano (1.0 μg/μl) 2 μl cDNA Synthesis Primer (10 μM) 1 μl Agua destilada estéril 2 μl

La reacción se incubó a 70ºC por 2 min, se enfrió en hielo por 2 min, se

centrifugó y se le adicionó lo siguiente:

5X buffer primera cadena 2 μl Mezcla de dNTPs (10 mM) 1 μl Agua destilada estéril 1 μl Enzima AMV – RT (20 U/μl) 1 μl

Nuevamente se mezcló por pipeteo, se centrifugó brevemente y se colocó a

incubar a 42ºC por 1.5 h. Terminada esta reacción, la muestra se colocó en

hielo y se continuó inmediatamente con la síntesis de la segunda cadena del

control de músculo esquelético humano (“Control PCR-Select”).

- 37 -

Extracción de RNA total

Síntesis de la segundacadena de cDNA por LD PCR

Purificación en columna delos productos de PCR

Síntesis de la primera cadenade cDNA por RT-PCR

Confirmación de la digestión

Análisis de la ligaciónde adaptadores

Digestión con Rsa I y purificación de la digestión

Primera hibridación

Segunda hibridación

Ligación de adaptadores al “Tester”

Primera PCR

Segunda PCR

Figura 3. Diagrama de flujo de la construcción de la biblioteca sustractiva de cDNA del estadio PCI 5 de maduración de banano con respecto al PCI 1.

- 38 -

III.5.3. Síntesis de la segunda cadena de cDNA del “Control PCR-Select”

1) Al tubo de PCR de la primera cadena del control se le agregó lo siguiente: Agua destilada estéril 48.4 μl Buffer 5X 2da cadena 16.0 μl dNTPs (10mM) 1.6 μl cóctel de enzimas 20X de segunda cadena 4.0 μl

2) Se mezcló por pipeteo y centrifugó (volumen total = 80 μl) para luego

incubarlo a 16ºC por 2 h.

3) Se le adicionaron 2 μl de T4 polimerasa (3 U/μl), se mezcló bien y se

incubó a 16ºC por 30 min.

4) Se agregaron 4 μl de EDTA/glicógeno 20X para detener la reacción.

5) Se agregaron 100 μl de fenol/cloroformo/alcohol isoamílico (25:24:1), se

agitó por “vortex” y se centrifugó a 14,000 rpm por 10 min a temperatura

ambiente.

6) Se recuperó la fase acuosa en un tubo nuevo de PCR y se agregaron 100

μl de cloroformo/alcohol isoamílico (24:1) agitando por “vortex” y

centrifugando a 14,000 rpm por 10 min a temperatura ambiente.

7) Se recuperó la fase acuosa, se transfirió a otro tubo de PCR y se le

agregaron 40 μl de acetato de amonio 4 M y 300 μl de etanol absoluto; se

agitó por “vortex” y centrifugó a 14,000 rpm por 20 min a temperatura

ambiente, luego se descartó el sobrenadante y se dejó secar la pastilla.

Se disolvió el pastilla en 50 μl de agua destilada estéril, se separaron 6 μl y

se guardaron a -20ºC (estos 6 μl se usaron para el análisis de la digestión

con Rsa I).

- 39 -

III.5.4. Síntesis de la segunda cadena de cDNA de las muestras y

“Control SMART”

1) Con el termociclador a 95ºC se colocaron 3 tubos de PCR por cada

muestra (“Tester”, “Driver” y “Control SMART”) conteniendo la siguiente

mezcla de reacción:

1 Rx 10 Rx Agua destilada estéril 83 μl 830 μl Buffer 10X Advantage 2 PCR 10 μl 100 μl dNTPs 50X (10 mM) 2 μl 20 μl 5’ PCR primer II A (12 μM) 2 μl 20 μl Mezcla de 50X BD Advantage 2 Polymerase (1.1 μg/μl) 2 μl 20 μl

2) A cada tubo conteniendo 99 μl de la mezcla se le adicionó 1 μl del cDNA

de primera cadena correspondiente.

3) Las muestras se incubaron en el termociclador bajo las siguientes

condiciones:

95ºC por 1 min 95ºC por 15 s 65ºC por 30 s 15 ciclos 68ºC por 6 min

4) Dos tubos de cada muestra se guardaron a 4ºC y con el tercer tubo de

cada una de las muestras se hizo la determinación del número óptimo de

ciclos.

5) Luego de los 15 ciclos, se tomaron 15 μl del tercer tubo de cada muestra,

se etiquetaron y guardaron a 4ºC. Seguidamente, se colocó en el

termociclador el restante de cada tercer tubo, por 3 ciclos adicionales y

nuevamente se tomaron 15 μl, se etiquetaron y guardaron a 4ºC. Este

mismo procedimiento se repitió 3 veces.

6) Se corrió un gel de agarosa al 1.2 % con 5 μl de cada una de las 4

alícuotas, y un marcador de 1 Kb en buffer TAE (el número óptimo de

- 40 -

ciclos de amplificación correspondió a aquel en el que se lograron

distinguir claramente los productos de PCR sin que un número adicional

de ciclos incrementara significativamente su intensidad)

7) Los 2 tubos de cada muestra guardados a 4ºC fueron recuperados y se

les dieron los ciclos adicionales requeridos, según lo determinado en el

paso anterior

8) Se corrió un gel de agarosa al 1.2 % con 5 μl de cada una de las seis

muestras a las que se les dio los ciclos adicionales

9) Se adicionaron a cada tubo 2 μl de EDTA 0.5 M para detener la reacción y

se transfirieron de cada una de las tres muestras (“Tester”, “Driver” y

“Control SMART”), 7 μl a un tubo nuevo, etiquetándolo como “muestra A”

de cada uno y almacenándola a -20ºC.

III.5.5. Cromatografía en columna del “Tester”, “Driver” y “Control

SMART”

1) Se combinó el contenido de los 2 tubos de cada muestra en un solo tubo

eppendorf y se agregó un volumen igual (180 μl) de

fenol/cloroformo/alcohol isoamílico (25:24:1) para luego agitar por

“vortex” y centrifugar a 14,000 rpm por 10 min.

2) Se recuperó la fase acuosa en un tubo nuevo, se le agregaron 700 μl de n-

butanol, se agitó por “vortex” y centrifugó a temperatura ambiente a

14,000 rpm por 1 min.

3) Con ayuda de una micropipeta se retiró y descartó la fase superior (que es

el n-butanol), quedando un volumen de entre 40 y 70 μl de muestra en

cada tubo.

4) Se tomó una columna BD CHROMA SPIN™ 1000 por cada muestra y se la

invirtió varias veces, hasta que se resuspendió la matriz (evitando dejar

- 41 -

burbujas). Luego, se le quitaron las tapas superior e inferior y se colocó la

columna en un tubo eppendorf (se eliminó el buffer de la columna que

cayó en el tubo eppendorf).

5) Se agregaron 1.5 ml de buffer TNE 1X y se dejó escurrir el buffer por la

columna hasta que la superficie de la matriz alcanzó la marca de 0.75 ml.

El buffer colectado fue desechado.

6) Se aplicó la muestra al centro de la superficie plana de la matriz y luego

de ello se aplicaron 25 μl de buffer TNE 1X y se dejó escurrir

completamente por la columna, para luego aplicar nuevamente 150 μl de

buffer TNE 1X y dejar escurrir.

7) Se transfirió la columna a un tubo eppendorf nuevo y se aplicaron 320 μl

de buffer TNE 1X colectando el eluido como la fracción purificada. Se

transfirieron 10 μl de esta fracción a un tubo nuevo que se etiquetó como

“muestra B” y se guardó a -20ºC.

8) Se aplicaron 75 μl de buffer TNE 1X a la columna y se colectó el eluido en

un tubo nuevo, etiquetándolo como muestra C y guardándolo a -20ºC.

9) Se corrió un gel de agarosa al 1.2% con las 3 muestras:

3.0 μl muestra A 10.0 μl muestra B 10.0 μl muestra C 0.7 μl marcador de 1 Kb 1.0 μl de buffer de carga

(Se compararon las intensidades de señal en el gel, de las muestras A, B y

C. La intensidad de señal de B fue aproximadamente un 50% menor que

la de A. Si esta diferencia hubiera sido del 30% o menos, se habría

comparado con C y si no se hubiera observado una alta intensidad en

ninguna de las 3 fracciones se habría tenido que repetir todo el

procedimiento desde el PCR).

- 42 -

III.5.6. Digestión del “Tester”, “Driver” y “Control SMART” con Rsa I

1) Se separaron 10 μl de cada muestra de cDNA purificado en columna y se

etiquetó como “muestra D” para usarlos en la comprobación de la

digestión.

2) Se adicionó a cada muestra de cDNA purificado, lo siguiente:

buffer de restricción Rsa I 10X 36.0 μl Rsa I (10 U/μl) 1.5 μl

3) Se mezcló por “vortex” y centrifugó suavemente para luego colocarlo a

incubar a 37°C por 3 h.

4) Para confirmar la digestión se corrió un gel de agarosa al 1.2% con 10 μl

del cDNA sin digerir (muestra D), 10 μl del cDNA digerido y un marcador

molecular de 1 Kb, en buffer TAE 1X (el barrido de la muestra digerida se

encontró en un rango de tamaño inferior al de la muestra sin digerir)

5) Confirmada la digestión se adicionaron 8 μl de EDTA 0.5 M a cada tubo,

para terminar la reacción. Seguidamente, se transfirieron 10 μl de cada

cDNA a un tubo nuevo y se los etiquetó como “muestra E”

almacenándolos a -20°C.

III.5.7. Purificación de la digestión de cDNAs

La purificación del producto de la digestión se realizó utilizando las columnas

del kit “GFX™ PCR DNA and Gel Band Purification” (Amersham Biosciences),

como si fuera producto de PCR, según las especificaciones del kit pero

realizando la elución final en 50 μl de buffer TE. Seguidamente, se aplicó el

eluido a la columna de microfiltración, se centrifugó por 5 min y desechó la

columna. Se transfirieron 6 μl de la muestra microfiltrada a un tubo con 14

μl de H2O, etiquetándolo como “muestra F” y guardándolo a -20°C para

analizar el cDNA después de la purificación. Al remanente de cada muestra

- 43 -

se le agregaron 20 μl de acetato de amonio 4 M y 100 μl de etanol absoluto,

agitándolo por “vortex” y centrifugándolo por 20 min a 14,000 rpm y

temperatura ambiente. El sobrenadante se descartó y la pastilla se lavó con

500 μl de etanol al 80%, centrifugando luego las muestras por 10 min a

14,000 rpm, descartando el etanol y dejando secar la pastilla de 5 a 10 min.

Posteriormente, la pastilla se disolvió en 6.7 μl de TNE 1X y se transfirió 1.0

μl a un tubo con 500 μl de H2O, etiquetándolo como “muestra G”. Esta

muestra fue cuantificada en un espectrofotómetro. Esto con el fin de ajustar

la concentración de las muestras a aproximadamente 300 ng (si la

concentración hubiera sido menor a 300 ng/μl se habría tenido que repetir la

construcción de la biblioteca de cDNA, desde la primera cadena de cDNA).

III.5.8. Digestión del “Control PCR-Select” con Rsa I

1) Se mezcló en un tubo eppendorf lo siguiente:

cDNA de doble cadena 43.5 μl buffer de restricción Rsa I 10X 5.0 μl Rsa I (10 U/μl) 1.5 μl

2) Se centrifugó e incubó a 37ºC por 1.5 h. Se separaron 5 μl de la mezcla

de digestión para analizar posteriormente la eficiencia de la enzima.

3) Se agregaron 2.5 μl de la mezcla EDTA/glicógeno 20X para terminar la

reacción.

4) Se agregaron 50 μl de fenol/cloroformo/alcohol isoamílico (25:24:1); se

agitó por “vortex” y centrifugó 10 min a 14,000 rpm.

5) Se transfirió la fase acuosa a un tubo nuevo y se le agregaron 50 μl de

cloroformo/alcohol isoamílico (24:1); se agitó por “vortex” y centrifugó 10

min a 14,000 rpm.

6) Se transfirió el sobrenadante a un tubo nuevo y se agregaron 25 μl de

acetato de amonio 4 M y 187.5 μl de etanol absoluto; se agitó por “vortex”

- 44 -

y centrifugó a temperatura ambiente por 20 min a 14,000 rpm. El

sobrenadante fue descartado.

7) Se lavó la pastilla con 200 μl de etanol 80%; se agitó por “vortex” y

centrifugó a 14,000 rpm por 5 min descartando luego el etanol y dejando

secar la pastilla.

8) Se disolvió la pastilla en 5.5 μl de H2O y se guardó a -20ºC

Para analizar la eficiencia de la digestión de las muestras y controles se

corrieron en un gel de agarosa de 1.2% y buffer TAE, lo siguiente:

2.5 μl dcDNA sin digerir “Control PCR-Select” 5.0 μl dcDNA digerido “Control PCR-Select” 10.0 μl dcDNA digerido y sin digerir de “Driver”, “Tester” y “Control

SMART” 0.6 μl marcador 1 Kb 2.0 μl buffer de carga por muestra

III.5.9. Ligación de los adaptadores

1) Se diluyó 1 μl del cDNA digerido del “Tester” en 5 μl de H2O.

2) Se centrifugó brevemente el tubo de DNA control (DNA de ΦX174 digerido

con Hae III) proporcionado en el kit. Se tomaron 2 μl y se diluyeron con

38 μl de H2O.

3) Se mezcló:

• 1 μl del “Control PCR-Select” digerido con 5 μl de DNAc/HAEIII

diluido del paso anterior.

• 1 μl del “Control del SMART” digerido con 5 μl de DNAc/HAEIII

diluido del paso anterior.

- 45 -

4) Se preparó la siguiente mezcla maestra:

1 Rx 7 Rx H2O 3 μl 21 μl 5X buffer de ligación 2 μl 14 μl T4 DNA ligasa (400 U/μl) 1 μl 7 μl Volumen total 6 μl

5) Para cada cDNA “Tester” y controles “Tester”, se combinó lo siguiente en

tubos de PCR:

T-1 T-2R S-1 S-2R E-1 E-2R

cDNA “Tester” diluido 2 μl 2 μl 2 μl 2 μl 2 μl 2 μl Adaptador 1 2 μl - 2 μl - 2 μl -

Adaptador 2R - 2 μl - 2 μl - 2 μl Mezcla maestra 6 μl 6 μl 6 μl 6 μl 6 μl 6 μl

6) En 3 tubos nuevos se mezclaron:

• 2 μl de “T-1” con 2 μl de “T-2R” y etiquetó como “Tns” (“Tester” no

sustraído)

• 2 μl de “S-1” con 2 μl de “S-2R” y etiquetó como “Sns” (“Control

SMART” no sustraído)

• 2 μl de “E-1” con 2 μl de “E-2R” y etiquetó como “Ens” (“Control

PCR-Select” no sustraído)

7) Se centrifugaron brevemente los 9 tubos y se incubaron a 16ºC toda la

noche. Luego de ello, se agregó 1 μl de EDTA/glicógeno 20X para detener

la reacción.

8) Se calentaron las muestras a 72ºC por 5 min para inactivar la ligasa y se

centrifugó brevemente.

9) Se tomó 1 μl de “Tns”, “Sns”, y “Ens” y se los diluyó en 1 ml de H2O.

Estas 3 muestras se guardaron a -20ºC para usarlas posteriormente en el

PCR.

- 46 -

III.5.10. Análisis de la ligación

Cada población de cDNA del “Tester”, “Control SMART” y “Control PCR-

Select” fue dividida en dos partes iguales y en reacciones independientes, a

una parte se ligó el adaptador 1 y a la otra el adaptador 2R. El propósito del

análisis de la ligación fue verificar que en cada población del cDNA del

“Tester”, “Control SMART” y “Control PCR-Select” (ligadas a los adaptadores 1

y 2R) al menos el 25% tuviera el adaptador correspondiente ligado a uno de

sus extremos.

Los oligos G3PDH3’ y G3PDH5’ son específicos del gen de gliceraldehído-3-

fosfato deshidrogenasa de humano, rata y ratón, por tanto deben de

amplificar adecuadamente con las muestras control.

1) Se diluyó 1 μl de cada cDNA ligado en 200 μl de H2O

2) Se combinaron los siguientes reactivos en 4 tubos para cada muestra

(“Tester”, “Control SMART” y “Control PCR-Select” )

“Tester” “Control SMART”

“Control PCR-Select”

1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 Ligado a adaptador 1 1 1 - - 1 1 - - 1 1 - - Ligado a adaptador 2R - - 1 1 - - 1 1 - - 1 1 oligo G3PDH3’ 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 oligo G3PDH5’ - 1 - 1 - 1 - 1 - 1 - 1 PCR primer 1 1 - 1 - 1 - 1 - 1 - 1 - Volumen total 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 * Unidades en μl

3) Se preparó la siguiente mezcla maestra: 1 Rx 12.5 Rx

H2O 18.5 μl 231.25 μl Buffer 10x PCR Advantage 2 2.5 μl 31.25 μl Mezcla de dNTPs (10 mM) 0.5 μl 6.25 μl Mezcla de cDNA Polymerase Advantage 50X (1.1 μg/μl) 0.5 μl 6.25 μl Volumen total 22.0 μl

- 47 -

4) Se colocaron 22 μl de la mezcla maestra a cada uno de los 12 tubos y se

mezcló bien.

5) Se incubaron en el termociclador a:

75ºC por 5 min 94ºC por 30 s 65ºC por 30 s 24 ciclos 68ºC por 2.5 min

6) Se analizaron 5 μl de cada reacción en un gel de agarosa al 1.2% en buffer

TAE.

III.5.11. Primera hibridación

El buffer de hibridación se dejó descongelar a temperatura ambiente por al

menos 20 min y seguidamente se preparó la siguiente mezcla de reacción

para el “Tester” (HT) y los dos controles (HS y HE) (total: 6 tubos).

HT HS HE 1 2R 1 2R 1 2R cDNA “Driver” digerido 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 Ligación del adaptador 1 1.5 1.5 1.5 Ligación del adaptador 2R 1.5 1.5 1.5 Buffer de hibridación 4X 1 1 1 1 1 1 Volumen total 4 4 4 4 4 4

Unidades en μl

Cada muestra se mezcló y centrifugó y luego se colocó a incubar a 98ºC por

1.5 min y a 68ºC por 8 h.

- 48 -

III.5.12. Segunda hibridación

Se rotularon 3 tubos de PCR colocándose en cada tubo:

cDNA “Driver” 1 μl buffer de hibridación 4X 1 μl Agua destilada estéril 2 μl

4 μl

Los tubos se incubaron a 98ºC por 1.5 min y luego, con una micropipeta

ajustada en 15 μl, se tomó para cada muestra todo el contenido del tubo con

el adaptador 1; dejando una burbuja de aire en la punta de la pipeta, se

procedió a tomar todo el volumen de la muestra del “Driver” correspondiente

a esa muestra y todo junto fue depositado sobre el tubo con la muestra del

adaptador 2R respectivo, para luego mezclarlo bien por pipeteo y

centrifugación. Las 3 reacciones (HT, HS y HE de la segunda hibridación) se

pusieron a incubar a 68ºC toda la noche, después de lo cual se les agregaron

200 μl de buffer de dilución a cada tubo, se mezcló por pipeteo y se calentó

en el termociclador a 68ºC por 7 min. Las muestras fueron guardadas a -

20ºC.

III.5.13. Primera PCR

1. Se colocaron en tubos de PCR 1 μl de cDNA de la segunda hibridación

(tubos: HT, HS y HE) y de los correspondientes controles no sustraídos

(tubos: “Tns”, “Sns” y “Ens”), además de 1 μl del cDNA control sustraído

proporcionado en el kit (total siete tubos de reacción).

- 49 -

2. Se preparó la siguiente mezcla maestra para la primera PCR:

1 Rx 7.5 Rx H2O estéril 19.5 μl 146.3 μl Buffer 10X PCR 2.5 μl 18.8 μl Mezcla de dNTPs (10 mM) 0.5 μl 3.8 μl PCR primer 1 (10 μM) 1.0 μl 7.5 μl Mezcla de cDNA polimerasa Advantage 50X (1.1 μg/μl) 0.5 μl 3.8 μl Volumen total 24.0 μl

3. Se alicuotaron 24 μl de la mezcla maestra en cada tubo de reacción y se

incubó en el termociclador a 75ºC por 5 min para extender los

adaptadores (no retirar las muestras del termociclador). Seguidamente se

corrió el siguiente programa de PCR:

94ºC por 30 s 66ºC por 30 s 27 ciclos

72ºC por 1.5 min

4. Se analizaron 8 μl de cada tubo en un gel de agarosa al 2% con buffer

TAE.

5. Se diluyeron 3 μl de cada muestra del primer PCR en 27 μl de H2O.

5.14. Segunda PCR

1. Se colocó en un tubo nuevo 1 μl de cada producto del primer PCR diluido

y se le adicionaron 24 μl de la siguiente mezcla maestra:

1 Rx 7.5 Rx H2O estéril 18.5 μl 138.8 μl Buffer 10X PCR Advantage 2.5 μl 18.8 μl Nested PCR primer 1 (10 μM) 1.0 μl 7.5 μl Nested PCR primer 2R (10 μM) 1.0 μl 7.5 μl mezcla de dNTPs (10 mM) 0.5 μl 3.8 μl Mezcla de 50X Advantage cDNA Polymerase 0.5 μl 3.8 μl Volumen total 24.0 μl

- 50 -

2. Las reacciones se colocaron en el termociclador bajo el siguiente programa

de PCR:

94ºC por 30 s 68ºC por 30 s 10 ciclos

72ºC por 1.5 min

3. Se analizaron 8 μl de cada una de las 7 muestras en un gel de agarosa al

2% con buffer TAE.

4. Las muestras fueron almacenadas a -20ºC.

III.6. Clonación de los fragmentos diferenciales reamplificados

La clonación se realizó utilizando el vector pCR® 2.1-TOPO® del TOPO TA

Cloning Kit® (Invitrogen). La reacción de ligación se realizó de manera

independiente con producto fresco de reamplificación de los fragmentos de

cDNA provenientes por un lado del despliegue diferencial y por el otro de la

biblioteca sustractiva.

Reacción de ligación: Producto de PCR 0.8 a 1.5 μl Solución salina (1.2 M NaCl; 0.06 M MgCl2) 0.3 μl Agua estéril 0.9 a 1.6 μl Vector (10 ng/μl DNA plasmídico) 0.3 μl Volumen final 3.0 μl

La reacción de ligación se incubó por 30 min a temperatura ambiente, luego

fue dializada por 20 min (filtros de 0.025 μm) y seguidamente fue adicionada

a 25 μl de células electrocompetentes de E. coli DH5 a 4°C. La mezcla de las

células electrocompetentes con la reacción de ligación fue colocada en una

celda de electroporación previamente congelada. La electroporación se realizó

utilizando el equipo “EasyjecT Optima” (EquiBio, Boughton Monchelsea,

Kent, UK). Después del pulso eléctrico, se agregó a las celdas de

electroporación 600 μl de medio SOC, la mezcla fue recuperada en un tubo

- 51 -

eppendorf y se colocó en incubación por 1 h a 37°C. Transcurrido este tiempo

80 μl de la muestra fueron plaqueados en cajas petri con agar LB

conteniendo ampicilina (0.1 mg/ml), IPTG (0.038 mg/ml) y X-Gal (0.032

mg/ml) y crecidos durante toda la noche a 37ºC, luego de lo cual fueron

almacenadas a 4ºC.

III.7. Confirmación de la clonación

La confirmación se llevó a cabo con las colonias provenientes de la clonación

de cada uno de los fragmentos recuperados del despliegue diferencial y con

algunas colonias blancas tomadas al azar, en el caso del producto de la

clonación de la biblioteca sustractiva. Para la extracción del DNA plasmídico

se empleó el kit “Fast Plasmid®Mini” (Eppendorf, Westbury, NY). El DNA

extraído fue analizado por restricción empleando la enzima Eco RI. El

producto de la digestión fue corrido en un gel de agarosa al 3%

conjuntamente con el marcador de 25 pb para confirmar el tamaño del

inserto según lo esperado.

III.8. Resiembra de las clonas diferenciales y almacenamiento de

réplicas

Todas las clonas confirmadas del despliegue diferencial así como las

provenientes de la biblioteca sustractiva fueron resembradas en placas de

microtitulación de 96 pozos. En cada pozo de la placa de microtitulación se

colocaron 250 μl de medio LB conteniendo ampicilina (0.1 mg/ml). Cada una

de las colonias blancas fue inoculada con un palillo estéril y sembrada en

uno de los pozos de la placa. Una vez sembrado el total de pozos de la placa,

se procedió a colocarles un tapete permeable “AirPore™ Tape Sheets”

(QIAGEN Sciences, Maryland, USA), para luego dejarlas en agitación a 37°C

por toda la noche.

- 52 -

Al día siguiente, se procedió a realizar una réplica de cada una de las placas

para lo cual se transfirieron a cada pozo de otra placa, 50 μl del cultivo del

pozo correspondiente y 50 μl de glicerol estéril al 40%. A cada pozo de la

placa original también se les adicionó glicerol al 40% en un volumen igual a

la cantidad de cultivo restante. Luego de realizada esta operación, cada una

de las placas fue cubierta con un tapete impermeable “Tape Pads” (QIAGEN)

y sometida a congelación sumergiéndolas en nitrógeno líquido. Ambas placas

(original y réplica) fueron rotuladas de manera idéntica, una de las placas se

destinó para secuenciación y la otra fue almacenada a -70°C.

III.9. Secuenciación y análisis de secuencias

La secuenciación de las clonas fue llevada a cabo en el laboratorio de

Genómica del CINVESTAV-Unidad Irapuato empleando para ello el equipo

ABI Prism® 3700 DNA analyzer (Applied Biosystems, Branchburg, NJ)).

Todas las clonas fueron secuenciadas a partir del extremo 5’ utilizando el

oligonucleótido universal M13.

Las secuencias resultantes fueron filtradas para removerles la secuencia del

vector. El ensamblaje de las secuencias en contigs se realizó con el programa

“CAP3 Sequence Assembler”; esto permitió disminuir la redundancia de

secuencias y formar grupos de alta fidelidad de transcritos no redundantes

(“unigen set”). Las secuencias con longitud menor a 100 pb no fueron

consideradas en el proceso de ensamblaje. Los unigenes formados fueron

analizados con la base de datos de GenBank usando los algoritmos BLASTN y

BLASTX. La ubicación de los contigs dentro de las diferentes categorías

funcionales fue llevada a cabo de acuerdo a las categorías del catálogo MIPS

del genoma de Arabidopsis thaliana (http://mips.gsf.de/proj/thal/db/)

- 53 -

III.10. Escrutinio diferencial

Los contigs formados fueron analizados seleccionándo una secuencia

representativa de cada uno de ellos, para su impresión en membranas de

nylon. Los pasos que se siguieron con cada una de las muestras

seleccionadas se detallan a continuación:

III.10.1. Amplificación de insertos por PCR

El DNA plasmídico de cada una de las clonas seleccionadas fue extraído

utilizando el kit “QIAprep 96 Turbo Miniprep” (QIAGEN) según las

especificaciones del fabricante; y reamplificado por PCR usando los

oligonucleótidos universales M13 (directo y reverso).

Mezcla de reacción de PCR por cada reacción:

1 Rx H2O estéril 54.5 μl Buffer 10X PCR 8.0 μl MgCl2 (50 mM) 4.8 μl Mezcla de dNTPs (250 μM) 9.0 μl M13 oligo directo (0.1 μg/μl) 1.2 μl M13 oligo reverso (0.1 μg/μl) 1.2 μl Taq DNA polimerasa (5 U/μl) 0.5 μl DNA plasmídico 0.8 μl (~80 ng de DNA) Volumen total 80.0 μl

Condiciones de PCR: 94ºC por 2 min 94ºC por 1 min 55ºC por 1 min 30 ciclos

72ºC por 1 min 72ºC por 7 min

Todos los productos de PCR fueron analizados por electroforesis en gel de

agarosa al 1.2% y cuantificados por densitometría utilizando el programa

ImageJ (versión 1.2). Las concentraciones de los cDNAs fueron igualadas y se

- 54 -

transfirió un volumen igual de cada una de estas muestras a una placa de

microtitulación de 384 pozos adicionándoles luego una cantidad de 50%

(v/v) NaOH 1 N, para desnaturalizarlos.

III.10.2. Preparación de los controles

Para la impresión en las membranas de nylon se empleó como control

positivo inducido el gen de la β-1,3-glucanasa de Musa acuminata, como

control positivo constitutivo un fragmento de un gen ribosomal 28S y como

controles negativos se emplearon el vector pCR® 2.1-TOPO® vacío y un

fragmento de 50 pb de poli A.

La obtención de DNA de los dos controles positivos así como la del vector

vacío se llevó a cabo subcultivando clonas que contenían cada uno de estos

DNAs, para luego hacer la extracción del DNA con el kit “Fast Plasmid®Mini”

(Eppendorf). El fragmento poli A fue amplificado por PCR. El DNA de todos

los controles fue confirmado en un gel de agarosa al 1% y los fragmentos de

interés fueron recuperados del gel empleando las columnas del kit “GFX™

PCR DNA and Gel Band Purification” (Amersham Biosciences). La

cuantificación de los DNAs se hizo por espectrofotometría.

III.10.3. Impresión de las membranas de nylon

Cada cDNA fue impreso por triplicado, en diferentes posiciones, sobre la

membrana de nylon Hybond-N+ (Amersham Biosciences) utilizando para ello

el equipo “VIRTEK’s Chip Writer™ Colony Arraying and Picking System

(CWCAPS)” (Virtek Vision International Inc., Waterloo, Ontario). Se hicieron 3

réplicas idénticas de cada membrana. Después de la impresión, los puntos

fueron neutralizados sumergiendo las membranas en una solución de 0.5 M

Tris-HCl (pH 7.5) por 3 min y luego enjuagándolas con agua destilada

- 55 -

desionizada estéril. Los cDNAs impresos fueron fijados a la membrana con

radiación ultravioleta usando para ello el “Spectrolinker XL-1000 UV

Crosslinker” (Spectronics Corporation, Westbury, NY).

III.10.4. Preparación de sondas

Muestras de cDNAs de pulpa en estadio PCI 1, PCI 5 y PCI 7 fueron usadas

como sondas para la hibridación. La preparación de estas sondas se llevó a

cabo por RT-PCR a partir de RNA total de pulpa de cada uno de los tres

estadios.

III.10.4.1. Reacción de síntesis de la primera y segunda cadena de cDNA

de las sondas

La reacción de la síntesis de la primera y segunda cadena de DNA de las

sondas se llevó a cabo siguiendo el mismo protocolo del kit “SMART™ PCR

cDNA synthesis” (BD Biosciences, Clontech) empleado anteriormente en la

construcción de la biblioteca sustractiva de cDNA.

III.10.4.2. Marcaje de las sondas

Las sondas fueron marcadas radiactivamente usando el “Rediprime II

Random Prime Labelling System” (Amersham Biosciences). Para ello:

1) Se diluyó el cDNA que iba a ser marcado, a una concentración de 15 ng

en 49 μl de buffer TE (10 mM Tris HCl pH 8, 1mM EDTA).

2) Se desnaturalizaron las muestras de cDNA por calentamiento a 95ºC

durante 5 min en el termoblock y luego se colocaron en hielo por 5 min.

- 56 -

3) Se adicionó el DNA desnaturalizado al tubo de reacción del “Rediprime II

Random Prime Labelling System” (Amersham Biosciences) y se adicionó

también 1 μl de [-32P] dCTP, mezclando por pipeteo.

4) Las reacciones fueron incubadas a 37ºC por 20 min. Seguidamente se

detuvo la reacción adicionando 5 μl de EDTA 0.2 M.

III.10.4.3. Purificación y cuantificación de las sondas

Las sondas marcadas radiactivamente fueron purificadas utilizando las

columnas “CHROMA SPIN™ -100 + TE” (BD Biosciences, Clontech) siguiendo

el protocolo del fabricante. Estas columnas permiten purificar moléculas de

DNA con tamaño mayor a 100 pb, eliminando así los fragmentos muy

pequeños, conjuntamente con la radiactividad no incorporada.

La cuantificación de la radiactividad incorporada por cada sonda se llevó a

cabo utilizando un contador de centelleo. Para ello, se cortaron para cada

muestra dos pequeños trozos de papel filtro de 1 cm2; en uno de ellos se

imprimió 1 μl de la sonda antes de purificar y en el otro se imprimió 1 μl de

la sonda ya purificada. Luego de secarse, cada trozo de papel filtro fue

colocado en un vial debidamente rotulado y fueron leídos en el contador de

centelleo “Tricarb 2100 TR Liquid Scintillation Analyzer” (Packard, Canberra

Co). Esto permitió igualar la cantidad de las diferentes sondas radiactivas

que se utilizaron para la hibridación.

III.10.5. Prehibridación e hibridación de las membranas

Las membranas fueron prehibridadas por 4 h a 65ºC con la solución “Rapid-

hyb buffer” (Amersham Biosciences) adicionada con 0.3 mg/ml de los oligos

anidados usados en la construcción de la biblioteca sustractiva de cDNA.

- 57 -

Las sondas radiomarcadas y debidamente igualadas fueron desnaturalizadas

a 95°C durante 5 min, colocadas en hielo por 5 min y luego adicionadas a la

solución de hibridación. La hibridación fue llevada a cabo a 65°C durante

toda la noche, con agitación continua.

Posteriormente, las membranas fueron lavadas como sigue:

2 lavados con 2 X SSC/0.5% SDS 1 lavado con 1 X SSC/0.5% SDS a 65°C por 20 min 1 lavado con 0.1 X SSC/0.5% SDS

Las membranas hibridadas fueron expuestas en pantallas de fósforo por 24 a

48 h; luego de ello, fueron escaneadas utilizando el “Storm 860” (Molecular

Dynamics, Sunnyvale, CA).

III.10.6. Análisis de los resultados de la hibridación

Las imágenes de las membranas, obtenidas producto del escaneo de las

pantallas de fósforo, fueron analizadas con el programa “Array-Pro analyzer

versión 4.0” (Media Cybernetic, Silver Spring, MD). Esto permitió identificar y

cuantificar la señal de hibridación correspondiente a cada fragmento de PCR

impreso en la membrana así como cuantificar y sustraer los valores de fondo.

III.11. Análisis northern blot

Se realizó según el método descrito por Sambrook y Russell (2001), para lo

cual 10 μg de RNA total de pulpa y cáscara de cada uno de los 7 estadios de

maduración del fruto, así como 10 μg de RNA total extraídos de hoja (lámina

foliar), nervadura (de la hoja), bráctea, órganos reproductivos, cormo y raíz

fueron corridos en geles desnaturalizantes (agarosa-formaldehído al 1%) y

transferidos a membranas de nylon. Estas membranas fueron hibridadas con

sondas radiactivas de clonas identificadas como positivas en el escrutinio

diferencial.

- 58 -

Para la preparación de estas sondas se aisló el DNA plasmídico de las clonas

seleccionadas y se digirió con Eco RI para liberar el fragmento. El producto de

la digestión fue corrido en gel de agarosa al 1.2% y el fragmento de interés

fue recuperado del gel y marcado como se describió anteriormente (paso

III.10.6).

- 59 -

IV. RESULTADOS

VI. 1 Extracción de RNA total

En la extracción del RNA total de banano se presentaron dificultades debido

a que la pulpa tiene un alto contenido de carbohidratos; por ello, fue

necesario probar varios métodos de extracción de RNA.

El método que resultó ser el mas eficiente en la extracción de RNA de alta

calidad, fue el descrito por Liu et al. (1998). El RNA extraído con este método

fue usado para las pruebas de despliegue diferencial y para la construcción

de la biblioteca sustractiva de cDNA.

Para las pruebas de northern blot se empleó el método de extracción de RNA

descrito por Chang et al. (1993), con el cual se obtuvo mayor cantidad de

RNA total por miligramo de tejido con una calidad aceptable, aunque un poco

menor que con el método anterior.

Las muestras de RNA extraídas con el método de Liu et al. (1998) fueron

tratadas con DNasa I para eliminar DNA contaminante, luego de lo cual se

cuantificaron y se ajustaron las concentraciones a 1 μg/μl.

VI. 2 Despliegue diferencial

Las muestras de RNA total empleadas en el despliegue diferencial

correspondieron a los estadios de maduración PCI 1, PCI 5 y PCI 7.

El RNA total de cada una de las 3 muestras fue diluido a 150 ng/μl y luego, 1

μl de cada una de estas diluciones fue analizado en un gel de agarosa/BrEt

al 0.8% para confirmar la uniformidad de las concentraciones.

Seguidamente, se procedió a realizar las reacciones de RT-PCR usando las

combinaciones de oligos descritas en la metodología.

- 60 -

VI.2.1 Pruebas preliminares

Estas pruebas se realizaron para ajustar las condiciones de trabajo y evaluar

la eficiencia de los oligos en la producción de fragmentos de expresión

diferencial. Para ello, se probaron muestras de los estadios PCI 1 y PCI 7 con

un total de 18 combinaciones de oligos: nueve combinaciones con los oligos

de Verástegui-Peña (1999) y nueve combinaciones con los oligos de la casa

“GenHunter”.

En estos experimentos preliminares se observó que las combinaciones de

oligos de Verástegui-Peña (1999) que se probaron, presentaron un número

reducido de bandas diferenciales y las bandas fueron de tamaño pequeño

(menores de 216 pb) e incluso, en algunas combinaciones, no se observó un

buen patrón de bandeo por lo que no permitió seleccionar ninguna banda

diferencial. En cambio con los oligos de la casa “GenHunter”, se incrementó

el número de bandas diferenciales obtenidas y los tamaños de las bandas

diferenciales fueron mayores (hasta 700 pb). Por ello, se decidió continuar los

análisis utilizando únicamente los oligos de esta casa comercial (tabla 2).

Tabla 2. Resultados preliminares del despliegue diferencial.

Oligos número de combinaciones

número de bandas

diferenciales

Tamaño máximo

(pb) Verástegui-Peña (1999) 9 16 215

“GenHunter” 9 89 700

- 61 -

VI.2.2 Comparación de dos métodos de recuperación de bandas

La recuperación y reamplificación de seis fragmentos diferenciales fue

probada con el método de Wang et al. (1998) y con el de Verástegui-Peña

(1999), observándose que con ambos métodos fue posible la recuperación de

las seis bandas. El método de Verástegui-Peña (1999) permitió realizar una

recuperación y reamplificación más eficiente, mientras que el método de

Wang et al. (1998) presentó las ventajas de ser más rápido, menos laborioso y

más económico por cuanto requiere del uso de menos reactivos. Por tales

razones este último método fue el más usado, dejando el otro sólo para

aquellos casos en los que la recuperación de la banda presentó ciertas

dificultades (figura 4).

método de Wang método de Verástegui-Peña 1 2 3 4 5 6 M 1 2 3 4 5 6

Figura 4. Gel de electroforesis comparando los dos métodos de recuperación y reamplificación de bandas: Wang et al. (1998) y Verástegui-Peña (1999). Se muestran los productos de la recuperación y reamplificación de las mismas seis bandas procesadas con ambas técnicas.

125 pb

500 pb

- 62 -

VI.2.3 Experimentos definitivos de despliegue diferencial

Se analizaron tres estadios de maduración (PCI 1, PCI 5 y PCI 7) con 15

combinaciones de oligos, identificando un total de 253 bandas diferenciales

de las cuales 238 pudieron ser recuperadas, siendo el porcentaje de

recuperación de bandas del 94.1% .

En la figura 5 se muestra la autoradiografía de un gel representativo de los

ensayos de despliegue diferencial realizados y, en la figura 6, se presentan

dos secciones ampliadas de autoradiografías, donde se aprecian claramente

las diferencias en los patrones de bandeo y la presencia de bandas

diferenciales expresadas en PCI 1 así como otras expresadas sólo en los

estadios PCI 5 y PCI 7.

El número de bandas diferenciales, el tamaño máximo y el tamaño promedio

de las bandas obtenidas con cada combinación de oligos se muestra en la

tabla 3. En ella, se puede observar que los oligos anclados H-T11C y H-T11G,

en sus diferentes combinaciones con oligos aleatorios, son los que produjeron

el mayor número de bandas diferenciales y las de mayor tamaño. Además, la

combinación del oligo aleatorio H-AP5, si bien presentó un buen número de

bandas diferenciales en su combinación con el oligo anclado H-T11G, no dio

buenos resultados en la combinación con los otros 2 oligos anclados. Para los

oligos anclados H-T11A y H-T11C la mejor combinación se observó con el oligo

aleatorio H-AP1, mientras que para el oligo anclado H-T11G la mejor

combinación fue con el oligo aleatorio H-AP2 (tabla 3).

- 63 -

A B C D E M 1 5 7 1 5 7 1 5 7 M 1 5 7 1 5 7 M

Figura 5. Gel de despliegue diferencial de cDNAs de pulpa de banano en el cual se comparan 3 estadios de maduración (PCI 1, PCI 5 y PCI 7), representados en la parte superior del gel, con los números 1, 5 y 7. Se muestran dos carriles por cada estadio, puesto que cada reacción fue realizada por duplicado y corrida de manera independiente para descartar falsos positivos. Los carriles con la letra M corresponden al marcador de 25 pb. Las letras de la A-E en la parte superior, se refieren a las 5 diferentes combinaciones de oligos empleadas en este gel. Al margen derecho se observan los valores del marcador molecular.

500 pb

125 pb

150 pb

175 pb

200 pb

225 pb

250 pb

300 pb

350 pb

400 pb

- 64 -

A B

Figura 6. Secciones ampliadas de las autoradiografías obtenidas de geles de despliegue diferencial, donde se observan los diferentes patrones de bandeo. En el primer carril del lado izquierdo se aprecia el marcador de 25 pb. Los carriles 2 y 3 de las imágenes A y B corresponden a las réplicas independientes del estadio PCI 1 de maduración de pulpa de banano, mientras que los carriles 4 y 5 corresponden a las réplicas de PCI 5 y los carriles 6 y 7 a las de PCI 7. Cada sección de gel mostrada proviene de una combinación diferente de oligos.

M PCI 1 PCI 5 PCI 7

M PCI 1 PCI 5 PCI 7

500 pb

400 pb

450 pb

300 pb

375 pb

200 pb

175 pb

150 pb

125 pb

1 2 3 4 5 6 7

1 2 3 4 5 6 7

- 65 -

Tabla 3. Cuadro comparativo de los resultados obtenidos en el despliegue diferencial, para cada combinación de oligos

oligo número

de bandas

bandas Recupe-radas

tamaño máximo

(pb)

Promedio (pb)

H-AP1 29 28 580 254 H-AP2 17 17 545 245 H-AP3 22 22 650 202 H-AP4 2 2 245 243 H-AP5 0 0 0 0

H-T11A

Total 70 69 650 235 H-AP1 31 31 850 304 H-AP2 23 19 1000 350 H-AP3 22 22 520 234 H-AP4 6 4 700 439 H-AP5 1 1 125 125

H-T11C

Total 83 77 1000 306 H-AP1 25 21 620 314 H-AP2 32 31 900 291 H-AP3 5 5 170 154 H-AP4 16 13 395 206 H-AP5 22 22 448 262

H-T11G

Total 100 92 900 270

Del número total de fragmentos diferenciales recuperados, 158 fueron

clonados y secuenciados, de los cuales 150 correspondieron a fragmentos

con más de 150 pb. El análisis de expresión diferencial de los 158

fragmentos, en los 3 estadios de maduración evaluados, se muestra en la

tabla 4, en la cual se puede apreciar que la gran mayoría de los fragmentos

diferenciales identificados se encontraron inducidos en los estadios PCI 5 y

PCI 7 de maduración del banano.

- 66 -

Tabla 4. Expresión de los 158 fragmentos diferenciales clonados y secuenciados, obtenidos por cada combinación de oligos en el despliegue diferencial y agrupados por el estadio de la maduración en el que se presentó su expresión.

Combinación de oligos

Número de

bandas

PCI 5 y 7

PCI 1 y 5 PCI 1 PCI 5 PCI 7

H-T11A / HAP-1 16 11 - 4 - 1 H-T11A / HAP-2 12 10 1 - - 1 H-T11A / HAP-3 10 3 3 2 1 1 H-T11A / HAP-4 2 2 - - - - H-T11C / HAP-1 27 19 4 1 - 3 H-T11C / HAP-2 12 6 - 6 - - H-T11C / HAP-3 13 7 - 5 1 - H-T11C / HAP-4 2 1 1 - - - H-T11G / HAP-1 19 12 3 3 - 1 H-T11G / HAP-2 20 18 - 1 1 - H-T11G / HAP-4 9 6 - 2 1 - H-T11G / HAP-5 16 14 2 - - -

VI.3. Construcción de la biblioteca sustractiva de cDNA

Las muestras de RNA total empleadas para la construcción de la biblioteca

sustractiva de cDNA correspondieron a los estadios PCI 1 (Driver) y PCI 5

(Tester). A partir de estos RNA totales se intentó extraer el RNA poli (A)

utilizando para ello el kit “Dynabeads® mRNA DIRECT™” (DYNAL); sin

embargo, la eficiencia obtenida fue muy baja, posiblemente debido a los

carbohidratos aún presentes en las muestras de RNA. Por ello, se decidió

utilizar el RNA total como material de partida, siguiendo el protocolo que se

detalló en la sección de metodología.

En la síntesis de los cDNAs, fue necesario determinar el número de ciclos

apropiados de PCR para la síntesis de la segunda cadena a partir del cDNA

obtenido de las muestras procesadas con el “SMART™ PCR cDNA synthesis

- 67 -

kit”. Esto se llevó a cabo sometiendo las muestras del “Tester”, “Driver” y

“Control SMART” a 15, 18, 21 y 24 ciclos de PCR y analizando una alícuota

de cada una de ellas en un gel de agarosa/BrEt al 1.2%. Con esto, se

determinó que el número apropiado de ciclos de PCR fue de 18, puesto que al

aumentar el número de ciclos la intensidad del barrido observado en el gel no

se incrementó considerablemente (figura 7).

15 ciclos 18 ciclos 21 ciclos 24 ciclos T D C T D C M T D C T D C

Figura 7. Determinación del número óptimo de ciclos de PCR para la síntesis de la segunda cadena de cDNA. Las letras T, D y C en la parte superior de los carriles, se refieren a la muestra “Tester” (PCI 5), “Driver” (PCI 1) y “Control SMART”, respectivamente. El carril con la letra M corresponde al marcador de 1 Kb. En la parte superior de las letras se indica el número de ciclos de PCR al que fue sometido cada grupo.

Luego de que las muestras de “Tester”, “Driver” y “Control SMART” fueron

amplificadas con el número de ciclos apropiados, éstas fueron sometidas a

una cromatografía en columna con el propósito de purificar los fragmentos de

cDNA y eliminar aquellos fragmentos muy pequeños. En este proceso se

colectaron 3 distintas fracciones (A, B y C) de cada muestra para verificar la

eficiencia de la cromatografía y se analizaron en un gel de agarosa/BrEt al

1.2% (figura 8).

3054 pb

506 pb

- 68 -

La intensidad de la señal de la fracción B es aproximadamente el 40% con

respecto a la intensidad de señal de la fracción A, lo cual nos indicó que la

cromatografía estuvo bien realizada y que se podía continuar con las

digestiones (figura 8).

“Tester” “Driver” “Control SMART” M A B C A B C A B C M

Figura 8. Análisis de la purificación de los productos de PCR por cromatografía en columna. Las letras A, B y C corresponden a las 3 fracciones colectadas de cada muestra durante la cromatografía. Estas fracciones pertenecen a las muestras “Tester”, “Driver” y “Control SMART”. El carril con la letra M corresponde al marcador de 1 Kb.

Después de realizada la verificación de la cromatografía, se procedió con la

digestión de todas las muestras (“Tester”, “Driver”, “Control SMART” y

“Control PCR–Select”). Alícuotas sin digerir y digerida de cada muestra,

fueron corridas en un gel de agarosa/BrEt al 1.2%. Esto permitió confirmar

que la digestión fue adecuada, dado que el barrido que se observa en la

muestra sin digerir se encuentra más arriba que el de la misma muestra pero

digerida, y que el barrido de la muestra digerida se aprecia entre los

tamaños esperados (figura 9).

3054 pb

506 pb

- 69 -

“Driver” “ Tester” “C. SMART” “C. PCR–Select” M s/d dig s/d dig s/d dig s/d dig M

Figura 9. Análisis de la digestión con Rsa I. Los carriles con la letra M corresponden al marcador de 1 Kb. Los carriles con “s/d” y “dig” se refieren a las muestras sin digerir y digeridas, respectivamente. En la parte superior de cada par de carriles se encuentran los nombres de las muestras a las que corresponden.

Una vez comprobada la digestión, se ligaron los adaptadores al “Tester” y a

los controles y se hizo el análisis de la ligación por medio de una

amplificación por PCR usando un oligo específico para los adaptadores (“PCR

primer 1”), así como oligos específicos para el gen de G3PDH (G3PDH3’ y

G3PDH5’). Como resultado de esto, se observó que los adaptadores se habían

ligado correctamente a las muestras control puesto que se verificó el

producto de amplificación en las proporciones esperadas. Sin embargo, no se

observó amplificación en el “Tester”, pero dado que los oligos empleados para

la amplificación eran específicos de los controles (oligos específicos para el

gen G3PDH de humanos, ratas y ratones, no de plantas) era de esperarse que

no amplificara en muestras vegetales. Teniendo en cuenta que todas las

reacciones fueron colocadas de manera simultánea, bajo las mismas

condiciones, se asumió que la ligación de adaptadores en la muestra del

“Tester” había sido igualmente correcta y se procedió a realizar el primer y

segundo PCR.

Verificada la adecuada ligación de los adaptadores se procedió con las dos

rondas de PCR, al cabo de las cuales se corrió un gel de agarosa/BrEt al 2%,

506 pb

2036 pb

- 70 -

cargando 8 μl de cada una de las muestras. En el gel se pudo observar que la

amplificación del “Tester” y controles sustraídos fue exitosa, y en el caso de

los controles sustraídos el patrón de bandeo que se observó fue idéntico al

del control sustraído proporcionado en el “PCR–Select cDNA Subtraction Kit”

(figura 10).

T Tns S Sns E Ens Cs M

Figura 10. Análisis por electroforesis en gel de agarosa de la eficiencia de la sustracción y amplificación de productos. Las muestras que se observan en el gel son el producto de la segunda PCR, ordenadas de izquierda a derecha como muestra del “Tester” sustraída (T), muestra del “Tester” sin sustraer (Tns), muestra del “Control SMART” sustraído (S) y no sustraído (Sns), muestra del “Control PCR-Select” sustraído (E) y no sustraído (Ens) y muestra control sustraída proporcionada en el kit. La M corresponde al marcador de 1 Kb. Los patrones de bandeo obtenidos en los controles S y E son iguales a los que se observan en el control sustraído proporcionado en el kit, con lo que se comprueba que la construcción de la biblioteca sustractiva de cDNA estuvo bien realizada.

Luego del análisis de la amplificación del segundo PCR, se procedió a realizar

la ligación de los productos del “Tester” en el vector de clonación pCR® 2.1-

TOPO®. Para ello se hizo otro PCR con la muestra del “Tester” y “Control PCR-

Select” y se corrió otro gel de confirmación (figura 11).

506 pb

2036 pb

- 71 -

El producto de la ligación fue usado para transformar células competentes de

E. coli DH5, por electroporación. Las células transformadas fueron crecidas

en placas Petri conteniendo medio LB con ampicilina, IPTG y X-Gal.

T C M

Figura 11. Análisis de la amplificación para la ligación. El carril T corresponde al producto de reamplificación de la muestra del segundo PCR del “Tester” sustraído. El carril C se refiere a la muestra sustraída y reamplificada del “Control PCR-Select”. El carril M pertenece al marcador de 1 Kb. La eficiencia de la clonación de la biblioteca sustractiva de cDNA se

determinó por minipreps; para ello, 10 colonias blancas fueron seleccionadas

al azar y crecidas en medio LB conteniendo ampicilina. Los DNA plasmídicos

extraídos fueron digeridos con Eco RI. Los productos de la digestión se

corrieron en un gel de agarosa/BrEt al 3% conjuntamente con los

marcadores de tamaño correspondientes para verificar la presencia y tamaño

de los insertos. Como se pudo observar, la clonación fue exitosa, ya que las

10 colonias analizadas tuvieron inserto y los tamaños de insertos en este

análisis estuvieron en el rango de 100 pb a 500 pb (figura 12).

2036 pb

506 pb

- 72 -

1 2 3 4 5 L M 6 7 8 9 10

Figura 12. Confirmación de la clonación de los fragmentos de la biblioteca sustractiva de cDNA. Los carriles 1 al 10 corresponden al DNA plasmídico de 10 colonias blancas, digerido con Eco RI. El carril M corresponde al marcador de 1 Kb y el carril L al marcador de 25 pb.

VI.4 Secuenciación y análisis de secuencias

Todas las clonas positivas provenientes de la construcción de la biblioteca

sustractiva de cDNA, así como las provenientes del despliegue diferencial,

fueron inoculadas en placas de microtitulación de 96 pozos conteniendo 250

μl de medio de selección. Además, se crecieron réplicas de cada una de las

placas, las cuales fueron usadas para la secuenciación de los insertos.

Como resultado de la secuenciación de la biblioteca sustractiva de cDNA se

obtuvieron 387 secuencias con una calidad promedio de 57.45 y un tamaño

promedio de inserto de aproximadamente 400 pb, siendo el inserto de mayor

longitud de 700 pb. Para el despliegue diferencial se obtuvieron 158

secuencias, con una calidad promedio de 62.01 y un tamaño promedio de

inserto de aproximadamente 318 pb, siendo el inserto de mayor longitud de

692 pb (tabla 5).

500 pb

75 pb

- 73 -

Tabla 5. Resultados de la secuenciación de los fragmentos obtenidos por las dos técnicas de análisis de expresión diferencial de genes empleadas.

Despliegue diferencial

Biblioteca sustractiva de cDNA

Total de secuencias 158 387 Calidad promedio 62.01 57.45 Longitud promedio 318 pb 400 pb Longitud máxima 692 pb 700 pb Longitud mínima 58 pb 50 pb

VI.4.1 Ensamblaje de ESTs

Las secuencias obtenidas por ambas técnicas fueron sometidas a un proceso

de ensamblaje con el propósito de agrupar aquellas que corresponden a un

mismo transcrito, disminuyendo así la redundancia y logrando secuencias

consenso de mejor calidad y mayor longitud. Sólo las secuencias mayores a

100 pb fueron tomadas en cuenta para el ensamblaje; esto incluyó a 380

secuencias provenientes de la biblioteca sustractiva de cDNA y 155

secuencias obtenidas por despliegue diferencial. Como resultado del

ensamblaje se obtuvieron 314 unigenes y sólo 4 de ellos estuvieron

conformados por secuencias provenientes de ambas técnicas. Además, la

mayoría de los contigs (90%) estuvieron conformados por 2 a 3 secuencias

(tabla 6).

Del ensamblaje de las secuencias de la biblioteca sustractiva de cDNA se

obtuvieron 215 unigenes, de los cuales 95 fueron contigs (resultado del

ensamblaje de varias secuencias de ESTs) y 120 fueron singletons

(secuencias que no pudieron ser ensambladas dentro de ningún contig),

dando un 43.4% de redundancia. Por otro lado, con el ensamblaje de las

secuencias provenientes del despliegue diferencial se obtuvieron 103

unigenes, de los cuales 28 fueron contigs y 75 fueron singletons, siendo la

redundancia en este ensamblaje del 33.6% (tabla 6).

- 74 -

Tabla 6. Resumen comparativo de los resultados del ensamblaje de ESTs de la biblioteca sustractiva de cDNA y del despliegue diferencial.

despliegue diferencial

biblioteca sustractiva de cDNA

Número de ESTs ensamblados 155 380 Número de unigenes 103 215 Número de contigs 28 95

Número de singletons 75 120 Porcentaje de redundancia 33.6 43.4

Número de contigs con 2 a 3 ESTs 23 84 Número mayor de ESTs en un contig 7 19

VI.4.2 Anotación de los unigenes y análisis derivados

La anotación fue hecha empleando los algoritmos BLASTX y BLASTN

existentes en GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). Las

secuencias consenso de cada unigen fueron comparadas contra cuatro

diferentes bases de datos: 1) la base de datos de polipéptidos no

redundantes, 2) la base de datos de polipéptidos anotados en arroz, 3) la base

de datos de polipéptidos anotados en Arabidopsis y, 4) la base de datos de

secuencias nucleotídicas. Las búsquedas en estas cuatro bases de datos

fueron hechas empleando el entorno de MAZORKA, del CINVESTAV-Irapuato

(http://mazorka.ira.cinvestav.mx:8080/).

Como criterio para la anotación se consideró un valor esperado (valor de E) ≤

1E-06, con el cual se pudieron anotar 205 unigenes. Anotaciones con valores

superiores de E fueron consideradas como no significativas y no fueron

tomadas en cuenta.

De los 205 unigenes anotados, 175 contenían secuencias obtenidas de la

biblioteca sustractiva de cDNA, 27 poseían secuencias provenientes del

despliegue diferencial y 3 tenían secuencias de ambas técnicas.

- 75 -

El número de secuencias entre los unigenes anotados de la biblioteca

sustractiva de cDNA fue de 307, lo que representa el 80.8% de la misma; en

cambio, para el despliegue diferencial el total de secuencias entre los

unigenes anotados fue de 45, lo que corresponde al 29.0% del total de

secuencias ensambladas para esta técnica.

Los unigenes anotados fueron, a su vez, asignados a una categoría funcional

de acuerdo al catálogo de MIPS del genoma de Arabidopsis thaliana

(http://mips.gsf.de/proj/thal/db/), permitiendo el agrupamiento de los

mismos en 14 categorías funcionales distintas. En esta distribución, las

categorías más representadas dentro de los unigenes obtenidos con cada

técnica, fueron la de metabolismo de carbohidratos y energía y la de

metabolismo de proteínas. Además, un porcentaje considerable de los

unigenes presentó similitud con secuencias de proteínas de función

desconocida y no clasificadas.

Las figuras 13, 14 y 15 muestran esquemáticamente la distribución de los

unigenes anotados entre las categorías funcionales asignadas, para los

unigenes con secuencias de despliegue diferencial, de la biblioteca

sustractiva de cDNA y para el total de los unigenes anotados,

respectivamente.

- 76 -

Figura 13. Clasificación funcional de los unigenes anotados producto del despliegue diferencial, según la categoría funcional asignada de acuerdo al catálogo de MIPS del genoma de Arabidopsis thaliana (http://mips.gsf.de/proj/thal/db/).

Figura 14. Clasificación funcional de los unigenes anotados producto de la biblioteca sustractiva de cDNA, según la categoría funcional asignada de acuerdo al catálogo de MIPS del genoma de Arabidopsis thaliana (http://mips.gsf.de/proj/thal/db/).

- 77 -

Figura 15. Clasificación funcional de todos los unigenes anotados conformados por ESTs provenientes de la construcción de la biblioteca sustractiva de cDNA y del despliegue diferencial, según la categoría funcional asignada de acuerdo al catálogo de MIPS del genoma de Arabidopsis thaliana (http://mips.gsf.de/proj/thal/db/).

VI.5 Escrutinio diferencial

Para confirmar la expresión diferencial de los transcritos obtenidos a partir

de ambas técnicas, se seleccionó un EST representativo de cada unigen. Se

extrajo el DNA plasmídico de las clonas de cada uno de los ESTs

seleccionados y se realizó la amplificación del inserto por PCR. Estos

productos de la amplificación fueron impresos por duplicado sobre una

membrana de nylon. Además, se imprimieron como controles una β-1,3-

glucanasa de Musa acuminata (control inducido), un fragmento de un gen

18S ribosomal (control constitutivo), el DNA correspondiente al vector

pCR®2.1-TOPO® (control negativo) y un fragmento de poli A de 50 pb (control

negativo).

Membranas idénticas fueron hibridadas por separado con los fragmentos de

cDNA de los estadios PCI 1, 5 y 7 marcados radiactivamente. Las membranas

- 78 -

hibridadas fueron expuestas en una pantalla de fósforo por 24 a 48 h, luego

de lo cual, la pantalla fue escaneada (figura 16).

El análisis de los datos obtenidos a partir de las imágenes se hizo con el

programa “Array-pro”, versión 4.0. La intensidad de la señal radioactiva se

cuantificó como el promedio de los valores de la densidad asignada a cada

una de las áreas seleccionadas como un ‘spot’. Los valores locales del fondo

fueron sustraídos, considerando como el valor máximo de éste la señal

promedio de los ‘spots’ de los controles negativos.

Las señales de hibridación obtenidas de los repetidos de cada clona fueron

comparadas entre sí para confirmar la reproducibilidad de los datos.

La figura 17 muestra la reproducibilidad existente entre los valores de

intensidad de señal asignados a cada una de las réplicas representativas

para cada unigen. En los tres experimentos (PCI 1, PCI 5 y PCI 7) las señales

fueron altamente reproducibles excepto para un pequeño número de clonas

(entre 5 y 10 clonas por experimento, representando entre el 2 y 5% del total

de clonas presentes en el macroarreglo). La relación entre los valores

repetidos proporciona confiabilidad en la medición de los datos. Una

inspección visual de las membranas mostró que las variaciones observadas

entre las intensidades de señal de las repeticiones se debieron a la presencia

de artefactos de fondo que producían señal. El valor promedio de intensidad

de señal de todos aquellos ‘spots’ representantes del transcrito del 28S

ribosomal permitió la normalización entre las membranas de cada uno de los

experimentos de hibridación (PCI 1, PCI 5 y PCI 7) y la comparación entre

ellas.

Con el propósito de confirmar la reproducibilidad de los resultados del primer

macroarreglo se seleccionaron 230 clonas y se imprimieron tres réplicas de

cada clona en otros dos juegos de membranas (juego de membranas A y B,

con 115 clonas en cada juego), colocando como controles un fragmento de un

gen 28S ribosomal, el DNA del vector pCR®2.1-TOPO®, un fragmento de poli

- 79 -

A de 50 pb y una muestra de agua destilada desionizada. La preparación de

las sondas al igual que la hibridación de las membranas, fueron realizadas

siguiendo el mismo protocolo empleado en el primer macroarreglo. Las

membranas obtenidas producto de este segundo macroarreglo se muestran

en las figuras 18 y 19.

Los resultados del análisis de este segundo grupo de membranas

confirmaron la alta reproducibilidad de los datos obtenidos.

En el análisis de ambos arreglos de cDNA, se comparó el incremento en la

expresión de PCI 1 a PCI 5, así como de PCI 1 a PCI 7. El criterio que se

empleó para la selección de los 173 contigs expresados diferencialmente en la

maduración fue que el valor de la relación de PCI 5/PCI 1 fuera ≥ 1.45. Este

criterio se fijó teniendo en cuenta las intensidades de señal de los ‘spots’ de

los controles positivos inducidos. Los datos correspondientes a las

intensidades de señal normalizada de cada uno de estos contigs, los valores

de relación PCI 5/PCI 1 y PCI 7/PCI 1, así como la anotación de los mismos

se muestran en la tabla 7.

Además, según las gráficas de distribución de frecuencia elaboradas con los

datos obtenidos de las relaciones PCI 5/PCI 1 y PCI 7/PCI 1, podemos

observar que para el primer caso, el 70.52% de las clonas expresadas

diferencialmente presentaron una inducción de entre 1.45 a 3.95 veces más

alta con respecto a la intensidad de señal observada para el estadio de PCI 1.

Para el segundo caso, vemos que el 62.43% de las clonas diferenciales

mostraron una intensidad de señal de 0.17 a 3.17 veces más alta que la

observada en PCI 1 (figura 20A y 20B).

Por otro lado, los resultados de la intensidad de señal normalizada, en los

tres estadios de maduración (PCI 1, PCI 5 y PCI 7), nos permitieron conocer

el patrón de comportamiento en la expresión de los 173 contigs seleccionados

como diferenciales. Con lo anterior, definimos 4 patrones de comportamiento

diferentes:

- 80 -

• Tipo 1: la señal se incrementa considerablemente de PCI 1 hacia PCI 5,

decayendo dramáticamente hacia PCI 7.

• Tipo 2: la señal tiene un moderado incremento de PCI 1 a PCI 5,

decayendo discretamente hacia PCI 7.

• Tipo 3: se presenta un incremento drástico de PCI 1 hacia PCI 5 y esa

tendencia continúa hacia PCI 7.

• Tipo 4: la intensidad de señal se incrementa discretamente de PCI 1 a

PCI 5 y se sigue incrementando levemente hacia PCI 7.

En la figura 21 se encuentran graficados 2 ejemplos para cada uno de los

cuatro patrones de comportamiento identificados.

81

Sonda de PCI 1 Sonda de PCI 5 Sonda de PCI 7

Figura 16. Primer experimento de escrutinio diferencial. Macroarreglo de 384 fragmentos de cDNA impresos por duplicado en 3 membranas de nylon e hibridadas contra las sondas de cDNA de PCI 1, PCI 5 y PCI 7 respectivamente.

82

Figura 17. Reproducibilidad de las señales de hibridación. Comparación de la intensidad de señal normalizada de cada uno de los 384 ESTs contra su réplica en la misma membrana. Los paneles A, B y C representan los datos de la membrana hibridada con las sondas de PCI 1, PCI 5 y PCI 7, respectivamente.

83

Juego de membranas A

Sonda de PCI 1 Sonda de PCI 5 Sonda de PCI 7

Figura 18. Segundo experimento de escrutinio diferencial realizado con el juego de membranas A. Macroarreglo de 115 fragmentos de cDNA impresos por triplicado con 39 puntos correspondientes a los controles respectivos, en 3 membranas de nylon, hibridadas contra las sondas de cDNA de PCI 1, PCI 5 y PCI 7, respectivamente.

84

Juego de membranas B Sonda de PCI 1 Sonda de PCI 5 Sonda de PCI 7

Figura 19. Segundo experimento de escrutinio diferencial realizado con el juego de membranas B. Macroarreglo de 115 fragmentos de cDNA impresos por triplicado con 39 puntos correspondientes a los controles respectivos, en 3 membranas de nylon, hibridadas contra las sondas de cDNA de PCI 1, PCI 5 y PCI 7, respectivamente.

85

A

B

Figura 20. Análisis de frecuencia de las intensidades de señal de las 173 clonas seleccionadas como positivas, producto del escrutinio diferencial. En las barras se grafican las relaciones de intensidad de señal normalizada de PCI 5/PCI 1 (A) y de PCI 7/PCI 1 (B). En el eje X se presentan los valores de límite superior de cada intervalo de clase. En el eje Y se representan el número de contigs que corresponden a cada clase.

86

Figura 21. Patrones de expresión observados durante la maduración de banano. Se muestran 2 gráficas modelo para cada uno de los 4 tipos de patrones de expresión. El eje X representa los 3 estadios de maduración evaluados y el eje Y corresponde al promedio de la intensidad de señal normalizada de los puntos réplica impresos en el arreglo. En la parte superior de cada gráfica se presenta el nombre de la clona y su anotación. A) patrón de expresión tipo 1: señal incrementada considerablemente de PCI 1 hacia PCI 5, decayendo fuertemente hacia PCI 7. B) patrón de expresión tipo 2: señal con moderado incremento de PCI 1 a PCI 5, decayendo discretamente hacia PCI 7. C) patrón de expresión tipo 3: incremento drástico de la señal de PCI 1 a PCI 5, tendencia que continúa hacia PCI 7. D) patrón de expresión tipo 4: la intensidad de señal se eleva discretamente de PCI 1 a PCI 5 y sigue aumentando levemente hacia PCI 7.

87

Tabla 7. ESTs representativos de los contigs seleccionados como diferencialmente expresados durante la maduración del banano, agrupados por categorías funcionales.

Señal prom

Señal prom

Señal prom Relación Relación Nombre del Longitud % Score Valor

PCI 1a PCI 5 b PCI 7c PCI 5/ PCI 1 PCI 7/ PCI 1 Clonad contig (pb) identidad bits E Anotacióne citoesqueleto y ciclo celular - regulación y control

0.221 2.394 3.721 10.826 16.826 fmglMusaS8_d03 ■ fS1989_15Mar2005_1 635 84 223 2,00E-57 actin depolymerizing factor [Populus x canescens] gi|4566614|

0.442 2.721 3.029 6.152 6.848 fmglMusaS7_f08 ▲ fS1959_15Mar2005_1 597 74 180 2,00E-44 protein kinase PK12, ethylene-induced [Nicotiana tabacum] gi|7489189|

0.702 4.019 4.158 5.726 5.923 fmglMusaS4_c11 ■ fC31_15Mar2005_2 286 42 66,2 2,00E-10 gibberellin-regulated protein GASA2 precursor [Arabidopsis thaliana] gi|15233953|

5.789 25.048 21.923 4.327 3.787 fmglMusaS6_d05 ■ fS1916_15Mar2005_1 340 98 152 2,00E-36 hypothetical protein [Oryza sativa (japonica cultivar-group)] gi|37806166|

53.039 149.625 103.339 2.821 1.948 fmglMusaS6_c11 ■ fC146_15Mar2005_2 286 39 65,5 3,00E-10 gibberellin-regulated protein GASA2 precursor [Arabidopsis thaliana] gi|15233953|

1.462 3.096 2.962 2.118 2.026 fmglMusaA2_g07 ■ fC45_15Mar2005_2 1113 88 303 6.00E-81 actin bundling protein ABP135 [Lilium longiflorum] gi|11358975|

defensa, respuesta a estrés y detoxificación

1.327 8.529 8.788 6.427 6.623 fmglMusaS4_h06 ■ fC130_15Mar2005_3 171 87 82,4 3,00E-15 ferritin 1, chloroplast precursor (SOF-35) (SFerH-1) pir||A40992 ferritin precursor - soybean ferritin light chain gi|120532|

9.221 54.913 60.846 5.955 6.599 fmglMusaS4_h11 ■ fC87_15Mar2005_3 212 *100 124 1,00E-62 Musa acuminata metallothionein-like protein (MWMT3) mRNA, complete cds gi|12006149|

2.317 11.490 9.788 4.959 4.224 fmglMusaS6_e12 ■ fC153_15Mar2005_3 709 66 230 2.00E-59 saccharopin dehydrogenase-like protein [Hordeum vulgare subsp. vulgare] gi|23304415|

5.144 25.317 47.519 4.922 9.237 fmglMusaA2_f01 ■ fS1790_15Mar2005_1 699 87 387 0 cytochrome P450-1 [Musa acuminata] gi|17644125|

2.490 11.385 11.083 4.572 4.451 fmglMusaS6_f07 ■ fC155_15Mar2005_2 425 64 177 3.00E-44 annexin-like protein RJ4 gb|AAF01250.1| annexin [Fragaria x ananassa] gi|21264397|

2.039 9.227 10.552 4.527 5.176 fmglMusaS6_e08 ■ fC152_15Mar2005_3 496 95 292 2,00E-78 beta-glucosidase [Musa acuminata] gi|12746303|

0.760 3.346 10.039 4.405 13.215 fmglMusaA2_a01 ■ fS1773_15Mar2005_1 570 84 259 2,00E-68 leucine-rich repeat disease resistance protein-like [Arabidopsis thaliana] Cf-5 disease resistance protein-like [Arabidopsis thaliana] gi|9757845|

0.663 2.817 2.769 4.249 4.177 fmglMusaS4_a04 ■ fC26_15Mar2005_3 498 75 113 2,00E-24 metallothionein-like protein [Elaeis guineensis] gi|5731773|

88

1.038 3.837 12.087 3.697 11.645 fmglMusaS4_g02 ■ fC123_15Mar2005_2 151 86 63,2 2,00E-09 betaine aldehyde dehydrogenase [Oryza sativa (japonica cultivar-group)] gi|30698520|

1.683 4.154 5.673 2.469 3.371 fmglMusaS8_d10 ■ fS1992_15Mar2005_1 158 95 87,4 9,00E-17 beta-glucosidase [Musa acuminata] gi|12746303|

7.010 14.260 29.212 2.034 4.167 fmglMusaS4_d12 ■ fS1864_15Mar2005_1 229 96 121 4,00E-27 pathogen-related protein [Musa acuminata] gi|21630094|

1.240 2.404 2.605 1.939 2.101 fmglMusaA2_h07 ■ fC48_15Mar2005_4 912 68 157 4.00E-37 apoptosis-related protein 19, putative [Arabidopsis thaliana] gi|18397268|

1.231 2.385 4.769 1.938 3.875 fmglMusaS8_d11 ■ fS1993_15Mar2005_1 382 85 204 3,00E-52 glutathione peroxidase, putative [Zea mays] gi|22268405|

0.952 1.837 2.857 1.929 3.001 fmglMusaS5_a08 ■ fC127_15Mar2005_3 308 98 163 1,00E-39 beta-glucosidase [Musa acuminata] gi|12746303|

0.500 0.773 0.796 1.546 1.592 fmglMusaS5_d09 ■ fC122_15Mar2005_2 381 95 222 1,00E-57

luminal binding protein 4 precursor (BiP 4) (78 kDa glucose-regulated protein homolog 4) (GRP 78-4) dnaK-type molecular chaperone blp4 precursor - luminal binding protein (BiP) [Nicotiana tabacum] gi|729620|

3.817 5.835 13.000 1.529 3.406 fmglMusaS4_g03 * ■ fC124_15Mar2005_2 299 72 144 4,00E-34 pathogenesis related protein, putative [Oryza sativa (japonica cultivar-group)] gi|34904656|

2.779 4.180 3.862 1.504 1.390 fmglMusaS5_c07 ■ fC119_15Mar2005_2 324 78 118 3,00E-26 metallothionein-like protein [Elaeis guineensis] gi|5731773|

2.221 3.317 3.758 1.494 1.692 fmglMusaS4_g12 ■ fC128_15Mar2005_2 449 99 259 8,00E-69 cytochrome P450-4 [Musa acuminata] gi|17644127|

3.000 4.442 6.539 1.481 2.180 fmglMusaS8_d05 ■ fS1990_15Mar2005_1 407 99 254 4,00E-67 beta-glucosidase [Musa acuminata] gi|12746303|

2.048 3.029 2.683 1.479 1.310 fmglMusaS5_g03 ■ fS1895_15Mar2005_1 260 100 128 3,00E-29 cytochrome P450-1 [Musa acuminata] gi|17644125|

Metabolismo

0.442 4.442 3.596 10.044 8.130 fmglMusaS5_d03 ■ fS1887_15Mar2005_1 283 57 90,1 1,00E-17 AT5g19690/T29J13_110 [Arabidopsis thaliana] gi|15215736|

1.615 2.865 2.685 1.774 1.662 fmglMusaS7_g01 ▲ fC170_15Mar2005_2 275 86 67,8 6,00E-11 hypothetical protein [Oryza sativa (japonica cultivar-group)] gi|32352160|

1.914 3.183 3.196 1.663 1.670 fmglMusaS8_h05 ■ fS2009_15Mar2005_1 289 71 82 3,00E-15 monodehydroascorbate reductase [Oryza sativa (japonica cultivar-group)] gi|42407947|

metabolismo de aminoácidos

22.519 118.500 132.394 5.262 5.879 fmglMusaS6_b09 ■ fS1908_15Mar2005_1 637 95 392 0 methionine synthase protein [Sorghum bicolor] gi|18483235|

1.144 5.759 3.869 5.033 3.381 fmglMusaS5_g08 ■ fC138_15Mar2005_6 894 80 259 4,00E-68 methionine synthase [Catharanthus roseus] gi|8134570|

1.135 5.067 5.101 4.464 4.494 fmglMusaS4_f08 ■ fS1869_15Mar2005_1 269 *98 123 7,00E-62 MAZ93105 M.acuminata mRNA; clone pBAN UU90 gi|2624201|

89

3.846 8.509 7.467 2.212 1.941 fmglMusaS6_f03 ■ fC154_15Mar2005_3 448 93 161 2,00E-39 methionine synthase [Zea mays] gi|17017263|

4.404 8.096 3.616 1.838 0.821 fmglMusaS5_c03 ■ fC132_15Mar2005_2 214 76 96,7 1,00E-19 glutamate decarboxylase, putative [Arabidopsis thaliana] gi|21536919|

3.636 6.365 5.865 1.751 1.613 fmglMusaS4_b04 ■ fS1856_15Mar2005_1 407 78 146 4,00E-51 Ca2+-dependent lipid-binding protein, putative [Arabidopsis thaliana] gi|22655178|

5.654 9.327 12.885 1.650 2.279 fmglMusaS4_d05 ■ fS1861_15Mar2005_1 145 90 83,2 2,00E-15 glutamate decarboxylase [Oryza sativa (japonica cultivar-group)] gi|28911953|

0.500 0.743 9.234 1.486 18.468 fmglMusaS8_e03 ■ fC157_15Mar2005_3 759 81 214 2,00E-54 senescence-related protein [Pyrus pyrifolia] gi|6177796|

2.260 3.317 3.731 1.468 1.651 fmglMusaS8_d08 ■ fS1991_15Mar2005_1 462 79 239 1,00E-62 branched-chain amino acid aminotransferase [Hordeum vulgare subsp. vulgare] gi|41349631|

2.035 2.970 10.346 1.460 5.084 fmglMusaS6_a09 * ■ fC141_15Mar2005_2 414 42 55.5 2.00E-07 chorismate mutase, putative [Arabidopsis thaliana] gi|15222292|

metabolismo de carbohidratos y energía

0.183 4.529 4.779 24.789 26.158 fmglMusaS5_h07 ■ fC113_15Mar2005_4 382 37 80,1 1,00E-14 legumin-like protein [Arabidopsis thaliana] gi|15226926|

1.433 28.298 31.539 19.752 22.013 fmglMusaS4_a09 ■ fS1854_15Mar2005_1 181 96 97,8 6,00E-20 pyruvate kinase [Cicer arietinum] gi|4586602|

1.577 27.404 62.231 17.378 39.463 fmglMusaA2_f03 ■ fC11_15Mar2005_2 301 96 171 4,00E-42 plastidic glucose 6-phosphate dehydrogenase, putative [Oryza sativa (japonica cultivar-group)] gi|34395325|

5.442 44.702 12.375 8.214 2.274 fmglMusaS7_g09 * ▲ fC161_15Mar2005_3 568 98 164 1,00E-39 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase [Musa acuminata] gi|56069874|

0.529 2.942 3.135 5.564 5.927 fmglMusaS5_c11 ▲ fS1884_15Mar2005_1 550 64 190 2,00E-47 pyridine nucleotide-disulphide oxidoreductase family protein [Arabidopsis thaliana] gi|15229901|

0.375 1.664 5.144 4.436 13.718 fmglMusaS5_d02 ■ fS1886_15Mar2005_1 202 87 105 2,00E-22 formate dehydrogenase, mitochondrial precursor (NAD-dependent formate dehydrogenase) (FDH) [Oryza sativa] gi|21263611|

2.375 7.894 13.356 3.324 5.624 fmglMusaS3_h06 ▲ fS1849_15Mar2005_1 573 64 192 3,00E-48 pyridine nucleotide-disulphide oxidoreductase family protein [Arabidopsis thaliana] gi|15229901|

1.519 4.817 4.567 3.171 3.006 fmglMusaS5_c10 ■ fS1883_15Mar2005_1 407 94 236 6,00E-62 enolase 2 (2-phosphoglycerate dehydratase 2) (2-phospho-D-glycerate hydro-lyase 2) [Zea mays] gi|1169528|

5.702 17.792 10.822 3.120 1.898 fmglMusaS6_g03 ■ fC140_15Mar2005_2 704 59 260 2,00E-68 OSJNBb0022F23.4 [Oryza sativa (japonica cultivar-group)] gi|38344811|

90

5.606 16.519 12.865 2.947 2.295 fmglMusaS8_d07 * ■ fC12_15Mar2005_3 329 92 184 4,00E-46 Inositol-3-phosphate synthase (Myo-inositol-1-phosphate synthase) (MI-1-P synthase) (IPS) - myo-inositol-1-phosphate synthase - common ice plant gi|14548091|

0.500 1.417 0.708 2.833 1.415 fmglMusaS4_f01 ■ fC120_15Mar2005_3 167 86 82,4 3,00E-15 NADP-specific isocitrate dehydrogenase [Oryza sativa (japonica cultivar-group)] gi|34911932|

3.154 8.548 8.619 2.710 2.733 fmglMusaS6_b10 ■ fS1909_15Mar2005_1 370 94 72,8 2,00E-12 alcohol dehydrogenase I [Oryza rufipogon] gi|34787309|

3.856 9.769 6.029 2.534 1.564 fmglMusaS6_c08 ■ fS1914_15Mar2005_1 662 86 208 7,00E-53 unnamed protein product [Oryza sativa (japonica cultivar-group)] gi|34903262|

1.779 4.471 3.039 2.514 1.708 fmglMusaS5_h03 ■ fS1898_15Mar2005_1 221 57 73,6 1,00E-12 beta-amylase, putative [Cicer arietinum] gi|7688089|

1.423 3.417 1.314 2.401 0.923 fmglMusaS5_d11 ▲ fC135_15Mar2005_4 619 65 197 1,00E-49 pyridine nucleotide-disulphide oxidoreductase, putative [Triticum aestivum] gi|40641605|

3.106 7.433 6.126 2.393 1.972 fmglMusaS6_e06 ■ fS1917_15Mar2005_1 425 78 100 5,00E-21 fructose 1,6-bisphosphate aldolase [Oryza sativa (japonica cultivar-group)] gi|41398198|

1.192 2.789 3.596 2.339 3.016 fmglMusaA2_c05 ■ fS1783_15Mar2005_1 655 52 85,5 8,00E-16 beta-amylase [Prunus armeniaca] gi|5031285|

0.875 1.830 1.323 2.091 1.512 fmglMusaS6_f12 ■ fC156_15Mar2005_6 608 77 316 2,00E-85 isoflavone reductase related protein [Pyrus communis] gi|3243234|

42.990 74.898 39.824 1.742 0.926 fmglMusaS6_c09 ■ fC145_15Mar2005_2 573 57 187 1,00E-46 alpha-amylase, putative / 1,4-alpha-D-glucan glucanohydrolase, putative [Arabidopsis thaliana] gi|18409378|

0.579 0.942 0.822 1.627 1.420 fmglMusaS4_f09 * ■ fC159_15Mar2005_19 846 58 196 5,00E-49 alcohol dehydrogenase, putative [Cucumis melo] gi|83284968|

3.529 5.394 7.067 1.529 2.003 fmglMusaS4_f03 ■ fC121_15Mar2005_2 338 57 60,1 1,00E-08 SfUCPb [Symplocarpus foetidus] gi|7106159|

23.472 34.388 22.952 1.465 0.978 fmglMusaS4_b07 ■ fC108_15Mar2005_2 465 73 221 2,00E-57 alcohol dehydrogenase [Miscanthus sinensis var. sinensis] gi|30141778|

metabolismo de lípidos

0.789 2.760 3.385 3.500 4.293 fmglMusaS7_f07 ▲ fS1958_15Mar2005_1 535 67 125 5,00E-28 choline-phosphate cytidylyltransferase [Brassica napus] gi|7488446|

3.298 4.800 7.823 1.455 2.372 fmglMusaS6_d10 ■ fC149_15Mar2005_2 538 69 250 9,00E-66 P0501G01.24 [Oryza sativa (japonica cultivar-group)] gi|34912830|

metabolismo de nucleótidos

7.779 11.432 26.510 1.470 3.408 fmglMusaS4_d08 ■ fC116_15Mar2005_2 357 83 187 6,00E-47 uridylate kinase / uridine monophosphate kinase / UMP kinase (PYR6) [Arabidopsis thaliana] gi|30690243|

metabolismo de proteínas

2.423 47.654 45.683 19.667 18.853 fmglMusaS6_e11 ■ fS1918_15Mar2005_1 641 71 193 2,00E-48 cathepsin B-like protease, putative [Pisum sativum] gi|6562770|

91

0.077 1.365 1.760 17.750 22.875 fmglMusaS5_g04 ■ fS1896_15Mar2005_1 312 62 108 4,00E-23

ESTs AU078175(C51476),AU068986(C51476) correspond to a region of the predicted gene.~similar to NADH dehydrogenase. (AC006532) [Oryza sativa (japonica cultivar-group)] gi|6063548|

1.490 20.990 20.808 14.087 13.965 fmglMusaS4_a12 ■ fS1855_15Mar2005_1 273 97 152 2,00E-36 polyubiquitin (UBQ10) (SEN3) [Arabidopsis thaliana] gi|42572839|

3.952 44.962 41.014 11.377 10.378 fmglMusaS6_b07 ■ fS1907_15Mar2005_1 688 80 196 4,00E-49 senescence-associated protein 4 [Hemerocallis hybrid cultivar] gi|3551952|

3.548 37.452 39.125 10.556 11.027 fmglMusaS4_g07 ■ fC125_15Mar2005_2 536 78 275 4,00E-73 cp10-like protein [Gossypium hirsutum] gi|21780187|

0.500 4.721 3.433 9.442 6.865 fmglMusaA2_h02 ■ fC47_15Mar2005_4 950 75 268 1,00E-70 OSJNBa0024J22.1 [Oryza sativa (japonica cultivar-group)] gi|32483270|

1.529 7.558 9.254 4.943 6.053 fmglMusaS8_g11 ■ fC33_15Mar2005_3 526 56 86,3 3,00E-16 acetohydroxyacid isomeroreductase, putative [Oryza sativa (japonica cultivar-group)] gi|37534846|

0.885 2.971 2.352 3.357 2.658 fmglMusaS4_a01 ■ fS1852_15Mar2005_1 339 76 140 9.00E-33 ADP-ribosylation factor, putative [Arabidopsis thaliana] gi|15228912|

0.500 1.419 0.842 2.839 1.685 fmglMusaS5_b06 ■ fS1879_15Mar2005_1 238 66 92 3,00E-18 DnaJ domain containg protein, putative [Oryza sativa (japonica cultivar-group)] gi|37537098|

1.539 4.250 3.283 2.763 2.134 fmglMusaS6_a08 ■ fS1905_15Mar2005_1 471 69 119 2,00E-26 26S proteasome regulatory particle triple-A ATPase subunit1 [Oryza sativa (japonica cultivar-group)] gi|28558165|

12.577 26.962 12.567 2.144 0.999 fmglMusaS6_e04 ■ fC151_15Mar2005_2 453 82 254 3,00E-67 OSJNBa0024J22.1 [Oryza sativa (japonica cultivar-group)] gi|32483270|

2.212 3.702 3.384 1.674 1.530 fmglMusaS4_e07 * ■ fS1866_15Mar2005_1 576 62 245 6,00E-64 ubiquitin-protein ligase/ zinc ion binding [Arabidopsis thaliana] gi|18379022|

1.289 1.975 2.519 1.533 1.955 fmglMusaS8_b12 ■ fS1983_15Mar2005_1 154 97 82 4,00E-15 eukaryotic elongation factor 1A [Bruguiera sexangula] gi|24371055|

2.039 3.077 2.640 1.509 1.295 fmglMusaA2_h06 ■ fC29_15Mar2005_2 426 90 81,6 3,00E-15 protein translation factor, putative [Phleum pratense] gi|5918208|

2.720 3.988 2.615 1.466 0.961 fmglMusaS6_a01 ■ fS1901_15Mar2005_1 561 38 99,4 4,00E-20 kinesin light chain, putative [Oryza sativa (japonica cultivar-group)] gi|19387245|

18.221 26.537 27.144 1.456 1.490 fmglMusaS5_b01 ■ fC109_15Mar2005_2 187 96 60,8 8,00E-09 ubiquitin-like protein [Arabidopsis thaliana] gi|15238924|

metabolismo secundario

0.462 2.212 3.279 4.792 7.104 fmglMusaS6_d04 ■ fC22_15Mar2005_2 702 73 179 4,00E-44 sterol carrier protein 2 (SCP-2) family protein [Arabidopsis thaliana] gi|15239102|

1.394 3.125 4.112 2.242 2.950 fmglMusaS4_d04 * ■ fS1860_15Mar2005_1 431 68 53,5 9,00E-07 orcinol O-methyltransferase [Rosa chinensis] gi|20514367|

92

pared celular 0.8846 10.808 16.347 12.217 18.4789 fmglMusaS5_d04 ■ fC136_15Mar2005_2 391 84 177 6,00E-44 pectate lyase 2 [Musa acuminata] gi|6606534| 0.5385 4.394 8.923 8.161 16.5714 fmglMusaA2_c04 ■ fC24_15Mar2005_12 772 98 206 4,00E-52 pectate lyase 2 [Musa acuminata] gi|6606534|

0.5673 1.567 0.873 2.763 1.5390 fmglMusaS8_c03 ■ fS1985_15Mar2005_1 648 97 218 8,00E-56 cell wall invertase [Musa acuminata] gi|27802647|

6.0288 13.096 15.067 2.172 2.4992 fmglMusaS4_h01 ■ fC129_15Mar2005_3 452 99 303 5,00E-82 pectate lyase 2 [Musa acuminata] gi|6606534|

1.7212 3.164 2.539 1.838 1.4748 fmglMusaA2_h03 * ● fC97_15Mar2005_2 731 54 142 9,00E-33 glycosyl hydrolase family protein 17 [Arabidopsis thaliana] gi|15238600|

6.0865 8.893 11.106 1.461 1.8246 fmglMusaS8_h08 ■ fC158_15Mar2005_2 572 77 303 1,00E-81 beta-galactosidase [Asparagus officinalis] gi|1168654|

transcripción

0.115 1.644 4.644 14.250 40.250 fmglMusaS4_c09 ■ fS1857_15Mar2005_1 227 58 90,9 7,00E-18 zwh21.1 [Oryza sativa (indica cultivar-group)] gi|5852098|

0.933 5.769 4.048 6.186 4.340 fmglMusaS4_c06 ■ fC112_15Mar2005_2 208 93 69,3 2,00E-11 eukaryotic translation initiation factor 5A isoform I [Hevea brasiliensis] gi|33325117|

1.529 5.385 4.731 3.522 3.094 fmglMusaS8_g08 * ■ fC49_15Mar2005_2 493 82 85,5 7,00E-16 NAM-like protein [Musa acuminata] gi|84663845|

5.481 18.577 11.058 3.390 2.018 fmglMusaS3_f10 ▲ fS1845_15Mar2005_1 259 *92 49 9,00E-18 Globba orixensis specimen-voucher Kress 01-6897 US trnK gene, intron; and maturase K (matK) gene, complete cds; chloroplast gi|38112169|

6.067 19.750 18.404 3.255 3.033 fmglMusaS6_c05 ■ fS1912_15Mar2005_1 678 98 249 5,00E-65 GTP-binding nuclear protein RAN1B [Lotus corniculatus var. japonicus] gi|1710008|

15.308 48.396 35.217 3.162 2.301 fmglMusaS6_e07 ■ fC20_15Mar2005_2 435 88 255 2,00E-67 zinc finger protein, putative [Oryza sativa (japonica cultivar-group)] gi|34908682|

3.183 7.644 13.183 2.402 4.142 fmglMusaS4_e04 ■ fS1865_15Mar2005_1 487 59 70,5 1,00E-11 eukaryotic translation initiation factor 5 (eIF-5) - kidney bean gi|1352439|

2.760 4.202 3.952 1.523 1.432 fmglMusaS8_b06 ■ fS1982_15Mar2005_1 688 52 114 1,00E-24 putative protein [Arabidopsis thaliana] gi|7486386|

10.346 15.283 12.471 1.477 1.205 fmglMusaS4_a02 ■ fS1853_15Mar2005_1 127 75 56,6 2,00E-07 F26F24.8 [Arabidopsis thaliana] gi|25373030|

2.904 4.239 3.660 1.460 1.260 fmglMusaS6_e02 ■ fC35_15Mar2005_2 318 85 141 4,00E-33 transcription initiation factor IIA gamma chain / TFIIA-gamma (TFIIA-S) [Arabidopsis thaliana] transcription factor IIA small subunit [Arabidopsis thaliana] gi|15233829|

transducción de señales

1.039 4.702 5.510 4.528 5.306 fmglMusaA2_d06 ■ fS1787_15Mar2005_1 354 58 98,6 3,00E-20 serine/threonine-specific receptor protein kinase, putative [Oryza sativa (japonica cultivar-group)] gi|34895444|

93

2.596 7.599 6.535 2.927 2.517 fmglMusaS5_f01 ■ fS1893_15Mar2005_1 411 70 59,7 1,00E-08 metallophosphatase, putative [Lupinus luteus] gi|18075960|

2.664 4.519 6.942 1.697 2.607 fmglMusaS4_b08 ■ fC10_15Mar2005_3 334 98 128 3,00E-29 unnamed protein product [Oryza sativa (japonica cultivar-group)] gi|34903330|

2.125 3.365 5.442 1.584 2.561 fmglMusaS8_f11 ■ fC30_15Mar2005_4 1081 99 296 5,00E-79 calmodulin [Oryza sativa (japonica cultivar-group)] gi|34903134|

transporte

0.096 5.240 8.654 54.500 90.000 fmglMusaS4_c05 ■ fC27_15Mar2005_3 440 95 249 1,00E-65 plasma membrane H+-ATPase [Sesbania rostrata] gi|31580853|

0.048 0.798 1.192 16.600 24.800 fmglMusaS4_e11 ■ fS1867_15Mar2005_1 366 76 130 6,00E-30 hemoglobin [Zea mays] gi|22001639|

0.740 7.231 3.490 9.766 4.714 fmglMusaS5_h10 * ● fC131_15Mar2005_8 523 59 132 3.00E-30 thioredoxin H-type 1 (TRX-H-1) [Arabidopsis thaliana] gi|15230385|

1.308 6.433 5.691 4.918 4.351 fmglMusaA2_f06 ■ fC39_15Mar2005_3 1152 61 117 6,00E-25 thioredoxin h [Oryza sativa (japonica cultivar-group)] gi|12082335|

4.529 19.732 22.760 4.357 5.026 fmglMusaA2_f05 ■ fS1791_15Mar2005_1 530 78 278 4,00E-74 permease, putative [Oryza sativa (japonica cultivar-group)] gi|37806039|

197.424 499.628 450.528 2.531 2.282 fmglMusaS6_d07 ■ fC148_15Mar2005_2 720 85 350 1,00E-95 Ras-related GTP-binding protein, putative [Arabidopsis thaliana] gi|15217568|

5.856 13.808 7.644 2.358 1.305 fmglMusaS6_f06 ■ fS1920_15Mar2005_1 679 83 382 0 clathrin heavy chain, putative [Arabidopsis thaliana] gi|42563757|

1.462 3.375 2.135 2.309 1.461 fmglMusaS6_g07 ■ fS1924_15Mar2005_1 497 87 285 4,00E-76 transport protein particle component Bet3-like protein [Oryza sativa (japonica cultivar-group)] gi|34896970|

1.115 2.442 0.192 2.190 0.172 fmglMusaS4_e10 ■ fC106_15Mar2005_2 173 80 84,3 7,00E-16 PDR-like ABC transporter, putative [Oryza sativa (japonica cultivar-group)] gi|40253893|

1.529 3.221 2.644 2.107 1.730 fmglMusaS4_g06 ■ fS1871_15Mar2005_1 363 96 59,7 1,00E-08 ADP-ribosylation factor [Medicago sativa] gi|39653273|

2.125 4.394 2.894 2.068 1.362 fmglMusaS6_f04 ■ fS1919_15Mar2005_1 691 53 104 2,00E-21 amino acid transporter family protein [Arabidopsis thaliana] gi|18406463|

1.096 2.237 2.846 2.040 2.597 fmglMusaS5_f10 ■ fC115_15Mar2005_2 154 92 62 4,00E-09 ubiquinone oxidoreductase subunit, putative [Oryza sativa (japonica cultivar-group)] gi|37537176|

1.904 3.615 2.425 1.899 1.274 fmglMusaS8_b04 ■ fS1981_15Mar2005_1 602 63 60,1 3,00E-08 clathrin heavy chain - soybean gi|7441347|

3.010 5.712 3.808 1.898 1.265 fmglMusaS7_e12 * ● fC180_15Mar2005_2 779 90 259 3.00E-68 vacuolar H+-ATPase catalytic subunit [Allium cepa] gi|6692624|

1.289 2.115 0.971 1.642 0.754 fmglMusaS5_g01 ■ fC110_15Mar2005_3 324 86 164 6,00E-40 hexose transporter pGlT [Olea europaea] gi|15625046|

1.962 2.952 2.327 1.505 1.186 fmglMusaS5_f09 ■ fS1894_15Mar2005_1 237 84 132 2,00E-30 PDR-like ABC transporter [Oryza sativa (japonica cultivar-group)] gi|27368821|

3.808 5.710 5.144 1.500 1.351 fmglMusaS6_e03 * ■ fC150_15Mar2005_2 707 74 253 3,00E-66 thioredoxin gi|308906|

94

1.269 1.875 2.769 1.477 2.182 fmglMusaS5_h08 ■ fS1899_15Mar2005_1 275 54 105 3,00E-22 synaptotagmin [Arabidopsis thaliana] gi|18399541|

proteínas desconocidas y no clasificadas

1.615 9.048 10.250 5.601 6.345 fmglMusaA2_d05 ■ fC28_15Mar2005_2 585 76 92 7,00E-18 hypothetical protein [Sorghum bicolor] gi|4680212|

2.769 14.817 15.885 5.351 5.736 fmglMusaA2_h01 ■ fS1796_15Mar2005_1 277 89 105 2,00E-22 expressed protein [Arabidopsis thaliana] gi|18394220|

4.762 17.248 23.807 3.622 5.000 fmglMusaS8_b11 ■ fC175_15Mar2005_3 442 68 149 9,00E-36 expressed protein [Arabidopsis thaliana] gi|18400785|

3.375 10.158 9.866 3.010 2.923 fmglMusaS6_a10 ■ fC142_15Mar2005_2 709 52 226 3,00E-58 OSJNBa0033G05.10 [Oryza sativa (japonica cultivar-group)] gi|38344886|

4.308 12.523 4.059 2.907 0.942 fmglMusaS6_a07 ■ fS1904_15Mar2005_1 697 79 201 4,00E-62 OSJNBa0060B20.12 [Oryza sativa (japonica cultivar-group)] gi|21741752|

4.750 13.279 6.067 2.796 1.277 fmglMusaS6_b05 ■ fS1906_15Mar2005_1 563 58 166 3,00E-40 NC domain-containing protein [Arabidopsis thaliana] gi|18415178|

10.125 27.587 9.559 2.725 0.944 fmglMusaS5_b11 ▲ fS1881_15Mar2005_1 544 70 140 1,00E-32 phospholipase, putative [Oryza sativa] gi|34897344|

1.481 3.548 4.067 2.396 2.747 fmglMusaS7_g06 * ▲ fS1965_15Mar2005_1 607 62 111 9.00E-24 expressed protein [Arabidopsis thaliana] gi|42571863|

4.731 10.002 21.995 2.114 4.649 fmglMusaS6_e09 ■ fC147_15Mar2005_2 693 *95 516 0 MAZ99968 Musa acuminata mRNA for unknown ripening-related protein (clone pBAN EU112) gi|6249486|

1.289 2.442 1.750 1.896 1.358 fmglMusaS8_a03 ■ fC43_15Mar2005_2 293 60 89,4 2,00E-17 haloacid dehalogenase-like hydrolase family protein [Arabidopsis thaliana] gi|18399067|

1.346 2.414 4.298 1.793 3.193 fmglMusaS8_a08 ■ fS1977_15Mar2005_1 316 *79 34 1,00E-08 MAZ93107 M.acuminata mRNA; clone pBAN UU80 gi|2624203|

1.596 2.589 1.839 1.622 1.152 fmglMusaS6_c03 ■ fS1911_15Mar2005_1 446 68 74,3 5,00E-13 pectin acetylesterase precursor, putative [Oryza sativa (japonica cultivar-group)] gi|34913332|

1.760 2.837 2.202 1.612 1.251 fmglMusaS4_h02 ■ fS1872_15Mar2005_1 180 *90 44 6,00E-15 Oryza sativa (japonica cultivar-group) cDNA clone:006-212-H07, full insert sequence gi|32994606|

1.375 2.181 4.115 1.586 2.993 fmglMusaS6_f10 ■ fS1921_15Mar2005_1 689 33 106 4,00E-22 hypothetical protein [Oryza sativa (japonica cultivar-group)] gi|37806166|

3.414 5.289 10.462 1.549 3.065 fmglMusaS5_b04 ■ fC118_15Mar2005_2 150 *93 88 3,00E-41 WHTMT26SRR Wheat mitochondrial 26S rRNA gene, complete cds gi|343690|

18.250 26.572 28.567 1.456 1.565 fmglMusaS3_h07 ▲ fC46_15Mar2005_5 361 83 72 3,00E-12 yippee family protein [Arabidopsis thaliana] YPL5_ARATH Yippee-like protein At4g27740 [Arabidopsis thaliana] gi|15234265|

95

no anotadas 2.712 47.154 115.981 17.390 42.773 fmglMusaS3_h09 * ● fC105_15Mar2005_5 472 --- 0.173 2.317 2.471 13.389 14.278 fmglMusaS5_g05 ■ fS1897_15Mar2005_1 172 --- 2.260 19.471 20.200 8.617 8.940 fmglMusaS3_h10 ▲ fS1850_15Mar2005_1 225 --- 1.048 8.048 5.683 7.679 5.422 fmglMusaS3_d11 ▲ fS1840_15Mar2005_1 231 --- 2.212 16.942 32.798 7.659 14.827 fmglMusaS4_d07 ■ fS1863_15Mar2005_1 245 --- 5.106 28.500 16.971 5.582 3.324 fmglMusaS6_g10 ■ fC32_15Mar2005_2 531 --- 1.394 7.298 4.462 5.234 3.200 fmglMusaS6_f01 ■ fC23_15Mar2005_2 325 --- 0.433 1.990 0.736 4.600 1.700 fmglMusaS3_d08 ▲ fC94_15Mar2005_3 248 --- 2.048 9.096 12.837 4.441 6.268 fmglMusaS4_d06 * ■ fS1862_15Mar2005_1 371 --- 2.308 8.606 5.481 3.729 2.375 fmglMusaS5_h01 * ■ fC34_15Mar2005_5 254 --- 1.385 4.760 3.725 3.438 2.690 fmglMusaS3_d10 ▲ fS1839_15Mar2005_1 184 --- 1.721 5.760 4.365 3.346 2.536 fmglMusaS5_e01 ■ fC108_15Mar2005_2 370 --- 1.625 5.385 1.952 3.314 1.201 fmglMusaS7_d09 ▲ fS1947_15Mar2005_1 278 --- 3.750 9.490 8.274 2.531 2.206 fmglMusaS6_d09 ■ fC16_15Mar2005_2 366 --- 1.769 4.269 3.539 2.413 2.000 fmglMusaS5_c12 ▲ fS1885_15Mar2005_1 389 --- 2.154 5.067 3.654 2.353 1.696 fmglMusaS8_c02 ▲ fS1984_15Mar2005_1 231 --- 2.808 6.589 6.955 2.347 2.477 fmglMusaS6_b12 ■ fC15_15Mar2005_2 422 --- 1.875 4.327 3.577 2.308 1.908 fmglMusaS5_d10 * ■ fS1888_15Mar2005_1 589 --- 1.173 2.683 1.914 2.287 1.631 fmglMusaS6_c01 ■ fS1910_15Mar2005_1 563 --- 1.183 2.566 1.417 2.170 1.199 fmglMusaS3_f09 ▲ fC102_15Mar2005_2 313 --- 0.500 1.078 0.756 2.157 1.513 fmglMusaA2_g10 ■ fC36_15Mar2005_2 321 --- 2.750 5.673 3.654 2.063 1.329 fmglMusaS3_e10 ▲ fS1843_15Mar2005_1 367 --- 3.990 8.221 8.885 2.060 2.227 fmglMusaS4_c12 ■ fS1858_15Mar2005_1 250 --- 1.289 2.558 3.677 1.985 2.854 fmglMusaS8_a01 ▲ fC165_15Mar2005_2 499 ---

14.740 27.702 10.317 1.879 0.700 fmglMusaS3_a10 ▲ fS1834_15Mar2005_1 309 --- 4.779 8.817 12.096 1.845 2.531 fmglMusaS5_a03 ■ fS1874_15Mar2005_1 187 ---

28.000 51.144 49.096 1.827 1.753 fmglMusaS4_b11 * ■ fC17_15Mar2005_3 318 --- 2.519 4.433 4.356 1.760 1.729 fmglMusaS6_g05 ■ fS1923_15Mar2005_1 373 --- 2.664 4.462 3.596 1.675 1.350 fmglMusaS3_c11 ▲ fS1837_15Mar2005_1 279 --- 2.250 3.596 4.529 1.598 2.013 fmglMusaS6_c07 ■ fS1913_15Mar2005_1 520 ---

96

1.183 1.885 3.414 1.594 2.886 fmglMusaS8_e11 ■ fS1997_15Mar2005_1 314 --- 2.500 3.885 8.644 1.554 3.458 fmglMusaA2_f02 ■ fC37_15Mar2005_3 633 --- 1.337 1.993 1.442 1.491 1.079 fmglMusaS7_h01 ▲ fS1970_15Mar2005_1 250 --- 2.385 3.525 3.154 1.478 1.323 fmglMusaS4_c07 ■ fC111_15Mar2005_2 216 --- 1.740 2.538 1.952 1.458 1.122 fmglMusaS5_h11 ▲ fC98_15Mar2005_2 264 --- 1.731 2.522 1.215 1.457 0.702 fmglMusaS5_e10 ■ fS1892_15Mar2005_1 300 --- 2.606 3.796 2.740 1.457 1.052 fmglMusaS3_d09 ▲ fS1838_15Mar2005_1 290 ---

a,b,c Promedio de la intensidad de señal normalizada de los puntos réplica de cada clona en el arreglo de membrana hibridada contra las sondas

de PCI 1, PCI 5 y PCI 7 respectivamente. d Clona del contig, que fue empleada en el macroarreglo. e Anotación con la base de datos de polipéptidos no redundantes de GenBank.

♦ Anotación con la base de datos de secuencias nucloetídicas de GenBank. ● Contigs conformados por secuencias provenientes de la construcción de la biblioteca sustractiva de cDNA y del despliegue diferencial ▲ Contigs formados por secuencias provenientes únicamente del despliegue diferencial ■ Contigs formados por secuencias provenientes únicamente de la construcción de la biblioteca sustractiva de cDNA * Clonas para las cuales se realizaron los ensayos de northern blot (se encuentran resaltadas en azul)

97

VI.6 Análisis de ensamblaje y alineamiento

Dentro de los contigs y singletons seleccionados como positivos, se

encuentran 26 que contienen únicamente secuencias obtenidas del

despliegue diferencial, 142 que provienen de secuencias de la biblioteca

sustractiva de cDNA y 4 que contienen secuencias de ambas técnicas.

Como se puede observar en la tabla 7, varios de los contigs resultantes

presentan similitud con una misma proteína; sin embargo, las secuencias

consenso de estos contigs no fueron agrupadas entre sí en el ensamblado

automático. Por ello, se llevó a cabo un ensamblaje y alineamiento manual

para aquellos cuya anotación correspondió a:

• factor de ribosilación dependiente de ADP (Arabidopsis thaliana y

Medicago sativa),

• alcohol deshidrogenasa (Miscanthus sinensis y Oryza rufipogon),

• beta-glucosidasa (Musa acuminata),

• citocromo P450 1 y 4 (Musa acuminata),

• beta-amilasa (Cicer arietinum y Prunus armeniaca),

• cadena pesada de clatrina (Arabidopsis thaliana),

• pectato liasa 2 (Musa acuminata),

• isoforma I del factor 5A de iniciación de la traducción eucariótica

(Hevea brasiliensis),

• glutamato descarboxilasa (Oryza sativa y Arabidopsis thaliana),

• proteína hipotética (Oryza sativa),

• proteína similar a metalotioneina (Elaeis guineensis y Musa

acuminata),

98

• metionina sintasa (Zea mays y Sorghum bicolor),

• OSJNBa0024J22.1 (Oryza sativa),

• Transportador ABC similar a PDR (Oryza sativa),

• Proteína de la familia de disulfuro oxidoreductasa dependiente de

piridín nucleótidos (Arabidopsis thaliana),

• Tiorredoxina (gi|308906|),

• precursor de la proteína GASA2 regulado por giberelinas (Arabidopsis

thaliana)

Los datos de este ensamblaje, para los seis casos en que sí pudieron

agruparse, se reportan en el anexo 4.

En el análisis de la beta-glucosidasa se compararon las secuencias consenso

de fC127_15Mar2005_3, fC152_15Mar2005_3, fS1990_15Mar2005_1 y

fS1992_15Mar2005_1 contra la secuencia de la beta-glucosidasa de banano

reportada en el GenBank. El análisis demostró que las cuatro secuencias

consenso corresponden al mismo transcrito, donde la secuencia de

fS1990_15Mar2005_1 se encuentra dentro de la secuencia consenso de

fC152_15Mar2005_3; y las secuencias de fC127_15Mar2005_3,

fC152_15Mar2005_3 y fS1992_15Mar2005_1 no se ensamblaron en un solo

contig puesto que no se traslapan entre sí.

Los tres contigs anotados como pectato liasa 2 también corresponden al

mismo transcrito aunque las secuencias consenso de fC129_15Mar2005_3 y

fC136_15Mar2005_2 no se traslapan entre sí. Además, la secuencia de

fC24_15Mar2005_12 se encuentra contenida en la secuencia de

fC136_15Mar2005_2.

En el caso de los dos contigs con similitud al precursor de la proteína GASA2

(fC31_15Mar2005_2 y fC146_15Mar2005_2), encontramos que ambas

99

secuencias se superponen perfectamente en una región, por lo que

pertenecen al mismo transcrito.

De los tres contigs con similitud a tiorredoxina (fC150_15Mar2005_2,

fC39_15Mar2005_3 y fC131_15Mar2005_8), sólo dos de ellos

(fC131_15Mar2005_8 y fC39_15Mar2005_3) correspondieron al mismo

transcrito y pudieron ser ensamblados, mientras que el otro correspondería a

otra tiorredoxina.

Los singletons fS1884_15Mar2005_1 y fS1849_15Mar2005_1 con similitud a

la disulfuro oxidoreductasa dependiente de piridín nucleótidos, presentaron

traslape en una región, por lo que corresponden al mismo transcrito; sin

embargo, el contig fC135_15Mar2005_4 no pudo ser ensamblado con ellos.

Las secuencias consenso de tres contigs (fS1790_15Mar2005_1,

fS1895_15Mar2005_1 y fC128_15Mar2005_2) presentaron similitud con una

citocromo P450 y fueron comparadas contra las secuencias de la citocromo

P450-1 y P450-4 de banano, encontrando que en principio las dos secuencias

de citocromo de banano reportadas en el GenBank se agrupan entre sí y

además las otras tres secuencias consenso también agruparían en el mismo

contig, observándose que la secuencia del singleton fS1895_15Mar2005_1 se

encontraría dentro de la del contig fC128_15Mar2005_2 y ambas se

alinearon con una región común a citocromo P450-1 y P450-4. La secuencia

de fS1790_15Mar2005_1 estaría alineándose principalmente con la secuencia

de citocromo P450-1 y en un fragmento más pequeño con la citocromo P450-

4 de banano.

En los otros once casos donde se observaron diferentes consensos con

anotación hacia la misma proteína, aún con el análisis de alineamiento y

ensamblaje más detallado que se llevó a cabo, no se pudieron agrupar.

Por otro lado, la clona fmglMusaS4_d04 (fS1860_15Mar2005_1) anotada con

una orcinol O-metil transferasa y la clona fmglMusaS4_d06

(fS1862_15Mar2005_1), sin anotación significativa pero con cierta similitud

100

hacia la misma proteína, presentaron perfiles de expresión idénticos por ello

se realizó un ensamblaje y alineamiento de sus secuencias, lo cual confirmó

que correspondían al mismo transcrito.

VI.7 Análisis de la expresión diferencial

Dieciocho clonas con expresión diferencial confirmada en los macroarreglos,

fueron seleccionadas para realizar los análisis de expresión diferencial; doce

de ellas obtenidas a partir de la construcción de la biblioteca sustractiva de

cDNA, otras dos provenientes de las pruebas de despliegue diferencial y las

cuatro últimas representantes de los unigenes que agruparon ESTs obtenidos

a partir de ambas técnicas (figuras 22, 23 y 24). Los datos de la señal de

hibridación de estas clonas en los macroarreglos, así como la anotación de

los mismos, se encuentran resaltados en la tabla 7.

Para las clonas con similitud a una tiorredoxina (fmglMusaS6_e03), una

proteína relacionada a patogénesis (fmglMusaS4_g03), una inositol-3-fosfato

sintasa (fmglMusaS8_d07) y el transcrito fmglMusaS5_h01 (sin anotación

significativa), obtenidas como resultado de la construcción de la biblioteca

sustractiva de cDNA, el análisis northern blot se limitó únicamente a los siete

estadios de pulpa, observando en los dos primeros casos, un patrón de

expresión similar, con un nivel máximo de expresión en el estadio PCI 4,

decayendo levemente hacia PCI 7. El perfil de expresión de la clona con

similitud a la inositol-3-fosfato sintasa (fmglMusaS8_d07) presentó su

máximo nivel en PCI 5, disminuyendo ligeramente hacia PCI 7. En cambio,

para la clona anotada con una proteína relacionada a patogénesis

(fmglMusaS4_g03), se observó un patrón de expresión con un incremento

moderado de PCI 1 hacia PCI 5, y una marcada elevación hacia PCI 7 (figura

22).

Un segundo grupo de siete clonas, todas ellas provenientes de la

construcción de la biblioteca sustractiva de cDNA, fue analizado por northern

101

blot para los siete estadios de pulpa, los estadios PCI 1, PCI 5 y PCI 7 de

cáscara, así como su expresión en tejidos de hoja y raíz (figura 23). En este

grupo, las clonas anotadas con una alcohol deshidrogenasa

(fmglMusaS4_f09) y una proteína similar a NAM (fmglMusaS8_g08),

presentaron patrones de expresión similares en todos los estadios de pulpa,

con una muy discreta elevación de la señal hacia PCI 3, incrementándose

significativamente en PCI 4 y encontrando su nivel máximo de expresión en el

estadio PCI 5, después del cual empieza a decaer. Además, los perfiles de

expresión de la clona anotada con una orcinol-O-metiltransferasa

(fmglMusaS4_d04) y la clona no anotada fmglMusaS4_d06, fueron idénticos

entre sí, observándose un incremento moderado de la señal, de PCI 1 a PCI 4,

alcanzando su máximo nivel en PCI 6 y disminuyendo levemente hacia PCI 7,

siendo la señal en PCI 7 superior a la observada en PCI 5. Un análisis de

alineamiento de secuencia de estas dos clonas (fmglMusaS4_d04 y

fmglMusaS4_d06) demostró que corresponden al mismo transcrito. En los

tejidos de cáscara analizados, se observaron patrones de expresión similares

para estas cuatro clonas, mientras que en el análisis de los tejidos de hoja y

raíz, las clonas fmglMusaS4_d04, fmglMusaS4_d06, fmglMusaS4_f09 no

mostraron expresión y la clona fmglMusaS8_g08 presentó una muy sutil

expresión en raíz.

En el análisis del perfil de expresión en pulpa de la clona fmglMusaS4_b11

(sin anotación significativa), se observó el máximo nivel de señal en el estadio

PCI 4, decayendo hacia PCI 7. La expresión en cáscara siguió la misma

tendencia y no se observó expresión ni en hoja ni en raíz.

La expresión de la clona similar a una ubiquitin protein ligasa

(fmglMusaS4_e07), fue muy marcada en tejido de pulpa, estando

completamente ausente en PCI 1 y elevándose drásticamente a partir de PCI

2, alcanzando su nivel máximo en PCI 6. Este mismo patrón de expresión se

observó en los tejidos analizados de cáscara. Además, presentó una clara

expresión en raíz y no estuvo presente en hoja.

102

La clona con similitud a una corismato mutasa (fmglMusaS6_a09) presentó

por su parte, una elevación discreta de su expresión en pulpa de PCI 1 hacia

PCI 6, alcanzando su nivel máximo en PCI 7. Para esta clona, los perfiles de

expresión obtenidos en los 3 estadios de maduración de la cáscara que

fueron analizados, no son coincidentes con los perfiles obtenidos en el

análisis de la expresión en pulpa. Además se observó expresión en raíz y muy

ligeramente en hoja.

Un tercer grupo de siete clonas fue analizado por northern blot para los siete

estadios de maduración de pulpa y cáscara así como para otros seis tejidos

(hoja, nervadura, bráctea, órgano reproductivo, cormo y raíz); cuatro de ellas

corresponden a contigs que agrupan ESTs obtenidos por ambas técnicas

(fmglMusaS5_h10, fmglMusaS3_h09, fmglMusaS7_e12 y fmglMusaA2_h03),

otras dos pertenecen a secuencias obtenidas por despliegue diferencial

(fmglMusaS7_g06 y fmglMusaS7_g09), mientras que la clona

fmglMusaS5_d10 fue obtenida en la construcción de la biblioteca sustractiva

(figura 24).

Figura 22. Perfiles de expresión en tejido de pulpa de banano, de cuatro clonas seleccionadas positivas en el escrutinio diferencial. En cada carril se analizaron por northern blot, 20 μg de RNA total de los estadios PCI 1 a PCI 7 de maduración de pulpa de banano. Los transcritos analizados presentaron anotación con: una tiorredoxina (fmglMusaS6_e03), una proteína relacionada a patogénesis (fmglMusaS4_g03), una Inositol-3-fosfato sintasa (fmglMusaS8_d07), así como un transcrito sin anotación significativa (fmglMusaS5_h01).

103

Figura 23. Perfiles de expresión en tejido de pulpa, cáscara, hoja y raíz, de siete clonas seleccionadas positivas en el escrutinio diferencial. Se analizaron por northern blot, 20 μg de RNA total de cada una de las muestras. Los transcritos analizados presentaron anotación con: una orcinol O-metiltransferasa (fmglMusaS4_d04), una alcohol deshidrogenasa (fmglMusaS4_f09), una proteína similar a NAM (fmglMusaS8_g08), una ubiquitin protein ligasa (fmglMusaS4_e07), una corismato mutasa (fmglMusaS6_a09), así como dos transcritos sin anotación significativa (fmglMusaS4_b11 y fmglMusaS4_d06).

104

Figura 24. Perfiles de expresión en los siete estadios de maduración de pulpa y cáscara de banano, así como en tejido de hoja, nervadura, bráctea, órganos reproductivos, cormo y raíz, de siete clonas seleccionadas positivas en el escrutinio diferencial. Se analizaron por northern blot, 20 μg de RNA total de cada una de las muestras. Los transcritos analizados presentaron anotación con: Una gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (fmglMusaS7_g09), una tiorredoxina (fmglMusaS5_h10), una H+-ATPasa vacuolar (fmglMusaS7_e12), una proteína expresada (fmglMusaS7_g06), una glicosil hidrolasa de la familia de proteínas 17 (fmglMusaA2_h03), así como dos transcritos sin anotación significativa (fmglMusaS5_d10 y fmglMusaS3_h09).

105

En los northern blots de pulpa de este grupo, se observó que las clonas

anotadas con una proteína expresada de Arabidopsis (fmglMusaS7_g06), una

gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (fmglMusaS7_g09), una glicosil

hidrolasa de la familia de proteínas 17 (fmglMusaA2_h03), así como la clona

fmglMusaS5_d10, sin anotación significativa, presentan una muy ligera a

nula expresión en PCI 1, incrementándose hacia PCI 5 donde alcanzan su

máximo nivel, para luego decaer. En el perfil de expresión de la clona con

similitud a una tiorredoxina H del tipo 1 (fmglMusaS5_h10) se pudo apreciar

que la expresión se inicia en PCI 2 elevándose hasta alcanzar su máximo

nivel en PCI 6. La expresión de la clona anotada con una H+-ATPasa vacuolar

(fmglMusaS7_e12) es similar a la anterior con la única diferencia de que sí

hay expresión en PCI 1. La expresión de fmglMusaS3_h09 (transcrito sin

anotación significativa), presenta un patrón diferente, puesto que si bien

tiene una notoria expresión en PCI 1, esta decae nuevamente en PCI 2 y PCI

3 para volver a elevarse a partir de PCI 4 alcanzando nuevamente un pico

entre PCI 6 y PCI 7. De manera general, los perfiles de expresión de estas

siete clonas son bastante coincidentes entre pulpa y cáscara.

Con respecto al análisis northern blot en los otros seis tejidos, pudimos

observar que las clonas fmglMusaS5_d10 y fmglMusaS5_h10 tuvieron una

expresión tejido específico, presente únicamente en tejido de pulpa y cáscara

y sin ninguna expresión en los otros tejidos.

Las clonas fmglMusaS7_g09, fmglMusaS7_e12, fmglMusaS7_g06 y

fmglMusaS3_h09 no tuvieron una expresión tejido específica puesto que no

sólo se expresaron en pulpa y piel sino que también presentaron expresión en

los otros seis tejidos analizados. De éstas, la clona fmglMusaS7_g09 presentó

sus mayores niveles en bráctea y órganos reproductivos y su nivel de

expresión más bajo fue en cormo. La clona fmglMusaS7_e12 tuvo una muy

discreta expresión en hoja, nervadura y cormo y presentó una fuerte

expresión en bráctea, órganos reproductivos y raíz. Además, la clona

fmglMusaS7_g06 se expresó muy discretamente en los seis tejidos, con una

106

menor expresión en cormo y raíz. En cambio, la clona fmglMusaS3_h09

mostró una menor expresión en bráctea y órganos reproductivos y una

expresión un poco mayor pero muy discreta para los otros cuatro tejidos.

Por ultimo, los niveles de expresión de la clona fmglMusaA2_h03 en los seis

tejidos analizados, fueron muy bajos, estando ausentes en cormo y raíz.

107

V. DISCUSIÓN

V.1 Despliegue diferencial

Los oligos de la casa comercial “GenHunter” resultaron ser más eficientes que

los oligos usados por Verástegui-Peña (1999) para la obtención de fragmentos

diferenciales. Esto pudo deberse al tamaño del oligo arbitrario y el número de

bases empleadas en el extremo 3’ de los oligos anclados, puesto que el

incremento en la longitud del oligo arbitrario de 10 a 13 bases permite una

mejor y más eficiente amplificación por PCR y produce bandas más

uniformes y altamente reproducibles en el despliegue diferencial (Liang et al.,

1994). Además, el uso de una sola base en el extremo 3’ de los oligos

anclados que divide a los mRNAs en tan sólo tres grupos y no en seis, como

sucede cuando se usan dos bases, contribuye a reducir la redundancia

(Liang et al., 1994).

Las bandas diferenciales que se obtuvieron en este trabajo se encontraron en

un rango de 125 pb a 1000 pb. Este rango de tamaños se encuentra dentro

del óptimo esperado para los fragmentos diferenciales producto del uso de

esta técnica, puesto que Liang y Pardee (1992), quienes reportaron por

primera vez esta técnica, encontraron fragmentos diferenciales en un rango

de 100 pb a 500 pb. Además, trabajos más recientes reportan un rango de

100 pb a 600 pb (Kadyrzhanova et al., 1998) y de 400 pb a 1200 pb

(Mandaokar et al., 2003).

Los fragmentos diferenciales identificados se expresaron principalmente en

los estadios PCI 5 y PCI 7 (69%) y un 15% se expresó únicamente en PCI 1.

Esto concuerda con el hecho de que durante la maduración ocurren una

serie de cambios a nivel de expresión genética, donde algunos genes se

inducen, otros se reprimen y otros tantos permanecen constitutivos (Tucker y

Grierson, 1987). Además, se conoce que parámetros bioquímicos y

fisiológicos como la biosíntesis de etileno y la respiración climatérica,

108

estrechamente asociados a la maduración del banano, inducen alteraciones

en la expresión génica. Dichos parámetros, en bananos tratados con etileno,

exhiben sus picos máximos en PCI 2 y PCI 4, respectivamente (Clendennen y

May, 1997).

V.2 Construcción de la biblioteca sustractiva de cDNA

A la fecha, sólo existen dos trabajos reportados sobre estudios de expresión

diferencial de genes durante la maduración del banano y en éstos se

comparan únicamente los estadios tempranos de la maduración que

corresponden a PCI 1, PCI 2, y PCI 3 (Clendennen y May, 1997; Medina–

Suárez et al., 1997). No existen estudios reportados sobre los cambios en la

expresión de genes que ocurren después del pico de respiración climatérica.

Es por ello que la biblioteca sustractiva de cDNA fue hecha del estadio PCI 5

de maduración, con el propósito de conocer los genes que se expresan en

etapas avanzadas de la maduración y tratar de entender el papel que estarían

jugando en ella.

Las bibliotecas sustractivas de cDNA, en general, producen pequeñas clonas

con insertos que van desde 50 pb a 1000 pb aproximadamente (Yang et al.,

1999), como se muestra en un estudio de maíz bajo condiciones de sequía,

donde las clonas obtenidas de las bibliotecas sustractivas de cDNA

construidas, presentaron insertos en un rango de 100 pb a 750 pb (Hayano-

Kanashiro, 2004). Además, el número de clonas diferenciales que se

producen con esta técnica no es muy alto puesto que se trata de bibliotecas

sustractivas y no de bancos completos. Así por ejemplo, el número de clonas

obtenidas de las dos bibliotecas sustractivas construidas en el estudio

realizado en hojas de manzana de cultivares resistentes y susceptibles a

patógenos fue de 218 y 262 clonas, respectivamente (Degenhardt et al.,

2005). En el reporte sobre hojas y raíces de trigo híbrido donde se

construyeron cuatro bibliotecas sustractivas de cDNA, el número de clonas

109

obtenido varió de 151 a 291 (Yao et al., 2005). En otro trabajo, realizado

sobre estrés salino en arroz, el número varió de 230 a 463 clonas entre las

cuatro bibliotecas construidas (Shiozaki et al., 2005). La biblioteca

sustractiva de cDNA de pulpa de banano que fue construida en este trabajo,

produjo un total de 387 clonas positivas con insertos en un rango de 50 pb a

700 pb y un tamaño promedio de 400 pb, lo cual representa un adecuado

número de clonas y tamaño promedio de insertos, que concuerda con los

resultados obtenidos con esta técnica en otros trabajos.

V.3 Ensamblaje de ESTs

En el presente trabajo, 380 secuencias provenientes de la construcción de la

biblioteca sustractiva de cDNA, conjuntamente con 155 secuencias producto

del despliegue diferencial, fueron sometidas a un proceso de ensamblaje

usando el “CAP3 Sequence Assembly Program”, lo cual dio como resultado la

formación de 314 unigenes, cuatro de los cuales presentaron secuencias

provenientes de ambas técnicas. De manera general, los resultados del

ensamblaje fueron satisfactorios; sin embargo, un pequeño grupo de

secuencias no pudieron ser ensambladas correctamente en un primer

intento. Por ello los consensos de los contigs con expresión diferencial

confirmada y anotación para la misma proteína, fueron sometidos a un nuevo

proceso de ensamblaje y alineamiento, eliminando regiones de la secuencia

que presentaban errores. De esta manera, pudimos reagrupar 18 secuencias

consenso en siete contigs. Este tipo de errores en el ensamblaje de

secuencias han sido anteriormente reportados y algunos de los factores que

afectan la eficiencia en el ensamblaje son debidos a errores en la

secuenciación, a la presencia de secuencias contaminantes, entre otros

(Wang et al., 2004). El error detectado en el ensamblaje de las secuencias de

este trabajo fue del tipo I. Este tipo de error consiste en que ESTs

110

correspondientes al mismo transcrito no son ensamblados juntos (Wang et

al., 2004).

Como resultado del ensamblaje también se pudo observar que las dos

técnicas utilizadas para la identificación de los transcritos con expresión

diferencial presentaron muy poca coincidencia en la identificación de estos,

encontrando solo cuatro transcritos de expresión diferencial comunes en

ambas técnicas, lo cual indica que cada una de ellas estaría detectando

diferentes poblaciones de transcritos. Un estudio previo, comparando la

hibridación sustractiva con el despliegue diferencial, reportó también un

bajo entrecruzamiento entre los resultados obtenidos con cada técnica (Wan

et al., 1996).

V.4 Anotación y clasificación funcional

La comparación de secuencias nucloetídicas o proteicas del mismo o

diferentes organismos, es una poderosa herramienta que permite inferir

sobre la función de un nuevo gen secuenciado (Madden, 2002). El algoritmo

BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) es la herramienta usada con

mayor frecuencia para calcular la similitud entre secuencias y el valor

esperado (E) nos brinda un indicador de la significación estadística entre el

alineamiento de un par de secuencias; es así que, a menor valor esperado,

más significativa es la similitud encontrada (Madden, 2002). El máximo valor

esperado que se utilizó en este estudio para considerar significativa una

anotación fue ≤1E-06. Si bien este valor es definido a criterio del investigador,

una probabilidad umbral ≤1E-06 es comúnmente usada para asignar una

función a una secuencia de DNA que ha sido traducida a su correspondiente

secuencia de aminoácidos y comparada con la base de datos de proteínas no

redundantes del GenBank. Este mismo valor umbral de E ha sido utilizado

en el trabajo realizado con bibliotecas de arroz bajo condiciones de sequía

para la identificación de nuevos genes (Reddy et al., 2002). También, ha sido

111

usado en el análisis de la expresión diferencial en raíces de lupino blanco con

deficiencia de fósforo (Uhde-Stone et al., 2003) y en el aislamiento de ESTs de

hojas de cacao tratadas con inductores de respuesta de defensa (Verica et al.,

2004).

La anotación funcional de todos los unigenes obtenidos en el presente

estudio se realizó utilizando este mismo criterio de valor umbral de ≤1E-06,

con lo cual 205 unigenes pudieron ser anotados. La gran mayoría de los

unigenes anotados correspondió a aquellos contigs formados con secuencias

de la biblioteca sustractiva de cDNA, incluyendo los tres contigs que

presentaron secuencias de ambas técnicas (86.8%). El hecho de que solo el

27.3% de los unigenes con secuencias del despliegue diferencial haya podido

ser anotado, probablemente se debió a características propias de la técnica,

puesto que una de las deficiencias del despliegue diferencial es que

usualmente se clona la región no codificante del extremo 3’ del mensajero y

no necesariamente la región codificante del mismo (Wan et al., 1996).

La clasificación funcional de los unigenes anotados se hizo con el propósito

de identificar los procesos metabólicos en los cuales estarían participando los

unigenes obtenidos en este estudio, ayudándonos así a comprender su papel

en la maduración. Este tipo de estrategia también ha sido empleada con la

misma finalidad en otros estudios, como por ejemplo en el aislamiento y

análisis de genes inducidos en condiciones de estrés por sequía en semillas

de maíz (Zheng et al., 2004) y en la identificación de genes diferencialmente

expresados entre líneas isogénicas de maíz asociadas a resistencia al virus

mosaico de la caña de azúcar (Shi et al., 2005).

El total de los unigenes anotados fue distribuido en 14 categorías funcionales

siendo las más representadas las del metabolismo de proteínas (18%) y el

metabolismo de carbohidratos y energía (14%), seguidas por defensa

respuesta a estrés y detoxificación (9%), transducción de señales (8%) y

transporte (7%).

112

V.5 Escrutinio diferencial

Las técnicas de despliegue diferencial y construcción de bibliotecas

sustractivas de cDNA tienen el propósito de permitir la identificación y

selección de fragmentos de cDNA de expresión diferencial. Sin embargo,

ambas técnicas producen falsos positivos, señalando como diferenciales

fragmentos de cDNA que realmente no lo son. Es por ello que los ESTs

obtenidos por estas técnicas deben ser sometidos a un escrutinio para

verificar su expresión diferencial.

Teniendo en cuenta esto, se seleccionó un EST representativo de cada unigen

y se lo imprimió en los dos juegos de macroarreglos que se realizaron.

El criterio que se empleó para la selección de los 173 ESTs diferenciales fue

de un valor de relación de PCI 5/PCI 1 ≥ 1.45. En otros estudios con

macroarreglos se ha utilizado un criterio de selección de 2 veces mayor en la

relación entre las señales, como por ejemplo en el trabajo reportado sobre el

análisis de genes expresados de manera preferencial durante el desarrollo

temprano de fibras de algodón (Ji et al., 2003). Sin embargo, en las pruebas

que hicimos por northern blot pudimos confirmar que el criterio de selección

que se empleó en este trabajo fue adecuado, puesto que aún con este valor

menor a dos veces la intensidad de señal, los northern blot mostraron que

estos ESTs tuvieron efectivamente una expresión diferencial.

Por otro lado, la normalización de la intensidad de las señales entre las

diferentes membranas nos permitió comparar los resultados obtenidos en

cada una de ellas, con lo cual fue posible definir los diferentes patrones de

comportamiento observados entre los 173 ESTs de expresión diferencial

analizados en las etapas PCI 1, PCI 5 y PCI 7 de maduración.

113

V.6 Distribución funcional de los unigenes con expresión diferencial

confirmada

Entre los unigenes cuya expresión diferencial fue confirmada por medio de

los macroarreglos, las categorías funcionales más representadas fueron las

de metabolismo de carbohidratos y energía (12.7%) y defensa, respuesta a

estrés y detoxificación (11.6%), seguidas por las categorías funcionales de

transporte (10.4%) y metabolismo de proteínas (9.2%).

Dado que el almidón es un componente mayoritario del fruto de banano, es

de esperarse que los eventos más significativos durante la maduración de

este fruto estén relacionados con el proceso de degradación del almidón en

azúcar (Terra et al., 1983). Además, una característica de los frutos

climatéricos consiste en una rápida elevación de la respiración, lo cual se

refleja en un incrementado flujo de carbono a través de la vía glicolítica

(Beaudry et al., 1989). El hecho de que la muestra en estudio (PCI 5)

corresponda al estadio siguiente al pico climatérico de respiración (PCI 4),

incrementa la posibilidad de encontrar transcritos que codifiquen para

enzimas involucradas en la respiración. Por otra parte, en el trabajo de

Medina–Suárez et al., (1997), sobre la expresión diferencial de genes en frutos

de banano entre los estadios PCI 1 y PCI 2, tan sólo fue posible la detección

de un transcrito similar a una aconitasa, enzima que participa en el ciclo de

los ácidos tricarboxílicos. En cambio, en un estudio similar realizado por

Clendennen y May (1997), comparando los estadios de maduración de PCI 1

y PCI 3, no fue posible detectar ningún transcrito cuya función estuviera

relacionada con el proceso de respiración. En el presente estudio se logró la

identificación de 12 transcritos de expresión diferencial involucrados con

diferentes etapas del proceso de respiración y producción de energía,

anotados como: piruvato cinasa, proteína relacionada con una isoflavona

reductasa, frutosa 1,6-bifosfato aldolasa, enolasa 2, precursor mitocondrial

de una formato deshidrogenasa, isocitrato deshidrogenasa específica de

114

NADP, glucosa 6-fosfato deshidrogenasa plastídica y una proteína de la

familia de disulfuro oxidoreductasa dependiente de piridín nucleótidos.

La maduración puede imponer, por si misma, condiciones estresantes sobre

el fruto ya que se liberan muchos metabolitos potencialmente tóxicos, tales

como las especies reactivas de oxígeno, y las células tienen que enfrentar el

estrés oxidativo resultante (Brennan y Frenkel, 1977). Presumiblemente,

muchas de las enzimas relacionadas con estrés y detoxificación que se

inducen durante la maduración, podrían estar ayudando a la célula a tolerar

el estrés (Andrews et al., 2004). En este estudio se identificó la expresión

inducida en PCI 5, de 20 transcritos relacionados con funciones de defensa,

respuesta a estrés y detoxificación. De manera similar, genes que codifican

para enzimas implicadas en respuesta a estrés y detoxificación han sido

identificadas en otros frutos tales como pera japonesa (Itai et al., 2000), fresa

(Aharoni et al., 2002) y piña (Moyle et al., 2005)

El transporte intracelular de una amplia variedad de moléculas es un proceso

común en la vida de los organismos y, por ello, no es de extrañar que en este

estudio se hayan encontrado 18 transcritos relacionados a la categoría

funcional de transporte.

Asociado al metabolismo de proteínas se identificó la expresión inducida de

16 transcritos, los cuales estarían interviniendo en procesos que van desde la

biosíntesis, plegamiento, ensamblaje y estabilización, hasta la degradación

proteolítica. El proceso de la maduración de los frutos se encuentra

altamente regulado (Giovannoni, 2001); la transición metabólica que tiene

lugar durante la maduración es dictada por una batería de genes regulatorios

que inducen la expresión de otros genes (Brady, 1987) lo cual conduce a la

síntesis de proteínas de novo (Domínguez-Puigjaner et al., 1992). Las

proteínas recién sintetizadas están sujetas a procesos de plegamiento,

ensamblaje y estabilización, y dado que durante el proceso de maduración se

ha demostrado que continúa la síntesis de proteínas, es normal encontrar

115

también inducida la expresión de transcritos vinculados a los procesos que la

acompañan.

Además, la senescencia de órganos es un ejemplo de muerte celular

programada en plantas (Aharoni et al., 2002) y la maduración es considerada

como una forma especializada de senescencia (Seymour et al., 1993) en la

cual se han implicado enzimas hidrolíticas, tales como las cisteín proteasas y

el sistema de ubiquitinación y proteasoma, actuando como mediadores en la

transducción de señales y como efectores de la muerte celular programada

(Groover y Jones, 1999).

Asociados a la degradación de la pared celular, un proceso menos

representado pero no menos importante, en este estudio se encontró un

pequeño grupo de unigenes dentro de los cuales resalta la pectato liasa, el

segundo transcrito más abundante cuya expresión inducida en la

maduración de banano ha sido previamente reportada (Domínguez-Puigjaner

et al., 1997; Pua et al., 2001; Marín-Rodríguez et al., 2003).

Por otro lado, el citoesqueleto es la estructura que contribuye a la altamente

ordenada organización de la célula eucariótica, proporcionando el armazón

para la división celular y el tráfico de organelos y macromoléculas. Esta

estructura sirve además para regular importantes procesos celulares tales

como señalización, traducción y metabolismo (Choung et al., 2004). A nivel

de la pared celular se producen rearreglos en la arquitectura del citoesqueleto

para permitir la expansión y elongación celular (Yokota et al., 1998; Marcus

2002). En este estudio se identificó la expresión inducida de seis unigenes

relacionados con el citoesqueleto.

Asimismo, se encontraron otros unigenes con expresión diferencial

confirmada que fueron agrupados dentro de las categorías funcionales de

metabolismo en general, metabolismo de carbohidratos, metabolismo

secundario y metabolismo de lípidos, pero que estarían relacionados con la

producción del aroma del fruto. El metabolismo de lípidos no es una ruta

116

prioritaria en el desarrollo y maduración del fruto de banano puesto que el

contenido lipídico en pulpa de banano comprende alrededor del 1% del peso

seco de la misma y la fracción de lípidos que la conforman ha sido reportada

sin cambios sustanciales durante la maduración, encontrando estos cambios

confinados a la fracción de fosfolípidos con un incremento en la proporción

de ácido linolénico y una disminución en la proporción de ácido linoleico; sin

embargo, la importancia de los lípidos en la maduración del banano radica

en que se ha demostrado que el metabolismo de ácidos grasos es otra ruta

para la producción de compuestos volátiles (Marriott, 1980; Seymour, 1993).

Además, se ha comprobado que los ácidos grasos palmítico, linoleico y

linolénico se incrementan con el pico climatérico y disminuyen cuando el

aroma es emitido (Tressl y Drawert, 1973).

V.7 Análisis de la expresión diferencial a lo largo de la maduración de

los unigenes seleccionados

Los 18 ESTs analizados por northern blot confirmaron tener una expresión

diferencial a través de las diferentes etapas de la maduración. Si bien la

proporción entre las variaciones de las intensidades de señal producidas por

los northern blot no son iguales a las observadas en los macrarreglos, si

podemos decir que son, en general, muy parecidas y que las tendencias

observadas en los patrones de expresión son reproducibles. Además, la

expresión diferencial observada en los northern blot de las clonas

fmglMusaS6_a09, fmglMusaS6_e03 y fmglMusaS4_g03, las cuales presentan

los valores de límite inferior para la relación de PCI 5/PCI 1 (1.459, 1, 1.499 y

1.528 respectivamente), validan el criterio de selección empleado en los

macroarreglos y por el cual se identificaron 173 ESTs con expresión

diferencial.

Un unigen de la clase funcional de defensa, respuesta a estrés y

detoxificación, cuya anotación correspondió a una proteína relacionada a

117

patogénesis, fue analizado por northern blot. Los resultados del análisis de

expresión de este transcrito muestran claramente que su expresión se

incrementa conforme avanza la maduración alcanzando sus más altos niveles

en el PCI 7. Esto puede ser debido a que el proceso de maduración esta

estrechamente relacionado a condiciones de estrés y se ha visto que en

frutos, las condiciones de estrés, el desafío de patógenos, las heridas y la

exposición a etileno inducen la expresión de proteínas relacionadas a

patogénesis, sugiriéndose una asociación entre este tipo de proteínas y la

maduración (Clendennen y May, 1997).

El análisis de la expresión de un EST involucrado en el metabolismo de

degradación de proteínas, que estaría codificando para una ubiquitin protein

ligasa con afinidad a iones de zinc, mostró una fuerte inducción en pulpa del

estadio PCI 2 hacia adelante, alcanzando su máximo nivel en el PCI 6

aproximadamente. Asimismo, se lo observó expresado en tejido de raíz, mas

no en hoja. La proteólisis selectiva de proteínas ha sido reconocida como un

mecanismo de gran importancia para la regulación de diferentes procesos

celulares como por ejemplo la transducción de señales y la transcripción

(Zheng et al., 2002; Zhao et al., 2003).

También analizamos la expresión de un unigen de la clase funcional de

metabolismo de aminoácidos, correspondiente a una corismato mutasa y

otros dos de la clase funcional de metabolismo de carbohidratos y producción

de energía, con similitud a una alcohol deshidrogenasa y una orcinol O-

metiltransferasa. Estos tres unigenes estarían involucrados en la producción

del aroma durante la maduración, el cual es debido a la liberación de

compuestos volátiles característicos de cada fruto (Wang y Luca, 2005).

Además, se ha demostrado que la concentración de aminoácidos en el

banano se incrementa cerca del pico climatérico de respiración, mostrando

un segundo pico en etapas avanzadas del post-climaterio (Marriot, 1980).

Los aminoácidos aromáticos son precursores de la síntesis de metabolitos

secundarios involucrados en la producción del aroma. La corismato mutasa

118

es una enzima de la vía del shikimato que cataliza el primer paso en la

síntesis de tirosina y fenilalanina. El análisis northern blot del transcrito con

similitud a una corismato mutasa reveló que la expresión de este transcrito

se va elevando conforme avanza la maduración del fruto, y que su expresión

no es especifica de tejido por cuanto también se la pudo observar en tejidos

de raíz y muy ligeramente en hoja. Estos resultados son semejantes a los

encontrados para un cDNA de corismato mutasa analizado en raíces, hojas y

pulpa de tomate (Eberhard et al., 1996). Los resultados antes mencionados

refuerzan la hipótesis de que los niveles de corismato mutasa se incrementan

principalmente en órganos fotosintéticamente inactivos, donde su

disponibilidad para el metabolismo secundario es mayor (Görlach et al.,

1994).

El unigen similar a una alcohol deshidrogenasa, se expresó de manera

diferencial en pulpa y cáscara de banano y no se encontró expresión ni en

hoja ni en raíz. Investigaciones realizadas en manzana, fresa y tomate han

reportado la presencia de las alcohol deshidrogenasas en la síntesis de

compuestos del aroma y se ha sugerido que son reguladores en la síntesis de

ésteres durante la maduración (Speirs et al., 1998; Beekwilder et al., 2004;

Defilippi et al., 2005). Sin embargo, las alcohol deshidrogenasas han sido

también asociadas a procesos de detoxificación, catalizando la oxidación

reversible de alcoholes a aldehídos o cetonas en respuesta a hipoxia o anoxia

(Garabagi y Strommer, 2004; Peters y Frenkel, 2004).

También involucradas en la producción del aroma se encuentran las O-

metiltransferasas, enzimas que catalizan la transferencia de grupos metilo de

S-adenosil-L-metionina (SAM) a los grupos hidroxilo o carboxilo de una

variedad de sustratos (Scalliet et al., 2002). Las dos clonas diferenciales con

similitud a orcinol O-metiltransferasa, encontradas en este estudio, tuvieron

el mismo perfil de expresión en todos los tejidos analizados y fueron

específicos de tejido por cuanto no se observó expresión ni en hojas ni en

raíz. Además, un análisis más detallado de ellas demostró que correspondían

119

al mismo transcrito. Similar a lo encontrado en este trabajo, el transcrito de

una O-metiltransferasa de fresa, reportado como componente clave en la

síntesis del aroma, mostró una expresión inducida durante la maduración

del fruto y estuvo ausente en tejidos de raíz, pecíolo, hoja y flores (Wein et al.,

2002).

Por otro lado, el análisis northern blot de otros dos transcritos agrupados

dentro de la clase funcional de metabolismo de carbohidratos y producción

de energía con anotación para una gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa y

una inositol-3-fosfato sintasa, reveló que el máximo nivel de expresión de

éstas en pulpa se presentó en PCI 5 decayendo hacia PCI 7. La enzima

gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa está involucrada en la producción de

energía a través de la vía glicolítica y dado que el pico climatérico de

respiración ocurre en PCI 4, era de esperarse que la expresión de genes que

codifican para enzimas relacionadas con la respiración y producción de

energía, se encontrara inducida. Además, la expresión de este transcrito no

fue específica de pulpa y cáscara puesto que también se observó su

inducción en los otros sies tejidos analizados, presentando sus niveles más

altos en tejidos de bráctea y órganos reproductivos y su menor nivel en tejido

de cormo. Por otro lado, la enzima inositol-3-fosfato sintasa participa en la

formación de mio-inositol, compuesto que cumple diversas funciones en

plantas, tales como el transporte y almacenamiento de auxinas, la biosíntesis

de la pared celular y la producción de moléculas relacionadas con el estrés,

entre otras (Styer, 2000).

Correspondiente a la clase funcional de pared celular, se analizó la expresión

de un EST con similitud a una proteína de la familia 17 de las glicosil

hidrolasas. Estas enzimas catalizan la hidrólisis de las uniones glicolíticas

entre dos o más carbohidratos o entre carbohidratos y no carbohidratos. Las

glicosil hidrolasas de la familia 17 comprenden enzimas con actividad de

endo-1,3-β-glucosidasa, exo-1,3-glucanasa y β-1,3-glucan transglicosidasa

(Coutinho y Henrissat, 1999). Debido a su actividad, se las ha involucrado en

120

los mecanismos de desensamblaje de la pared celular. La expresión de este

transcrito en pulpa de banano alcanzó su máximo nivel en PCI 5,

observándose un patrón muy similar en los tejidos de cáscara analizados.

Además, su expresión no fue específica de fruto puesto que mostró expresión

en los otros seis tejidos analizados, aunque en niveles muy bajos y casi

imperceptibles para la cantidad de RNA (20 μg) analizado por muestra

(Nogueira et al., 2003).

Tres unigenes asociados a mecanismos de transporte también fueron

analizados por northern blot. Uno de ellos presentó similitud con la

subunidad catalítica de una H+-ATPasa vacuolar y los otros dos con una

tiorredoxina y una tiorredoxina H del tipo 1, respectivamente.

El unigen con similitud a la H+-ATPasa vacuolar mostró patrones de

expresión similares entre pulpa y cáscara, alcanzando sus máximos niveles

de expresión entre los estadios PCI 5 y PCI 6. Asimismo, se observó su

expresión en los otros seis tejidos analizados. Esto era de esperarse por el

tipo de función que estaría cumpliendo. Estudios sobre las H+-ATPasas

vacuolares en el crecimiento y desarrollo de las plantas han revelado que

estas enzimas pertenecen a una familia altamente conservada de bombas de

protones dependientes de ATP, responsable de la acidificación de

componentes endomembranales en células eucarióticas y del transporte de

solutos por hidrólisis de ATP (Schumacher et al., 1999).

Los unigenes con similitud a tiorredoxina mostraron patrones de expresión

diferentes con un nivel de expresión máximo entre PCI 4 y PCI 5 para el caso

del unigen similar a tiorredoxina, y en PCI 6 para el unigen con similitud a la

tiorredoxina H del tipo 1. Además, en el análisis de ensamblaje y

alineamiento manual no pudieron ser ensamblados entre sí, por lo que

estarían correspondiendo a diferentes tipos de tiorredoxinas. Las

tiorredoxinas, en general, actúan sobre puentes disulfuro por medio de un

mecanismo redox (Besse y Buchanan, 1997). En las células vegetales existen

diferentes isoformas de tiorredoxinas; en el genoma de Arabidopsis han sido

121

identificadas ocho diferentes isoformas de tiorredoxinas las cuales presentan

diferentes niveles y tipos de expresión y en chícharo se encontraron

resultados similares; por ello, se ha sugerido que las diferentes isoformas de

tiorredoxinas estarían cumpliendo funciones específicas dentro de la célula

(Montrichard et al., 2003).

Relacionado a la clase funcional de transcripción se analizó la expresión de la

clona cuya anotación correspondió con una proteína de banano similar a

NAM (No Apical Meristem). La expresión de este unigen estuvo presente en

pulpa y cáscara de banano y muy discretamente en tejidos de raíz. Las

proteínas NAM juegan un papel importante en procesos de crecimiento,

desarrollo y senescencia (Souer et al., 1996). Estudios de éstas proteínas en

Arabidopsis han sugerido un posible papel a nivel de control transcripcional

(Duval et al., 2002). La presencia de estas proteínas también ha sido

identificada en estudios de expresión diferencial realizados en caña de azúcar

en respuesta a bajas temperaturas.

De igual forma, se realizó el análisis northern blot de un unigen de la clase

funcional de proteínas desconocidas o no clasificadas el cual reportó

similitud con una proteína expresada de Arabidopsis, de función

desconocida. Este unigen no tuvo una expresión específica de tejido, puesto

que se lo observó expresado en todos los tejidos analizados, aunque en

diferentes niveles, siendo su nivel máximo de expresión en pulpa en PCI 5.

Por último, también se analizó la expresión de cinco clonas agrupadas dentro

de la clase funcional de no anotados (fmglMusaS4_d06, fmglMusaS3_h09,

fmglMusaS5_h01, fmglMusaS5_d10 y fmglMusaS4_b11). Dado que el perfil

de expresión de la clona fmglMusaS4_d06 fue idéntico al observado para la

orcinol O-metiltransferasa (fmglMusaS4_d04), se realizó un análisis más

detallado de las secuencias de ambas clonas encontrando que correspondían

al mismo transcrito. Los otros cuatro ESTs de esta clase funcional, que no

presentaron similitud significativa con ninguna proteína o secuencia

122

nucleotídica previamente reportada podrían estar codificando para genes

nuevos.

123

VI. CONCLUSIONES

• Se identificó la expresión inducida de 160 genes durante la maduración de

la pulpa del fruto de banano, los cuales incrementaron su expresión con

respecto a la observada en el estadio PCI 1.

• Sólo 4 contigs presentaron ESTs provenientes del despliegue diferencial y

de la construcción de la biblioteca sustractiva de cDNA, lo cual indica la

baja superposición entre los dos métodos para identificar el mismo grupo

de transcritos, y sugiere la presencia de otros transcritos de expresión

diferencial que no han sido identificados en este estudio.

• Del total de genes diferenciales obtenidos por DD y SSH, un porcentaje

considerable (71%) de los ESTs producto del despliegue diferencial no

pudo ser anotado, frente a un 29.2% de ESTs de la biblioteca sustractiva

de cDNA que tampoco pudo ser anotado.

• Los contigs de expresión diferencial confirmada mostraron una similitud

significativa con genes involucrados en metabolismo de carbohidratos y

energía, defensa, respuesta a estrés y detoxificación, transporte,

metabolismo de proteínas, metabolismo de aminoácidos, transcripción,

citoesqueleto y ciclo celular (regulación y control), pared celular,

transducción de señales, metabolismo, metabolismo secundario,

metabolismo de lípidos y metabolismo de nucleótidos.

• Las clases funcionales con mayor número de genes diferenciales

confirmados por macroarreglos correspondieron al metabolismo de

carbohidratos y producción de energía (12.7%), defensa, respuesta a

estrés y detoxificación (11.6%) y transporte (10.4%). Sin embargo, el grupo

más numeroso correspondió a los transcritos sin anotación funcional

significativa (21.4%).

• Un grupo considerable de contigs con expresión diferencial (20.8%) no

presentó similitud significativa con ninguna secuencia reportada en la

124

base de datos de polipéptidos no redundantes ni en la base de datos de

secuencias nucleotídicas.

• Los 14 transcritos analizados por northern blot en tejido de pulpa y

cáscara de banano presentaron una expresión similar en ambos tejidos,

durante la maduración.

• Los transcritos con anotación para una tiorredoxina H tipo 1, una alcohol

deshidrogenasa, una orcinol O-metiltransferasa y dos transcritos sin

anotación significativa (fmglMusaS4_b11 y fmglMusaS5_d10) presentaron

expresión específica en pulpa y cáscara de banano.

125

VII. PERSPECTIVAS

• Continuar con los análisis de expresión de los ESTs diferenciales por

grupos funcionales, con el propósito de entender mejor el papel que

estarían jugando durante la maduración.

• Realizar análisis bioinformáticos más detallados con las secuencias de

los contigs expresados diferencialmente, sobre todo con aquellos que

no pudieron ser anotados significativamente en ninguna de las bases

de datos consultadas.

• Construir una biblioteca sustractiva de cDNA de PCI 1 para identificar

también los genes que se reprimen durante la maduración del fruto de

banano de manera que nos brinde un panorama más completo de lo

que esta sucediendo a nivel molecular durante la maduración.

• Aislar los transcritos completos para los genes diferenciales de mayor

interés con el propósito de realizar una caracterización molecular

detallada de los mismos.

• Identificar, en el fruto, las proteínas correspondientes a los genes de

interés y realizar un análisis funcional de las mismas, con el fin de

comprender mejor la actividad que realizan durante la maduración.

• Ampliar la colección de ESTs relacionados al desarrollo y la

maduración del fruto de banano y realizar estudios con microarreglos

para obtener una mayor información de la expresión de los genes

involucrados en estos procesos.

• Investigar las similitudes o diferencias de ciertos genes de interés

expresados en este modelo climatérico (banano), al compararlos con

un modelo no climatérico, para ampliar así nuestro conocimiento sobre

las relaciones entre ambos modelos de maduración de frutos.

126

VII. REFERENCIAS:

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ANEXOS

ANEXO 1

Método para aislamiento de RNA total de tejido de fruto de banano

(Liu JJ, Goh CJ, Loh CS, Liu P Pua EC. 1998) Buffer de extracción:

• 100 mM Tris HCl (pH 7.5)

• 500 mM NaCl

• 25 mM EDTA (pH 8.0)

• 1.5% SDS

• 2% PVP 40

• 0.7% 2-mercaptoetanol

1. Pulverizar 4 g. de tejido en nitrógeno líquido.

2. Transferir el tejido pulverizado a un tubo de centrífuga de 50 ml,

conteniendo 20 ml. de buffer de extracción. Mezclar por “vortex”.

3. Incubar por 10 min. a temperatura ambiente, agitando

ocasionalmente.

4. Centrifugar a 3.7 K por 15 min. a temperatura ambiente. para eliminar

los restos celulares insolubles.

5. Recuperar el sobrenadante en otro tubo y adicionar 1/3 de volumen de

AcK 5M (pH 6.0) previamente enfriado (0°C). Mezclar bien y colocar por

30 min. en hielo.

6. Centrifugar a 10 K por 15 min. a 4°C.

7. Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo y agregar un volumen igual

de fenol/cloroformo/isoamil alcohol (25:24:1). Mezclar por “vortex”.

8. Centrifugar a 10 K por 10 min. a 4°C (se requieren 2 extracciones con

fenol/cloroformo/IAA para una interfase limpia).

9. Extraer la fase acuosa y agregar un volumen igual de

cloroformo/isoamil alcohol (24:1). Mezclar por “vortex” y centrifugar a

10 K por 10 min. a 4°C.

- 147 -

10. Transferir la fase acuosa a un tubo nuevo y adicionar de 2 a 3

volúmenes de etanol absoluto, colocar por 30 min. a -70°C para

precipitar el RNA.

11. Centrifugar a 10 K por 15 min. a 4°C para empastillar el RNA.

12. Resuspender la pastilla en agua DEPC.

13. Repetir la extracción con fenol/cloroformo/IAA y cloroformo/IAA y

precipitar con etanol (pasos 10 a 12).

14. Lavar la pastilla con etanol al 70%.

15. Dejar secar la pastilla y luego resuspender en agua DEPC.

16. Almacenar a -70°C.

- 148 -

ANEXO 2

Método simple y eficiente para aislamiento de RNA total de árboles de pino

(Chang S, Puryear J, Cairney J. 1993)

Buffer de extracción:

• 2% CTAB

• 2% PVP 30

• 100 mM Tris-HCl (pH 8.0)

• 25 mM EDTA (pH 8.0)

• 2.0 M NaCl

• 0.5 g/L espermidina

SSTE:

• 1.0 M NaCl

• 0.5% SDS

• 10mM Tris-HCl (pH 8.0)

• 1mM EDTA (pH 8.0)

1. Pulverizar 2 a 3 g de tejido en nitrógeno líquido y colocarlo en un tubo

de centrífuga de 50 ml.

2. Calentar el buffer de extracción, adicionar 15 ml del buffer y 300 μl de

β-mercaptoetanol a cada muestra y mezclar por inversión.

3. Realizar 2 extracciones con un volumen igual de cloroformo:alcohol

isoamílico (24:1), mezclar por “vortex” y centrifugar a 10,000 rpm a

temperatura ambiente.

4. Adicionar ¼ de volumen de 10 M de LiCl al sobrenadante y mezclar.

Dejar precipitar el RNA toda la noche a 4°C.

5. Centrifugar a 10,000 rpm por 20 min para empastillar el RNA.

- 149 -

6. Disolver la pastilla en 500 μl de SSTE y transferir a un tubo

eppendorff.

7. Realizar 2 extracciones más con un volumen igual de

cloroformo:alcohol isoamílico (24:1), mezclar por “vortex” y centrifugar.

8. Adicionar dos volúmenes de etanol al sobrenadante y dejar precipitar a

-70°C por 1 h.

9. Centrifugar por 20 min para empastillar el RNA, decantar y dejar secar

la pastilla.

10. Resuspender la pastilla en agua DEPC.

- 150 -

ANEXO 3

Preparación de soluciones Solución de acrilamida al 40%: Para preparar 1 litro de solución de acrilamida al 40%, pesar:

Acrilamida 320 gr.

Bisacrilamida 20 gr.

Resina AG-501-X8(Biorad) 20 gr.

Disolver en 500 ml de agua destilada y dejar agitando la resina por

aproximadamente una hora a temperatura ambiente. Filtrar la solución al

vacío (filtro de 1.2 μ) y aforar el volumen a 1 litro.

Solución de poliacrilamida 6%, Urea 8 M: Disolver 480.5 gr de urea en 350 ml de agua destilada desionizada. Filtrar la

solución al vacío (filtro de 1.2 μ) y agregar 100 ml de TBE 10X y 150 ml de la

solución de acrilamida al 40%. Aforar a 1 litro y guardar en frasco oscuro.

Buffer TBE 10X: Trisbase 108 gr

Ac. Bórico 55 gr

EDTA 1M pH 8 20 ml

Disolver en un volumen suficiente de agua destilada (aproximadamente 300 a

500 ml). Filtrar la solución al vacío (filtro de 1.2 μ) y aforar el volumen a 1

litro.

- 151 -

ANEXO 4

Ensamblado de secuencias y alineamientos manuales

Pectato liasa 2: Nombre de secuencias consenso comparadas: fC129_15Mar2005_3

fC136_15Mar2005_2 fC24_15Mar2005_12

Reporte del ensamblaje y alineamiento: Number of segment pairs = 12; number of pairwise comparisons = 4 '+' means given segment; '-' means reverse complement Overlaps Containments No. of Constraints Supporting Overlap ******************* Contig 1 ******************** pectate+ fC129_15Mar2005_3- is in pectate+ fC136_15Mar2005_2- fC24_15Mar2005_12- is in fC136_15Mar2005_2- DETAILED DISPLAY OF CONTIGS ******************* Contig 1 ******************** . : . : . : . : . : . : pectate+ atgacggcgggtttaagatggattcctcctctgcttcttcttcttctgggcttcctgctg ____________________________________________________________ consensus ATGACGGCGGGTTTAAGATGGATTCCTCCTCTGCTTCTTCTTCTTCTGGGCTTCCTGCTG . : . : . : . : . : . : pectate+ gttttgaacggaagtcgggggtggattggaagcgagcggtcctctggctcgaggaatggc ____________________________________________________________ consensus GTTTTGAACGGAAGTCGGGGGTGGATTGGAAGCGAGCGGTCCTCTGGCTCGAGGAATGGC . : . : . : . : . : . : pectate+ ggagcatcgcggaggagcttgagagaggcctccgcgaacgcgaccagcgccgatgcttcc ____________________________________________________________ consensus GGAGCATCGCGGAGGAGCTTGAGAGAGGCCTCCGCGAACGCGACCAGCGCCGATGCTTCC . : . : . : . : . : . : pectate+ ttggaagagagggctgtaaccagggcagcagaagccgcagtcgacgaccccgaggaggtt ____________________________________________________________ consensus TTGGAAGAGAGGGCTGTAACCAGGGCAGCAGAAGCCGCAGTCGACGACCCCGAGGAGGTT . : . : . : . : . : . : pectate+ gcttcgacggtcctgacgaccataatcaacagcacggctcgcagatctcttggttatctg ____________________________________________________________ consensus GCTTCGACGGTCCTGACGACCATAATCAACAGCACGGCTCGCAGATCTCTTGGTTATCTG

- 152 -

. : . : . : . : . : . : pectate+ tcgtgcggttcaggcaacccgatcgacgactgctggcggtgcgaccccgattggcatgtc ____________________________________________________________ consensus TCGTGCGGTTCAGGCAACCCGATCGACGACTGCTGGCGGTGCGACCCCGATTGGCATGTC . : . : . : . : . : . : pectate+ aacagaaaaaagctcgctgactgcggcattggctttggccgcaacgcgataggtggccgc ____________________________________________________________ consensus AACAGAAAAAAGCTCGCTGACTGCGGCATTGGCTTTGGCCGCAACGCGATAGGTGGCCGC . : . : . : . : . : . : pectate+ gacggggagttgtacgttgtgacagactccggggacgatgatcccgtgaatcctcgcccg ____________________________________________________________ consensus GACGGGGAGTTGTACGTTGTGACAGACTCCGGGGACGATGATCCCGTGAATCCTCGCCCG . : . : . : . : . : . : pectate+ ggaacacttagatacgccgtcatccaggacgtgcccctctggatcacctttaaacacgac ____________________________________________________________ consensus GGAACACTTAGATACGCCGTCATCCAGGACGTGCCCCTCTGGATCACCTTTAAACACGAC . : . : . : . : . : . : pectate+ atggagatcacgctcaaggaggaactcattatgaacagctttaagacgatcgatggacgc ____________________________________________________________ consensus ATGGAGATCACGCTCAAGGAGGAACTCATTATGAACAGCTTTAAGACGATCGATGGACGC . : . : . : . : . : . : pectate+ ggtgtcaacgtccacattgccaatggcgcctgcatcaccatccagtacatcaccaacgtc fC129_15Mar2005_3- GTACATCACCAACGTC ____________________________________________________________ consensus GGTGTCAACGTCCACATTGCCAATGGCGCCTGCATCACCATCCAGTACATCACCAACGTC . : . : . : . : . : . : pectate+ atcatccacggcctccacatccacgactgcaagcccaccgggaatgccatggtccgcagc fC129_15Mar2005_3- ATCATCCATGGCCTCCACATCCACGACTGCAAGCCCACCGGGAATGCCATGGTCCGCAGC ____________________________________________________________ consensus ATCATCCACGGCCTCCACATCCACGACTGCAAGCCCACCGGGAATGCCATGGTCCGCAGC . : . : . : . : . : . : pectate+ tctccttctcactatggatggagaaccatggctgatggggatgccgtttccattttcggc fC129_15Mar2005_3- TCTCCTTCTCACTATGGATGGAGAACCATGGCTGATGGGGATGCCGTTTCCATTTTCGGC ____________________________________________________________ consensus TCTCCTTCTCACTATGGATGGAGAACCATGGCTGATGGGGATGCCGTTTCCATTTTCGGC . : . : . : . : . : . : pectate+ tccagccacatttgggtggaccactgctctctgtccaactgcgccgatggacttgtcgat fC129_15Mar2005_3- TCCAGCCACATTTGGGTGGACCACTGCTCTCTGTCCAACTGCGCCGATGGACTTGTCGAT ____________________________________________________________ consensus TCCAGCCACATTTGGGTGGACCACTGCTCTCTGTCCAACTGCGCCGATGGACTTGTCGAT . : . : . : . : . : . : pectate+ gccgtcatgggctccactgccattacggtctccaacaattacttcacccaccacaatgag fC129_15Mar2005_3- GCCGTCATGGGCTCCACTGCCATTACGGTCTCCAACAATTACTTCACCCACCACAATGAG ____________________________________________________________ consensus GCCGTCATGGGCTCCACTGCCATTACGGTCTCCAACAATTACTTCACCCACCACAATGAG

- 153 -

. : . : . : . : . : . : pectate+ gtcatgcttttgggacacactgattcttatgcaagggacagcatcatgcaagtaacgatc fC129_15Mar2005_3- GTCATGCTTTTGGGACACACTGATTCTTATGCAAGGGACAGCATCATGCAAGTAACGATC ____________________________________________________________ consensus GTCATGCTTTTGGGACACACTGATTCTTATGCAAGGGACAGCATCATGCAAGTAACGATC . : . : . : . : . : . : pectate+ gcatttaatcattttggtgaaggcctgattcagagaatgcccaggtgcaggcatggctac fC129_15Mar2005_3- GCATTTAACCATTTTGGTGAAGGTCTGATTCAGAGAATGCCCAGGTGCAGGCATGGCTAC ____________________________________________________________ consensus GCATTTAACCATTTTGGTGAAGGCCTGATTCAGAGAATGCCCAGGTGCAGGCATGGCTAC . : . : . : . : . : . : pectate+ ttccacgtggtaaacaatgactacacgcactgggagatgtacgccattggcggtagcgcg fC129_15Mar2005_3- TTCCACGTGGTAAACAATGACTACACGCACTGGGAGAT fC136_15Mar2005_2- GTACGCCATTGGCGGTAGCGCG fC24_15Mar2005_12- GTACGCCATTGGCGGGAGCGCG ____________________________________________________________ consensus TTCCACGTGGTAAACAATGACTACACGCACTGGGAGATGTACGCCATTGGCGGTAGCGCG . : . : . : . : . : . : pectate+ aatccaacgatcaacagtcaaggcaaccgataccttgcgccgaccaatccatttgcaaag fC136_15Mar2005_2- AATCCAACGATCAACAGTCAAGGCAACCGATACCTTGCGCCGACCAATCCATTTGCAAAG fC24_15Mar2005_12- AATCCAACGATCAACAGTCAAGGCAACCGATACCTTGCGCCGACCAATCCATTTGCAAAG ____________________________________________________________ consensus AATCCAACGATCAACAGTCAAGGCAACCGATACCTTGCGCCGACCAATCCATTTGCAAAG . : . : . : . : . : . : pectate+ gaggtaacaaaaagggtggacacagatcaaagcacgtggaagaactggaattggaggtcg fC136_15Mar2005_2- GAGGTAACAAAAAGGGTGGACACAGATCAAAGCACGTGGAAGAACTGGAATTGGAGGTCG fC24_15Mar2005_12- GAGGTAACAAAAAGAGTGGACACAGATCAAAGCACGTGGAAGAACTGGAATTGGAGGTCG ____________________________________________________________ consensus GAGGTAACAAAAAGGGTGGACACAGATCAAAGCACGTGGAAGAACTGGAATTGGAGGTCG . : . : . : . : . : . : pectate+ gagggtgacctgcttctgaatggtgcttttttcaccccttccggtgcaggggcttcagcc fC136_15Mar2005_2- GAGGGTGACCTGCTTCTGAATGGTGCTTTTTTCACCCCTTCCGGTGCAGGGGCTTCAGCC fC24_15Mar2005_12- GAGGGTGACCTGCTTCTGAATGGTGCTTTTTTCACCCCTTCCGGTGCAGGGGTTTCAGCC ____________________________________________________________ consensus GAGGGTGACCTGCTTCTGAATGGTGCTTTTTTCACCCCTTCCGGTGCAGGGGCTTCAGCC . : . : . : . : . : . : pectate+ agctacgcacgggcctccagctttggggccaagccctcttccttggtcgacacactgact fC136_15Mar2005_2- AGCTACGCACGGGCCTCCAGCTTTGGGGCCAAGCCCTCTTCCTTGGTTGACACACTGACT fC24_15Mar2005_12- AGCTACGCACGGGCCTCCAGCTTTGGGGCCAAGCCCTCTTTCTTGGTTGACACACTGACT ____________________________________________________________ consensus AGCTACGCACGGGCCTCCAGCTTTGGGGCCAAGCCCTCTTCCTTGGTTGACACACTGACT . : . : . : . : . : . : pectate+ tctgatgctggggtcctgtcttgccaagtcggcactcgatgttaa fC136_15Mar2005_2- TCTGATGCTGGGGTCCTGTCTTGCCAAGTCGGCACTCGATGTTAACGTAATGCCAAGTGG fC24_15Mar2005_12- TCTGATGCTGGGGTCCTGTCTTGCCAAGTCGGCACTCGATGTTAACGTAATGCCAAGTAG ____________________________________________________________ consensus TCTGATGCTGGGGTCCTGTCTTGCCAAGTCGGCACTCGATGTTAACGTAATGCCAAGTAG

- 154 -

. : . : . : . : . : . : fC136_15Mar2005_2- CAGAACGCCACAACCCGAAGGATGGGAAATC fC24_15Mar2005_12- CAGAACGCTACAACCCGAAGGATGGGAAAT ____________________________________________________________ consensus CAGAACGCCACAACCCGAAGGATGGGAAATC

- 155 -

Disulfuro oxidoreductasa dependiente de piridín nucleótidos: Nombre de secuencias consenso comparadas: fS1849_15Mar2005_1

fS1884_15Mar2005_1 fC135_15Mar2005_4

Reporte del ensamblaje y alineamiento: Number of segment pairs = 12; number of pairwise comparisons = 1 '+' means given segment; '-' means reverse complement Overlaps Containments No. of Constraints Supporting Overlap ******************* Contig 1 ******************** fS1849_15Mar2005_1+ fS1884_15Mar2005_1- is in fS1849_15Mar2005_1+ DETAILED DISPLAY OF CONTIGS ******************* Contig 1 ******************** . : . : . : . : . : . : fS1849_15Mar2005_1+AAACAGCTCTTATGAGCTCATCAACATGATCTATATATATAAATAGTTCTGACACCGGCA ____________________________________________________________ consensus AAACAGCTCTTATGAGCTCATCAACATGATCTATATATATAAATAGTTCTGACACCGGCA . : . : . : . : . : . : fS1849_15Mar2005_1+GAAACCCCAACAAACATGCAGAACACAACAAGGAGGCAACACAAACACATCATCATCTCT ____________________________________________________________ consensus GAAACCCCAACAAACATGCAGAACACAACAAGGAGGCAACACAAACACATCATCATCTCT . : . : . : . : . : . : fS1849_15Mar2005_1+CAGATTAGGCCATCAGGAGTCGAGACCCAGATTCTTCCTAGTCTTTTCCACAAACAGGTC fS1884_15Mar2005_1- CATCAGGAGTCGAGACCCAGATTCTTCCTAGTCTTTTCCACAAACAGGTC ____________________________________________________________ consensus CAGATTAGGCCATCAGGAGTCGAGACCCAGATTCTTCCTAGTCTTTTCCACAAACAGGTC . : . : . : . : . : . : fS1849_15Mar2005_1+CTTGGGCTTGATCCGCCCCGGCAGGCACCCGATCACCGTGCCGAACGGGAACTGCCCCAC fS1884_15Mar2005_1-CTTGGACTTGATCCGCCCCGGCAGGCACCCGATCACCGTGCCGAACGGGAACTGCCCCAC ____________________________________________________________ consensus CTTGGACTTGATCCGCCCCGGCAGGCACCCGATCACCGTGCCGAACGGGAACTGCCCCAC . : . : . : . : . : . : fS1849_15Mar2005_1+GCCTTCTTTTCGACCCAGAGACATAATGGTCGTGGCAGAAGCGGCCTTATATTTCACCAG fS1884_15Mar2005_1-GCCTTCTTCTCGACCCAGAGACACAATGGTCGTGGCAGAAGCGGCCTTGTACTTCACCAG ____________________________________________________________ consensus GCCTTCTTCTCGACCCAGAGACACAATGGTCGTGGCAGAAGCGGCCTTATACTTCACCAG . : . : . : . : . : . : fS1849_15Mar2005_1+CTTGCTCTCCTTCCCTCCCTTCATCAGCAGCTGCAAGTTCTTCGACACCACCGCAGAATG fS1884_15Mar2005_1-CTTGCTCTCCTTCCCTCCCTTCATCAGCAGCTGCAAGTTCTTCGACACCACCGCAGAATG ____________________________________________________________ consensus CTTGCTCTCCTTCCCTCCCTTCATCAGCAGCTGCAAGTTCTTCGACACCACCGCAGAATG

- 156 -

. : . : . : . : . : . : fS1849_15Mar2005_1+TTTTTGAGCAATGTATCCTTCTTTGATCTCAGGAACATCGGTGATGTCTCCAATGGCAAA fS1884_15Mar2005_1-TTTTTGAGCAATGTATCCTTCTTTGATCTCAGGAACATCGGTGATGTCTCCAATGGCAAA ____________________________________________________________ consensus TTTTTGAGCAATGTATCCTTCTTTGATCTCAGGAACATCGGTGATGTCTCCAATGGCAAA . : . : . : . : . : . : fS1849_15Mar2005_1+GATGTTGCTTCGACCTCTGACCCTGAAGCACTCATCAACCATCAACCTGCCTTTCTCGTT fS1884_15Mar2005_1-GATGTTGCTTCGACCTCTGACCCTGAAGCACTCATCAACCATCAACCTGCCTTTCTCGTT ____________________________________________________________ consensus GATGTTGCTTCGACCTCTGACCCTGAAGCACTCATCAACCATCAACCTGCCTTTCTCGTT . : . : . : . : . : . : fS1849_15Mar2005_1+CAAGCAATCCTTGAGAACAGAATTCTGAAGCCATGATGATCCCAGTGGCTTGCCAATACA fS1884_15Mar2005_1-CAAGCAATCCTTGAGAACAGAATTCTGAAGCCATGATGATCCCGGTGGCTTGCCAATACA ____________________________________________________________ consensus CAAGCAATCCTTGAGAACAGAATTCTGAAGCCATGATGATCCCAGTGGCTTGCCAATACA . : . : . : . : . : . : fS1849_15Mar2005_1+GACAAAATGGCAATCAAG fS1884_15Mar2005_1- GACAAAATGGCAATC ____________________________________________________________ consensus GACAAAATGGCAATCAAG

- 157 -

Tiorredoxina: Nombre de secuencias consenso comparadas: fC150_15Mar2005_2

fC39_15Mar2005_3 fC131_15Mar2005_8

Reporte del ensamblaje y alineamiento: Number of segment pairs = 12; number of pairwise comparisons = 1 '+' means given segment; '-' means reverse complement Overlaps Containments No. of Constraints Supporting Overlap ******************* Contig 1 ******************** fC39_15Mar2005_3+ fC131_15Mar2005_8- is in fC39_15Mar2005_3+ DETAILED DISPLAY OF CONTIGS ******************* Contig 1 ******************** . : . : . : . : . : . : fC39_15Mar2005_3+ TCCACTTAATTGAGCATATCGAGTTCTGTCAAACTAAGTCTATCAAACTTATGGTGGTGA ____________________________________________________________ consensus TCCACTTAATTGAGCATATCGAGTTCTGTCAAACTAAGTCTATCAAACTTATGGTGGTGA . : . : . : . : . : . : fC39_15Mar2005_3+ AGCTGATGATTCCAAGAGATCAGGTGGTCGTAGATTTCACTTCTTCATGGTGTGGTCCTT fC131_15Mar2005_8- GGTGGTCGTAGATTTCACTTCTTCATGGTGTGGTCCTT ____________________________________________________________ consensus AGCTGATGATTCCAAGAGATCAGGTGGTCGTAGATTTCACTTCTTCATGGTGTGGTCCTT . : . : . : . : . : . : fC39_15Mar2005_3+ GCCGTATGATTGCCCCGTTCTTCGCTGAGCTAGCTAATAAGTTCACCGATGCCATCTTCC fC131_15Mar2005_8- GCCGCTTGATTGCCCCGTTCTTCGCTGAGCTAGCTAATAAGTTCACCGATGCCATCTTCC ____________________________________________________________ consensus GCCGCATGATTGCCCCGTTCTTCGCTGAGCTAGCTAATAAGTTCACCGATGCCATCTTCC . : . : . : . : . : . : fC39_15Mar2005_3+ TAAGGGTGGACGTCAATGAGCTGAAGAGGGTTGCCCTGGACTGTGCGATCGAGACACTGC fC131_15Mar2005_8- TAAGGGTGGACGTCAATGAGCTGAAGAGGGTTGCCCTGGACTGTGCGATCGAGACACTGC ____________________________________________________________ consensus TAAGGGTGGACGTCAATGAGCTGAAGAGGGTTGCCCTGGACTGTGCGATCGAGACACTGC . : . : . : . : . : . : fC39_15Mar2005_3+ CAACCTTCATCTTCCTGAGGCAGGGAAACATTGTGGATCGCGTTGTTGGTGCTCGTAAAG fC131_15Mar2005_8- CAACCTTCATCTTCCTGAGGCAGGGAAACATTGTGGATCGCGTTGTTGGTGCTCGCAAAG ____________________________________________________________ consensus CAACCTTCATCTTCCTGAGGCAGGGAAACATTGTGGATCGCGTTGTTGGTGCTCGCAAAG . : . : . : . : . : . : fC39_15Mar2005_3+ ATCTGTTGCCGAAGAAGATTGAGCTCCACATGAGGAACTGAATGCTCGCTTGCAGTATTA fC131_15Mar2005_8- ATCTGTTGCCTAAGAAGATTGAGCTCCACATGAGGAACTGAATGCTCGCTTGCAGTATTG ____________________________________________________________ consensus ATCTGTTGCCGAAGAAGATTGAGCTCCACATGAGGAACTGAATGCTCGCTTGCAGTATTA

- 158 -

. : . : . : . : . : . : fC39_15Mar2005_3+ GTGTCGGTGTTGGGTCGTGAACTCGGAGATTTTGTGGGGTTAGAATAAACATATGTACCT fC131_15Mar2005_8- GTGTCGGTGTTGGGTCGTGAACTCGGAGATTTTGTGGGGTTAGAATAAACATATGTAC ____________________________________________________________ consensus GTGTCGGTGTTGGGTCGTGAACTCGGAGATTTTGTGGGGTTAGAATAAACATATGTACCT . : . : . : . : . : . : fC39_15Mar2005_3+ GCCCGGGCGGCCGCCCGGGCAGGTACAGAACAATGCATCCAATGATTGCAGCACAGGTGA ____________________________________________________________ consensus GCCCGGGCGGCCGCCCGGGCAGGTACAGAACAATGCATCCAATGATTGCAGCACAGGTGA . : . : . : . : . : . : fC39_15Mar2005_3+ ATAGAATGAGCAGAACAAGAGAGAGCGCATAGGCTGTGCGGGAATATGAGTAACTTCGGC ____________________________________________________________ consensus ATAGAATGAGCAGAACAAGAGAGAGCGCATAGGCTGTGCGGGAATATGAGTAACTTCGGC . : . : . : . : . : . : fC39_15Mar2005_3+ GGCGGCAACAGAAGTAATAGCAACAGCTAAATAACAACACCAGCCCAAAAACCAGGAACC ____________________________________________________________ consensus GGCGGCAACAGAAGTAATAGCAACAGCTAAATAACAACACCAGCCCAAAAACCAGGAACC . : . : . : . : . : . : fC39_15Mar2005_3+ ACACAAAGGCAATGGCGAACAGGGGGACAGCCGTAAAACCAACAGAAGCCCAGTAGTGTT ____________________________________________________________ consensus ACACAAAGGCAATGGCGAACAGGGGGACAGCCGTAAAACCAACAGAAGCCCAGTAGTGTT . : . : . : . : . : . : fC39_15Mar2005_3+ GCTCACTGATGTTCCAACCACCAGTGTAACGCTTGAATCCATTCAAAGGATCTTTCCTGT ____________________________________________________________ consensus GCTCACTGATGTTCCAACCACCAGTGTAACGCTTGAATCCATTCAAAGGATCTTTCCTGT . : . : . : . : . : . : fC39_15Mar2005_3+ GTGTCCTATCCGCAGCCAGGATGAAAGAGCTGTTATCCACGGTAAGATTGCCGGTAGGTG ____________________________________________________________ consensus GTGTCCTATCCGCAGCCAGGATGAAAGAGCTGTTATCCACGGTAAGATTGCCGGTAGGTG . : . : . : . : . : . : fC39_15Mar2005_3+ GCACCTCAGCAGCATACCTCCTCGGTAGAACATACCCATCTCGCAGCCCTCCACCTGGTA ____________________________________________________________ consensus GCACCTCAGCAGCATACCTCCTCGGTAGAACATACCCATCTCGCAGCCCTCCACCTGGTA . : . : . : . : . : . : fC39_15Mar2005_3+ AGGGCGTTTTCTGGATCTCAGAATAAGCGTGGGAGACCGAGAAGGGAAGGCAAAGGACAA ____________________________________________________________ consensus AGGGCGTTTTCTGGATCTCAGAATAAGCGTGGGAGACCGAGAAGGGAAGGCAAAGGACAA . : . : . : . : . : . : fC39_15Mar2005_3+ GCATAAGAGGAAGAAGGAAGAGGGAAGCTGGAAATCCAGGGAATGCCATGCTCATCGGAG ____________________________________________________________ consensus GCATAAGAGGAAGAAGGAAGAGGGAAGCTGGAAATCCAGGGAATGCCATGCTCATCGGAG . : . : . : . : . : . : fC39_15Mar2005_3+ CTGGGTTACTCGGTTCCAGGGTGCGCCAAGATGACGCTTTCCCGAAAGCAGAGGCTTCAG ____________________________________________________________ consensus CTGGGTTACTCGGTTCCAGGGTGCGCCAAGATGACGCTTTCCCGAAAGCAGAGGCTTCAG

- 159 -

. : . : . : . : . : . : fC39_15Mar2005_3+ AATCGCACGAAAACAGACGTTTTGGGGACGATAGAGGAGACGTCGTGGTGCTTCCTCACG ____________________________________________________________ consensus AATCGCACGAAAACAGACGTTTTGGGGACGATAGAGGAGACGTCGTGGTGCTTCCTCACG . : . : . : . : . : . : fC39_15Mar2005_3+ AGCGCATTGAGCCGAACTGTGTAGGTTTATCGTCCTGGGGT ____________________________________________________________ consensus AGCGCATTGAGCCGAACTGTGTAGGTTTATCGTCCTGGGGT

- 160 -

Beta-glucosidasa: Nombre de secuencias consenso comparadas: fC127_15Mar2005_3

fC152_15Mar2005_3 fS1990_15Mar2005_1 fS1992_15Mar2005_1

Reporte del ensamblaje y alineamiento: Number of segment pairs = 20; number of pairwise comparisons = 5 '+' means given segment; '-' means reverse complement Overlaps Containments No. of Constraints Supporting Overlap ******************* Contig 1 ******************** beta-glucosidase+ fS1992_15Mar2005_1- is in beta-glucosidase+ fC127_15Mar2005_3- is in beta-glucosidase+ fC152_15Mar2005_3+ fS1990_15Mar2005_1+ is in fC152_15Mar2005_3+ DETAILED DISPLAY OF CONTIGS ******************* Contig 1 ******************** . : . : . : . : . : . : beta-glucosidase+ gtggcggagatggggagctggcgggctctgttgcagcggcggctgctgttgctctctgct ____________________________________________________________ consensus GTGGCGGAGATGGGGAGCTGGCGGGCTCTGTTGCAGCGGCGGCTGCTGTTGCTCTCTGCT . : . : . : . : . : . : beta-glucosidase+ ttggcggtggctgttcgtgtgaaggcactcagcagagacgatttccccgccggcttcatt ____________________________________________________________ consensus TTGGCGGTGGCTGTTCGTGTGAAGGCACTCAGCAGAGACGATTTCCCCGCCGGCTTCATT . : . : . : . : . : . : beta-glucosidase+ tttggcgcaggcacctccgcttatcaggtagaaggtgcagctgcagaggggggaagaaca ____________________________________________________________ consensus TTTGGCGCAGGCACCTCCGCTTATCAGGTAGAAGGTGCAGCTGCAGAGGGGGGAAGAACA . : . : . : . : . : . : beta-glucosidase+ cccagcatttgggacacgtttacgcatgcagggagaactttcgaccagagcaccggagac ____________________________________________________________ consensus CCCAGCATTTGGGACACGTTTACGCATGCAGGGAGAACTTTCGACCAGAGCACCGGAGAC . : . : . : . : . : . : beta-glucosidase+ gtagcagctgatcagtatcacaagtacaaggaagatgtgaagctgatgcatgagatgggc fS1992_15Mar2005_1- GTACAAGGAAGGTGTGAAGCTGATGCATGAGATGGGC ____________________________________________________________ consensus GTAGCAGCTGATCAGTATCACAAGTACAAGGAAGATGTGAAGCTGATGCATGAGATGGGC

- 161 -

. : . : . : . : . : . : beta-glucosidase+ ttcgatgcttacagattctccatctcctggtccagagttatccccaatggtcgagggcct fS1992_15Mar2005_1-TTCGATGCTTACAGATTCTCCATCTCCTGGTCCAGAGTTATCCCCAATGGTCGAGGGCCT ____________________________________________________________ consensus TTCGATGCTTACAGATTCTCCATCTCCTGGTCCAGAGTTATCCCCAATGGTCGAGGGCCT . : . : . : . : . : . : beta-glucosidase+ gtgaatccacaaggcttgcggtactacaacaacctgatcgatgagctcaaaagatatgga fS1992_15Mar2005_1-GTGAATCCACAAGGCTTGCG ____________________________________________________________ consensus GTGAATCCACAAGGCTTGCGGTACTACAACAACCTGATCGATGAGCTCAAAAGATATGGA . : . : . : . : . : . : beta-glucosidase+ atcgagcctcatgtcactctttaccacttcgaccttccgcaagcactggaagacgagtac fC127_15Mar2005_3- GTAC ____________________________________________________________ consensus ATCGAGCCTCATGTCACTCTTTACCACTTCGACCTTCCGCAAGCACTGGAAGACGAGTAC . : . : . : . : . : . : beta-glucosidase+ gccgggcagctgagcccaaagatcgtagaggacttcaccgcttacgccaacgtgtgcttc fC127_15Mar2005_3- GCCGGGCAGCTGAGCCCAAAGATCGTAGAGGACTTCACCGCTTACGCCAACGTGTGCTTC ____________________________________________________________ consensus GCCGGGCAGCTGAGCCCAAAGATCGTAGAGGACTTCACCGCTTACGCCAACGTGTGCTTC . : . : . : . : . : . : beta-glucosidase+ agcgagtttggggatcgagtcaagcactggatcaccatcaatgaacccaacatagatccc fC127_15Mar2005_3- AGCGAGTTTGGGGATCGAGTCAAGCACTGGATCACCGTCAATGAACCCAACATAGATCCC ____________________________________________________________ consensus AGCGAGTTTGGGGATCGAGTCAAGCACTGGATCACCATCAATGAACCCAACATAGATCCC . : . : . : . : . : . : beta-glucosidase+ gtcctcggccacgatttcggcatcttcgcgcctggccgctgctcttatcccttcggcctc fC127_15Mar2005_3- GTCCTCGGCCACGATTTCGGCATCTTCGCGCCTGGCCGCTGCTCTTATCCCTTCGGCCTC ____________________________________________________________ consensus GTCCTCGGCCACGATTTCGGCATCTTCGCGCCTGGCCGCTGCTCTTATCCCTTCGGCCTC . : . : . : . : . : . : beta-glucosidase+ aactgcaccaagggcaactcctccagtgagccatacatcgccgcacataaccttctgctc fC127_15Mar2005_3- AACTGCACCAAGGGCAACTCCTCCAGTGAGCCATACATCGCCGTACATAACCTTCTGCTC ____________________________________________________________ consensus AACTGCACCAAGGGCAACTCCTCCAGTGAGCCATACATCGCCGCACATAACCTTCTGCTC . : . : . : . : . : . : beta-glucosidase+ tcgcatgcatcagcagccgctctgtacaaagagaagtaccaggtgaaacaaggaggttac fC127_15Mar2005_3- TCGCATGCATCAGCAGCCGCTCT ____________________________________________________________ consensus TCGCATGCATCAGCAGCCGCTCTGTACAAAGAGAAGTACCAGGTGAAACAAGGAGGTTAC . : . : . : . : . : . : beta-glucosidase+ atcgggatcacactgcttgccctctggtacgagcccttcacggacttggcagaggacata fC152_15Mar2005_3+ GAGCCCTTCACGGACTTGGCAGAGGACATA ____________________________________________________________ consensus ATCGGGATCACACTGCTTGCCCTCTGGTACGAGCCCTTCACGGACTTGGCAGAGGACATA

- 162 -

. : . : . : . : . : . : beta-glucosidase+ gcagccgcgaagagagccctggatttccaaatcggctggttcgtggatcctcttgtgtac fC152_15Mar2005_3+ GCAGCCGCGAAGAGAGCCCTGGATTTCCAAATCGGCTGGTTCGTGGATCCTCTTGTATAC ____________________________________________________________ consensus GCAGCCGCGAAGAGAGCCCTGGATTTCCAAATCGGCTGGTTCGTGGATCCTCTTGTATAC . : . : . : . : . : . : beta-glucosidase+ ggaacctacccttctgtcatgagagagttcgtcgggtctcgtctaccgtccttcgaacca fC152_15Mar2005_3+ GGAACCTACCCTTCTGTCATGAGAGAGTTCGTCGGGTCTCGTCTACCGTCCTTCGAACCA fS1990_15Mar2005_1+GGAACCTACCCTTCTGTCATGAGAGAGTTCGTCGGGTCTCGTCTACCGTCCTTCGAACCA ____________________________________________________________ consensus GGAACCTACCCTTCTGTCATGAGAGAGTTCGTCGGGTCTCGTCTACCGTCCTTCGAACCA . : . : . : . : . : . : beta-glucosidase+ gaagaatcaaagatgctgagaggatcgttcgacttcatcggactgaatcactatgttgca fC152_15Mar2005_3+ GAAGAATCAAAGATGCTGAGAGGATCGTTCGACTTCATCGGACTGAATCACTATGCTGCA fS1990_15Mar2005_1+GAAGAATCAAAGATGCTGAGAGGATCGTTCGACTTCATCGGACTGAATCACTATGTTGCA ____________________________________________________________ consensus GAAGAATCAAAGATGCTGAGAGGATCGTTCGACTTCATCGGACTGAATCACTATGTTGCA . : . : . : . : . : . : beta-glucosidase+ gtctttctggaagcagctacctatgatcccgacgagagcggcagagaatactacaccgac fC152_15Mar2005_3+ GTCTTCCTGGAAGCAGCTACCGATGATCCCGACGAGAGCGGCAGAGAATACTACACCGAC fS1990_15Mar2005_1+GTCTTTCTGGAAGCAGCTACCTATGATCCCGACGAGAGCGGCAGAGAATACTACACCGAC ____________________________________________________________ consensus GTCTTTCTGGAAGCAGCTACCTATGATCCCGACGAGAGCGGCAGAGAATACTACACCGAC . : . : . : . : . : . : beta-glucosidase+ atgtcggtgaaatttgcaatgccaaacatcatactcacgaaggtgcccccccaaactctg fC152_15Mar2005_3+ ATGTCGGTGAAAATTGCAATGCCAAACATCATACTCACGAAGGTGCCCC---AAACTCTG fS1990_15Mar2005_1+ATGTCGGTGAAATTTGCAATGCCAAACATCATACTCACGAAGGTGCCCCCCCAAACTCTG ____________________________________________________________ consensus ATGTCGGTGAAATTTGCAATGCCAAACATCATACTCACGAAGGTGCCCCCCCAAACTCTG . : . : . : . : . : . : beta-glucosidase+ ccgattcttaagcaaacggtaagaacttcttccgacgggaaccaaaactcgcgtcaggat fC152_15Mar2005_3+ CCGATTCTTAAGCAAACGGTAAGAACTTCTTCCGACGGGAACCAAAACTCGCGTCAGGAT fS1990_15Mar2005_1+CCGATTCTTAAGCAAACGGTAAGAACTTCTTCCGACGGGAACCAAAACTCGCGTCAGGAT ____________________________________________________________ consensus CCGATTCTTAAGCAAACGGTAAGAACTTCTTCCGACGGGAACCAAAACTCGCGTCAGGAT . : . : . : . : . : . : beta-glucosidase+ tttgtgtcggacgacgcacctacgttccctgcaactccatgggctctgcaaaagctactc fC152_15Mar2005_3+ TTTGTGTCGGACGACGCACCTACGTTCACTGCAACTCCATGGGCTCTGCGAAAGCTACTC fS1990_15Mar2005_1+TTTGTGTCGGACGACGCACCTACGTTCCCTGCAACTCCATGGGCTCTGCAAAAGCTACTC ____________________________________________________________ consensus TTTGTGTCGGACGACGCACCTACGTTCCCTGCAACTCCATGGGCTCTGCAAAAGCTACTC . : . : . : . : . : . : beta-glucosidase+ gagtac fC152_15Mar2005_3+ GAGTACCTCGGCC fS1990_15Mar2005_1+GAGTACCTCGGCC ____________________________________________________________ consensus GAGTACCTCGGCC

- 163 -

Citocromo P450: Nombre de secuencias consenso comparadas: fS1790_15Mar2005_1

fS1895_15Mar2005_1 fC128_15Mar2005_2

Reporte del ensamblaje y alineamiento: Number of segment pairs = 20; number of pairwise comparisons = 8 '+' means given segment; '-' means reverse complement Overlaps Containments No. of Constraints Supporting Overlap ******************* Contig 1 ******************** cytochrome+ fS1790_15Mar2005_1+ is in cytochrome+ cytochrome+ is in cytochrome+ fC128_15Mar2005_2+ fS1895_15Mar2005_1+ is in fC128_15Mar2005_2+ DETAILED DISPLAY OF CONTIGS ******************* Contig 1 ******************** . : . : . : . : . : . : cytochromeP450_1+ atggcccttcctcccctcctgctctcacctctcccttctcttctcgttgttctcgcactg ____________________________________________________________ consensus ATGGCCCTTCCTCCCCTCCTGCTCTCACCTCTCCCTTCTCTTCTCGTTGTTCTCGCACTG . : . : . : . : . : . : cytochrome P450_1+ ctgtcttcacttcttctcgcaggtcggaaggcgagaggtggctcggcgacctggaaactc ____________________________________________________________ consensus CTGTCTTCACTTCTTCTCGCAGGTCGGAAGGCGAGAGGTGGCTCGGCGACCTGGAAACTC . : . : . : . : . : . : cytochrome P450_1+ cctccaggcccacccaagctccccgtcatcggccacctccacctcttggggagcagcttg ____________________________________________________________ consensus CCTCCAGGCCCACCCAAGCTCCCCGTCATCGGCCACCTCCACCTCTTGGGGAGCAGCTTG . : . : . : . : . : . : cytochrome P450_1+ ctgcatcgctccctttgggaactctccaagaaacatggacctctcatgcacttgaaattt fS1790_15Mar2005_1+ GGGAACTCTCCACGAAACATGGACCTCTCATGCACTTGAAATTT ____________________________________________________________ consensus CTGCATCGCTCCCTTTGGGAACTCTCCAAGAAACATGGACCTCTCATGCACTTGAAATTT . : . : . : . : . : . : cytochrome P450_1+ ggtcgagtccccgttgtcgtcgtgtcctcgccggagatggctaaggaagtgctaaagaca fS1790_15Mar2005_1+GGTCGAGTCCCCGTTGTCGTCGTGTCCTCGCCGGAGATGGCTAAGGAAGTGCTAAAGACA ____________________________________________________________ consensus GGTCGAGTCCCCGTTGTCGTCGTGTCCTCGCCGGAGATGGCTAAGGAAGTGCTAAAGACA . : . : . : . : . : . : cytochrome P450_1+ cacgaccttgagtgctgcagtcggccttcgctcctctccttttccaagttttcatacggt fS1790_15Mar2005_1+CACGACCTTGAGTGCTGCAGTCGGCCTTCGCTCCTCTCCTTTTCCAAGTTTTCATACGGT ____________________________________________________________ consensus CACGACCTTGAGTGCTGCAGTCGGCCTTCGCTCCTCTCCTTTTCCAAGTTTTCATACGGT

- 164 -

. : . : . : . : . : . : cytochrome P450_1+ ctctccgacgtcgccttcatcccatacggagaacgatggaggcagcttcggaagctctgc fS1790_15Mar2005_1+CTCTCCGACGTCGCCTTCATCCCATACGGAGAACGATGGAGGCAGCTTCGGAAGCTCTGC ____________________________________________________________ consensus CTCTCCGACGTCGCCTTCATCCCATACGGAGAACGATGGAGGCAGCTTCGGAAGCTCTGC . : . : . : . : . : . : cytochrome P450_1+ accgtcgaactcttaagcaccaggaagatcaactcttttagggacataagaaaagaagag fS1790_15Mar2005_1+ACCGTCGAACTCTTAAGCACCAGGAAGATCAACTCTTTTAGGGACATAAGAAAAGAAGAG ____________________________________________________________ consensus ACCGTCGAACTCTTAAGCACCAGGAAGATCAACTCTTTTAGGGACATAAGAAAAGAAGAG . : . : . : . : . : . : cytochrome P450_1+ atggagcgagtgacgaaactgatatgttctcacgttcgcgcttcatccatggtcaacctg fS1790_15Mar2005_1+ATGGAGCGAGTGACGAAACTGATATGTTCTCACGTTCGCGCTTCATCCATGGTCAACCTG ____________________________________________________________ consensus ATGGAGCGAGTGACGAAACTGATATGTTCTCACGTTCGCGCTTCATCCATGGTCAACCTG . : . : . : . : . : . : cytochrome P450_1+ agcgagttgctgctctcgctttcctgcaatatgacatgcagatctgcctttggctctggc fS1790_15Mar2005_1+AGCGAGTTGCTGCTCTCGCTTTCCTGCAATATGACATGCAGATCTGCCTTTGGCTCTGGC ____________________________________________________________ consensus AGCGAGTTGCTGCTCTCGCTTTCCTGCAATATGACATGCAGATCTGCCTTTGGCTCTGGC . : . : . : . : . : . : cytochrome P450_1+ ttcgacgatggaggcgacatccaactccacgacatgctcagagaagcccaagaagagtta fS1790_15Mar2005_1+TTCGACGATGGAGGCGACATCCAACTCCACGACATGCTCAGAGAAGCCCAAGAAGAGTTA ____________________________________________________________ consensus TTCGACGATGGAGGCGACATCCAACTCCACGACATGCTCAGAGAAGCCCAAGAAGAGTTA . : . : . : . : . : . : cytochrome P450_1+ agtggcttgtttttatctgattacttaccattgttggggtgggttgataggctaagtggg fS1790_15Mar2005_1+AGTGGCTTGTTTTTATCTGATTACTTACCATTGTTGGGGTGGGTTGATAGGCTAAGTGGG cytochrome P450_4+ ggttgattggctacgtggg ____________________________________________________________ consensus AGTGGCTTGTTTTTATCTGATTACTTACCATTGTTGGGGTGGGTTGATAGGCTAAGTGGG . : . : . : . : . : . : cytochrome P450_1+ atgagatccagacttgaaagggcctttcttaagctcgatagcatctatcaacgccgtata fS1790_15Mar2005_1+ATGAGATCCAGACTTGAAAGGGCCTTTCTTGAGCTCGATAGCATCTATCAACGCCGTATA cytochrome P450_4+ atgagatccagacttgaaagggcctacgttaagctcgatagcatctaccaacgccttata ____________________________________________________________ consensus ATGAGATCCAGACTTGAAAGGGCCTTTCTTAAGCTCGATAGCATCTATCAACGCCGTATA . : . : . : . : . : . : cytochrome P450_1+ gattaccaccaagatcgattgaggcaacaaggtaaagaagatggagacgtcttagatgct fS1790_15Mar2005_ GATTACCACCAAGATCGATTGAGGCAACAAGGTAAAGAAGATGGAGACGTCTTAGATGCT 1+cytochrome P450_4+ gattaccaccaagatcgattcagactacaaggtaaagaagatgaagacatcttagatgct ____________________________________________________________ consensus GATTACCACCAAGATCGATTGAGGCAACAAGGTAAAGAAGATGGAGACGTCTTAGATGCT . : . : . : . : . : . : cytochrome P450_1+ ttgctccgcatgcaaaaggatgaggagggtctaacagaagaccacatcaaaggagttctc fS1790_15Mar2005_ TTGCTCTGCATGCAAAAGGATGAGGAGGG 1+ cytochrome P450_4+ ttgctccgcatgcaaaaggatgaggagggtgtaacagaagaccacatcaaaggagtgctc ____________________________________________________________ consensus TTGCTCCGCATGCAAAAGGATGAGGAGGGTCTAACAGAAGACCACATCAAAGGAGTGCTC

- 165 -

. : . : . : . : . : . : cytochrome P450_1+ atggatattttcattgctgggacggacacatcctcggcaaccgtggagtgggcgatggcg cytochrome P450_4+ atgaatattatcattgctgggacggacacatccacagcaaccgtgctgtggacgatggcg ____________________________________________________________ consensus ATGAATATTATCATTGCTGGGACGGACACATCCACAGCAACCGTGCAGTGGACGATGGCG . : . : . : . : . : . : cytochrome P450_1+ gagctcatcagacaacctgagctgatgaagagagcacaagacgaggtaagacgatgtgtc cytochrome P450_4+ gagctcatcagacaacctgagctgatgaagagagcacaagacgaggtgagaggatgtgtc ____________________________________________________________ consensus GAGCTCATCAGACAACCTGAGCTGATGAAGAGAGCACAAGACGAGGTAAGACGATGTGTC . : . : . : . : . : . : cytochrome P450_1+ ggaagcaaaggggaggtggaggagagtgaccttcaccaacttcatttcttcaagtgtgtc cytochrome P450_4+ cgaagcaaaggggaggtggaggagagcgaccttgaccaacttcatttcttgaagtgtgtc ____________________________________________________________ consensus CGAAGCAAAGGGGAGGTGGAGGAGAGCGACCTTCACCAACTTCATTTCTTCAAGTGTGTC . : . : . : . : . : . : cytochrome P450_1+ atcaaggagacgatgaggctgcaccctcccgctccgctgctacttcctagggaaaccatg cytochrome P450_4+ atcaaggagacaatgaggctgcaccctcccgttccgctgctacttcctagggaaaccatg ____________________________________________________________ consensus ATCAAGGAGACAATGAGGCTGCACCCTCCCGCTCCGCTGCTACTTCCTAGGGAAACCATG . : . : . : . : . : . : cytochrome P450_1+ cagcactttaagcttaatggctatgatattctacccaaaacatggatgtatgtgaatgct cytochrome P450_4+ cagcactttaagcttaatggctatgatattttacccaaaacatggatgtatgtgaatgct fC128_15Mar2005_2+ ACTTTAAGCTTAATGGCTATGATATTTTACCCAAAACATGGATGTATGTGAATGCT ____________________________________________________________ consensus CAGCACTTTAAGCTTAATGGCTATGATATTTTACCCAAAACATGGATGTATGTGAATGCT . : . : . : . : . : . : cytochrome P450_1+ tgggcgataggaagagatcccaattcgtgggggaggcctcatgtctttgatccagagagg cytochrome P450_4+ tgggcgataggaagagatcccaattcgtgggcgaggcctcatgtctttgatccagagagg fC128_15Mar2005_2+TGGGCGATAGGAAGAGATCCCAATTCGTGGGCGAGGCCTCATGTCTTTGATCCAGAGAGG ____________________________________________________________ consensus TGGGCGATAGGAAGAGATCCCAATTCGTGGGCGAGGCCTCATGTCTTTGATCCAGAGAGG . : . : . : . : . : . : cytochrome P450_1+ ttcatgcatgactccacggaggcaagtgggcaggatttcaagctcataccatttggcgaa cytochrome P450_4+ tgcatgactccacggaggcaagtgggcaggatttcaagctcataccatttggcgaa ttcafC128_15Mar2005_2+ TTCATGCATGACTCCACGGAGGCAAGTGGGCAGGATTTCAAGCTCATACCATTTGGCGAA fS1895_15Mar2005_1+ GAA ____________________________________________________________ consensus TTCATGCATGACTCCACGGAGGCAAGTGGGCAGGATTTCAAGCTCATACCATTTGGCGAA . : . : . : . : . : . : cytochrome P450_1+ ggtcgaaggatctgccccggtaaaaatcttggaatgttaatggtggaacttgtgcttgcc cytochrome P450_4+ ggtcgaaggatctgccccggtaaaaatcttggaatgttaatggtggaacttgtgcttgcc fC128_15Mar2005_2+ GGTCGAAGGATCTGCCCCGGTAAAAATCTTGGAATGTTAATGGTGGAACTTGTGCTTACC fS1895_15Mar2005_1+GGTCTAACGATCTGCCCCGGTAAAAATCTTGGAATGTTAATGGTGGAACTTGTGCTTGCC ____________________________________________________________ consensus GGTCGAAGGATCTGCCCCGGTAAAAATCTTGGAATGTTAATGGTGGAACTTGTGCTTGCC

- 166 -

. : . : . : . : . : . : cytochrome P450_1+ aacctcctctactcctttgattggcatttaccacctggaatggtgaaggaggacatcagt cytochrome P450_4+ aatctcatctactcctttgattggcatttaccacctggaatggtgaaggaggacatcagt fC128_15Mar2005_2+ AATCTCATCTACTCCTTTGATTGGCATTTACCACCTGGAATGGTGAAGGAGGACATCAGT fS1895_15Mar2005_1+AACCTCCTCTACTCCTTTGATTGGCATTTACCACCTGGAATGGTGAAGGAGGACATCAGT ____________________________________________________________ consensus AACCTCATCTACTCCTTTGATTGGCATTTACCACCTGGAATGGTGAAGGAGGACATCAGT . : . : . : . : . : . : cytochrome P450_1+ atggaggaagcacctggtgtcaccgtgcatagagagtatgctctttgtctcatggccacc cytochrome P450_4+ atggaggaagcagctggttttacaatgaatagagagtatgctctttgtctcatggccacc fC128_15Mar2005_2+ ATGGAGGAAGCAGCTGGTTTTACAATGAATAGAGAGTATGCTCTTTGTCTCATGGCCACC fS1895_15Mar2005_1+ATGGAGGAAGCACCTGGTGTCACCGTGCATAGAGAGTATGCTCTTTGTCTCATGGCCACC ____________________________________________________________ consensus ATGGAGGAAGCACCTGGTGTCACAATGAATAGAGAGTATGCTCTTTGTCTCATGGCCACC . : . : . : . : . : . : cytochrome P450_1+ aatatgatgcaacaacagcctga acytochrome P450_4+ tatgattcaccaacagcctga aaafC128_15Mar2005_2+ AAATATGATTCACCAACAGCCTGAATTGCATGTGCATGTTAAAGTACCTGCCCGGGC fS1895_15Mar2005_1+ AAATATGATGCAACAACAGCCTGAATTGCTTGTGCATGTTAAAGTACCT ____________________________________________________________ consensus AAATATGATGCAACAACAGCCTGAATTGCATGTGCATGTTAAAGTACCTGCCCGGGC

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Precursor de la proteína GASA2 regulado por giberelinas: Nombre de secuencias consenso comparadas: fC31_15Mar2005_2

fC146_15Mar2005_2 Reporte del ensamblaje y alineamiento: Number of segment pairs = 6; number of pairwise comparisons = 1 '+' means given segment; '-' means reverse complement Overlaps Containments No. of Constraints Supporting Overlap ******************* Contig 1 ******************** fC31_15Mar2005_2+ fC146_15Mar2005_2+ is in fC31_15Mar2005_2+ DETAILED DISPLAY OF CONTIGS ******************* Contig 1 ******************** . : . : . : . : . : . : fC31_15Mar2005_2+ GTGGGGACGTCCGAATCGTCTCCCTTGCTCTGTTATACTTCCTCTCTCATGGCGAAGTCT fC146_15Mar2005_2+ GGGGACGCCCGAATCGTCTCCCTTGGTCTGTTATACTTCCTCTCTCATGGCGAAGTCT ____________________________________________________________ consensus GTGGGGACGCCCGAATCGTCTCCCTTGCTCTGTTATACTTCCTCTCTCATGGCGAAGTCT . : . : . : . : . : . : fC31_15Mar2005_2+ TCCATCGCCTGTGCACTGCTTCTCTTCTTACTTCTGGTGGAGATGGATATCTCAGCTGTC fC146_15Mar2005_2+ TCCATCACCTGCGCAGTGCTTCTCCTGTTACTTCTGGTGGAGATGGATATCTCAGCTGTC ____________________________________________________________ consensus TCCATCACCTGCGCACTGCTTCTCCTCTTACTTCTGGTGGAGATGGATATCTCAGCTGTC . : . : . : . : . : . : fC31_15Mar2005_2+ GCAGAAAAAGAAATCAATTGTGAGGCGAGGTGTTCGCACCGTTGCTCCAAGGCATCAAGG fC146_15Mar2005_2+ GCAGAAAGAGAAATCAATTGTGAGGCGAAGTGTTCGCACCGTTGCTCCAAGGCATCAAGG ____________________________________________________________ consensus GCAGAAAAAGAAATCAATTGTGAGGCGAAGTGTTCGCACCGTTGCTCCAAGGCATCAAGG . : . : . : . : . : . : fC31_15Mar2005_2+ CACAAGATGTGCATGAGAGCTTGCATCGACTGCTGTCACAAGTGCCACTGCGTCCCGCCC fC146_15Mar2005_2+ CACAAGATGTGCATGAGAGCTTGCATCGACTGCTGTCACAAGTGCCACTGCGTCCCGCCC ____________________________________________________________ consensus CACAAGATGTGCATGAGAGCTTGCATCGACTGCTGTCACAAGTGCCACTGCGTCCCGCCC . : . : . : . : . : . : fC31_15Mar2005_2+ GGTACCTGCCCGGGC fC146_15Mar2005_2+ GGTACCTGCCCGGGC ____________________________________________________________ consensus GGTACCTGCCCGGGC

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Orcinol O-metil transferasa:

Nombre de secuencias consenso comparadas: fS1860_15Mar2005_1 fS1862_15Mar2005_1 Reporte del ensamblaje y alineamiento: Number of segment pairs = 2; number of pairwise comparisons = 1 '+' means given segment; '-' means reverse complement Overlaps Containments No. of Constraints Supporting Overlap ******************* Contig 1 ******************** fS1860_15Mar2005_1+ fS1862_15Mar2005_1+ is in fS1860_15Mar2005_1+ DETAILED DISPLAY OF CONTIGS ******************* Contig 1 ******************** . : . : . : . : . : . : fS1860_15Mar2005_1+ TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGTACGCGGGGACAGTCAGTGGAGGGATGCAAAGGGAGGAA ____________________________________________________________ consensus TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGTACGCGGGGACAGTCAGTGGAGGGATGCAAAGGGAGGAA . : . : . : . : . : . : fS1860_15Mar2005_1+ CACGAATGGCGTAAGATCTTTACGGACGCTGGTTTTTCGAGCTACACGATCAAAGGTATG fS1862_15Mar2005_1+ GAATGACGTAAGATCTTTACGGACGCTGGTTTTTCGAGCTACACGATCAAAGGTATG ____________________________________________________________ consensus CACGAATGACGTAAGATCTTTACGGACGCTGGTTTTTCGAGCTACACGATCAAAGGTATG . : . : . : . : . : . : fS1860_15Mar2005_1+ GGATTGCGTTCCTTGATCGAGGTTTATCCTTGATGTTTATCGCAAGTGAAATTAATGGGG fS1862_15Mar2005_1+ GGATTGCGTTCCTTGATCGAGGTTTATCCTTGATGTTTATCGCAAGTGAAATTAATGGGG ____________________________________________________________ consensus GGATTGCGTTCCTTGATCGAGGTTTATCCTTGATGTTTATCGCAAGTGAAATTAATGGGG . : . : . : . : . : . : fS1860_15Mar2005_1+ GTCAGTCAAACAATAAGCTCCTCCAACAATGGTAAGTTGAAAACATCTGTATGTTACCGA fS1862_15Mar2005_1+ GTCAGTCAAACAATAAGCTCCTCCAACAATGGTAAGTTGAAAACATCTGTATGTTACCGA ____________________________________________________________ consensus GTCAGTCAAACAATAAGCTCCTCCAACAATGGTAAGTTGAAAACATCTGTATGTTACCGA . : . : . : . : . : . : fS1860_15Mar2005_1+ ATAAGGTGATGCAAG fS1862_15Mar2005_1+ ATAAGGTGATGCAAG ____________________________________________________________ consensus ATAAGGTGATGCAAG

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