Estudio de las actividades analgésica e inhibitoria de los efectos...

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Estudio de las actividades analgésica e inhibitoria de los efectos tóxicos

del veneno de Bothrops asper por extractos y compuestos aislados de

Renealmia alpinia silvestre.

Isabel Cristina Gómez Betancur

Tesis presentada para optar al título de Doctorado en Ciencias Farmacéuticas y

Alimentarias

Tutora

Dora María Benjumea Gutiérrez. PhD

Profesora Facultad de Ciencias Farmacéuticas y Alimentarias

Universidad de Antioquia

Facultad de Ciencias Farmacéuticas y Alimentarias

Medellín, 2015

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Agradecimientos

A Dios, por su infinito amor, por fortalecer mi corazón e iluminar mi mente y por haber puesto en

mi camino a aquellas personas que han sido mi soporte y compañía durante todo el período de estudio.

A mis padres Duván y Amanda y mis hermanos Lina, Martha y Duván, por su amor y su compañía

siempre tan oportuna. A mi abuela y madrina Ofelia quien se marchó mientras realizaba mi

pasantía. A mi esposo Mauricio, por apoyarme y animarme siempre, por su comprensión y su amor y por no desfallecer a pesar del tiempo y la distancia, a nuestro hijo Emmanuel por ser el tesoro y

la luz al final de todo este proceso.

A COLCIENCIAS, por la beca recibida durante el período 2012-2015, para la realización de la

presente Tesis Doctoral.

Al CODI (Proyecto CIQF-139), por los fondos destinados a financiar esta tesis y a la Facultad de Ciencias Farmacéuticas y Alimentarias de la Universidad de Antioquia, por apoyarme durante este

período de formación.

Al comité tutorial, encabezado por la Doctora Dora María Benjumea, por sus buenos consejos y la

confianza depositada en mí, a la Doctora Vitelbina Núñez, por su ejemplo, por sus enseñanzas y

por creer en mí, al doctor Edison Osorio por su disposición y paciencia, a la Doctora Katalina

Muñoz por sus valiosas orientaciones.

Al Serpentario, Programa de Ofidismo/Escorpionismo de la Universidad de Antioquia, por su

invaluable apoyo durante mi formación. A los Profesores del Programa de

Ofidismo/Escorpionismo, y a los compañeros del laboratorio por su ayuda, sus consejos, pero en

especial por su amistad.

A los Doctores Isabel Bazzochi y Antonio Jiménez del Instituto Universitario de Bio-Orgánica Antonio González (IUBO), de la Universidad de La Laguna (España) y a los Doctores Stephen

Cutler y Francisco León del Departamento de Ciencias Biomoleculares de la Universidad de

Mississippi -Olemiss- (Estados Unidos de América), por haberme acogido en sus laboratorios

durante mi pasantía.

A la Doctora Nora Jiménez y Natalie Charlotte del laboratorio de Investigación en Sustancias Bioactivas (GISB), por su colaboración en el desarrollo del estudio Fitoquímico, de corazón

gracias por los buenos momentos compartidos durante mi permanencia en el laboratorio.

¡Mi sentimiento de eterna gratitud a todos aquellos que hicieron posible la realización del

presente trabajo!

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Tabla de Contenido Páginas

Índice de tablas………………………………………………………..……………… 5

Índice de figuras ……………………………………………………………………... 6

1. Introducción ………………………………………………………………… 10

1.1 Accidente ofídico ………………………………………………………….11

1.2 Uso de plantas medicinales para el tratamiento del accidente ofídico…….15

1.3 Renealmia alpinia y su uso en medicina tradicional……………………....17

2. Hipótesis y Objetivos ………………………………………………….……. 22

3. Estudio dirigido a la búsqueda de compuestos fenólicos de Renealmia alpinia 25

3.1 Materiales y Métodos…………………………………………………...…26

3.2 Técnicas cromatográficas ……………………………………………..…..26

3.3 Técnicas experimentales ………………………………………………….30

3.4 Metabolitos aislados de Renealmia alpinia ………..……………………..31

3.5 Resultados y discusión …………………………………………………....34

4. Estudio Farmacológico …………………………………………………….. 46

4.1 Animales de experimentación …………………………………………….47

4.2 Venenos …………………………………………………………………..48

4.3 Evaluación de la actividad Citotóxica de compuestos aislados de Renealmia

alpinia…………………………………………………………………….49

4.4 Evaluación de la Toxicidad aguda de compuestos aislados de Renealmia

alpinia…………………………………………………………………….52

4.5 Inhibición de los efectos tóxicos del veneno de Bothrops asper por el extracto y

compuestos aislados de Renealmia alpinia………………………………..60

4

4.6 Estudio de Fluorescencia intrínseca y ultravioleta (UV)…………..……..79

4.7 Estudios de acoplamiento molecular (Docking molecular)……………....80

4.8 Ensayos de analgesia …………………………………………………….83

4.9 Análisis estadístico ……………………………………………………….92

Conclusiones ………………………………………………………………………. 93

Perspectivas….…………………………………………………………………….. 95

Referencias bibliográficas …………………………………………………………96

Anexos ……………………………………………………………………………. 108

Anexo A: Espectros de los compuestos aislados de Renealmia alpinia ………...109

5

Índice de tablas Página

Tabla N°1 Nombres comunes de R. alpinia ……………………………………………… 17

Tabla N°2 Otros usos populares de R. alpinia según diferentes países …………………… 19

Tabla N°3 Rendimiento de las fracciones obtenidas de Renealmia alpinia ……………….. 33

Tabla N°4 Datos de RMN-1H, RMN-13C, HSQC y HMBC (300 MHz) de F-1 ………....…35

Tabla N°5 Datos de RMN-1H, RMN-13C, HSQC y HMBC (300 MHz) de F-2 ………….…36

Tabla N°6 Datos de RMN-1H, RMN-13C, HSQC y HMBC (300 MHz) de F-3 ………….…37

Tabla N°7 Datos de RMN-1H, RMN-13C, HSQC y HMBC (300 MHz) de F-4 ..…………..38

Tabla N°8 Datos de RMN-1H, RMN-13C, HSQC y HMBC (500 MHz) de F-5 ……………40

Tabla N°9 Datos de RMN-1H, RMN-13C, HSQC y HMBC (300 MHz) de D-1 ....................41

Tabla N°10 Datos de RMN-1H, RMN-13C, HSQC y HMBC (500 MHz) de D-2 …………..42

Tabla N°11 Datos de RMN-1H, RMN-13C, HSQC y HMBC (500 MHz) de K-1………….. 43

Tabla N°12 Datos de RMN-1H, RMN-13C, HSQC y HMBC (400 MHz) de 3,5- β-Sitosteryl β-D-

glucoside…………………………………………………………………………………….….44

Tabla N°13 Algunas características de los compuestos en estudio, aislados de R. alpinia .…52

Tabla N°14 Toxicidad aguda. Respuesta a la muestra administrada ……………………. 55

Tabla N°15 Toxicidad aguda. Determinación de las condiciones generales ……………….56

Tabla N°16 Registro del peso corporal de los animales de experimentación ……………….57

Tabla N°17 Porcentaje de inhibición del efecto hemorrágico …………………………….. 68

Tabla N°18 Ensayo. Receptores de canabinoides (CB1 y CB2) y opioides (δ, κ, y μ)…… 85

Tabla N°19 Actividad analgésica …………………………………………..………..89

Tabla N°20 Actividad analgésica ……………………..…………………………….90

6

Índice de figuras Página

Figura N° 1 Distribución de algunas especies de serpientes del género Bothrops ………… 13

Figura N° 2 Actividad catalítica de las PLA2……………………………………………… 14

Figura N° 3 Cromatografía en columna preparativa………………………………………... 28

Figura N° 4 Cromatografía circular preparativa (Cromatotrón) …………………………… 29

Figura N° 5 Equipo para Cromatografía en Capa Delgada de Alta Definición (HPTLC) ….30

Figura N° 6 (F-1), 5-hydroxy-7-methoxyflavanone (Pinostrobin) ………………………… 34

Figura N° 7 (F-2) 2',6'-Dihydroxy-4'-methoxychalcone (Pinostrobin-Chalcona) ………… 36

Figura N° 8 (F-3) Sakuranetin (Naringenin 7-methyl ether) ……………………………….37

Figura N° 9 (F-4) Naringenin 7,4'-dimethylether (Sakuranetin 4'-methyleter) …………… 38

Figura N° 10 (F-5) 3'4',5-Trihydroxy-7-methoxyflavanone (Sterubin) ……………………39

Figura N° 11 (D-1) 5-Heptanediol, 1,7-diphenyl (Yashabushidiol) ……………………… 41

Figura N° 12 (D-2) 1-(4-Hydroxyphenyl)-7-phenyl-(4E)-4-hepten-3-one …………….…..42

Figura N° 13 4-methoxy-6-[(E)-2-phenylethenyl]-2H-pyran-2-one (Desmethoxyyangonin) 43

Figura N° 14 3,5- β-Sitosteryl β-D- glucoside ……..………………………………………. 44

Figura N° 15 Citotoxicidad en células C2C12 de 6 compuestos aislados ……..…………..50

Figura N° 16 Citotoxicidad en células J-774 de 6 compuestos aislados ……………………. 51

Figura N° 17 Ganancia de peso corporal de los animales de experimentación tratados ….…58

Figura N° 18 Observaciones macroscópicas realizadas después del sacrifico de los animales. 59

7

Índice de figuras Página

Figura N° 19 Inhibición del efecto proteolítico inducido por el veneno de B. asper ………..62

Figura N° 20 Inhibición del efecto de coagulación inducida por el veneno de B. asper ……..64

Figura N° 21 Inhibición del efecto hemolítico indirecto inducido por el veneno de B. asper ..66

Figura N° 22 Inhibición de la actividad enzimática de la PLA2. …………………………….. 71

Figura N° 23 Inhibición de la miotoxicidad inducida por PLA2 ……………………………… 74

Figura N° 24 Inhibición de la formación de edema de la PLA2 por pinostrobin. …......……… 76

Figura N° 25 Inhibición de la actividad anticoagulante de la PLA2 por pinostrobin. …..78

Figura N° 26 Estudios de fluorescencia intrinseca y UV ……………………………………… 80

Figura N° 27 Resultados del docking molecular ………………………………………………. 82

Figura N° 28 Porcentaje de inhibición del dolor inducido por fenilquinona ………………….. 91

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RESUMEN

Históricamente los productos naturales han jugado un papel fundamental en el desarrollo de

nuevos fármacos (Cordell & Colvard, 2012). Esto se hace evidente en la cantidad de

fármacos de origen natural y derivados sintéticos que actualmente se usan en la práctica

clínica, tales como ciclosporina1 (Kingston, 2011).

Los recursos naturales empleados tradicionalmente por el hombre, constituyen una fuente

inagotable de conocimiento que nos invita a la búsqueda de moléculas con actividad

biológica para el tratamiento de diversos problemas de salud. Principalmente en países en

vía de desarrollo, donde existen diversas enfermedades tropicales desatendidas por los

gobiernos, entre las cuales, se encuentra el accidente ofídico.

Las mordeduras causadas por serpientes representan un gran problema para la salud pública

en áreas tropicales y subtropicales del mundo (Mebs, 2002) e incluso, superan en algunos

casos el número de muertes ocasionadas por enfermedades como fiebre hemorrágica del

dengue, cólera, leishmaniosis y enfermedad de Chagas (Williams et al, 2010).

En Colombia, anualmente se producen cerca de 4000 mordeduras por serpientes con altas

tasas de morbimortalidad. Resulta interesante saber que un gran porcentaje de dichas

mordeduras son inicialmente tratadas empleando la medicina tradicional, situación que no

es solo característica de nuestro país, sino de otros, donde las plantas medicinales han sido

utilizadas para tratar este tipo de envenenamientos; lo cual ha sido demostrado en 700

plantas de diferentes familias con pruebas básicas de laboratorio, donde se manifiesta la

capacidad inhibitoria sobre el veneno completo o toxinas aisladas de algunas serpientes

(Reyes-Chilpa et al, 1994; Borges et al, 2001; Núñez et al, 2005)

El propósito de esta tesis es contribuir al conocimiento fitoquímico y farmacológico de la

especie vegetal Renealmia alpinia (“matandrea”), como posible coadyuvante en el

1 Péptido producido por el hongo Tolypocladium inflatum, usado en trasplantes, Artemisina, lactona sesquiterpénica usada en el tratamiento de la malaria; Paclitaxel, compuesto antitumoral aislado de Taxus brevifolia.

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tratamiento del accidente ofídico, para ello se realizó la evaluación de la actividad

analgésica y la inhibición de los efectos tóxicos del veneno de Bothrops asper (“mapaná”)

por los extractos y compuestos aislados de hojas de R. alpinia, obtenida de la flora silvestre

en Antioquia, Colombia.

La tesis comienza con una introducción donde se describe la problemática del accidente

ofídico, el uso de las plantas medicinales en el tratamiento del dolor y las mordeduras por

serpientes, continuando con una descripción de los componentes del veneno de B. asper.

Posteriormente se describen los objetivos de la tesis. Los siguientes capítulos contienen el

estudio fitoquímico de R alpinia, los estudios de seguridad de los compuestos aislados.

Posterior a esto se encuentra el capítulo de evaluación de las actividades inhibitorias del

veneno de B. asper y finalmente la evaluación de la actividad analgésica; para terminar con

las conclusiones, perspectivas y las referencias bibliográficas.

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Introducción

Bothrops asper

Renealmia alpinia

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1. INTRODUCCIÓN

1.1 Accidente ofídico

El accidente ofídico es una intoxicación producida por la inoculación de veneno a través de

la mordedura de una serpiente; éste es un grave problema de salud pública en áreas

tropicales y subtropicales del mundo (Mebs, 2002), pues se producen aproximadamente

5’500.000 accidentes/año, con síntomas de envenenamiento en más de la mitad de las

mordeduras y una tasa de letalidad que puede ser superior al 2% (Pineda & Rengifo, 2002;

Stock et al., 2007); de estos, ocurren en Latinoamérica cerca de 150.000

envenenamientos/año, con una letalidad superior al 3%. En Colombia, se presentaron de

4.400 mordeduras/año, la incidencia de accidente ofídico en el país es de 9,01 casos por

100.000 habitantes; (INS, 2014).

El tratamiento efectivo, aceptado y conocido desde hace más de 120 años, es la administración

del antiveneno, la cual es prioritaria, pues el retraso en la atención inicial puede disminuir

las oportunidades de supervivencia. Sin embargo, la poca producción y distribución de

antivenenos eficaces y a la vez asequibles por la comunidad en cualquier centro de salud, no

evita las secuelas físicas o psicológicas permanentes.

En los países del trópico, la cultura ancestral promueve la realización de otro tipo de

prácticas no médicas, como la utilización de hierbas, incisiones, succión o ligadura que en

ocasiones pueden resultar en alteraciones del cuadro clínico, infección, gangrena o edema,

lo que puede empeorar el pronóstico (Phillips et al 1988; Warrell 1995).

En años anteriores, en Colombia, el suero antiofídico polivalente se adicionó al listado de

Medicamentos Vitales No Disponibles, del Instituto Nacional de Vigilancia de

Medicamentos y Alimentos –INVIMA– (INVIMA, 2011); pero solo permanecen en el

listado los sueros antielapídicos (corales (Micrurus) y la serpiente marina (Pelamis

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platurus)) (INVIMA, 2013) y se producen y comercializan el suero polivalente y el suero

monovalente antibotrópico (INS, 2011).

La importancia del accidente ofídico para el sistema de vigilancia en salud pública es alta,

porque las características socioculturales y demográficas de Colombia hacen que la

susceptibilidad de la población aumente, tanto en la presentación de eventos mórbidos

como mortales, las cuales, pueden ser evitables con la instauración de tratamiento oportuno

y eficaz. En Colombia, el suministro del antiveneno y la atención de los pacientes con

ofidiotoxicosis son obligatorios, por lo que se debe garantizar el personal técnico necesario

para realizar las actividades de prevención y control desde el nivel municipal al

departamental y la consecución de suero antiofídico.

Los principales géneros de serpientes que afectan a los humanos en Colombia son Bothrops

y Portidium, además se incluyen géneros como Bothriechis y Lachesis, las manifestaciones

clínicas de los accidentes son similares, causando efectos, incluyendo edema, hemorragia

local, formación de ampollas, dermonecrosis, y mionecrosis, coagulopatia y diátesis

hemorrágicas, entre otras (Pereira et al, 2004).

Los envenenamientos por la serpiente Bothrops asper se caracterizan por presentar

alteraciones locales conspicuas en el lugar donde el veneno es inyectado, incluyendo

edema, hemorragia local, formación de ampollas, dermonecrosis y mionecrosis. En casos

severos, signos y síntomas de envenenamiento sistémico incluyen desfibrinogenación,

hipoagregación plaquetaria, trombocitopenia, hemorragia sistémica, coagulación

intravascular diseminada, shock cardiovascular e insuficiencia renal aguda. La muerte

puede ser el resultado de la hipotensión secundaria a hipovolemia, insuficiencia renal, o de

la hemorragia intracraneal (Saborıo et al 1998).

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Figura 1: Distribución de algunas especies de serpientes del género Bothrops (asper y atrox) en

América Central y del Sur. Mapa físico de Centroamérica y el norte, América del Sur destaca la

distribución geográfica de B. asper (puntos), B. atrox (gris), y B. colombiensis (blanco y amarillo).

(Campbell y Lamar, 2004)

B. asper se distribuye ampliamente en las tierras bajas húmedas. Se encuentra en la isla de

Trinidad; en México y América Central, en altitudes de hasta 1500 m, mientras que en

América del Sur se encuentra hasta 2500 m (Campbell y Lamar, 2004). La distribución de

B. asper en el Caribe se extiende continuamente a lo largo de la costa del Golfo de México,

la Península de Yucatán, Centroamérica, Panamá, la costa del Caribe, a través de los valles

interandinos de Colombia, y desde allí hacia el este a través del norte y centro de

Venezuela. En el Pacífico, la distribución de de B. asper incluye la región central y sur de

Costa Rica, a través de Panamá, continuando por el oeste de Colombia, el norte de Ecuador

y el extremo nororiental de Perú. En la figura 1 se observa la distribución de especies del

género Bothrops (asper y atrox).

Los venenos de serpiente son secreciones producidas por las glándulas exocrinas

especializadas que contienen una mezcla compleja de proteínas tóxicas que contribuyen a

someter, matar y/o digerir la presa (Fry et al., 2006; Vonk et al., 2008). Las toxinas del

veneno probablemente evolucionaron a partir de un conjunto reducido de proteínas con

funciones fisiológicas normales que fueron reclutadas en el proteoma del veneno antes de

que se diera la diversificación de las serpientes avanzadas (Fry and Wüster, 2004; Fry,

2005). Las toxinas de la familia Viperidae se pueden agrupar en unas pocas familias de

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proteínas, incluyendo enzimas (serin proteasas, metaloproteinasas, L-amino acido oxidasas,

Fosfolipasas del grupo II) y proteínas sin actividad enzimática (desintegrinas, moléculas de

tipo C-lectina, péptidos potenciadores de bradiquinina, miotoxinas, proteínas secretoras

ricas en cisteína) (Calvete et al., 2007). Las fosfolipasas A2, son las toxinas más abundantes

en el veneno de B. asper, por lo tanto son las responsables de muchos de los efectos de

mayor relevancia.

Las fosfolipasas A2 son enzimas, que catalizan la hidrolisis de glicerofosfolípidos en la

posición sn-2 (Kini, 2003) (Figura 2). Son enzimas de amplia distribución en la naturaleza,

su clasificación se ha basado en su secuencia, masa molecular, patrones de puentes

disulfuro y requerimiento de Ca 2+

.

Figura 2. Actividad catalítica de las PLA2. Los glicerofosfolípidos (izquierda) son hidrolizados en

la posición sn-2 para producir un ácido graso libre y un lisofosfolípido (tomado de Fernandez

Maritza, Aislamiento de una fosfolipasa A2 homóloga del veneno de la serpiente Bothrops asper:

caracterización bioquímica y biológica, tesis de Maestria, Universidad de Antioquia, 2013).

Las acciones de las fosfolipasas A2 incluyen la desestabilización de la membrana, produce

pérdida del control de la permeabilidad, produciéndose un influjo de calcio, y en

consecuencia hay un daño en el gradiente electroquímico que existe en dicha membrana.

Además, conlleva a la salida del contenido citoplasmático, como las enzimas

PLA2

+ R2COOH

Lisofosfolípido Ácido graso

15

deshidrogenasa láctica (LDH) y creatina kinasa (CK) (Gutiérrez y Ownby, 2003). El

incremento del calcio citosólico pone en marcha una serie de procesos degenerativos tales

como: hipercontracción de miofilamentos, alteraciones mitocondriales, activación de

calpaínas (proteínas intracelulares dependientes de calcio) y de fosfolipasas A2

intracelulares, así como desregulación de diversas vías metabólicas. Como consecuencia de

estos procesos, las células se lesionan irreversiblemente en un proceso de muerte celular

necrótica (Lomonte et al., 1994, Kini., et al, 2003).

1.2 Uso de plantas medicinales para el tratamiento del accidente ofídico.

El gran número de accidentes ofídicos en zonas rurales, en las que es habitual el uso de

técnicas de medicina tradicional, ha promovido la utilización de éstas, como elección

inicial, en el tratamiento de los envenenamientos por serpientes, estas medidas tradicionales

se emplean aproximadamente en el 80% de la población mundial (Alam & Gomes, 2003;

Chopra et al., 1956; Kirtikar & Basu, 1975; Lewis & Elvin-Lewis, 1977; Nadkarni, 1976;

Oliveira et al., 2005). En Colombia se ha reportado que cerca del 30% de las víctimas de

mordedura de serpiente utilizan algún tipo de práctica no médica en el momento del

accidente, siendo frecuente el empleo de plantas medicinales (Abadía, 1977; Fonnegra &

Roldan, 1994; INS, 2012; Otero et al, 2001). En un estudio realizado por Otero et al. (2000

a), con diferentes comunidades rurales de los departamentos de Antioquia y Chocó en

Colombia, se colectaron un total de 75 plantas utilizadas por los chamanes de cada región

para el tratamiento de los envenenamientos causados por serpientes, se prepararon extractos

acuosos o etanólicos, y de éstas, cerca del 50% mostraron neutralización (moderada o alta)

del efecto hemorrágico inducido por el veneno de B. asper, y un 16% de ellas, inhibieron el

efecto letal del veneno (Otero et al, 2000b, c).

Estudios etnobotánicos del uso de plantas para el tratamiento de la mordedura de serpiente,

han mostrado interesantes resultados y en consecuencia, es posible contar con un número

16

importante de plantas de diferentes familias, potencialmente inhibidoras de los efectos

tóxicos del veneno de B. asper (Castro et al,. 1999; Melo et al., 1994; Mors et al., 1989;

Núñez et al., 2005; Reyes-Chilpa et al., 1994); actividad que puede ser atribuida a la

presencia de principios activos propios de algunas plantas como 4-nerolidylcatechol y

Edunol (Núñez et al., 2005; Reyes-Chilpa et al., 1994), así como también los flavonoides,

que pueden quelar los átomos de zinc, requeridos por las metaloproteinasas del veneno de

las serpientes y que son las responsables de la actividad hemorrágica del veneno (Castro et

al., 1999).

De igual manera, diversas investigaciones han reportado la presencia de actividad anti-

hemorrágica, anti-letal, anti-desfibrinante y anti-miotóxica de los extractos de Eclipta

prostrata y el componente cumestano wedelolactona, que inhibe en pruebas in vitro el

efecto hemorrágico del veneno de Bothrops jararaca, Bothrops jararacussu y Lachesis

muta (Melo & Ownby, 1999), e inhibe los efectos letal y miotóxico de la especie Crotalus

durissus terrificus (Melo et al., 1994; Mors et al., 1989).

Renealmia alpinia (Rottb.) Maas, ha sido usada tradicionalmente para el tratamiento de la

mordedura de serpiente por los indígenas de las tribus Emberá-Katíos, pertenecientes a las

regiones de Antioquia y Chocó, en Colombia (Otero et al., 2000a).

Por lo anterior, el Programa Ofidismo/Escorpionismo de la Universidad de Antioquia se ha

interesado en profundizar en el estudio de esta especie botánica, con el fin de buscar una

alternativa terapéutica para el tratamiento por la mordedura de serpiente. En el año 2001 se

confirmó que R. alpinia tiene efectos anti-edematizantes, anti-hemorrágicos y

neutralizantes del veneno de Bothrops asper (mapaná, equis), tanto en modelos in vitro

como in vivo, constituyéndose en una potencial fuente de moléculas con importancia

farmacéutica (Otero, et al, 2000b, c; Núñez, et al, 2004).

Posteriormente, por fraccionamiento cromatográfico se estudiaron diferentes extractos

obtenidos con solventes de polaridad creciente, con el objeto de encontrar la fracción

responsable de la inhibición de los efectos tóxicos del veneno; además se logró comprobar,

17

en animales de experimentación, que R. alpinia posee actividad analgésica, lo cual podría

contribuir con el alivio del dolor que se produce durante una mordedura (Patiño A, et al.,

2012).

1.3 Renealmia alpinia (Rottb.) Maas, 1975: Pertenece a la familia Zingiberaceae,

caracterizada por tener especies botánicas de gran importancia farmacológica y alimenticia,

como el jengibre (Zingiber officinale) y el cardamomo (Elettaria cardamomum) que hacen

pensar en la riqueza que puede tener esta especie botánica; sin mencionar su gran belleza

que la destaca entre muchas, para usos ornamentales.

1.3.1 Nombres comunes y sinónimos

Sinónimos: Amomum alpinia Rottb. (Catálogo plantas vasculares de Antioquia)

Nombre comunes: Renealmia alpinia es conocida popularmente en Colombia con los

nombres de “guaiporé”, “matandrea”, “achira de monte”. Otros nombres comunes en

diferentes latitudes, según el idioma o la lengua, son: “huevos de sapo”, “sarandango”,

“abebe” (español), “haimonor” (huitoto), “conoba” (miraña), “mubai-kurugameku”

(muiname) (López, et al, 2007). En la tabla 1 se relacionan nombres comunes de Renealmia

alpinia usados en el Neotrópico.

Tabla Nº 1: Nombres comunes de R. alpinia según lengua o idioma, usados en el neotrópico

(Macía, 2003)

Nombre común País Referencia

Cardamomo Puebla (México) Villalobos y Contreras (1994)

Guaiporé (Curripaco) Colombia Acero (1979)

Ixquihit (nahua) Puebla (México) Martínez, Alfaro & al. (1995)

Mardigra Trinidad y Tobago Lans and Brown (1998)

Jazmín de monte Guatemala Standley & Steyermark (1952)

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Naiku (tikuna) Colombia Acero (1979)

Pintura negra Colombia Acero (1979)

Sictia (tukano) Colombia Acero (1979)

Sieunka (puinave) Colombia Acero (1979)

X'quijit (totonaco) Puebla (México) Villalobos y Contreras (1994)

Mususi Venezuela Gomez, 2002

1.3.2 Distribución geográfica y altitudinal

R. alpinia, es típica de bosques tropicales húmedos de tierras bajas (Villalobos C.G, 1994,

Standley and Steyermark, 1952, Acero, L.E.1979). Se distribuye desde México hasta Perú y

Brasil pasando por las Antillas, Guyana Francesa, Guyana, Surinam y Venezuela. Se

encuentra desde 50m hasta 900 m de altitud (Maas y Maas, 2007).

En Colombia, se encuentra en los departamentos de Antioquia y Chocó. Específicamente en

Antioquia, se ha encontrado en la región oriental, en los municipios de San Luis, San

Carlos y San Rafael. También ha sido reportada hacia el sur de país en Caquetá, Putumayo,

Guaviare y Amazonas, así como en los llanos Orientales.

1.3.3 Taxonomía y Descripción botánica

Planta herbácea de unos 2-6 m de alto, gregaria, de hojas simples, alternas, sin estipulas,

largo-lanceoladas, hasta 110 cm de longitud y 11 cm de ancho, nervadura paralela, vaina de

la hoja abierta, con lígula. Con inflorescencia racemosa, basal, 20-50 cm de longitud;

brácteas de la inflorescencia rosado-rojizas, raquis pardo-rojizo; flor tubular, amarilla o

rojiza. Fruto en cápsula, rojo cuando está inmaduro, negro al madurar, ovoide, 3-4 cm de

largo y 1.5-2 cm de diámetro, con numerosas semillas embebidas en una pulpa amarilla

(López, et al, 2007).

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1.3.4 Usos populares

R. alpinia ha sido usada por los indígenas del Chocó contra la mordedura de serpiente del

genero Bothrops (Otero, et al, 2000a); así mismo, en medicina tradicional R. alpinia ha sido

apreciablemente utilizada como febrífugo (antifebril, antipirético) y antiemético, para tratar

heridas y úlceras malignas (Martínez, 1995); además en Surinam es usada para la epilepsia

(Ruysschaert S. et al, 2009).

También es utilizada tradicionalmente para infecciones fúngicas (Ficker, C.E, 2003), para

la preparación de aceites a partir de semillas, como comestible (arilo de las semillas), contra

náuseas y vómitos (Ruysschaert S. et al, 2009); incluso algunas de sus partes, como los

trozos de las vainas foliares, son agregadas a los huecos de siembra de algunos cultivos

como el maíz, para evitar que sean comidas por roedores y aves (Macía, 2003). Así mismo,

la decocción de sus tallos, sus raíces o bien de la planta completa, es empleada para el

tratamiento de infecciones vaginales y para aliviar afecciones digestivas como la

indigestión (acción carminativa), la acidez y el dolor estomacal (COE, F.G, 2008).

Es una especie ornamental apreciada por sus inflorescencias rojo amarillentas y sus frutos

rojo-escarlata muy llamativos; la planta macerada y mezclada con agua se frota sobre el

cuerpo de los perros para mejorar su habilidad en la caza (López C et al.,2006) ,

igualmente, entre los usos etno-veterinarios, se encuentra que R. alpinia es usada en

Trinidad y Tobago para el tratamiento de los parásitos de gallinas y patos (Lans and

Browm, 1998) y contra la mordedura de serpiente en perros (Lans et al, 2001). La tabla N°2

muestra otros usos populares dados a esta especie botánica:

Tabla Nº 2. Otros usos populares de R. alpinia según diferentes países (Gómez-Betancur I &

Benjumea D, 2014)

País Parte usada Forma de uso y aplicación Referencias

Colombia Hojas y tallo Infusión, para el dolor de estómago Milliken W, Albert, B, 1996

Honduras Hojas y tallo Decocción, para limpiar la piel Lentz et al. 1998

20

Brasil Hojas y tallo Infusión, para el dolor de cabeza Milliken W, Albert, B, 1996

Surinam Hojas secas Infusión oral, utilizada como febrífugo Zhou et al, 1997

Honduras Fruto fresco Utilizado como alimento Lentz, D. 1993

Colombia Rizomas Decocción oral, para la mordedura de

serpiente Otero et al, 2000

Colombia Rizomas secos Infusión, para la mordedura de serpiente Otero et al, 2000

1.3.5 Actividades farmacológicas

R. alpinia ha sido escasamente estudiada desde el punto de vista farmacológico. Se ha

demostrado que tiene propiedades tales como: antiedematizante, antihemorrágica y

neutralizante del veneno de Bothrops atrox-asper (mapaná equis) (Otero, et al, 2000c);

igualmente, posee actividad antimalárica y leishmanicida (Valadeau C, 2009). Se ha

comprobado mediante estudios de citotoxicidad que los rizomas de R. alpinia causan un

sustancial efecto antiproliferativo de células tumorales, convirtiéndose en una planta de

gran interés farmacéutico contra el cáncer (De Mesquita, M.L., 2009).

1.3.6 Principios activos

Según la revisión realizada por Gómez-Betancur & Benjumea (2014), R. alpinia se

caracteriza por su rico contenido de flavonoides, entre los cuales se han aislado

especialmente flavanonas y chalconas, compuestos derivados de la ruta del ácido

shikímico, que han demostrado ser biológicamente muy activos. En un estudio para evaluar

el efecto del extracto de etanol y las fracciones obtenidas a partir de R. alpinia en el veneno

de serpiente B. asper, las fracciones muestran una presencia predominante de cumarinas.

Los esteroides, carotenoides, monoterpenos, diterpenos (diterpenos labdano) y

sesquiterpenos se han encontrado en las hojas de R. alpinia, muchas de las cuales aún no se

han dilucidado o caracterizado (Lognay et al, 1991; Yang et al, 1999). En cuanto a los

21

aceites esenciales, un gran número de componentes en las hojas, tallos y frutos de R.

alpinia han sido identificados.

La composición fitoquímica de R. alpinia cuenta con la presencia de flavonoides,

diarilheptanoides, y kavalactonas (Gómez-Betancur et al, 2015).

22

Hipótesis y Objetivos

23

2.A HIPÓTESIS

Renealmia alpinia tiene compuestos con actividades analgésica e inhibitoria de los efectos

tóxicos producidos por el veneno de la serpiente Bothrops asper (“mapanà”)

2.B OBJETIVOS

Con los antecedentes mencionados, se considera que la búsqueda de metabolitos

secundarios de la especie Renealmia alpinia utilizada en la medicina tradicional de

Colombia, para el tratamiento de la mordedura de serpiente, se exhibe como una excelente

estrategia para disminuir los efectos tóxicos del veneno de la serpiente Bothrops asper y

aportar nuevo conocimiento en torno a nuevos coadyuvantes para el tratamiento del dolor y

del accidente ofídico.

Objetivo general

Evaluar la actividad analgésica y la inhibición de los efectos tóxicos del veneno de

Bothrops asper por los extractos y compuestos aislados de hojas de Renealmia

alpinia, obtenida de forma silvestre.

Objetivos específicos

Aislar y purificar algunos metabolitos secundarios de hojas de R. alpinia, con el fin

de realizar una identificación estructural de los mismos.

Determinar la seguridad de los compuestos aislados de R. alpinia, mediante pruebas

de toxicidad in vivo e in vitro.

24

Comprobar las propiedades inhibitorias de los efectos tóxicos del veneno de B.

asper, por los extractos y compuestos aislados de R. alpinia, al ser capaces de

inhibir las actividades coagulante, hemolítica y proteolítica in vitro del veneno de

Bothrops asper.

Determinar la actividad analgésica de extractos y compuestos aislados de R. alpinia,

en modelos de experimentación in-vitro e in-vivo.

25

Estudio Estudio dirigido a la

búsqueda de compuestos fenólicos

de Renealmia alpinia

Hojas de Renealmia alpinia

26

3. ESTUDIO DIRIGIDO A LA BÚSQUEDA DE COMPUESTOS FENÓLICOS

DE Renealmia alpinia

3.1 Materiales y Métodos

3.1.1 Identificación y recolección de la especie Renealmia alpinia

El material vegetal utilizado en este estudio (hojas) se colectó durante febrero de 2011en la

vereda Dantas, municipio de San Rafael, Oriente de Antioquia - Colombia, ubicada a 1000

m.s.n.m. Fue identificado por el Profesor Francisco Roldan, del Instituto de Biología de la

Universidad de Antioquia; un espécimen fue depositado en el Herbario de la Universidad

de Antioquia (número de voucher 176395).

3.1.2 Preparación del Material vegetal y Extracto

Las hojas de Renealmia alpinia frescas fueron troceadas y secadas en estufa con circulación

forzada de aire a 37ºC durante 48 horas. Posteriormente se procedió a la pulverización

mecánica del material vegetal seco en un molino. El material vegetal seco y molido, se

depositó en recipientes herméticos hasta su uso.

Para el estudio fitoquimico y los ensayos farmacológicos, se preparó un extracto de

diclorometano a partir de 1500 g de material vegetal, mediante una extracción continua con

diclorometano CH2Cl2 (3 x 3 L) a temperatura ambiente. Posteriormente, el solvente fue

eliminado usando un rotaevaporador Laborota-4000 efficient Heidolph, y el extracto se

almacenó a 4 °C hasta su uso. El rendimiento fue de 74,0 g, correspondiente a 4,93%.

3.2 Técnicas cromatográficas:

3.2.1 Cromatografía en capa fina (CCF / TLC):

27

Se usaron cromatofolios TLC Silica gel 60 F254 de la casa MERCK, de 0.25 mm de espesor,

con indicador de luminiscencia a 254 nm. Se utilizaron como eluyentes n-hexano,

diclorometano, acetato de etilo, cloroformo, metanol, y mezclas de éstos en diferentes

proporciones. Para el revelado de las placas, se utilizó: oleum (solución formada por 4% de

H2SO4, 80% de CH3COOH, 16% de H2O) y posteriormente calentados a 110ºC durante

algunos minutos, solución de anisaldehido, solución de vainillina.

3.2.2 Cromatografía en capa fina preparativa (CPCF):

Se usaron placas de (20 x 20 cm) de 2 mm de espesor de Silica gel 60 F254 de la casa

MERCK, sembrándose entre 40 y 50 mg de producto en cada una de ellas usándose para la

elución diferentes mezclas de disolventes. La detección de los productos sobre las placas se

realizó por fluorescencia con luz ultravioleta a 254 y/o 360 nm, o bien aplicando óleum

sobre el borde, después de proteger convenientemente el resto de la placa con una lámina

de vidrio y posterior calentamiento de la zona tratada.

3.2.3 Cromatografía en columna preparativa (Flash):

La cromatografía “Flash” es un método rápido y económico para la separación de mezclas

que no requieren alta resolución y se prepara de igual forma que la columna seca. Para las

columnas secas y húmedas se empleó gel de sílice 0.063-.0200 mm de diámetro de la casa

MERCK. Para las columnas húmedas se usó SEPHADEX LH-20 de la casa PHARMACÍA

FINE CHEMICALS. Las columnas cromatográficas secas se montaron introduciendo

lentamente gel de sílice por el extremo superior de la columna y aplicando posteriormente

vacío por el extremo inferior. Una vez preparada la columna se fue añadiendo el eluyente

elegido, que se encontraba en un balón acoplado a la columna y al vacío. Se aplicó la

presión conectando el vacío a la llave. Se procedió a recoger las fracciones, cuyo volumen

dependía de la cantidad y de las características de la muestra adsorbida.

28

Figura 3. Cromatografía en columna preparativa de una fracción del extracto de diclorometano de

hojas de Renealmia alpinia. (Laboratorio 14 Instituto Universitario de Bioorgánica – IUBO, La

Laguna, Tenerife, España).

3.2.4 Cromatografía líquida al vacío (CLV / VLC):

En la realización de las columnas cromatográficas se empleó gel de sílice fina (0.063–0.200

nm de diámetro) de la empresa Macherey-Nagel. Las columnas se montaron aplicando

vacío, mientras se cargaba lentamente con gel de sílice. La mezcla a resolver se colocó en

la parte superior de la columna, adsorbida en gel de sílice gruesa (0.2–0.5 nm de diámetro)

de la empresa Merck. Se aplicó vacío, para proporcionar un aumento en la velocidad del

flujo de la fase móvil y las fracciones se recogieron en un matraz de fondo redondo.

3.2.5 Cromatografía circular preparativa (Cromatotrón):

Cromatografía circular preparativa, funciona por efecto centrífugo. La muestra a separar se

aplica o inyecta cerca del centro de un disco giratorio recubierto con una fina capa de sílice

29

gel. La elución por disolvente forma bandas circulares de los componentes que se separan

del borde del rotor junto con el disolvente.

Figura 4. Cromatografía circular preparativa (Cromatotrón) de una fracción del extracto de

diclorometano de hojas de Renealmia alpinia (Laboratorio 14 Instituto Universitario de Bioorganica

– IUBO, La Laguna, Tenerife, España).

3.2.6 Cromatografía en Capa Delgada de Alta Definición (HPTLC):

Los extractos se prepararon pesando 300 mg de material seco y molido (R. alpinia) y

extrayendo con 3mL de metanol por 5 min en baño de agua caliente a 60°C. Se recuperaron

3 mL de extracto para el análisis. Se usaron placas de silica gel 60 F-254 pre-recubiertas

con soporte en aluminio (10x10cm, 250 µm de espesor; Merck, Alemania). Las muestras

fueron aplicadas con una microjeringa de 100µL (Hamilton-Bonaduz Schweiz, Camag,

Suiza), usando un sistema Linomat V (Camag, Suiza). Se aplicaron 20 µL de muestra en

bandas de 10 mm en las pistas de las placas. Posteriormente, las placas fueron desarrolladas

en una cámara de vidrio vertical (20x10 cm; Camag, Muttenz, Suiza) (figura 6), usando dos

fases móviles diferentes: (1) Tolueno:Eter 1:1 y saturada con 10% ácido acético. (2)

30

Acetato etilo-acido fórmico- ácido acético glacial - agua: 100:11:11:26. (3) Hexano-

Acetato de etilo: 8:2.

Se aplicaron diferentes tiempos de optimización para la saturación de la cámara a

temperatura ambiente (25±2°C). La distancia cubierta por el frente de solvente fue de 9 cm.

Después del desarrollo, las placas fueron secadas y los componentes se visualizaron por

irradiación de energía a diferentes longitudes de onda UV.

Todas las mediciones fueron operadas por el software winCATS versión 1.4.4.6337

(Camag, Muttenz, Suiza). Luego, las placas fueron derivatizadas con los siguientes

reveladores para permitir la visualización de los componentes: (1) Hidróxido de Potasio

etanólico al 10%, (2) NP Metanólico al 1% y PEG etanólico al 5%. Los análisis fueron

llevados a cabo por duplicado.

Figura 5. Equipo para Cromatografía en Capa Delgada de Alta Definición (HPTLC) del Grupo de

Investigación en sustancias Bioactivas (GISB) de la Universidad de Antioquia.

3.3 Técnicas experimentales:

3.3.1 Espectroscopia: Resonancia Magnética Nuclear (RMN)

31

Espectros de RMN 1H,

13C y bidimensionales se realizaron en el espectrómetro BRUKER

AMX 300 (300 MHz) y en BRUKER AVANCE 400, 500 y 600 (MHz) utilizando

preferiblemente cloroformo deuterado CDCl3 como disolvente si los productos son solubles

en este, también se empleó Acetona y Metanol deuterados y con TMS como referencia

interna. Se realizaron experimentos homonucleares (COSY) y heteronucleares (HMQC y

HMBC) para la asignación absoluta de las moléculas. Los valores de desplazamiento

químico (δ) se expresan en ppm y los de las constantes de acoplamiento (J) se expresan en

Hz.

3.4 Aislamiento y purificación de metabolitos de Renealmia alpinia

3.4.1 Fraccionamiento cromatográfico del extracto de diclorometano

Con el extracto de diclorometano previamente obtenido (20 g), se realizó una

Cromatografía Líquida de Vacío (VLC) , eluyendo secuencialmente con mezclas de

solventes de polaridad creciente (3:1, 1:1, 1:3) así: n-hexano:diclorometano,

diclorometano:acetona y acetona:metanol, con gradientes de 1 L cada uno, sucesivamente,

para obtener fracciones 1 a 13, estas fracciones se combinaron con base en monitoreo

realizado por TLC para resultar ocho fracciones principales: 1 (0,125 g), 2 (0,471 g), 3 (1,9

g), 4 (3,0 g), 5 (1,0 g), 6 (7,0 g), 7 (1,6 g), 8 (1,6 g).

A continuación se exponen los resultados obtenidos del estudio fitoquímico de Renealmia

alpinia. Después de realizar la VLC y agrupar las fracciones en ocho, se llevó a cabo lo

siguiente:

La fracción 4 (3,0 g) se aplicó a una columna de gel de sílice, eluyendo con n-

hexano: diclorometano (6:4) para obtener las subfracciones 4-1 a 4-4. La

subfracción 4-3 (1,8 g) se recristalizó usando acetato de etilo-metanol

proporcionando cristales incoloros del compuesto F-1 (1,3 g).

La fracción 5 (1,0 g) se sometió a una columna de gel de sílice, eluyendo con n-

hexano: diclorometano (6: 4) para obtener subfracciones 5-1 a 5-9. La subfracción

32

5-2 (0,075 g) se aplicó a una columna de Sephadex LH-20 se eluyó con una mezcla

cloroformo: metanol 1:1, y el compuesto F-2, (0,008 g) se separó en forma de

cristales incoloros.

La fracción 6 (6 g) se recristalizó usando metanol para dar cristales de color

naranja del compuesto F-3 (0,5 g). La parte líquida de la fracción 6 se re-fraccionó

por cromatografía líquida de vacío (VLC) utilizando diferentes mezclas de

disolventes, eluyendo secuencialmente con n-hexano: diclorometano (3: 1,1: 1,1: 3),

diclorometano: acetato de etilo (3: 1, 1: 1, 1: 3), y acetato de etilo: metanol (3: 1, 1:

1, 1: 3) con gradientes cada uno de 0,5 L, sucesivamente, para obtener

subfracciones 6.1 a 6.10. La subfracción 6.6 (5,0 g) se aplicó a una columna de gel

de sílice, eluyendo con n-hexano: acetona (8:2) para obtener subfracciones de 6.6.1

a 6.6.20. La subfracción 6.6.10 (0,720 g) se aplicó a una columna de gel de sílice,

eluyendo con n-hexano: acetato de etilo (6: 4) para obtener fracciones de 6.6.10-1 a

6.6.10-5. La subfracción 6.6.10.4 (0,5 g) se aplicó a una columna de Sephadex LH-

20, eluyendo con cloroformo: metanol (1: 1) para obtener el compuesto F-4 (0,021

g). La subfracción 6.6.13 se aplicó a una columna de gel de sílice y resultaron

cristales incoloros del compuesto D-1 (0,7 g).

La fracción 7 (1,5 g) se aplicó a una columna de gel de sílice, eluyendo con n-

hexano: acetona (7: 3) para obtener subfracciones 7.1 a 7.4. Desde 7-3 y después de

la evaporación del disolvente, se aislaron 12 mg del compuesto K-1.

Posteriormente se obtuvo el compuesto D-2 (1,5 mg) a partir del residuo de la

subfracción 6.6.10.4 (0,04 g) se sometió a una Cromatografía en placa preparativa

usando como fase móvil n-hexano:acetato de etilo 6:4.

El F-5 (1,0 mg) se obtuvo a partir de la fracción 6, subfracción 6.8 mediante

Cromatotrón (cromatografía preparativa circular) utilizando como fase móvil

diclorometano: metanol 9,5:0,5.

33

A partir de la fracción 8, subfracción 8.9, se obtuvo el compuesto S-1 (5,0 mg). Se

sometió a una columna en gel de sílice con una mezcla de diclorometano: metanol

9:1 y posteriormente se termina de fraccionar mediante Cromatotrón (cromatografía

preparativa circular) utilizando como fase móvil diclorometano: metanol 9,5:0,5.

Las estructuras de los nueve (9) productos aislados de R. alpinia fueron elucidadas

mediante técnicas espectroscópicas de RMN 1H y

13C (Resonancia Magnética Nuclear de

protón y carbono), incluyendo experimentos homonucleares, COSY (Correlated

Spectroscopy) y ROESY (Rotating Frame Overhauser Effect) y heteronucleares, HSQC

(Heteronuclear Single Quantum coherente) y HMBC (Heteronuclear Multiple Bond

Correlation), así como mediante espectrometría de masas de baja (EM) y alta resolución

(EMAR).

Por otra parte, y debido a que todas las estructuras de los compuestos eran conocidas, estas

fueron establecidas con base en sus datos físicos y espectroscópicos y se compararon los

mismos con los existentes en la bibliografía química.

Los nueve (9) metabolitos aislados, han sido agrupados y denominados de acuerdo a la

similitud de sus estructuras químicas, para facilitar su estudio y discusión de la siguiente

manera:

D: Diarylheptanoides

F: Flavonoides

K: Kavalactonas

S: Saponinas

Tabla Nº3. Rendimiento de las fracciones obtenidas de Renealmia alpinia

Nº fracción Peso (gr) Porcentaje de rendimiento

34

1 0,13 0,63

2 0,47 2,36

3 1,90 9,50

4 3,00 15,00

5 1,00 5,00

6 7,00 35,00

7 1,60 8,00

8 1,60 8,00

3.5 Resultados y discusión

3.5.1 Flavonoides

Tras repetidas cromatografías del extracto de diclorometano de las hojas de R. alpinia,

como se indica en el numeral 3.1.3, se aislaron cinco flavonoides, que se denominaron de

F-1 a F-5, todos compuestos conocidos reportados en la bibliografía química. Los

flavonoides aislados se agruparon en función del grado de oxidación del anillo C de benzo-

γ-pirona.

Teniendo en cuenta dicha consideración, el producto que se denominó 2',6'-Dihydroxy-4'-

methoxychalcone (Hu et al, 2006) (F-2), se caracteriza por poseer un esqueleto de

chalcona; los productos denominados 5-hydroxy-7-methoxyflavanone (González et al,

1989) (F-1), naringenin 7-methyl ether (Agrawal et al, 1989) (F-3), naringenin 7,4'-

dimethyl ether (Iwu and Chiori, 1984) (F-4) y 3'4',5-Trihydroxy-7-methoxyflavanone

(Abdel et al 2003) (F-5), tienen un esqueleto de flavanona.

5-hydroxy-7-methoxyflavanone (Pinostrobin) (F-1): El compuesto fue aislado como

cristales blancos, corresponde a la formula molecular C16H14O4 y fue corroborada su

identificación con base en los datos espectroscópicos reportados en la literatura (González

et al, 1989). La estereoquímica absoluta para la flavanona F-1, se encontró que era 2S

35

comparando el valor de rotación específica de muestra aislado (-48,7 °; c 0,41, CHCl3) con

el valor reportado por Kinghorn (-57,5 °; c 0,80, CHCl3) (Su et al, 2003).

Figura 6. (F-1), 5-hydroxy-7-methoxyflavanone (Pinostrobin)

Tabla Nº 4. Datos de RMN-1H, RMN-

13C, HSQC y HMBC (300 MHz) de F-1

Protón 1H (δ) m (J Hz) HSQC,

13C(δ) HMBC (principales)

H-2 5.49 dd (3.0, 12.9) 79.27 d C-2

H-3a 3.14 dd (12.9, 17.1) 43.42 t C-3

H-3b 2.86 dd (3.3, 17.1) 195.81 s C=O

164.19 s C-5

H-6 6.13 d (2.1) 95.19 s C-6

168.03 s C-7

H-8 6.11 d (2.1) 94.31 d C-8

162.83 s C-9

H-2` 7.48 M 103.19 s C-10

H-3` 7.48 M 138.42 s C-1’

H-4` 7.48 M 126.18 d C-2’

H-5` 7.48 M 128.92 d C3’

H-6` 7.48 M 128.92 d C4’

Me-7

OH-5

3.86

12.07

s

s

128.92 d

126.18 d

55.73 c

C5’

C6’

C-7 (OCH3)

[

C

a

p

t

e

l

a

a

t

e

n

c

i

ó

n

d

e

l

o

s

l

e

c

t

o

r

e

s

36

2',6'-Dihydroxy-4'-methoxychalcone (Pinostrobin-Chalcona) (F-2): el compuesto fue

aislado como cristales color naranja, corresponde a la formula molecular C16H14O4 y fue

corroborada su identificación con base en los datos espectroscópicos reportados en la

literatura (Hu et al, 2006). La estereoquímica relativa del doble enlace en el compuestos F-2

se determinó como E basado en el acoplamiento de valores constantes y la comparación

con los valores publicados (Hu et al, 2006).

Figura 7. (F-2) 2',6'-Dihydroxy-4'-methoxychalcone (Pinostrobin-Chalcona)





H-2 7.44 dd (2.1, 4.95) 138.97 s

105.31 s

C-1

C-2

H-3 7.46 dd (1.8, 4.95) 164.59 s

127.47 s

C-3

C-4

H-4 7.46 dd (1.8, 4.95) 192.59 s C=O

H-5 7.72 dd (1.8, 6.3) 130.15 s C-5

H-6 7.72 dd (2.4, 6.3) 128.32 s C-6

37

135.57 s C- α

H-α

H-β

8.27

7.81

d (15.9)

d (15.6)

142.10 d C- β

162.83 s C-1’

H-3’ 6.05 s 105.31 s C-2’

H-5’ 6.05 S 93.73 d C-3’

Me-7 3.83 S 166.41 s C-4’

OH-5 12.08 S 93.73 d C-5’

166.41 s C6’

54.99 c C-4 (OCH3)

Naringenin 7-methyl ether (Sakuranetin) (F-3): El compuesto fue aislado como cristales

blanquecinos, corresponde a la formula molecular C16H14O5 y fue corroborada su

identificación con base en los datos espectroscópicos reportados en la literatura (Agrawal et

al, 1989). El compuesto F-3 se aisló en forma de una mezcla racémica. Una búsqueda en la

literatura demostró que la mayoría de las flavanonas aisladas de fuentes naturales tienen la

configuración absoluta 2S, que está de acuerdo con los resultados presentados (Su et al,

2003; Yoshikawa et al, 1998).

Figura 8. (F-3) Sakuranetin (Naringenin 7-methyl ether)



[

C

a

p

t

e

l

a

a

t

e

n

38



H-2 5.48 dd (2.7, 12.9) 79.15 d C-2

H-3a 2.76 dd (3.0, 17.1) 42.59 t C-3

H-3b 3.21 dd (12.9, 17.1) 196.76 s C-4 C=O

H-6 6.04 d (2.1) 164.10 s C-5

H-8 6.05 d (2.1) 93.67 s C-6

H-2’ 6.90 d (8.7) 167.96 s C-7

H-3’ 7.39 d (8.4) 94.57 d C-8

H-5’

H-6’

7.42

6.93

d (8.4)

d (8.7)

163.30 s C-9

Me-7

OH-5

OH-4

3.85

12.15

8.64

s

s

s

102.84 s

129.74 s

128.16 d

115.30 d

C-10

C-1’

C-3’, C5’

C2`, C6`

157.87 d

55.73 c

C4’

C7(OCH3)

Naringenin 7,4'-dimethyl ether (F-4): el compuesto fue aislado como cristales color

blanco, correspondió a la formula molecular C17H16O5 y fue corroborada su identificación

con base en los datos espectroscópicos reportados en la literatura (Iwu and Chiori, 1984).

La estereoquímica de la flavanona F-4 se supone que es S por las consideraciones

biogenéticas.

39

Figura 9. (F-4) Naringenin 7,4'-dimethylether (Sakuranetin 4'-methyleter)





H-2 5.41 dd (3.0, 15.0) 79.05 d C-2

H-3a 2.81 dd (3.0, 17.1) 43.24 t C-3

H-3b 2.86 dd (12.9, 16.8) 196.08 s C=O

H-6 6.09 d (2.4) 164.17 s C-5

H-8 6.12 d (2.4) 94.26 d C-6

H-2’ 7.0 d (9.0) 168.0 s C-7

H-3’ 7.43 d (9.0) 95.12 d C-8

H-5’

H-6’

7.0

7.43

d (9.0)

d (9.0)

162.93 s

103.18 s

C-9

C-10

Me-7

Me-4’

OH-5

3.85

3.88

12.07

S

s

s

130.41 s

114.26 d

127.77 d

128.16 d

C-1’

C-2’

C-3’

C-5’

114.26 d

55.71

C6’

C-4’ (OCH3)

55.71

160.08

C-7 (OCH3)

C4`

[

C

a

p

t

e

l

a

a

t

e

n

c

i

ó

n

d

e

l

o

s

l

e

c

t

o

r

e

s

m

e

d

i

a

n

t

e

40

3'4',5-Trihydroxy-7-methoxyflavanone (F-5): corresponde a la formula molecular

C16H14O6 y su identificación fue corroborada con base en los datos espectroscópicos

reportados en la literatura (Abdel et al 2003).

Figura 10. (F-5) 3'4',5-Trihydroxy-7-methoxyflavanone (Sterubin)





H-2 5.43 dd (3.7, 12.0) 78.09 d C-2

H-3a 3.17 dd (15.2, 18.0) 41.54 t C-3

H-3b 3.20 dd (15.2, 18.0) 195.66 s C=O

H-6 6.04 d (2.8) 162.95 s C-5

H-8 6.07 d (2.8) 92.52 d C-6

H-2’ 7.04 d (1.7) 166.82 s C-7

H-5’ 6.90 d (8.0) 93.38 d C-8

H-6’ 6.90 dd(8.0) 162.16 s

101.72 s

C-9

C-10

Me-7

OH-5

3.87

12.07

S

s

129.33 s

112.75 d

C-1’

C-2’

41

OH-3’

OH-4’

s

s

144.52 d

144.12 d

114.03 d

C-3’ (OH)

C-5’

C-6’

117.17 d C-4’ (OH)

166.82 d C-7 (OCH3)

3.5.2 Diarylheptanoides

Se aislaron dos Diarylheptanoides, que se denominaron D-1 y D-2, ambos compuestos

conocidos reportados en la bibliografía química. El producto que se denominó 5-

Heptanediol, 1,7-diphenyl (Kuroyanagi, et al, 1983) (D-1), y el compuesto 1-(4-

Hydroxyphenyl)-7-phenyl-(4E)-4-hepten-3-one (Suksamrarna et al, 2008) (D-2), ambos se

caracterizan por poseer esqueleto de Diarylheptanoide lineal.

5-Heptanediol, 1,7-diphenyl (D-1): correspondió a la fórmula molecular C19H24O2 y su

identificación fue corroborada con base en los datos espectroscópicos reportados en la

literatura (Kuroyanagi, et al, 1983).

Figura 11. (D-1) 5-Heptanediol, 1,7-diphenyl (Yashabushidiol)


13C, HSQC y HMBC (300 MHz) de D-1



1

2 3

4 5

6

7 2´

3´

4´ 5´

3´´

4´´ 5´´

42

H-4 1.57 t (12.6) 33.05 t C-1, C-7

H-2, H-6 1.75 dd (7.8, 15) 41.20 t C-2, C-6

H-1, H-7 2.70 m 45.70 t C-4

H-3, H-5 3.84 t (12.3) 68.68 d C-3, C-5

Arom protons 7.19 M 126.70 d Arom

129.70 d Arom

129.46 d Arom

143.70 s

C-1’, C-1’’

1-(4-Hydroxyphenyl)-7-phenyl-(4E)-4-hepten-3-one (D-2): corresponde a la fórmula

molecular C19H20O2 y su identificación fue corroborada con base en los datos

espectroscópicos reportados en la literatura (Suksamrarna et al, 2008).

Figura 12. (D-2) 1-(4-Hydroxyphenyl)-7-phenyl-(4E)-4-hepten-3-one (D-2)


13C, HSQC y HMBC (500 MHz) de D-2



43

H-1 2.87 d (7.6) 29.24 t C-1

H-2 2.83 d (6.7) 34.15 t C-6

H-4 6.12 d (15.9) 34.41 t C-7

H-5 6.84 dd (15.9) 41.98 t C-2

H-6 2.55 dd (7.0) 115.27 2xd C-3’, C-5’

H-7 2.80 t (7.4) 126.24 d C-4’’

H-2’, H-6’ 7.07 d (8.5) 128.34 2xd C-2’’, C-6’’

H-3’, H-5’

H-2’’, H-6’’

H-3’’, H-5’’

H-4’’

6.77

7.20

7.28

7.23

d (8.5)

d (7.4)

d (7.4)

d (7.4)

128.53 2xd

129.50 2xd

130.73 d

133.41 s

C-3’’, C-5’’

C-2’, C-6’

C-4

C-1’

OH

4.73

S

140.68 s

146.35 d

153.80 s

199.70 s

C-1’’

C-5

C-4’

C-3

3.5.3 Kavalactonas

Tras repetidas cromatografías del extracto de diclorometano de hojas de R. alpinia, se aisló

una kavalactona, compuesto conocido y reportado en la literatura (Orapin Ch et al, 2005),

identificado como: 4-methoxy-6-[(E)-2-phenylethenyl]-2H-pyran-2-one. Se denominó

como K-1. La estereoquímica relativa del doble enlace en el compuesto K-1 se determinó

como E basado en el acoplamiento de valores constantes y la comparación con los valores

publicados (Orapin et al, 2005).

44

Figura 13 (K-1): 4-methoxy-6-[(E)-2-phenylethenyl]-2H-pyran-2-one (Desmethoxyyangonin).


13C, HSQC y HMBC (500 MHz) de K-1



OCH3 3.83 s 164.05 s C-2

H-3 5.50 d (2.2) 88.87 t C-3

H-5 5.95 d (2.2) 171.09 s C-4

H-7 6.58 d (16) 101.37 d C-5

H-11, H-12, H-13 7.37-7.34 m 158.64 s C-6

H-8 7.38 d (14.4) 118.63 d C-7

H-10, H-14 7.50 d (14) 135.82 s C-8

135.23 d

137.46 2xd

C-9

C-10, C-14

128.92 2xd

129.47 d

C-11, C-13

C-12

3.5.4 Saponinas

Se aisló el compuesto S-1 que corresponde a una Saponina de nombre: 3,5- β-Sitosteryl β-

D-glucoside (β-D-Glucopyranoside, (3β)-stigmast-5-en-3-yl), de fórmula molecular:

C35 H60 O6. Los datos espectroscópicos de RMN del compuesto están de acuerdo a los

reportados por Chadwick, et al,

2004).

45

Figura 14. 3,5- β-Sitosteryl β-D- glucoside.


13C, HSQC y HMBC (400 MHz) de 3,5- β-Sitosteryl β-D-

glucoside. C35H60O6



CH3

CH3

CH3

CH3

CH3

H11a

H1a, H2a

H28a, H15a, H12a

H23

H16a

H22

Me-21

H9

H15b

H28b

Me-29, 29

H3, H2a, H1b

H16b

H6, H7b

H12b, H11a, H11b

0.63

0.77

0.79

0.81

0.82

0.89

0.94

1.06

1.11

1.25

1.26

1.40

1.45

1.55

1.57

1.62

1.75

1.85

1.93

1.99

s

d (10)

d (10)

t (7.5)

s

m

m

m

m

m

m

m

m

m

m

m

m

m

m

dd (12.8, 3.0)

12.12

12.23

19.07

19.39

19.55

20.16

21.05

23.06

25.88

28.25

29.16

31.87

33.79

35.92

36.66

37.28

38.75

42.30

45.59

50.05

55.87

C18

C29

C21

C19

C26

C27

C11

C28

C15

C23

C16

C2, C25

C8

C7

C22

C20

C10, C1

C13

C24

C9

C17

H3, H1a, H1b 2.16 m 56.63 C14

46

H6, 3, 4a, 7b 2.49 ddm 61.53

70.54

C6’

C4’

H2a, H3, H4b 2.75 dd (13.1, 3.3) 73.90 C2’

-

3.97 M 77.15

77.18

77.40

C5’

C3

C3’

H4’, H6a’, H6b’ 4.20 dd (9.0, 5.4) 101.21 C1’

H1’, H3’ 4,22 dd (7.7, 9.2) 121.65 C6

H3’, H5’ 4.43 dd (9.0, 8.5) 140.88 C5

H-2’, H4’ 4.45 dd (9.2, 8.9)

H5’, H6’b

H5’, H6’a

4.46

4.87

dd (11.8, 5.4)

dd (11.8, 2.1)

H2’

H4b, 7a, 7b

4.90

5.32

d (7.7)

m

47

Estudio farmacológico

48

4. ESTUDIO FARMACOLÓGICO

El estudio farmacológico del extracto de diclorometano y de los compuestos aislados de

Renealmia alpinia abarcó inicialmente diferentes estudios de toxicidad (citotoxicidad y

toxicidad aguda); en segundo lugar comprendió el estudio de la inhibición de los efectos

tóxicos del veneno de Bothrops asper y de una toxina aislada del mismo, por extractos y

compuestos aislados de R. alpinia. Por ultimo incluyo el estudio de la actividad analgésica

de R. alpinia, como posible valor agregado a los efectos tóxicos, como es el dolor que se

produce en el sitio de la mordedura.

Todos los compuestos no fueron ensayados en modelos in vivo por razones de cantidad

disponible de cada uno.

4.1 Animales de experimentación

Los animales utilizados para los estudios in vivo de este trabajo fueron obtenidos del

Bioterio de la Sede de Investigación de la Universidad de Antioquia (SIU) y mantenidos de

acuerdo con las Directrices del Consejo Canadiense para el cuidado de los animales de

experimentación (Consejo Canadiense 1998) y en la Guía para el Cuidado y Uso de

Animales de Laboratorio del Instituto Nacional de Salud de los Estados Unidos (National

Research Council, 2011). Acta de aprobación del Comité de ética para animales de

experimentación No 76.

Ratones de la cepa Swiss, machos y hembras (nulíparas y no grávidas), entre 8 y 12

semanas de edad, con un peso de 20-25 g fueron utilizados después de un período de

adaptación de 3 días. La temperatura de las jaulas se mantuvo en 22°C (± 3°C). La

humedad relativa fue de al menos 30% y no superior a 70%, salvo durante la limpieza de la

jaula, la cual fue de 50-60%. La iluminación fue artificial, con fotoperiodo de 12 horas de

luz y 12 horas de oscuridad. Los animales se mantuvieron alojados en pequeños grupos del

mismo sexo hasta el momento de los experimentos.

49

Se empleó una dieta convencional de laboratorio combinada con un aporte ilimitado de

agua potable y estéril, los animales fueron alimentados con LabDiet 5010®. La dieta

administrada cubrió todas las necesidades nutricionales de la especie sometida a

experimentación.

Los indicadores de dolor en ratones se evaluaron como lo describe Morton y Griffiths

(1985) y Carstens y Moberg (2000). Si un animal presentó pérdida del 15% del peso

corporal, postura encorvada, pelaje áspero, y / o si no podia comer o beber, fué sacrificado

antes de la terminación del experimento planificado con una sobre exposición a vapores de

isoflurano. Cada parámetro tuvo una escala de 0 a 5. Luego, la puntuación total fué

determinada y la severidad del dolor se clasificó de la siguiente manera: 0-5: normal; 6-10:

se vigiló cuidadosamente, se consideraron analgésicos; 11-15: sufrimiento, se proporcionó

alivio, y observación con regularidad; y 16-20 Dolor severo, se consideró el sacrificio de

animales. Para todos los procedimientos de inyección, de medición y de recogida de sangre,

los animales fueron anestesiados con isoflurano.

4.2 Venenos

A partir de especímenes mantenidos en el Serpentario de la Universidad de Antioquia

(Medellín, Colombia) e incluidos en la colección COLBIOFAR 149, registrada ante el

Instituto de Investigaciones de Recursos Biológicos Alexander Von Humboldt, se obtuvo el

veneno por extracción manual de 40 ejemplares adultos sanos de la serpiente Bothrops

asper procedentes de diferentes regiones de Colombia. La mezcla se constituyó de esta

manera para disminuir el impacto que tiene la alta variabilidad. Esta mezcla homogénea,

una vez centrifugada a 2500 rpm durante 10 minutos a 4 °C es liofilizada y congelada a -

20 °C hasta su utilización.

50

4.3 Estudio de la Citotoxicidad sobre Células Murinas C2C12 (Mioblastos) y Células J-

774 (Macrófagos)

4.3.1 Método

En este estudio se evaluó la toxicidad sobre Células Murinas C2C12 (Mioblastos) y Células

J-774 (Macrófagos) de acuerdo al método descrito por Lomonte et al. 1999. Seis (6) de los

compuestos aislados de R. alpinia: F-1, F-2, F-3, F-4, D-1 y K-1, fueron empleados en dos

concentraciones de (100 µg/150 µl y 300 µg/150 µl). Los compuestos corresponden a tres

flavanonas, una chalcona, un diarylheptanoide y una kavalactona. El extracto de R. alpinia

ya había sido evaluado previamente sin presentar signos de citotoxicidad y por lo tanto no

se evaluó en esta oportunidad (Patiño et al, 2012).

Para ello, las células se crecieron en frascos de cultivo con el medio Dulbecco- Eagle

suplementado con suero fetal bovino al 10%, antibióticos y antimicóticos; en una atmósfera

humidificada, 5% de CO2 y a 37oC. Cuando se obtuvo un crecimiento confluente, las

células fueron colectadas y resuspendidas en el mismo medio de crecimiento y transferidas

a microplacas de 96 pozos. Una vez alcanzado el 90-100% de confluencia en cada uno de

los pozos (5-6 días para células C2C12 y 2-3 días para células J-774), se adicionaron

concentraciones variables de la muestra (0,02 a 10mg/100µl/pozo) diluidas en el medio con

suero fetal al 1% a cada pozo y se utilizó como controles el medio de cultivo sólo o

suplementado con 0,1% de Triton X-100 (para 0 y 100% de citotoxicidad,

respectivamente).

Después de 3 horas de incubación a 37ºC se verificó el estado general de las células y el

cultivo con microscopía de luz (microscopio invertido MOTIC) y se tomó una alícuota del

sobrenadante para determinar la liberación de la enzima Lactato Deshidrogenasa (LDH) en

las células dañadas, empleando un ensayo cinético (Wiener LDH-P UV). Los experimentos

se llevaron a cabo con tres replicas y tres repeticiones.

51

4.3.2 Resultados

Figura 15. Citotoxicidad en células C2C12 de 6 compuestos aislados: 5-hydroxy-7-

methoxyflavanone (F-1); 2',6'-Dihydroxy-4'-methoxychalcone (F-2); naringenin 7-methyl ether (F-

3), Naringenin 7,4'-dimethylether (Sakuranetin 4'-methyleter) (F-4), 5-Heptanediol, 1,7-diphenyl

(Yashabushidiol)(D-1),4-methoxy-6-[(E)-2-phenylethenyl]-2H-pyran-2-one (Desmethoxyyangonin)

(K-1).

Trito

n

Med

io/D

MSO

F-1

100

ug

F-1

300

ug

F-2

100

ug

F-2

300

ug

F-3

100

ug

F-3

300

ug

F-4

100

ug

F-4

300

ug

D-1

100

ug

D-1

300

ug

K-1

100

ug

K-1

300

ug

0

200

400

600

800

1000

***

*

F-1: Pinostrobin

F-2: Pinostrobin-chalcone

F-3: Sakuranetine

F-4: Sakuranetin 4'-methyleter

D-1: Yashabushidiol

K-1: Desmethoxyyangonin

Citotoxicidad celulas C2C12

Acti

vid

ad

(U

/L)

52

Figura 16. Citotoxicidad en células J-774 de 6 compuestos aislados: 5-hydroxy-7-

methoxyflavanone (F-1); 2',6'-Dihydroxy-4'-methoxychalcone (F-2); naringenin 7-methyl ether (F-

3), Naringenin 7,4'-dimethylether (Sakuranetin 4'-methyleter) (F-4), 5-Heptanediol, 1,7-diphenyl

(Yashabushidiol)(D-1),4-methoxy-6-[(E)-2-phenylethenyl]-2H-pyran-2-one (Desmethoxyyangonin)

(K-1).

4.3.3. Discusión

Las lecturas en las diferentes concentraciones para ambas líneas celulares, resultaron

similares a las del control negativo (medio/DMSO), lo cual indica que los compuestos

evaluados no causan daño a la membrana de las células sin importar las dosis evaluadas; es

decir el empleo de cualquiera de las dosis en la mayoría de los compuestos no impide la

viabilidad celular, ni la integración de la misma y por esta razón se debe descartar eventual

toxicidad a nivel celular. La figura 15, muestra lo descrito anteriormente, únicamente para

el compuesto F-3, a la mayor concentración (300 ug/150 ul), se observa cierto nivel de

toxicidad.

Trito

n

Med

io/D

MSO

F-1

100

ug

F-1

300

ug

F-2

100

ug

F-2

300

ug

F-3

100

ug

F-3

300

ug

F-4

100

ug

F-4

300

ug

D-1

100

ug

D-1

300

ug

K-1

100

ug

K-1

300

ug

0

200

400

600

800

1000 ***

F-1: Pinostrobin

F-2: Pinostrobin-chalcone

F-3: Sakuranetine

F-4: Sakuranetin 4'-methyleter

D-1: Yashabushidiol

K-1: Desmethoxyyangonin

Citotoxicidad células J774

Acti

vid

ad

(U

/L)

53

4.4. Evaluación de la Toxicidad aguda de compuestos aislados de Renealmia alpinia.

4.4.1 Método:

El ensayo de la toxicidad aguda se define como la evaluación de un síndrome tóxico

producido por la administración de una o de varias dosis (dos o tres veces, o en infusión

continua), en el transcurso de un día con un período de observación de hasta 14 días

(OECD Guideline for Testing of Chemicals, 1995). Esta evaluación determina la letalidad e

identifica los signos y síntomas producidos por sobredosis, fija las dosis adecuadas para los

estudios de toxicidad a largo plazo (Vogel, 2006), establece el tiempo en el que aparecen

los efectos tóxicos aditivos y brinda una información de la cinética toxicológica del

producto.

Los principales objetivos de este ensayo fueron, la detección de los niveles de tolerancia

aguda a los compuestos testeados y el establecimiento de la naturaleza de los síntomas de

toxicidad aguda.

La evaluación de la toxicidad aguda de dos compuestos aislados (Pinostrobin-chalcona y

Sakuranetina) de Renealmia alpinia se realizó siguiendo la Norma 423 de la Organización

para la Cooperación y el Desarrollo Económico (OCDE Guía N°423, 2001). Los datos

generales de las sustancias suministradas se presentan en la tabla 13.

Tabla Nº 13. Algunas características de los compuestos en estudio, aislados de R. alpinia

(Pinostrobin-chalcona y Sakuranetin).

Muestra A

Nombre

Pinostrobin-Chalcona

Masa molar 270 g/mol

Características organolépticas Cristales sueltos, color naranja

Muestra B

Nombre

Sakuranetina

Masa molar 286 g/mol

Características organolépticas Cristales sueltos, color blanco

54

4.4.1.1 Preparación de la dosis

Para el ensayo se utilizaron cuatro ratones por grupo, tres para evaluar los productos a

ensayar (tratamientos) y uno adicional al que se administró el vehículo en el cual fueron

diluidas (buffer de fosfatos, PBS) las muestras y sirvió como control negativo para realizar

las comparaciones estadísticas. A los grupos de tratamiento, se les administró la dosis

empleada en el ensayo (300 mg/Kg) de manera independiente y consecutiva con

verificación de la toxicidad en cada uno de ellos. En todos los casos, y de acuerdo a la

siguiente formula, se administró por vía oral, 1 ml de muestra por 40 g de peso del ratón

(ver tabla 14).

𝑋 = 1 𝑚𝑙 𝑣𝑒ℎí𝑐𝑢𝑙𝑜

40 𝑔 𝑟𝑎𝑡ó𝑛𝑥

12 𝑚𝑔 𝑠𝑢𝑠𝑡𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎

1 𝑚𝑙 𝑣𝑒ℎí𝑐𝑢𝑙𝑜𝑥

1000 𝑔 𝑟𝑎𝑡ó𝑛

𝐾𝑔 𝑟𝑎𝑡ó𝑛= 300

𝑚𝑔

𝐾𝑔

Los ratones se sometieron a un período de ayuno de seis horas previas al experimento, con

libre acceso al agua. Pasado este tiempo se administró por vía oral y con una sonda

orogástrica la dosis (tratamiento) correspondiente a su peso corporal; mientras que el grupo

control recibió únicamente el vehículo en el cual fue diluida la muestra (PBS). Una vez

administrada la muestra, se continuó con el ayuno durante una hora más, con el fin de

observar su respuesta y transcurrido este tiempo, se suministró a los ratones la dieta normal.

En las primeras 24 horas posteriores a la administración, los ratones fueron observados

cada 30 minutos durante la primera hora, luego cada 60 minutos hasta completar la cuarta

hora y posteriormente cada 240 minutos hasta finalizar el día. En los días subsiguientes, los

ratones se mantuvieron en observación durante un periodo de 14 días (por si ocurre retraso

en la muerte), evaluando diariamente el peso corporal, las respuestas por parte de los

animales frente a cada una de las dosis usadas, es decir, los signos de toxicidad, el tiempo

55

de aparición de éstos, la naturaleza, gravedad y duración de los efectos; así como también

la mortalidad.

4.4.1.2 Registros de toxicidad y mortalidad

Cada uno de los días del período de ensayo (14 días) se evaluaron los signos de toxicidad

macroscópicos relacionados con sistemas: nervioso central y somatomotor, autónomo,

respiratorio, cardiovascular, gastrointestinal, genitourinario, piel y pelaje,

membranas/mucosas y ojos. Estas observaciones realizadas, fuera de la cama de

alojamiento, en un ambiente normal y siempre a la misma hora, fueron complementadas

con una evaluación final de reactividad sensorial frente a estímulos tales como: visual,

propiocepción, presión con fuerza y actividad motora (IPCS, 1986; Tupper and Wallace

1980; Gad, 1982; Moser, et al, 1991).

4.4.1.3 Seguimiento del peso corporal

La determinación del peso corporal es un parámetro importante, pues se constituye en uno

de los indicadores más sensibles de perturbación de la homeóstasis. En esta evaluación se

registró el peso corporal diariamente como medida adicional de la toxicidad a nivel

sistémico.

4.4.1.4 Determinaciones en orina

Diariamente se evaluaron variables tales como: aspecto, color, cambios observables en el

volumen de excreción y presencia de sangre en ella.

4.4.1.5 Determinaciones macroscópicas de órganos en ratones.

56

Pasados los 14 días de observación, los animales fueron sacrificados en cámara con CO2. Y

se les realizó necropsia para determinar por inspección visual si habia signos de toxicidad

en órganos como la cavidad abdominal, hígado, riñones, estómago, glándulas suprarrenales,

testículos, epidídimo, útero, ovarios, timo, bazo, cerebro y corazón, según protocolo.

4.4.2 Resultados

No se presentó muerte o signos evidentes de toxicidad en ninguno de los animales en

estudio tratados con Pinostrobin-chalcona y Sakuranetin (F-2, F-3) (Tablas 14 y 15), hecho

que se corrobora con la ganancia de peso corporal (tabla 16 y figura 18) que si bien no es

estadísticamente significativo, sí es reflejo de la inocuidad de los compuestos analizados

(F-2 y F-3), pues una de las principales características de toxicidad es la pérdida en el peso

corporal.

Tabla Nº 14. Respuesta a la muestra administrada a cada grupo de animales a la dosis

administrada.

Grupos Toxicidad Evolución Muerte Día de la

muerte

Controles 0 N/A 0 N/A

C2H1 0 N/A 0 N/A

C2H2 0 N/A 0 N/A

C2H3 0 N/A 0 N/A

C2M1 0 N/A 0 N/A

C2M2 0 N/A 0 N/A

C2M3 0 N/A 0 N/A

C3H1 0 N/A 0 N/A

C3H2 0 N/A 0 N/A

C3H3 0 N/A 0 N/A

C3M1 0 N/A 0 N/A

C3M2 0 N/A 0 N/A

57

C3M3 0 N/A 0 N/A

Toxicidad = Número de animales que presenten signos de toxicidad

Evolución = Evolución temporal de los efectos tóxicos y la reversibilidad

Muerte: Número de animales muertos o sacrificados por razones compasivas

N/A = No aplica.

C2H: Pinostrobin-chalcona Hembra. C2M: Pinostrobin-chalcona Macho

C3H: Sakuranetin Hembra C3M: Sakuranetin Macho.

Tabla Nº 15. Determinación de las condiciones generales en cada uno de los sistemas orgánicos de

los animales de experimentación tratados con la muestra.

Sistema

orgánico Observación y examen

Signos comunes de

toxicidad Resultado*

Nervioso Central

y Somatomotor

Comportamiento Agresividad inusual, pesadez

y sedación. 0

Movimientos Temblor, ataxia, catatonia,

parálisis, convulsión. 0

Reactividad a varios

estímulos

Irritabilidad, pasividad,

anestesia, hiperestesia 0

Reflejos cerebrales y

espinales Ausencia de reflejo 0

Tono Muscular Rigidez o flacidez 0

Nervioso

Autónomo Medida de la pupila Miosis, midriasis 0

Respiratorio Ventanas de la nariz

Descarga (coloreado y no

coloreado) 0

Carácter y rata Bradipnea, disnea 0

Cardiovascular Palpación de la región

cardiaca

Latido o pulsación,

bradicardia, taquicardia,

arritmia

0

Gastrointestinal

Eventos Diarrea, constipación 0

Forma abdominal Flatulencia, contracción 0

Consistencia de las heces y Sin forma, negro o color 0

58

color arcilloso

Genitourinario

Vulva, glándulas mamarias Hinchazón 0

Pene Prolapso 0

Región del perineo Sucia 0

Piel y pelaje Color, turgencia e

integridad

Enrojecimiento, flacidez,

erupciones, piloerección 0

Membranas y

mucosas Boca y conjuntiva

Congestión, hemorragia,

cianosis, 0

Ojos

Párpados Ptosis 0

Globo ocular Exostalmus, nistagmus, 0

Transparencia Opacidad 0

Otros

Temperatura rectal o de la

piel Anormal, incrementada 0

Sitio de inyección Hinchazón N/A

Condiciones generales Postura anormal,

emancipación 0

N/A = No aplica

*Grados de severidad: Sin lesión = 0, leve = 1, moderado = 2 y grave = 3

Tabla Nº 16. Registro del peso corporal de los animales de experimentación, tratados con la dosis

de 300 mg/Kg de cada compuesto bajo estudio, durante 14 días.

Grupo/Dia 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 X±ES

Control 20,9 20,9 21,0 21,1 21,5 21,6 21,7 21,9 22,1 22,5 22,9 23,0 23,4 23,4 2,5

C2H1 20,6 20,6 21,0 21,0 21,0 21,1 21,4 21,4 22,7 22,6 23,4 23,6 24,7 24,7 4,1

C2H2 22,0 22,5 22,9 22,9 23,0 23,6 23,8 24,4 24,9 25,2 25,7 25,8 27,7 27,8 5,8

C2H3 19,9 20,1 20,0 20,1 20,1 20,1 20,4 21,0 21,2 22,0 22,2 22,5 23,3 23,3 3,4

Control 20,7 20,8 21,0 21,0 21,3 21,5 21,8 22,0 22,1 22,5 22,8 23,0 23,4 23,4 2,7

C2M1 19,1 19,7 21,4 21,7 22,9 24,8 25,4 27,1 28,0 29,4 29,4 29,5 29,9 29,9 10,8

C2M2 18,0 18,4 20,8 21,2 22,4 24,8 25,9 26,4 28,4 28,4 28,6 28,8 28,8 29,0 11

C2M3 21,7 21,9 22,9 22,9 23,6 25,1 25,3 26,3 26,6 28,3 28,4 28,4 28,6 28,6 6,9

59

Control 21,9 21,9 22,1 22,5 22,6 22,8 22,9 23,1 23,5 23,6 23,9 24,1 24,1 24,2 2,3

C3H1 18,0 18,4 19,9 20,7 21,7 22,3 22,7 24,0 24,0 24,7 24,7 25,1 25,6 25,6 7,6

C3H2 20,4 20,4 20,7 20,7 20,9 21,0 21,1 22,3 22,5 22,7 22,7 23,3 24,9 24,9 4,5

C3H3 21,3 21,4 21,7 21,9 22,0 22,7 22,7 22,9 23,0 23,5 24,0 24,1 24,3 24,4 3,1

Control 20,4 20,5 20,7 20,7 20,8 20,9 21,0 21,0 21,3 21,5 21,7 21,8 22,0 22,0 1,6

C3M1 19,1 19,8 21,3 22,3 24,6 25,9 27,1 28,0 28,8 30,3 29,7 30,0 29,9 30,1 11

C3M2 20,0 21,8 23,9 24,7 25,3 27,1 27,2 27,9 28,2 28,5 28,6 28,9 28,6 28,6 8,6

C3M3 21,0 21,4 23,1 23,9 25,9 26,5 27,4 27,8 28,1 28,8 28,9 29,0 29,1 29,1 8,1

Los valores representan el error estándar (X±ES) de cada uno de los grupos de ratones tratados con la muestra bajo estudio, a dosis de 300 mg/kg.

C2H: Pinostrobin-chalcona Hembra. C2M: Pinostrobin-chalcona Macho

C3H: Sakuranetin Hembra C3M: Sakuranetin Macho.

Figura 17. Ganancia de peso corporal de los animales de experimentación tratados con la dosis de

300 mg/Kg de cada compuesto bajo estudio, desde el inicio al final de la observación.

El aspecto y el color en la orina de cada uno de los animales empleados tanto en el grupo

control como en los tratamientos fue normal y no se encontraron cambios en el volumen de

excreción, ni presencia de hematuria en alguno de los grupos.

CONTR

OL

C2H

1

C2H

2

C2H

3

CONTR

OL

C2M

1

C2M

2

C2M

3

CONTR

OL

C3H

1

C3H

2

C3H

3

CONTR

OL

C3M

1

C3M

2

C3M

3

0

5

10

15

Difere

ncia

de p

eso

60

Las observaciones macroscópicas realizadas durante el sacrifico de los animales: parte

externa del cuerpo, incluyendo cavidad abdominal y su contenido: hígado, riñones,

glándulas suprarrenales, testículos, útero, ovarios, bazo, cerebro y corazón, no mostraron

daño visible o aparente en los órganos.

Figura 18: Observaciones macroscópicas realizadas después del sacrifico de los animales.

4.4.3 Discusión

La administración de una única dosis (300 mg/Kg) de Pinostrobin-chalcona y de

Sakuratenina, valorada durante 14 días de ensayo, no causó la muerte de ninguno de los

animales de experimentación empleados en los tratamientos o el control, ni se produjeron

signos aparentes de toxicidad que condujeran al sacrificio o el retiro de alguno de los

animales del estudio.

En cuanto al peso corporal no se presentaron cambios estadísticamente significativos con

relación al co

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