Estudio de las propiedades fisioquímicas de toxinas ...
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DE TOXINAS AISLADAS DE
KARWINSKIA HUMBOLDTIANA
QUE EN DPCIQTT AL BRADO IME MAESTRO EN CIEWCIAÖ
u m m
MONTERREY, N.L. ENERO DE 1990
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TM Z6658 FM 1990 MB
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M 3
\
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ESTUDIO DE LAS PROPIEDADES FISICOQUIMICAS
DE TOXINAS AIS-ADAS DE
Karvinskia humboldiiana
POR
Q . C . B . LAURA ESTHER MARTINEZ VILLARREAL
TESIS PRESENTADA A LA
FACULTAD DE MEDICINA
DE LA
UNIVERSIDAD AUTONOMA DE NUEVO LEON
COMO REQUISITO PARCIAL PARA
LA OBTENCION DEL BRADO DE
MAESTRO EN CIENCIAS
CON ESPECIALIDAD EN QUIMICA ANALITICA BIOMEDICA
MONTERREY, N . L .
ENERO DE 1990
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DRA. NOEMI WAKSMAN DE
PRESIDENTE
'of i -^ Ä
TORRES
DRA. MIRTHALA MORENO DE DE LA GARZA
SECRETARIO
EDCK PINEYRO LOPEZ
PRIMER VOCAL
DR. MARIO CESAR SALINAS CARMONA
SEGUNDO VOCAL
DRA HERMINIA SPE. MARTÍNEZ RODRIGUEZ
TERCER VOCAL
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ASESOR DE TESIS: DRA NOEMI WAKSMAN DE TORRES
DEPARTAMENTO DE FARMACOLOGIA Y TOXICOLÜGIA
FACULTAD DE MEDICINA
U . A . N . L .
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AGRADECIMIENTOS
D r . A l f r e d o P i f í e y r o López .
D i r e c t o r de l a F a c u l t a d de M e d i c i n a y
J e f e d e l Departamento de F a r m a c o l o g í a y T o x i c o l o g i a
de l a U . A . N . L .
Con adfli i rae i ón y r e s p e t o po r su apoyo p a r a l a cu1m inac i ón de
e s t e t r a b a j o .
D r a . Noemi Waksman de T o r r e s .
Mi s i n c e r o a g r a d e c i m i e n t o p o r su v a l i o s a a s e s o r í a y p o r
c o m p a r t i r sus c o n o c i m i e n t o s .
S r . R o g e r i o G o n z á l e z A l a n i s .
P o r su apoyo y e l a b o r a c i ó n d e l m a t e r i a l f o t o g r á f i c o de e s t a
t e s i s .
E s t a t e s i s se r e a l i z ó en p a r t e g r a c i a s a l apoyo económico de l a
SEP segCn c o n v e n i o # 86—01—371.
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A mis padree
Mauro y Rebeca l e s d e d i c o con amor e s t e t r a b a j o .
A mis hermanos
L u i s , M a r i o , Mar tha , Mauro, Thelma, R o g e l i o y Fe rnanda .
Con c a r i ñ o
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A mis compañeros y amigos
Por su apoyo
A mis maestros
Por sus enseñanzas
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INDICE
— A b r e v i a t u r a s 10
—In t roduce i ón 11
H i p ó t e s i s 22
O b j e t i v o 23
— M a t e r i a l y métodos 24
I > Métodos g e n e r a l e s 24
I I ) Obtenc ión de l a s t o x i n a s 26
I I I ) P u r e z a de l a s t o x i n a s . . . . 26
IV) E s t u d i o s f i s i c o q u í m i c o s 28
1) S o l u b i l i d a d 28
2) C o e f i c i e n t e de p a r t i c i ó n a p a r e n t e <Kpa)
1 i p i d o / a g u a 28
3) C o n s t a n t e de a c i d e z <K > . . 29 a
A) D e t e r m i n a c i ó n d e l pK^ aprox imado 30
B) Método e s p e c t r o f o t o m é t r i c o 30
C) Método de p a r t i c i ó n . . . 33
4) Degradac ión de l a s t o x i n a s en s o l u c i o n e s acuosas . 34
—Resul tados 36
I ) S o l u b i l i d a d 36
I I ) C o e f i c i e n t e de p a r t i c i ó n a p a r e n t e (Kpa) l í p i d o / a g u a . 36
I I I ) C o n s t a n t e de a c i d e z (K ) . 36 a
1) Método e s p e c t r o f o t o m é t r i c o 42
2) Método de p a r t i c i ó n 46
IV) Deg radac ión de l a s t o x i n a s en s o l u c i o n e s a c u o s a s . . . . 50
—Discus ión 65
—Conc lus iones 72
—Bibl i o g r a f l a * 73
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INDICE DE TABLAS
T a b l a I . S o l u b i l i d a d de T544, T514 y T496 en mg/ml 37
T a b l a l í a . C o e f i c i e n t e de p a r t i c i ó n a p a r e n t e íKpa)
1 i p i d o / a g u a de T544 38
T a b l a I l b . C o e f i c i e n t e de p a r t i c i ó n a p a r e n t e (Kpa)
l i p i d o / a g u a de T514 39
T a b l a I l e . C o e f i c i e n t e de p a r t i c i ó n a p a r e n t e <Kpa>
l i p i d o / a g u a de T496 40
T a b l a I I I . C á l c u l o d e l pK aprox imado 41 a
T a b l a IVa . C á l c u l o e s p e c t r o f a t o m é t r i c o d e l pK^ de T 5 4 4 . . . . 47
T a b l a IVb . C á l c u l o e s p e c t r o f o t o m é t r i c o d e l pK^ de T 5 1 4 . . . . 48
T a b l a IVc . C á l c u l o e s p e c t r o f o t o m é t r i c o d e l pK de T 4 9 6 . . . . 49 A
T a b l a V. Ecuac iones de v e l o c i d a d y de v i d a media 54
T a b l a V I . Tiempo de v i d a media de T544 y T514 57
T a b l a V I I . Tiempo de v i d a media de T49é> 61
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INDICE DE FISURAS
F i g u r a i . A r b u s t o de l a humboldtiana 12
F i g u r a 2 . D i s t r i b u c i ó n de l a K. humboldtiana en l a
R e p ú b l i c a Mexicana . 13
F igu ra 3. F ru to de la hurnboldtiana 14
F i g u r a 4 . T o x i n a s de l a humboldtiana 17
F i g u r a 5 . P o s i b l e s p r e c u r s o r e s o m e t a b o l i t o s de l a s t o x i n a s
a i s l a d o s d e l f r u t o de l a K. humboldiiana 18
F i g u r a 6 . Método m o d i f i c a d o de D r e y e r . . . . . 27
F i g u r a 7a . E s p e c t r o U V - V i s i b l e de l a T544 43
F i g u r a 7b. E s p e c t r o U V - V i s i b l e de l a T514 44
F i g u r a 7c. E s p e c t r o U V - V i s i b l e de l a T496 45
F i g u r a 8 . G r á f i c a de Kpa vs Kpa/CH+D
p a r a c a l c u l a r KD y 51
F i g u r a 9a . G r á f i c a s de Ln T544 vs t i e m p o . . . . 55
F i g u r a 9b . G r á f i c a s de Ln T514 vs t iempo 56
F i g u r a 10. Cromatograma de T514. E f e c t o d e l t iempo 58
F i g u r a 11. Cromatograma de T 5 1 4 . E f e c t o de l a t e m p e r a t u r a . . . 59
F i g u r a 12. G r á f i c a de Ln T496 vs t iempo a 2 5 ° C , pH2, l u z . . . . 60
F i g u r a 13. Cromatograma de T496 a d i f e r e n t e s pH 62
F i g u r a 14. Cromatograma de T496 a d i f e r e n t e s t i e m p o s . . . . . . . . 63
F i g u r a 15. G r á f i c a de Ln T496 vs t iempo a 7 0 ° C , pH2, l u z . . . . 64
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ABREVIATURAS
B /A Benceno /ace tona .
CCF C r o m a t o g r a f í a en capa f i n a .
EM E s p e c t r o de masas.
k C o n s t a n t e de v e l o c i d a d .
K Cons tan te de a c i d e z , a
KD C o e f i c i e n t e de d i s t r i b u c i ó n v e r d a d e r o .
Kpa C o e f i c i e n t e de p a r t i c i ó n a p a r e n t e .
fj F u e r z a i ó n i c a .
pK L o g a r i t m o n e g a t i v o de l a c o n s t a n t e de a c i d e z o b a s i c i d a d .
pK L o g a r i t m o n e g a t i v o de l a c o n s t a n t e de a c i d e z . ct 2
r C o e f i c i e n t e de c o r r e l a c i ó n .
Rf F a c t o r de r e t a r d o ,
rpm R e v o l u c i o n e s p o r m i n u t a .
SNP S is tema n e r v i o s a p e r i f é r i c o .
t í / 2 Tiempo de v i d a media.
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INTRODUCCION
La Karuinskia humboldtiana^ también c o n o c i d a comúnmente como
t u l 1 i d o r a o coyot i l i o , es un a r b u s t o que se e n c u e n t r a
d i s t r i b u i d o en t o d o México ( 1 ) , s u r e s t e de l o s E s t a d a s Un idos y
C e n t r o América <2>. ( F i g s . 1 y 2 ) .
Humboldt , Bompland y Kunth d e s c r i b e n a l a h u m b o l d t i a n a como
un á r b o l de mucha e l e v a c i ó n (más comúnmente es un a r b u s t o ) ,
l i s o , no p r e s e n t a o l o r d e s a g r a d a b l e ; posee ramas c i l i n d r i c a s y
l a r g a s , r u g o s a s , i ne rmes , morenas; de r a m i t a s d e l g a d a s ,
l a m p i ñ a s ; h o j a s p e c i o l a d a s c o l o c a d a s en e l t a l l o de manera
a l t e r n a y o p u e s t a s ( 3 ) •
E l f r u t o de l a K' humboldiiana es una d r u p a de c o l o r v i o l e t a
o b s c u r o cuando e s t á maduro ( F i g . 3 ) , de uno a uno y medio
c e n t í m e t r o s de d i á m e t r o , de endocarpo l e ñ o s o , que e n c i e r r a
f r ecuen temente dos s e m i l l a s f é r t i l e s y dos a b o r t a d a s . T iene
a lmendra c e n t r a l a m a r i l l e n t a y g r a s o s a , no t i e n e o l o r , e l sabor
d e l mesocarpo es a g r a d a b l e , d u l z ó n , d e b i d o a l a p r e s e n c i a de
g l u c o s a y c o n t i e n e m a t e r i a c o l o r a n t e v i o l e t a , t a n i n o s y
s u s t a n c i a s p é p t i c a s .
E l f r u t o de l a AT. humbo ld t iana es t ó x i c o , su i n g e s t i ó n p rovoca
una p o l i n e u r o p a t i a ascendente , s i m é t r i c a y p r o g r e s i v a , que en
l o s casos más g r a v e s causa p a r á l i s i s r e s p i r a t o r i a y b u l b a r ( 4 ) .
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i» -ÌV.
Figura 1. Arbusto de la A". humbol dt iana.
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Figura 3. Fruto de la K. humboldtiana.
Verde, maduro, y semimaduro.
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La i n g e s t i ó n a c c i d e n t a l de e s t e f r u t a produce muerte en humanos
y en ganado ( 5 ) . E l g rado de p a r á l i s i s e s t á en r e l a c i ó n d i r e c t a
con e l c o n t e n i d o de tox i n a s en l o s f r u t o s de d i f e r e n t e s
p rocedenc i as < 6 >'.
Padrón (7) r e f i e r e que ya desde e l s i g l o X V I I I se c o n o c í a que e l
agente t ó x i c o de l a X. humboldtiana se e n c o n t r a b a en l a s e m i l l a
d e l f r u t o , d a t o que aparece en l a ob ra " H i s t o r i a de l a a n t i g u a a
B a j a C a l i f o r n i a " e s c r i t a p o r e l j e s u i t a D. F r a n c i s c o X a v i e r
C l a v i j e r o . Padrón supuso que l a n a t u r a l e z a q u í m i c a d e l agente
tóx i c o e r a h i d r o s o l u b l e . Trece añas más t a r d e (en 1964 ) ,
Anguiano e n c o n t r ó l o s e x t r a c t a s c l o r o f ó r m i c o s d e l f r u t o más
a c t i v o s que l o s e x t r a c t o s acuosos y po r e l l o pensó que e l agente
t ó x i c o e r a l i p o s o l u b l e ( 8 ) .
En 1972, Kim <9) r e p o r t ó e l a i s l a m i e n t o y c a r a c t e r i z a c i ó n
p a r c i a l de una s u s t a n c i a n e u r o t ó x i c a , l a c u a l f u e e x t r a í d a d e l
f r u t o con c l o r o f o r m o y se p r e c i p i t ó con n—hexano, se ob tuvo un
p o l v o a m a r i l l o . E s t e p o l v o f u e p u r i f i c a d o med iante c r o m a t o g r a f í a
en columna de s í l i c a g e l G y e l u i d o con una mezcla de B /A 2 0 / 1 ;
l o s compuestos a s í o b t e n i d o s se a n a l i z a r o n po r CCF. La f r a c c i ó n
p r i n c i p a l de c o l o r amar i l i o se e v a p o r ó y se p r e c i p i t ó con
c l o r o f o r m o / n - h e x a n o . Por medio de l a CCF se o b s e r v ó que se h a b l a
a i s l a d o un s o l o compuesto, r e a l i zándose p r u e b a s de g r u p o
f u n c i o n a l e s como l a d e l F e C l g pa ra i d e n t i f i c a r o x h i d r i l o s
f e n ó l i c o s y l a p rueba de T o l l e n s p a r a a l d e h i d o s . Además, se
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r e a l i z ó e l e s p e c t r o de «nasas (EM) para conocer l a compos ic ión
e l e m e n t a l d e l compuesto, l a c u a l fue de C H O con un peso 32 32 a
m o l e c u l a r de 544. Se p r o b ó l a t o n i c i d a d de l a s u s t a n c i a a i s l a d a
en un mono capuch ino p r o v o c á n d o l e c u a d r i p l e j i a y l a muerte .
Más t a r d e ( 1 9 7 5 ) , D r e y e r y c o l a b o r a d o r e s (10) a i s l a r o n e
i d e n t i f i c a r o n c u a t r o s u s t a n c i a s t ó x i c a s . De manera semejante a
Kim, D reye r u t i l i z ó e l e x t r a c t o c l o r o f ó r m i c o d e l f r u t o de l a
ftumfeoldii ana y l a c r o m a t o g r a f l a en columna de s i l i c a g e l G p a r a
l a s e p a r a c i ó n de e s t o s compuestas. Empleó como mezclas B /A de
d i f e r e n t e p o l a r i d a d : 5 0 / 1 , 2 0 / 1 , 1 0 / 1 y 5 / 1 . Para l a
p u r i f i c a c ión de l a s t o x i n a s se r e a l i za ron v a r i a s s e p a r a c i o n e s
c r o m a t o g r á f i c a s de l a s d i f e r e n t e s f r a c c i o n e s o b t e n i d a s de l a
p r i m e r a columna. Mediante un e s p e c t r o de masas de a l t a
r e s o l u c i ó n se e s t a b l e c i ó l a composic ión e lementa l de l a s c u a t r o
s u s t a n c i a s a i s l a d a s ; se l a s l l a m ó T544, T496, T514 y T516 ( e l
núnero r e p r e s e n t a su peso m o l e c u l a r ) . Por medio de l a
e s p e c t r o f o t o m e t r l a i n f r a r r o j a y r e s o n a n c i a magnét ica n u c l e a r , se
l o g r ó c a r a c t e r i z a r l a s s u s t a n c i a s , l a s c u a l e s son d e r i v a d o s
d i an t r a c e n t ín icos y poseen una e s t r u c t u r a común como se o b s e r v a
en l a f i g . 4 .
No se ha e s t u d i a d o l a t o x i c i d a d d e l e x t r a c t o hexán ico d e l f r u t o
de l a X. ftumboldi i ana; de é l se han a i s l a d o c u a t r o compuestos:
c r i s o f a n o l , 7 - m e t o x i e l e u t e r i n a , 6 - 0 H - 7 - m e t o x i e l e u t e r i n a y e l
é t e r monometi 1 ico de l a t a r a c r i s o n a ( f i g . 5 ) . Es tos compuestos
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HO O OH
CRISOFANOL
METOXIELEUTER,NA
6* OH - 7 ' METOXIELEUTERINA
ETER MONOMETILICO DE LA TARACRISONA
FIGURA 5 POSIBLES PRECURSORES O METABOUTOS DE LAS TOXINAS AISLADAS DEL FRUTO DE LA K. HUMB0LDT1ANA.
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se asemejan a l o s monómeros que componen l o s d imeros de l a s
t o x i n a s y p o r e s t a r a z ó n se sospecha que pueden s e r l o s
p r e c u r s o r e s o m e t a b o l i t o s de l a s d i a n t r a c e n o n a s n e u r o t ó x i c a s
<11) .
Domínguez (5 ) a i s l ó de l a r a í z de l a K. humboldtiana, T544 y
T516, ademáis l a f l a v o n a b a i c a l e i n a y e l f l a v o n o l q u e r c e t i n a y
o t r o s dos nuevos f l a v o n o i d e s (no c a r a c t e r i zados a ú n ) . Los
e x t r a c t o s de l a s h o j a s c o n t i e n e n t r e s de l o s componentes
n e u r o t ó x i c o s e n c o n t r a d o s en e l f r u t o ( 5 ) .
As í mismo, se han a i s l a d a de l a r a í z dos compuestos c o n o c i d o s
como d i m e t i I b e n c i s o c r o m a n o s con a c t i v i d a d a n t i m i c r o b i a n a <12) .
Dada l a t o x i c i d a d que p r e s e n t a e l f r u t o de l a K. humboldiiana,
se han r e a l i z a d o v a r i o s e s t u d i o s e x p e r i m e n t a l e s en d i f e r e n t e s
e s p e c i e s de a n i m a l e s . E l l o d i o l u g a r a a l g u n a s d a t a s
i n t e r e s a n t e s r e s p e c t o de l a a c c i ó n b i o l ó g i c a d e l f r u t o y t o x i n a s
de é l a i s l a d a s .
Escobar y N i e t o (8 ) r e a l i z a r o n i n t o x i c a c i o n e s en g a t o s y r a t a s
b l a n c a s a d m i n i s t r a n d o l a s e m i l i a d e l f r u t o de l a K.
humboldi i.anam Observaron y d e s c r i b i e r o n una p o l i n e u r o p a t í a
d e s m i e l i n i zan te s e g m e n t a r i a . C h a r l t o n y c o l a b o r a d o r e s (13)
e f e c t u a r o n e s t u d i o s en s i s t e m a n e r v i o s o p e r i f é r i c a <SNP).
I n t o x i c a r o n cabras con f r u t o m o l i d o de K.humboldiiana p o r medio
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de l a a d m i n i s t r a c i ó n de d i s t i n t a s d o s i s o r a l e s d i a r i a s . Las
l e s i o n e s e n c o n t r a d a s po r e l l o s en SNP r e v e l a r o n i n f 1 salación de
l a s c é l u l a s de Schwann, f r a g m e n t a c i ó n en l a v a i n a de m i e l i n a ,
d e s m i e l i n i z a c i ó n s e g m e n t a r i a y d e g e n e r a c i ó n wa l1e r i ana»
Mi t c h e l 1 y c o l a b o r a d o r e s (14) e s t u d i a r o n l a s p r o p i e d a d e s
n e u r o t ó x i c a s de l a T496 y T544 i n y e c t a n d o l a t o x i n a en e l n e r v i o
c i á t i c o de r a t a p rovocando p a r e s i a en ambos casos ; se o b s e r v ó
d e s m i e l i n i z a c i ón s e g m e n t a r i a en e l n e r v i o i n y e c t a d o .
Mucho se ha e s t u d i a d o acerca d e l daño que p roduce en e l s i s t e m a
n e r v i o s o de l o s a n i m a l e s , l a i n t o x i c a c i ó n con f r u t o y t o x i n a s de
l a K' humboldtiana. Rec ientemente se ha p r o f u n d i z a d o acerca de
l a s v a r i a d a s l e s i o n e s e x t r a n e u r o n a l e s que produce l a
i n t o x i c a c i ó n aguda de f r u t o y t o x i n a s en r a t o n e s , s i e n d o l a s más
i m p o r t a n t e s en h í g a d o y pulmón ( 1 5 ) . La T514 p roduce un mayor
daño hepatopu lmonar que l a T544 <16) .
Deb ido a l o s t r a b a j o s que se e s t á n l l e v a n d o a cabo a c t u a l m e n t e
con l a s t o x i n a s p u r a s como a g e n t e s c i t o t ó x i c o s es de g r a n
i m p o r t a n c i a e l e s t u d i o de sus p r o p i e d a d e s f i s i c o q u í m i c a s como
son su h i d r o s o l u b i 1 i d a d , 1 i p o s o l u b i 1 i d a d , p o l a r i d a d , fo rma ,
tamaño, g rado de i o n i zac i ón, pa ra p redec i r su absorc i ón ,
t r a n s p o r t e , d i s t r i b u c i ó n , metabo l i smo y e l i m i n a c i ó n en e l
o rgan ismo .
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Las t o x i n a s también pueden e s t a r s u j e t a s a cambios q u í m i c o s ya
sea s u p r i m i e n d o o i n t r o d u c i e n d o c i e r t o s g r u p o s p a r a p o d e r
m o d i f i c a r su compor tamiento f a r m a c o l ó g i c o y as í f a v o r e c e r l a
d i s t r i b u c i ó n de l a s mismas e n t r e l o s d i f e r e n t e s c o m p a r t i m i e n t o s
p a r a hacer más s e l e t t i va su acc i ón . Además, e l t e n e r
c o n o c i m i e n t o de. l a s e s t r u c t u r a s q u í m i c a s de e s t e t i p o de
compuestos y de sus p r o p i e d a d e s f i s i c o q u í m i c a s , nos p e r m i t i r í a
c o m p a r a r l a s con o t r a s s u s t a n c i a s p r e s e n t e s en l a n a t u r a l e z a y
e s t a b l e c e r una e q u i v a l e n c i a b i o i s ó s t e r a . E l conocer l a r e l a c i ó n
e s t r u c t u r a — a c t i v i d a d de l a s t o x i n a s nos s e r í a ú t i 1 pa ra e l
d e s a r r o l l o de d e r i v a d o s b i o r r e v e r s i b l e s .
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HIPOTESIS
D e b i d o a su e s t r u c t u r a q u í m i c a l a s t o x i n a s son á c i d o s d é b i l e s ,
1 i p o s o l u b l e s , termo y f o t o l á b i l e s , más e s t a b l e s en medio á c i d o
que a l c a l i n o . De l a s t r e s t o x i n a s p o d r í a r e s u l t a r l a T514 l a más
á c i d a , l a menos l i p o s o l u b l e y l a más i n e s t a b l e .
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OBJETIVO
Conocer e l compor tamiento f i s i c o q u í m i c o de l a s t o x i n a s 544, 514
y 496 a is ladas de K> humboldtiana.
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MATERIAL Y METODOS
I ) METODOS GENERALES.
Todos l o s r e a c t i v o s u t i l i z a d o s f u e r o n g rado a n a l í t i c o . Los pH se
m i d i e r o n con un p o t e n c i ó m e t r o Beckman d i g i t a l modela 3500 con
una p r e c i s i ó n de 0 . 0 1 u n i d a d e s . Los e s p e c t r o s y l a s med ic iones
UV—Vi s i b 1 e f u e r o n rea1 i zados en un e s p e c t r o f o t ó m e t r o Beckman
Acta I I I de d o b l e haz con c e l d a s de 1 cm, en e l rango e s p e c t r a l
comp rend i do ent r e 360 y 500 nm. Todas 1as evaporac i ones se
r e a l i z a r o n b a j o N^ pa ra p r e v e n i r l a descompos ic ión .
Se u t i l i z ó una c e n t r í f u g a r e f r i g e r a d a IEC CRU-5000. Los puntos
de f u s i ó n se m i d i e ron en un a p a r a t a e1ec t r a t é r m i ca marca
E l e c t r o t h e r m a l .
Las c u a n t i f i c a c i o n e s en CCF se r e a l i z a r o n p o r r e f l e c t a n c i a en un
e s p e c t r o f o t ó m e t r o modelo PMQ 3 C a r i Z e i s s de acuerdo a l a
m e t o d o l o g í a p r o p u e s t a p o r G u e r r e r o y c o l a b o r a d o r e s ( 6 ) .
Todos l o s e x p e r i m e n t o s se r e a l i z a r o n a t e m p e r a t u r a ambiente
( 22 °C ) , excepto en l o s casos en que se s e ñ a l a n o t r a s
t e m p e r a t u r a s de t r a b a j o . En e s t o s casos , l a s mismas f u e r o n
e s t a b l e c i d a s en un baño B l u e M modelo MW-1120A-1 - 2 ° C .
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Las a g i t a c i o n e s se r e a l i z a r o n en
S 8 2 2 3 - 1 . Pa ra l a s med ic iones de
p i p e t a s E p p e n d o r f .
un V o r t e x M i x e r S / P modelo
vo1úmenes pequeños se usaron
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I I ) OBTENCION DE LAS TOXINAS.
E l f r u t o de l a K. humboldtiana se r e c o l e c t ó en V i l l a de G a r c í a ,
Nuevo León, se secó en una e s t u f a a 3 5 - 4 0 ° C po r 12 d í a s y se
m o l i ó en un m o l i n o W i l e y M i l l s modelo 4 . Se u t i l i z ó e l método
mod i f i cado de D r e y e r p a r a l a p u r i f i c a c i ón de l a s t o x i n a s
( 6 ) . ( F i g . 6) .
I I I ) PUREZA DE LAS TOXINAS.
A) D e t e r m i n a c i ó n d e l p u n t o de f u s i ó n ( 1 7 ) .
B) C r o m a t o o r a f l a en capa f i n a
Se r e a l i z a r o n s o l u c i o n e s c u a l i t a t i v a s de l a s t o x i n a s y se
a p i i c a r o n en l a s p l a c a s de s i 1 i c a g e l 6 j u n t o con l o s
e s t á n d a r e s . Se e l u y ó con B /A 5 / 1 . Se o b s e r v ó s i e x i s t í a una s o l a
mancha, se d e t e r m i n a r o n l o s Rf y med iante una lámpara de l u z UV
a una X de 375 nm se o b s e r v ó l a f l u o r e s c e n c i a de l a s mismas.
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IV) ESTUDIOS FISICQQUIMICQ5.
1) SOLUBILIDAD,
Se pesó 1 mg de t o x i n a en tubos de v i d r i o 13 x 50 mm,
agregando p o r c i o n e s de 5 jj1 de s o l v e n t e cada vez y a g i t a n d o
has ta o b s e r v a r una s o l u c i ó n homogénea. En l o s casos en que e l mg
de t o x i n a f u e i n s o l u b l e a l a g r e g a r h a s t a 1 mi d e l s o l v e n t e , se
l l e v ó a un volumen de 5 mi , se a g i t ó po r 15 min . y se c e n t r i f u g ó
a 3500 rpm p o r 10 m i n . ; se s e p a r ó e l sob renadante d e l
p r e c i p i t a d o . E l s o b r e n a d a n t e se e x t r a j o con CHCl^ a g i t a n d o p o r
30 s e g . , se s e p a r ó l a f a s e o r g á n i c a l a c u a l se l l e v ó a sequedad
con N^, se a f o r ó con benceno a l i g u a l que e l r e s i d u o . E l
cromatograma se c u a n t i f i c ó po r r e f l e c t a n c i a .
Se u t i 1 i z a r o n l o s s i g u i e n t e s s o l v e n t e s : agua, metano1,
c l o r o f o r m o , n—hexano, n—heptano, n—octano l , d i m e t i I s u l f ó x i d o ,
s o l u c i o n e s b u f f e r de f o s f a t o s de pH 2 . 5 , é», 9 y 12 ( fj = 0 . 2 ) .
Los sob renadantes de pH b á s i c o s se a c i d i f i c a r o n con HC1
concen t rado antes de e x t r a e r .
2) COEFICIENTE DE FARTICION APARENTE <Kpa) LIPIDO/AGUA.
De una s o l u c i ó n de 0 . 2 5 mg/ml de l a t o x i n a en acetona , se
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c o l o c a r o n 100 <25 fjg> en tubos de v i d r i o 13 x lOO mm y se
evaporó con c o r r i e n t e de N^ h a s t a sequedad; se a g r e g ó 1 mi de
s o l v e n t e o r g á n i c o y se a g i t ó con 1 mi de b u f f e r p o r 30 s e g . ; se
d e j ó r e p o s a r po r 5 min . Una vez r e s t a b l e c i d o e l e q u i l i b r i o se
s e p a r ó l a f a s e o r g á n i c a , se e v a p o r ó con N^, se a f o r ó con benceno
y l a t o x i n a en e l cromatograma se c u a n t i f i c ó p o r r e f l e c t a n c i a .
En e l caso d e l c o e f i c i e n t e de p a r t i c i ó n a p a r e n t e p a r a l a T496 en
b u t a n o l se r e a l i zó l a c u a n t i f i c a c ión de l a t o x i n a p o r
e s p e c t r o f o t o m e t r í a UV—Vis ib le .
La f a s e acuosa se e x t r a j o con 1 mi de CHCl^, se a g i t ó p o r 30
s e g . , se d e j ó r e p o s a r 5 min . y se s i g u i ó e l mismo p r o c e d i m i e n t o
d e s c r i t o a n t e r i o r m e n t e p a r a l a c u a n t i f i c a c i ó n de l a s t o x i n a s .
Las s o l u c i o n e s acuosas de pH b á s i c o se a c i d i f i c a r o n con HC1
p r e v i a m e n t e a l a e x t r a c c i ó n .
Se u t i l i z a r o n s o l u c i o n e s b u f f e r de f o s f a t o s <fj = 0 . 2 ) de pH 2 . 5 ,
6 , 9 y 12 y como s o l v e n t e s o r g á n i c o s b u t a n o l , c l o r o f o r m o y
n—hexano.
3) CPNSTANTE DE ACIDEZ iKaLs_
La c a n t i d a d de t o x i n a u t i 1 i z a d a en cada caso se a j u s t ó de
acuerdo con l a d i s p o n i b i l i d a d de l a misma. E l volumen de
s o l v e n t e empleado d e p e n d i ó de l a s o l u b i l i d a d de cada uno de l o s
compuestos .
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A) DETERMINACION DEL qK APROXIMADO.
a) T544
Se pesaron 5 mg de t o n i n a en un tubo de v i d r i o 16 x ICO mm, se
l e s a g r e g a r o n 3 . 5 mi de acetona + 4 . 5 mi de agua, se a g i t ó y se
m i d i ó e l pH de l a s o l u c i ó n r e s u l t a n t e .
b) T514
Se pesaron 3 mg de t o x i n a en un tubo de v i d r i o 16 x 100 mm, se
l e s a g r e g a r o n 2 mi de acetona + 4 mi de agua, se a g i t ó y se
m i d i ó e l pH de l a s o l u c i ó n r e s u l t a n t e .
c) T496
Se pesaron 5 mg de t o x i n a en un tubo de v i d r i o 16 x 100 mm, se
l e s ag rega ron 4 mi de acetona + 4 mi de agua , se a g i t ó y se
m i d i ó e l pH de l a s o l u c i ó n r e s u l t a n t e .
B> METODO ESPECTRQFOTOMETRICO.
a) BARRIDO DEL ESPECTRO UV -V IS IBLE .
1) T544
i ) 500 jul de T544 a l 0.06257. ( ace tona : agua 3 . 5 : 4 . 5 ) + una g o t a
de HC1 conc. se a f o r a r o n a 10 mi con a c e t o n a - a g u a 50% .
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i i > 500 fj 1 de T544 a l 0.0625% (ace tona : agua 3 . 5 : 4 . 5 ) + una g o t a
de NaOH 0 . 1 N se a f o r a r o n a 10 mi con a c e t o n a - a g u a 50% .
2 ) T514
i ) 500 ¿jI de T514 a l 0.05% (ace tona :agua 1 : 2 ) + una g o t a de HC1
conc . se a f o r a r o n a 10 mi con acetona—agua 50'/. .
i i ) 500 jul de T514 a l 0.05"/. ( acetona : agua 1 : 2 ) + una g o t a de NaOH
O.1N se a f o r a r o n a 10 mi con acetona—agua 50% .
3 ) T496
i ) 125 ¿J1 de T496 a l 0.1% en acetona + 3 mi de acetona + una
g o t a de HC1 conc. se a f o r a r o n a 10 mi can acetona—agua 50%
i i ) 125 ¿j1 de T496 a l 0.1% en acetona + 3 mi de acetona + una
g o t a de NaOH 0 . 1 N se a f o r a r o n a 10 mi con acetona—agua 50%
b) DETERMINACION DEL pK^
1) T544
Se p r e p a r ó una s o l u c i ó n de T544 a l 0.05% (acetona—agua 50%).
PROCEDIMIENTO:
i ) 500 p l de l a s o l u c i ó n + una go ta de HC1 conc. se a f o r a r o n a
10 mi con acetona -agua ( 1 : 1 ) .
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i i ) 500 de l a s o l u c i ó n + una g o t a de NaOH 0 .1N se a f o r a r o n a
10 mi con acetona—agua ( 1 : 1 > .
i i i ) 500 fj 1 de l a s o l u c i ó n se a f o r a r o n a 10 mi con e l b u f f e r
c o r r e s p o n d i e n t e . Se t r a b a j ó con b u f f e r de f o s f a t o s <p = 0 . 0 4 ) de
pH 7 . 6 , 7 . 7 9 , 8 . 4 y 8 . 6 . La c o n c e n t r a c i ó n de l a s s o l u c i o n e s
f i n a l e s f u e de 4 . 6 x 10 Se m i d i ó l a a b s o r b a n c i a a 410, 425 y
435 nm.
2) T514
Se p r e p a r ó una s o l u c i ó n de T514 a l 0.05% ( a c e t o n a - a g u a 1 : 2 ) .
PROCEDIMIENTOS
i ) 250 f j l de l a s o l u c ión +• una go ta de HC1 conc . se a f o r a r o n a
10 mi con (acetona—agua 1 : 2 ) .
i i ) 250 ¿il de l a s o l u c i ó n + una g o t a de NaOH 0 . 1N se a f o r a r o n a
10 mi con (acetona—agua 1 : 2 ) .
i i i ) 250 f j l de l a s o l u c i ó n se a f o r a r o n a ÍO mi con e l b u f f e r
c o r r e s p o n d i e n t e . Se t r a b a j ó con b u f f e r de f o s f a t o s i f j = 0 . 0 4 ) de
pH 7 . 2 5 , 7 . 8 y 7 . 8 5 . La c o n c e n t r a c i ó n de l a s s o l u c i o n e s f i n a l e s
f u e de 2 . 4 x 10 sft. Las a b s o r b a n c i a s se m i d i e r o n a 410 , 421 y
430 nm .
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3) T496
Se p r e p a r ó una s o l u c i ó n de T496 a l 0.25% en acetona .
PROCEDIMIENTO;
i ) 100 fj 1 de l a s o l u c i ó n + una g o t a de HC1 conc. se a f o r a r o n a
10 mi con una s o l u c i ó n de NaCl i f j = 0 . 0 5 ) .
i i ) 100 /J1 de l a s o l u c i ó n + una go ta de NaOH
10 mi con una s o l u c i ó n de NaCl {fj = 0 . 0 5 ) .
i i i ) 100 ¡ j l de l a s o l u c i ón se a f o r a r o n a 10
c o r r e s p o n d i e n t e . Se t rabad ó con b u f f e r de
s o d i o (f j = 0 . 0 5 ) de pH 1 0 . 5 7 , 10 .77 ,
c o n c e n t r a d ón de l a s s o l u c i o n e s f i n a l e s f u e
m i d i ó l a a b s o r b a n c i a a 380 , 400 y 425 nm.
C) METODO DE PARTICION-
DETERMINACION;
1) T544
De una s o l u c i ó n de 1 mg/ml en o c t a n o l se c o l o c a r o n 50 ¡j1 en
tubos Eppendor f y se l l e v a r o n a 500 fj 1 con o c t a n o l , se a g i t ó con
500 p l de buf f e r y se c e n t r i f u g ó po r 10 min . ; se tomó 0 . 3 mi de
l a f a s e o r g á n i c a , se l l e v ó a 2 . 6 mi con o c t a n o l y se l e y ó l a
a b s o r b a n c i a a 415 nm. Se t r a b a j ó a una c o n c e n t r a c i ó n i n i c i a l de
1 . 8 x 10~4M.
0 .1N se a f o r a r o n a
ml con e l b u f f e r
t e t r a b o r a t o de
10 .91 y 1 0 . 9 8 . La
de 5 x 10"SM. Se
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2) T 5 Í 4
De una s o l u c i ó n de 0 . 5 mg/ml en o c t a n o l se c o l o c a r o n 100 ¿¿1 en
tubos E p p e n d o r f y se l l e v a r o n a 500 con o c t a n o l , se a g i t ó con
500 ¿jl de b u f f e r y se c e n t r i f u g ó p o r 10 m i n . ; se tomó 0 . 3 mi de
l a f a s e orgánica, se l l e v ó a 2 . 6 mi con o c t a n o l y se l e y ó l a
a b s o r b a n c i a a 402 nm. Se t r a b a j ó a una c o n c e n t r a c i ó n i n i c i a l de
1 . 9 x 10~4M.
P a r a ambas d e t e r m i n a c i o n e s se u t i l i z a r o n b u f f e r de f o s f a t o s de
pH 6 . 1 , 6 . 8 , 7 . 6 , 8 y 8 . 3 = 0 . 0 4 ) .
En ambos casos l a s c u r v a s de c a l i b r a c i ó n c o r r e s p o n d i e n t e s se
r e a l i z a r o n con l a s t o x i n a s p u r a s d i s u e l t a s en o c t a n o l .
Notas E l o c t a n o l y l o s b u f f e r s se s a t u r a r o n uno con e l o t r o
a n t e s de r e a l i z a r l a p a r t i c i ó n .
4 ) DEGRADACION DE LAS TOXINAS EN SOLUCIONES ACUOSAS
A p a r t i r de una s o l u c i ó n de 0.025% (en acetona ) de l a t o x i n a , se
c o l o c a r o n 100 ¡jI ( 0 . 0 2 5 mg) en t u b o s de v i d r i o 13 x lOO mm, se
a g r e g ó 1 mi d e l b u f f e r c o r r e s p o n d i e n t e , se a g i t ó y se tapó .
E l e s t u d i o se l l e v ó a cabo a 2 5 ° , 3 7 ° y 70°C y en c o n d i c i o n e s de
l u z y o s c u r i d a d ; se u t i l i z a r o n b u f f e r de f o s f a t o s ifj - 0 . 2 ) de
pH 2 . 5 , 6 , 9 y 12.
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A d i s t i n t o s i n t e r v a l o s de t iempo se r e t i r a r o n l o s tubos de l o s
bafíos de t e m p e r a t u r a c o n t r o l a d a , se ag regó 1 mi de CHCl g , se
a g i t ó po r 30 seg . y se s e p a r ó l a f a s e o r g á n i c a , l a c u a l se
e v a p o r ó con se l l e v ó a un volumen c o n o c i d o en benceno. La
t o x i n a remanente se c u a n t i f i c ó en CCF p o r r e f l e c t a n c i a . Todos
l o s e s t u d i o s c i n é t i c o s se r e a l i z a r o n h a s t a t iempos mayores de
dos veces e l t i / 2 p a r a cada una de l a s c o n d i c i o n e s .
Se m i d i ó e l pH de l a s s o l u c i o n e s d u r a n t e todo e l t iempo que d u r ó
e l ensayo .
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RESULTADOS
Todos l o s r e s u l t a d o s p r e s e n t a d a s en l a s s i g u i e n t e s t a b l a s son
p romedio de p o r l o menos t r e s d e t e r m i n a c i o n e s , con excepc ión de
l a d e t e r m i n a c i ó n de s o l u b i 1 i d a d , p a r a l a c u a l se r e a l i zó una
med ic ión ú n i c a .
I ) SOLUBILIDAD (18 ) •
Los r e s u l t a d o s de l a p rueba de s o l u b i l i d a d se muest ran en l a
t a b l a I .
I I > COEFICIENTE DE FARTICIQN APARENTE (Kpa) LIPIDQ/AGUA ( 1 9 ) .
Los r e s u l t a d o s de l o s c o e f i c i e n t e s de p a r t i c i ó n a p a r e n t e s se
muestran en l a t a b l a I I a, b y c .
I I I ) CONSTANTE DE ACIDEZ ( K J .
Se u t i 1 i z a r o n dos métodos d i s t i n t o s p a r a hacer l a s
d e t e r m i n a c i o n e s . En ambos casos e r a n e c e s a r i o conocer
p r e v i a m e n t e e l rango d e n t r o d e l c u a l e s t a b a e l pK de cada una
de l a s t o x i n a s . Pa ra e l l o se m i d i ó e l pH de s o l u c i o n e s de
c o n c e n t r a c i ó n c o n o c i d a de cada una de e l l a s en acetona—agua y ,
po r medio de l a ecuac ión de Henderson H a s s e l b a l c h , se c a l c u l a r o n
l o s v a l o r e s que f i g u r a n en l a T a b l a I I I . Con e l l o se pudo
conocer e l rango de pH a l c u a l se i b a a t r a b a j a r p a r a hacer l a s
de te rminac i ones .
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I ) METODO ESPECTROFOTGHETFTICO•
E l método e s p e c t r o f o t o m é t r i c o p a r a l a d e t e r m i n a c i ó n d e l pK^ ha
s i d o ampl iamente u t i l i z a d a p a r a conocer e l pK de o t r o s fá rmacos .
H u r w i t z (18) l o u t i l i z ó p a r a d e t e r m i n a r e l P ^ a de e s t r é n e n o s .
La e c u a c i ó n empleada p a r a c a l c u l a r e l pK p o r e s t e método se di
deduce a p a r t i r de l a e c u a c i ó n de H e n d e r s o n - H a s s e l b a l c h .
pK = pH - l o g (ft) ~ (fta) (1) ¿I
(Ab) - (A)
Donde:
A = a b s o r b a n c i a de una s o l u c i ó n a l pH
c o n s i d e r a d o y a una dada X.
Aa — a b s o r b a n c i a de l a misma s o l u c i ó n a l a
misma X. y a un pH á c i d o .
Ab = a b s o r b a n c i a de l a misma s o l u c i ó n a l a
misma X y a un pH b á s i c o .
Aa y Ab se deben m e d i r a l e j a d a s un mínimo de dos u n i d a d e s de pK
p a r a que toda l a s u s t a n c i a e s t é en fo rma i o n i z a d a y no i o n i z a d a
r e s p e c t i v a m e n t e . Además, o t r o r e q u i s i t o p a r a que se cumpla l a
e c u a c i ó n 1, es que e x i s t a v a r i a c i ó n en e l e s p e c t r o U V - V i s i b l e
p a r a l a fo rma i o n i z a d a y no i o n i z a d a s de e s t a s m o l é c u l a s . Po r
e l l o f u e n e c e s a r i o r e a l i z a r p r e v i a m e n t e e l e s p e c t r o U V — V i s i b l e
de cada uno de l o s c o m p u e s t o s . ( F i g . 7 . a , b y c ) .
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FORMA ACIDA FORMA ALCALINA
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Para s a c a r un p romed io d e l v a l o r d e l pK^ se d e t e r m i n a r o n l a s
a b s o r b a n c i a s de l a s s o l u c i o n e s a 3 X d i f e r e n t e s , l a X de
a b s o r b a n c i a máxima p a r a l a forma b á s i c a , p a r a l a á c i d a y o t r a X
i n t e r m e d i a . ( T a b l a IV a , b y c ) .
2> METODO DE PARTICION.
Ezumi (19) u t i l i z ó e s t e método p a r a d e t e r m i n a r e l pK^ de a l g u n o s
fármacos , aunque e l e q u i l i b r i o c o r r e s p o n d i e n t e h a b l a s i d o
d e s c r i t o en 1953 ( 2 0 ) .
S i cons ideramos e l s i g u i e n t e e q u i l i b r i o s
Fase o r g á n i c a
AHorg A o r g . / 4
K a f
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Fase acuosa
K = CH •"*" ao3 CA ao3 (2) ¿I a 1
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Y c o n s i d e r a n d o que a un pH cercano a l pK (A ) o r g = O, l o s
c o e f i c i e n t e s de r e p a r t o que se c a l c u l a r o n ( T a b l a I I ) f u e r o n
a p a r e n t e s y d e p e n d i e r o n d e l pH de l a f a s e acuosa .
Kpa = (AHoro)
(AHaq) + (A~aq>
![Page 51: Estudio de las propiedades fisioquímicas de toxinas ...](https://reader031.fdocumento.com/reader031/viewer/2022022522/6217f0810c953a3bb72112e7/html5/thumbnails/51.jpg)
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EX c o e f i c i e n t e de d i s t r i b u c i ó n v e r d a d e r o (KD) es e l que
i n t e r e s a en l o s e s t u d i o s f i s i c o q u í m i c o s y e s t á d i rectamente
r e l a c i o n a d a can l a K . a
KD = (AHoro) (4)
(AHaq)
R e l a c i o n a n d o l a s e c u a c i o n e s 2 , 3 y 4 l l egamos a l a ecuac ión 5
donde:
Kpa = KD - K a Kpa <5)
CH-3
Por l o t a n t o g r a f i c a n d o Kpa p a r a d i s t i n t o s pH c o n t r a Kpa/CH + 3 se
debe o b t e n e r una l i n e a r e c t a de cuya p e n d i e n t e se c a l c u l a K y el
KD de l a o rdenada a l o r i g e n .
Las g r á f i c a s que o b t u v i m o s en n u e s t r o caso se muestran en l a
F i g . 8 . Los v a l o r e s de KD y pK p a r a l a T544 f u e r o n de 11 .4 d
- 0 . 1 5 y 8 . 4 2 - 0 . 3 r e s p e c t i v a m e n t e y p a r a l a T514 de
8 . 2 - 0 . 1 2 y 7 . 2 6 - O . 2 5
IV ) DEGRADACION DE LAS TOXINAS EN SOLUCIONES ACUOSAS.
Para poder c a l c u l a r l a v i d a media de l a s t o x i n a s , neces i tábamos
conocer l a c o n s t a n t e de v e l o c i d a d de l a r e a c c i ó n , l a c u a l
ob tuv imos a l d e t e r m i n a r e l o r d e n de r e a c c i ó n .
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FIGURA 8 GRAFICA DE Kpa vs K p a / [ H ~ H PARA CALCULAR KD Y Ka / L_ _l CONCENTRACION INICIAL DE T544 r 1.8 X IO-4 M. (4l5nm) CONCENTRACION INICIAL DE T514 - 1.9 X IO-4 M. (402 nm ) SOLVENTES: OCTANOL Y BUFFERS DE FOSFATOS pH 6.1, 6.8, 76. 8 Y 8 . 3 ( / < r 0.04 )
![Page 56: Estudio de las propiedades fisioquímicas de toxinas ...](https://reader031.fdocumento.com/reader031/viewer/2022022522/6217f0810c953a3bb72112e7/html5/thumbnails/56.jpg)
Empleamos e l método g r á f i c o (21) p a r a a v e r i g u a r l a c i n é t i c a de
degradac i ón que s i guen 1as tox i n a s . Pa ra cada o rden de reacc i ¿n
ex i s t e una ecuac i ¿n de v e l o e i dad <Tabla V ) . La 1 i n e a r i d a d f ya
sea de C, LnC o 1 /C en f u n c i ó n d e l t iempo nos i n d i c a l a c i n é t i c a
de l a r e a c c i ó n . De l a p e n d i e n t e de l a r e c t a se c a l c u l a l a
c o n s t a n t e de v e l o c i d a d y é s t a se s u s t i t u y e en l a ecuac ión de
v i d a media c o r r e s p o n d i e n t e p a r a e l o rden de r e a c c i ó n e n c o n t r a d o
(Tab la V ) .
La c i n é t i c a de d e g r a d a c i ó n que s i g u i e r o n l a s t o x i n a s T544 y T514
f u e de p r i m e r o rden ( F i g s . 9a y b ) . Aquí se muestran a l g u n a s de
l a s g r á f i c a s o b t e n i d a s p a r a l a s d i f e r e n t e s c o n d i c i o n e s d e l
es t u d i o ; t od as f u e r o n seme j a n t e s .
No hubo v a r i a c i ó n s i g n i f i c a t i v a d e l pH de l a s s o l u c i o n e s a l cabo
d e l t i empo .
Empleamos l a ecuac idn t l / 2 = 0 . 6 9 3 / k p a r a c a l c u l a r l a v i d a media
de cada una de l a s t o x i n a s ( T a b l a V I ) .
Un e j e m p l o d e l e f e c t o d e l t iempo y l a t e m p e r a t u r a s o b r e l a T514
se puede o b s e r v a r en l a s f i g u r a s 10 y 11.
Pa ra l a T496 a 2 5 ° y 37°C y a pH á c i d o s se p r e s e n t ó también una
c i n é t i c a de p r i m e r o r d e n ( F i g . 12 ) y se c a l c u l ó su v i d a media
( T a b l a V I I ) , p e r o a pH b á s i c o s no f u e p o s i b l e c a l c u l a r su
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c i n é t i c a ya que l a T496 se t r a n s f o r m a en o t r o compuesto en un
t iempo r e l a t i v a m e n t e c o r t o , a l r e d e d o r de 5 m i n u t o s ( F i g s . 13 y
1 4 ) . A P H á c i d o y a 70°C aparece también e l mismo compuesto. En
l a F i g . 1 5 se p r e s e n t a l a c i n é t i c a que s i g u i ó l a T496 en d i c h a s
c o n d i c i o n e s .
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4.00264--
3.73767 -
Ln O 4.55" 5.826 X 10'3T
R2- 0.9601
9 0 HORAS 120
pH 25 25° C
3.67795
3.33220 -
L n C = 4 . 4 0 3 1 - 7 3 1 7 X I 0 _ 3 t
f2= 0.9437
90 120 HORAS
T544 OSCURIDAD I pH 2.5 70* C
FIGURA 9A GRAFICAS DE Ln T544 VS TIEMPO CONCENTRACION INICIAL = 0.025 mg/ml. BUFFER DE FOSFATOS (/<=0.2)
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FIGURA 9t> GRÁFICAS DEL Ln T5I4 VS TIEMPO CONCENTRACION INICIAL = 0.025 mg/mL BUFFER DE FOSFATOS ÍM = 0.2 )
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A
RL RO SI SO QL 00
B
RL RO SL SO OL 00
F i g u r a 10. E f e c t o d e l t iempo. A: 2 h r
B: 8 h r
Cromatograma de T514 a pH2 ( b u f f e r de f o s f a t o s ^ =
25°C ( R ) , 37°C ÍS> y 70°C <Q>; l u z ÍL) y o s c u r i d a d Í O ) .
C o n c e n t r a c i ó n i n i c i a l : 0 . 0 2 5 mg/ml .
A d s o r b e n t e : S í l i c a g e l S 60 Merck, espesor de capa 0 . 2
S is tema de s o l v e n t e : B /A 3 / 1 .
![Page 63: Estudio de las propiedades fisioquímicas de toxinas ...](https://reader031.fdocumento.com/reader031/viewer/2022022522/6217f0810c953a3bb72112e7/html5/thumbnails/63.jpg)
RL RO SL SO QL QO
F i g u r a 11. E f e c t o de l a t e m p e r a t u r a .
Cromatograma de T514 a pH 2 ( b u f f e r de f o s f a t o s fj = 0 . 2 ) ; t iempo
de i n c u b a c i ó n B h r , 25 °C ( R ) , 37 °C (S) y 70°C ( Q ) ; l u z (L) y
o s c u r i d a d ( O ) .
C o n c e n t r a c i ó n i n i c i a l : 0 . 0 2 5 mg /ml .
A d s o r b e n t e : S i l i c a g e l 6 óO Merck, espesor de capa 0 . 2 mm.
S is tema de s o l v e n t e : B /A 3 / 1
![Page 64: Estudio de las propiedades fisioquímicas de toxinas ...](https://reader031.fdocumento.com/reader031/viewer/2022022522/6217f0810c953a3bb72112e7/html5/thumbnails/64.jpg)
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F i g u r a 13. Cromatograma de T496 a d i s t i n t o s pH.
C o n d i c i o n e s : 24 h r , 37 °C , l u z .
C o n c e n t r a c i á n i n i c i a l : 0 . 0 2 5 mg/ml .
Adsorbentes S i l i c a Qel B ¿SO Merck, espesor de capa 0 . 2 M .
S is tema de s o l v e n t e : B /A 5 / 1 .
a : E s t á n d a r de T496
b; pH 2
c: pH 6
d s pH 9
es pH 1 1 . 5
B u f f e r de f o s f a t o s (¡j = 0 . 2 ) .
![Page 66: Estudio de las propiedades fisioquímicas de toxinas ...](https://reader031.fdocumento.com/reader031/viewer/2022022522/6217f0810c953a3bb72112e7/html5/thumbnails/66.jpg)
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F i g u r a 14. Cromatograma de T496 a d i f e r e n t e s t iempos ; l u z ,
pH9 ( b u f f e r de f o s f a t o s /J = 0 . 2 ) .
C o n c e n t r a c i ú n i n i c i a l : 0 . 0 2 5 mg/ml
A d s o r b e n t e : S í 1 i c a g e l 6 60 Merck « espesor de capa 0 . 2 mm.
S is tema de s o l v e n t e : B /A 5 / 1 .
a: 0 minutos
b : 3 minutos
c : 5 m inu tos
![Page 67: Estudio de las propiedades fisioquímicas de toxinas ...](https://reader031.fdocumento.com/reader031/viewer/2022022522/6217f0810c953a3bb72112e7/html5/thumbnails/67.jpg)
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DISCUSION
No e x i s t e n i n g ú n d a t o c u a n t i t a t i v o en l a l i t e r a t u r a con r e s p e c t o
a l a s o l u b i l i d a d de l a s t o x i n a s , aunque ya se t e n í a una i d e a de
su 1 i p o s o l u b i 1 i dad Í 8 ) .
E s t e t i p o de compuestos posee s u s t i t u y e n t e s h i d r ó f i l o s en s u
e s t r u c t u r a a n t r a c e n á i i c a <F íg . 4 ) , l o que l e c o n f i e r e una
1 i p o s o l u b i 1 i d a d i n t e r m e d i a ; como consecuenc ia de e l l o no son muy
s o l u b l e s n i en s o l v e n t e s p o l a r e s n i en s o l v e n t e s no p o l a r e s .
Las t o x i n a s en medios a l c a l i n o s t i e n d e n a i o n i z a r s e d e b i d o a que
son á c i d o s d é b i l e s , p o r eso p r e s e n t a n una mayor s o l u b i l i d a d en
medios acuosos a l c a l i n o s que en medios acuosos á c i d o s (Tab la I ) .
E x i s t e una d i f e r e n c i a e s t r u c t u r a l i m p o r t a n t e en e l s i s tema
a n t r a c e n ó n i c o no común. La T514 posee un g rupo o x h i d r i l o
a l c o h ó l i c o , l o c u a l l a hace más p o l a r que l a T496 ( F i g . 4 ) .
La mayor p o l a r i d a d de l a T514 se ve c l a r a m e n t e en su s o l u b i l i d a d
en e l agua y en l o s s i s t e m a s acuosos a d i f e r e n t e s pH ( T a b l a I )
con r e s p e c t o a l a s o t r a s dos t o x i n a s .
Además, comparando l a s o l u b i 1 idad de l a T514 a pH 2 . 5 y 6
( T a b l a 1) con l o s d a t o s c o r r e s p o n d i e n t e s de T496 y T544 se
o b s e r v a un aumento de s o l u b i l i d a d so lamente p a r a l a p r i m e r a a l
![Page 69: Estudio de las propiedades fisioquímicas de toxinas ...](https://reader031.fdocumento.com/reader031/viewer/2022022522/6217f0810c953a3bb72112e7/html5/thumbnails/69.jpg)
aumentar e l pH. Se p o d r í a pensar que e s t a t e n d e n c i a se
c o r r e s p o n d e con l o s pK e n c o n t r a d o s ( v e r más a d e l a n t e ) . s
La T544 p r e s e n t a escasos g r u p o s p o l a r e s en l a e s t r u c t u r a no
comúi ( F i g . 4) p o r l o que posee una mayor s o l u b i 1 idad en l o s
s o l v e n t e s no p o l a r e s y de p o l a r i d a d i n t e r m e d i a .
En g en e r a 1 se c on f i rman 1os r e s u 1 1 ados ob t en i dos en l a
d e t e r m i n a c i ó n de s o l u b i l i d a d con l o s v a l o r e s e n c o n t r a d o s p a r a e l
c o e f i c i e n t e de p a r t i c i ó n a p a r e n t e (Kpa) l i p i d o / a g u a pa ra l a s
t r e s t o x i n a s ( 1 7 ) :
- E l c o e f i c i e n t e de p a r t i c i ó n a p a r e n t e es mayor en c l o r o f o r m o
que en n - h e x a n o y bu tano1 , l o c u a l r e a f i r m a l a mediana
1 i p o s o 1 u b i 1 idad de e s t o s compuestos.
- En medios acuosos á c i d o s se p r e s e n t a un mayor c o e f i c i e n t e de
p a r t i c i ó n a p a r e n t e que en medios acuosos a l c a l i n o s , ya que en
e s t o s ú l t i m o s e x i s t e i o n i z a c i ó n y , como señalamos a n t e r i o r m e n t e ,
mayor s o l u b i 1 idad en l a f a s e acuosa .
- La t o x i n a menos s o l u b l e en med i os acuosas ác i dos (T496)
p r e s e n t a e l mayor c o e f i c i e n t e de p a r t i c i ó n a p a r e n t e en
c l o r o f o r m o m i e n t r a s que l a más s o l u b l e (T514) p r e s e n t a e l menor
c o e f i c i e n t e de p a r t i c i ó n a p a r e n t e .
![Page 70: Estudio de las propiedades fisioquímicas de toxinas ...](https://reader031.fdocumento.com/reader031/viewer/2022022522/6217f0810c953a3bb72112e7/html5/thumbnails/70.jpg)
La t i t u l a c i ó n p o t e n c i o m é t r i c a , comúnmente ú t i l i z a d a p a r a l a
d e t e r m i n a c i ó n d e l pK , no f u e p o s i b l e a p l i c a r l a en n u e s t r o caso
d e b i d o a l a escasa s o l u b i l i d a d que p r e s e n t a n l a s t o x i n a s en agua
y po r l a c a n t i d a d de s u s t a n c i a r e q u e r i d a p a r a e l e s t u d i o
(aproximadamente 50 mg) s i se r e a l i z a r a en s o l v e n t e s no acuosos
( 2 2 ) -
Para l a d e t e r m i n a c i ó n d e l empleamos dos métodos i n d i r e c t o s
( e s p e c t r o f o t o m é t r i c o y de p a r t i c i ó n ) . E s t o s métodos se basan en
l o s cambios q u í m i c o s que p r e s e n t a n e s t o s t i p o s de compuestos a l
v a r i a r e l pH, l o c u a l o r i g i n a e s p e c i e s i o n i z a d a s y no i o n i z a d a s .
Cada una de e l l a s muest ra p r o p i e d a d e s f í s i c a s d i f e r e n t e s , l o
c u a l l a s hace p r o p i c i a s pa ra su d e t e r m i n a c i ó n .
La base de l a med ic ión p o r e l método e s p e c t r o f o t o m é t r i c o , r a d i c a
en l a s a b s o r b a n c i a s d i f e r e n c i a l e s que p r e s e n t a n l a s d i s t i n t a s
e s p e c i e s ( i o n i z a d a s y no i o n i z a d a s ) a d i s t i n t a s
Se c a l c u l a e l pK^ p o r medio de l a ecuac ión 1 ( R e s u l t a d o s ) . En
e s t e caso pa ra que d i c h a ecuac ión se cumpla debemos de t r a b a j a r
a l o s pH adecuados.
E l método de p a r t i c i ó n p a r a l a med ic ión d e l pK se fundamenta en el
l a d i f e r e n c i a de s o l u b i 1 idad que e x i s t e e n t r e l a s fo rmas
i o n i z a d a s y no i o n i z a d a s a l o s d i s t i n t a s pH empleados ; tomando
en c u e n t a l o s d i f e r e n t e s e q u i l i b r i o s que e x i s t e n en s o l u c i ó n , se
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1 lega a l a ecuac ión 5 ( R e s u l t a d o s ) , a t r a v é s de l a c u a l se
o b t i e n e l a K . a
Para e s t a d e t e r m i n a c i ó n se u t i 1 i z a de p r e f e r e n c i a n—heptaño
d e b i d a a que l a d i s o c i a c i ó n i ó n i c a es menor en e s t e s o l v e n t e . En
n u e s t r o t r a b a j o no f u e p o s i b l e e m p l e a r l o dada l a escasa
s o l u b i l i d a d que p r e s e n t a n l a s t o x i n a s en e l mismo ( T a b l a I ) . En
su l u g a r usamos n—octano l , e l c u a l también ha s i d o r e p o r t a d o
como s o l v e n t e ú t i l p a r a d e t e r m i n a r l a K^ de a l g u n o s compuestos
( 1 9 ) . En e s t e caso se hace n e c e s a r i o s a t u r a r l a s f a s e s e n t r e s i
a n t e s de r e a l i z a r l a p a r t i c i ó n , p a r a o b t e n e r una me jo r
s e p a r a c i ó n de l a s mismas.
La cuant i f i cac i ón en e s t e caso no se 11evó a cabo p o r
c r o m a t o g r a f i a en capa f i n a , a p e s a r de s e r más s e n s i b l e que l a
e s p e c t r o s c o p í a UV—Vis ib le , d e b i d o a l a d e g r a d a c i ó n que
p r e s e n t a b a n l a s t o x i n a s a l e v a p o r a r con N2 e l o c t a n o l .
La T514 p r e s e n t ó l a mayor a c i d e z , l e s i g u i ó l a T544 y p o r ú l t i m o
1 a T49¿>. E s t e o r d e n c o r r e l a c i o n a b i e n con l o s d a t o s de
s o l u b i l i d a d ( T a b l a I ) . Observamos que l a T514 con un pK oL
a l r e d e d o r de 7 . 2 ( T a b l a IVb) aumenta su s o l u b i l i d a d a l pasar de
pH 2 a ¿>, en e l c u a l ya e s t á p a r c i a l m e n t e i o n i z a d a . E s t o no
sucede con l a s o t r a s dos t o x i n a s . Pa ra l a T544 con un pK
a l r e d e d o r de 8 . 4 ( T a b l a IVa ) sucede l o mismo p e r o a l cambiar de
pH 6 a 9 ( T a b l a I ) .
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Las v e n t a j a s que p r e s e n t a n e s t o s métodos p a r a l a med ic ión de l a
K es su s e n c i l l e z , s e n s i b i l i d a d y c o n f i a b i 1 i d a d ; p o r l o c u a l el
recomendamos su uso . La p o s i b l e d i f e r e n c i a en l a e f i c i e n c i a de
ambos métodos se d e t e r m i n ó med iante l a p rueba t de S t u d e n t dando
una p no s i g n i f i c a t i v a .
Con a n t e r i o r i d a d a e s t e t r a b a j o , suponíamos que l a s t o x i n a s
f u e r a n i n e s t a b l e s , p e r o no conocíamos sus c a r a c t e r l s t i c a s . E l
e v a l u a r 1a deg radac i ón de e s t o s compuestos a d i f e r e n t e s
c o n d i c i o n e s de pH f t e m p e r a t u r a e i l u m i n a c i ó n , nos p e r m i t e una
m e j o r m a n i p u l a c i ó n en e l a i s l a m i e n t o , p u r i f i c a c i ón,
a lmacenamiento y medios de r e a c c i ó n (23 , 24 , 25 y 2 6 ) .
La m a y o r í a de l o s p r o c e s o s o b s e r v a d o s en l a n a t u r a l e z a s i g u e n
una c i n é t i c a de p r i m e r o r d e n ( 2 7 ) . La T544 y T514 s i g u i e r o n e s t e
t i p o de c i n é t i c a p a r a su d e g r a d a c i ó n en l a s d i f e r e n t e s
c o n d i c i o n e s empleadas.
Tanto l a T544 como l a T514 f u e r o n más i n e s t a b l e s en medios
a l c a l i n o s , en l a l u z y a l aumentar l a t e m p e r a t u r a ( F i g . 1 1 ) . En
g e n e r a l l a T514 p r e s e n t ó menor e s t a b i l i d a d que l a T544.
Cabe a c l a r a r que l a d e g r a d a c i ó n de l a T514 a pH 12 ( T a b l a V I )
no se l l e v ó a cabo d e b i d a a que l a e x t r a c c i ó n con c l o r o f o r m o no
f u e p o s i b l e . E s t o se e x p l i c a po rque l a t o x i n a e s t á t o t a l m e n t e
i o n i z a d a a ese pH (pK = 7 . 2 7 -- 0 . 0 9 , Kpa CHC1 / p H 12 = 0 . 0 6 4 ) . d d
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La i n f 1 u e n c i a d e l pH en l a degradac i ón que p r e s e n t a r o n l a s
t o x i n a s se debe a su e s t r u c t u r a f e n ó l i c a . En medios a l c a l i n o s ,
e s t e t i p o de compuestos se t r a n s f o r m a en su base c o n j u g a d a ; é s t a
es muy i n e s t a b l e y r e a c t i v a , dando l u g a r a d i v e r s o s p r o d u c t o s de
o x i d a c i ó n ( 2 8 ) .
La o x i d a c i ón de f e n o l e s se puede 1 l e v a r a cabo p o r
a u t o — o x i d a c i ó n a t r a v é s de r a d i c a l e s l i b r e s ( 2 9 ) . En n u e s t r o
caso , l a s tox i n a s p r e s e n t a n e s t e t i p o de e s t r u c t u r a ; l a
d e g r a d a c i ó n que observamos con l a l u z , se p o d r í a e x p l i c a r p o r
e s t e mecanismo. Además, se conoce que e l aumento de t e m p e r a t u r a
a c e l e r a l o s p r o c e s o s de o x i d a c i ó n .
Los r e s u 1 t a d o s ob ten i d o s con 1a T496 l o s cons ideramos a p a r t e p o r
p r e s e n t a r un compor tamiento d i s t i n t o de l a s o t r a s t o x i n a s .
Es te compuesto f u e (en g e n e r a l ) más i n e s t a b l e que l o s o t r o s en
t o d a s l a s c o n d i c i o n e s empleadas .
Como ya se mencionó a n t e r i o r m e n t e ( R e s u 1 t a d o s ) , l a T496 se
t r a n s f o r m a a o t r o compuesto a pH a l c a l i n o ( F i g . 13) y a todas
l a s t e m p e r a t u r a s e s t u d i a d a s (a pH á c i d o s so lamente a 7 0 ° C ) , en
un t iempo c o r t o . Deb ido a é s t o no se pudo d e t e r m i n a r su
s o l u b i 1 i d a d , c o e f i c i e n t e de p a r t i c i ó n a p a r e n t e l i p i d o / a g u a y su
d e g r a d a c i ó n a pH 9 y 12.
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Por e l mismo m o t i v o , l a d e t e r m i n a c i ó n d e l se l l e v ó a cabo
s ó l o p o r e l método e s p e c t r o f o t o m é t r i c o . A p e s a r de que ambos
métodos ( e s p e c t r o f o t o r o é t r i c o y de p a r t i c i ó n ) se r e a l i z a r o n a pH
a l c a l i n o , s ó l o se u s ó e l p r i m e r o d e b i d o a que su t iempo de
a n á l i s i s f u e de 3 m i n u t o s . E l a n á l i s i s p a r a e l segundo no f u e
p o s i b l e r e a l i z a r l o en menos de 5 m i n u t o s , t iempo en e l c u a l se
comprobó que empieza l a t r a n s f o r m a c i ó n de l a T496 <F ig . 1 4 ) .
En l o s casos en que se pudo m e d i r , l a c i n é t i c a de T496 f u e de
p r i m e r o r d e n .
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CONCLUSIONES
1) La T514 r e s u l t ó s e r l a menos l i p o s o l u b l e y l a más á c i d a de
l a s t o x i n a s .
2) La T496 f u e l a más i n e s t a b l e en todas l a s c o n d i c i o n e s .
3 ) Se p o d r í a p e n s a r en una mayor a b s o r c i ó n de l a T496 en e l
o rgan ismo d e b i d o a su mayor c o e f i c i e n t e de d i s t r i b u c i ó n a p a r e n t e
l l p i d o / a g u a . S i n embargo a l pH g á s t r i c o l a s t r e s t o x i n a s e s t a r á n
no i o n i z a d a s y se podrán a b s o r b e r s i n d i f i c u l t a d .
4 ) Las t r e s t o x i n a s se p o d r í a n d e p o s i t a r en g r a s a dada s u
1 i p o s o l u b i 1 i d a d .
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E p i m e r i z a t i o n K i n e t i c s o f Moxalactam i n Aqueous S o l u t i o n .
J o u r n a l o f P h a r m a c e u t i c a l S c i e n c e s 73 3 ( 1 9 8 4 ) .
25) Miyamoto, E . ; Ddashima, S „ ; K i tagawa, I - ; T s u j i A. S t a b i 1 i t y
K i n e t i c s o f G i n s e n o s i d e s i n Aqueous S o l u t i o n . American
P h a r m a c e u t i c a l A s s o c i a t i o n . 73 3 ( 1 9 8 4 ) .
26) Bakar , S. K . ; N i a z i , S . S t a b i l i t y o f A s p i r i n i n D i f f e r e n t
Med ia . American P h a r m a c e u t i c a l A s s o c i a t i o n 72 9 ( 1 9 8 3 ) .
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