ESTUDIO DEL EFECTO DEL EXTRACTANTE EN LA RECUPERACIÓN DE …
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UNIVERSIDAD TÉCNICA FEDERICO SANTA MARÍA DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA CIVIL QUÍMICA Y AMBIENTAL SANTIAGO – CHILE ESTUDIO DEL EFECTO DEL EXTRACTANTE EN LA RECUPERACIÓN DE ENZIMA LACASA PRODUCIDA A PARTIR DE UN RESIDUO AGRÍCOLA ANGELA CRISTINA ROCHA ARANCIBIA MEMORIA DE TITULACIÓN PARA OPTAR AL TÍTULO DE INGENIERO CIVIL QUÍMICO PROFESORA GUÍA: DRA. ANDREA CARVAJAL PROFESORA CORREFERENTE: DRA. CAROLYN PALMA Octubre, 2019 “Material de referencia, su uso no involucra responsabilidad del autor o de la Institución”
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UNIVERSIDAD TÉCNICA FEDERICO SANTA MARÍA
DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA CIVIL QUÍMICA Y AMBIENTAL
SANTIAGO – CHILE
ESTUDIO DEL EFECTO DEL EXTRACTANTE EN LA
RECUPERACIÓN DE ENZIMA LACASA PRODUCIDA A
PARTIR DE UN RESIDUO AGRÍCOLA
ANGELA CRISTINA ROCHA ARANCIBIA
MEMORIA DE TITULACIÓN PARA OPTAR AL TÍTULO DE
INGENIERO CIVIL QUÍMICO
PROFESORA GUÍA: DRA. ANDREA CARVAJAL
PROFESORA CORREFERENTE: DRA. CAROLYN PALMA
Octubre, 2019
“Material de referencia, su uso no involucra responsabilidad del autor o de la Institución”
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3
Agradecimientos
Este trabajo fue realizado gracias al Proyecto interno UTFSM Proyecto de línea “Estudio de
valorización del residuo de la industria olivícola en una biorrefinería” PI_L_18_26 DGIIP.
A la profesora Dra. Andrea Carvajal por el apoyo, disponibilidad y paciencia durante la
realización de este trabajo, a María Victoria Riquelme (la Vicky) por su eterna paciencia y
disposición en mis largos días dentro del laboratorio, a Valentina Wyman por su ayuda y
apoyo en la etapa inicial de mi trabajo y a todos mis compañeros del laboratorio de
valorización de residuos que hicieron llevaderos los días con su compañía y gratas
conversaciones.
A mis padres Bernarda y Raúl, por su apoyo incondicional en todo ámbito de mi vida, a mi
hermano mayor Jair por ayudarme en la decisión sobre mis estudios y a mis abuelas Tita y
Elba que ya no se encuentran con nosotros, sin ustedes nada de esto sería posible.
A mi compañera y amiga Isabel Zapata con quien he compartido este largo camino de
universidad, gracias por estar siempre.
A mi pololo Jorge Venegas por acompañarme gran parte de mi etapa universitaria.
4
A Teresa Leonor Chazal Herrera
Abuela, aunque no estés físicamente siempre
estarás presente en mi mente y corazón.
Un abrazo al cielo.
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Resumen
Los residuos agrícolas lignocelulósicos, como el residuo generado por la industria oleícola,
se caracterizan por su composición de celulosa, hemicelulosa y lignina; donde el último
compuesto le entrega rigidez a la matriz celular y le da características recalcitrantes. En
particular, el alperujo posee una alta fitotoxicidad, transformando su disposición en un
problema ambiental, que hace pertinente la búsqueda de un método de tratamiento, con el fin
de mitigar sus impactos ambientales. Una de las estrategias biotecnológicas de tratamiento
de residuos lignocelulósicos, que además permite valorizar el residuo, corresponde al uso de
hongos de putrefacción blanca para la producción de enzimas ligninolíticas; sin embargo, no
se reporta en la literatura estrategias de producción de enzimas a partir del residuo de la
industria oleícola. El objetivo principal de este estudio es definir un proceso de producción
y extracción de enzima lacasa de la cepa Trametes versicolor, utilizando como substrato un
residuo generado por la industria oleícola sometido a pretratamiento.
El estudio consistió en tres etapas de evaluación, donde la primera fue la aplicación
comparativa de 5 pretratamientos físico, químico y combinado. Luego, cada residuo
pretratado fue sometido a un tratamiento biológico durante 20 𝑑 con hongo Trametes
versicolor. Posteriormente, se seleccionó un único pretratamiento para producir la enzima
lacasa y evaluar el efecto de los extractantes (agua versus buffer fosfato pH 7). La selección
del pretratamiento se hizo por medio de la cuantificación de actividad enzimática y el efecto
de los extractantes por medio de la cuantificación de recuperación de enzima (extracción y
semi purificación), estabilidad enzimática y capacidad de degradación de un contaminante
específico, en función del 𝑝𝐻 y temperatura de aplicación.
Como principal resultado de la selección del pretratamiento, se obtuvo un valor máximo de
actividad enzimática luego de 20 𝑑 en la etapa de producción enzimática para el alperujo
pretratado en condición de alta temperatura (120°𝐶) y adición de hidróxido de sodio 2 𝑁,
siendo 9,66 ± 0,43 𝑈/𝑔. Al evaluar el efecto de los medios extractantes agua versus buffer,
solo se obtuvo diferencias en el proceso de semi purificación con disminuciones de la
actividad enzimática del 11 y 30%, respectivamente. La enzima obtenida a partir de ambos
medios extractantes tuvo una mayor estabilidad a 𝑝𝐻 7 y a las temperaturas 4 y 30°𝐶;
adicionalmente, en el efecto de la temperatura se observó que a 17°𝐶 existe una diferencia
significativa en la estabilidad asociadas al medio extractante; sin embargo, al finalizar el
ensayo ambos extractos presentaron actividades residuales similares. Respecto a la capacidad
de degradación de la enzima, no se obtuvo diferencia respecto al medio extractante utilizado,
sino que se observó diferencia significativa respecto a la temperatura de aplicación de la
enzima, donde la degradabilidad se vio favorecida a temperaturas más altas (30°𝐶).
Se concluye que para el proceso de producción de enzima lacasa con el hongo Trametes
versicolor a partir de residuo oleícola debe tener una duración de 18 𝑑 sobre el substrato
alperujo sometido a un pretratamiento a alta temperatura con hidróxido de sodio. La enzima
producida puede ser extraída con agua siendo las condiciones óptimas de aplicación 𝑝𝐻 7 y
30°𝐶.
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Índice
1. Introducción ............................................................................................................... 10
1.1. Industria olivícola .................................................................................................. 10
1.1.1. Aceite de oliva .................................................................................................... 10
1.2. Mercado nacional ................................................................................................... 11
1.3. Residuo generado ................................................................................................... 13
1.3.1. Actualidad .......................................................................................................... 14
1.4. Biomasa lignocelulósica ........................................................................................ 15
1.5. Producción enzimática ........................................................................................... 16
1.5.1. Fermentación en estado sólido ........................................................................... 17
1.5.2. Pretratamientos ................................................................................................... 18
1.5.3. Extracción........................................................................................................... 20
1.5.4. Enzimas ligninolíticas ........................................................................................ 20
1.5.5. Lacasa ................................................................................................................. 21
2. Objetivos .................................................................................................................... 23
2.1. Objetivo general ..................................................................................................... 23
2.2. Objetivos específicos ............................................................................................. 23
3. Materiales y métodos ................................................................................................. 24
3.1. Materiales ............................................................................................................... 25
3.1.1. Residuo ............................................................................................................... 25
3.1.2. Hongo ................................................................................................................. 25
3.2. Métodos ................................................................................................................. 26
3.2.1. Etapa 1: Pretratamientos..................................................................................... 26
3.2.2. Etapa 2: Producción enzimática ......................................................................... 28
3.2.2.1. Fase soluble .................................................................................................... 28
3.2.3. Etapa 3: Extracción y calidad de la enzima ........................................................ 28
3.2.3.1. Producción ...................................................................................................... 28
3.2.3.2. Recuperación de enzima lacasa(Extracción) .................................................. 29
3.2.3.3. Calidad de la enzima producida ..................................................................... 30
3.3. Técnicas analíticas ................................................................................................. 31
4. Resultados y discusión .............................................................................................. 32
4.1. Caracterización del residuo .................................................................................... 32
7
4.2. Pretratamientos ...................................................................................................... 33
4.3. Producción enzimática ........................................................................................... 36
4.4. Recuperación del crudo enzimático ....................................................................... 43
4.4.1. Estabilidad .......................................................................................................... 44
4.4.2. Degradabilidad ................................................................................................... 47
5. Conclusiones .............................................................................................................. 49
6. Referencias ................................................................................................................ 51
Anexo ................................................................................................................................ 57
A. Técnicas analíticas ................................................................................................. 57
A.1 Azúcares reductores ............................................................................................... 57
A.2 Actividad enzimática de lacasa .............................................................................. 57
A.3 Proteína total .......................................................................................................... 57
A.4 Sólidos totales y volátiles ...................................................................................... 58
A.5 Fenoles ................................................................................................................... 58
A.6 Nitrógeno total ....................................................................................................... 58
A.7 Nitrógeno amoniacal .............................................................................................. 58
A.8 Oxitetraciclina (OTC) ............................................................................................ 59
A.9 Análisis de datos .................................................................................................... 59
A.9.1. T-student............................................................................................................. 59
A.9.2. ANOVA ............................................................................................................. 59
B. Características del alperujo .................................................................................... 60
C. Tratamiento biológico a 30 d ................................................................................. 61
C.1 Cinética de crecimiento ......................................................................................... 61
C.2 Concentración de azúcares reductores ................................................................... 61
D. Concentración de proteínas .................................................................................... 62
E. Análisis estadístico .................................................................................................... 62
E.1 Diferencia de la extracción sobre la actividad enzimática ..................................... 62
E.2 Análisis resultados estabilidad comparativo entre temperaturas para crudo extraído
con agua ............................................................................................................................ 63
E.3 Análisis resultados estabilidad comparativo entre temperaturas para crudo extraído
con buffer .......................................................................................................................... 63
E.4 Análisis resultados estabilidad comparativo entre medios extractantes ................ 63
E.5 Análisis resultados degradabilidad ........................................................................ 63
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Índice de tablas
Tabla 1: Ventajas y desventajas de la fermentación en medio sólido frente a la fermentación
sumergida (Suarez, 1993). .................................................................................................... 18
Tabla 2: Pretratamientos aplicados sobre residuos agroindustriales. ................................... 19
Tabla 3 : Variables de entrada correspondientes al diseño experimental. ............................ 31
Tabla 4: Caracterización del residuo alperujo utilizado a lo largo de la experimentación. .. 33
.Tabla 5: Diferencias entre promedios de las variables respuesta medidas respecto al control
y su significancia estadística para los distintos pretratamientos aplicados (prueba t-student).
.............................................................................................................................................. 36
Tabla 6: Actividad enzimática de distintos residuos. (García Torres & Torres Sáe, 2003). 42
Tabla 7: Reducción de la concentración del antibiótico Oxitetraciclina en el tiempo (4 h). 48
Tabla 8: Características reportadas por distintos autores para residuo alperujo................... 60
Tabla 9: análisis estadístico t-student para estudiar la significancia de la diferencia en la
extracción del crudo enzimático. .......................................................................................... 62
Tabla 10: Parámetros del anova realizado entre las diferentes temperaturas en el ensayo de
estabilidad del crudo extraído con agua (∝=0,01). .............................................................. 63
Tabla 11: Parámetros del anova realizado entre las diferentes temperaturas en el ensayo de
estabilidad del crudo extraído con buffer (∝=0,01). ............................................................ 63
Tabla 12:Parámetros del anova realizado entre los medios extractantes a las distintas
temperaturas estudiadas (∝=0,01). ....................................................................................... 63
Tabla 13: Parámetros del anova realizado entre las diferentes temperaturas y extactantes en
el ensayo de degradabilidad (∝=0,01). ................................................................................ 63
Índice de figuras
Figura 1: Distribución de la superficie plantada con olivos en Chile. Elaboración propia, datos
(Chile Oliva, 2017a). ............................................................................................................ 12
Figura 2: Producción de aceite de oliva a lo largo del tiempo en Chile. Elaboración propia,
datos (COI, 2018). ................................................................................................................ 12
Figura 3: Balance de masa del método de extracción de aceite de oliva por centrifugación (a)
3 fases y (b) 2 fases (Christoforou & Fokaides, 2016). ........................................................ 13
Figura 4: Diagrama de la estructura molecular de la biomasa lignocelulósica (Manzano
Chávez, 2013). ...................................................................................................................... 16
Figura 5: Ciclo catalítico de oxidación de un sistema lacasa-mediador (Kunamneni,
Ballesteros, Plou, & Alcalde, 2007). .................................................................................... 22
Figura 6: Estructura molecular oxitetraciclina (Nguyen et al., 2014). ................................. 22
9
Figura 7: Esquema global del estudio realizado, las líneas punteadas azules representan los
límites de cada etapa. ............................................................................................................ 24
Figura 8: Esquema general del procedimiento aplicado sobre el residuo alperujo obtenido a
partir de la extracción del aceite de oliva. ............................................................................ 26
Figura 9: Esquema representativo de los pretratamientos aplicados sobre el residuo alperujo.
.............................................................................................................................................. 27
Figura 10: Esquema representativo del procedimiento experimental para la recuperación de
enzima lacasa en crudo. ........................................................................................................ 30
Figura 11: Resultados obtenidos en el proceso de pretratamientos:(a)Concentración de
azúcares reductores, (b)Concentración de fenoles y (c)Relación sólido volátil- sólido total,
en todas las gráficas se muestra el monitoreo de un control y las mediciones luego de la
aplicación de los distintos pretratamientos. .......................................................................... 35
Figura 12: Concentración de azúcares reductores a lo largo del tiempo de producción
enzimática. En gráfico (a) se representa los pretratamientos Control ( ) y Alta temperatura
( ), mientras que en el gráfico (b) se encuentran representados los pretratamientos Alta
temperatura alcalino (●), Baja temperatura ( ), Baja temperatura alcalino (Δ) y alcalino ( ).
.............................................................................................................................................. 38
Figura 13: Imágenes de los ensayos en el último día de tratamiento biológico (20 d), en la
imagen (A) se encuentra encerrada en rojo la contaminación presente en el ensayo control.
.............................................................................................................................................. 39
Figura 14: Actividad enzimática de lacasa para el proceso de producción enzimática realizado
con hongo Trametes versicolor en el tiempo. Simbología: Control ( ), Alta temperatura (
), Alta temperatura alcalino (●), Baja temperatura ( ), Baja temperatura alcalino (Δ) y
alcalino ( ). .......................................................................................................................... 41
Figura 15: Concentración de fenoles del residuo alperujo pretratado (alta temperatura
alcalino), durante el tiempo de producción enzimática. ....................................................... 43
Figura 16: Actividad residual (𝑎𝑡/𝑎0); (a)extraído con agua como medio extractante y
(b)extraído con buffer como medio extractante, ambos en función del tiempo. Simbología:
pH 7: 4°𝐶(●), 17°𝐶(●), 30°𝐶(●), pH 5,5: 4°𝐶(▲), 17°𝐶(▲), 30°𝐶(▲). ........................... 46
Figura 17: Actividad enzimática de enzima lacasa en el tiempo, para el pretratamiento
seleccionado (alta temperatura alcalino). ............................................................................. 61
Figura 18: Concentración de azúcares reductores del residuo alperujo pretratado (alta
temperatura alcalino) durante el tratamiento biológico. ....................................................... 61
Figura 19: Concentración de proteínas a lo largo del proceso de producción enzimática.
Simbología: Control ( ), Alta temperatura ( ), Alta temperatura alcalino (●), Baja
temperatura ( ), Baja temperatura alcalino (Δ) y alcalino ( ). ............................................ 62
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1. Introducción
1.1. Industria olivícola
La industria olivícola se centra en dos principales actividades, la producción de aceituna de
mesa y la producción del aceite de oliva por medio de extracción. La producción de aceite de
oliva se registra desde el 5000 𝑎. 𝐶., con herramientas rudimentarias en Palestina, Creta y
Egipto. En América, las plantaciones industriales de olivo tienen sus comienzos desde 1560
en México, expandiéndose luego a Perú, California, Argentina y Chile. En el año 1950 Chile
importó tecnología desde Italia, descubriendo el potencial de la olivicultura nacional,
alcanzando en el año 1996 una oleicultura competitiva, optando por la diferenciación en la
calidad del aceite producido. Con una mayor densidad de plantas por hectárea, un aumento
de la superficie plantada y en el rendimiento de extracción, se logró abarcar un segmento del
mercado mundial en el que hoy ya ha alcanzado reconocimiento y prestigio (Pefaur Lepe,
2015).
1.1.1. Aceite de oliva
La oleicultura como definición corresponde a la “fabricación y producción del aceite de oliva
y de otros aceites vegetales” (Real Academia Española, 2017). El aceite de oliva posee una
gran variedad de usos, éste se caracteriza por sus grandes cualidades nutricionales,
organolépticas y gastronómicas, pudiendo ser utilizado como alimento tanto en seres
humanos como animales; además, su composición combinada de ácido monoinsaturado y
poliinsaturado, generan una acción beneficiosa en el sistema circulatorio sanguíneo. Por otro
lado, los aceites obtenidos a partir de una segunda extracción que no son aptos para el
consumo humano, podrían convertirse en biocombustible, como biodiésel (Parada, 2008).
En la actualidad, se ha desarrollado un modo de alimentación basado en patrones dietéticos
utilizados en algunos países de la región mediterránea, como España, Francia, Italia y Grecia;
la cual incluye una mayor cantidad de alimentos ricos en ácidos grasos monoinsaturados,
como el aceite de oliva, disminuyendo el riesgo de enfermedades cardiovasculares. Esto ha
sido una de las principales razones que justifican el aumento en el consumo de este producto,
creciendo fuertemente durante los últimos años, tanto en el mundo como en Chile (González
Zagal, 2013).
11
1.2. Mercado nacional
En Chile, a pesar de la estabilización en cuanto a superficie plantada, una de las industrias
que ha destacado con un crecimiento dinámico y significativo es la industria oleícola,
llegando a destacarse internacionalmente en conjunto con otras grandes industrias (frutas,
vinos y salmones), con una buena calidad de aceite de categoría extra virgen. La especial
situación geográfica de Chile, refugiada por la Cordillera de Los Andes y bajo la influencia
del Océano Pacífico, otorgan características del clima mediterráneo especialmente favorables
para el cultivo del olivo (Agencia de Sustentabilidad y Cambio Climático, 2016).
Las características nutricionales beneficiosas del aceite de oliva, mencionadas en el punto
1.1.1, ha sido una de las principales razones que justifican un incremento sostenido de las
tasas de consumo. En Chile, desde 2014 hasta el último informe publicado en el año 2017,
la superficie nacional de plantaciones de olivos destinadas a la producción de aceite de oliva
se ha mantenido estable con 25000 ℎ𝑎 distribuidas entre las regiones de Atacama y del
Maule, concentrándose principalmente entre las regiones de Coquimbo y del Maule, como
se muestra en la Figura 1 (Chile Oliva, 2017a).
El aumento de la producción como se observa en la Figura 2, entre los años 2005 y 2011, se
debió principalmente a la entrada en producción de nuevas plantaciones, la especialización
de los trabajadores en las distintas áreas de la cadena productiva y a la implementación de
nuevas tecnologías, que se traducen en una mayor eficiencia en el proceso de extracción. Por
otro lado, las bajas productivas de los años 2013 y 2014 se debieron principalmente a
fenómenos agroclimáticos que afectaron directamente la producción de las olivas (Agencia
de Sustentabilidad y Cambio Climático, 2016). En cuanto a la producción de aceite de oliva
registrada durante el año 2017, ésta alcanzó las 20.000 𝑡𝑜𝑛, equivalente a un 14,2 % de
aumento respecto al año 2016; debido principalmente a estados fenológicos más
adelantados; sin embargo, en el año 2018, si bien se alcanzó una cosecha que permitió la
producción de 22.000 𝑡𝑜𝑛 de aceite de oliva, se observó de forma generalizada una menor
acumulación de aceite en el fruto (Chile Oliva, 2017a, 2018).
12
Figura 1: Distribución de la superficie plantada con olivos en Chile. Elaboración propia, datos
(Chile Oliva, 2017a).
Figura 2: Producción de aceite de oliva a lo largo del tiempo en Chile. Elaboración propia, datos
(COI, 2018).
13
1.3. Residuo generado
Dentro de la industria oleícola se generan grandes cantidades de residuos, producidos
específicamente en la etapa de extracción del aceite de oliva. Actualmente, estos residuos no
tienen mayor valor y sus características dependerán netamente del método de extracción
utilizado en el proceso, dentro de los cuales se destacan en la actualidad los sistemas de
extracción continua de dos y tres fases. Una de las diferencias entre estos procesos (como se
muestra en la Figura 3), son los subproductos generados. En el sistema de centrifugación de
tres fases se genera además del aceite de oliva, un residuo sólido llamado orujo, el cual está
conformado por hueso, piel y pulpa, y un residuo líquido llamado alpechín, conformado en
su mayor parte por agua y una pequeña porción de materia orgánica y minerales
(aproximadamente un 2%). En el otro caso (sistema de dos fases), se produce el aceite de
oliva y un residuo denominado alperujo, conformado por una mezcla pastosa de alpechín y
orujo, con más de un 55% de humedad (Jiménez Márquez, Hermoso Fernández, & Uceda
Ojeda, 1995).
Figura 3: Balance de masa del método de extracción de aceite de oliva por centrifugación (a) 3 fases
y (b) 2 fases (Christoforou & Fokaides, 2016).
14
En general, los procesos de extracción, incluidos los más modernos (mencionados en la
Figura 3), implican una baja eficiencia de obtención de producto, pues se genera mayor
cantidad de residuo que de producto deseado por cantidad de materia prima procesada. En el
caso particular del sistema más utilizado actualmente, la centrifugación de dos fases, se
producen aproximadamente 800 𝑘𝑔 de alperujo por tonelada de oliva procesada (Rincón,
Borja, Martín, & Martín, 2009).
El proceso continuo de dos fases está basado en el uso de una centrífuga horizontal que
permite el ahorro de agua, y como consecuencia, la reducción del residuo líquido generado;
por lo que se le considera como el proceso más avanzado en la actualidad y que ha sido
acogido por la mayor parte de las fábricas de aceite de oliva. Esta implementación, ha
generado que el desperdicio mayoritario sea de tipo semisólido, el cual presenta un alto
contenido de humedad (55,6 − 74,5%) y materia orgánica; la cual, está compuesta
principalmente por lignina, celulosa y hemicelulosa, que representan aproximadamente un
46%, 21% 𝑦 38% de la materia orgánica, respectivamente. Otros compuestos que forman
parte de la materia orgánica son el aceite retenido, carbohidratos hidrosolubles, proteínas y
bajas fracciones, pero activas, de sustancias fenólicas solubles en agua (1,5%
aproximadamente), que junto con la fracción lipídica, se relacionan con los efectos
fitotóxicos y antimicrobianos del residuo (Alburquerque, Gonzálvez, García, & Cegarra,
2004). De forma más específica, las grandes cantidades de residuo semisólido generado en
el proceso de producción de aceite de oliva, conllevan consigo problemas ambientales
relacionados directamente con su alta carga orgánica con propiedades fitotóxicas y
antimicrobianas, que pueden afectar negativamente los cultivos vegetales, la estabilidad
estructural del suelo y la calidad de las aguas subterráneas (Chartzoulakis, Psarras,
Moutsopoulou, & Stefanoudaki, 2010; Garcia-Ortiz Civantos, 2016).
1.3.1. Actualidad
En la actualidad la intensificación de la actividad industrial, asociada directamente con el
crecimiento de la población, se traduce en un aumento de la generación de residuos,
formando una creciente preocupación en la sociedad moderna. Lo anterior, sumado a la Ley
de responsabilidad extendida del producto (Ley REP), aprobada en mayo de 2016 en Chile,
que establece un marco para la gestión de residuos, la responsabilidad extendida del
15
productor y el fomento al reciclaje con el fin de proteger la salud humana y el medio ambiente
(Ministerio del Medio Ambiente, 2017) hace pertinente la búsqueda de tratamientos y
alternativas de valorización de estos residuos con el fin de mitigar sus impactos ambientales.
La Asociación Chilena de Productores de Aceite de Oliva, Chile Oliva, es una asociación
gremial que incluye a las empresas que participan directamente en la producción del aceite
de oliva y tiene como propósito organizar la industria, tomando un compromiso con la
sustentabilidad. Desde el año 2012, Chile Oliva inició un camino hacia el mejoramiento
continuo, donde para el año 2016 de las 38 empresas pertenecientes a la asociación gremial,
20 adhirieron a un Acuerdo de Producción Limpia y 17 de ellas cumplieron en un 100% la
auditoria final de evaluación; abarcando temáticas como el uso eficiente del agua, gestión de
energía, valorización de residuos, responsabilidad social, entre otras. Desde el punto de vista
del residuo es posible destacar que posee el potencial para ser considerado como un sustrato
interesante para obtener productos valiosos, de interés industrial debido a su alta
concentración inicial de ácidos y fenoles; sin embargo, actualmente en Chile solo el 36% de
las empresas participantes del APL realiza aplicación directa de los residuos orgánicos al
suelo, incorporándolos como aporte de materia orgánica, 27% realiza compostaje, 9% hace
una valoración energética de éstos y el 28% restante no valoriza (Chile Oliva, 2017b).
1.4. Biomasa lignocelulósica
La biomasa lignocelulósica, como el residuo presentado en la sección 1.3, está formada por
celulosa, hemicelulosa, lignina y otros compuestos aromáticos en menor proporción. Dentro
de sus características es posible mencionar que la hemicelulosa posee un menor peso
molecular que la celulosa y está compuesta principalmente por hexosas (como manosa,
galactosa y glucosa) y pentosas (como xilosa y arabinosa); por otro lado, la lignina es un
biopolímero aromático complejo que le proporciona rigidez a la pared celular y resistencia
contra un posible ataque microbiano, es el segundo polímero en abundancia después de la
celulosa y constituye cerca de un 15% de la biomasa terrestre, específicamente en la madera
se encuentra en una proporción del 20 al 35% siendo esta la responsable de su resistencia
mecánica (Brodeur et al., 2011; Hammel, 1996). Los componentes mencionados forman una
estructura compleja donde las cadenas de celulosa se empaquetan en microfibrillas que se
estabilizan mediante enlaces de hidrógeno y se encuentran unidas entre sí por hemicelulosas,
16
polímeros de diferentes azúcares y otros polímeros como la pectina, donde finalmente posee
un recubrimiento de lignina como se muestra en la Figura 4; estas características estructurales
dificultan la degradación de los residuos agroindustriales y por ende, la degradación de la
celulosa en azúcares fermentables (Brodeur et al., 2011; Manzano Chávez, 2013).
Figura 4: Diagrama de la estructura molecular de la biomasa lignocelulósica (Manzano Chávez,
2013).
1.5. Producción enzimática
Para la producción de enzimas ligninolíticas se utilizan hongos basidiomicetos, en específico
los hongos de pudrición blanca. Estos hongos poseen como principal característica ser el
grupo más importante dentro del pequeño número de microorganismos responsables de la
biodegradación de la lignina. El mecanismo de degradación es llevado a cabo gracias a que
estos hongos producen enzimas ligninolíticas, capaces de formar radicales libres en el
biopolímero los cuales desestabilizan los enlaces produciendo la ruptura de la macromolécula
(Barr & Aust, 1994; Hammel, 1996).
17
Los residuos agroindustriales se han convertido en una alternativa extremadamente atractiva
para ser utilizada como substrato en la producción de enzimas ligninolíticas extracelulares
de interés industrial debido a su bajo costo, disponibilidad y grandes cantidades de celulosa,
hemicelulosa, pectina y lignina que sirven como inductores para la producción de enzimas
ligninolíticas (García Torres & Torres Sáe, 2003; Marín, Artola, & Sánchez, 2018;
Raimbault, 1998). Generalmente, la producción enzimática se lleva a cabo en una
fermentación en estado sólido, donde se producen una gran variedad de enzimas; sin
embargo, la estructura de la biomasa lignocelulósica mencionada en la sección 1.4, donde la
naturaleza cristalina de las fibrillas de celulosa y la presencia de lignina, dificultan la
hidrólisis enzimática haciendo pertinente la búsqueda de pretratamientos que permitan una
mayor accesibilidad del hongo a los nutrientes necesarios para su crecimiento y posterior
expresión enzimática (Brodeur et al., 2011).
1.5.1. Fermentación en estado sólido
Dentro de los procesos de producción enzimática se pueden mencionar la fermentación
sumergida (SF) y la fermentación en estado sólido (SSF); ésta última, posee un mayor
rendimiento, requiere equipos más pequeños y simples y es más adecuada para la producción
de enzimas dadas las características fisiológicas y morfológicas de los hongos filamentosos,
por lo que se ha vuelto más relevante en los últimos años (García Torres & Torres Sáe, 2003;
Kriaa & Kammoun, 2016); sin embargo, a pesar de los buenos rendimientos obtenidos, la
SSF se ha desarrollado principalmente a escala de laboratorio (Marín et al., 2018). La
fermentación sumergida a grandes rasgos corresponde al proceso donde los microorganismos
están en contacto con el substrato en un medio acuoso, en cambio la fermentación en estado
sólida presenta baja cantidad de agua libre; de esta manera es posible mencionar una serie de
ventajas y desventajas del uso de la SSF respecto al cultivo sumergido, las cuales se resumen
en la Tabla 1.
18
Tabla 1: Ventajas y desventajas de la fermentación en medio sólido frente a la fermentación
sumergida (Suarez, 1993).
Ventajas • Utiliza sustratos simples
• Recipientes de fermentación relativamente pequeños los cuales
utilizan poca agua y el sustrato se encuentra concentrado
• Crecimiento similar al natural
• Disminuye el riesgo de contaminación por bacterias debido a la
baja humedad
• Altos rendimientos
• No hay líquido residual
Desventajas • Generalmente se requiere de pretratamientos para mejorar la
accesibilidad a los nutrientes, así como, a su estructura física para
favorecer la colonización y penetración del micelio
• Puede ser necesaria la adición de nutrientes que proporcionen un
medio complementario para el inicio del crecimiento del hongo y
la síntesis de enzimas inducibles
• Es difícil separar la biomasa microbiana del sustrato sólido
residual, ya que el micelio está fuertemente unido al sustrato
• Se dificulta el análisis para cuantificar los cambios físicos,
químicos y biológicos durante la fermentación
1.5.2. Pretratamientos
Debido a que la biomasa lignocelulósica posee características estructurales que dificultan la
degradación de la celulosa en azúcares fermentables y que dentro de las desventajas de la
fermentación en estado sólido se encuentra la dificultad de acceder a los nutrientes que la
constituyen, se hace pertinente la utilización de pretratamientos sobre los residuos
lignocelulósicos para generar una conversión de la biomasa de manera eficiente. Los
pretratamientos a aplicar pueden ser de tipo físico, químico, térmico o combinado y tiene
como finalidad promover la conversión efectiva de carbohidratos disponibles como azúcares
fermentables, en otras palabras, debe maximizar la formación de azúcares o en su defecto la
19
capacidad de formar posteriormente azúcares por hidrólisis enzimática y a su vez evitar la
degradación o perdida de carbohidratos (McMillan, 1994). Estos pretratamientos han sido
estudiados principalmente para la accesibilidad de los nutrientes antes de la hidrolisis
enzimática para mejorar la producción de metano en el proceso de digestión anaerobia, por
lo que no se reporta mayores antecedentes de sus efectos sobre la producción enzimática.
Dentro de los pretratamientos reportados para la producción de biogás aplicados residuos
lignocelulósicos se presenta la Tabla 2 algunos ejemplos de los estudios reportados en la
literatura, donde muestran las condiciones aplicadas y sus efectos sobre el residuo.
Tabla 2: Pretratamientos aplicados sobre residuos agroindustriales.
Condiciones Tipo de residuo Efectos del pretratamiento Referencia
Inyección de vapor
a 0,85 𝑀𝑃𝑎, 170°𝐶
durante 60 𝑚𝑖𝑛
Alperujo • No hubo disminución de sólido volátil
y DQO.
• Aumento en un 26,3% de compuestos
orgánicos solubles.
• Aumento de hasta 60,4% en la
concentración total de fenoles.
• No existió mejora significativa en la
producción de metano.
(Serrano et
al., 2017)
NaOH 8,0% 𝑝/𝑝 a
0 𝑦 100°𝐶 durante
10, 30 𝑦 60𝑚𝑖𝑛
Madera de pino • A 100°𝐶 se obtuvieron menores
reducciones de glucano y menor
incremento de lignina insoluble en
ácido con 10𝑚𝑖𝑛 de tratamiento
• A 0°𝐶 hay mayor impacto en tiempos
más largos de tratamiento.
• Ambos tratamientos incrementaron la
el % de sólido volátil.
• Reducción significativa de la
cristalinidad de la celulosa y
eliminación de la lignina.
• Todos los tratamientos mejoraron la
producción de biogás con mejores
resultados para 10𝑚𝑖𝑛 a 100°𝐶
(Salehian,
Karimi,
Zilouei, &
Jeihanipour,
2013)
Remojo en NaOH a
4 𝑦 10𝑔𝑁𝑎𝑂𝐻
100 𝑔𝑇𝑆 en
concentración
sólida de 35 𝑔𝑇𝑆
𝐿 a
55°𝐶 por 12 ℎ
Sorgo • Reducción de la lignina (50 − 70%),
hemicelulosas (18 − 35%), celulosa
(16 − 45%) y ácidos galacturónicos
(hasta 100%), para todas las
variedades de sorgo.
• No tuvo un efecto positivo en la mejora
de los rendimientos de metano.
(Sambusiti,
Ficara,
Malpei,
Steyer, &
Carrère,
2013)
20
1.5.3. Extracción
Una de las dificultades que presenta la fermentación en estado sólido es la necesidad de
añadir soluciones extractantes que permitan la separación de la enzima del sustrato y el hongo
utilizado. Durante este proceso de extracción pueden existir pérdidas de actividad debido a
un área de contacto baja entre el sólido y el extractante utilizado (Zhang & Sang, 2015), lo
que se traduce en una transferencia de masa ineficiente. Otra razón que puede afectar la
recuperación enzimática es la estabilidad de la enzima producida, es decir, la capacidad de
una enzima de mantener su actividad en distintas condiciones de almacenamientos u
operacionales, ya que esta se puede ver afectada por el pH y la temperatura (Sánchez-López
et al., 2010).
Algunos datos obtenidos a escala de laboratorio en recuperación de enzima donde se extrajo
proteasa del salvado fermentado, se concluyó que las condiciones óptimas de lixiviación
fueron durante un tiempo de contacto de 60 𝑚𝑖𝑛 y agitación 100 𝑟𝑝𝑚 con una mezcla de
glicerol y agua como extractante, donde el parámetro más influyente fue la relación sólido-
extractante (1: 5) (Chaithanya, Bhagavathy, & Mrudula, 2012).
1.5.4. Enzimas ligninolíticas
En los años setenta, por medio de la realización de estudios con estos hongos se logró
comprobar que la degradación de la lignina daba lugar a productos que provenían de la
ruptura oxidativa de los anillos aromáticos. El mecanismo del sistema degradador ha
desarrollado un sistema enzimático único y no específico que funciona en el ambiente
extracelular, permitiendo que las enzimas sean catalíticamente activas sobre una gran
variedad de sustratos orgánicos (Dávila-Vázquez & Vázquez-Duhalt, 2006).
Dentro de las enzimas ligninolíticas producidas con hongos de pudrición blanca se
encuentran la lacasa, lignina peroxidasa y manganeso peroxidasa, cuya producción aislada
es de especial interés en la actualidad como una alternativa adecuada por su potencial uso en
la biorremediación de suelos y aguas contaminadas, en la biodegradación de compuestos
recalcitrantes; como sustancias químicas de alteración endocrina (EDC) (Falade, Mabinya,
Okoh, & Nwodo, 2018) o en la industria del papel, principalmente en el proceso de
deslignificación durante el blanqueo (Quintero, Feijoo, & Lema, 2006).
21
La cepa de Trametes versicolor ha sido identificado como un productor eficiente de enzimas
ligninolíticas. La aparición simultánea de enzimas ligninolíticas hace de ésta cepa un hongo
atractivo para diversas aplicaciones biotecnológicas y ambientales; en específico este hongo
segrega enzimas ligninolíticas extracelulares como lignina peroxidasa, manganeso
peroxidasa y lacasa (H. Iqbal, Asgher, & Bhatti, 2011). Para el caso particular de este estudio
el hongo de pudrición blanca utilizado en la producción enzimática se seleccionó basado en
buenos resultados de producción de enzima lacasa a partir de alperujo. Estos resultados
previos se obtuvieron luego de comparar la capacidad de producción de tres enzimas
ligninolíticas utilizando tres hongos de putrefacción blanca. En ese estudio en particular, se
obtuvo la mayor producción de enzima lacasa luego de 15 𝑑 de tratamiento con el hongo
Trametes versicolor con un valor de 1524 ± 79,9 𝑈/𝐿, en cambio si se usaba el hongo
Pleurotus ostreatus o Pleurotus eryngii, sólo se obtenía 647,9 ± 79,9 𝑈/𝐿 y 534,8 ±
68,3 𝑈/𝐿 luego de 10 y 11 𝑑 respectivamente (Garrido, 2017).
1.5.5. Lacasa
Las enzimas fenol oxidasas pueden ser clasificadas en dos grupos, el primero incluye las
polifenol oxidasas, las tirosinasas y las catecol oxidasas, y el segundo incluye las oxidasas
multicobre o también denominadas lacasas (Sánchez-Rosario, Sánchez, Vázquez-Duhalt, &
Andrade-Gallegos, 2011). La enzima lacasa presenta usualmente un peso molecular entre 58
y 90 𝑘𝐷𝑎, pH óptimo entre 2 y 10 y cuatro átomos cobre que oxidan una amplia gama de
compuestos aromáticos utilizando oxígeno molecular en una reacción catalizada por
radicales (Falade et al., 2018). Los átomos de cobre presentes en la enzima se distribuyen en
tres sitios redox: el tipo I corresponde al sitio activo donde se lleva a cabo la oxidación del
substrato (fenol) y en los tipos II y III es donde ocurre la reducción de oxígeno molecular a
agua. La lacasa reacciona con polifenoles y otros compuesto aromáticos derivados de la
lignina, los cuales pueden ser polimerizados o incluso actuar como mediadores redox de bajo
peso molecular, en la Figura 5, se muestra el ciclo catalítico de oxidación donde la lacasa se
activa con una molécula de oxígeno como substrato aceptor de electrones y lo reduce hasta
agua, una vez oxidada la enzima oxida al mediador y recupera su estado inicial, el mediador
activo se difunde hacia la lignina oxidándola (Falade et al., 2018).
22
Figura 5: Ciclo catalítico de oxidación de un sistema lacasa-mediador (Kunamneni, Ballesteros,
Plou, & Alcalde, 2007).
Como se mencionó en el punto 1.4, las enzimas ligninolíticas producidas por los hongos de
pudrición blanca son catalizadores poco específicos en las cuales su mecanismo de reacción
involucra la formación de radicales libres. El uso de oxígeno atmosférico como aceptor de
electrones en la reacción catalizada por la lacasa genera una ventaja sobre el uso de peróxido
de hidrógeno por las peroxidasas, por lo que han atraído una atención considerable en la
última década para aplicaciones potenciales en diversos procesos biotecnológicos como
biorremediación, decoloración de tintes textiles, tratamiento de efluentes, blanqueamiento y
más recientemente se reporta un cambio drástico en su uso para la degradación de
contaminantes emergentes (Falade et al., 2018). Dentro de los contaminantes emergentes se
encuentra la oxitetraciclina (OTC), un antibiótico de amplio espectro perteneciente al grupo
de las tetraciclinas y uno de los dos antibióticos (junto a la estreptomicina) registrados por la
EPA para uso veterinario en tratamiento profiláctico, es decir, para proteger de una
enfermedad (Ahumada-Rudolph et al., 2016). Este antibiótico es difícil de eliminar del agua
debido el anillo fenólico que constituye la estructura principal de la molécula (ver Figura 6),
su capacidad de formar complejos con otras especies, su alta solubilidad y la dependencia de
su estado iónico con el pH (Andrade, 2018).
Figura 6: Estructura molecular oxitetraciclina (Nguyen et al., 2014).
23
2. Objetivos
2.1. Objetivo general
• Definir un proceso de producción y extracción de enzima lacasa de la cepa Trametes
versicolor, utilizando como substrato un residuo generado por la industria oleícola
sometido a pretratamiento.
2.2. Objetivos específicos
• Comparar el efecto de la aplicación de distintos pretratamientos, sobre alperujo, de
tipo térmico, químico y combinado; para la producción de enzima lacasa utilizando
el hongo Trametes versicolor.
• Comparar el efecto del medio extractante utilizado en la etapa de recuperación de la
enzima lacasa producida a partir de alperujo (agua versus buffer).
• Estudiar el comportamiento de la enzima producida y recuperada por medio de la
evaluación de su estabilidad y capacidad de degradación a distintos pH y temperatura
de aplicación.
24
3. Materiales y métodos
Con el fin de abordar los objetivos planteados en este estudio, se realizó un procedimiento
secuencial de tres etapas (Figura 7). El método de producción de enzima lacasa a partir del
residuo alperujo inicia con la aplicación de pretratamientos físicos, químicos y combinados
(etapa 1) sobre éste, donde las variables monitoreadas fueron sólidos totales y volátiles al
alperujo total, azúcares reductores y fenoles a la fase soluble de las muestras pretratadas.
Luego, cada residuo pretratado fue utilizado como sustrato para la producción de enzima
lacasa en una fermentación en medio sólido utilizando el hongo Trametes versicolor (etapa
2), en esta etapa los análisis se realizaron en la fase soluble monitoreando: actividad
enzimática lacasa, azúcares reductores y proteína en el tiempo. Desde la etapa 2, se
seleccionó el ensayo cuyo pretratamiento se tradujo en una mayor expresión de actividad
enzimática lacasa, el cuál fue utilizado para producir esta enzima y pasar a la etapa de
extracción y calidad de la enzima (etapa 3), donde se utilizaron dos extractantes (agua y
buffer) y se monitoreo: la recuperación de la enzima, su estabilidad y capacidad de degradar
en función del 𝑝𝐻 y temperatura de aplicación.
Figura 7: Esquema global del estudio realizado, las líneas punteadas azules representan los límites
de cada etapa.
Térmico
Químico
Trametes versicolor
Extractante 1
Extractante 2
Etapa 1:Pretratamientos
Etapa 2:Producción enzimática
Etapa 3: Extracción y calidad de la enzima
Residuo Alperujo
Combinado
Alperujo total:• Sólido total y volátilFase soluble:• Azúcares reductores• Fenoles
Fase soluble:• Actividad enzimática• Azúcares reductores• Proteína
Fase soluble:• Recuperación• Estabilidad• Degradabilidad
Variables controladas
Residuo sólido
Residuo sólido
Crudo enzimático
Crudo enzimático
25
3.1. Materiales
3.1.1. Residuo
El residuo que será fue utilizado como nutriente para la producción de enzima lacasa,
corresponde a alperujo proveniente de la región de Coquimbo, Chile. Este fue proporcionado
por la Sociedad Agrícola y Ganadera Río Negro Ltda. y se mantuvo almacenado en cámara
fría a una temperatura de 4°𝐶 hasta el día de su utilización. El alperujo se caracterizó
mediante la cuantificación de azúcares reductores, proteína, fenoles y nitrógeno amoniacal a
la fase soluble extraída y nitrógeno total, sólidos totales y volátiles al alperujo total.
3.1.2. Hongo
Para producir la enzima se utilizó una cepa de hongo de putrefacción blanca, específicamente
Trametes versicolor. Ésta se mantuvo preservada en placas Petri de extracto de malta y agar
(MEA). La proliferación del hongo se desarrolló de dos formas:
• Para la etapa 2 de producción enzimática, la proliferación se realizó mediante cultivo
sumergido en matraces de 250 𝑚𝐿 con 100 𝑚𝐿 de medio de cultivo líquido
(Salvachúa et al., 2011). El proceso de cultivo se realizó con agitación constante a
200 𝑟𝑝𝑚 y temperatura de 30°𝐶. El cultivo se dio por finalizado cuando la
concentración de azúcar reductor en el medio líquido se redujo en un 90%. Los
pellets de hongo obtenidos fueron almacenados en un frasco ISO de 1𝐿 (previamente
esterilizado), a una temperatura de 4°𝐶 hasta el momento de su utilización.
• Para la etapa 3 de extracción y calidad de la enzima, se cambió el método de
inoculación, con el fin de disminuir los riesgos de contaminación por manipulación.
De esta manera, la proliferación se realizó mediante técnica de cultivo estático en
matraces de 1𝐿 con 200 𝑚𝐿 de medio de cultivo líquido (Salvachúa et al., 2011).
Los matraces se incubaron de manera estática a una temperatura de 30°𝐶 y el cultivo
se dio por finalizado cuando se observó una película de hongo homogénea cubriendo
la superficie del medio de cultivo. Para almacenar las esporas se realizó una
homogenización del medio y posterior guarda en frasco ISO de 1𝐿 (previamente
26
esterilizado). Se guardó el material a una temperatura de 4°𝐶 hasta el momento de
su utilización.
3.2. Métodos
El procedimiento experimental de producción y estudio de enzimas se dividió en tres etapas
principales (Figura 8): aplicación de pretratamientos, producción enzimática y la extracción
y calidad de la enzima.
Figura 8: Esquema general del procedimiento aplicado sobre el residuo alperujo obtenido a partir
de la extracción del aceite de oliva.
3.2.1. Etapa 1: Pretratamientos
Tal como se indicó en los objetivos específicos, se estudió el efecto de aplicar distintos
pretratamientos sobre el residuo, los cuales fueron térmicos, químico y combinado. En
función de la información descrita en la literatura, se escogieron los valores a estudiar para
las variables de temperatura y pH, estableciendo 3 grupos de pretratamientos (ver esquema
en la Figura 9) que se describen en detalle a continuación:
• Térmico: Se definieron dos niveles, alta temperatura y baja temperatura, el primero
se realizó en autoclave a temperatura de 120°𝐶 durante 30 𝑚𝑖𝑛 y el segundo se
realizó en incubadora a temperatura de 30°𝐶 durante 24 ℎ. En ambos casos el pH no
se controló, utilizando el original del residuo (5,22 ± 0,05).
• Químico: Este pretratamiento consideró la adición de hidróxido de sodio en
concentración 2 𝑁 con el fin de cambiar el pH del residuo a tiempo corto durante
Aceite
Residuo Alperujo
Pretratamiento ProducciónEnzimática
Extracción de la enzima
Crudo enzimático
Ensayo de estabilidad
Ensayo de degradabilidad
Oliva
27
5 𝑚𝑖𝑛 (Trigo Álvarez, 2017). Transcurrido el tiempo de tratamiento se restableció el
pH a su valor original, mencionado en el punto anterior, por medio de la aplicación
de una solución de ácido clorhídrico 2 𝑁. Este último paso se realizó con el fin de
favorecer el crecimiento del hongo (Tavares, Coelho, Agapito, Coutinho, & Xavier,
2006).
• Combinado: Este pretratamiento consideró la aplicación de ambos pretratamientos
térmicos (alta y baja temperatura), en conjunto con la variación de pH indicada en el
pretratamiento químico de acuerdo a los tiempos descritos en el tratamiento térmico.
De forma adicional, se agregó un control, el cual correspondió a residuo fresco, sin pretratar
con el fin de evaluar el efecto de los pretratamientos aplicados. Para ello se cuantificó sólidos
totales y volátiles al alperujo total, y azúcares reductores y fenoles en la fase soluble extraída.
Figura 9: Esquema representativo de los pretratamientos aplicados sobre el residuo alperujo. 1
1 pH original del residuo 5,22±0,05. Independiente del pretratamiento aplicado el pH final del
residuo fue igual al original.
Pretratamientos
Térmico
Alta temperaturapH1
120°C30 min
Baja temperaturapH1
30°C24 h
Químico Alcalino
pH 10
22°C 5 min
Combinado
Alta temperatura alcalino
pH 10120°C30 min
Baja temperatura alcalino
pH 1030°C24 h
28
3.2.2. Etapa 2: Producción enzimática
Luego de realizar los distintos pretratamientos descritos en el punto 3.2.1 al residuo en
estudio, se recuperó el alperujo pretratado y se realizó un cultivo en medio/sustrato sólido
utilizando el hongo de putrefacción blanca Trametes versicolor. Para evaluar la etapa de
crecimiento y expresión del hongo en función del tiempo de cultivo, se cuantificó a la fase
soluble: la actividad enzimática, azúcares reductores y proteína, durante 20 𝑑. Las muestras
fueron de tipo destructivas con mediciones cada 5 𝑑 y en triplicado. Estos ensayos se
realizaron en matraces de 100 𝑚𝐿 con 10 𝑔 del alperujo y una alícuota de 7,5 𝑚𝐿 de pellets
de hongo previamente producidos (sección 3.1.2); los cuales fueron incubados a 30°𝐶 y
monitoreados en función del tiempo de tratamiento (Garrido, 2017). Es importante destacar
que la inoculación del hongo sobre el residuo, independiente del tipo de pretratamiento
aplicado, fue realizada bajo estrictas condiciones de esterilidad, en campana de flujo laminar
y con material estéril.
3.2.2.1. Fase soluble
Para obtener la fase soluble desde el residuo pretratado, luego del tiempo de tratamiento
biológico correspondiente, se adicionó 10 𝑚𝐿 de agua destilada y se aplicó agitación manual;
posteriormente se agitó en un shaker durante 1 ℎ a una temperatura de 10°𝐶 y velocidad de
250 𝑟𝑝𝑚. Finalizada la agitación, el contenido del matraz fue trasvasijado a un tubo tipo
falcon y centrifugado durante 10 𝑚𝑖𝑛 a 10°𝐶 y 5000 𝑟𝑝𝑚. Finalmente, el sobrenadante fue
filtrado usando un tamaño de poro de 0,45 𝜇𝑚 (Garrido, 2017).
3.2.3. Etapa 3: Extracción y calidad de la enzima
3.2.3.1. Producción
De acuerdo con los resultados obtenidos en la segunda etapa, es decir producción enzimática,
se seleccionó el pretratamiento que arrojó mayor expresión de actividad de enzima lacasa
(alta temperatura alcalino). Entonces, se realizó una nueva medición durante 30 𝑑 donde se
cuantificó a la fase soluble y en duplicado, actividad enzimática, azúcares reductores y
fenoles cada 3 𝑑 con el fin de obtener el día de mayor expresión enzimática y comenzar con
la producción masiva. La fase soluble de la muestra fue obtenida por ensayos destructivos
29
como se describe en la sección 3.2.2.1 adicionando 62 𝑚𝐿 de agua destilada para facilitar el
filtrado de la muestra.
Una vez obtenido el día de máxima producción de enzima lacasa, es decir, a los 18 𝑑 de
tratamiento biológico con el hongo Trametes versicolor, se programó la producción masiva
la cual se realizó con un total de 60 matraces de 100 𝑚𝐿, con 10𝑔 de alperujo y una alícuota
de 7,5 𝑚𝐿 del hongo seleccionado en esporas (sección 3.1.2). Tras 18 𝑑, los experimentos
fueron retirados de la incubadora y almacenados en cámara fría hasta el momento de su
utilización en el proceso de recuperación. Las filtraciones, se realizaron en lotes de 3
matraces por vez para el ingreso al proceso de extracción de enzima lacasa.
3.2.3.2. Recuperación de enzima lacasa(Extracción)
En el proceso de recuperación de la enzima que se esquematiza en la Figura 10, se utilizaron
dos medios extractantes: agua destilada y buffer fosfato pH 7 de concentración 100 𝑚𝑀.
Para comparar posteriormente la calidad de la enzima, se utilizó la estabilidad y capacidad
de degradación de la misma. La recuperación se realizó por medio de ensayos destructivos,
donde se adicionaron 62 𝑚𝐿 de medio extractante y se aplicó doble agitación (manual y en
shaker, tal como se describió en la sección 3.2.2.1). A diferencia del proceso descrito en la
sección mencionada, el sobrenadante fue filtrado en primera instancia en sistema al vacío
usando un filtro tipo Whatman 𝑁º1 y posteriormente en carcasa con filtro de tamaño de poro
de 0,45 𝜇𝑚 (Blair, 2018). Finalmente, para obtener el crudo enzimático, el filtrado anterior
se sometió a un proceso de ultrafiltración utilizando la celda Amicon con membrana de
tamaño de poro 10 𝑘𝐷𝑎 y presión de nitrógeno en 2 𝑏𝑎𝑟. El proceso de ultrafiltración se dio
por finalizado cuando el volumen sobre la membrana se redujo lo más posible, verificando
que el filtrado no tuviera más del 10% de la actividad enzimática original. Una vez finalizado
el proceso de ultrafiltración, se realizó la resuspensión del contenido atrapado por la
membrana usando buffer fosfato de 100 𝑚𝑀 a pH 7, generando un crudo enzimático que fue
almacenado en un frasco ISO estéril a 4°𝐶 hasta el momento de su utilización. La
resuspención de la enzima se realizó, en ambos casos, con buffer para asegurar que el tiempo
de almacenamiento, antes de su utilización en los ensayos para estudiar la calidad de ésta, no
afectara la calidad de la enzima obtenida, ya que según se reporta en la literatura la enzima
es más estable en estas condiciones (Sánchez-López et al., 2010).
30
Para analizar el proceso de recuperación, se comparó la concentración esperada teóricamente
con la concentración final medida en el crudo enzimático, la concentración teórica esperada
se calculó considerando las unidades de enzima lacasa recuperadas en el proceso de
filtración.
Figura 10: Esquema representativo del procedimiento experimental para la recuperación de enzima
lacasa en crudo.
3.2.3.3. Calidad de la enzima producida
Con el fin de evaluar la calidad de la enzima se realizó un estudio de estabilidad y
degradabilidad. La estabilidad de la enzima se analizó mediante un diseño experimental
donde las variables manipuladas fueron pH y temperatura (Tabla 3) y la variable respuesta
fue la actividad enzimática residual, es decir, la razón entre la actividad enzimática en función
del tiempo (𝑎𝑡) y la actividad enzimática inicial (𝑎0). De esta manera se realizaron ensayos
análogamente con ambos crudos enzimáticos (extraído con agua y con buffer Figura 10),
donde se incubaron 2000 𝑈 𝐿⁄ de lacasa durante 4 ℎ en tubos criogénicos de 5 𝑚𝐿 con 5 𝑚𝐿
de solución, con combinatorias de tres temperaturas y dos pH (ver Tabla 3). Las mediciones
de actividad enzimática se realizaron en triplicado, con mediciones en función del tiempo:
1/2, 1, 2, 3 y 4 h. En el caso de los ensayos a pH 7 y 5,5, se utilizó tampón fosfato y acetato,
respectivamente; con una concentración de 100 𝑚𝑀 durante la incubación.
Extracción con agua
Extracción con buffer fosfato
Filtrado Whatman 1 Filtrado 0,45µm
Crudo enzimático recuperado
Crudo enzimático recuperado
Ultrafiltración 10 kDa
31
Tabla 3 : Variables de entrada correspondientes al diseño experimental.
𝒑𝑯 [−] Temperatura °𝑪
Crudo enzimático
5,5
4
17
30
7
4
17
30
Una vez finalizado el ensayo de estabilidad y analizados los resultados, para seleccionar las
condiciones utilizadas en el ensayo de degradabilidad, se tomó como parámetro de selección
la estabilidad resultante y con las condiciones, dentro del diseño experimental, que se
asemejan a las condiciones operacionales de la industria en las que podría ser utilizada la
enzima recuperada; de esta manera, las condiciones escogidas para el ensayo de
degradabilidad fueron las temperaturas de 17 y 30°𝐶 a 𝑝𝐻 7.
El estudio de degradabilidad del antibiótico Oxitetraciclina (OTC) se realizó en duplicado,
en tubos criogénicos de 5 𝑚𝑙 con 5 𝑚𝑙 de solución. El ensayo se realizó con muestras
destructivas, es decir, en función del tiempo se quitaron los tubos completos para ser
procesados. Se utilizó una concentración de 2000 𝑈 𝐿⁄ de enzima lacasa producida,
7,5 𝑚𝑔 𝐿⁄ de OTC y buffer fosfato 100 𝑚𝑀 a pH 7. Las muestras se tomaron luego de 2 y
4 h de incubación, se filtraron usando un filtro de jeringa CHROMAFIL RC-20/25, con un
tamaño de poro de 0,20 𝜇𝑚, se acidificaron con una solución de HCL 1𝑀 (previamente
filtrada) y fueron congeladas hasta el momento de su análisis, donde se cuantificó la
concentración de OTC en HPLC (Blair, 2018). Adicionalmente, se agregaron controles para
verificar la ausencia de OTC en las soluciones utilizadas y para evaluar la degradación de la
OTC por efecto de la temperatura en un tubo con las mismas concentraciones mencionadas
sin la enzima producida.
3.3. Técnicas analíticas
Para mayor detalle de las técnicas analíticas utilizadas ver anexo A.
32
4. Resultados y discusión
4.1. Caracterización del residuo
Durante el desarrollo de este estudio se utilizó el residuo agroindustrial denominado alperujo,
proveniente de la zona norte del país, específicamente de la región de Coquimbo, Ovalle.
Este residuo fue caracterizado físico-químicamente con el fin de cuantificar el aumento en la
disponibilidad de nutrientes para la posterior producción enzimática debido a la aplicación
de pretratamientos (Figura 9 del punto 3.2.1). Los resultados de la caracterización del residuo
fresco se presentan en la Tabla 4, donde se puede destacar que el contenido de nitrógeno
Kjeldahl representó un 0,43% de la composición del residuo, lo que se traduce en un
contenido suficiente de nitrógeno orgánico para el crecimiento de hongos (Blair, 2018). La
humedad con un valor 67,9% se encuentra dentro del rango que permite el desarrollo del
hongo reportado en la literatura, sin embargo el valor óptimo de este parámetro es muy
variable lo que ilustra a la humedad como un parámetro poco fiable para predecir el
crecimiento microbiano (Raimbault, 1998). En cuanto a la materia orgánica sobre masa seca
se obtuvo un valor 95,01%, constituida en su mayor parte por celulosa, hemicelulosa y
lignina, tal como se mencionó en la sección 1.3, los cuales por medio de pretratamientos y
acción del hongo utilizado en este estudio pueden ser transformados en azúcares fermentables
disponibles como fuente de carbohidratos para el desarrollo del hongo y la producción
enzimática. Adicionalmente, se reporta que la relación carbono-nitrógeno (C/N) en medios
de cultivo, fermentación en estado sólido y sumergida, varía entre 10,22 y 240,0 (Blair,
2018).
Los valores obtenidos para la caracterización fueron similares a los reportados por otros
autores (ver Anexo B) en caracterizaciones realizadas para distintas zonas dentro y fuera de
Chile. Las diferencias en el contenido de agua (humedad) observada se podría atribuir a las
condiciones climáticas de las distintas zonas de origen del residuo y su estado de maduración;
debido a que en estados inmaduros, el fruto del olivo puede llegar a tener hasta un 90% de
agua, la que disminuye con el nivel de madurez alcanzando un valor de 70% de humedad
para el fruto maduro y con un mayor contenido de aceite y de mejor calidad (Tapia C et al.,
2003); sin embargo, el residuo contiene agua disponible para la fermentación, por lo que
independiente de la zona donde se obtenga esta podrá llevarse a cabo.
33
Tabla 4: Caracterización del residuo alperujo utilizado a lo largo de la experimentación.
Parámetro Valor Unidad
pH 5,22 (±0,05) - Azúcares reductores 3,825 (±0,404) mg/g
Fenoles 2,218 (±0,015) mg/g
Sólidos Totales 0,321 (±0,002) g/g
Sólidos Volátiles 0,305 (±0,001) g/g
Proteínas 1,430 mg/g
Nitrógeno Kjeldahl 4,321 g N/kg
Nitrógeno Amoniacal 0,0862 g 𝑁𝐻4+/kg
4.2. Pretratamientos
En la primera etapa de este estudio se realizaron cinco condiciones distintas de
pretratamiento, las que afectaron las propiedades del residuo. A continuación, se revisan los
efectos observados sobre: la concentración de los azúcares reductores, fenoles, sólidos totales
y volátiles; que representan las características fundamentales que de forma posterior podrían
afectar el cultivo del hongo y por lo tanto la producción de enzimas. De esta manera, como
se mencionó en la sección 1.5.2, estos pretratamientos buscan dar una mayor accesibilidad
de nutrientes durante la producción enzimática en sustrato sólido.
En el caso de la variación de la concentración de azúcares reductores en el medio (fase
soluble), se considera una variable muy importante a monitorear debido a que estos
compuestos serán el azúcar fácilmente disponible y corresponderán a la fuente de energía
inicial, necesaria para el crecimiento del hongo en la siguiente etapa de producción
enzimática. Se obtuvo una diferencia significativa respecto al control (alperujo sin pretratar)
(Figura 11.a) solo para el pretratamiento correspondiente al proceso de alta temperatura
(Tabla 5), donde se obtuvo un aumento del 87% en la concentración de azúcares reductores.
En el caso de las otras condiciones de pretratamiento no se obtuvo diferencia significativa,
manteniéndose una concentración de azúcar reductor en torno a 4 𝑚𝑔/𝑔.
Otra variable respuesta monitoreada luego de la aplicación de los pretratamientos fue el
contenido de fenoles (Figura 11.b), donde se obtuvo un aumento estadísticamente
significativo para el pretratamiento a alta temperatura y alta temperatura alcalino, con un
aumento de 35% y 13% respectivamente, en la concentración de los fenoles presentes en la
34
fase soluble de las muestras analizadas (Tabla 5); en el resto de condiciones de pretratamiento
no se obtuvo diferencia significativa para este parámetro. Los resultados obtenidos coinciden
con los reportados en la literatura, donde los tratamientos a alta temperatura producen un
aumento de la concentración de fenoles como consecuencia de la hidrólisis térmica de la
biomasa lignocelulósica, ya que se generan subproductos como furano y compuestos
fenólicos. Adicionalmente, las altas temperaturas desplazan parcialmente los fenoles totales
a la fase soluble, alcanzando hasta un 60,4% de aumento en la concentración de este
compuesto (Serrano et al., 2017). Como se mencionó en la sección 1.3, estos compuestos son
responsables de la fitotoxicidad del residuo, por lo que estos tratamientos permiten una
posible separación de estos compuestos de la fase sólida y a su vez, pueden ser extraídos de
la fase soluble como un producto de valor agregado, o bien favorecer la expresión enzimática
lacasa al utilizar hongos de pudrición blanca sobre el residuo alperujo para la producción
enzimática, donde los fenoles actúan como intermediario para la oxidación de otros
compuestos de interés (Eggert, Temp, & Eriksson, 1996; García Torres & Torres Sáe, 2003).
La última variable respuesta monitoreada, luego de la aplicación de los pretratamientos, fue
el ratio entre sólido volátil y sólido total del residuo (Figura 11.c), donde solo se observó
variación estadísticamente significativa para el tratamiento alcalino respecto al control, con
una disminución promedio de 1,97% como se muestra en la Tabla 5. Lo anterior se traduce
en que existió una disminución de la cantidad de materia orgánica disponible en el residuo
para el crecimiento del hongo. La disminución observada coincide con lo reportado por otros
autores, donde se obtuvo una disminución del 4,6% respecto al control para un cambio de
𝑝𝐻 durante 1 ℎ, a su vez en el mismo estudio no se obtuvieron diferencias significativas en
el resto de los pretratamientos para este parámetro (Trigo Álvarez, 2017). Respecto al
tratamiento a alta temperatura se reportan aumentos de la materia orgánica de hasta un 26,3%
más alto que en el control (residuo sin pretratar) como consecuencia de la hidrólisis de la
materia fibrosa del residuo alperujo (Serrano et al., 2017), esta tendencia coincide con los
resultados obtenidos; sin embargo, en este estudio este aumento no fue significativo respecto
al control.
35
Figura 11: Resultados obtenidos en el proceso de pretratamientos:(a)Concentración de azúcares
reductores, (b)Concentración de fenoles y (c)Relación sólido volátil- sólido total, en todas las
gráficas se muestra el monitoreo de un control y las mediciones luego de la aplicación de los distintos
pretratamientos.
(a)
(b)
(c)
36
Tabla 5: Diferencias entre promedios de las variables respuesta medidas respecto al control y su
significancia estadística para los distintos pretratamientos aplicados (prueba t-student).
Azúcares Reductores Fenoles SV/ST
Variación
(%) Significativo
Variación
(%) Significativo
Variación
(%) Significativo
Alta
temperatura 87 Si 35 Si 0,38 No
Alta
temperatura
alcalino
11 No 13 Si −0,61 No
Baja
temperatura 21 No 11 No 0,04 No
Baja
temperatura
alcalino 9 No 3 No −0,43 No
Alcalino −5 No 2 No −1,97 Si
4.3. Producción enzimática
Durante el seguimiento del crecimiento del hongo realizado en el alperujo sometido a
distintos pretratamientos, se monitorearon tres variables respuesta en el tiempo: el contenido
de azúcares reductores, de proteína total y la actividad enzimática para la enzima lacasa.
Respecto al contenido de azúcares reductores, fue posible observar que la concentración
inicial variaba en función del tipo de pretratamiento aplicado. Esto se observó previamente
en la sección 4.2, y los resultados que se presentan en esta etapa son consistentes con los
presentados previamente en cuanto a la tendencia que siguió cada pretratamiento respecto al
control, sin embargo existieron diferencias de los valores de concentración obtenidos en esta
segunda etapa, los cuales se pueden atribuir a la preparación de la muestra que en esta
segunda ocasión se agregó agitación en shaker durante 1ℎ como se describe en la sección
3.2.2.1, esta agitación favorece la correcta solubilización de los componentes hidrosolubles
presentes en el residuo previo a la etapa de centrifugación y filtrado, lo que podría explicar
las mayores concentraciones de azúcar medidas en esta etapa. En la Figura 12.(a), es posible
observar una concentración inicial para el control de 13,54 ± 0,42 𝑚𝑔/𝑔 y que la mayor
concentración obtenida se dio en el ensayo con pretratamiento a alta temperatura con un valor
de 18,92 ± 3,61 𝑚𝑔/𝑔, es decir, que este pretratamiento produjo un aumento de 39,73% en
37
la concentración de azúcares reductores, este aumento se debe a que durante el pretratamiento
térmico, el agua del mismo residuo puede penetrar en la estructura celular de la biomasa,
solubilizando la hemicelulosa dando como resultado oligosacáridos solubles que luego se
transforman en azúcares monoméricas produciendo así desplazamiento de compuestos a la
fase soluble (Serrano et al., 2017). De esta manera y bajo la teoría de que el hongo requiere
de nutrientes fácilmente disponibles estos son consumidos rápidamente en los primeros días
de cultivo promoviendo el crecimiento del hongo (Wyman, Henríquez, Palma, & Carvajal,
2018), tal como se observa en la Figura 12.(a), la concentración de azúcares reductores
disminuyó hasta valores menores de 2 𝑚𝑔/𝑔 en tan solo 5 días de cultivo, lo que permitió
un rápido crecimiento del hongo. Lo anterior, se pudo observar consistentemente al
monitorear visualmente el crecimiento del hongo (Figura 13.B). En el caso de las otras
condiciones de pretratamiento (Figura 12.(b)), al tener una menor concentración de azúcares
disponibles (menor a 4 𝑚𝑔/𝑔) el crecimiento inicial del hongo no fue tan rápido. Por otro
lado, respecto a las características visuales del crecimiento del hongo (Figura 13), es posible
atribuir un efecto protector del tratamiento alcalino frente a posibles contaminaciones del
residuo que inhiben el crecimiento del hongo inoculado y por consecuencia la producción
enzimática, esto se puede apreciar en la Figura 13-C, E y F. Para el pretratamiento alcalino
por si sólo (Figura 13-F) se observa menor crecimiento celular del hongo en comparación a
las imágenes B y C de la misma figura al finalizar el tratamiento biológico.
38
(a)
(b)
Figura 12: Concentración de azúcares reductores a lo largo del tiempo de producción enzimática.
En gráfico (a) se representa los pretratamientos Control ( ) y Alta temperatura ( ), mientras que
en el gráfico (b) se encuentran representados los pretratamientos Alta temperatura alcalino (●), Baja
temperatura ( ), Baja temperatura alcalino (Δ) y alcalino ( ).
39
Control Alta temperatura Alta temperatura alcalino
Baja temperatura Baja temperatura alcalino Alcalino Figura 13: Imágenes de los ensayos en el último día de tratamiento biológico (20 d), en la imagen
(A) se encuentra encerrada en rojo la contaminación presente en el ensayo control.
Respecto a la variable monitoreada actividad enzimática (Figura 14), se observa que la
producción de enzima lacasa fue favorecida por la aplicación de los distintos pretratamientos
realizados, independiente de la concentración inicial de azúcares reductores. Estos resultados
coinciden con lo reportado por la literatura donde por un costo de procesamiento razonable
se espera que estos pretratamientos, idealmente, mejoren la reacción de hidrólisis enzimática
(Kim, Lee, & Kim, 2016). De forma específica, luego de 5 𝑑 de cultivo casi todos los
ensayos, a excepción del alperujo pretratado a baja temperatura, superaron la actividad
enzimática expresada por el ensayo control (sin pretratamiento), coincidiendo con la
disminución de azúcares disponibles donde debido al estrés del hongo de no encontrar la
energía suficiente para continuar su crecimiento, comienza la expresión enzimática.
40
Posteriormente, luego de 10 𝑑 de cultivo, la actividad enzimática del alperujo con
pretratamiento alta temperatura alcalino superó la producción máxima del ensayo control,
siendo un valor 72% mayor. Finalmente, luego de 20 𝑑 de cultivo, se obtuvo una actividad
enzimática de 9,66 ± 0,43 𝑈/𝑔 para el alperujo pretratado en condición de alta temperatura
alcalino. El comportamiento descrito previamente se puede atribuir por un lado a la
solubilización de los compuestos fenólicos propios del residuo, los que contribuyen
estimulando la expresión enzimática del hongo (García Torres & Torres Sáe, 2003). Además,
se ha mostrado en la literatura que la aplicación de soluciones alcalinas con hidróxido de
sodio poseen la capacidad de modificar la estructura de lignina, celulosa y/o hemicelulosa
favoreciendo la degradación de biomasa de microorganismos y enzimas, por efecto del
aumento de la porosidad y área superficial interna, alteración la lignina, el hinchamiento de
la estructura, entre otros efectos (Zheng, Zhao, Xu, & Li, 2014). Por otro lado, en el caso del
pretratamiento a baja temperatura, se obtuvo la menor expresión de actividad enzimática
(Figura 14) y se apreció visualmente el crecimiento de otro hongo (contaminación) que
inhibió el desarrollo celular y con ello la expresión enzimática (Figura 13.D), ya que existe
una relación entre la biomasa producida y la actividad enzimática (Manzano Chávez, 2013).
Esta contaminación también se observó en el control (residuo sin pretratar) pero en menor
medida, por lo que existió una mayor expresión enzimática del hongo inoculado.
41
Figura 14: Actividad enzimática de lacasa para el proceso de producción enzimática realizado con
hongo Trametes versicolor en el tiempo. Simbología: Control ( ), Alta temperatura ( ), Alta
temperatura alcalino (●), Baja temperatura ( ), Baja temperatura alcalino (Δ) y alcalino ( ).
Una vez finalizada la segunda etapa de tratamiento biológico al residuo pretratado, se observó
el punto de máxima producción enzimática al finalizar el experimento, lo que sugiere que
puede existir una mayor producción posterior a los 20 𝑑 o bien en un día intermedio, por lo
que se tomó la decisión de realizar una nueva evaluación de los parámetros para al
pretratamiento seleccionado (alta temperatura alcalino). Esta evaluación consideró la
monitorearon, a la fase soluble, de la concentración de azúcares reductores (Anexo C.2),
actividad enzimática (Anexo C.1) y concentración de fenoles (Figura 15), utilizando cepa de
hongo Trametes versicolor en esporas como se mencionó en la sección 3.2.2, donde se obtuvo
una actividad máxima a los 18 𝑑 de 7,10 ± 1,61 𝑈/𝑔, es decir un 26,41 ± 17,27% menor
al tratamiento hecho con pellet, donde el pH inicial fue el mismo en ambos cultivos y la
humedad total al inicio muy similar con un valor de un 80% para el cultivo con pellet y 81%
para el cultivo con esporas (valores óptimos para el desarrollo del celular del hongo utilizado
(Raimbault, 1998)).
42
De forma global, los valores de actividad enzimática máxima obtenidos en este estudio son
distintos respecto a los reportados en literatura utilizando otros residuos agroindustriales
(Tabla 6). Es posible observar como la actividad enzimática de lacasa en este estudio es
131,3% mayor que la obtenida a partir de paja de trigo y 349,4% mayor que la obtenida a
partir de tuza de mazorca; ambos siendo los mayores reportados en literatura al utilizar
fermentaciones en sustrato sólido con esporas del hongo Trametes versicolor.
Tabla 6: Actividad enzimática de distintos residuos. (García Torres & Torres Sáe, 2003).
Residuo Actividad enzima lacasa [𝑼/𝒈]
Salvado de trigo 0,94
Tuza de mazorca 1,58
Bagazo de caña 0,11
Hoja de piña 𝑁𝑜 𝑠𝑒 𝑑𝑒𝑡𝑒𝑐𝑡𝑎
Cereza de café 3,61 ∙ 10−3
Cacota de cacao 2,90 ∙ 10−3
Tamo de arroz 0,94
Paja de trigo 3,07
Como se mencionó anteriormente (sección 1.3), el residuo utilizado se caracteriza por
presentar una alta fitotoxicidad que dificulta su disposición final (Karam & Nicell, 1997), lo
que comúnmente se asocia al alto contenido de compuestos fenólicos. En el caso de someter
el alperujo a un pretratamiento alcalino a alta temperatura para la producción enzimática, se
observó una disminución significativa de los compuestos fenólicos en función del tiempo
(Figura 15), donde la reducción fue de un 67,89 ± 1,14% respecto al valor inicial (antes de
la utilización del hongo para la producción enzimática). Estos resultados muestran que la
etapa de acumulación de enzimas durante el cultivo (18 𝑑 de tratamiento) además de permitir
recuperar crudo enzimático permite el tratamiento del residuo. De acuerdo a esto, y
considerando que el alperujo residual (luego de recuperación de enzimas) podría ser utilizado
en la producción de biogás, se abre una oportunidad de mejora sinérgica, debido que estudios
de literatura han mostrado mejoras significativas en el rendimiento y tasa de producción de
metano como consecuencia de la reducción de la concentración de fenoles (Serrano et al.,
2017).
43
Figura 15: Concentración de fenoles del residuo alperujo pretratado (alta temperatura alcalino),
durante el tiempo de producción enzimática.
4.4. Recuperación de la enzima
Una vez finalizado el proceso de producción y de acuerdo a los resultados obtenidos en la
sección 4.3 de producción enzimática, se inició la etapa de recuperación de enzima utilizando
dos medios extractantes (agua y buffer), para el primer proceso de recuperación (filtración
simple para remover alperujo y hongo) se obtuvo una actividad promedio de 784 ± 197 𝑈/𝐿
y 788 ± 82 𝑈/𝐿 de enzima lacasa para la extracción realizada con agua y buffer,
respectivamente. Al realizar un análisis estadístico entre esas muestras (anexo E.1), se obtuvo
una diferencia no significativa entre medios extractantes, indicando que no hay diferencia en
el uso de ambos medios para la obtención del crudo enzimático antes de concentrar. Desde
este punto de vista, es posible indicar que el medio usado en el lavado del residuo y el hongo,
que permiten solubilizar la enzima y recuperarla no afecta a la actividad enzimática
detectada; sin embargo, no es posible aún indicar que el medio extractante no provoque efecto
a largo plazo.
Respecto al proceso de semi purificación, realizado por medio de concentración, se obtuvo
una pérdida del 11% de la actividad enzimática para el crudo obtenido usando agua y un
44
30% para el crudo obtenido usando buffer. Este resultado puede deberse a una inactivación
de la enzima lacasa al utilizar el medio extractante buffer.
4.4.1. Estabilidad
La estabilidad de la enzima se entiende como la capacidad de una enzima de mantener su
actividad cuando es sometida a distintas condiciones operacionales o almacenamiento. En
este caso se estudió su comportamiento en distintas condiciones de 𝑝𝐻 y temperatura. En el
caso de la variable 𝑝𝐻, se obtuvo una disminución superior a un 40% en ambos concentrados
de crudo enzimático para la condición de 𝑝𝐻 5,5 como se muestra en la Figura 16 (extraído
con agua (a) y extraído con buffer (b)) por lo que fueron descartados para el posterior análisis
de degradabilidad. Por otro lado, en los ensayos realizados a 𝑝𝐻 7, se observó una mayor
adaptación de la enzima al medio, incrementando el valor de la actividad enzimática al
cumplir las 4 ℎ de ensayo, estos resultados concuerdan con lo reportado por otros autores
comprobando el hecho de que a 𝑝𝐻 más ácidos las enzimas ligninolíticas pierden
rápidamente la actividad y son más estables a 𝑝𝐻 cercanos a la neutralidad (Sánchez-López
et al., 2010).
En el caso de la variable temperatura, se realizó el análisis estadístico ANOVA a los
resultados obtenidos para ambos crudos enzimáticos (extraído con agua y buffer) a las
distintas temperaturas planteadas en el estudio con medio de incubación a 𝑝𝐻 7 el cual, como
se mencionó anteriormente, presentó una mayor estabilidad de la enzima. Del análisis
estadístico se obtuvieron los siguientes resultados:
• En el caso de la enzima extraída con agua (Figura 16) existe una diferencia
significativa para los valores de la actividad enzimática residual en función de la
temperatura, entre 4 y 17°𝐶 y 17 y 30°𝐶, mientras que entre 4 y 30°𝐶 no existe
diferencia estadísticamente significativa (Anexo E.2).
• En el caso de la enzima extraída con buffer (Figura 16) no existe una diferencia
significativa para los valores de la actividad enzimática residual graficados en función
de las temperaturas estudiadas (4 y 17°𝐶, 17 y 30°𝐶 y 4 y 30°𝐶, ver Anexo E.3).
Al realizar el análisis estadístico entre los medios extractantes, se obtuvo que no existe
diferencia significativa al comparar los resultados de estabilidad a las temperaturas 4 y 30°𝐶;
45
sin embargo, en el caso de la evaluación realizada a 17°𝐶 se obtuvo una diferencia
significativa entre la enzima extraída con agua versus el extraído con buffer (Anexo E.4). En
esta última condición, se observó una mayor expresión enzimática para el extracto realizado
con buffer alcanzando una actividad residual cercana a 0,85 luego de 2 ℎ; sin embargo, al
término del ensayo (4ℎ), se observó una actividad residual similar en torno a los 0,7 para
ambos extractos, siendo levemente mayor en el caso de la extracción realizada con agua
(Figura 16).
De acuerdo con los resultados presentados, es posible señalar que la enzima presenta un
comportamiento más estable a las temperaturas 4 y 30°𝐶 sin diferencias significativas entre
ellas e independiente del medio extractante utilizado. Por otro lado, se obtuvo una
dependencia de la temperatura para la estabilidad en la enzima extraída con agua con
diferencias significativas entre las temperaturas más estables mencionadas y los 17°𝐶 (4 y
17°𝐶 y 17 y 30°𝐶). Finalmente, se determinó la realización del ensayo de degradabilidad,
con el antibiótico Oxitetraciclina, para ambas enzimas (extraído con agua y buffer) en medio
a 𝑝𝐻 7 y temperaturas de 17 y 30°𝐶, ya que como se mencionó en la sección 3.2.3.3, los
parámetro de selección fueron la estabilidad resultante y con las condiciones, dentro del
diseño experimental, que se asemejan a las condiciones operacionales de la industria en las
que podría ser utilizada la enzima recuperada.
46
(a)
(b)
Figura 16: Actividad residual (𝑎𝑡/𝑎0); (a)extraído con agua como medio extractante y (b)extraído
con buffer como medio extractante, ambos en función del tiempo. Simbología: pH 7: 4°𝐶(●),
17°𝐶(●), 30°𝐶(●), pH 5,5: 4°𝐶(▲), 17°𝐶(▲), 30°𝐶(▲).
47
4.4.2. Degradabilidad
Para medir el efecto de degradación de la enzima, es decir, su capacidad para descomponer
biológicamente por acción de su metabolismo, fueron utilizados los resultados obtenidos en
la sección 4.4.1, donde se seleccionó el medio a 𝑝𝐻 7 y las temperaturas 17 y 30°𝐶, dado
que estas temperaturas representan las condiciones ambientales y de operación de un reactor,
sumado a que se reporta una mayor eficiencia de la actividad de biorremediación a
temperaturas altas, con tasas cinéticas de reducción de contaminantes significativamente más
altas (J. Iqbal, 2003). Sin embargo, se recomienda la realización del ensayo de degradabilidad
a 4°𝐶, con el fin de comparar el efecto de la enzima sobre la degradación de contaminantes
emergentes a bajas temperaturas.
En esta etapa del estudio se utilizó la enzima recuperada y concentrada para degradar el
contaminante emergente Oxitetraciclina. De esta forma, se podría evaluar la capacidad de la
enzima producida con residuo alperujo y hongo Trametes versicolor, de degradar un
antibiótico ampliamente utilizado en conjunto con la dieta alimentaria en la salmonicultura
de nuestro país.
En la Tabla 7 se muestran los resultados obtenidos para el ensayo de degradabilidad, donde
se observa el efecto provocado por la enzima sobre la concentración del antibiótico en
función del tiempo de aplicación. De acuerdo al análisis estadístico tipo ANOVA (Anexo
E.5) no existió diferencia significativa debido al tipo de extractante utilizado (en la etapa de
recuperación) sobre la capacidad de degradar el antibiótico utilizado. Por otro lado, si existió
diferencia significativa en el efecto de la temperatura sobre la degradación del antibiótico,
donde claramente a mayor temperatura (30ºC) se obtuvo una degradación de hasta un 22,4 %
mayor que cuando se realiza el tratamiento a 17ºC en el caso del crudo extraído con buffer.
Lo anterior coincide con resultados reportados por otros autores, donde se expresa que
temperaturas más altas favorecen la actividad enzimática y por consecuencia la degradación
de contaminantes recalcitrantes (J. Iqbal, 2003). Es posible verificar que la degradación
observada se debe principalmente al efecto de la enzima y no a factores como la temperatura,
ya que las concentraciones disminuyeron en porcentajes por sobre la disminución obtenida
para el control.
48
Dado que no existen diferencias significativas entre los medios extractantes en estudio, es
factible utilizar agua por sí sola, disminuyendo así los costos asociados al proceso de
producción y extracción de la enzima semi purificada obtenida a partir de residuo alperujo.
Tabla 7: Reducción de la concentración del antibiótico Oxitetraciclina en el tiempo (4 h).
Reducción en el
control %
Temperatura
°𝑪
Reducción total de la
concentración %
Enzima extraída
con agua
15,3 17 38,7(±1,6)
3,5 30 51,8(±1,8)
Enzima extraída
con buffer
15,3 17 33,8(±0,8)
3,5 30 56,2(±0,5)
49
5. Conclusiones
Al finalizar este estudio, se puede concluir que el pretratamiento aplicado con diferencias
significativas sobre la concentración de azúcares reductores y fenoles en la fase soluble fue
el tratamiento a alta temperatura; sin embargo, se obtuvo una mayor actividad de enzima
lacasa con al pretratamiento realizado a alta temperatura con adición de hidróxido de sodio,
para el cual se obtuvo un valor máximo de 9,66 ± 0,43 𝑈/𝑔 de actividad enzimática luego
de 20 𝑑 de producción con el hongo Trametes versicolor, versus 5,51 ± 2,19 𝑈/𝑔 obtenidas
para el control, alcanzando una actividad 72% mayor gracias al pretratamiento aplicado.
Respecto al proceso de recuperación de la enzima con los medios extractantes agua y buffer,
se concluyó que no existe diferencia estadísticamente significativa entre los medios
extractantes para el proceso de filtración simple, donde se removió el alperujo y el hongo;
sin embargo, el medio extractante si afecta en la etapa de semi purificación donde se obtuvo
una reducción de la actividad enzimática en un 30% para el extracto obtenido con buffer en
comparación con un 11 % para el extracto obtenido con agua.
En cuanto a la estabilidad, se logró concluir que la enzima obtenida a partir de ambos medios
extractantes presenta una mayor estabilidad a 𝑝𝐻 7 y a las temperaturas 4 y 30°𝐶.
Adicionalmente, en el efecto de la temperatura se observó que a 17°𝐶 existe una diferencia
significativa en la estabilidad, asociada al medio extractante; sin embargo, al finalizar el
ensayo (4 ℎ) ambos extractos presentaron una actividad residual (𝑎t/𝑎0) similar en ambos
casos, siendo levemente mayor en el caso de la extracción realizada con agua. Respecto a la
capacidad de degradación de la enzima, se concluye que no existe diferencia respecto al
medio extractante utilizado; sin embargo, si existe diferencia significativa respecto a la
temperatura de aplicación de la enzima, donde la degradabilidad se vio favorecida a
temperaturas más altas.
Finalmente, se concluye que para el proceso de producción de enzima lacasa con el hongo
Trametes versicolor a partir de residuo oleícola, éste debe tener una duración de 18 𝑑
utilizando para ello, un alperujo sometido a un pretratamiento combinado a alta temperatura
con hidróxido de sodio. La enzima producida puede ser extraída con agua siendo las
condiciones óptimas de aplicación 𝑝𝐻 7 y 30°𝐶.
50
Se recomienda, para futuras investigaciones, estudiar el efecto de degradación a 4°𝐶 por su
potencial uso en la biorremediación de sectores naturales con temperaturas bajas.
51
6. Referencias
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57
Anexo
A. Técnicas analíticas
A.1 Azúcares reductores
Para cuantificar la cantidad de azúcares reductores, tanto en la caracterización como a lo
largo del tratamiento con hongo, se utilizó la fase soluble sometida a una técnica
colorimétrica que emplea ácido 3,5 dinitrosalicílico para la hidrólisis de polisacáridos
presentes en la muestra, se cuantificó la absorbancia utilizando un espectrofotómetro marca
Analitik Jena modelo SPECORD 200 PLUS de haz doble con rendija fija, a una longitud de
onda de 640 𝑛𝑚, método DNS (Miller, 1959). La curva de calibración para la interpretación
de los datos obtenidos fue preparada a partir de una estándar de 2 𝑔/𝐿 de glucosa, para
concentraciones entre 0,2 𝑦 1 𝑔/𝐿.
A.2 Actividad enzimática de lacasa
El monitoreo de la actividad enzimática de enzima Lacasa se llevó a cabo utilizando un
método colorimétrico con ABTS (ácido 2,2′-azino-bis (3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico),
utilizando el espectrofotómetro marca Analitik Jena modelo SPECORD 200 PLUS de haz
doble con rendija fija, a una longitud de onda de 436 𝑛𝑚. La medición se realizó a la fase
soluble de la muestra, donde el método mide la oxidación del reactivo 2,2azino-bis-(3-
etiltiazolina-6-sulfonato) (Muñoz, Guillén, Martínez, & Martínez, 1997). En este estudio, se
utilizó el método para baja concentración, el cual contempla una mayor dosis de muestra y
buffer acetato pH 5 de concentración 400 𝑚𝑀.
A.3 Proteína total
Durante el tratamiento biológico se monitoreó el contenido de proteína total con el método
Bradford, el cual se basa en la propiedad del colorante Coomassie azul brillante 𝐺250 de
unirse a proteínas (Walker & Kruger, 2003). El método es espectrofotométrico por lo que se
cuantificó la absorbancia utilizando un espectrofotómetro marca Analitik Jena modelo
SPECORD 200 PLUS de haz doble con rendija fija, a una longitud de onda de 595 𝑛𝑚. La
medición se realizó a la fase soluble de la muestra y la curva de calibración para la
58
interpretación de los datos obtenidos fue preparada a partir de una estándar de 1,5 𝑚𝑔/𝑚𝐿
de Albúmina de suero Bovino, para concentraciones entre 0,3 𝑦 1,5 𝑚𝑔/𝑚𝐿.
A.4 Sólidos totales y volátiles
Para determinar los sólidos totales y volátiles, se utilizó procedimiento estándar de diferencia
de masas (APHA, 2012). Para el análisis de sólidos totales se utilizaron 10 𝑔 de muestra
sólida (total) en estufa a 105°𝐶 durante un mínimo de 24 ℎ, la cual posteriormente, para la
determinación de sólidos volátiles, se pasó a mufla a 550°𝐶 durante 24 ℎ.
A.5 Fenoles
En la determinación de la concentración de fenoles se utilizó el procedimiento de acuerdo el
método de Folin-Ciocalteu (Rover & Brown, 2013), utilizando el espectrofotómetro marca
Analitik Jena modelo SPECORD 200 PLUS, a una longitud de onda de 765 𝑛𝑚. La medición
se realizó a la fase soluble de la muestra. La curva de calibración para la interpretación de los
datos obtenidos fue preparada a partir de una solución de trabajo de ácido gálico de
1000 𝑚𝑔 𝐿⁄ para concentraciones entre 10 𝑦 250 𝑚𝑔 𝐿⁄ .
A.6 Nitrógeno total
Para cuantificar la cantidad total de nitrógeno presente en las muestras analizadas, antes y
después de ser sometidas a pretratamiento, se utilizó el método de Nitrógeno Kjeldahl
(AOAC, 2000), el cual corresponde a la suma del nitrógeno orgánico y el ion amonio 𝑁𝐻4+.
A.7 Nitrógeno amoniacal
Para la determinación de nitrógeno amoniacal se utilizó como método de análisis por
determinación directa con electrodo ion selectivo (APHA, 2012), debido a la baja
concentración de amonio en la muestra, este método admite concentraciones entre 0,1 y
1000 𝑚𝑔 𝐿⁄ y tiene como principio la medición de iones amonio por la conversión a gas
amoniaco al añadir solución ISA.
59
A.8 Oxitetraciclina (OTC)
Para determinar la concentración de OTC, se utilizó un método implementado en
cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC) marca Agilent Technologies, modelo
Infinity 1260, con detector de diodos (DAD) y una columna cromatográfica Kinetex EVO
𝐶18 de 150 𝑚𝑚 de largo y 4,6 𝑚𝑚 de diámetro de fase reversa. La fase móvil corresponde
a una mezcla de ácido oxálico 0,2 𝑀, acetonitrilo y metanol en proporción 64: 18: 18 %𝑣/𝑣
a pH 2 con adición de ácido heptano sulfónico con una temperatura de trabajo es de 30°𝐶
(Prado & Machinski Junior, 2011).
A.9 Análisis de datos
A.9.1. T-student
Para realizar la comparación entre los resultados obtenidos en el proceso de pretratamiento y
en la recuperación con los dos medios extractantes utilizados (agua y buffer), se utilizó la
herramienta de análisis de datos de Excel para medidas independientes. Para determinar si la
diferencia entre los medios extractantes fue significativa, se seleccionó la función para
análisis: “Prueba t para dos muestras suponiendo varianzas iguales”, en el caso del análisis
de los pretratamientos, se seleccionó la función “Prueba t para muestras emparejadas” en
ambos casos se definió una diferencia hipotética entre las medidas de 0 y un nivel de
confianza de 95% (∝= 0,05).
A.9.2. ANOVA
Para realizar la comparación entre los resultados obtenidos en el proceso de estabilidad y
degradabilidad del crudo enzimático obtenido se utilizó la herramienta de análisis de datos
de Excel. Para determinar si las diferencias obtenidas entre los parámetros evaluados eran
significativas se seleccionó la función para análisis: “Análisis de varianza de dos factores con
varias muestras por grupo” con un nivel de confianza de 99% (∝= 0,01).
60
B. Características del alperujo
Tabla 8: Características reportadas por distintos autores para residuo alperujo.
Residuo Parámetro Valor Referencia
Alperujo Sur de
Chile
Carbono Orgánico (%) 51,78 (Suárez, 2012)
Nitrógeno Kjeldahl (%) 0,55
Alperujo Chile pH 5,02 (Varnero,
Galleguillos, &
Rojas, 2011) Humedad (%) 48
Materia Orgánica (g/kg) 773
Nitrógeno Kjeldahl (g/kg) 7,3
Alperujo Sur de
Chile
pH 4,68 (Trigo Álvarez,
2017) Sólidos totales (g/g) 0,21(±0,01)
Sólidos Volátiles (g/g) 0,20(±0,01)
Humedad (%) 79,9(±0,003)
Proteínas (mg/L) 0,18(±0,041)
Alperujo España pH 5,03 (Garcia de la
Fuente R., 2013) Materia Orgánica (g/kg) 896
Nitrógeno total (g/kg) 15,9
C/N 32,2
Alperujo pH 4,9(±0,2) (Rincón,
Bujalance,
Fermoso, Martín,
& Borja, 2013)
Sólidos totales (g/g) 0,265(±0,003)
Sólidos Volátiles (g/g) 0,228(±0,002)
Alperujo Norte de
Chile
pH 4,97 (Garrido, 2017)
Sólidos totales (g/g) 0,36(±0,004)
Sólidos Volátiles (g/g) 0,31(±0,003)
Humedad (%) 64,0(±0,4)
Azúcares (mg/mL) 1,8(±0,21)
Nitrógeno Kjeldahl (g/kg) 2,94(±0,30)
Alperujo Sur de
Chile
pH
Sólidos totales (g/g)
Sólidos volátiles (g/g)
Humedad (%)
Proteínas (mg/g)
Nitrógeno Kjeldahl (g/kg)
Nitrógeno amoniacal (g/kg)
5,35 0,21(±0,006) 0,20(±0,010)
79(±0,6) 0,3(±0,056) 2,0(±0,33)
0,21(±0,009)
(Barrera Celis,
2016)
Alperujo Norte de
Chile
pH
Sólidos totales (g/g)
Sólidos volátiles (g/g)
Humedad (%)
Proteínas (mg/g)
Nitrógeno Kjeldahl (g/kg)
Nitrógeno amoniacal (g/kg)
4,97 0,33(±0,004) 0,31(±0,006)
67(±0,5) 0,48(±0,018) 2,94(±0,32)
0,67(±0,001)
61
C. Tratamiento biológico a 30 d
C.1 Cinética de crecimiento
Figura 17: Actividad enzimática de enzima lacasa en el tiempo, para el pretratamiento seleccionado
(alta temperatura alcalino).
C.2 Concentración de azúcares reductores
Figura 18: Concentración de azúcares reductores del residuo alperujo pretratado (alta temperatura
alcalino) durante el tratamiento biológico.
62
D. Concentración de proteínas
Figura 19: Concentración de proteínas a lo largo del proceso de producción enzimática. Simbología:
Control ( ), Alta temperatura ( ), Alta temperatura alcalino (●), Baja temperatura ( ), Baja
temperatura alcalino (Δ) y alcalino ( ).
E. Análisis estadístico
E.1 Diferencia de la extracción sobre la actividad enzimática
Tabla 9: análisis estadístico t-student para estudiar la significancia de la diferencia en la extracción
del crudo enzimático.
Extracción con Buffer Extracción con agua
Media 788 784
Grados de libertad 8
Estadístico t 0,0425
P(T<=t) dos colas 0,9671
Valor crítico de t (dos colas) 2,3060
63
E.2 Análisis resultados estabilidad comparativo entre temperaturas para
crudo extraído con agua
Tabla 10: Parámetros del anova realizado entre las diferentes temperaturas en el ensayo de
estabilidad del crudo extraído con agua (∝=0,01).
Comparación F F Crítico Significativo
𝟏𝟕°𝑪 − 𝟑𝟎°𝑪 8,04 7,82 Si
𝟒°𝑪 − 𝟏𝟕°𝑪 18,36 7,82 Si
𝟒°𝑪 − 𝟑𝟎°𝑪 2,24 7,82 No
E.3 Análisis resultados estabilidad comparativo entre temperaturas para
crudo extraído con buffer
Tabla 11: Parámetros del anova realizado entre las diferentes temperaturas en el ensayo de
estabilidad del crudo extraído con buffer (∝=0,01).
Comparación F F Crítico Significativo
𝟏𝟕°𝑪 − 𝟑𝟎°𝑪 0,22 7,82 No
𝟒°𝑪 − 𝟏𝟕°𝑪 0,11 7,82 No
𝟒°𝑪 − 𝟑𝟎°𝑪 0,02 7,82 No
E.4 Análisis resultados estabilidad comparativo entre medios extractantes
Tabla 12:Parámetros del anova realizado entre los medios extractantes a las distintas temperaturas
estudiadas (∝=0,01).
Comparación F F Crítico Significativo
Agua-Buffer a 𝟒°𝑪 2,43 7,82 No
Agua-Buffer a 𝟏𝟕°𝑪 26,74 7,82 Si
Agua-Buffer a 𝟑𝟎°𝑪 0,02 7,82 No
E.5 Análisis resultados degradabilidad
Tabla 13: Parámetros del anova realizado entre las diferentes temperaturas y extactantes en el
ensayo de degradabilidad (∝=0,01).
Comparación F F Crítico Significativo
Extractante 0,06 21,20 No
Temperaturas 389 21,20 Si
