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dianas | Vol 6 Num 2 | septiembre 2017 | e20170901 - 1
Estudio del mecanismo de activación de la quinasa dependiente de adenosín monofosfato por capsaicina en células de hepatocarcinoma HepG2.
Elena Spínola Lassoa, Alicia Bort Bueno, Elena Pintos Sánchez, Belén Sánchez Gómez, Nieves Rodríguez-Henche, Inés Díaz-Laviada Marturet
Unidad de Bioquímica y Biología Molecular, Departamento de Biología de Sistemas, Facultad de Medicina y Ciencias de la Salud, Universidad de Alcalá, 28871 Alcalá de Henares, Madrid, España.
Palabras clave: carcinoma hepatocelular; fitoquímicos; capsaicina; TRPV1; calcio; AMPK
Resumen
Debido a la necesidad de encontrar tratamientos efectivos contra el hepatocarcinoma celular y dado el interés que han tomado hoy en día los compuestos naturales, nos centramos en el estudio de la capsaicina, fitoquímico responsable del sabor picante de los pimientos. La actividad antitumoral de la capsaicina ha sido descrita en distintos tipos de cáncer, entre ellos el de hígado. En este trabajo estudiamos el mecanismo de acción de la capsaicina sobre AMPK. Los resultados muestran que la capsaicina produce muerte celular a través de la activación de AMPK y que esta activación es dependiente de calcio/CaMKK e independiente de TRPV1. Además, se describe la posible implicación de ROS en el mecanismo de acción de la capsaicina.
Cita: Spínola Lasso, Elena; Bort Bueno, Alicia; Pintos Sánchez, Elena; Sánchez Gómez, Belén; Rodríguez-Henche, Nieves; Díaz-Laviada Marturet, Inés (2017) Estudio del mecanismo de activación de la quinasa dependiente de adenosín monofosfato por capsaicina en células de hepatocarcinoma HepG2. dianas 6 (2): e20170901. ISSN 1886-8746 journal.dianas.e20170901. URI http://hdl.handle.net/10017/15181
Copyright: © Spínola-Lasso E, Bort-Bueno A, Pintos-Sánchez E, Sánchez-Gómez B, Rodríguez-Henche N, Díaz-Laviada-Marturet I. Algunos derechos reservados. Este es un artículo open-access distribuido bajo los términos de una licencia de Creative Commons Reconocimiento-NoComercial-SinObraDerivada 4.0 Internacional. http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/
Introducción
El carcinoma hepatocelular o hepatocarcinoma (HCC) es el principal tipo de cáncer primario de hígado y
supone la tercera causa de muerte por cáncer, provocando 662.000 víctimas al año [1-3]. La infección por
el virus de la hepatitis B o C y las enfermedades crónicas hepáticas, especialmente la cirrosis, son
importantes factores de riesgo para sufrir la enfermedad y por tanto, la incidencia de HCC en estos
pacientes aumenta de forma considerable [3-4].
Este tipo de cáncer es asintomático en los primeros estadios, lo cual supone un problema para su
diagnóstico y en consecuencia para su tratamiento, ya que suele detectarse en fases avanzadas de la
enfermedad cuando las terapias son menos efectivos. Actualmente, la resección quirúrgica es la mejor
opción de tratamiento, sin embargo, solo es efectiva en etapas iniciales del cáncer. Por ello, es necesaria
la búsqueda de nuevos agentes químicos que puedan frenar el avance de la enfermedad en estadios más
avanzados. Los fitoquímicos, compuestos bioactivos presentes en las plantas, están teniendo un creciente
interés como antitumorales debido a su alta disponibilidad, bajo precio, y a su capacidad para ejercer
otros efectos beneficiosos[5].
Capsaicina
En este trabajo nos centramos en el estudio de un fitoquímico concreto, la capsaicina (CAP). La
capsaicina (trans-8-metil-N-vanilil-6-nonenamida) es un alcaloide lipofílico, responsable del sabor
picante de los pimientos. Forma parte del grupo de los capsinoides, que son los compuestos que se
encuentran de forma mayoritaria en los pimientos picantes, pertenecientes al género Capsicum. En cuanto
a su estructura química, podemos diferenciar tres regiones en la molécula: un anillo aromático, un grupo
amida y una cola hidrofóbica[6-8].
Se ha demostrado que la capsaicina interacciona con un canal catiónico no selectivo denominado TRPV1,
perteneciente a la superfamilia de los receptores TRP (transient receptor potencial). TRPV1 es una
proteína tetramérica integral de membrana cuyos extremos amino y carboxilo terminal están localizados
en la cara intracelular. La capsaicina es capaz de unirse al canal y estimular en minutos la entrada a la
célula de cationes, principalmente de calcio y sodio. Este aumento de cationes intracelulares produce la
despolarización de neuronas nociceptivas, produciendo la sensación del picante [9,10]. El aumento de la
Activación de AMPK por capsaicina
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concentración de calcio intracelular tiene un gran impacto sobre la viabilidad celular debido a la
importancia de este ion en las funciones celulares esenciales.
Numerosos estudios han demostrado que la capsaicina tiene efecto anticancerígeno por su capacidad para
inducir la apoptosis, producir parada del ciclo celular, por sus propiedades antiangiogénicas y por la
actividad antiinvasiva y antimigratoria que tiene dicho compuesto sobre las células tumorales[8].
Recientemente se ha demostrado que las células tumorales modifican su metabolismo como mecanismo
de supervivencia y adaptación al elevado ritmo de crecimiento. Algunos estudios demuestran que el
consumo de capsaicina está relacionado con un aumento de la tasa metabólica y una regulación del
apetito. Por ello, sería interesante estudiar el efecto de la capsaicina sobre el metabolismo de las células
tumorales.
AMPK
La quinasa dependiente de adenosín monofosfato (AMPK) es un regulador metabólico y sensor del estado
energético de la célula. Se trata de una serín-treonín quinasa, que tiene un papel fundamental en el
crecimiento, metabolismo y diferenciación celular. En mamíferos, AMPK es un heterotrímero formado
por una subunidad catalítica () y dos subunidades reguladoras ( y ). Existen distintas formas de
activación de esta quinasa; una de ellas es la fosforilación directa en T172 de la subunidad por LKB1,
(liver kinase B1), que es un supresor tumoral alterado en algunos tipos de cáncer. Además, puede
producirse una activación alostérica por unión de AMP a la subunidad , lo cual produce un cambio
conformacional que aumenta la actividad de AMPK. Esto se da en situaciones de estrés celular (durante el
ejercicio, en situaciones de deprivación de glucosa, en isquemia o por la exposición a fármacos) en los
que la relación AMP/ATP aumenta. Por otra parte, se ha visto que en algunos tipos celulares la activación
de AMPK se produce a través de la CaMKK (quinasa de la quinasa dependiente del complejo
calcio/calmodulina) en respuesta a un aumento de calcio intracelular, o por miembros de la familia
MAPKKK. Cuando AMPK se activa, promueve rutas catabólicas que generan ATP e inhibe vías
anabólicas que lo consumen. Por esta razón, AMPK es esencial en la homeostasis y regulación del
metabolismo celular. Su papel como regulador metabólico, la ha llevado a convertirse en una importante
diana terapéutica en cáncer y otras enfermedades [11-14].
Objetivo
El objetivo de este trabajo es estudiar el efecto de la capsaicina sobre AMPK en células de
hepatocarcinoma HepG2. Se estudiará el mecanismo molecular por el cual actúa la capsaicina además de
su efecto sobre la viabilidad celular.
Materiales y métodos
Se utilizó capsaicina, BAPTA, capsazepina (CPZ) y dorsomorfina dihidrocloruro de TOCRIS (Bristol,
UK); STO-609 y N-acetil cisteína (NAC) de Sigma (St. Louis, MO, USA);. Los anticuerpos primarios
utilizados fueron AMPK, p-AMPK, ACC y p-ACC de Cell Signaling Technology (MA, USA); TRPV1,
CaMKKα y CaMKKβ de Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA) y β-tubulina de
Sigma (St. Louis, MO, USA). Los anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa empleados fueron
IgG anti-rabbit (Cell Signaling Technology, MA, USA) e IgG anti-mouse (Sigma, St. Louis, MO, USA).
Además, se hizo uso de RNA de interferencia específico para CaMKKα (sense:
5’GAAUGAGCCCGUGGUGUUU; antisense: 5’AAACACCACGGGCUCAUUC), CaMKKβ (sense:
5’GCUCCUAUGGUGUCGUCAA; antisense: 5’UUGACGACACCAUAGGAGC) de Sigma (St. Louis,
MO, USA) y para TRPV1 (sense: 5’GCCGUUUCAUGUUUGUCUA ; antisense:
5’UAGACAAACAUGAAACGGC) de Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, USA), así
como los respectivos RNA de interferencia inespecíficos de cada casa comercial.
Cultivos celulares
Se utilizó la línea celular HepG2 procedente de un hepatocarcinoma humano obtenida de American Type
Culture Collection (ATCC Nº BH-8065, Rockville, MD, USA). Para el mantenimiento de las células se
empleó medio DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) de Lonza Group Ldt (Basilea, Suiza),
suplementado con un 10% de suero fetal bovino (FBS) de Sigma (St. Louis, MO, USA) y un 1% de una
solución de diferentes antibióticos (penicilina G 100 UI/ml, sulfato de estreptomicina 100 g/ml y
anfotericina B 0,25 g/ml), de Sigma (St. Louis, MO, USA). Además, se empleó medio EMEM (Eagle’s
Minimum Essential Medium) suplementado con 1% de solución de antibióticos de Sigma (St. Louis, MO,
USA).
Activación de AMPK por capsaicina
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Transfección celular con RNA de interferencia (siRNA)
Las células se sembraron a una densidad de 30.000 células/cm2 en medio sin antibiótico. Para vehiculizar
los RNA de interferencia al interior de la célula se utilizó lipofectamina de Invitrogen (Paisley, UK),
utilizando Optimen (Gibco BRL, Escocia, Reino Unido) como medio de transfección.
Pruebas de viabilidad celular: MTT
Las células se sembraron a una densidad de 37.500 células/cm2. La viabilidad celular se midió con un
método colorimétrico basado en la reducción de MTT (bromuro de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-
difeniltetrazol, Sigma, St. Louis, MO, USA) a formazán, por acción de deshidrogenasas mitocondriales en
células vivas.
Obtención y cuantificación de proteínas
Para la extracción de proteínas, las células se lisaron en 300 μl de tampón de homogeneización (Tris-HCl
50 mM, pH= 7,4; tritón x100; Na3VO4 1 mM; β-glicerofosfato 10mM; NaF 5mM; leupeptina 2 μg/ml;
aprotinina 10 μg/ml; PMSF 0,1 mM). Posteriormente se incubaron 15 minutos y seguidamente se
centrifugaron a 16.060 x g, 10 minutos, a 4ºC. A continuación, se recogió el sobrenadante y se realizó una
cuantificación de las proteínas por el método Bradford [15]. Para ello se hizo uso de un reactivo
comercial de BioRad (Richmond, CA, USA) y de una curva estándar de BSA de Sigma (St. Louis, MO,
USA).
Electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS (SDS-PAGE) e inmunodetección de proteínas
A las muestras con las proteínas problema, se les añadió SBL (Tris 0,06 M, pH= 6,8; SDS 2%; glicerol
10%; β-mercaptoetanol 5%; azul de bromofenol 0,001%) y se sometieron a desnaturalización por calor.
Se realizó una electroforesis de tipo vertical en gel de poliacrilamida-SDS aplicando 20 μg de proteína
por pocillo, en un sistema de BioRad (Richmond, CA, USA) durante 120 minutos, a temperatura
ambiente. Se utilizaron marcadores de bajo peso molecular de Lonza Group Ldt (Basilea, Suiza). Tras la
separación electroforética de las proteínas, se transfirieron a membranas de fluoruro de polivinilideno
(PVDF) de BioRad (Richmond, CA, USA) mediante la aplicación de un campo eléctrico a 100V durante
120 minutos, a 4ºC. Posteriormente se realizó la detección de proteínas. Para ello, se incubaron las
membranas con el anticuerpo primario, toda la noche a 4ºC y después se hizo una incubación de una hora
a temperatura ambiente con el anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa. Tras esto, se realizaron
tres lavados de 10 minutos a temperatura ambiente con TBS-Tween al 0,1% y, finalmente se añadió ECL
(ácido p-cumárico 90 mM; luminol 250 mM; tris-HCl 1,5 M, pH 8,5) y peróxido de hidrógeno. La
detección de luz se hizo por exposición a películas fotográficas HyperfilmTM ECL de AGFA (México
D.F., México).
Medida de especies reactivas de oxígeno (ROS)
Las células se sembraron a una densidad de 31.000 células/cm2 en medio DMEM completo. Para medir
niveles de ROS las células, previamente tratadas con distintos compuestos, fueron incubadas con la sonda
2’,7’-diclorofluoresceína diacetato (λ= 504/524 nm) de Sigma (St. Louis, MO, USA) durante media hora
a 37ºC, 5% CO2. La medición de la fluorescencia emitida se realizó en un citómetro de flujo FASCalibur
(Becton Dickinson Labware, New Yersey, USA), en el canal FL1.
Análisis estadístico
El análisis de las bandas obtenidas en las placas fotográficas tras el Western Blot, se realizó por
densitometrado haciendo uso del programa Scion Image (Scion Corporation, Maryland, USA). El análisis
estadístico de los datos se realizó con el programa Office Excel. Los valores dados corresponden con la
media de los valores obtenidos ± desviación estándar. Para comparar valores entre los que solo varía un
parámetro se realizó la t de Student. Los valores entre los que varían dos o más parámetros se analizaron
aplicando ANOVA y el test de Tukey. El resultado se consideró significativo cuando p<0,05.
Resultados
Activación de AMPK por capsaicina en células de hepatocarcinoma
Para estudiar el efecto de la capsaicina sobre la viabilidad de HepG2, se incubaron las células con
concentraciones crecientes de dicho compuesto durante 24 horas y se observó que la capsaicina produce
muerte celular con un efecto dependiente de la dosis (Figura 1). Para determinar si AMPK interviene en
el mecanismo por el que se produce la muerte de estas células, se utilizó dorsomorfina dihidrocloruro que
es un inhibidor farmacológico de AMPK. En la Figura 1 observamos que la dorsomorfina es capaz de
revertir el efecto que produce la capsaicina sobre la viabilidad celular.
Activación de AMPK por capsaicina
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0
40
80
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160
C CAP20μM CAP50μM CAP100μMCAP150μMCAP200μM
Viabilidad
celular(%
resp
ectoalc
ontrol)
Control
Dorsomorfina
*
*
*
*
*
###
Figura 1. Porcentaje de viabilidad de células de
hepatocarcinoma HepG2, respecto al control, tras
la incubación con dorsomorfina dihidrocloruro 5
M y concentraciones crecientes de capsaicina
durante 24 horas. * Diferencias significativas
respecto al control (p<0,05); #Diferencias
significativas respecto a células incubadas con
CAP (p<0,05).
Teniendo en cuenta estos resultados, se procedió a analizar el efecto que tiene la capsaicina sobre la
activación AMPK. Para ello, las células fueron incubadas durante una hora con dicho fitoquímico a una
concentración de 200 M. Posteriormente se analizaron los niveles de fosforilación de AMPK en el
residuo T172 y de uno de sus sustratos directos, ACC (Acetil-CoA carboxilasa). En la Figura 2 se
observa que la capsaicina aumenta de forma significativa los niveles de la forma fosforilada de AMPK.
Además, también se produce un aumento de fosforilación de ACC lo cual indica que el aumento de p-
AMPK producido por capsaicina corresponde a una activación de la quinasa.
0,00
1,00
2,00
3,00
Nivelesde
proteína(%re
spec
toal
control)
p-AMPK/AMPK
p-ACC/ACC
p-AMPK
p-ACC
AMPK
ACC
β-tubulina
[CAP]200μM +-
*
*
0,00
1,00
2,00
Niveles
deproteína(%res
pectoal
control)
p-LKB1/LKB1
p-LKB1
LKB1
β-tubulina
[CAP]200μM +-
Figura 2. Niveles de las formas totales y fosforiladas
de AMPK y ACC en células de hepatocarcinoma
HepG2 incubadas con capsaicina 200 M durante 1
hora. Los niveles de -tubulina se muestran como
control de carga. *Diferencias significativas respecto
al control (p<0,05). Los resultados son medias S.D.
de cuatro experimentos diferentes.
Figura 3. Niveles de las formas totales y fosforiladas de
LKB1 en células de hepatocarcinoma HepG2 incubadas
con capsaicina 200 M durante 1 hora. Los niveles de
-tubulina se muestran como control de carga.
*Diferencias significativas respecto al control (p<0,05).
Los resultados son medias S.D. de tres experimentos
diferentes.
Mecanismo de activación de AMPK por capsaicina: LKB1
La activación de AMPK puede producirse a través de distintas vías, por ello se procedió a analizar el
mecanismo por el que podría actuar la capsaicina. Tras la incubación de las células con CAP 200 M
durante una hora, se midieron los niveles de la forma total y fosforilada de LKB1. En la Figura 3 se
observa que los niveles de fosforilación no varían respecto al control, por lo que descartamos que la
capsaicina actúe a través de LKB1.
Activación de AMPK por capsaicina
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0,00
2,00
4,00
Nivelesdeproteína(%
resp
ectoal
control)
p-AMPK/AMPK
p-ACC/ACC
p-AMPK
p-ACC
AMPK
ACC
β-tubulina
*
*
*
**
[CAP]200μM + - +-[STO-609]40μM +-- +
#
Figura 4. Niveles de las formas totales y fosforiladas
de AMPK y ACC en células de hepatocarcinoma
HepG2 incubadas con STO-609 10 M y capsaicina
200 M durante 1 hora. Los niveles de -tubulina se
muestran como control de carga. *Diferencias
significativas respecto al control (p<0,05); #
Diferencias significativas respecto a las células
incubadas con CAP (p<0,05). Los resultados son
medias S.D. de tres experimentos diferentes.
Mecanismo de activación de AMPK por capsaicina: CaMKK
Pasamos a estudiar la posible implicación de CaMKK en la activación de AMPK promovida por CAP.
Para ello incubamos las células una hora con STO-609 10 M, un inhibidor farmacológico de las formas
y de CaMKK. STO-609 revierte el aumento de p-AMPK producido por CAP. En el caso de p-ACC
se producen cambios en el mismo sentido aunque no llegan a ser significativos (Figura 4). Estos datos
indican que la CaMKK está implicada en el mecanismo por el que CAP activa AMPK. Hay que tener en
cuenta que este compuesto también disminuye los niveles de p-AMPK y p-ACC respecto a la situación
control, por lo que es posible que en estas células CaMKK esté activando a AMPK de forma basal.
Para corroborar estos resultados, procedimos a silenciar la expresión de CaMKK y de CaMKK
mediante transfección con siRNA selectivo para estas proteínas. La Figura 5A muestra que al silenciar
CaMKK no se modifica la fosforilación de AMPK inducida por CAP. Lo mismo ocurre con p-ACC
cuyos niveles de fosforilación no se ven modificados al silenciar CaMKK. Hay que tener en cuenta que
el silenciamiento de CaMKK es tan solo de un 28% y por tanto para confirmar estos resultados sería
necesario realizar una transfección del siRNA más efectiva. Por otro lado, en la Figura 5B se aprecia que
las células con CaMKK silenciada y tratadas con CAP tienen niveles de p-AMPK menores que las
células no silenciadas (siCtrl) tratadas con CAP. Esto apoya la hipótesis de que CAP activa AMPK a
través de CaMKK en células HepG2.
Papel del calcio y del receptor TRPV1 en el mecanismo de acción de la capsaicina
Como se ha comentado anteriormente, TRPV1 es un canal que actúa como receptor de la capsaicina
produciendo la entrada en la célula de cationes, principalmente de Ca2+ que está implicado en la
activación de la CaMKK. Para determinar si el calcio y TRPV1 están implicados en el proceso de
activación de AMPK promovido por CAP, las células fueron pretratadas durante media hora con BAPTA
40 M, un quelante de calcio intracelular, y con capsazepina (CPZ) 20 M, un antagonista competitivo de
TRPV1. Posteriormente, las células se incubaron con CAP 200 M durante una hora. En la Figura 6A se
aprecia que BAPTA revierte la acción de la capsaicina sobre la fosforilación de AMPK. En el caso de p-
ACC se producen cambios en el mismo sentido aunque no son significativos. BAPTA también produce
un descenso en los niveles de p-AMPK respecto al control, por lo que de nuevo pensamos en una posible
activación basal de AMPK en la que estaría implicada el calcio. Posteriormente se utilizó el antagonista
de TRPV1, capsazepina (CPZ). En la Figura 6B se observa que aunque CPZ parece revertir el aumento
de p-AMPK producido por CAP, los cambios producidos en los niveles de la proteína no son
significativos. Además, CPZ no modifica de manera significativa la fosforilación de ACC.
Activación de AMPK por capsaicina
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0,00
1,00
2,00
Niveles
deproteína(%res
pectoal
control)
p-AMPK/AMPK
p-ACC/ACC
0,00
1,00
2,00Nivelesde
pro
teína(%resp
ectoa
l
control)S iCaMK K β
0,00
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Nivelesde
proteína(%
resp
ectoal
control)
p-AMPK/AMPK
p-ACC/ACC
0,00
1,00
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Nivelesdepr
ote
ína
(%re
spec
toa
l
cont
rol)
CaMK K α
p-AMPK
p-ACC
AMPK
ACC
SiCtrl SiCaMKKβ
β-tubulina
CaMKKβ
[CAP]200μM + - +-
*
*
*
**
p-AMPK
p-ACC
CaMKKα
AMPK
ACC
SiCtrl SiCaMKKα
β-tubulina
[CAP]200μM + - +-
*
* *
A B
Figura 5. Niveles de las formas y de CaMKK y de las formas totales y fosforiladas de AMPK y ACC en células
de hepatocarcinoma HepG2 incubadas con capsaicina 200 M durante 1 hora. La expresión de CaMKK y fue
previamente silenciada mediante transfección de siRNA. Los niveles de -tubulina se muestran como control de
carga. * Diferencias significativas respecto al control (p<0,05); #Diferencias significativas respecto a las células
incubadas con CAP (p<0,05). Los resultados son medias S.D. de tres experimentos diferentes.
Para confirmar los resultados obtenidos por western blot sobre la implicación de TRPV1 en el mecanismo
de acción de CAP, procedimos a realizar el silenciamiento de TRPV1 mediante transfección con siRNA.
En la Figura 7 se observa que la capsaicina aumenta los niveles de las formas fosforiladas de AMPK y
ACC tanto en las células control como en aquellas en las que TRPV1 está silenciado. Esto parece indicar
que la capsaicina activa AMPK de forma independiente a TRPV1. Sin embargo, estos resultados son
preliminares ya que obedecen a un único experimento.
La Figura 8 representa el efecto del silenciamiento de TRPV1 sobre la viabilidad celular. En las células
silenciadas se produce una disminución de la viabilidad celular significativa respecto a la situación
control tanto en presencia como en ausencia de CAP. Esto podría atribuirse a las propias condiciones del
experimento, que son agresivas. Otra posibilidad es que en células de hepatocarcinoma HepG2, TRPV1
sea una proteína esencial para la supervivencia. Es necesario seguir estudiándolo para llegar a una
conclusión.
Mecanismo de activación de AMPK por capsaicina: aumento de ROS
Para continuar con el estudio del mecanismo de activación de AMPK inducido por la capsaicina en
células HepG2, analizamos la posibilidad de que CAP promoviera un aumento de AMP y de esta manera,
la activación alostérica de la quinasa. Como se ha comentado con anterioridad, el estrés celular aumenta
la relación AMP/ATP, lo que puede inducir la activación de AMPK. El estrés oxidativo es una forma de
estrés celular inducida por un aumento en los radicales libres de oxígeno. Para comprobar si CAP induce
estrés oxidativo en las células HepG2, se incubaron con la sonda DCFDA que mide la concentración
intracelular de especies reactivas de oxígeno, ROS. En la Figura 9 vemos que la capsaicina aumenta de
Activación de AMPK por capsaicina
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forma muy notable el porcentaje de ROS. Este aumento es contrarrestado cuando se añade NAC, un
antioxidante, o cuando se añade el quelante de calcio BAPTA. Estos resultados indican que la capsaicina
induce de manera notable la formación de especies reactivas de oxígeno en HepG2, que por estrés
oxidativo podría aumentar la relación AMP/ATP produciendo la activación de AMPK; y que el calcio
está implicado en este proceso.
Figura 6. Niveles de las formas totales y fosforiladas de AMPK y ACC en células de hepatocarcinoma HepG2
incubadas con BAPTA 40 M (A), CPZ 20 M (B) y capsaicina 200 M, 1 hora. Los niveles de -tubulina se
muestran como control de carga. * Diferencias significativas respecto al control (p<0,05); #Diferencias significativas
respecto a las células incubadas con CAP (p<0,05). Los resultados son medias S.D. de tres experimentos diferentes.
0,00
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Niveles
deproteína(%
resp
ectoal
control)
p-ACC
p-AMPK
0,00
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Nivelesde
proteína(%
res
pectoal
control)
TRPV1
AMPK
ACC
TRPV1
p-AMPK
p-ACC
SiCtrl SiTRPV1
[CAP]200μM + - +-
β-tubulina
[CAP]200μM + - +-
SiCtrl SiTRPV1
Figura 7. Niveles de TRPV1 y de las formas totales y fosforiladas de AMPK y ACC en células de hepatocarcinoma
HepG2 incubadas con capsaicina 200 M, 1 hora. La expresión se las TRPV1 fue previamente silenciada mediante
transfección con siRNA. Los niveles de -tubulina se muestran como control de carga. *Diferencias significativas
respecto al control (p<0,05); #Diferencias significativas respecto a las células incubadas con CAP (p<0,05). Los
resultados son medias de un experimento.
Activación de AMPK por capsaicina
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60
80
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C CAP100μM
Viabilidad
celular(%
res
pectoalco
ntrol)
S iCtrl
SiTRPV1
#*
*
*
0
250
500
750
1000
C CAP200μM
%FluorescenciaDCFDA
Control
NAC
BAPTA
Figura 8. Porcentaje de viabilidad de células de
hepatocarcinoma HepG2, respecto al control, tras la
incubación con capsaicina 100 M durante 24 horas.
La expresión de TRPV1 fue previamente silenciada
mediante transfección con siRNA. *Diferencias
significativas respecto al control (p<0,05);
#Diferencias significativas respecto a las células
incubadas con CAP (p<0,05). Los resultados son
medias S.D. de dos experimentos diferentes.
Figura 9. Porcentaje de fluorescencia de la sonda
DCFDA (indicativa de niveles de ROS) de células de
hepatocarcinoma HepG2, tras la incubación con NAC
10 M, BAPTA 20 M y CAP 200 M durante 1 hora.
Los resultados son medias S.D. de dos experimentos
diferentes.
Discusión
En este trabajo nos centramos en el estudio del efecto antiproliferativo del compuesto natural capsaicina
en células de carcinoma hepatocelular. Se ha analizado la activación de AMPK y el mecanismo
implicado. Los experimentos realizados en nuestro laboratorio demuestran que la capsaicina produce la
muerte de células HepG2 de manera dosis dependiente, y que aumenta de forma clara la fosforilación de
AMPK. El aumento de la forma fosforilada de AMPK está relacionado con una activación de dicha
proteína, ya que los niveles de p-ACC también aumentan por efecto de CAP.
Se ha determinado que AMPK puede intervenir en procesos que contribuyen a la patogénesis del cáncer y
actuar como supresor de tumores. Así, niveles bajos de p-AMPK se asocian a malos pronósticos de la
enfermedad [13].
Está descrito que en en situaciones de baja energía, AMPK actúa sobre el metabolismo de las células
inhibiendo el crecimiento y proliferación de las mismas [12]. En los resultados de este trabajo, la
inhibición que produce la dorsomorfina indica que la activación de AMPK está implicada en el efecto
antiproliferativo de CAP. Se ha visto que otros compuestos naturales también inhiben la proliferación
celular en HCC por activación de AMPK [16]. El mecanismo por el cual AMPK produce inhibición del
crecimiento no está del todo claro pero una posibilidad es que AMPK active el proceso de autofagia a
través de la inhibición de mTOR. Por ejemplo en células HepG2 tratadas con cannabinoides, se produce
autofagia y muerte celular a través de la activación de AMPK [17].
A pesar de que LKB1 es la principal responsable de la fosforilación de AMPK, nuestros resultados
muestran que en células de hepatocarcinoma LKB1 no media la activación de AMPK producida por
caspsaicina. Por otra parte, los datos obtenidos al usar inhibidores o siRNA específicos para las dos
formas de la CaMKK y el quelante de calcio, parecen indicar que en la línea celular empleada,
Ca2+/CaMKK interviene en el proceso de activación de AMPK promovido por CAP. Aunque en otros
tipos de cáncer se ha determinado que AMPK puede ser activadada por CaMKK, es la primera vez que
se describe esto en células de HCC.
Teniendo en cuenta los resultados obtenidos al eliminar la función de TRPV1 en células HepG2 ya sea
por antagonismo o por silenciamiento de su expresión, pensamos que (a tiempos cortos) la capsaicina
activa AMPK en este tipo celular de forma independiente a TRPV1.
Por último, los resultados obtenidos al medir especies reactivas de oxígeno por citometría de flujo
muestran que la capsaicina aumenta de forma notable los niveles de ROS en células HepG2. Las especies
reactivas de oxígeno se han relacionado durante mucho tiempo con cáncer, considerándose que el
aumento de sus niveles pueden resultar oncogénicos por producir daño en el DNA, proteínas y lípidos y
por promover la inestabilidad genómica y la tumorogénesis. Sin embargo, hay que tener en cuenta que los
ROS también pueden promover señalización anticancerígena, induciendo muerte de células tumorales por
estrés oxidativo [18]. Nos planteamos la posibilidad de que el aumento de ROS inducido por CAP
aumente la relación AMP/ATP, produciendo así la activación alostérica de AMPK. Por ello se pretende
continuar el estudio determinando los niveles intracelulares de AMP para confirmar esta hipótesis.
Activación de AMPK por capsaicina
dianas | Vol 6 Num 2 | septiembre 2017 | e20170901 - 9
En resumen, la capsaicina produce disminución de la viabilidad de células de hepatocarcinoma HepG2 a
través de la activación de AMPK. Dicha activación es promovida por calcio y por la CaMKK pero es
independiente de TRPV1. Además, es posible que CAP produzca estrés oxidativo que aumente la relación
AMP/ATP produciendo la activación alostérica de la quinasa.
De acuerdo con estas conclusiones, actualmente se está llevando a cabo un estudio “in vivo” para
determinar el efecto antitumoral de CAP y estudiar la activación de AMPK en tumores xenógrafos
inducidos en ratones atímicos. Para ello ha sido necesario realizar el correspondiente curso de formación
para obtener la capacitación de experimentación animal, que se ha hecho durante el desarrollo de este
trabajo de fin de máster.
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