Estudio fitoquimico y microbiológico en el extracto etanólico de Acalypha arvensis y Acalypha...
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UNIVERSIDAD VERACRUZANA
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
QUÍMICA INDUSTRIAL
Estudio fitoquimico y microbiológico en el extracto etanólico de Acalypha arvensis y
Acalypha Alopecuroidaes
LABORATORIO DE FITOQUÍMICA
DOCENTE: QI. MARÍA MAGDALENA LUNA BARRADASTÉCNICO ACADÉMICO: MC. ODÓN CASTAÑEDA CASTRO
INTEGRANTES:JESUS ANTONIO CRUZ NAVARRO
ALDO MARTÍNEZ HERNÁNDEZOSCAR ANTONIO SÁNCHEZ AGUIRRE
MARCO TEÓRICO
Descripción de Acalypha arvensis Poepp. & Endl
Los autores Standley y Steyermark, 1949; Stevens et al., 2001, describen a la hierba del
pastor como una hierba de vida corta (a veces perennes), a veces leñosa en la base, que
llega a medir 70 cm de alto, su tallo es erecto o ascendente, simple o ramificado, con
pelillos cortos (a veces erguidos).
Sus hojas son alternas, rómbico-ovadas, de hasta 7 cm de largo y hasta 4 cm de ancho, con
el ápice variable, los márgenes aserrados, la base redondeada o angostándose, cubiertas de
abundantes o escasos pelillos. Los pecíolos de hasta 3 cm de largo, con pelillos como en los
tallos, sin glándulas en el ápice. En el tallo, junto a la base del pecíolo, se presentan un par
de hojillas llamadas estípulas, muy angostas, de hasta 5 mm de largo.
Sus inflorescencias son Espigas en las axilas de las hojas. Las espigas masculinas están
ubicadas en la parte media de la planta, de hasta 3 cm de largo y hasta 1.5 mm de grueso,
sobre pedúnculos de hasta 2.5 cm de largo y cubiertos de pelillos como los de los tallos,
estas espigas están compuestas de flores masculinas dispuestas en grupitos en las axilas de
brácteas diminutas. Las espigas de la parte superior de la planta (de hasta 8 cm de largo y 2
cm de ancho cuando ya se han desarrollado los frutos) son femeninas, sobre pedúnculos de
hasta 3 cm de largo y cubiertos de pelillos que a veces son glandulares, estas espigas están
compuestas por flores femeninas (a veces unas pocas masculinas) dispuestas en grupitos (1
a 3 flores) en las axilas de brácteas, éstas densamente agrupadas (ocultando el eje de la
espiga), divididas en 3 a 7 lóbulos triangulares con una larga y delgada punta (de hasta 5
mm de largo), cubiertas de pelillos largos y erguidos y pelos glandulares.
Sus flores masculinas son muy pequeñas, casi sésiles, el cáliz con 4 lóbulos, pétalos
ausentes, estambres generalmente 8, libres. Las flores femeninas sésiles, el cáliz de 3 a 5
lóbulos, pétalos ausentes, el ovario con 2 a 3 estilos de hasta 4 mm de largo, unidos hacia la
base y divididos en delgados segmentos hacia el ápice, rojizos. A veces se presentan
algunas flores femeninas sésiles o pedunculadas, que no van acompañadas de brácteas.
El fruto es una cápsula de hasta 1.5 mm de largo y más o menos 2 mm de ancho, cubierta
de pelillos, y que al madurar se separa en 2 o 3 segmentos (quedando la columnela en el
centro).
Clasificación taxonómica de Acalypha arvensis Poepp. & Endl
Se encuentra en el reino Plantae dentro del subreino Traqueobionta (plantas vasculares) con
superdivisión Spermatophyta (plantas con semillas) en la división Magnoliophyta (plantas
con flor) dentro de la clase Magnoliopsida, ubicada en la subclase Rosidae y finalmente se
ubica en el orden Euphorbiales.
Distribución en México
Se ha registrado en Campeche, Chiapas, Colima, Morelos, Oaxaca, Tabasco y Veracruz
(Villaseñor y Espinosa, 1998).
Nombres comunes usados en español
Hierba del cáncer, gusanillo, gusanito, mata-gusano, corrimiento, gatito, espinosilla, hierba
del gusano (Martínez, 1979; Standley y Steyermark, 1949).
Imagen 1. Inflorescencias de Acalypha arvensis Poepp. & Endl
Usos de Acalypha arvensis Poepp. & Endl
En Veracruz, los usos medicinales que se dan a esta planta la indican contra la diarrea y
como antiemético, para lo cual se emplea la planta entera en cocimiento administrada por
vía oral. Se prescribe: en buches para aliviar granos en la boca (aftas); de forma externa, en
lavados locales para sanar heridas y granos, o en baños para los niños recién nacidos.
Incluso se aconseja su uso contra las picaduras de capulincillo (picadura de araña capulina).
En Tabasco, para la aliviar la sarna se dan baños con la cocción de las hojas, o maceradas
junto con tabaco se aplican para el piquete de araña.
Efectos farmacológicos de Acalypha arvensis Poepp. & Endl
Únicamente se ha demostrado la actividad antibiótica contra Staphylococcus aureus que
ejerce la tintura de las hojas, la cual fue probada también contra Escherichia
coli, Pseudomona aeruginosa y Candida albicans con resultads negativos. Además se
investigaron, la actividad diabética en rata y la acción citotóxica de los extractos
metanólico, clorofórmico y etéreo, en cultivos de células de carcinoma humano de colon
CO-115, sin resultados positivos.
El inicio de la Herbolaria y la Medicina Tradicional
El consumo sistemático de plantas con atributos medicinales se remonta posiblemente a 2
millones de años en algún lugar de África, cuna de la humanidad. Los primeros prosimios,
probables ancestrales del hombre, buscaban en las imponentes selvas los paliativos para
eventuales disturbios orgánicos. A medida que la evolución ensayaba y esculpía la
inteligencia en los primeros hominídeos, el instinto fue cediendo lugar a la razón, y la
búsqueda de la flora, ahora empírica, pasó a contar con un fuerte aliado: el espíritu
investigador. (Chifa, 2010)
En los orígenes de la historia, cuando la sabiduría popular fue emergiendo de las tinieblas,
la noción de planta activa fue englobando tanto a la que alimentaba, a la que curaba como a
la que mataba. Brujos, magos y curanderos poseían a la vez la ciencia de los venenos y de
las drogas, por lo que se les atribuía un poder relacionado con los espíritus y con lo
sobrenatural. La herbolaria, producto de una rica tradición cultural de nuestros pueblos,
posee mayor antigüedad que cualquier otra terapia. La eficacia terapéutica intrínseca que
posee la herbolaria americana, se debe a las propiedades que derivan de los principios
activos de las plantas y que han sido utilizadas por generaciones enteras con el éxito
deseado. Pero no solamente curan los metabolitos secundarios contenidas en las plantas, un
fuerte componente de carácter cultural se añade a la terapia para hacer de esta un
tratamiento exitoso (Chifa, 2010).
La interacción del hombre con su variada naturaleza generó una gran cantidad de
conocimientos científicos y empíricos sobre el correcto aprovechamiento de los recursos
que nos ofrecen las plantas. Es por esta razón que la medicina tradicional encuentra en
América Latina un lugar preponderante, pues la cosmovisión indígena valoriza las formas
naturales de entender y curar las enfermedades en contraposición de lo que predica la
medicina clásica.
En América, la medicina reconocida oficialmente para atender las distintas enfermedades
del pueblo es la alopática, que reduce al enfermo como si se tratara de una máquina
descompuesta que será restaurada. Utiliza para esto un despliegue impresionante de
tecnología producida en los países capitalistas avanzados y, por otra parte, se basa en el
consumo inmoderado o descontrolado de fármacos. La mayoría de estos fármacos fueron
investigados y elaborados para atender las patologías de los países desarrollados de acuerdo
a las necesidades propias de aquellos países. Las corporaciones multinacionales que los
producen, invaden los países que dependen de una economía de mercado circunscripta al
capitalismo internacional, en virtud de que en dichos países existen pocas estrategias de
control.
Dentro de estas otras medicinas, se encuentran la herbolaria, la homeopatía, la acupuntura,
el naturismo, el curanderismo, el chamanismo, el espiritualismo, y en general la medicina
indígena tradicional. Estas prácticas alternativas de la medicina, muchas veces
denominadas medicinas paralelas, quedan ignoradas por la ciencia médica oficial y por lo
tanto borrada de las preocupaciones de las demás ciencias, incluidas las sociales. No
obstante, en el panorama cotidiano, las medicinas marginales, especialmente la medicina
indígena tradicional, muchas veces llamada medicina popular, constituyen una realidad a la
que se debe conocer, respetar y contribuir a su preservación de una manera positiva y
creativa.
La Medicina Tradicional ha desempeñado un papel importante en el tratamiento de diversas
patologías, fundamentalmente en los países en desarrollo. En ellos, el 80 % de la población
acude a este tipo de medicina para satisfacer las necesidades primarias de salud. Si bien los
productos de origen vegetal, particularmente las drogas secas y los extractos, pasaron de
ocupar un lugar preponderante a un segundo plano, en las últimas décadas han vuelto a
alcanzar una presencia cada vez mayor en la Medicina Occidental. Este retorno ha sido
propiciado por el regreso hacia lo natural, pero también debido al desarrollo científico de
los fitomedicamentos y al mayor conocimiento del riesgo beneficio de los fármacos
sintéticos. (Prieto-Gonzales, et al. 2002).
Muchos profesionales de la salud cuestionan esta medicina por el hecho de no contar con la
explicación de algunos de los efectos que produce. El hecho de que no exista en este
momento un método capaz de desentrañar los fenómenos físico/químicos que expliquen los
cambios biológicos que tienen lugar con la aplicación de estas terapias, no invalida su
carácter científico, por lo que cada día hay más investigación sobre los principios activos en
plantas. (Barranco, 2009).
El estudio químico de las plantas
Se estima que el número de especies de plantas con flores está situado entre 200000 y
250000, distribuidas entre 300 familias y 10500 géneros. Pese a la rápida expansión de la
literatura fitoquímica, solo un pequeño tanto por ciento de la totalidad de las especies se ha
estudiado y queda, por tanto, un amplio campo de investigación (Trease y Evans, 1991).
Dependiendo la cultura y el país, las plantas que se encuentran en dichas regiones han sido
utilizadas para fines curativos o remedios naturales, lográndose una colección vegetal
recopilada por siglos mediante tanteos y errores utilizando al propio humano como
conejillo de indias, sin saber cuáles fuesen las consecuencias y las reacciones secundarias.
A raíz de ello, se sabe que plantas sirven para curar determinadas enfermedades y que parte
de la planta utilizar, logrando que este conocimiento sea transferido de generación a
generación, sin embargo, la población desconoce cuál es el principio activo o que ocasiona
que la enfermedad sea curada.
Este tema ha llamado la atención considerablemente, y al cabo de muchos años, ha llevado
al químico hacia la investigación básica y aplicada en el campo de la botanica, logrando
que en los últimos 40 años se hayan aislado y caracterizado miles metabolitos secundarios
(alcaloides, heterósidos, etc), permitiendo una prospección de muchas muestras de plantas.
Un examen de la lista de fármacos derivados de fuentes naturales revela que la mayoría
procede de Espermatofitas, plantas con semilla que predominan en el campo.
El análisis fitoquímico tiene por objetivo determinar los metabolitos secundarios presentes
es una especie vegetal a estudiar, aplicando para ello una serie de técnicas de extracción,
separación, purificación y determinación estructural (UV, IR, RMN, Masas, etc). (Look,
1994).
Se han desarrollado una serie de métodos para la detección preliminar de los diferentes
constituyentes químicos, basados en la extracción de estos con disolventes apropiados y en
la aplicación de pruebas de coloración.
Uno de los métodos clásicos de análisis muy utilizado para el estudio químico de una planta
son los ensayos a la gota o marcha fitoquímica (esquema 1), que consiste en una previa
maceración de la parte de la planta a estudiar, para posteriormente realizar pruebas al
extracto utilizando diversos reactivos reportados en la bibliografía, con el objetivo de
conocer qué tipo de metabolitos secundarios están presentes. Actualmente, esta
metodología suele ser complementadas con técnicas más avanzadas como las técnicas
cromatograficas, dentro de las cuales, las más utilizadas son: cromatografía en capa fina
(CCF) la cual se utiliza para tener una noción de la cantidad de metabolitos presentes en
una muestra, cromatografía liquida de alta eficiencia (HPLC, por sus siglas en inglés) que
se usa para cuantificar los metabolitos en un extracto de una planta, y la cromatografía de
gases, que se utiliza para la identificación de metabolitos secundarios volátiles, como
aceites esenciales y diversos tipos de alcoholes.
Planta seca y pulverizada
Extracto etanólico
Maceración en caliente con EtOH por 48 h
Fracción A
Taninos Aminoacidos Flavonoides
Insoluble Solución acida
Fracción B
Esteroles Quinonas Fase orgánica Fase acuosa
Fracción C
Esteroides Alcaloides
cc. a sequedad + 4ml de DCM
cc. a sequedad + 4ml de HCl al 1%
Fracción D Fracción E
Fase orgánica Fase Ac.
Extraer con EtOH, DCM
3:2
cc. a sequedad y ext con 150ml de HCl al 1% a 50°C
Lavar con agua y ext con DCM.
Alcalinizar con NH4OH y extraer con DCM
Lavar con agua, secar y llevar a 50mL
Esteroides Flavonoides Antocianinas Alcaloides
Alcaloides Antocianidinas
Esquema 1.
Metabolitos secundarios frecuentes en las plantas
Se llaman metabolitos secundarios a los compuestos químicos sintetizados por las plantas
los cuales cumplen funciones “no esenciales”, de forma que su ausencia no es fatal para la
planta, ya que no intervienen en el metabolismo primario de la planta. Los metabolitos
secundarios intervienen en las interacciones ecológicas entre la planta y su ambiente.
(Swain, 1973).
Los metabolitos secundarios se agrupan según su origen biosintético, y así podemos
mencionar a los terpenos, esteroides, flavonoides, saponinas, cromenos, benzofuranos,
coumarinas, quinonas, entre otros.
Alcaloides
Un diverso número de plantas contienen alcaloides, y tan solo las propiedades químicas
debidas al nitrógeno básico unifican las numerosas clases de alcaloides, por lo que su
importancia, taxonomía y biogénesis son enjuiciadas de forma adecuada en relación a una
determinada clase de alcaloides. (Trease y Evans. 1991).
Es un tanto difícil definir el termino alcaloide debido a que no existe una clara distinción
entre alcaloides y aminas complejas de origen natural, sin embargo, en la literatura se
encuentran diferentes “definiciones” del termino alcaloide, Pelletier (1982) citado por
Bañuelos, et al. (2006) define a los alcaloides como “compuestos cíclicos que contienen
nitrógeno en un estado de oxidación negativo, cuya distribución está limitada en
organismos vivos”, mientras que Korolkovas y Burchkalther (1983) definen a los alcaloides
como sustancias orgánicas nitrogenadas con carácter básico.
Los alcaloides típicos son de origen vegetal, básicos, contienen uno o más átomos de
nitrógeno (generalmente en un anillo heterocíclico) y suelen poseer una marcada acción
fisiológica en el ser humano y otros animales. En la práctica, las sustancias presentes a los
ensayos cualitativos descritos más adelante son denominados alcaloides. Varios
compuestos nitrogenados derivados de bacterias, hongos y animales también son
considerados como alcaloides, entre ellos los aislados de las ranas del genero Phyllobates,
que constituyen algunas sustancias más venenosas para el hombre, hasta ahora conocidas.
Imagen 2: Ejemplo de alcaloides.
Los alcaloides pueden clasificarse como primarios (mescalina), secundarios (efedrina) y
terciarios (atropina) o cuaternarios; aspecto que afecta, tanto a los derivados alcaloídicos
que pueden prepararse como a los procedimientos de su aislamiento. En las plantas los
alcaloides pueden existir en estado libre, al estado de sales, como amina o como alcaloide
N-oxidos.
Clasificación de los alcaloides
Debido a la gran diversidad de alcaloides que se han aislado y a su variedad de estructuras,
es difícil una clasificación, sin embargo, Martínez (2007) clasifica a los alcaloides
dependiendo del aminoácido de procedencia de la siguiente manera:
Alcaloides derivados de la ornitina y lisina
Alcaloides derivados de la tirosina y fenilalanina
Alcaloides derivados del triptófano
Alcaloides derivados del ácido nicotínico
Alcaloides derivados de la histidina.
El metabolismo de la ornitina da origen a un conjunto de alcaloides denominados
pirrolizidínicos (procedentes de dos moléculas de ornitina). Los alcaloides tropánicos se
caracterizan por tener un núcleo de tropano (biciclo formado por un anillo de piperidina y
uno de pirrolidina) además de ser esteres entre el alcohol tropánico y un ácido aromatico o
alifático. Los alcaloides derivados de la lisina tienen un anillo de piperidina, de indol o
derivados de quinolinas. Los alcaloides de la tirosina y fenilalanina tienen un núcleo de
isoquinolina.
Los alcaloides del triptófano son derivados de un producto de descarboxilación, la
triptamina. Se caracterizan por presentar un núcleo de tipo indol y se considera un grupo de
alcaloides con más amplia variedad, dicho grupo tiene grandes intereses farmacológicos,
terapéuticos y químicos. Entre estos alcaloides existen multitud de derivados que presentan
propiedades psicodislépticas.
Los alcaloides derivados de la ergolina presentan una estructura tetraciclica, llamada
ergolina, formada a partir de la inserción de un resto de isopreno al nucleo de indol, los
alcaloides más activos de este tipo son los derivados del ácido lisérgico.
Figura 3. Tipos de Alcaloides
Métodos de identificación
Las técnicas de reconocimiento son basadas en la capacidad que tienen los alcaloides en
estado de sal (extractos ácidos), de combinarse con el yodo y metales pesados como
bismuto, mercurio, tugsteno formando precipitados; estos ensayos preliminares se pueden
realizar en el laboratorio o en el campo.
En la práctica, se utilizan reactivos generales para detectar alcaloides como: la solución de
yodo-yoduro de potasio (Reactivo de Wagner), mercurio tetrayoduro de potasio (reactivo
de Mayer), tetrayodo bismuto de potasio (reactivo de Dragendorff), solución de ácido
pícrico (reactivo de Hager), ácido sílico túngtico (reactivo de Bertrand), p-dimetilamino
benzaldehido (reactivo de Ehrlich); nitración de alcaloides (reacción de Vitali-Morin se usa
para alcaloides en estado base).
El reactivo de Mayer: se prepara disolviendo 1.3 g de bicloruro de mercurio en 60 ml de
agua y 5 g de yoduro de potasio y se afora a 100 ml. Los alcaloides se detectan como un
precipitado blanco o de color crema soluble en ácido acético y etanol. El reactivo de
Dragendorff: se prepara mezclando 8 g de nitrato de bismuto pentahidratado en 20 ml de
ácido nítrico al 30% con una solución de 27.2 g de yoduro de potasio en 50 ml de agua. Se
deja en reposo por 24 horas, se decanta y se afora a 100 ml. La presencia de alcaloides se
detecta por la formación de un precipitado naranja rojizo cuando se le adiciona esta reactivo
a una solución ácida de alcaloides. Algunas sustancias oxigenadas con alta densidad
electrónica como es el caso de las cumarinas, chalconas, maltol, acetogeninas, etc. pueden
dar falsos alcaloides con el reactivo de Dragendorff.
Saponosidos
Los vegetales cuyo contenido de saponinas es alto, se han utilizado en diversas regiones del
mundo debido a sus propiedades tenso activas.
Las saponósidos se caracterizan por producir espuma en solución acuosa, siendo esta
propiedad una prueba de identificación para reconocer a estos compuestos, así mismo,
poseen propiedades hemolíticas, es decir, si se inyectan al torrente sanguíneo pueden
producir intoxicación, tienen un elevado peso molecular y su aislamiento en estado puro es
difícil, ya que se hidrolizan en ácidos dando una genina y diversos azucares y ácidos
urónicos relacionados.
Los saponósidos tienen un gran interés por su explotación industrial, ya que la industria
farmacéutica utiliza diversas drogas con saponosidos para la obtención de formas galénicas.
La biosíntesis de las saponósidos se realiza mediante la ruta del ácido mevalónico. La
ciclación que sufre el escualeno (Imagen 4) da origen al colesterol, el cual a su vez, sufre
diversas modificaciones para generar diferentes sapogeninas (imagen 5).
Imagen 4. Ciclación del escualeno y formación del colesterol
Imagen 5. Metabolitos del colesterol
Clasificación de los saponosidos
Según la estructura de la genina se conocen dos grupos de saponósidos; los tipo esteroide y
triterpenoide pentacíclico (imagen 6 ).
Imagen 6. Saposido esteroidal (izquierda) y saposido triterpenoide pentacíclico (derecha)
Los saponósidos esteroidales poseen un esqueleto de 27 átomos de carbono que consta
habitualmente de seis ciclos: los dos ciclos E (furánico) y F (piránico) ocurren por
cetalización intramolecular causada por una oxidación.
Los saponósidos esteroidales no se encuentran ampliamente distribuidos como las
triterpenoides pentacíclicas, sin embargo, estos compuestos son de gran interés debido a su
alta relación con las hormonas sexuales, cortisona, esteroides diuréticos, vitamina D y
heterosidos cardiotónicos.
Los saponósidos naturales se diferencian por su configuración en los átomos de carbono 3,5
y 25, en algunos casos, el anillo F se mantiene abierto para la formación de glucósido.
Muchos saponósidos esteroidales se utilizan para la fabricación de fármacos, un ejemplo
claro es el da la hecogenina, la cual se utiliza como producto de partida parta la síntesis de
corticosteroides, mientras que la diosgenina se utiliza para la fabricación de anticonceptivos
orales. A diferencia de los saponósidos esteroidales, los saponósidos triterpenoides
pentacíclicos abundan en muchas familias de dicotiledóneas. En estas, la saponina se
encuentra unida a una cadena de azucares o de ácido urónico, generalmente en la posición
3.
Los saponósidos triterpenoides se han clasificado en tres grupos, representados por α-
amirina, β-amirina y lupeol (imagen 7).
Imagen 7. Tipos de saponósidos triterpenoides. a) α-amirina, b) β-amirina y c) lupeol
Esta ciclación conduce a los dammaranos, moléculas tetracíclicas que existen al estado de
heterósidos en drogas como el ginseng, o, cuando dicha ciclación implica una
conformación diferente del precursor, a los cucurbitanos. Los ácidos triterpenoides
relacionados se forman por sustitución de un grupo metilo por un grupo carbonilo en
posiciones 4, 17 ó 20 de dichas sustancias. Muchas plantas tienen cantidades considerables
de saponósidos triterpenoides, alrededor del 5-10%, sin embargo, la purificación de estos
compuestos resulta una tarea difícil.
Métodos de identificación
Las saponinas esteroides se pueden reconocer fácilmente en los análisis fitoquímicos
preliminares mediante los ensayos de la espuma, hemólisis de glóbulos rojos, Liebermann-
Burchard y ensayos para carbohidratos.
Al agitar una solución acuosa de una muestra que sea o contenga saponinas, se forma una
espuma estable como la obtenida al agitar la solución acuosa de un jabón. Puesto que
existen otras sustancias que pueden formar también espuma, se debe asumir este ensayo
como una prueba presuntiva de la presencia de saponinas esteroides. (Muñoz, 1956).
El ensayo de hemolisis es más confiable que el de la espuma. A una suspensión de glóbulos
rojos en solución salina diluida, se añade una solución de la muestra que se presume que es
o que contiene saponinas. Si los glóbulos rojos se rompen (lisan o hemolizan), se asume
que la prueba es positiva. Este ensayo puede realizarse en tubo de ensayo Cuando la
muestra contiene taninos, deben eliminarse antes de realizar la prueba ya que la interfieren.
Esto se logra por tratamiento repetido de la muestra con óxido de magnesio, el cual forma
complejos insolubles con los taninos, por lo cual es fácil eliminarlos por filtración.
Este ensayo, junto con el de la espuma, cuando ambos resultan positivos en una muestra
vegetal (extracto, fracción ó sustancia pura) permiten establecer que la muestra contiene
saponinas. La sola prueba de espuma positiva no es concluyente para determinar la
presencia de saponinas. Además hay sustancias que interfieren estas dos pruebas como son
los taninos. Si la muestra contiene taninos, estos pueden eliminarse pues se absorben en
MgO.
Por la porción esteroide que poseen las saponinas esteroides, el ensayo de Liberman-
Buchnar puede confirmar su presencia por ejemplo en muestras y extractos vegetales, tal
como se indicó anteriormente para los esteroles, pero debe tenerse en cuenta que al igual
que en el caso de los esteroles -y los esteroides en general- solamente dan un resultado
positivo los que tengan grupos dienos conjugados reales o potenciales. Sin embargo otras
saponinas como las triterpenoides también dan positiva la prueba. (Martinez, 2001)
Técnicas cromatográficas
La cromatografía es una técnica que permite separar los componentes de una mezcla. Esta
separación se logra utilizando un sistema bifásico: fase estacionaria donde se retienen los
compuestos a separar y fase móvil que desplaza de forma diferencial los compuestos a
través de la fase estacionara.
Cromatografía en capa fina
Cromatografía de capa fina (CCF) es un método de separación y purificación de
compuestos orgánicos que depende de la distribución de ellos en la fase estacionaria. Para
efectuar una separación cromatográfica se requiere de una fase estacionaria sólida (material
adsorbente como alúmina, gel de sílice, carbón o celulosa) y de una fase móvil (eluyente).
La muestra se aplica en el adsorbente (en la placa) y luego se deja que pasen a través del
adsorbente los componentes de la mezcla, que se desplazarán dependiendo de su
solubilidad relativa en el eluyente y en el adsorbente. Aquellos que son más solubles y que
son menos atraídos por la fase estacionaria se desplazarán más rápido, mientras que
componentes insolubles quedan en el punto de aplicación.Después del proceso se tiene
como resultado un cromatograma en el cual los componentes separados se revelan, ya sea
por su color inherente o por medio de un método físico o químico. La cromatografía
generalmente se usa como un método cualitativo, pero también se puede usar para efectuar
análisis cuantitativo. (Douglas A Skoog 2008).
Imagen 8. Ejemplo de una elución
Cromatografía en columna
La cromatografía en columna (CC) es el método más utilizado para la separación y
purificación de compuestos orgánicos, sólidos o líquidos, a escala preparativa. La fase
estacionaria (adsorbente) se coloca en una columna de vidrio que termina en un
estrechamiento con una llave y se impregna con el eluyente (fase móvil). La mezcla a
separar se deposita en la parte superior de la columna y la fase móvil atraviesa el sistema.
Los compuestos se van eluyendo disueltos en el eluyente, se van recogiendo
ordenadamente en fracciones de pequeño volumen (1,2,..) y se analizan por cromatografía
en capa fina (CCF). Los productos van saliendo de la columna según su polaridad, primero
salen los menos polares que son los menos retenidos por el adsorbente y los últimos los más
polares por su mayor retención en la fase estacionaria. El adsorbente más utilizado para este
tipo de cromatografía es gel de sílice y en segundo lugar la alúmina.
El tamaño de partícula del adsorbente es importante para la separación y su elección
depende en gran medida de que la elución de la cromatografía se realice por gravedad o a
media presión (flash chromatography). En una elución a media presión se pueden emplear
tamaños de partícula más pequeños, que permiten una separación más eficaz. Sin embargo,
en una elución por gravedad el uso de tamaños de partícula pequeños impediría el flujo del
disolvente. Antes de realizar una separación en cromatografía de columna hay que elegir
adecuadamente el disolvente haciendo ensayos en CCF. (Dupont Durst H. 2007).
Antimicrobianos
Desde el siglo XVIII se han empleado sustancias químicas para el tratamiento de las
emfermedades infecciosas. Paul Ehrlich, quien formulo los principios de toxicidad
selectiva, reconoció las reacciones químicas específicas entre microorganismos y
medicamento, la aparición de la resistencia a estos y el papel de la terapéutica combinada
para combatirlos. Posteriormente se descubrieron las sulfonamidas y se acrecentó el interés
en sustancias antibacterianas de origen microbiano, llamadas antibióticos, de ahí surgió la
penicilina, estreptomicina, tetraciclina, cloramfenicol, etc. Las cuales también han sido
obtenidas sintéticamente, a través de modificación química, total o parcial, de las moléculas
por biosíntesis (Manrique E, 1997).
El ataque a los microorganismos, por parte de los antimicrobianos, se pueden dar de
diferentes maneras: por inhibición de la síntesis de la pared celular, de las funciones de la
membrana celular, de la traducción de material genético y de la síntesis de ácidos nucleicos
(Manrique E, 1997).
El término antibiótico, se refiere a un producto metabólico de un organismo que es
perjudicial o inhibitorio para otros microorganismos en muy pequeñas cantidades, estas
sustancias pueden actuar de dos maneras:
a. Como microbiocidas, es decir, que matan las formas vegetativas de los
gérmenes, específicamente se denominan bactericidas, refiriéndose a bacterias y
fungicidas refiriéndose a hongos.
b. Como microbiostatico, es decir que inhibe el crecimiento de microorganismos y
se denominará, bacteriostático o fungistático, según se refiera a bacterias o a
hongos, respectivamente (Barreto J, 1997).
Control químico antimicrobiano
De acuerdo a lo que menciona (Madigan et al, 2004). Un agente antimicrobiano es un
compuesto químico, natural o sintético, que mata o inhibe el crecimiento de los
microorganismos. Los agentes que matan microorganismos se denominan agentes-cida,
con un prefijo que indica el tipo de microorganismos que mata. Así, tenemos agentes
bactericidas, fungicidas y virucidas. Un agente bactericida mata bacterias; aunque puede
matar o no otros microorganismos.
Los agentes que no matan pero inhiben el crecimiento se denominan agentes-estáticos; así,
se hablará de agentes bacteriostáticos, fungistáticos y virustáticos.
Efecto de los agentes antimicrobianos sobre el crecimiento
Se observan tres tipos de efectos cuando se añade un agente antimicrobiano a un cultivo
bacteriano en fase exponencial de crecimiento: bacteriostático, bactericida y bacteriolítico.
Se observa un efecto bacteriostático cuando se inhibe el crecimiento pero las células no
mueren. Con frecuencia, los agentes bacteriostáticos son inhibidores de la síntesis de
proteínas y actúan uniéndose a los ribosomas. No obstante, dicha unión no es una unión
fuerte y, cuando disminuye la concentración del agente, el antimicrobiano se libera de los
ribosomas y se reanuda el crecimiento. Muchos antibióticos actúan según este mecanismo.
Los agentes bactericidas matan las células pero no dan lugar a la lisis o rotura de las
células. Los agentes bactericidas son una clase de agentes químicos que generalmente se
unen fuertemente a sus dianas celulares de acción.
Los agentes bacteriolíticos provocan la muerte celular por lisis, la rotura celular se detecta
por un descenso en el número de células o en la turbidez, después de que se haya añadido el
agente. Dentro de los agentes bacteriolíticos se incluyen antibióticos que inhiben la síntesis
de la pared celular, como la penicilina y los compuestos químicos que lesionan la
membrana citoplasmática.
Mecanismos de resistencia a antibióticos
Una de las características importantes en las bacterias es su resistencia a los antibióticos. En
este sentido, los mecanismos de resistencia que presentan estos agentes frente a antibióticos
son muy diversos, sin embargo, Flórez et al. (2008) los clasifica en cinco tipos principales:
1) Bloqueo del transporte del antibiótico, 2) expulsión del antibiótico por un mecanismo
activo de bombeo, 3) la modificación enzimática del antibiótico, 4) la modificación del
blanco o sitio de acción del antibiótico, y 5) la producción de una enzima alternativa que
evita el efecto inhibitorio.
En estos mecanismos se encuentran involucrados procesos de mutación, transducción,
transformación y conjugación en las bacterias, que ayudan a que éstas adquieran
resistencia, frente a los fármacos (Calderón, 2008).
Metabolitos secundarios con actividad antimicrobiana
Algunos de los metabolitos secundarios de las plantas presentan actividad biológica contra
agentes patógenos de humanos (Ríos y Recio, 2005; Barrera-Figueroa et al., 2011)
ofreciendo una fuente alternativa de los recursos disponibles en el combate de
enfermedades infecciosas. Los grupos de metabolitos que se han reportado como agentes
antimicrobianos, de acuerdo a Daciana y Băra (2007), son los siguientes:
Fenoles, polifenoles simples y ácidos fenólicos. El ácido caféico es un ejemplo de
estos compuestos, y es efectivo contra virus, bacterias y hongos. Los grupos
hidroxilo que tienen este tipo de compuestos, se cree que son los que son
responsables de su toxicidad contra microorganismos patógenos.
Quinonas. Grupo de compuestos aromáticos altamente reactivos. La vitamina K es
una naftoquinona que tiene actividad antihemorrágica, lo que puede estar
relacionado con su facilidad de oxidarse en los tejidos.
Por otro lado, este tipo de compuestos se caracterizan por su compleja irreversibilidad al
combinarse con los aminoácidos de las proteínas, con lo cual la inactivan provocando que
pierda su función. Así, el potencial antimicrobiano que se le atribuye a estos compuestos se
debe a la posibilidad elevada de adherirse a polipéptidos de membrana, adhesinas y
enzimas de unión de membrana.
Flavonas, flavonoides, y flavonoles. Compuestos fenólicos con un grupo carbonilo,
los flavonoides también contienen grupos hidroxilo y se agrupan generalmente a un
anillo aromático. Su actividad antimicrobiana probablemente se deba a su afinidad y
unión a proteínas solubles extracelulares como las quinonas. Los flavonoides que
son lipofílicos también pueden romper las membranas microbianas.
Taninos. Estos compuestos tienen una propiedad muy particular ya que son
astringentes, son capaces de unirse a proteínas y desnaturalizarlas. Se dividen en dos
grupos, hidrolizables y condensados. Se encuentran en casi todas las partes de la
plantas. Los taninos también se pueden formar por la polimerización de unidades de
quinonas.
Las actividades biológicas que se les atribuyen son: capacidad de estimular a los fagocitos,
como antitumorales y con un espectro amplio de actividades anti-infectivas contra
bacterias, levaduras, hongos filamentosos, etc. Su capacidad antimicrobiana proviene de su
habilidad para inactivar adhesinas, enzimas, proteínas de transporte, etc.
e. Cumarinas. Compuestos fenólicos resultado de la fusión de bencenos y pironas.
Las actividades más representativas que tiene son anti-inflamatorias,
vasodilatadoras y antitrombóticas. Los reportes sobre su actividad antimicrobiana
son escasos, pero se ha reportado que algunos compuestos de este grupo tienen
actividades fungicidas.
f. Terpenoides y aceites esenciales. Los compuestos que le brindan los olores a las
plantas pertenecen a este grupo, su estructura base son isoprenos. Comparten su
origen con los ácidos grasos, pero difieren de éstos últimos en que los terpenos
forman estructuras largas y cíclicas. Se encuentran reportados como antibacterianos,
fungicidas, antivirales y antiparasíticos.
g. Alcaloides. Grupo de compuestos de las plantas más eficientes y
terapéuticamente significativos químicamente muy diverso. Las actividades
biológicas más representativas que tienen son como analgésico, antiespasmódico y
antibacteriano.
Bacterias patógenas en salud pública
Las bacterias que pueden producir enfermedad se llaman patógenas (pathos: enfermedad,
afeccion) y se conoce como patogenicidad a la capacidad que tiene una bacteria para causar
enfermedad.
Las bacterias pueden ser patógenas para el hombre y para animales así como para las
plantas, por lo que son de gran importancia, no solo en salud pública, sino también en el
campo económico (García, 2005).
Staphylococcus aureus
Imagen 9. Staphylicoccus aureus
Son cocos Gram positivos de 0,5 - 1 mcm de diámetro, inmóviles, aerobios o anaerobios
facultativos, caracterizados por su agrupación en forma de racimo. Crecen a una
temperatura óptima de 37 °C y se desarrollan mejor en un pH ligeramente alcalino de 7.6 la
adición de glucosa favorece el crecimiento (Peñaranda, 2003).
Forma parte de la flora normal de mucosas y piel e intervienen en procesos patológicos
diversos como infecciones supurativas e intoxicaciones alimenticias (Arévalo A, 1996).
Más del 95% de los Staphylococcus aureus producen proteína A, la cual puede estar
asociada a la célula o al medio extracelular, con una importante afinidad. La presencia de
proteína A o coagulasa es de gran utilidad clínica para diferenciar Staphylococcus aureus
de otras especies de Estafilococos (Uribe C, 2003). Staphylococcus aureus es una bacteria
que puede causar infección en todos los grupos de edad tanto en forma esporádica como
epidémica y se ha identificado como una de las principales causas de infección de heridas
quirúrgicas. Su principal forma de transmisión es por contacto (Uribe C, 2003).
La capacidad de S. aureus para fermentar los azúcares como maltosa, manitol, trehalosa es
positiva. La producción de una nucleasa termoestable es un buen indicador de la presencia
S. aureus, al igual que la conversión de nitratos a nitritos (Peñaranda O, 2003)
Escherichia coli
Imagen 10. Escherichia coli
Es un bacilo de 1 – 3 μm por 0.5 μm, que se presenta sólo, en pares, en cortas cadenas o
formando grupos. En general es móvil (por flagelos perítricos), aunque existen variantes
inmóviles no flageladas. No forma esporas y por lo general es no cápsulado y Gram
negativo. En cultivos jóvenes la forma cocobacilar es bastante frecuente; en los viejos se
presentan formas de una dimensión mayor (Peñaranda O, 2003).
En agar forma colonias circulares de 3 a 5 mm convexas, de borde continuo o un tanto
ondulado, brillantes y de coloración blanca un poco amarillenta. Con producción de ácido y
gas, fermenta la lactosa y un gran número de carbohidratos; algunas cepas son lactosa
negativas. Es indol positiva, rojo de metilo positiva, Voges Proskauer (VP) negativa y no
utiliza el citrato. Produce H2S en determinados medios.
Acidifica y coagula la leche. Pueden necesitarse pruebas adicionales en casos de E. coli
aislada de colitis hemorrágicas, las cuales son típicamente negativas a sorbitol. Este bacilo
es aerobio y anaerobio facultativo. Su temperatura óptima de crecimiento es de 37 °C, pero
posee propiedades de desarrollo en una gama bastante amplia de temperaturas; el pH
favorable es de 7 alguna cepas producen hemolisina (Peñaranda O, 2003).
Se ha considerado inicialmente sólo como un habitante del intestino, desde hace cerca de
tres décadas se empezó a estudiar su poder enteropatógeno. Se ha visto que las cepas
toxigénicas de E. coli pueden producir una enterotoxina termolábil (TL), una termoestable
(TS) o ambas. La TL es una proteína de alto peso molecular, que bioquímicamente es muy
similar a la toxina de Vibrio cholerae, activando la adenilciclasa. Es inactivada a 60 ºC. La
TS es una pequeña molécula relativamente estable al ser hervida (Rodríguez V, 1995).
Salmonella typhi
Imagen 11. Salmonella typhi.
Es un bacilo Gram negativo, aerobio y anaerobio, flagelado, no encapsulado, muere por
ebullición y pasteurización, produce una endotoxina, posee los antígenos somático (O),
flagelar (H) y (Vi).
Los síntomas más frecuentes son: fiebre de 40ºC a 41ºC que puede durar hasta tres semanas
en caso de no dar antimicrobianos, desciende alrededor del quinto día si se administran; la
diarrea se presenta en la mitad de los pacientes alternándose con periodos de constipación,
otros síntomas que pueden presentarse son dolor abdominal, cefalea, fiebre sin sudación,
embotamiento mental, vómitos, dolor faríngeo (Chin, 2001).
Métodos de evaluación de la capacidad antimicrobiana de extractos de plantas
No existe una reglamentación y/o estandarización de la metodología para la evaluación de
la capacidad inhibitoria de extractos de plantas (EP), como se establece para antibióticos.
La mayoría de los métodos están basados en los métodos utilizados para evaluar la
resistencia y/o susceptibilidad a antibióticos.
Los métodos utilizados para evaluar actividad de extractos de plantas sobre bacterias y
hongos suelen ser similares, variando la preparación del inóculo, medio de cultivo,
temperatura y tiempo de incubación (Cowan, 1966).
Los métodos más comúnmente utilizados en laboratorio por su sencillez y rapidez, son: La
técnica de difusión por discos en agar, es utilizada para generar datos cualitativos
principalmente, y los métodos de dilución en medio líquido de cultivo y en agar, ambos
métodos nos permiten conocer datos cuantitativos (Hammer, 1999).
Métodos en Agar
Entre estos métodos el más utilizados por su sencillez y rapidez en la lectura de resultados
es el método de difusión por discos, basados en la metodología utilizada por Bauer et al.,
1966. El principio del método involucra la aplicación de una cantidad determinada de un
antimicrobiano u otra sustancia en un sustrato, (usualmente discos de papel) en la superficie
del agar sobre el cual se ha distribuido un inóculo del microorganismo en estudio; se
formará así, por difusión un gradiente de concentración del producto alrededor del disco y
la sensibilidad del microorganismo estará indicada por el tamaño de la zona de inhibición
del crecimiento bacteriano.
Imagen 12. Ejemplo de inhibición bacteriana
El diámetro obtenido dependerá no sólo de la sensibilidad del microorganismo y la carga
del disco, sino también del espesor de la capa de agar, del pH y de la composición del
medio de cultivo, de la capacidad de difusión del producto en ese medio, de la temperatura
y de la atmósfera de incubación, de la velocidad de duplicación bacteriana, y del tamaño
del inóculo y fase de crecimiento de la bacteria o microorganismos en estudio (INPPAZ,
2000).
Otro método de evaluación en agar es el de dilución en agar, en éste método se incorpora el
producto a evaluar a un medio con agar. El producto se añade cuando el medio aún está
líquido. Para lograr el rango de dilución deseado se prepara una serie de placas, cada una
con una determinada concentración de producto. Las placas se inoculan con un replicador
una vez que se haya solidificado el medio de cultivo (Hammer, 1999).
Los resultados de las pruebas de dilución en agar se expresan como concentraciones
mínimas inhibitorias (CMIs).
Métodos en medios de cultivo líquidos
La cuantificación de la actividad in vitro de los aceites esenciales se realiza habitualmente,
mediante alguna de las variantes de los métodos de dilución. Estos métodos se basan en la
determinación del crecimiento del microorganismo en presencia de concentraciones
crecientes del aceite esencial, que se encuentra diluido en el medio de cultivo (caldo).
Se pueden realizar determinaciones empleando series de tubos con caldo de cultivo con un
rango determinado de aceite (macrodilución). Esta metodología es muy engorrosa, por la
cantidad de material y de manipulaciones necesarias para su realización. La utilización de
micropipetas y de placas de microtitulación facilita la utilización del método de
microdilución en caldo.
Este último método se ha venido usando para la determinación de las concentraciones
mínimas inhibitorias (CMIs) de extractos de plantas (Carro, 2002), describen la CMI como
la menor concentración que mantiene o reduce la viabilidad del inóculo luego de 24 horas
de contacto. En la mayoría de los casos se preparan diluciones del producto a evaluar en
progresión geométrica en base 2 utilizando un medio de cultivo adecuado; posteriormente
se inocula dicho medio y tras la correspondiente incubación para permitir el crecimiento del
microorganismo se realiza la lectura, determinando qué concentración causa la inhibición
del crecimiento del microorganismo.
HIPOT ESIS Y OBJETIVOS
Hipótesis
Los metabolitos secundarios de la planta Acalypha Arvensis y Acalypha Alopecuroidaes
podrían identificarse mediante análisis cualitativo, así mismo, las propiedades bactericidas
de estas planta podrían utilizarse para la inhibición del crecimiento de Staphylococus
aureus y Salmonella typhi
Objetivos
Obtener el extracto etílico de la hierba la Acalypha Arvensis y Acaplypha Alopecuroidaes y
confirmar su efecto inhibidor en las sepas Staphylococus aureus y Salmonella typhi, y
realizar pruebas cualitativas para la identificación y un posible aislamiento de metabolitos
secundarios.
Objetivos particulares
Seleccionar la zona con mayor población de Acalypha.
Muestrear en base a la norma de conducta.
Preparar correcta la muestra en estudio.
Obtener el extracto etanólico de la muestra.
Evaluar la Alelopatia en las sepas seleccionadas.
Ensayo fitoquímico preliminar en la hierba del pastor (Arcalypha arvensis) y su efecto
alelopático en Staphylococus aureus y Salmonella typhi
METODOLOGIA
Toma y acondicionamiento de la muestra
La muestra se obtuvo en el mes de septiembre del 2014 en dos terrenos diferentes ubicados
en la avenida 37 y 39 en la colonia Lázaro Cárdenas, del municipio de Córdoba Veracruz.
Posteriormente se determinó el pH del suelo, las coordenadas y la temperatura, y otra
muestra más, tomada en la avenida 23, calle 43, colonia López Arias.
Imagen 14. Mapa de la zona de recolección
Materiales y reactivos
Los disolventes utilizados en este trabajo fueron de la marca JT Baker® y se usaron sin un
tratamiento previo, para la separación en columna se utilizó Silica Gel de la marca Merk®,
los reactivos utilizados para llevar a cabo la identificación de metabolitos fueron
proporcionados en el Lab. 113 de la Facultad de Ciencias Químicas, Orizaba. Ver.
Extracción de principios activos de Acalypha arvensis
Para la extracción de los componentes del material vegetal se realizó un análisis
fitoquímico preliminar la cual consistió en preparar extractos de las partes de Acalypha
arvensis y Acaplypha Alopecuroidaes (flores, tallo y hojas) tomando una pequeña porción
de ellas y por separado fueron depositadas en matraces Erlenmeyer de 250 mL, donde se
empleó etanol como disolvente, llevándose a cabo la extracción se realizó en caliente.
Imagen 15. Distribución de la extracción.
Se realizaron pruebas fotoquímicas de los extractos de cada parte de la planta con el
objetivo de determinar cuál extracto tiene la característica de presentar un mayor número de
metabolitos, comprobando que la flor y la hoja presentaron dicha característica
Posteriormente, se depositaron en un matraz Erlenmeyer de 1500 mL, 73 g del material
vegetal (Acaplypha Arvensis) previamente triturado y se le añadió etanol, asi mismo, se
añadió 200g de hojas y flor de Acaplypha Alopecuroidaes en otro matraz de 1500mL. Se
mantuvo en reflujo durante 12 horas con la finalidad de hacer una extracción exhaustiva,
cambiando el disolvente cada determinado tiempo por disolvente limpio para continuar con
la extracción.
Imagen 16. Maceración en caliente
Decoloración y disminución del volumen del extracto etanólico de Acalypha arvensis
Al término de la extracción, se tomó una pequeña cantidad de los extractos y se depositaron
en tubos de ensaye para escoger el mejor método para eliminar las clorofilas.
Se realizaron pruebas con arcilla de tonsil y carbón activado, para ello se calentó el
extracto hasta su punto de ebullición seguidamente se le añadió arcilla de tonsil a uno de los
tubos y al otro carbón activado, se continuo calentando por unos momentos más y se filtró
en caliente a través de papel filtro Whatman no.1, observándose que el carbón activado
tiene una mayor adsorción de clorofilas. Una vez decolorado el extracto, se concentró a
50ml en un rotovapor.
Imagen 18. Evaporación en rotavapor
Pruebas fitoquímicas
Teniendo el extracto previamente decolorado, se procedió a realizar pruebas fotoquímicas
mediante ensayos a la gota para identificar alcaloides, flavonoides, coumarinas, esteroles,
quinonas, saponinas, glicosidos cardiotónicos, sesquiterpenlactonas, polifenonesl
fenilpropanoides e iridoides, siguiendo las presentes metodologías.
Alcaloides
Se realizaron las pruebas fitoquímicas al extracto etanólico de Acalypha arvensis de
acuerdo a la metodología de Dominguez, 1983, para la identificación de los metabolitos
secundarios. Las cuales consisten en reacciones de precipitación y coloración.
Para la identificación de alcaloides, se utilizó la prueba de Mayer y de Dragendorff. Para la
prueba de Mayer, se utilizó una muestra de extracto previamente acidulada con ácido
sulfúrico o ácido clorhídrico diluido, se trató con unas gotas de reactivo de Mayer, mientras
que para la prueba de Dragendorff, se usó una muestra de extracto previamente acidulada
con ácido sulfúrico o ácido clorhídrico diluido y se tratío con unas gotas del reactivo de
Dragendorff.
Como método adicional, se utilizó la prueba de Wagner, en la cual se manejó una muestra
del extracto acuoso o etanólico previamente acidulada, y se trató con el reactivo de
Wagner.
Flavonoides
Para la identificación de flavonoides se utilizó la prueba con vapores de amoniaco y otra
metodología utilizando NaOH al 5%. Se sometió una muestra del material a estudiar, a
dichos reactivos con el objetivo de observar cambios de coloración en la muestra vegetal.
Como método adicional, se utilizó la reacción de Shinoda, usando una porción de extracto
alcohólico incoloro o ligeramente amarillo, con una viruta de magnesio y 3 gotas de ácido
clorhídrico concentrado con la finalidad de observar un cambio de coloración.
Coumarinas
Para la identificación de coumarinas, se utilizó la reacción de formación de hidroximato,
donde se utilizó una gota de extracto etanólico a la cual se le añadió una gota de solución
de metanol 2N de clorhidrato de hidroxilamina y una gota de solución metanólica 2N de
KOH. Se calentó la mezcla durante unos minutos y se enfrió para posteriormente acidular
con HCl 0.5 N y añadir una gota de cloruro ferrico al 1%, con la finalidad de observa la
formación de una coloración violácea.
Se utilizó como complemento la prueba de Legal, donde se disolvió una pequeña muestra
de extracto con tres gotas de piridina y se adicionó una gota de solución de nitroprusiato de
sodio al 0.5% y posteriormente cuatro gotas de KOH 2N, con el objetivo de observar un
cambio de coloración a rosa-rojo.
Finalmente se usó la prueba de Erlich para grupo furano, donde a una muestra del extracto
etanólico, se le agregaron unas gotas de p-dimetilaminobenzaldehido al 5% en etanol y se
añadió HCl concentrado, con el propósito de observar un cambio de coloración.
Esteroles
Para determinar la presencia de esteroles se utilizó la prueba de Liebermann-Burchard,
mezclando 1mL de anhídrido acético y 1mL de cloroformo, posteriormente se añadió una
gota de ácido sulfúrico concentrado. Una porción de esta mezcla se puso en contacto con
una muestra de extracto etanólico con el objetivo de observar cambios de coloración.
Así mimo, se utilizó la ´prueba de Rosenheim, donde una muestra del extracto etanólico se
puso en contacto con ácido tricloroacético en agua. Finalmente se usó la prueba de
Salkowski, donde una muestra del extracto etanólico se trató con un volumen igual de ácido
sulfúrico concentrado.
Glicosidos cardiotónicos
Para la identificación de glicosidos cardiotónicos se utilizó la prueba de Kedde, donde se
mezclaron cantidades iguales de ácido 3,5-dinitrobenzoico y de potasa solución y se
añaden 2 gotas del material. Adicionalmente se manejó la prueba de Legal, donde una
pequeña muestra se disolvió en 3 gotas de piridina y se agregó una gota de solución de
nitroprusiato de sodio y 3 gotas de sosa.
Quinonas
Para la identificación de quinonas se utilizó la reacción de Borntrager, que consistió en
acidular una muestra de extracto alcalino y extraer con benceno. El extracto bencénico se
trató con un volumen igual de KOH del 2 al 5%, esto con el objetivo de observar un cambio
de coloración
Saponinas
Para determinar la presencia de saponinas, se manejó la prueba de la espuma, donde se
agitó una muestra de extracto etanólico en agua con el motivo de observar la formación de
espuma, así mismo se realizó la prueba de Molisch, donde una gota del extracto se mezcló
con dos gotas de alfa naftol en etanol al 5%. Por la pared del tubo se agregó ácido sulfúrico
concentrado, con la finalidad de presenciar una coloración.
Sesquiterpenlactonas
La prueba de Tollens fue utilizada para la identificación de estos metabolitos, la cual
consistió agregar unas 3 gotas de nitrato de plata al 5%, una gota de NaOH al 10%.
Posteriormente se añadió hidróxido de amonio al 2% hasta disolver precipitado. Un
mililitro de esta mezcla se agregó a una muestra del extracto libre de disolvente.
Polifenoles
Para la identificación de polifenoles se usó la prueba de Folin-Ciocalteu, donde en un
microcono se colocó 0.5 mL de extracto con cinco gotas del reactivo Folin-Ciocalteu, más
dos gotas de carbonato de sodio al 7.5%.
Fenilpropanoides
Se adicionaó 1 mL de extracto etanólico más 2 mL de HCl 0.5 N, posteriormente se añadió
2 mL de la solución acuosa de nitrito de sodio al 10% y finalmente se agregó 2 mL de la
solución acuosa de NaOH 2N.
Iridoides
Se colocó 0.5 mL del extracto vegetal y se mezclaron con 3 mL de vainillina (4% p/v en
metanol) y con 1.5 mL de HCl concentrado. La muestra se protegió de la luz durante 1-2
horas para obtener el resultado de la reacción.
Cromatografía en capa fina
Se realizó un ensayo en CCF para determinar la presencia de metabolitos secundarios,
utilizando las muestras de extracto etanolico sin diluir, y usando diferentes fases móviles,
con la finalidad de obtener la fase correcta para separar los metabolitos en columna. Se
utilizó un cromatofolio de silica gel 20 x 20 marca Merck. Como revelador se empleó luz
UV obtenida de una lámpara portátil (254 – 365 nm).
Imagen 19. Cromatografía en capa fina
Cromatografía en columna
Para separar los metabolitos se realizó cromatografía en columna al extracto, utilizando
arena de otawa para fijarlo dicho extracto, y silica gel parta la columna. Se utilizó como
fase móvil, la mezcla 7:2:1 de éter de pretroleo, butanol y metanol.
Imagen 20. Cromatografía en columna
Pruebas de inhibición del extracto
Preparación del inoculo
Para la preparación del inoculo se llevó a cabo en medio líquido utilizando como medio de
cultivo caldo nutritivo, para el experimento se emplearon las cepas de Staphylococcus
aureus que se encontraba en caldo nutritivo y Escherichia coli en medio EMB y Salmonella
thypi en el medio Salmonella shigella, estos fueron proporcionados por el laboratorio de
Microbiología de la Facultad de Ciencias Químicas, de la Universidad Veracruzana.
En tres tubos de ensaye con 2 mL de caldo nutritivo se colocó 2 colonias de cada cepa
respectivamente y se dejó incubar a temperatura ambiente por 24 h. Transcurrido el tiempo
se observa el crecimiento de cada tubo.
Método de difusión en agar
Se tomaron 3 mL de los extractos etanólicos concentrados de Acalypha arvensis y
Acaplypha Alopecuroidaes y se depositó en un vial previamente tarado, este extracto se
redisolvio con 3 mL de etanol para conocer la concentración de la dosis a emplear en los
sensidiscos.
Utilizando un hisopo estéril, fueron sembrados los microorganismos a estudiar por estriado
en agar nutritivo, enseguida se colocaron sobre la placa los sensidiscos impregnados del
extracto de interés, con una concentración de 0.00134mg.mL-1 equivalente a 20 µL.
Como control positivo se empleó el ciprofloxacino el cual es un antibiótico de amplio
espectro y con diversos usos a padecimientos patológicos, además se utilizó etanol para
comprobar que la inhibición existente sea por los principios activos del extracto y no el
efecto del etanol.
Las cajas Petri fueron incubadas a 35ºC por 24 h en una estufa de incubación, seguidamente
se procedió a la observación y medida de los halos de inhibición de crecimiento con ayuda
de un vernier.
RESULTADOS Y DISCUCIÓN
Análisis del suelo
Se realizó una examinación al suelo de los dos terrenos de los cuales se obtuvo la planta, se
observó que ambos terrenos tenían diferente tierra, una de color naranja oscuro
(vulgarmente conocida como tierra “roja y el otro terreno presentó tierra de color café
oscuro (imagen 21).
Imagen 21. Tipos de suelo
Utilizando tiras de pH, se determinó el pH de los suelos, disolviendo 10g de suelo en 100ml
de agua, obteniéndose los siguientes resultados:
Tipo de tierra pHTierra “roja” 8Tierra café oscuro 6
La variación de pH en la tierra es debida al contenido de Fe2O3, lo que le otorga un carácter
más básico a la tierra roja.
Obtención de coordenadas
Con la ayuda de un GPS de bolsillo marca Garmin® se determinó las coordenadas de los
terrenos en los cuales se obtuvieron las pruebas, obteniéndose los siguientes datos
Terreno CoordenadasCol. Lázaro Cárdenas (1) 18° 52’ 11.7’’ N, 96° 55’ 47.2’’ ECol. Lázaro Cárdenas (1I ) 18° 52’ 11.4’’ N, 96 °55’ 39.1’’ ECol. López Arias (III) 18° 52’ 22.8’’ N, 96° 55’ 41.7’’ E
Análisis fitoquímico
Se realizó un análisis fitoquimico preeliminar a los tres primeros extractos de Acalypha
Arvensis y Acaplypha Alopecuroidaes realizados con diferentes partes de la planta,
obteniéndose los siguientes resultados.
Acaplypha ArvensisMetabolitos secundarios Prueba Extracto de hojas Extracto de flor Extracto de tallo
Alcaloides Mayer - - -
Dragendorff + + -
Wagner + + -
Quinonas Borntrager + + -
Saponinas Espuma + + -
Molish + + -
Coumarinas Hidroximato - + -
Legal + + -
Erlich - - -
Flavonoides Vapores de
amoniaco
+ + -
Álcali + + +
Shinoda - + -
Glucosidos cardiotónicos Kedde - - -
Legal + - -
Keller-Kiani + - -
Baljet - + -
Sapogeninas Rosentaller - - -
Polifenoles Folin-
Cicalteu
+ + +
Sesquiterpenlactonas Tollens + + +
Esteroles Lieberman-
Burchard
- - -
Rosenheim-
Salkowski
- - -
Fenilpropanoides + + +
Iridoides - - -
Acaplypha AlopecuroidaesMetabolitos secundarios Prueba Extracto de hojas Extracto de flor Extracto de tallo
Alcaloides Mayer + + -
Dragendorff + + -
Wagner + + -
Quinonas Borntrager - - -
Saponinas Espuma + + -
Molish + + -
Coumarinas Hidroximato + + -
Legal + + -
Erlich - - -
Flavonoides Vapores de
amoniaco
+ + -
Álcali + + -
Shinoda + + -
Glucosidos cardiotónicos Kedde - - -
Legal - - -
Keller-Kiani - - -
Baljet - - -
Sapogeninas Rosentaller + + -
Polifenoles Folin-
Cicalteu
+ + +
Sesquiterpenlactonas Tollens - - +
Esteroles Lieberman-
Burchard
+ + -
Rosenheim-
Salkowski
+ + -
Fenilpropanoides - - +
Iridoides - - -
Cromatografía
El análisis por cromatografía en placa fina realizado para el extracto de la planta se llevó a
cabo con la fase 7:2:1 Éter de petróleo/N-Butanol/Metanol dando un resultado aceptable en
la separación de los metabolitos presentes.
Este resultado fue aplicado para realizar una separación en cromatografía por columna, sin
embargo, no se logró separar los metabolitos, probablemente a la alta polaridad de la fase
móvil utilizada, la cual no permitió separar los metabolitos de una manera eficiente.
Pruebas de inhibición antimicrobiana
Mediante la técnica de difusión de discos se evaluó la actividad antimicrobiana de los
extractos de Acalypha arvensis frente a microorganismos patógenos tales como Escherichia
coli, Salmonella typhi y Staphylococcus aureus se realizaron las pruebas suceptibilidad del
extracto vegetal para comparar su capacidad inhibitoria, se usa como control positivo el
ciprofloxacino, teniendo en cuenta que es un antibiótico de amplio espectro activo en
técnicas in vitro contra un gran número de microorganismos Gram positivos y negativos.
Se midió la capacidad antibacteriana a través del diámetro del halo de inhibición, el cual
puede ser afectado por las exigencias del microorganismo en estudio y la composición
química del extracto vegetal.
En la siguiente figura se observa el efecto inhibitorio de los extractos etanólicos de
Acalypha arvensis donde solo hubo inhibición frente a Salmonella typhi y Escherichia coli,
sin embargo en el caso de Staphylococcus aureus no se desarrolló en ninguno de los casos
esto es debido a que la cinética de crecimiento de este microorganismo es más lenta a
comparación a las anteriores.
Para el caso del gusano largo el
comportamiento fue igual solo se observó inhibición en Salmonella typhi y Escherichia
La evaluación de la prueba de actividad antimicrobiana frente a bacterias patógenas de
salud pública se presenta en la Tabla X, donde se observa el valor de inhibición; se puede
señalar que la adición de 20 μL de extracto etanólico de Acalypha arvensis los sensidiscos,
originan una actividad antimicrobiana en la mayoría de las especies estudiadas.
Acalypha ArvensisReplica Salmonella typhi Escherichia coli Ciprofloxacino
1 0.3 0.1 0.752 0.2 0.3 0.90
Acalypha AlopecuroidaesReplica Salmonella typhi Escherichia coli Ciprofloxacino
1 0.10 0.15 0.62 0.125 0.25 0.43 0.07 0.07 1.05
Los resultados señalan que Escherichia coli es el microorganismo que más sensibilidad
presento
Escherichia coli forma parte de las bacterias Gram negativas estas, además del
peptidoglicano, poseen una capa adicional en su pared que está compuesta de
lipopolisacáridos. Esta capa representa una segunda bicapa lipídica, que no consta
solamente de fosfolípidos como la membrana plasmática, sino que contiene polisacáridos y
proteínas. Los lípidos y polisacáridos están estrechamente unidos en la capa externa
formando estructuras lipopolisacáridas específicas (Lizcano, 2008).
Los mecanismos de resistencia de estas bacterias pueden presentarse como alteración del
sitio blanco o diana de antimicrobianos, disminución de la permeabilidad de la pared por
poseer una pequeña capa de peptidoglicano, la cual es más sensible, adquisición de
mecanismo de eflujo y cambio de vía metabólica externa (Lizcano, 2008), lo anterior
podría sugerir que el extracto etanólico de Acalypha arvensis puede poseer sustancias
capaces de contrarrestar los mecanismos de resistencia del microorganismo.