POSGRADO EN CIENCIAS Y BIOTECNOLOGÍA DE PLANTAS

Estudios moleculares sobre la síntesis de alcaloides bencilisoquinolínicos de

Argemone mexicana

Tesis para obtener el grado de Doctor en Ciencias presenta:

JORGE ALBERTO RUBIO PIÑA

Centro de Investigación Científica de Yucatán, A.C.

Mérida, Yucatán, México

2008

Declaración de propiedad

Declaro que la información contenida en la sección de materiales y métodos experimentales, los resultados y discusión de este documento proviene de las actividades de experimentación realizadas durante el periodo que se me asignó, para desarrollar mi trabajo de tesis, en las Unidades y Laboratorios del Centro de Investigación Científica de Yucatán, A.C., y que dicha información le pertenece en términos de la ley de la propiedad industrial, por lo que no me reservo ningún derecho sobre ello.

IBQ. Jorge Alberto Rubio Piña

RECONOCIMIENTOS

Este trabajo se realizó en la Unidad de Bioquímica y Biología Molecular de Plantas del Centro de Investigación Científica de Yucatán, bajo la dirección del Dr. Felipe Augusto Vázquez Flota, a quien le agradezco su respaldo y el interés mostrado en la planeación, desarrollo y evaluación del mismo.

Se agradece al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología por la beca otorgada a Jorge Alberto Rubio Piña para estudios de doctorado (185784).

Este trabajo fue financiado con fondos de los proyectos 52062 de la Convocatoria 2006 para la Consolidación de Investigadores (SNI CONACYT); P1-60746 de la Convocatoria Nacional de Investigación Básica (SEP-CONACYT) 2006; 052778 de la Convocatoria CONACYT para la Formación de Doctores 2007 y 06-177 RG/810/LA - UNESCO FR: 3240157854 de la Academy of Sciences for the Developing World (TWAS), Convocatoria 2007.

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AGRADECIMIENTOS

Esta tesis doctoral, si bien ha requerido de esfuerzo y mucha dedicación por parte del autor y su director de tesis, no hubiese sido posible sin la cooperación desinteresada de todas y cada una de las personas que a continuación citaré y, muchas de las cuales, han sido un soporte muy fuerte en momentos de angustia y desesperación.

Primero y antes que nada gracias Dios por ser mi mejor amigo, mi fortaleza, darme todo lo que tengo y nunca dejarme caer. Por permitirme llegar hasta este momento tan importante de mi vida y lograr otra meta más en mi carrera.

Agradezco enormemente a mis padres Carlos y Judith, por su cariño, comprensión y apoyo sin condiciones ni medida. Gracias por darme la vida, por guiarme sobre el camino de la fe, del amor y la educación. Ahora entiendo su forma de amarme cuando miro en retrospectiva y me veo. Nuevamente gracias por estar ahí en todo momento.

A mis hermanos (Giadys, Carlos, Gabriela y Judith) que siempre estuvieron pendientes de mi y de las necesidades que pudiera pasar.

A mi esposa Yolanda por ser mi compañera de viaJe, la persona que ha compartido la carga de mis estudios y porque en su compañía las cosas malas se convierten en buenas, la tristeza se transforma en alegría y la soledad no existe.

Al doctor Felipe Vázquez Flota, mi asesor de tesis, quiero agradecer su amistad, paciencia y sobre todo reconocer que mucho de lo que hoy he aprendido es por sus enseñanzas.

De igual manera mi más sincero agradecimiento a la M.C. Miriam Monforte González por haberme dirigido durante mis

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primeros pasos por la ciencia, por su amistad y por la ayuda técnica prestada para la realización de esta tesis.

Especialmente agradezco al Dr. José Ramírez Benítez por el apoyo técnico ofrecido durante el análisis in situ de los transcritos y alcaloides.

Agradezco particularmente a los miembros de mi comité tutoral y de evaluación de tesis: Dra. Virginia Herrera, Dra. Renata Rivera, Dra. Luisa López, Dr. Gregario Godoy, Dr. Edmundo Lozoya, Dr. Rafael Rojas, por sus atinadas observaciones y la revisión crítica con la que enriquecieron el presente escrito.

A mis compañeros y amigos con los que comparto las mismas experiencias y nos ponemos el hombro cada vez que se necesita, por su apoyo y ánimo en cada etapa que se pasa y viene a lo largo de estos años de estudio.

Deseo extender un reconocimiento a los profesores del Posgrado en Ciencias y Biotecnología en Plantas del Centro, que generosamente me brindaron un poco de su experiencia, a todos les estaré eternamente agradecido por su apoyo.

En general quisiera agradecer a todas y cada una de las personas que han vivido conmigo la realización de esta tesis doctoral, con sus altos y bajos desde los más profundo de mi corazón les agradezco el haberme brindado todo el apoyo, colaboración, ánimo y sobre todo cariño y amistad.

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DEDICATORIA

A Laura Yolanda de la Vega Bias

Solo tú, solo yo, en un mundo incierto de sensaciones dulces, de sentimientos de añoranza del otro ... unidos hasta el

despertar en el que aun seguiremos juntos.

A mis padres Carlos y Judith

Enseñarás a volar, pero no volarán tu vuelo.

Enseñarás a soñar, pero no soñarán tu sueño.

Enseñarás a vivir, pero no vivirán tu vida.

Sin embargo ... en cada vuelo, en cada vida,

en cada sueño, perdurará siempre la huella

del camino enseñado

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vi

ÍNDICE GENERAL

RESUMEN 1 ABSTRACT 3 INTRODUCCIÓN 5 CAPÍTULO 1 ANTECEDENTES 7

1.1. Argemone mexicana 7 1.1.1. DESCRIPCIÓN BOTÁNICA 8 1.1.2. USOS TRADICIONALES 8 1.1.3. COMPOSICIÓN QUÍMICA 9 1.2. ALCALOIDES BENCILISOQUINOlÍNICOS 1 O

(ABis) 1.2.1. RUTA DE SÍNTESIS DE LOS ABis 11 1.2.2. Formación de norcoclaurina 12 1.2.3. Formación de reticulina a partir de norcoclaurina 12 1.2.4. Formación de benzofenantridinas y 13

protoberberinas 1.2.5. Síntesis de alcaloides morfinanos 16 1.3. REGULACIÓN Y LOCALIZACIÓN TEJIDO- 18

ESPECIFICA DE LOS ABis 1.4. COMPARTAMENTALIZACIÓN SUBCELULAR 20

DE LAS ENZIMAS DE LA SÍNTESIS DE LOS A Bis

1.5. TRANSPORTE INTERCELULAR DE LAS 22 ENZIMAS BIOSÍNTETICAS DE LOS ABis

1.6. SÍNTESIS DE ABis EN CULTIVOS DE CÉLULAS 23 in vitro

1. 7. TRANSDUCCIÓN DE SEÑALES EN LA 27 SÍNTESIS DE ABis EN RESPUESTA A LA INDUCCIÓN

1.8. ANÁLISIS DE LA ACUMULACIÓN DE ABis EN 30 CULTIVOS in vitro DE Argemone mexicana

1.9. RECAPITULACIÓN DE LOS ANTECEDENTES 31 1.1 O. REFERENCIAS 32

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CAPITULO 2 MATERIALES Y MÉTODOS 47 2.1 . OBJETIVOS 47 2.2. HIPÓTESIS 48 2.3. ESTRATEGIA EXPERIMENTAL 48 2.4. MATERIAL BIOLÓGICO 49 2.6. REFERENCIAS 50

CAPÍTULO 3 AISLAMIENTO DE LOS ADNcs 51 DE LA NORCOCLAURINA SINTASA {NCS) Y LA ENZIMA FORMADORA DEL PUENTE DE LA BERBERINA {BBE)

3.1. INTRODUCCIÓN 51 3.2. MATERIALES Y MÉTODOS 51 3.3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 58 3.4 CONCLUSIONES 71 3.5. REFERENCIAS 71

CAPÍTULO 4 CARACTERIZACIÓN 73 MOLECULAR DE LA NORCOCLAURINA SINTASA (NCS) Y LA ENZIMA FORMADORA DEL PUENTE DE LA BERBERINA {BBE) EN Argemone mexicana

4.1. INTRODUCCIÓN 75 4.2. MATERIALES Y MÉTODOS 76 4.3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 83 4.4. CONCLUSIONES 116 4.5 REFERENCIAS 117

CAPÍTULO 5 EFECTO DEL JASMONATO DE 127 METILO Y ACIDO SALICÍLICO EN LA EXPRESIÓN DE LA NCS Y BBE EN SUSPENSIONES CELULARES DE Argemone mexicana

5.1. INTRODUCCIÓN 5.2. MATERIALES Y MÉTODOS 5.3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

viii

127 129 132

5.4. CONCLUSIONES 138 5.5. REFERENCIAS 139

CAPÍTULO 6 DISCUSIÓN GENERAL y 145 PERSPECTIVAS

6.1 REFERENCIAS 159 DATOS COMPLEMENTARIOS 165 ANEXO 1 169

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ÍNDICE DE FIGURAS

FIGURA 1.1. Argemone mexicana 1 O FIGURA 1.2. Representación de la ruta de biosíntesis 12

de los ABis FIGURA 1.3. Síntesis de los alcaloides tipo 15

benzofenantridina FIGURA 1.4. Síntesis de los alcaloides tipo 16

protoberberina FIGURA 1.5. Síntesis de los alcaloides tipo 17

morfina nos FIGURA 1.6. Modelo hipotético de la cascada de 29

señales en respuesta a la activación con un inductor de levadura en suspensiones de Eschscholzia californica

FIGURA 2.1. Esquema de la estrategia experimental 49 propuesto para este proyecto

FIGURA 3.1 Esquema utilizado para la síntesis de la 56 primera cadena de ADNc utilizando un oligo de ARN y un oligo d(T) del estuche GeneRacer

FIGURA 3.2. Secuencias de aminoácidos 59 conservados de la NCS y BBE

FIGURA 3.3. Amplificación de los ADNcs parciales 59 correspondientes a la NCS y BBE

FIGURA 3.4. Comparación de las secuencias de 61 aminoácidos deducidos de NCS y BBE

FIGURA 3.5. Comparación de las secuencias de 63 aminoácidos deducidos a partir de NCSAm1 y NCSAm2 con secuencias de NCS reportadas

FIGURA 3.6. Comparación de la secuencia de 65 aminoácidos deducidos a partir de BBEAm1

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FIGURA 3. 7. Amplificación de los extremos 5' y 3, 66 correspondientes a los ADNcs de la NCS y BBE por RACE

FIGURA 3.8. Empalme de las secuencias de la 67 NCSAm1 y de la NCSAm2

FIGURA 3.9. Comparación de las secuencias de 68 nucleótidos de NCSAm1 y NCSAm2 de Argemone mexicana

FIGURA 3.10. Empalme de las secuencias de la 69 BBEAm1 y de la BBEAm2

FIGURA 3.11. Comparación de las secuencias de 70 nucleótidos de BBEAm1 y BBEAm2 de Argemone mexicana

FIGURA 4.1. Comparación de la secuencia de 84 aminoácidos deducidos a partir de NCSAm1 y NCSAm2 de Argemone mexicana

FIGURA 4.2. Alineación de las secuencias de 87 aminoácidos deducidos de la NCSAm1 y NCSAm2 con secuencias reportadas para la norcoclaurina sintasa (NCS)

FIGURA 4.3. Comparación de la secuencia de 90 aminoácidos deducidos a partir de BBEAm1 y BBEAm2 de Argemone mexicana

FIGURA 4.4. Alineación de las secuencias de 91 aminoácidos deducidos de la BBEAm1 y BBEAm2 con secuencias reportadas para la enzima formadora del puente de la berberina

FIGURA 4.5. Árbol filogenético obtenido mediante la 94 aplicación del método neighbor-joining (método del vecino más próximo) utilizando la secuencia de nucleótidos codificantes de la NCSAm1 y NCSAm2 de Argemone mexicana

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FIGURA 4.6. Árbol filogenético obtenido mediante la 96 aplicación del método neighbor-joining (método del vecino más próximo) utilizando las secuencia de nucleótidos codificantes de la BBEAm1 y BBEAm2 de Argemone mexicana

FIGURA 4.7. Análisis de restricción de los ADNcs de 97 la NCS y BBE de Argemone mexicana

FIGURA 4.8. Análisis tipo Southern blot de la NCS de 99 Argemone mexicana

FIGURA 4.9. Análisis tipo Southern blot de la BBE de 101 Argemone mexicana

FIGURA 4.1 O. Acumulación de ABis y análisis de 1 05 expresión de la NCS y BBE en plantas maduras de Argemone mexicana

FIGURA 4.11. Acumulación de ABis y análisis de 112 expresión de la NCS y BBE después de la germinación de semillas de Argemone mexicana

FIGURA 4.12 Acumulación de ABis y análisis de 115 expresión de la NCS y BBE en plantas en desarrollo de Argemone mexicana (post-emergencia)

FIGURA 5.1. Curva de crecimiento y acumulación de 133 sanguinarina de la suspensión celular AmMiF de Argemone mexicana durante un ciclo de cultivo

FIGURA 5.2. Acumulación de sanguinarina en 135 suspensiones celulares de Argemone mexicana expuestas a jasmonato de metilo y ácido salicílico

FIGURA 5.3. Acumulación de sanguinarina y análisis 136 de expresión de la NCS y BBE en suspensiones celulares de Argemone mexicana

FIGURA 6.1 Esquema de la acumulación de 151

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FIGURA6.2

alcaloides de tipo benzofenantridina y protoberberina durante el desarrollo de plantas de Argemone mexicana Modelo hipotético de la cascada de 155 señales en respuestas a jasmonato de metilo y acido salicílico en suspensiones celulares de Argemone mexicana

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ÍNDICE DE CUADROS

CUADRO 1.1. Enzimas involucradas en la síntesis de 24 los ABis en plantas para las que han sido aislados los ADNcs correspondientes

CUADRO 3.1. Cebadores empleados para la 55 amplificación del ADNc parcial de la NCS y la BBE en Argemone mexicana

CUADRO 3.2. Cebadores empleados para la 57 amplificación de los extremos 5, y 3, de la NCS y la BBE en Argemone mexicana

CUADRO 3.3. Porcentaje de identidad de la secuencia 62 de aminoácidos deducidos de los ADNcs parciales de la norcoclaurina sintasa de Argemone mexicana (NCSAm1 y NCSAm2) con otras especies

CUADRO 3.4. Porcentaje de identidad de la secuencia 64 de aminoácidos deducidos del ADNc de la enzima formadora del puente de la berberina de Argemone mexicana (BBEAm1) con otras especies

CUADRO 4.1. Cebadores empleados para la 78 amplificación del ADNc parcial de la NCS y la BBE en Argemone mexicana

CUADRO 4.2. Relación de secuencias utilizadas en los 82 análisis de comparación y filogenéticos

CUADRO 4.3. Porcentaje de identidad de las 86 secuencias de aminoácidos deducidos de la NCSAm1 y NCSAm2 con secuencias reportadas para la norcoclaurina sintasa (NCS), proteínas de patogénesis (PR10), proteínas con unión a citocininas (CSBP) y proteínas

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alergénicas Bet V1 (MAP) CUADRO 4.4. Porcentaje de identidad de las 89

secuencias de aminoácidos deducidos de la BBEAm1 y BBEAm2 con secuencias reportadas para la enzima formadora del puente de la berberina (BBE), proteínas dependientes de FAD

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4-HPAA 4'0MT 6'0MT A Bis ADN ADNc ANA ARN ARNm BAP BBE CFS CNMT COR CTAB DBOX DRR EDTA ETOH FAD IPTG JA LPC MES MEJA MOPS MSH NCS NMCH P6H PF PS PVPP PCR RE RT-PCR SA

ABREVIA TU RAS

4-hidroxifenilacetaldehído 3 • -hidroxi-N-metilcoclaurina 0-metiltrasferasa 6-0-metiltransferasa Alcaloides bencilisoquinolínicos Ácido desoxirribonucleico Ácido desoxirribonucleico complementario Ácido naftalénacetico Ácido ribonucleico Ácido ribonucleico mensajero 6-bencilaminopurina Enzima formadora del puente de la berberina ( S)-chelantiofolia sintasa Coclaurina N-metiltransferasa Codeinona reductasa Bromuro de hexadeciltrimetil amonio Dihidobenzofenantridina oxidasa 1 ,2-dehidroreticulina reductasa Ácido etilendiaminotetraacético Etanol Flavín adenina dinucleotido lsopropil ~-D-1-thiogalactopiranósido Ácido jasmonico Lisofosfatidilcolina Material electrónicamente-denso Jasmonato de metilo Ácido 3-( morfolino )propanosulfónico ( S)-cis-N-metilestilopina 14-hidroxilasa Norcoclaurina sintasa N-metilcoclaurina 3'hidroxilasa Protopina-6-hidroxilasa Peso fresco Peso seco Polivinilpolipirrolidona Reacción en cadena de la polimerasa Retículo endoplásmico Reacción de la polimerasa del ARN retrotranscrito Ácido salicílico

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SAT SDS SPS SOMT SOR STS TNMT Tm Tris TYDC X-GAL

Acetil coenzima A: salutaridinol-7 -0-acetiltransferasa Dodecil sulfato de sodio ( S)-estilopina sintasa Escoulerina-9-0-metiltransferasa Salutaridina: NADPH 7 -oxidoreductasa Salutaridina sintasa Tetrahidroprotoberberina-cis-N-metiltransferasa Temperatura de desnaturalización Hidroximetil aminometano clorhidrato Tirosina/dopa descarboxilasa 5-bromo-4-cloro-3-indolii-~-D-galactopiranosido

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RESUMEN

Cardo santo (Argemone mexicana L, Papaveraceae) es una planta a la que se atribuyen propiedades medicinales que posiblemente se relacionen con su capacidad para acumular alcaloides tipo isoquinolínicos (berberina y sanguinarina). Estos alcaloides se forman a partir de la tirosina mediante una compleja serie de reacciones enzimáticas que suceden en diferentes compartimentos celulares. En este trabajo se aislaron y caracterizaron los ADNc correspondientes a dos enzimas involucradas en la síntesis de alcaloides en A. mexicana: la norcoclaurina sintasa (NCS) y enzima formadora del puente de la berberina (BBE). En general, la secuencia de las dos isoformas aisladas para la NCS y para la BBE mostraron un 70% de identidad con las ya reportadas en Papaver somniferum, Eschscholzia californica (ambas de la familia Papaveraceae) y Talictrum flavum (familia Ranunculaceae ). De igual forma, presentaron identidad con otras proteínas de defensa, sugiriendo un antecesor común con éstas. El análisis filogenético apoyó esta interpretación. Tanto la NCS como la BBE parecen formar familias génicas con un número reducido de copias.

Por otro lado, el análisis de la expresión de la NCS y BBE en diferentes tejidos mostró una relación entre los niveles de transcritos y la acumulación de los alcaloides en plantas maduras. En plántulas en desarrollo, la sanguinarina se pudo detectar desde etapas tempranas, no así la berberina que sólo se observó en etapas más avanzadas y solamente en las partes aéreas. La acumulación de los transcritos, tanto de la NCS como de la BBE, mostró una correlación con la de los alcaloides. Algo similar se detectó en suspensiones celulares, que fueron capaces de acumular sanguinarina, aún sin ser sometidas a condiciones de inducción del metabolismo secundario. No obstante, la exposición de éstas al jasmonato de metilo (MEJA), pero no al ácido salicílico, aumentó la

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acumulación de sanguinarina y este efecto fue posterior al aumento en el nivel de los transcritos.

Estos datos, en conjunto, sugieren que la síntesis de alcaloides en A. mexicana tiene características particulares, distintas a los reportados en otras plantas que producen alcaloides del mismo tipo.

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ABSTRACT

Argemone mexicana L, (Papaveraceae) is known with the common na me of "cardo santo", among others. lt has been used since ancient times for its alleged healing properties, probably due to the isoquinoline alkaloids that it produces, such as berberine and sanguinarine. These alkaloids are formed from tyrosine, through a complex series of enzyme reactions, taking place in different subcellular compartments. In this work, the cDNAs corresponding to two of the enzymes involved in alkaloid biosynthesis in A. mexicana were isolated and characterized: norcoclaurine synthase (NCS) and the berberine bridge enzyme (88E). For both enzymes, two isoforms were isolated by RT -PCR and sequence analysis revealed up to 70% identity with those previously reported from Papaver somniferum, Eschscholzia californica (both Papaveraceae) and Talictrum flavum (Ranunculaceae). Significant identity was found with other defense related proteins, suggesting a common ancestor. A phylogenetic analysis supported this interpretation. 8oth, NCS and 88E seem to belong to small gene families.

8oth, NCS and 88E transcripts accumulated in the alkaloid accumulating . tissues roots, stem and capsule, suggesting that such tissues may also be the sites for synthesis. In developing seedlings, sanguinarine was detected from early stages whereas berberine was only detected at later phases and only in the aerial tissues. NCS and 88E transcript accumulation correlated with alkaloid accumulation. A similar trend was observed in cell suspensions which accumulated important levels of sanguinarine, even in the absence of treatments to induce secondary metabolism. However, exposure to methyl jasmonate (MEJA), but not to salicylic acid, increased sanguinarine accumulation and this effect was occurred after the increase of transcript levels.

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Taken together, these results suggest that alkaloid biosynthesis in A. mexicana present important differences, in comparison with other plants.

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INTRODUCCIÓN

Los alcaloides son compuestos nitrogenados, de naturaleza alcalina, con una distribución taxonómica restringida y que ejercen un efecto fisiológico en organismos diferentes a los que lo producen (Hashimoto y Yamada, 1994). Si bien diversos organismos pueden producirlos, las plantas son consideradas como la fuente principal ya que son muy comunes en ellas. La función de los alcaloides está relacionada con diferentes tipos de interacciones del organismo que los produce con su entorno, como aquellas entre plantas con herbívoros o de plantas con microorganismos.

El nitrógeno de los alcaloides proviene de ciertos aminoácidos, por lo que se pueden definir los diferentes grupos de alcaloides por su origen biosintético. Las principales familias de alcaloides provienen de la ornitina/argina, lisina, triptofano, fenilalanina y tirosina. La tirosina da lugar a los alcaloides bencilisoquinolínicos (ABis), una de las familias más numerosas.

Muchos de los ABis presentan actividad farmacológica y algunos de ellos son útiles en el tratamiento de diversas afecciones. Estos alcaloides son comunes en las Papaveraceas, familia que incluye a Argemone mexicana, una planta utilizada en la medicina tradicional mexicana y que es capaz de sintetizar alcaloides tipo benzofenantridina (sanguinarina) y protoberberina (berberina); dos subgrupos de los ABis con una potente actividad antimicrobiana que sugiere su participación en la protección química de las plantas que los forman.

La biosíntesis de estos alcaloides se ha estudiado debido a que su acumulación puede promoverse cuando las plantas, o sus tejidos, son expuestos a condiciones que simulan un ataque por patógenos o herbívoros. Más aún, varias de las enzimas involucradas en la formación de estos alcaloides han sido

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aisladas y caracterizadas, por lo que se han empezado a entender los mecanismos moleculares y los controles bioquímicos que regulan el flujo de los intermediarios. Estos trabajos han indicado que estos alcaloides se acumulan de manera diferencial en los tejidos de las distintas especies que los producen. De este modo, los mecanismos regulatorios descritos en otras especies pueden diferir de los que operan en A. mexicana.

Con el fin de documentar las particularidades de la síntesis de ABis en A. mexicana, en este trabajo se aislaron los ADNc correspondientes a dos de las enzimas involucradas en este proceso; la norcoclaurina sintasa (NCS) y la enzima del puente de la berberina (BBE). Una vez que se dispuso de ambas clonas, éstas fueron utilizadas como sondas moleculares para estudios sobre la regulación molecular de la síntesis de alcaloides, que incluyeron el análisis de la expresión tejido específico y la relación que ésta guarda con el tipo y contenido de alcaloides, tanto en plantas maduras como en plántulas en desarrollo. Más aún, utilizando un cultivo de células en suspensión, derivado de hojas, se analizaron los efectos de algunos inductores del metabolismo secundario sobre los niveles de los transcritos y los alcaloides. De esta manera, este trabajo marca el inicio de los estudios a nivel molecular de esta interesante planta de la medicina tradicional mexicana.

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CAPÍTULO 1 ANTECEDENTES

1.1. Argemone mexicana

La familia Papaveraceae incluye plantas cuyos compuestos qUJm1cos tienen propiedades farmacológicas. Varios integrantes de esta familia se han ganado un lugar en la terapéutica tradicional mexicana y con frecuencia se mencionan en la historia de la medicina en diferentes culturas nativas de América (Lozoya y Lozoya, 1982; Schwarzbach y Kadereit, 1999). Por otro lado, la flora mexicana es una de las más diversas del mundo. Lá disponibilidad de estos recursos naturales, junto con el avance cultural de los antiguos habitantes de la región de lo que hoy es México propició la identificación y manejo de plantas que podían satisfacer diferentes necesidades de esos pueblos, incluyendo las de medicinas y de elementos para usos religiosos. Gracias a las diferentes fuentes históricas, se han podido reconocer muchas de las plantas utilizadas con fines curativos y ceremoniales. Una de estas plantas es Argemone mexicana, probablemente la papaverácea silvestre más abundante en nuestro país (Fig.1.1 ). Esta planta tiene varios nombres comunes en español, como amapola montés, cardo o cardo santo, así como en diversas lenguas indígenas como chicalote (Náhuatl), guechinichi (Zapoteco), y k'ix- k'anlol (Maya), entre otros. Se encuentra ampliamente distribuida en los estados de Aguascalientes, Coahuila, Colima, Chiapas, Chihuahua, Durango, Guanajuato, Guerrero, Jalisco, Estado de México, Morelos, Nuevo León, Oaxaca, Puebla, Querétaro, Quintana Roo, Sinaloa, Sonora, Tamaulipas, Tlaxcala, Veracruz y Yucatán (Lozoya y Lozoya, 1982). Se le puede encontrar como flora arvense y vegetación secundaria en áreas de cultivo abandonadas, pastizales y orillas de carreteras.

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1.1.1. DESCRIPCIÓN BOTÁNICA

Argemone mexicana es una planta anual que contiene un látex amarillo brillante. Alcanza entre 30 y 90 cm de alto; su tallo es solitario y ramoso en la base, con espinas escasas perpendiculares o ligeramente reflejas. Sus hojas son alternas y sésiles, lobuladas de aproximadamente 4 a 8 cm de ancho y de 6 a 20 cm de largo, las basales son ovalolanceoladas y las superiores elípticas u ovaladas y espinosas. Sus flores pueden ser amarillas o blancas de 3 a 7.5 cm de diámetro. Los frutos son cápsulas de entre 4 y 6 carpelos, dehiscentes por el vértice (Lozoya y Lozoya, 1982). Esta planta crece en los climas semicálidos y templados, con alturas que van desde el nivel del mar hasta los 2750 m, su distribución por la zona bioclimática se encuentra entre las zonas áridas y de selva baja caducifolia (Villaseñor-Ríos y Espinosa-García, 1998).

1.1.2. USOS TRADICIONALES

Existen datos de que esta planta era utilizada por las culturas prehispánicas con fines curativos (Emmart, 1940; Willcox et al., 2007). Se empleaba para el tratamiento de nubes o cataratas, aplicando directamente el látex sobre los ojos. También era usada para aliviar la fiebre, para curar úlceras sexuales, la sarna, como purgante y en ciertas enfermedades cutáneas. Entre los usos medicinales también aparece el que se hace de sus flores para preparar infusiones consideradas sedantes, narcóticas y antitusivas. De igual forma, el aceite obtenido de las semillas se ha utilizado para aliviar los cólicos ya que desvanece el dolor, produciendo un efecto hipnótico notable. Hay que señalar que tales usos medicinales fueron adquiridos a lo largo de su historia y que la presencia de alcaloides en diferentes partes de la planta puede explicar las propiedades que se le atribuyen (Lozoya y Lozoya, 1982).

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1.1.3. COMPOSICIÓN QUÍMICA

A esta planta se le ha llamado "fábrica de alcaloides" debido a sus compuestos químicos, algunos de conocida toxicidad y que pueden producir diversos efectos. Estos alcaloides son del grupo de los bencilisoquinolínicos, típicos de las Papaveraceas, e incluyen compuestos del grupo protoberberina (berberina), predominantes en las partes aéreas, así como del grupo benzofenantridina (sanguinarina), mayoritario en la raíz y las semillas (Lozoya y Lozoya, 1982). Estos alcaloides tienen en común propiedades antibióticas sobre un rango amplio de microorganismos patógenos (Beuria et al., 2005; Villinski et al. , 2003; Sánchez-Mendoza et al., 2008) y han sido utilizados en tratamientos para prevenir la placa dento-bacteriana y como expectorante (Robert y Wink, 1998). Además, a la sanguinarina se le atribuye la capacidad de inhibir la proliferación de varios tipos de células cancerígenas y la disrupción de microtúbulos (Adhami et al. , 2004; Ahmad et al., 2000; Wolff y Knipling, 1993). Otros alcaloides presentes en cantidades menores incluyen la coptisina, alocriptopina, la queleritrina y dihidroqueleritrina que poseen propiedades de modificar la función cardiaca, según estudios realizados en farmacología animal (Lozoya y Lozoya, 1982; Sánchez-Mendoza et al., 2008).

Las semillas de Argemone contienen un 93% de ácidos grasos de los cuales el 80% corresponden a ácidos insaturados (linoléico, oléico, ricinoléico, palmitoléico y linolénico) y el resto lo constituyen los ácidos saturados palmítico y esteárico. Por otro lado, de las flores se han aislado derivados de flavonoides como la isoharmnetina, el glucósido de 3-isoharmnetina y la 7-isoharmnetina, (Lozoya y Lozoya, 1982).

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Figura 1.1. Argemone mexicana. A) Cápsula en desarrollo; B) cápsula dehiscente; C) tallo con espinas perpendiculares; D) flor (amaril la); E) hoja lateral.

1.2. ALCALOIDES BENCILISOQUINOLÍNICOS (ABis)

Desde el descubrimiento y caracterización de los constituyentes químicos del opio (morfina, codeína, tebaína, papaverina, noscapina) , la pasta formada con el látex seco de la amapola (Papaver somniferum) , en el siglo XIX, un gran número de ABis han sido aislados. Más de 2,500 alcaloides de este tipo han sido identificados en familias del superorden de las Magnoliflorae y de las Ranunculiflorae (Berberidaceae, Ranunculaceae, Menispermaceae, Fumariaceae, Papaveraceae) (Facchini y De Luca , 2008) . Algunos de estos

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alcaloides son usados como fármacos, incluyendo la morfina, la codeína, la papaverina, la berberina, la sanguinarina y la (+)­tubocurarina, entre otros (Fig. 1.2). La función de los ABis en plantas incluye protección contra herbívoros y agentes patógenos. La actividad farmacológica de algunos de estos alcaloides los hace útiles en el tratamiento de diversas afecciones y nos permite tener una idea de su función biológica en la planta (Facchini, 2001; Zieg¡ler y Facchini, 2008). Por ejemplo, la morfina tiene eficacia como analgésico, la colchicina provoca la disrupción de los microtúbulos y la ( + )­tubocurarina es un bloqueador neuromuscular. Esto sugiere que los alcaloides también podrían funcionar en plantas como protección en contra del ataque de herbívoros. Por otro lado, las propiedades antimicrobianas de la sanguinarina y la berberina sugieren que estos alcaloides confieren protección contra patógenos (Schmeller et al., 1997; García et al., 2006). Muchas plantas, tales como las Papaveraceas, invierten considerables recursos para la producción de estos alcaloides, lo que sugiere que estos componentes juegan un papel relevante en la fisiología de la planta (Schmeller et al., 1997; Wink et al. , 1998).

1.2.1. RUTA DE SÍNTESIS DE LOS ABis

De manera general, la ruta de biosíntesis de los ABis se puede dividir en tres etapas (Fig. 1.2). En la etapa inicial, ·dos moléculas de tirosina, el aminoácido que da origen a todos los alcaloides de este tipo, experimentan una serie de reacciones para producir dopamina y 4-hidroxifenilacetaldeido (4-HPAA), dos intermediarios que se condensan para producir (S)­norcoclaurina, que es considerado como el precursor central de todos los ABis. La segunda etapa corresponde a la formación de (S)-reticulina, el último intermediario común en la síntesis de todos los alcaloides de este tipo. En la etapa final, la ruta de biosíntesis se ramifica para producir los tres tipos principales de alcaloides de este grupo: benzofenantridina (sanguinarina), protoberberina (berberina) y los morfinanos (morfina).

11

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Figura 1.2. Representación de la ruta de biosíntesis de los ABis. Abreviaciones: TYDC, tirosina/dopa decarboxilasa; NCS, norcoclaurina sintasa; BBE, enzima del puente de berberina.

1.2.2. Formación de norcoclaurina

Las reacciones iníciales de la biosíntesis de los ABis, consisten en una serie de descarboxilaciones, orto-hidroxilaciones y desaminaciones que convierten dos moléculas de tirosina en dopamina y en 4-hidroxifenilacetaldehído (4-HPAA), respectivamente (Rueffer y Zenk, 1987) (Fig. 1.3). Estas reacciones involucran la participación de una familia de enzimas conocida como tirosina/dopa descarboxilasa (TYDC) que . convierten la tirosina y su derivado hidroxilado, la dihidroxifenilalanina (L-DOPA) en sus respectivas aminas (Fig. 1.3). La norcoclaurina sintasa (NCS) cataliza la condensación de dopamina y 4-HPAA para producir (S)-norcoclaurina, que es

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el precursor central de todos los ABis (Samanani et al., 2004; Liscombe et al., 2005).

1.2.3. Formación de reticulina a partir de norcoclaurina

La ( S)-norcoclaurina se convierte en ( S)-reticulina mediante una serie de reacciones ordenadas que incluyen una hidroxilación y tres metilaciones (Fig. 1.3). Las primeras dos metilaciones son catalizadas por la 6-0-metiltransferasa (6'0MT) (Sato et al., 1994) y la coclaurina N-metiltransferasa (CNMT) (Frenzel y Zenk, 1990), mientras que la N­metilcoclaurina 3'hidroxilasa .(NMCH) es la responsable de la subsiguiente reacción de hidroxilación (Pauli y Kutchan, 1998). Finalmente la 3, -hidroxi-N-metilcoclaurina 0-metiltrasferasa (4'0MT), lleva a cabo la última reacción de esta serie (Sato et al., 1994 ). La ( S)-reticulina es el punto principal de ramificación en la biosíntesis de los ABis, que incluyen los de tipo benzofenantridina (Kutchan y Zenk, 1993). Una segunda rama conduce a la formación de los alcaloides protoberberina (Hashimoto y Yamada, 1994) y otra más a los alcaloides morfinanos (Facchini y Bird, 1998) (Fig. 1.3).

1.2.4. Formación de benzofenantridinas y protoberberinas

El primer paso en la síntesis de sanguinarina y berberina involucra la conversión del grupo N- metilo de ( S)-reticulina en el componente del puente metileno de la ( S)-escoulerina por acción de la enzima formadora del puente de la berberina (BBE) (Steffens et al., 1985). La ( S)-escoulerina es convertida a ( S)-estilopona por acción de dos oxidasas dependientes del citocromo P-450, la ( S)-chelantiofolia sintasa (CFS) y la (S)­estilopina sintasa (SPS), resultando en la formación de dos grupos metilenodioxi (Bauer y Zenk, 1989; 1991 ). La (S)-estilopina es N-metilada por una enzima llamada tetrahidroprotoberberina-cis-N-metiltransferasa (TNMT) (Rueffer et al., 1990). Después del paso de N-metilación, una tercera monooxigenasa dependiente del citocromo P-450, la

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( S)-cis-N-metilestilopina 14-hidroxilasa (MSH) conduce a la formación de protopina (Rueffer y Zenk, 1987) (Fig. 1.3).

Por su lado, la conversión de la protopina a sanguinarina involucra una hidroxilación, llevada a cabo por otra enzima dependiente del citocromo P-450, la protopina-6-hidroxilasa (P6H). Seguidamente un rearreglo intramolecular produce la dihidrosanguinarina (Tanahashi y Zenk, 1990) que por acción de la dihidrobenzofenantridina oxidasa (DBOX), es convertida a sanguinarina (Schumacher y Zenk, 1988) (Fig.1.3).

En cuanto a la formación de berberina, en algunas familias de plantas como las Berberidaceas y las Ranunculaceas, ésta se inicia con la metilación de la ( S)-escoulerina para dar lugar a la (S)-tetrahidrocolumbamina. La reacción es catalizada por la escoulerina-9-0-metiltransferasa (SOMT) (Sato et al., 1994 ). El siguiente paso involucra la formación de un puente metilenodioxi en la (s)-tetrahidrocolumbamina llevada a cabo por la canadina sintasa (CDS), dependiente del citocromo P-450, para formar la (S)-canadina (Rueffer y Zenk, 1994). Finalmente la ( S)-canadina, también conocida como la (S)­tetrahidroberberina, se oxida a berberina por acción de la (S)­canadina oxidasa (CDO) en Coptís y Tha/íctrum (Amman et al., 1986) o por la (S)-tetrahidroprotoberberina oxidasa (STOX) en Berberís (Hashimoto y Yamada, 1994). Aunque estas enzimas catalizan la misma reacción, sus propiedades bioquímicas son bastante diferentes. La STOX de Berberís es una proteína flavinilada con un amplio espectro para el uso de sustratos, en tanto que la CDO de Coptis y Thalíctrum contiene hierro y procede mediante un mecanismo diferente y acepta preferentemente a la (S)-canadina como sustrato (Hashimoto y Yamada, 1994) (Fig. 1.4).

14

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Figura 1.3. Síntesis de los alcaloides tipo benzofenantridina (sanguinarina) . La localización subcelular de las enzimas biosintéticas se indica con los siguientes colores: citosol , amarillo; lumen del retículo endoplásmico, azul ; membrana del retículo endoplásmico, púrpura. En color rojo se muestran las modificaciones en la estructura de los intermediarios hasta la síntesis de sanguinarina. Abreviaciones: TYDC, tirosina/dopa decarboxilasa; NCS, norcoclaurina sintasa; 6'0MT, norcoclaurina 6-0-metiltransferasa; CNMT coclaurina N-metiltransferasa; NMCH, N-metilcoclaurina 3 · -hidroxilasa; 4'0MT, 3'-hidroxi-N-metilcoclaurina 4 '-0-metiltransferasa; BBE, enzima del puente de berberina; CFS, chelantifolina sintasa; SPS, estilopina sintasa; TNMT, tetrahidroprotoberberina cis-N-metiltransferasa; MSH N-metilestilopina-14-hidroxilasa; P6H, protopina 6-hidroxilasa; DBOX, dihidrobenzofenantridina oxidasa.

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OCHJ Berberina

Protoberberlnas

Vesiculas

Figura 1.4. Síntesis de los alcaloides tipo protoberberina (berberina). Abreviaciones: BBE, enzima del puente de berberina; SOMT, escoulerina-9-0-metiltransferasa; CDS, canadina sintasa; CDO, canadina oxidasa; STOX, tetrahidroprotoberberina oxidasa.

1.2.5. Síntesis de alcaloides morfinanos

En algunas especies del género Papa ver, la conversión de (S)­reticulina a su (R)-enantiómero representa la primera etapa en la síntesis de los alcaloides morfinanos. Esto se lleva a cabo en dos pasos; el primero de ellos es la reducción estéreo específica de la 1 ,2-deshidroreticulina a (R)-reticulina, que es catalizada por acción de la 1 ,2-deshidroreticulina reductasa. Esta es una enzima citosólica dependiente de NADPH, que ya ha sido purificada de P. somniferum (De-Eknamkul y Zenk, 1992). El siguiente paso requiere el acoplamiento de un carbón intramolecular con el carbón fenólico de la (R)-reticulina, que es catalizado por la salutaridina sintasa (STS), dando lugar a la salutaridina (Gerardy y Zenk, 1993a, b) (Fig.1.5). La enzima

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citosólica salutaridina: NADPH 7-oxidoreductasa (SOR), reduce la salutaridina a (7S)-salutaridinol (Gerardy y Zenk, 1993a), mientras que la transformación de (7S)-salutaridinol en tebaína involucra una acetilación llevada a cabo por la salutaridinol-7-0-acetiltransferasa (SAT) que utiliza acetiiCoA como donador. SOR y SAT han sido detectados sólo en P. somniferum y P. bracteatum. Las últimas etapas de la transformación de tebaína en morfina consisten en una serie de reacciones, en las que la tebaína se convierte en codeinona, que se reduce a codeína (Lenz y Zenk, 1995), para finalmente ser desmetilada y producir morfina (Fig. 1.5). Solo la codeinona reductasa (COR), una enzima citosolica dependiente de NADPH cataliza la reducción de codeinona a codeína (Lenz y Zenk, 1995; Unterlinner et al., 1999).

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Figura 1.5. Síntesis de los alcaloides tipo morfinanos (morfina). Abreviaciones: DRR, 1 ,2-dehidroreticulina reductasa; STS, salutaridina sintasa; SOR, salutaridina: NADPH 7-oxidoreductasa; SAT, acetil­coenzimaA: salutaridinol-7 -0-acetiltransferasa; COR, codeinona reductasa.

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1.3. REGULACIÓN Y LOCALIZACIÓN TEJIDO-ESPECIFICA DE LOSABis

La síntesis de alcaloides en las plantas puede presentar diferentes grados de complejidad ya que puede involucrar la participación de diferentes tejidos, diferentes tipos celulares en un mismo tejido y diferentes compartimentos en una misma célula (Facchini, 2001 ). Más aún, además de esta separación espacial, también puede ocurrir una separación temporal, en la que parte de la ruta de síntesis de un alcaloide no puede ocurrir, sino hasta que el tejido alcanza cierto estado de madurez (Facchini , 2001; Ziegler y Facchini , 2008).

En el caso de la síntesis de morfina (Figs. 1.3 y 1.5), diferentes tejidos están involucrados en el proceso de síntesis en P. somniferum. Así, la TYDC se expresa principalmente en tallos y raíz en menores niveles en las cápsulas. En los tallos, los transcritos se acumulan en abundancia en las células del metafloema (Facchini y De Luca, 1995). En esta especie, el metafloema se encuentra en estrecha asociación con las células laticíferas lo que establece una relación directa entre los sitios de síntesis de los alcaloides o sus precursores con el tejido vascular (Facchini y De Luca, 1995). De esta manera, el transporte de los alcaloides a los sitios finales de acumulación se facilitaría. Por su lado, la NCS también es más activa en raíces y tallos en P. somniferum (Samanani y Facchini, 2001 ), mientras que los transcritos de la NMCH son más abundantes en tallo, seguidos por la raíz, hojas y tejidos florales (Huang y Kutchan, 2000). La actividad de la STS y la SOR, que participan en la síntesis de morfina (Fig. 1.5), pueden ser detectadas en las raíces y brotes (Gerardy y Zenk, 1993a, 1993b ). En contraste, la COR, responsable del último paso de la síntesis de morfina, se encuentra distribuida en todos los tejidos. No obstante, la mayor actividad ocurre en cápsulas y en partes jóvenes de los tallos (Huang y Kutchan, 2000). Si bien estos resultados sugieren que algunos intermediarios de la síntesis de la morfina deben ser transportados de las raíces a

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las diferentes partes aéreas donde el alcaloide se acumula, tanto en raíces como en tallos se pueden localizar los transcritos correspondientes a enzimas involucradas en las tres etapas de la síntesis de ABis, concretamente de la morfina. Esto sugiere que todas las reacciones podrían tomar lugar en un mismo tejido (Bird et al., 2003; Ziegler y Facchini, 2008). No obstante, esto no implica que todas estas reacciones sucedan en el mismo tipo celular. Mediante inmunofluorescencia, y utilizando anticuerpos purificados por afinidad contra BBE, CYP8081 y COR (Figs. 1.3, 1.4 y 1.5), se pudo observar que los antígenos correspondientes se localizaban en las regiones parietales de las células que conforman los tubos cribosos del floema, mientras que, por hibridación in situ, se observó que los . transcritos correspondientes se encontraban en las células acompañantes, adyacentes a éstos. Más aún, los alcaloides no se lograron detectar en ninguno de estos dos tipos celulares, sino en un tercero; las células laticíferas (Bird et al., 2003; Ziegler y Facchini, 2008). De esta manera, la síntesis de estos alcaloides puede involucrar hasta tres distintos tipos celulares.

Por otra parte, la acumulación de sanguinarina (Fig. 1.3) en raíces de P. somniferum podría indicar que las enzimas involucradas en su síntesis se encuentran solamente en este órgano (Facchini y De Luca, 1995). Sin embargo, los niveles sustanciales de ARNm y de actividad de BBE en los brotes, sugieren que los intermediarios involucrados en la síntesis de la sanguinarina pueden ser transportados de los brotes a las raíces (Steffens et al., 1985; Facchini et al. , 1996b). De modo similar, y aún cuando la berberina, una protopina, se acumula en las raíces primarias de Coptis japonica , la baja actividad en estos tejidos de la SOMT, que participa en la síntesis de este alcaloide (Fig. 1.4 ), sugieren que éstas no son el sitio principal de síntesis (Fujiwara et al. 1993). De hecho, la síntesis de berberina podría ocurrir en las raíces laterales y en los tallos, donde se detectó la mayor actividad de SOMT. De manera interesante la NCS se expresa principalmente en raíces y tallos en Talictrum flavum (Samanani et al. , 2002).

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1.4. COMPARTAMENTALIZACIÓN SUBCELULAR DE LAS ENZIMAS DE LA SÍNTESIS DE LOS ABis

Algunas de las enzimas que participan en la síntesis de los ABis se encuentran asociadas a diferentes compartimientos subcelulares mientras que otras se encuentran en el citosol (Fig. 1.3). La compartimentación de estas enzimas tiene como consecuencia la retención de los alcaloides tóxicos en estructuras cerradas, aislándolos del citosol, donde podrían interferir con otros procesos metabólicos. Por otro lado, la distribución de las enzimas en diferentes estructuras subcelulares, implica que los intermediarios deben ser transportados entre ellas y este tráfico subcelular podría representar un nivel importante de regulación metabólica (Facchini, 2001 ; Ziegler y facchini, 2008).

El estudio de la síntesis de sanguinarina en P. somniferum mediante el fraccionamiento de componentes celulares en un gradiente de densidad, sugiere la localización no citosólica de las enzimas involucradas en la conversión de ( S)-reticulina a sanguinarina. Así, la BBE, CFS, SPS, MSH, y P6H (Fig. 1.3) han sido localizadas en formaciones vesiculares submicroscópicas (microsomas) (Amman et al, 1986; Bauer y Zenk, 1989; 1991 ; Rueffer y Zenk, 1987; Tanahashi y Zenk, 1990). Todas las enzimas anteriores, con excepción de la BBE, son dependientes de citocromo P-450 y están asociadas con las membranas del retículo endoplásmico (RE) o con vesículas derivadas de éste. Además, a diferencia de las otras enzimas, la BBE no está embebida de manera integral en la membrana (Bird y Facchini 2001; Liscombe y Facchini, 2008). Los microsomas, a los que se asocian algunas de estas enzimas tienen una densidad entre 1.11 y 1.14 g mr1

, lo que sugiere la existencia de vesículas diferentes a las derivadas del RE y posiblemente especializadas en la síntesis de alcaloides (Amman et al., 1986; Bauer y Zenk, 1989). Más aún, la oxidación final de la dihidrosanguinarina a sanguinarina, catalizada por DBOX (Fig. 1.3), ocurre probablemente en estas

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vesículas (Amman et al, 1986), que terminan por fusionarse con la vacuola central , donde se acumula la sanguinarina (Amman et al, 1986; Liscombe y Facchini, 2008).

De este modo, al menos tres compartimentos subcelulares están involucrados en este proceso; el RE, vesículas microsomales y la vacuola. En este sentido, el producto de la traducción del transcrito de la BBE es inicialmente dirigido al RE, para después ser enviado a la vacuola, por medio de las vesículas ya descritas, en donde realizaría su función (Alcántara et al, 2005; Bird y Facchini, 2001; Liscombe y Facchini, 2008). No obstante, dado que el pH óptimo para la actividad de la BBE es básico (8.8; Steffens et al. , 1985), las condiciones ácidas de la vacuola, harían poco probable el funcionamiento de la enzima (Facchini, 2001 ). De igual forma, la NCS posee un posible péptido señal que la dirigiría al RE (Samanani et al., 2004).

La acumulacion de sanguinarina en la vacuola sugiere que el contenido de las vesículas de transporte incluyen a la BBE, así como diversos intermediarios que pueden ser transportados del RE hacia este organelo (Amann, et al., 1986). Es interesante hacer notar que en suspensiones celulares de P. somniferum tanto la NMCH, como la BBE y la sanguinarina fueron co­localizadas en el RE (Alcántara et al; 2005). Más aún, la acumulación de sanguinarina inducida por la exposición a homogenados fúngicos, produjo una dilatación del RE, conjuntamente con la acumulación de material electrónicamente-denso (MES) entre éste y la vacuola. La presencia de MES sugiere la ocurrencia de compuestos químicos, probablemente alcaloides, en las vesículas derivadas del RE y que terminan fusionándose con la vacuola central (Alcántara et al , 2005). Esto sugiere que el proceso de síntesis de este alcaloide se inicia en el RE, del cual se desprenden las vesículas especializadas en las que el proceso continúa, para finalizar en la vacuola, donde el alcaloide se acumula.

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1.5. TRANSPORTE INTERCELULAR DE LAS ENZIMAS BIOSÍNTETICAS DE LOS ABis

Por lo general los alcaloides se acumulan en tipos específicos de células probablemente como una forma de protección contra su toxicidad, relacionada con su participación en mecanismos de defensa. Por ejemplo, los alcaloides de Catharanthus roseus se acumulan en los idioblastos y en las células laticíferas (St-Pierre et al., 1999; De Luca y St-Pierre, 2000), mientras que en Talictrum flavum se localizan en la endodermis de la raíz y en la corteza o médula del tallo (Samanani et al., 2005). De igual forma, en Papaver somniferum los alcaloides se acumulan en las células laticíferas adyacentes o próximas a los elementos de los tubos cribosos del floema (Bird et al., 2003; Liscombe y Facchini, 2008). El citoplasma de las células laticíferas se conoce como látex y puede contener todos los organelos y vesículas donde se acumulan los alcaloides (Alcántara et al., 2005). El látex fue considerado por mucho tiempo como el sitio dónde ocurría la biosíntesis de los ABis. Esta percepción parecía reafirmarse cuando, recientemente, la enzima COR fue identificada como una de las proteínas más abundantes en una fracción cruda del látex de tallos de P. somniferum (Decker et al., 2000; Hagel et al., 2008). Sin embargo, el látex cosechado de cápsulas y tallos puede resultar contaminado con el citoplasma presente en las células circundantes, especialmente de las que se encuentran en el floema (Facchini y St-Pierre, 2005). De hecho, como ya se mencionó, la localización in situ de los transcritos y las enzimas involucradas, confirman que este proceso no involucra a las células laticíferas, sino que éstas podrían ser únicamente los sitios de acumulación (Bird, et al. 2003; Weid, et al. 2004; Liscombe y Facchini, 2008). Un total de siete enzimas; 6'0MT, CNMT, NMCH, 4'0MT, BBE, SAT, COR, han sido localizadas por inmunocitoquímica en los elementos de los tubos cribosos en P. somniferum mientras que los transcritos correspondientes se localizan en las células acompañantes (Samanani et al.

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2006; Liscombe y Facchini, 2008). La localización de los transcritos y sus proteínas correspondientes en diferentes tipos de células, sugiere la existencia de un mecanismo de movilización intercelular de los transcritos hacia los elementos de los tubos cribosos del floema. Esto sería posible gracias a que algunas de estas enzimas poseen las secuencias que facilitarían su transporte simplástico (Oparka y Turgeon, 1999; Oparka, 2004 ). Esto quedó demostrado cuando el extremo N­terminal de una presunta BBE de N. benthamiana se fusionó con la proteína verde fluorescente, lo que permitió visualizar el transporte de la proteína quimérica entre las células acompañantes y los tubos cribosos vía plasmodesmo (Oparka, 2004).

Es interesante notar que previamente no se tenía evidencia de que las células de los tubos cribosos pudieran tener un metabolismo complejo ya que pierden el núcleo durante su maduración. Por esta razón, se asumía que sólo poseían un número limitado de proteínas; las necesarias para su propia conservación y el transporte de solutos. No obstante, la lista de funciones fisiológicas ahora conocidas para los elementos de los tubos cribosos incluye el transporte de macromoléculas, como el ARN (Jorgensen et al., 1998), así como la biosíntesis de diferentes compuestos, incluyendo el ácido jasmónico (Hause et al. 2003), ácido ascórbico (Hancock et al., 2003) y otras moléculas relacionadas con los mecanismos de defensa (Walz et al. 2004).

1.6. SÍNTESIS DE ABis EN CULTIVOS DE CÉLULAS in vitro

El perfeccionamiento de las metodologías de cultivos in vitro de células vegetales, y en particular la inducción del metabolismo secundario, redundó en el descubrimiento de muchas enzimas que participan en estas vías de síntesis. En los últimos años, los ADNcs correspondientes a las enzimas involucradas en la síntesis de los ABis han sido aislados y caracterizados en diversas especies, lo que ha permitido estudiar el efecto de

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diversos inductores sobre la actividad transcripcional (Cuadro 1.1 ).

Cuadro 1.1. Enzimas involucradas en la síntesis de los ABis en plantas para las que han sido aislados los ADNcs correspondientes.

Enzimas Especies Num. Expresión Inducción Referencia copia (Fúnglcos,

Jasmonatos)

TYDC T. flavum 15 Tallo, raíz si Samanani et al. 2005 P. somniferum Facchini et al. 1994

NCS T. flavum 2 Tallo, si Samanani et al. 2004 P. somnireum pecíolo Liscombe et al. 2005 C. japonica Minami et al. 2007

6'0MT T .flavum 1 Tallo, raíz, si Samanani et al. 2005 P. somnireum hoja, Morishíge et al. 2000 C.japonica cápsula Ounaroon et al. 2003

CNMT T. f/avum 1 Tallo, raíz, si Samanani et al. 2005 P. somniferum brotes Choi et al. 2002 C.japonica Facchini et al. 2003

NMCH T. flavum 263 Tallo, raíz, si Samanani et al. 2005 P. somniferum hoja, brote Pauli et al. 1998 E. californica Huang et al. 2000

4'0MT T. ffavum 2 Tallo, brote si Samanani et al. 2005 P. somniferum Morishige et al. 2000 C. japonica Facchini et al. 2003

BBE T. ffavum, 3 Tallo, raíz, si Sama na ni et al. 2005 P. somniferum hoja, brote, Dittrich et al. 1991 B. stolonifer, cápsula Chou et al. 1998 E. californica Facchiní et al. 1996b

Hauschild et al. 1998 SOMT T. flavum 1 Tallo, raíz si Samanani et al. 2005

C.japonica Takeshita et al. 1995 COR P. somniferum 6 Tallo, rafz, No Unterlinner et al.1999

hoja, brote, cápsula

P. somniferum es un modelo ventajoso para el estudio de la regulación diferencial de la síntesis de los ABis ya que produce tanto los de tipo benzofenantridina, como los de tipo morfinanos, si bien esta última capacidad se pierde en cultivos no diferenciados (Facchini y Bird, 1998; Zulak et al., 2008). En las suspensiones celulares de esta planta se han podido detectar las enzimas involucradas en la síntesis de morfina, no

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obstante, dicho alcaloide no logra acumularse, aun en condiciones en que se induce la activación del metabolismo secundario, como el tratamiento con jasmonatos (JA) y homogenados fúngicos (Lenz y Zenk, 1995; Facchini y Bird, 1998). Estos tratamientos, por otra parte, logran inducir la síntesis de sanguinarina, no solo en P. somniferum, sino también en cultivos de E. californica (Ditrich y Kutchan, 1991 ). Los cultivos de diferentes especies de Papaveraceas que producen estos alcaloides, son capaces de sintetizarlos cuando se exponen a inductores del metabolismo secundario. Por ejemplo, en cultivos de P. somniferum, E. californica y S. canadensis, solamente se detectan trazas de sanguinarina en condiciones normales de mantenimiento. Sin embargo, al ser expuestas a un inductor este alcaloide se acumula en contenidos de hasta el 4% peso seco (PS) (lkuta, 1998; Zulak et al., 2008).

De manera general, la actividad de las enzimas biosintéticas asociadas a la membrana se promueve por acción de los inductores, no así las citosólicas (Biechert et al., 1995). Sin embargo, varios miembros de la familia de la TYDC, que son enzimas citosólicas, se expresan de manera rápida y transitoria en suspensiones celulares de P. somniferum como respuesta a los tratamientos con inductores (Facchini et al., 1996a, 1998). Esta inducción podría requerir la participación de JA, ya que la aplicación de este compuesto produce efectos similares (lgnatov et al., 1996). De modo interesante, en los cultivos de Papaver los transcritos para NMCH y BBE que participan en la formación de intermediarios comunes para las benzofenantridinas y protoberberinas (Fig. 1.3), presentaron patrones de expresión similares a los de la TYDC. Por su parte, la expresión de COR, involucrada en la formación de morfina sólo pudo detectarse en niveles muy bajos, que no se modificaron en respuesta al inductor (Huang y Kutchan, 2000).

La coordinación de la expresión de BBE con NMCH también ocurrió en cultivos de E. ca/ifornica tratados con jasmonato de

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metilo (MEJA), provocando la acumulación de los transcritos correspondientes (Pauli y Kutchan, 1998; Blechert et al. , 1995; Dittrich y Kutchan, 1991 ; Pauli y Kutchan, 1998). Más aún, la actividad de las enzimas CFS, SPS, MSH, P6H, todas dependientes del citocromo P-450, también aumentaron después de la exposición al inductor (Bauer y Zenk, 1991 ; Blechert et al., 1995).

Por su parte, en cultivos de S. canadiensis se ha demostrado que la actividad de la DBOX, enzima que participa en la formación de las benzofenantridinas, incrementa entre 4 y 14 veces en suspensiones celulares tratadas con MEJA y ácido salicílico (SA), respecto a cultivos no tratados (lgnatov et al. , 1996).

Las suspensiones celulares de especies productoras de berberina como T. tuberosum y C. japonica (Ranunculacea) pueden ser inducidas, conduciendo a la acumulación de este alcaloide (De Luca y Laflamme, 2001; lkezawa et al. , 2008). Así, la exposición a MEJA aumentó la actividad de cuatro diferentes 0-metiltransferasas que actúan en la síntesis de este alcaloide en cultivos de T. tuberosum (Frick y Kutchan, 1999). Esto establece un contraste con los cultivos que acumulan alcaloides de tipo benzofenantridina, como P. somniferum y E. californica, en los que la actividad de las metiltransferasas no es sensible a este inductor (Frick y Kutchan, 1999).

Tomando en cuenta estos resultados, es claro que la biosíntesis de sanguinarina y berberina puede resultar promovida por diferentes tipos de inductores, como consecuencia de la activación coordinada de genes de su biosíntesis. Sin embargo, estos inductores pueden activar distintos conjuntos de genes en diferentes especies de plantas, lo que parece depender de la clase de ABis que producen. De este modo, los hallazgos en una especie no pueden ser extrapolados a otras sin un análisis cuidadoso.

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El estudio de los promotores de genes involucrados en la síntesis de los ABis permite explorar aspectos en el control de la formación de éstos. El análisis de expresión temporal de construcciones hechas uniendo promotores de los genes Tydcl y Bbe1 de P. somniferum, con el gen reportero GUS, ha permitido la identificación de las regiones necesarias para la funcionalidad de dichos promotores (Park et al. , 1999). Además, se han logrado identificar dominios de entre 1 00 y 150 nucleótidos que son necesarios para la inducción por heridas en estos dos genes (Park et al., 1999). Por su parte, el análisis funcional del promotor de la Bbe1 de E. ca/ifornica reveló una secuencia de 150 nucleótidos, que comparte un 55% de identidad con la región equivalente en el promotor para este mismo gen en P. somniferum (Hauschild et al. , 1998). Esto sugiere que dichas secuencias podrían participar en la activación de este gen a los inductores u otros estímulos comunes (Facchini, 2001; Ziegler y Facchini, 2008).

1.7. TRANSDUCCIÓN DE SEÑALES EN LA SÍNTESIS DE ABis EN RESPUESTA A LA INDUCCIÓN

Como ya se señaló en el apartado anterior, las suspensiones celulares de diversas Papaveraceas reaccionan a diferentes inductores (homogenizados fúngicos, levaduras y jasmonatos) promoviendo la biosíntesis de los ABis. Esta respuesta es la parte final de un sistema que se inicia tras la percepción del estímulo inicial. Es importante resaltar que, en cultivos de Eschscholzia californica, la activación de la síntesis de alcaloides ocurre utilizando concentraciones de un inductor, preparado con extracto de levadura, muy por debajo del umbral requerido para estimular los eventos asociados con la respuesta hipersensible como el depósito de proteínas en las paredes celulares, la acumulación de compuestos fenólicos, la lignificación y muerte celular (Roos et al., 1998). Este aumento en la síntesis de alcaloides se relaciona con la acidificación del citosol que, a su vez, resulta de la salida de protones de la vacuola (Roos et al. , 1998). Diversos datos sugieren la

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existencia de dos vías de señalización involucradas en el incremento de los alcaloides en estos cultivos. Por un lado, se ha demostrado que las concentraciones bajas del inductor (entre 0.2 a 1 ~g/ml) promueven la síntesis de ABis, sin aumentar los contenidos internos de JA, mientras que las concentraciones elevadas (>5 ~g/ml), sí lo hacen (Farber et al., 2003). El JA es una hormona que funciona como mediador químico en la inducción de la síntesis de alcaloides en E. californica (Biechert et al., 1995) y en C. roseus (Van der Fits y Memelink, 2000), entre otros. De manera interesante, la inducción en respuesta al JA, en los cultivos de E. califórnica, no está acompañada por la acidificación del citoplasma, pero sí desencadena las reacciones asociadas con la respuesta hipersensible (Farber et al., 2003). Como ya se mencionó, estos datos sugieren la existencia de dos rutas diferentes de señalización que convergen para la biosíntesis de alcaloides y que se ilustran en la Figura 1.6. La primera de estas rutas dependería de los JAs y no ha sido bien detallada. Esta se basa en que las concentraciones elevadas del inductor (extracto de levadura) establecen una interacción con una fosfolipasa A2 soluble que conduce a un aumento en la producción del jasmonato, a partir del ácido linolénico. El aumento de este compuesto promueve la activación de genes relacionados con la defensa, entre ellos, los de la síntesis de alcaloides (Fig.1.6; Faber et al., 2003). La segunda ruta parece depender del flujo de protones y conduce hacia la síntesis de los alcaloides, aún sin tener una relación directa con los JA y la repuesta hipersensible. Esta última comprende la activación de una proteína Ga, asociada a la membrana plasmática, y que podría establecer el contacto con el inductor (Viehweger et al., 2006). Se ha demostrado que esta proteína puede activar a una fosfolipasa A2, sobre la misma membrana, provocando un aumento de lisofosfatidilcolina (LPC) dentro del citoplasma (Roas et al., 1999; Viehweger et al., 2002, Heinze et al., 2007). La LPC actúa, a su vez, como un segundo mensajero conectando la membrana plasmática con el tonoplasto, lo que podría activar a los transportadores H+/Na+, aumentando el

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flujo de protones de la vacuola al exterior, llevando a la acidificación transitoria del citoplasma (Roos et al. , 1999; Viehweger et al. , 2002; Schwartze y Roos, 2008). De esta manera , el flujo de protones funcionaría como un intermediario para la síntesis de los alcaloides. En este sentido, la acidificación artificial del citoplasma a partir del flujo de protones de la vacuola , utilizando ácido butírico y ácido pavílico promov1o la síntesis de alcaloides. Por otro lado, el agotamiento de la poza vacuolar de protones, manipulando el pH intracelular, impide dicha respuesta. Aquí es importante tener en mente que la acidificación del citoplasma ocurre por la salida de protones vacuolares (Fig . 1.6; Roos et al. , 1998). Los mecanismos moleculares para la activación de los genes debido al cambio de pH aún están por ser identificados.

Concentración elevada de inductor

Concentración baja de inductor

Respuesta hlpersensible

'\.

Áctdo linoléntco

\ Incremento del jasmona to

Na; ____ __ _ _

--/ H' /Na'

:~ (citop lasma) :::::::::;::::::: .. :.~) L'lp H

_ --------- Inducción de las Acttvacton transcrip tonal

enzimas biosintéticas deABis

Figura 1.6. Modelo hipotético de la cascada de señales en respuesta a la activación con un inductor de levadura en suspensiones de Eschscholzia californ ica. Dos tipos de respuesta pueden activarse dependiendo de la magnitud del estímulo, representada por la dosis del inductor. Ver explicación en el texto. (Modificado de Roos et al., 2006).

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1.8. ANÁLISIS DE LA ACUMULACIÓN DE ABis EN CULTIVOS in vitro DE Argemone mexicana

Con frecuencia los cultivos in vitro de diversas especies de Papaveraceas pueden acumular diversos alcaloides. Esto puede ser resultado de la modificación de las rutas biosintéticas durante el proceso del establecimiento de los cultivos y el contenido exógeno de hormonas en los medios de cultivos (Eirlert y De Luca, 1994; Long y Benfey, 2006). En el caso de Argemone, existen trabajos previos para la producción de alcaloides en cultivos in vitro. Entre estos se encuentra la adición de precursores al medio de cultivo, como fenilalanina y tirosina. De hecho, con base en estos trabajos se propuso que la tirosina es el precursor de la biosíntesis de ABis (Khanna et al. , 1982).

En nuestro laboratorio, se han establecido cultivos de callos de A. mexicana generados a partir de hoja joven (Campos­Tamayo, 2002). En estos cultivos se observó la presencia de sanguinarina, pero no de berberina, que se identificaron con base en criterios de cromatografía de capa delgada (Carrillo­Pech, 2006). La acumulación de sanguinarina en estos cultivos fue sensible a la luz, ya que, en condiciones de oscuridad se presentó un menor contenido, en comparación con aquellos cultivados en condiciones de luz (Carrillo-Pech, 2006). Los reguladores de crecimiento también modificaron el patrón de acumulación de alcaloides ya que la adición de ácido naftalenacético y 6-bencilaminopurina aumentaron el contenido de sanguinarina (Campos-Tamayo, 2002)

A partir de estos callos, se obtuvo una suspensión celular, para cuya obtención fue necesario variar el pH del medio de 5.5 a 6.0, ya que a pH ácido, se observaba el oscurecimiento de las suspensiones, probablemente debido a la formación de polifenoles, tipo melanina (Carrillo-Pech, 2006). La modificación del pH también permitió el aumento en el índice de crecimiento durante un ciclo de cultivo, lo que puede estar relacionado con

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las condiciones ambientales en las que la planta se desarrolla, ya que prefiere los suelos alcalinos (Ramakrishnan y Gupta, 1972). En esta suspensión, como en los callos, se identificó la presencia de sanguinarina, pero no la de berberina. No obstante, a diferencia de los callos, las suspensiones sometidas a diferentes condiciones de iluminación no mostraron un cambio significativo en el contenido de sanguinarina, aunque el perfil cualitativo presentó algunas variaciones. Además de los efectos de la luz mencionados previamente, se pudo observar que los cultivos in vitro fueron susceptibles a la aplicación de inductores químicos, como el jasmonato de metilo (MEJA) (Carrillo-Pech, 2006).

1.9. RECAPITULACIÓN DE LOS ANTECEDENTES

De la revisión anterior se desprende que Argemone mexicana (Papaveracea) es una planta que se ha utilizado en la medicina tradicional mexicana. La presencia de algunos alcaloides bencilisoquinolínicos (ABis), derivados de la tirosina, como la sanguinaria y la berberina, podría explicar las propiedades que se le atribuyen, ya que estos alcaloides tienen probada actividad antimicrobiana y leishmanicida. La ruta de síntesis de los ABis es larga y complicada, ya que involucra alrededor de 1 O enzimas, dependiendo del tipo de alcaloide en particular de que se trate (Fig. 1.2; 1.3; 1.4 y 1.5). Estas enzimas están distribuidas en diferentes tejidos, diferentes tipos celulares y, en una misma célula, en distintos compartimentos subcelulares. Esto implica la posible participación de sistemas de transporte para la movilización de los intermediarios entre los diferentes sitios. Más aún, al menos en P. somniferum, las enzimas pueden ocurrir en diferentes tipos celulares que los transcritos. Ahora bien, esta distribución puede no ser la misma en diferentes especies. Por ejemplo, la expresión de TYDC es abundante en raíces de P. somniferum mientras que es baja en las de T. flavum, en la cual es más abundante en el rizoma, un tallo modificado (Samanani et al. , 2005, Ziegler y Facchini, 2008).

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Por otro lado, en cultivos celulares de P. somniferum, E. californica y otros, la sanguinarina sólo puede detectarse en condiciones de inducción del metabolismo secundario, mientras que en los de A. mexicana este alcaloide se acumula en cantidades significativas, aún en condiciones de mantenimiento (Campos-Tamayo, 2002). Esto indica que los procesos de síntesis de estos alcaloides pueden presentar características particulares en las diferentes especies que los producen.

Las características propias de la síntesis de los ABis en A. mexicana no han sido analizadas y, puesto que este proceso puede diferir en las plantas que los producen, podría diferir de los ya estudiados. Este trabajo pretendió sentar las bases para el estudio molecular de la síntesis de alcaloides en A. mexicana. Para ello, se aislaron los ADNc correspondientes a dos enzimas claves en la síntesis de ABis; la NCS y la BBE. Una vez disponibles, y después de su caracterización, las clonas se utilizaron como sondas moleculares para el análisis de la expresión de los genes correspondientes en los diferentes tejidos de plantas maduras, así como en plántulas en desarrollo, y en cultivos de células en suspensión sometidos a diferentes condiciones. Los resultados obtenidos permitieron identificar similitudes y diferencias del proceso de síntesis de ABis entre A. mexicana y otras plantas, y así, establecer qué eventos han sido conservados entre los diferentes géneros y familias productoras de ABis.

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45

46

CAPÍTULO 2

MATERIALES Y MÉTODOS

Con base en la revisión presentada anteriormente, este trabajo plantea los siguientes objetivos.

2.1. OBJETIVOS

Objetivo general

Analizar la expresión de los genes correspondientes a la norcoclaurina sintasa (NCS) y la enzima del puente de la berberina (BBE) en Argemone mexicana, con el fin de establecer su posible participación en el control de las síntesis de los alcaloides bencilisoquinolínicos en esta especie.

Objetivos particulares

1) Aislar y caracterizar los ADNc correspondientes a la norcoclaurina sintasa (NCS) y la enzima del puente de la berberina (BBE) de A. mexicana.

2) Analizar de la expresión génica de la NCS y la BBE en diferentes tejidos de plantas maduras de A. mexicana, así como el contenido de alcaloides en los mismos tejidos.

3) Analizar la expresión génica de la NCS y la BBE, así como el contenido de alcaloides en plántulas en desarrollo de A. mexicana.

4) Evaluar el efecto del jasmonato de metilo (MEJA) y el ácido salicílico (SA) sobre la expresión génica de la NCS y BBE, así como sobre el contenido de los alcaloides en suspensiones celulares de A. mexicana.

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2.2. HIPÓTESIS

La síntesis de los alcaloides bencilisoquinolínicos (ABis) de Argemone mexicana presenta aspectos regulatorios (moleculares y fisiológicos) diferentes de los ya reportados en otras especies.

2.3. ESTRATEGIA EXPERIMENTAL

Para cumplir con los objetivos planteados, se siguió una estrategia experimental dividida en dos partes (Fig. 2.1 ). En la primera parte, se aislaron los ADNcs correspondientes a los genes que codifican para las enzimas NCS y BBE. Para ello se generaron oligonucleótidos basados en las secuencias de aminoácidos conservadas en enzimas de otras especies productoras de ABis. Estos oligonucleótidos se utilizaron como iniciadores en la reacción de la polimerasa, con ARN retrotranscrito de diferentes tejidos de A. mexicana (RT -PCR). En la segunda parte, con los ADNc ya aislados, se procedió a la caracterización molecular de los genes. Dicha caracterización involucró el análisis de la redundancia genética, así como de los patrones de expresión. Para esto último, se analizaron diferentes tejidos de la planta, así como suspensiones celulares expuestas a diferentes condiciones que afectan la biosíntesis de los alcaloides (Fig. 2.1 ). Los resultados fueron comparados con los reportados para otras especies acumuladoras de ABis.

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1 Aislamiento de los ADNc de NCS y BBE 1

de A. mexicana

1 Redundancia genética

Expresión tejido específica en plantas

de campo

1

1 RT·RCP 1

L Obtención de sondas 1 1

l Análisis molecular 1 1

.¡. 1 Análisis de expresión 1

r

1 Suspensiones celulares

1 Inducción JA, SA 1 l

1

1

1 Ralz 11 Hoja 11 Tallo 11 Cápsula 1

1 Curso temporal de la 1

activación transcripcional

Figura 2.1. Esquema de la estrategia experimental propuesto para este proyecto. Los detalles se describen en el texto en el apartado diseño experimental.

2.4. MATERIAL BIOLÓGICO

Las plantas utilizadas en este trabajo se colectaron en diferentes zonas de la ciudad de Mérida. Las plantas fueron identificadas taxonómicamente por el Dr. Roger Orellana Lanza, de la Unidad de Recursos Naturales de este Centro. Las plantas fueron colectadas completas, incluyendo las raíces, se trasladaron al laboratorio en bolsas de polietileno, conservadas en hielo. En el laboratorio, fueron lavadas con agua jabonosa y enjuagadas,· primero con agua corriente y después con agua desionizada. Se secaron con toallas de papel absorbente y se separaron los diferentes tejidos (hojas, tallos, raíces y cápsulas) que fueron pesados, congelados con nitrógeno líquido y conservados a -aooc hasta que se utilizaron. También se colectaron semillas que fueron etiquetadas y almacenadas a temperatura ambiente.

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La línea celular utilizada en el trabajo se obtuvo a partir de callos de hoja (Campos Tamayo, 2002; Carrillo Pech, 2006) y se ha mantenido en el medio PC (Phillips y Collins, 1979) a pH 5.5, suplementados con 25 g/L de sacarosa y 1 .5 mg/L de ácido naftalénacetico (ANA) y 0.5 mg/L de 6-bencilaminopurina (BAP) como reguladores del crecimiento. Los cultivos estuvieron en condiciones de cuarto de cultivo a 25°C y bajo luz continua entre 40 y 50 IJmol m-2 s-1 (lámparas fluorescentes de 39 W), con una agitación continúa de 100 rpm. Los diferentes tratamientos aplicados se describen en las secciones correspondientes.

2.6. REFERENCIAS

Campos-Tamayo, F.O., (2002) Efectos de los procesos de diferenciación celular sobre la síntesis de alcaloides en cultivos in vitro de Argemone mexicana y Catharanthus roseus. Tesis de licenciatura. Químico Farmacéutico Biólogo. Facultad de Química. UADY. Mérida, Yucatán, México.

Carrillo-Pech, M.R. , (2006) Regulación de la síntesis de alcaloides en cultivos in vitro de Argemone mexicana. Tesis de maestría. Centro de Investigación Científica de Yucatán, A.C. Mérida, Yucatán, México.

Phillips, G.C. , and G.B. Collins (1979) In vitro tissue culture of selected legumes and plant regeneration from callus cultures of red clover. Crop Science, 19, 59-64.

50

CAPITULO 3

AISLAMIENTO DE LOS ADNcs DE LA NORCOCLAURINA SINTASA (NCS) Y LA ENZIMA FORMADORA DEL PUENTE DE LA BERBERINA

(BBE) DE Argemone mexicana

3.1 . INTRODUCCIÓN

La investigación sobre la biosíntesis de los ABis se ha centrado en un número limitado de especies. De este modo, Coptis japonica y Talictrum flavum, ambas de la familia de las Ranunculaceas, han sido modelos para el estudio de la biosíntesis de berberina, mientras que Eschscholzia californica y Papaver somniferum (Papaveraceas) se han empleado como sistemas para investigar la síntesis de sanguinarina y de morfina, respectivamente (Liscombe y Facchini, 2008).

Si bien estos alcaloides comparten la misma ruta de biosíntesis, algunas diferencias en los mecanismos que la regulan pueden existir (Liscombe y Facchini, 2008). Más aun, la manipulación genética de plantas o cultivos in vitro para aumentar la producción de alcaloides ha generado resultados inesperados, revelando la existencia de puntos de control que no se habían evidenciado anteriormente (Facchini, 2001) lo que demuestra la necesidad de conocer mejor los factores que controlan la biosíntesis de estos compuestos (Facchini y De Luca, 2008).

La norcoclaurina sintasa (NCS; EC. 4.2.1.78) es una enzima clave para la síntesis de los ABis, ya que condensa oxidativamente la dopamina con el 4-HPAA, formando la norcoclaurina, el compuesto que constituye el esqueleto carbonado central de los ABis (Fig.1.3; Samanani et al., 2004). Recientemente, se han aislado dos isoformas de la NCS en P. somniferum (Liscombe et al., 2005) y una de T. flavum (Samanani et al. , 2004), las cuales tienen menos del 40 % de

51

identidad entre ambas especies. Es interesante hacer notar que la parte central de estas proteínas (residuos 40-170) presentan similitud (28-44%) con miembros de la familia de las proteínas relacionadas con patogénesis como las PR-1 O que incluyen a la familia de proteínas alergénicas Bet V1 que han sido divididas en 14 clases (Liscombe et al. , 2005). No obstante, las NCS de P. somniferum y de T. flavum se distinguen entre estas proteínas ya que son las únicas que presentan una extensión de aminoácidos en los extremos N- y e-terminales, con las características de posibles péptidos señal y transmembranales respectivamente (Facchini et al. , 2007).

Por otro lado, recientemente se aisló el ADNc de una presunta NCS a partir de cultivos celulares de C. japonica (Ranunculaceae). Esta NCS, se distingue de las anteriores debido a que corresponde a una dioxigenasa dependiente de 2-oxoglutarato (Minami et al. , 2007) y no presenta identidad significativa con las NCS de P. somniferum y T. flavum. Más aún, no está claro el mecanismo enzimático mediante el cual podría llevar a cabo la reacción. De manera interesante, en estos cultivos también se logró el aislamiento del ADNc de una presunta PR1 O, con un 65 % de identidad con la NCS de T. flavum y que al ser expresado tuvo la capacidad de catalizar la formación de (s)-norcoclaurina a partir de dopamina y 4-HPAA (Minami et al. , 2007). Estos resultados demuestran la necesidad de realizar mayores estudios en C. japonica para aclarar la participación precisa de estas dos enzimas en la formación de la (s)-norcoclaurina (Liscombe y Facchini , 2008).

Por su parte, la síntesis de los diferentes tipos de ABis, involucra la oxidación del grupo N-metilo de la ( S)-escoulerina, lo que resulta en la formación de un puente N-metileno con el C-8 (Fig. 1.3). Esta reacción es catalizada por la enzima del puente de la berberina (BBE; EC. 1.21.3.3), una flavin proteína. Los ADNcs para esta enzima han sido aislados a partir de diferentes especies como B. stolonifera, E. californica, P. somniferum (Dittrich y Kutchan, 1991; Facchini et al., 1996; Samanani et al. , 2005). A pesar de la divergencia evolutiva

52

entre estas especies, todas presentan un alto grado de conservación y corresponden a proteínas de aproximadamente 519 residuos, con un peso molecular de 59 kDa. Además, en todos los casos se ha encontrado el dominio entre los residuos 1 04 y 166 en la región intermedia, que corresponde al sitio de unión alFAD y un presunto péptido de tránsito en el extremo N­terminal, acorde con su localización microsomal. La conservación de estas características sugiere que son esenciales para su funcionamiento (Liscombe et al., 2005). Este capítulo describe el aislamiento de los ADNcs correspondientes a la NCS y BBE de A. mexicana. El interés en estas enzimas se debe a que participan en puntos claves de la biosíntesis de ABis (Fig. 1.2; 1.3), los cuales nos permitirán estudiar eventos relacionados con la formación de estos compuestos.

3.2. MATERIALES Y MÉTODOS

3.2.1. Material biológico

Plantas de A. mexicana, con flores y cápsulas, fueron colectadas en poblaciones silvestres localizadas en los alrededores de la ciudad de Mérida (20°58'00" N/89°37'00" 0), en el estado de Yucatán. Una vez identificadas, fueron transportadas al laboratorio en bolsas de polietileno, conservadas en hielo. Las plantas fueron lavadas con agua fría y divididas en hojas, tallos, raíces, flores y frutos (cápsulas) mismos que se congelaron y se conservaron a -80°C hasta su utilización.

3.2.2. Extracción de ARN

La extracción del ARN total se realizó a partir de 1.0 g de tejido utilizando N2 líquido. La extracción se hizo con el reactivo Trizol de acuerdo a las modificaciones publicadas (Rubio-Piña y Vázquez-Fiota, 2008, Anexo 1 ).

53

3.2.3. Amplificación de los fragmentos de ADNc de la NCS y BBE a partir de retrotranscritos (RT-PCR}

La síntesis de ADNc se realizó por transcripción reversa utilizando como molde 5l-Jg de ARN total de diferentes tejidos (ver resultados), 1 O l-JM de oligo-d(T) y (1 O U/l-JI) de transcriptasa reversa (M-MLV; lnvitrogen), de acuerdo a las instrucciones del proveedor. El ADN de cadena sencilla así formado fue sometido a la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para el aislamiento de los ADNcs parciales correspondientes a la NCS y la BBE. Se utilizaron 1 O l-JM de cebadores específicos (Cuadro 3.1) y (0.5 U/l-JI) de Taq ADN polimerasa (lnvitrogen). El producto esperado para la NCS correspondía a un fragmento de 305 pb utilizando los cebadores NCSF y NCSR (Cuadro 3.1 ). El programa consistió en 30 ciclos con etapas de 30s cada una a 94 y 50°C, y de 1 min a 72°C, para la desnaturalización, alineamiento y amplificación, respectivamente, precedidos por una etapa de 3 m in a 94 oc y finalizado con otra de 1 O m in a 72°C.

Los productos esperados utilizando los cebadores diseñados para la BBE correspondieron a 390, 1107 y 1125 pb, para las combinaciones b-e, b-d y a-e respectivamente (Fig. 3.1 ). El programa consistió de 30 ciclos con dos etapas de 30 s cada una a 94 y 60°C, y una de 1.5 min a 72°C, para la desnaturalización, alineamiento y amplificación, precedidos por una etapa de 3 m in a 94 oc y finalizado con otra de 1 O m in a 72°C.

Por último, se diseñaron cebadores para amplificar un fragmento de 467 pb del ADNc de la actina, con los cebadores ACTF y ACTR (Cuadro 3.1 ). El programa consistió de 30 ciclos de dos etapas de 30 s cada una a 94 y 60°C y una de 1 min a 72°C, para la desnaturalización, alineamiento y amplificación, respectivamente, precedido por una etapa de 3 m in a 94 oc y finalizado con otra de 1 O m in a 72°C.

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Cuadro 3.1. Cebadores empleados para la amplificación de los ADNc parciales de la NCS y de la BBE en Argemone mexicana.

Cebador Secuencias 5' ~3· Referencia<'>

NCSF GGIGATGGAGGTGTIGGTAC NC5-P.s (AY860500; 280 pb)

NCSR GAGATGACTICTGCCATGG NC5-P.s (AY860500; 590 pb)

BBEF1(a) TGGACTATAAGATIAAGAAGTGGTGG BBE-E.c (565550; 280 pb}

BBEF2 (b) AGTGGTGGTCATAGTIATGAAGGGTI BBE-E.c (565550; 300 pb)

BBER1(c) TGCACCCCAGACACCACC BBE-E.c (565550; 690 pb}

BBER2(d) CCAATCTATICTICCGAGAT BBE-E.c(565550; 1410 pb)

ACTF CACIACTACTGCT AAACGGGAAA Act- P.s (EB740770; 90 pb)

ACTR ACATCTGCTGGAAGGTGCTG Act-P.s (EB740770; 550 pb}

*Tomando como referencia las secuencias de P. somníferum y E. calíforníca, para el diseño de cebadores

3.2.4. Amplificación de los extremos 5'y 3' por RACE (Rapid Amplification of cONA Ends)

Para amplificar los extremos 5 • y 3 · de los ADNcs de la NCS y BBE, se utilizó el estuche GeneRacer Kit (RLM-RACE, lnvitrogen), la Figura 3.1 presenta el esquema general del ensayo. Para la síntesis del ADNc de cadena sencilla se realizó una reacción de transcripción reversa utilizando como molde 5 j.lg de ARN total de raíz, obtenido como ya se describió. El oligoribonucleótido adaptador (5'-CGA CUG GAG CAC GAG GAC ACU GAC AUG GAC UGA AGG AGU AGA AA-3') fue ligado al extremo 5 · de acuerdo a las instrucciones del fabricante y la síntesis de ADNc se llevó a cabo utilizando como cebador el oligo-d(T)­GeneRacer (5'-GCT GTC AAC GAT ACG CTA CGT AAC GGC ATG ACA GTG (T)N-3'), según las indicaciones del proveedor. Con 0.5 !JI de este producto se realizaron las amplificaciones por PCR utilizando los cebadores GeneRacer-5'(5-CGA CTG GAG CAC GAG GAC ACT GA-3), y GeneRacer-3' (5-GCT GTC AAC GAT ACG CTA CGT AAC G-3), en combinación con los cebadores específicos para la NCS y BBE, según el extremo a amplificar

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(Cuadro 3.2). Para la PCR se utilizó la enzima Platinum Taq DNA Polymarase High Fidelity (lnvitrogen) de acuerdo con las especificaciones del GeneRacer Kit.

A

B

Eatructura cap 6' Cola de poli A 3 '

ARNm m,Gop-p-p------------ AAAAAAA

ARN oligo Gene Racer A AAAAAA

••••••-------------------~-- illllii -(N )~

+--------- Ollgo d(T) Gene Racer Sfntesls de la primera cadena de ADNc Transcrlptasa Reversa

Amplificac ión del extremo 6'

Cebador 6 · Gene Racer ---------------------TTTTTTT-(Nhe - - Cebador especifico NCS, BBE Primera cadena de ADNc

Amplificación del extremo 3'

Cebador eapecfftco NCS, BBE ____ ..____.::=:~~· -----TITITTI-(NNNNNNNN)

Primera cadena de ADNc -­Cebador3' Gene Racer

Figura 3.1. A) Esquema utilizado para la síntesis de la primera cadena de ADNc utilizando un oligorinobucleótido y un oligod(T) del estuche GeneRacer (lnvitrogen). B) Proceso utilizado para la amplificación de los extremos s· y 3' del ADNc de la NCS y BBE, utilizando cebadores del GeneRacer y cebadores específicos para cada ADNc.

El programa utilizado para la amplificación de los extremos 5 · y 3, se realizó de acuerdo a las especificaciones del GeneRacer Kit. Consistió de un ciclo de 2 m in a 94°C; seguido de · 5 ciclos de 30 s a 94°C y 1 min a 72°C. Posteriormente 5 ciclos de 30 s a 94°C y 1 min a 70°C. Por último, se realizaron 25 ciclos de 30 s a 94°C; 30 s de las temperaturas de alineamiento de acuerdo a los cebadores específicos (Cuadro 3.2) y 1 min a 68°C; se finalizó con una extensión de 1 O m in a 68°C

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Cuadro 3.2. Cebadores empleados para la amplificación de los extremos 5" y 3" de la NCS y la BBE en Argemone mexicana.

Cebador Extremo Tm . Secuencias s· ~3·

NCSF1 3" 65 TTTTCCCTCCAGGTGCTGTGCCC

NCSR1 5" 64 ACIGCACCTGGAGGGAAAACAA T

NCSR2 5" 65 TAACAACGGGGCACAGCACCTGG

BBEF1 3" 63 TTCATTAGGATTCACAGCAGGTTGG

BBER1 5" 64 ATCGGCTGCGAGACCGTATTT

Tm: Temperatura de alineamiento utilizada en el programa RACE

3.2.5. Clonación, secuenciac1on y análisis de los fragmentos aislados

Los productos de la RT-PCR fueron resueltos en geles de agarosa al 1% y teñidos con bromuro de etidio. Los fragmentos fueron aislados del gel utilizando el estuche QIAEX 11 Gel Extraction (QIAGEN lnc) y ligados al vector pGEM-T Easy Vector System 11 (Promega), de acuerdo a las instrucciones del proveedor. Con los plásmidos obtenidos se transformaron células competentes E. coli (DH5a) (Stratagene, La Jolla CA) (Sambrook et al., 1989). Las bacterias, conteniendo los plásmidos e insertos, fueron seleccionadas en medio LB con 100 mg/L de ampicilina, 0.5 mM de isopropil ~-D-1-thiogalactopiranósido (IPTG) y 1.6 mg de 5-bromo-4-cloro-3-indolii-~-D-galactopiranósido (X-GAL). Las colonias bacterias seleccionadas fueron cultivadas en medio LB liquido con 100 mg/L de ampicilina para multiplicar los plásmidos y éstos se recuperaron por lisis alcalina (Sambrook et al., 1989), se secuenciaron mediante el método de didesoxiribonucleótidos marcados utilizando un secuenciador automático ABI PRISM™ 31 O del servicio comercial (Macrogen; Seúl Corea), las secuencias obtenidas fueron comparadas con las depositadas en bases de datos del GenBank, utilizando el paquete BLAST (Basic Local Alignment and Search Tool;

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www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) (Aitschul et al., 1997). Para el alineamiento de secuencias se utilizaron los programas Multialin (http://bioinfo.genotoul.fr/multalin/multalin.html) y CLC Main Workbench (CLCBio Software).

3.3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

3.3.1. Obtención de los ADNcs parciales de la norcoclaurina sintasa (NCS) y la enzima formadora del puente de la berberina (BBE) de Argemone mexicana

Para obtener las secuencias de los ADNcs correspondientes a la NCS y BBE, se diseñaron cebadores (Cuadro 3.1) utilizando las secuencias reportadas para diferentes especies (Papaver somniferum, Eschscholzia californica, Berberís stolonifera y Talictrum flavum). Estas secuencias presentan una identidad de alrededor del 80% entre sí. Los cebadores se diseñaron considerando el grado de conservación de las secuencias analizadas, la temperatura de desnaturalización (Tm) y el tamaño del producto esperado (Fig. 3.2). Para la NCS los cebadores sentido y antisentido correspondieron a las secuencias localizadas entre los aminoácidos 86 y 187, en tanto que para la BBE fueron entre los aminoácidos 99, 228 y 4 75, tomando como base la secuencia de P. somniferum en ambos casos

La amplificación de los ADNcs parciales se llevó a cabo utilizando la metodología de RT-PCR a partir de ARN total de la raíz de A. mexicana y los cebadores ya descritos. Se lograron amplificar los fragmentos con los tamaños esperados, utilizando el ADNc de raíz en ambos casos (Fig. 3.3). Para la NCS, se obtuvo un ADNc de 305 pb, mientras que para la BBE los productos fueron de 390, 1107 y 1125 pb. De igual modo, como control positivo se logró la amplificación de un fragmento de 467 pb del ADNc de la actina.

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A

[::::J NCS P.o -NCSAm

B

P. sormiferum E.califomica B.stolonifera

T .flavum Consensus

... ... ... ... ... ...

BBE

E!WTIRLRSGGH G,;WTI RLRSGGH G,WTIRLRSGGH G WTIRLRSGGH GSWT 1 RLRSGGH '

99 a .a.

a.a.

475a.a .

Fig. 3.2. Secuencias de aminoácidos conservados de la NCS (A) y BBE (B) que se emplearon como base para el diseño de cebadores y el aislamiento de los fragmentos de ADNc correspondientes. Las líneas punteadas indican las regiones consideradas tomando como base la secuencia de Papaver somniferum. Los recuadros señalan las diferencias de aminoácidos.

NCS BBE A B

1000pb

300pb

Fig. 3.3. Amplificación de los ADNcs parciales correspondientes a la NCS (A) y BBE (B) por RT-PCR. En B; los carriles: 1, 2, 3 y 4 corresponden a combinaciones de los cebadores b-e (390pb}; b-d (1107 pb}; a-d (1125 pb); y ACTF-ACTR (467pb), respectivamente (Cuadro 3.1 ).

59

El análisis de 30 clonas conteniendo los ADNc parciales de la NCS reveló dos secuencias, con un 85 % de identidad entre sí (Fig. 3.4A). Las secuencias de nucleótidos se denominaron NCSAm1 y NCSAm2, las cuales tienen un tamaño de 305 pb, correspondiendo a un marco de lectura de 101 aminoácidos deducidos

Por su parte, el análisis de 20 clonas conteniendo los diferentes ADNcs parciales de la 88E (Fig. 3.38), correspondieron a una sola secuencia (Fig. 3.48). La secuencia única se nombró 88EAm1 de 1125 pb, la cual correspondió a un marco de lectura de 375 aminoácidos deducidos.

Las secuencias obtenidas, tanto para la NCS y la 88E se compararon con las depositadas en base de datos del Gen8ank, utilizando el programa 8.LAST (Aitschul et al., 1997). La comparación de las secuencias de aminoácidos de la NCSAm1, NCSAm2 y 88EAm1 reveló una identidad significativa con otras secuencias ya reportadas en P. somniferum, E. californica y T. f/avum, en ambos casos (Liscombe et al., 2005).

60

~ ~ . 1 1

A NCSAm1 GDGGVGTVLD 1 VFPPGAVPRCYKEKF 1 Ñ 1 NKKRLKEV 1M 1 EGGYLOMGCT 51 NCSAm2 GDGGVGTVLDIVFPPGAVPR~YKEKFVKINN~KRLKEVIMIEGGYLOMGCT 51 Coo~n~sGOGGVGTV L DIVFPPGAVPR'YKEKF''I'N"KRLKEVIMIEGGYLOMGCT

60 80 ·100 1 1 1

NCS.Ail\1 Y DR 1 HV 1 ~KTPNSCV 1 kss 1 1 YDVK~EYAE~MSKL 1 TT 1 PLKSMAEV 1 101 NCSAm2 SYriDR 1 HV'LEKTPNSCV 1 ESS 1 1 YEVK~EYADEMSKL 1 TT PLKSMAEV 1 101 Coo~nsu s ' Y' DRIHV' 'KTPNSCVI'SSIIY'VK'EYA' 'MSKLITT'PLKSMAEVI

B BBEAm1

BBEAm1

BBEAm1

BBEAm1

BBEAm1

BBEAm1

BBEAm1

BBEAm1

BBEAm1

BBEAm1

20 1

WTIRLRSGGHSYEGLSYTADTPFVLIDLMNLNRISIOI 40 60 1 1

DSETAWVESGA TLGELYYA 1 TEL TDSLGFTAGWCPTVG 80 100 1 1

SGGHISGGGFGMMSRKYGLAAONVEDVILIOSRGAILD m 1~ 1 1

RKLMGEDVFWAVRGGGGGVWGAIYAWKIKLLPVPKKVT 1ro RO 1 1

VFRVTKNVNIEEASFLIHKWQYVADELDDDFTVSILGG ~o m 1 1

ANGNEVWVIFLGLHLGCKTVAKSI IDKKFPELGLIEEE 2co 2ro 1 1

FLEMNWGESFAYLSGLKTVKELNNRFLKFODRAFKTKV 280 300 1 1

DFTKETLPLEAIOGLLEILSKEPRGFIALNGFGGKMSK no ~o 1 1

ISNDFTPFPHRKGTKLMVEYIVAWSKDEESRSDEFFDW 360 1

LRNIYDYMEMFVSKNPRVGYVNHIDLDLGRIDW

Figura. 3.4. Comparación de las secuencias de aminoácidos deducidos de NCSAm1 y NCSAm2 (A). Secuencia de aminoácidos deducidos correspondiente al ADNc parcial de la BBEAm (8). Los recuadros señalan las diferencias de aminoácidos.

Análisis de la secuencia parcial de la NCS de Argemone mexicana

La secuencias de aminoácidos deducidos de la NCSAm2 mostró un 86% de identidad con la región comprendida entre los aminoácidos 86 y 186 de las dos NCS de P. somniferum (Liscombe et al., 2005), y de un 60% con el tramo entre los

61

residuos 87 y 187 de T. flavum (Samanani et al., 2004) (Cuadro 3.3; Fig. 3.5). Por su parte, NCSAm1 presentó un 77% y 81% de identidad con los tramos comprendidos entre los residuos 86 y 186 de las NCS 1 y NCS2 de P. somniferum respectivamente (Liscombe et al., 2005) y un 58% con el tramo entre los residuos 87 y 187 de la de T. flavum (Samanani et al., 2004). Ninguna de las dos secuencias aisladas presentaron identidad significativa con la NCS de C. japonica (Minami et al. , 2007).

Cuadro 3.3. Porcentaje de identidad de la secuencia de aminoácidos deducidos de los ADNcs parciales de la norcoclaurina sintasa de Argemone mexicana (NCSAm1 y NCSAm2) con otras especies (de res iduos de 86 a 186}

Secuencias Otras especies de NCS1P.s NCS2P.s NCST.f

Argemone % identidad

NCSAm1

NCSAm2

77

86

81

87

60

58

NCSC.j

NCS1 P.s, NCS2P.s (P. somniferum); NCSC.j (C. japonica) ; NCST.f (T. flavum)

62

1111 1211 uo 1!0 1 1 1 1

NCSaml • • • GOGGVGTV LO 1 VFPPGAVPRQyKEKF ltl ONK_KRLKEV Ul l EGGYLP.,GCUYLOR 1 Hy 1 ~KT PNSCV 1 KS S 11 YDYK EY 81 NCS.A.rn~ • • • • GOGGVGTV LO 1 VFPPGAVPR~YKEKFV 1 HNEKRLKEV 1M 1 EGGYLOMGCTSYMOR 1 HHEKTPNSCV 15SS 11 Y EVKi EY 81

P.somNCS~ OV I'E,GÑGGVGTV LO 1 VFPPGAVpR.YKEKFVff 1 ~HEK~LKEV 1M 1 EGGYLOMGC T~YMOR 1 H FEKT PNSCV 1 ES S 11 YEVK EY 166 P.sornNCS1 OVI'AG~GGVGTVLOI,FP GAVPR~YK EKFVKIÍIHEKRLKEVVMI EGGYLOMGCTfYMORIH FEKTPNSCYi'ESS IIYEVK EY 166

HavuroNCS E 11 • GOGGVGT 1 LDIITFXPGEFPHEYKEKF fL VONEHRLK~VQMI EGGYLOLGV T YMO I 1 HVVPTGkDSCV 1 KSSTEY~VKPEf 167 P.somPRIO DVVEG~GGLGTV L~~YY,P~GSVPLSYKEKFVTIIONHKRLKEVRQ 1 EGG YL EMGCTF YMOSFQ 1 LKKTHOSC T 1 RS 1 TK YEVSAEL 127

CjapNCS E ll· GOGGEGS LOIITF PPGQFPH~ YREKFVFFOHKNRYKLV EQ 1 DGJ!.FFOLGV T~YMO T 1 RVYA GPDSCV 1 KSTTEYHVKfEf 163 Conseosus OV 1 • GOGGVGTV LO 1 VF PPGAVPR ' YKEKFV ' 1 ONEKRLKEV 1M 1 EGGYLOMGCT ' YMOR 1 HV' EKT PNSCV 1 ' S S 11 Y EVK ' EY

Figura 3.5. Comparación de las secuencias de aminoácidos deducidos de la NCSAm1 y NCSAm2 con las NCS reportadas para otras especies. El alineamiento se realizó con secuencias correspondientes a la NCS1 de P. somniferum (AAX56303.1 ); NCS2 de P. somniferum (AAX56304.1 ); T. flavum (AAR22502.1) y C. japonica (BAF45337.1) El color azul representa aminoácidos idénticos. Los recuadros señalan las diferencias de aminoácidos.

Análisis de la secuencia parcial de la BBE de Argemone mexicana

La secuencia de aminoácidos de la BBEAm1 (Cuadro 3.4; Fig. 3.6), mostró una identidad del 80% con el tramo comprendido entre los residuos 99 y 473 de la BBE de P. somniferum (Facchini et al, 1996), del 77% con el tramo entre los residuos 95 y 469 de la de E. californica (Dittrich y Kutchan, 1991 ), del 66% con el tramo entre los residuos 91 y 466 de B. stolonifera (Chou et al., 1998) y del 65% con el tramo entre los residuos 92 y 467 de T. flavum (Samanani et al. , 2005). Es interesante

63

notar que BBEAm1 presentó un dominio RSSGHSYEGLS, de unión a flavina, lo que coincide con su naturaleza de flavín­oxidoreductasa (Dittrich y Kutchan, 1991; Facchini et al., 1 996).

Cuadro 3.4. Porcentaje de identidad de la secuencia de aminoácidos deducidos del ADNc de la enzima formadora del puente de la berberina de Argemone mexicana (BBEAm1) con otras especies.

Secuencias Otras especies de Argemone ....,s=s=E=-=P:-.s-----,B=B=E=--=E:-. c----=s=-=s=-=E=--=8-. s----=s=-=s=-=E=-=r:-:. f-

%identidad

BBEAm 79 77 67 65

BBEP.s (P. somniferum), BBEE.c (E. californica), BBEB.s (B. stolonifera) , BBET.f(T. flavum) .

64

"r ~f ''tr 9!16Aml •••••! . ••• •••Wflll SOOHSYfOLS r'AO·f,,\1 IDLMNLNitiSliO '3* ~ 'AKPllfiKI'SPIV~POSK!I!li!ITVHCCTIIISWTIIt SOOHSYfOLS TAOTffV VDUMNLNltiSIDV 134 e 1r>0 'QttUIII(PS~IIVOSKIILII(TIIlCIIt~OSWflll ' SOOI.SYI!Ols TIOTP,ILIOU~NLNit~SIOL ~~ 8~ l'ltra HIIPKtPIIPS~III.PQ.IK!fi.AAIVVCIMIIOLWTIIt SOO.HSYI!Oll . IIAIHffYVIOl,loiNLNitiSIO\ 1:'8

""" r'I'IICfr OP8VIILPIISIIOQ~AI! 1 CCTitOSWTIIl J·OOHSUOL·S AOjfPrYIID~MNtNOISiO\ 1~ Cctlw<~M Hit' t• 'Kt$ " 11 LPOSKUl'!IT" ·CCT"'9SWYllt S<lqfiS.VIOL'S 'fAPTPP'V ' 1 OUÍNLNitl SI DL

~lil' • 1 ' 1 1

tnj ~S!TAWVI!SCIATLOI!LYYA I Tfi:~DlLOPTAOWcP'rVOSOOHI SOOCIPOMNSilWYOLUONY:lD l'i. 1 OÍ IDil P lilm>l•~m UITAWVI$0ATI.OIIL V'tA IAQSiJOJi.Oflll>AOWCPTVOSOOHI SOOOPOMN$1ti(YOUAO!IVYDA: 1 L 1 OS ~05

E . 1M:1 IS!TAWYI!SOiTLOI!L.Y'rA 111!¡SSII(LG,fAOWCP'ÍVOlOOHI SOOOfOii!MlRII'tOUADNYVOA ILIDA 2ó2 !l •slic TAWVUGA TLOI! hCA IUnOTLGPJGGYCpTVO. SOOH 1 SOOOfOMNSRKYGUAONY DA_ ~ 1 ~DA 1 T~ OTOf,l.,-yUOATLOI! YHAIIIISSGJNA,I.AOJCPT.fGSOOHI AP.OGfOMJoo!SIU<YOLAADIIVVOA!oilYOA

COn.xi\SII'i • IITo\WYtU&TLOI!L VYAO!!S$0TLOPTAOWCI'TVOSOOHI $00010WISIU!,YOLAAONVVDo\ lll 011

~ \ ' 1 IIEJ;ml ~ I' I.:IQII~t,;li4~DVP'WAVIIGOGOÓVWOArvAW!< 1 Kt LPVPKI(Y TY''IIVTKNV J)'U tCASPL HKWOVVAD 111 P.-~ lfOA 1 ~ORI!IQtGOOYrVJ~ IR04~04YW~ 1 't:AWKIKUJIIVI'Ifl< YV.fltVTKNV ·OIIDASIUH)(WQ'tvAO 21S

NOAILOR.CWoiQI!DYfÓWAI R04004VWO•I YAWII J Klí.,VPIKYJV'RYTI(NY · 11 1 QUTI.lLHI<WOfWIII ,7,1 JI·•• NOA'VLORI$1¡101!DV 1WA 'llt04000VWO'-I YA~LOU PV 'Kit Y JVI lCLMI<NUNI tU SICIIL HKWOVYAP. ~ tN\'1 NOVVL01t.fSii41!0YfWA IIIOOOOOVWOA '(AWI(L~I. PY,.(NYT 'IILM!<Iiii•VI!DASI(I.LH!CWOI.VAP 14'

Ql.\itA HOA 1 LOIU!SMQI!OV:FWA 1 AOOOOOVWQA 1 'I'AWK 1 KlVVPKKY tYrltYTKNV ·N ti!US• HHKWO'I'VA ' • »>

1 1 1 S&eAi'!ll I:LbDOflQS LO GANO NI .Wf HOLIHt.OCKJUICS liOICK~'ILGl ii!IIP:LI~OIS,·A'VL.JGl.l(f .~

,. 4'11111 flDIOf T~SVL·OOJNOND··WliiHOLI!I:.GaK_OA4Klii ·QlKfPI! •LOl VDIII,Q!IolhiOU ... :PL(OLOT ..J4~ ' !l'IQ lLUOftlSVL·OOAOIIS'O • WwL Tli!LO:PHI!GLIIU'AI<UPOJ,L;p.LGLYeiOrLI!MSWOUFAYLAOI,.'ff Q

8s~~~ ALI!OOFTLSYLAOAOTNO · JWPIFLOL~LG'KILAISIVOQNf'I!LNLYMI!OCIII!MSWYI!SFAIILAOLNI l~ l ~LI!OOfiL YLAG~HKOIIIWLTfLOLYLOI'KIL:AISJ'"KKfJIIILNLlLI!OCIII!MSWYI!ATAILAOLKI 3n

(01!1:1' IL I!DOnLS'Y l ·GOANGH • • 'WL. TtlOLH~GPK" 'Al(f•tOKK,I!LOL'YI!fO• L IMSWOUFA YLAOLI(T

'f . . f . ' . . 1 80EAI'JII YKI!LNNRfll(fOO~fKfKVD,_TK~I llU~' G U UI(E,PROF IALHOfOOKIIISK i SNOf fpf.PifAK ll&

P ~-111'1 ' SILNNitfLKPDIIlMKTKYOHI(JI i'LN-PIHAUI!IL$10)0Gf' IAL!IOF'OGICMSII'STOffPU!Hiti< ~~q eo/ló(I'Í(i YS!OLNNRfLK,Ot:IIAfKTKVO TKI!PI.\Pti(AP.YOj.l.•l!lt,LSKI!PIIOF IIUNOf'OOQMSK I :SIIi' TPrPHIII ~ l O

9 ... ~~ V,IIWHNIIFli<.OOIIA'I<TKVOf!IKIP 1 PLIIII 0Allllt TKfLitGf~1NOQ041.N,SIII UOITPPPHAK >107 IMI VULIIDIIP LIUDOIIA rKTIIVO,I<E~Jr,U8140AU 1 L'ICI<fOilOf.,YMHOQOOIIaQIII t S'fD~Ii P f PHAI ~Oil

télt1 M>1t YSI!LNNitrLKfOOIIA,I<fKV:OfTKI!P" Pll!' 1 •.o.cu·• LSKI!PAGf IALNOfOOICMS • 1 s• OfT,PHAK - ~ ~ 1 1 1 89EAml OT~L~Ve\'1 'liiWIICOIIS8S01''DWI.IIIW. YOYMINfVSiCN.,_.'IOYVIiiU OL.OLOA ~ • • • • • • • d1$

P lilitllltll.ttl OTICLMf.I!Y 1 fAWJIOOUSK fffiiWL"KHDYLIPrV$.KI'ItVG't'YNilfOL_ Ot OfiDWANKIIU,H·AV ~83 ~ OT!iLM~IY 1 VAwNQ,I!Q~I(I,C~e,I,OWLIK\iYI!,MK!'IVIICN,ALlOYYNHIO~OJ.O!I I OWONK111VtfN•~ 1 ~7P

9 !'lttll OTLIIMtl Y 1 VAWOIIDU~KS'tf' I~LIH.fTNY,MOQfj.I!I.P'R'IAYYNHII:DLOLORLDVÚNIT 1 UN •.A 1 ~lB l .tMI OT,L.MYI!Y 1 YAwOKiti!ÍILttS•!if IIMLHQI,.PDY.IIOI(fVSNNPIIVOYVNHVDLOLORI DW NKT 115011¡\ 1 ~lB

<l<lnwmm GT 'LMYU 1 YAW•' '01!.' SKI' U:~OWLHK.PYOYM•PPVSKNPAVGYYNHI DLDL"OR l OW' NICTI 'SN•A 1

Figura 3.6. Comparación de la secuencia aminoácidos deducidos de la BBEAm1 con las BBE reportadas para otras especies. El alineamiento se realizó con secuencias correspondientes a la BBE de P. somniferum (AAC61839.1), E californica (AAB20352.1); B. stolonifera (AAD17487.1); y T. flavum (AAU20769.1 ). El recuadro indica el presunto dominio de unión a flavina. Los recuadros señalan las diferencias de aminoácidos.

3.3.2. Amplificación de los extremos 5'y 3' de la NCS y BBE por RACE (Rapid Amplification of cONA Ends)

Una vez obtenidos los ADNcs parciales para la NCS y BBE de A. mexicana, se procedió al aislamiento de los extremos 5' y 3' de ambas para obtener secuencias completas. Para esto, se

65

diseñaron cebadores específicos tomando como base la secuencia de los ADNcs aislados (Cuadro 3.2). Posteriormente, se amplificaron por PCR las secuencias correspondientes, utilizando como molde ADNc de raíz sintetizado de acuerdo con las especificaciones del paquete GenRacer kit (Fig. 3.7).

A

NCS

300pb

B

BBE

600pb

5' 3'

-

Figura 3.7. Amplificación de los extremos s· y 3' correspondientes a los ADNcs de la NCS (A) y BBE (B) por RACE.

Las reacciones para la NCS generaron productos de tamaños cercanos a los esperados (300 pb para el extremo 5' y 600pb para el 3') (Fig. 3. 7 A). El análisis de estos productos mostró la presencia de dos secuencias diferentes, tanto para los extremos 5 ' y 3 '. Estos fragmentos clonados, se denominaron pNCSAm1-5; pNCSAm1-3; pNCSAm2-5 y pNCSAm2-3, según contuvieran los extremos correspondientes. Por otra parte, para la BBE sólo se observó un producto para cada reacción. Ambos tuvieron los tamaños esperados; 600 y 1200pb para los

66

extremos 5' y 3' respectivamente (Fig. 3.78). Estos fragmentos clonados se denominaron p88EAm-5 y p88EAm-3. La identificación de nucleótidos en los extremos y las secuencias previamente aisladas permitieron la asignación de la identidad de la NCSAm1 y NCSAm2 (Fig. 3.8 A y 8).

A

B

- 57 6. ( 18jun7

21jun7 3· ( 111ar

211ar

- 57 6. ( .18jun7

2i.Jun7 3. ( 1"ar

2"ar

55 6. [ 25jun

26Jun 3. [ 261iay

27Hay

- 55 25Jun 26Jun 26Hay 27Hay

251 260 270 280 290 300 ·--------+---------+---------+---------·---------1

GGGGRTGGAGGTGTTGGTRCTGTTC~R GRRRRGCTRGRTGTGRTTGRGGGCRRTGGTGGTGTTGGRRCTGTTC T A GRRRRGCTRGRTGTGRTTGRGGGCRRTGGTGGTGTTGGRRCTGTtC T R

301 310 320 330 340 350 l--------+---------·---------·---------·---------1 CRTTGTTTTCCCTCCRGGTGCTGTGCCCC TTGT RCRRRGRGRRRTTCR CRTTGTTTTCCCTCCRGGTGCTGTGCCCC TTGT R CRTTGTTTTCCCTCCRGGTGCTGTGCCCC TTGT A

TTTTCCCTCCAGGTGCTGTGCCCC TTGT RCAAAGRGARATTCA TTTTCCCTCCAGGTGCTGTGCCCC TTGT ACRARGRGRRATTCR

251 260 270 280 290 300 ·--------+---------+---------·---------+---------1

GGGGRTGGRGGTGTTGGTRCTGTTC~ GRRRRGTTRGRTGTGRTCGRGGGCRRTGGTGGTGTTGGRRCTGTTC C R GRRRRGTTRGRTGTGRTCGRGGGCRRTGGTGGTGTTGGRRCTGTTC C

301 310 320 330 340 350 1--------+---------·---------·---------+---------l CRTTGTTTTCCCTCCAGGTGCGGTGCCCgRRGR CRAGGAGRRRTTTG CRTTGTTTTCCCTCCRGGTGCCGT CRTTGTTTTCCCTCCRGGTGCCGT

TTTTCCCTCCRGGTGCTGTGCCC RGR CRRGGRGRRRTTTG TTTTCCCTCCRGGTGCTGTGCCC RRGR CRAGGRGRRRTTTG

Figura 3.8. Empalme de las secuencias de la NCSAm1 (A) y de la NCSAm2 (B). Las flechas señalan las secuencias internas obtenidas previamente, y los corchetes los productos de las reacciones 5'-RACE y 3'-RACE de las NCS de A. mexicana. Los recuadros indican los nucleótidos correspondientes a las secuencias comunes.

El empalme de las secuencias parciales de la NCSAm1 y NCSAm2 con sus respectivos extremos permitió identificar las secuencias completas, las cuales fueron de 1035 y 927 pb respectivamente (Fig. 3.9).

67

,. .. 1 1 1

NCSAm1 NCSAm2

Consensus ~~:::~~:~~~:~~:~ ~~:~~:~~~~::::::~:~~:~~~~~: ~g~:~~i~i:::~i: :

NCSAm1 NCSAm2

Conse1sus

NCSAm1 NCSAm2

Consensus

ATCAAATCATCTATCAT • TACOACOTOAAAAAAOAOTATQ • COA • ocTATOTCTAAA • TA .. 1 1 1

AT~ACAACCA~ACC~TTOAAATC~ATOTC ~OAAO~CATCOCTAATTACOTTCTTAAOAA~ AT mACAACCPCACC.TTGAAATCCATOTCQCAAOACATCOCTAATTACOTTCTTAAOAA~ AT•ACAAcc •• AcC • TTOAAATC•ATOTC•oAAO•cATCOCTAATTACOTTCTTAAOAA•

'"" 1 1 1

~::~~~~~~~::~:::~~~:~~~:6:~:i~::~i~~::~i:~6::~:i6:~6i~:ii6: CAATCTOT•ATAAQ • AAOQ • AOTTACATATOAATTOOAAOTACCA • CATCAOCTOATTCA

200 1 1 1

120 119

160 179

NCSAm1 ATTTOOOCAOTTTAtiAGTTCACCCAACATTCCTACACTTCTAAOAOATGTTCTACTTCCT ~O NCSAm2 ATTTOOOCAOTTTA~AGTTCACCCAACATTCCTACACTTCTAAOAOATGTTCTACTTCCT ~9

Consensus ATTTGOOC AOT TTA * AOTTCAC CCAA CATTC CT A CA CTTCT AA CA OATOTTCT AC TTC CT

NCSAm 1 NCSAm2

Consensus

NCSAm1 NCSAm2

Consensus

... 1 1 1

~~~~~~~~~~::::~o~:~:~~~~:~~~:~~~~::~~~~~~~~~~~~::~~~~~~~~~:~ OOTOTTTTTOAAAAO . TAOATOTOAT • oAOOOCAATOOTOOTOTTOOAACTOTTCT '"' OAC

""" 1 1 1

300 299

360 359

~g~~ ::~a:~::~~~=~~::::~::~~=:~~:~~=~~~::~~~~~!~: ~~:~:~:~~~~:~~e:~~ Consensus AAC * AOAAO • O "' TTAAAAOAAOT .. ATTATOATCOAAOO• OC""* A .. TTAOACATOOOATO,...

""' 1 1 1 NCSAm1 NCSAm2

consensus :~:~e~~:~-~~~:~:~~: ~~~:~~~::~:~:~::::~ct~~~::~ ~~~~~~~~~: ~~::: :~~ ACAT * TTAC • TQQA•AQOATCCATOT~ • T•a•aAAAAC*CCTAA•Tc*TOTOT*AT""*AA .,.

1 1 1 NCSAm1 TCJ:TCTATjfATTTACOA l:;OTOAAA'A;AAOACTATCCQ:OA O;li:TATOTCTAA-. -TAATCACA !540 NCSAm2 TCOTC0ATTATTTACOA40TOAAAAAAOAOTATCC~OA~O·MATOTCTAA~ TAATCACA ~9

Consensus TC • TC .. AT • ATTTACOA · OTOAAA "'AAOAOTATOC • cA ... O .... ATOTCTAA • • TAATCACA 000

1 1 1 NCSAm1 ACC~TACCTTTOAAATCCATOTC~OAAOT~ATCOCTAATTACOTTCT 6AAOAAmcAAT~ 000 NCSAm2 AC C0,TACCATTOAAATCCATCTCACAAOT¡T'ATCOCTAATTACOTTCT AAOAA~CAATTC 599

Consensus ACC*TACC"'TTOAAATCCATOTC .. OAAOT"'ATCOCTAATTACOTTCT*AAOAA • cAAT"" ..

"" 1 1 1 NCSAm1 CICAciTTT ATACTTCACCCAACATTCCTACAA TT CT CAO'iio~ T'iiT \"¡ CT OC:TTCC Í'i OOTOT T 720 NCSAm2 TOTTAT OTT:rG~T:_ A C g-T TOOi1"_1ATTCTCjlO O~T~TA)CTO~TTAC OOTCTT 701

Consensus o •'" • "' TTATAOTT "'"' •,.. '"A,.. C'"' • y • • • "' "''"' ATTCTC • o• O • T "' T"' CTO "' TT ,.. C .. OOTOTT

NCSAm1 780 NCSAm2 73~

Consensus

NCSAmt 840 NCSAm2 780

Consensus TCCCATCCAOOTA.ATTC '"'A ... o• A"' '"'A"' TA .. TT '"' TTT • CA'"' T"' TA •"' "' T • .. '"'TT"' • AT "' ""'

NCSAm1 NCSAm2

Con sensus

NCSAm1 NCSAm2

Consensus

NCSAm1 NCSAm 2

Consensus

... 1 1 1

:~CAOCATACTAO~::~~:~~:~o::~~É ~:;ATAOT~~~~O~~::~:~~~:::~~~~~~ ATCACCATACTA . TAAC•ATOQ••AATT•c•"'ATAOTTC"'O*T ••• To • T • A•A."'•TTC •

.... 1 1 1

dAAT~ TAOXTT C AA~AATAA~A~ATAA~TAA~ACTATAeTo~ATTTTTTTOTTOCAA j] ATJSTAT TAA09,AAT~AOATTAA~ATAA~TAAAAAT.@TAc.-0C~AA• • .... • • • • • ·AA OAAT '" TA '"' •T ••"'"' A.A •• J4. ••••• A.•ATAA'"'TAA"'A * T*TA.••o•A•TTTTTTOTTOCAA

NCSAm1 AAAAA.AAAAAAAAAA 1035 NCSAm2 AAAAAAAAAAAAAAA 927

Consensus AAAAAAAAAAAAAAA

900 02e

960 864

1020 912

Figura 3.9. Comparación de las secuencias de nucleótidos de la NCSAm1 y NCSAm2 de Argemone mexicana. Los recuadros señalan las diferencias de nucleótidos.

68

La clonación y análisis de los productos de las reacciones para los extremos de la BBE revelaron la existencia de dos secuencias diferentes, tanto para los extremos 5' como 3' (Fig. 3.1 O). En ambos casos, las secuencias correspondieron a las reportadas para otras BBE; sin embargo, estas diferencias permitieron asignar identidades a dos posibles isoformas denominadas BBEAm1 , (presuntamente aislada previamente), y otra que designó como BBEAm2.

A

- B8E8ft

6" ( 2Rll!l 37"11!1

3" ( 1abr ,.., ...

- BBEatt

6" [ 2ttay 37itay

3" [ 1abl-9abr

B

·- BBEatt 6" ( 41Aay

4ttay 3 " ( 16abr

20.

-6" ( BBEatt 4~ .._

3" [ 16abr 2o.br

481 490 500 510 520 530· 540 1 1 CTTGGIIGAACTCTRTTRTGCTRTCACTGRGTTGRCTGATTCRi TlCRCfiGCRGGT CTTGGAGIIACTCTRTTRTGCTRTCRCTGIIGllGRCTGATTCR TRG rrTCRCRGCRGG'T CTTGGAGARCTCTRTTRTGCTRTCRCTGIIGTTGRCTGATTCII T TTCACRGCAGG'T

TTCR T TTCRCAGCfiGGT TTCR TTCRCRGCRGGl

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Figura 3.10. Empalme de las secuencias de la BBEAm1 (A) y de la BBEAm2 (B). La flecha señala la secuencia interna obtenidas previamente, y los corchetes los productos de las reacciones 5'-RACE y 3'-RACE de las BBE de A mexicana. Los recuadros indican los nucleótidos correspondientes a las secuencias comunes.

El empalme de los productos de las reacciones de RACE con la secuencia parcial, previamente aislada, permitió disponer de las secuencias completas con tamaños de 1771 y 1718 pb para la BBEAm1 y BBEAm2, respectivamente (Fig. 3.11 ).

69

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Figura 3.11. Comparación de las secuencias de nucleótidos de BBEAm1 y BBEAm2 de A. mexicana. Los recuadros señalan las diferencias de nucleótidos.

70

3.4. CONCLUSIONES

A partir del ARN de raíces de plantas maduras fue posible obtener las secuencias completas de ADNcs correspondientes a la NCS y la BBE de Argemone mexicana. Esta información se obtuvo en dos etapas. En la primera, basados en secuencias internas, conservadas para ambas enzimas en diferentes especies, se diseñaron cebadores que permitieron aislar los fragmentos específicos para las enzimas de A. mexicana. Con dichas secuencias se diseñaron otros cebadores que permitieron el aislamiento de los extremos 5, y 3,, por medio de reacciones de RACE. Tanto para la NCS como la BBE se lograron identificar dos isoformas con identidades entre sí mayores del 70 y 90%, respectivamente y con una identidad cercana al 80% con otras especies, como P. somniferum y E. californica. Estos ADNc podrán usarse como sondas moleculares para los siguientes estudios sobre la expresión de los genes correspondientes en diferentes tejidos y condiciones.

3.5. REFERENCIAS

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73

74

CAPITULO 4 CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE LA

NORCOCLAURINA SINTASA (NCS) Y LA ENZIMA FORMADORA DEL PUENTE DE LA BERBERINA

(BBE) EN Argemone mexicana

4.1. INTRODUCCIÓN

Argemone mexicana (Papaveracea) es una planta utilizada en la medicina tradicional para el tratamiento de diversas afecciones. La presencia de alcaloides del tipo bencilisoquinonolínico (ABis), como las benzofenantridinas (sanguinarina) y protoberberinas (berberina), podrían explicar las propiedades medicinales que se les atribuye (Chang et al. , 2003; Willcox et al., 2007; Sánchez-Mendoza et al., 2008). Los ABis, son compuestos con una distribución taxonómica restringida que incluye cinco familias, entre ellas a las Papaveraceas. En las plantas que los producen, algunos de estos alcaloides participan en interacciones de defensa contra herbívoros y patógenos debido a su actividad biológica (Liscombe y Facchini, 2008).

Los diferentes ABis presentan patrones de distribución característicos a través de los distintos tejidos de las plantas que los producen. Por ejemplo, la sanguinarina es un alcaloide que solamente se encuentra en las raíces, mientras que la berberina se acumula principalmente, pero no de manera exclusiva, en las partes aéreas (Facchini, 2001 ). La acumulación de ciertos alcaloides en tejidos específicos puede proporcionar claves acerca de sobre su función biológica. Más aún, en P. somniferum y T. flavum los sitios de síntesis y acumulación de los ABis pueden estar separados, tanto temporal como espacialmente, formando una asociación compleja (Samanani et al. 2005; 2006). De igual forma, la biosíntesis de los ABis está controlada por el estado de desarrollo y por factores ambientales (Facchini, 2001 ). Por ejemplo, en P. somniferum la sanguinarina se encuentra sólo

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en la raíz, mientras que la papaverina y la noscapina se han detectado solamente en los órganos aéreos. En contraste, la morfina y la codeína predominan en las partes aéreas, aunque también se pueden encontrar en bajas cantidades en la raíz (Huang and Kutchan, 2000). Más aún, estos alcaloides se encuentran presentes desde etapas muy tempranas del desarrollo (Facchini et al., 1996; Huang y Kutchan, 2000). Por otro lado, el análisis de expresión de los genes involucrados en síntesis de estos alcaloides en los diferentes tejidos, vincula la presencia de los transcritos con las de los alcaloides. No obstante, existen algunas notables excepciones. Por ejemplo, en T. flavum la expresión de los genes que participan en la síntesis de berberina ocurre principalmente en el rizoma, mientras que la mayor acumulación del alcaloide sucede en la raíz. Esto sugiere que algunos intermediarios de la síntesis de la berberina son transportados del rizoma a este tejido (Samanani et al., 2002a; 2005).

El objetivo de este capítulo es caracterizar los ADNc previamente aislados de la NCS y BBE (Capítulo 3), así como utilizarlos como sondas moleculares para estudiar la relación entre la expresión génica y el contenido de ABis en plántulas en desarrollo y en plantas maduras de A. mexicana.

4.2 MATERIALES Y MÉTODOS

4.2.1. Material biológico

Las plantas con flores y cápsulas de A. mexicana, fueron colectadas en poblaciones silvestres localizadas en la periferia de la ciudad de Mérida. Una vez identificadas, fueron transportadas al laboratorio en bolsas de polietileno, conservadas en hielo y procesadas como se describió (Capítulo 2), conservadas a -80° C hasta su utilización.

Para los análisis de plántulas en desarrollo, se extrajeron las semillas de las cápsulas dehiscentes, se esterilizaron con hipoclorito de sodio 20 % (v/v) por 15 min y germinadas en

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cajas Petri, sobre papel toalla saturado con una solución de 1 00 mg/L de ácido giberélico (Sigma Chemical Co, USA), en condiciones de oscuridad y a temperatura ambiente (Karlsson et al., 2003). Después de aproximadamente cuatro semanas, se detectó la emergencia de la radícula y dos semanas después, las plántulas, de entre 1.0 y 1.5 cm, fueron transferidas, a medio PC (Phillips y Collins, 1979), pH 7, suplementado con 25 g/L de sacarosa, a 25°C y bajo luz continua entre 40 y 50 ¡Jmol m·2 s·1, suministrado por lámparas fluorescentes de 39 W.

4.2.2. Extracción de ARN

La extracción del ARN total se realizó a partir de 1 g de los diferentes tejidos de A. mexicana, utilizando N2 líquido. La extracción se hizo con el reactivo Trizol de acuerdo a las modificaciones publicadas por Rubio-Piña y Vázquez-Fiota (2008).

4.2.3. Extracción de ADN genómico

La extracción de ADN genómico se realizó a partir de 1.0 g de tejido foliar, las muestras fueron procesadas con N2 líquido y se aplico el método con el amortiguador de bromuro de hexadeciltrimetilamonio {CTAB) (1.4 M NaCI, 100 mM Tris-HCI pH 8, 20 mM EDTA, 2 % CTAB; 0.2 % 2-mercaptoetanol) de acuerdo a Murray y Thompson (1980).

4.2.4. Análisis de la expresión génica de la NCS y BBE a partir de retrotranscritos (RT-PCR)

La síntesis de ADNc se realizó por transcripción reversa utilizando como molde 5 ¡Jg de ARN total, 1 O !JM de oligo-d(T) y 1 O U/ !JI de transcriptasa reversa (M-MLV; lnvitrogen), de acuerdo a las instrucciones del proveedor. La amplificación de los fragmentos de ADNc de la NCS y BBE se llevó a cabo por PCR utilizando 1 O IJM de los cebadores específicos (Cuadro 4.1) y 2.5 U/IJI de Taq ADN polimerasa (lnvitrogen). El programa de PCR utilizado para la NCSAm1 como para la

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NCSAm2 consistió de 30 ciclos con dos etapas de 30 s cada una a 94 y 65°C y otra de 1 min a 72°C, para la desnaturalización, alineamiento y amplificación respectivamente, precedido por una etapa de 3 min a 94°C y finalizado con otra de 1 O m in a 72°C. El programa de PCR para la BBEAm1 y BBEAm2 consistió de 30 ciclos con dos etapas de 30 s cada una a 94 y 66°C y otra de 1 min a 72°C, para la desnaturalización, alineamiento y amplificación respectivamente, precedido por una etapa de desnaturalización de 3 m in a 94 oc y finalizado con otra de extensión de 1 O m in a 72°C. La amplificación del ADNc de actina fue utilizado como control de carga y de amplificación de la RT-PCR. El programa de PCR utilizado consistió de 30 ciclos con dos etapas de 30 s cada una a 94 y 66°C y otra de 1 min a 72°C, para la desnaturalización, alineamiento y amplificación respectivamente, precedido por una etapa de 3 m in a 94 oc y finalizado con otra de 1 O m in a 72°C.

Cuadro 4.1.Cebadores empleados para la amplificación del ADNc parcial de la NCS y la BBE en Argemone mexicana.

Cebador Secuencias 5' ~3· Producto (pb)

NCSAm1 F-GAGGGCAATGGTGGTGTTGG 423

R-GTAGTACATGGAA TT ACCTGGATGGG

NCSAm2 F-GAGGGCAATGGTGGTGTTGG 541

R-CAGTAAACCTCCGAGAATAACCAAAC

BBEFAm1 F-CATCTTTGTTCATCATCATCTTCTTCTTCT 561

R-ATCGGCTGCGAGACCGTATTT

BBEFAm2 F-CTCATCTTTGTTCATCTTCTTTTCTGTGC 549

R-ATCGGCTGCGAGACCGTATTT

ACT F- CACIACTACTGCT AAACGGGAAA 467

R-ACATCTGCTGGAAGGTGCTG

78

4.2.5. Determinación del número de copias de la NCS y BBE por hibridación tipo Southern

El ADN genómico (20 IJg) fue digerido de manera independiente con las siguientes endonucleasas de restricción; BamHI, EcoRI, Hind/11, y Kpnl. Estas enzimas fueron seleccionadas con base en el análisis de las secuencias de la NCS y BBE de A. mexicana (Fig. 4.7). Los productos de la digestión se separaron en un gel de agarosa al 0.8%, y se transfirieron por capilaridad a una membrana de nylon N+ (Amersham), utilizando procedimientos estándares (Sambrook et al., 1989). El ADN se fijó a la membrana por radiación UV, (Stratalinker UV Crosslinker 2400; Stratagene, La Jolla, CA). Como sondas moleculares para la detección de la NCS se utilizaron los ADNc contenidos en las clonas pNCSAm1-5 y pNCSAm1-3 (ver Capítulo 3 y Fig. 4. 7). Para la BBE se utilizaron los ADNc contenidos en las clonas pBBEAm1-3; pBBEAm1-5 (ver Capítulo 3 y Fig. 4.7). Estas fueron marcadas con digoxigenina mediante PCR, de acuerdo a las instrucciones del proveedor (Roche Applied Science ). Las condiciones de hibridación empleadas fueron de 42° e por 24 h en una solución Dig easy hyb de acuerdo a las instrucciones del proveedor (Roche Applied Science ). Después de la hibridación, las membranas se lavaron dos veces en SSC 1 X con 0.1% SOS a temperatura ambiente durante 5 m in (SSC 1 X es 8. 7 g de citrato de sodio y 1 g de cloruro de sodio por litro, pH 7), seguido de dos lavados en 0.5X SSC con 0.1 % SOS a 65°C por 15 min cada uno. La detección se realizó usando Dig luminescent detection kit (Rache Applied Science) según las instrucciones del fabricante.

4.2.6. Análisis de secuencias

Las secuencias obtenidas de la NCS (NCSAm1 y NCSAm2) y la BBE (BBEAm1 y BBEAm2) de Argemone mexicana (Capítulo 3; Fig. 3.9 y 3.11) fueron comparadas con las depositadas en bases de datos del GenBank, utilizando el

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paquete BLAST (Basic Local Alignmnent and Search Tool; www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST). Para el análisis de dominios se utilizó el paquete SMART (Simple Modular Architecture Research Tool; http://smart.embl-heidelberg.de/), mientras que para la comparación múltiple de las secuencias de ADN, se utilizaron los programas Multialin (http://bioinfo.genotoul.fr/multalin/multalin.html) y CLC Main Workbench (CLCBio Software).

El análisis filogenético se realizó con el programa CLC Main Workbench (CLCBio Software). La búsqueda del árbol se realizó utilizando el método de neighbor joining, y se evaluó la robustez con el método bootstrap, utilizando 1 000 repeticiones. Las secuencias utilizadas para los alineamientos, comparación y análisis filogenético se presentan en el Cuadro 4.2.

4.2.7. Extracción, identificación y cuantificación de alcaloides

Los alcaloides se obtuvieron mediante una extracción ácido­base de acuerdo a la metodología descrita por Monforte­González et al (1992) con algunas modificaciones. Brevemente, de 1 00 a 200 mg de tejido liofilizado fueron homogenizados en 15 mi de metanol: HCI 5% (v/v) e incubados a 45°C, con agitación durante 2 h. Después de este tiempo, el extracto fue centrifugado, tomándose 500 !JI de la suspensión y evaporando hasta sequedad a presión reducida. El residuo se resuspendió en 1 00 1-11 de m etanol y fue utilizado en los análisis. La separación de los alcaloides se realizó mediante cromatografía de capa delgada (CCD) sobre placas de sílice ( cromatofolios de gel de sílice 60F254, Merck), utilizando los diferentes sistemas reportados (ver Resultados; Carrillo-Pech, 2006). Los alcaloides fueron identificados por comparación de sus propiedades cromatográficas (valor de Rr y fluorescencia) con los estándares de berberina y sanguinarina (Sigma-Aidrich Chemical Co ). La cuantificación de los alcaloides se realizó por densitometría in situ sobre las placas cromatográficas, utilizando el método del estándar externo, en un densitómetro

80

Shimadzu CS-930 equipado con un graficador (DR-2). Las lecturas en el densitómetro se hicieron por barrido lineal de cada carril y la concentración se determinó comparando el área del pico de las muestras contra el área de los picos obtenida aplicando concentraciones conocidas de los estándares. Los alcaloides fueron detectados por fluorescencia a una longitud de onda (A) de 300 nm (Carrillo-Pech, 2006).

4.2.8. Análisis estadístico

Los datos del contenido de alcaloides (mg) fueron estandarizados con el peso seco del tejido vegetal extraído, utilizando el programa Microsoft Excel .2007 (Microsoft, Redmond, WA, USA). Los gráficos fueron elaborados utilizando el programa SigmaPiot v.1 O (Systat Software lnc., San Jose, CA, USA). Se analizó la diferencia de medias de los contenidos de alcaloides entre tejidos y tratamientos mediante el análisis de varianzas (ANOVA de una vía) con la prueba de comparación de Holm-Sidak, utilizando el programa SigmaStat v. 3.1 (Systat Software lnc., San Jose, CA, USA).

81

Cuadro 4.2. Relación de secuencias utilizadas en los análisis de comparación y filogenéticos.

Abreviatura No. de accesión Especie

NCSAm1 EU881891 Argemone mexicana NCSAm2 EU881893 Argemone mexicana PsNCS1 AY860500 Papaver somniferum PsNCS2 AY860501 Papaver somniferum TfNCS AY376412 Thalictrum flavum CjNCS AB267398 Coptis japonica PsPR10-1 AY861682 Papaver somniferum PsPr10-2 AY861683 Papaver somniferum CjPR10 AB267399 Coptis japonica PmPR10 AY064193 Pinus monticola PgPR10 AF197342 Picea glauca PsmPR10 AF211850 Pseudotsuga menziesii CaPR10 AY829648 Capsicum annuum PcPR1 X12574 Petroselinum crispum AoPR10 AJ132610 Asparagus officinalis VqPR10 00396809 Vitis quinquangularis FsPR1 AJ130889 Fagus sylvatica StPR10 M25156 Solanum tuberosum DcPR10 AB082377 Daucus carota LePR10 Y15846 Lycopersicon esculentum BvMAP AJ006912 Betula verrucosa BpMAP AB046540 Betula platyphylla AgMAP Z48967 Apium graveolens AtMAP NM_122684 Arabidopsis thaliana CaMAP X70997 Corylus avellana CbMAP Z80169 Carpinus betulus PcMAP AF057030 Pyrus communis VrCSBP AB012218 Vigna radiata LICSBP AF288708 Lupinus luteus BBEAm1 EU881889 Argemone mexicana BBEAm2 EU881890 Argemone mexicana EcBBE S65550 Eschscholzia californica PsBBE AF025430 Papaver somniferum TfBBE AY610511 Thalictrum flavum BsBBE AF049347 Berberís stolonifera NtBBE AM851017 Nicotiana tabacum OsFAD NM_001067570 Oryza sativa AtFAD1 NM_102807 Arabidopsis thaliana AtFAD2 NM_102808 Arabidopsis thaliana AtFAD3 NM_102813 Arabidopsis thaliana AtFAD4 NM_103181 Arabidopsis thaliana AtFAD5 NM_118200 Arabidopsis thaliana AtFAD6 NM_118204 Arabidopsis thaliana AtFAD7 NM 123803 Arabidopsis thaliana

82

Abreviatura

AtFA08 AtFA09 AtFA010 AtFA011 AtFA012 GmFA02 GmFA01 CdFAO CsCBOAS CsTAS NICOX HaCOX AtCE

No. de accesión

NM_123805 NM_123806 NM_123807 NM_123808 NM_123811 00318817 00318816 AY451241 AB292682 AB057805 AF503442 AF364866 NM 101049

4.3 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Especie

Arabidopsis thaliana Arabidopsis thaliana Arabidopsis thaliana Arabidopsis thaliana Arabidopsis thaliana G/ycine max Glycine max Cynodon dactylon Cannabis sativa Cannabis sativa Nicotiana langsdorffii Helianthus annuus Arabidopsis thaliana

4.3.1. Análisis de los ADNcs de la NCS y BBE

Las secuencias completas de los ADNcs para la NCS y la BBE obtenidas por PCR como se describió en el Capítulo 3 permitió el análisis molecular y las caracterizaciones correspondientes una vez que éstas estuvieron disponibles.

Análisis de las secuencias de las NCS de Argemone mexicana

El ADNc de la NCSAm1 contiene un marco de lectura abierto de 828 pb que corresponde a un péptido de 275 aminoácidos, de una masa molecular predicha de 30.6 kDa. Por otro lado, la NCSAm2 tiene un marco de lectura de 663 pb que corresponde a un péptido de 220 aminoácidos, con una masa molecular predicha de 24.3 kDa. Las secuencias de aminoácidos deducidos de la NCSAm1 y NCSAm2 mostraron un 61% de identidad entre sí. En ambos casos, las secuencias de aminoácidos presentaron una región conservada entre los residuos 26 al 182, relacionados con el dominio de la familia Bet-v1, que constituyen el mayor grupo de proteínas aeroalérgenicas y se encuentran entre los cuatro alérgenos alimentarios más comunes en especies filogenéticamente

83

distantes (Schenk et al. , 2006) (Fig. 4.1 ). También se identificó un posible dominio transmembranal , localizado hacia el extremo e-terminal, entre los residuos 250 y 272 para la NCSAm1 y entre los residuos 195 y 217, para la NCSAm2. En ninguna de las dos secuencias se identificaron dominios correspondientes a posibles péptidos señal, como se ha reportado para la NCS de T. flavum (Samanani et al. , 2004).

20 40 1

NCSAm-1 MSKL I TTIP LKSMSE IANYVLK SVIRKIIVTYELEVPTSADSIWAVYS 50 NCSAm-2 MSKL 1 TT AP LKSMSE 1 AN YVLK SV 1 RK VTYE!LEVPASADS IWAVYS 50

NCSAm-1

NCSAm-2 L..::.:...:..:....:..:.....:..::...:.:..:..:....:...:.:.::...;:;;.::...:..::~.:...:....:....:..::==-:..;:...:...:-=..:...:..;:..:...:.-=.:~=~~

Figura 4.1. Comparación de las secuencias de aminoácidos deducidos a partir de NCSAm1 y NCSAm2 de Argemone mexicana. La caja indica la región conservada del posible dominio Bet-v1 . Las cajas punteadas señalan posibles sitios transmembranales .

La comparación de las secuencias de aminoácidos deducidos de la NCSAm1 y NCSAm2 con las secuencias depositadas en el GenBank, utilizando el programa BLAST (Aitschul et al. , 1997), mostró un porcentaje de identidad significativo, de entre el 50 y 75%, con las NCS de P. somniferum (Liscombe et al., 2005). De igual forma, presentaron una identidad significativa, del 30 al 39 %, con la de T flavum, y algo menor, del 12-39 %, con proteínas relacionadas con patogénesis (PR1 O). Estas

84

últimas incluyen a la subfamilia de proteínas alergénicas Bet V (MAP) y a la de proteínas con unión a citocininas (CSBP) de diferentes especies (Samanani et al., 2004; Pastemak et al., 2005; 2006) (Cuadro 4.3; Fig. 4.3). No obstante, ninguna de éstas ha demostrado actividad enzimática de NCS, a pesar de la homología que comparten (Liscombe et al. , 2005). Cabe mencionar que las dos NCS de A. mexicana, junto con las de P. somniferum y la de T. flavum, forman polipéptidos mayores que las proteínas PR1 O, CSBP y MAP debido a fragmentos adicionales en los extremos N y C de las primeras. Esto se relaciona con un presunto péptido señal, localizado en el extremo N-terminal de la NCS de T. flavum y con los posibles dominios transmembranales de las de P. somniferum (Samanani et al., 2004; Liscombe et al., 2005) y que también podrían ocurrir en la de A. mexicana (Fig. 4.3). Cabe resaltar, que tanto la NCSAm1 como NCSAm2 poseen extremos e­terminal prominentes, que se extienden mas allá de los extremos e-terminal de las de P. somniferum y T. flavum (Liscombe et al., 2005). En particular, la NCSAm1, presenta 51 residuos adicionales en el extremo e-terminal, en comparación con la NCSAm2. Esta es la razón por la cual se observa un menor porcentaje de identidad con las NeS ya reportadas. Por el contrario, la NCSAm2 tiene el extremo e-terminal conservado con respecto a las de P. somniferum (Cuadro 4.3).

85

Cuadro 4.3. Porcentaje de identidad de las secuencias de aminoácidos deducidos de la NCSAm1 y NCSAm2 con secuencias reportadas para la norcoclaurina sintasa (NCS) de P. somniferum (Ps) y T. flavum (Tf), proteínas de patogénesis (PR1 0), proteínas con unión a citocininas (CSBP) y proteínas alergénicas Bet V1 (MAP).

Proteína 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

1. NCSAm1 61 50 50 30 31 27 25 14 13 14 12

2. NCSAm2 75 74 39 39 33 30 17 16 16 14

3. PsNCS1 89 38 37 31 28 15 15 17 15

4. PsNCS2 38 38 34 27 16 16 16 15

5. PsPR10-1 30 28 37 19 20 16 15

6. TfNCS 59 28 18 17 19 17

7. CjPR10 25 15 15 16 15 8. PsPR10-2 23 22 18 17

9. VrCSBP 62 22 22

10. LICSBP 22 21

11. VpMAP 91

12. BpMAP

Las abreviaturas y la lista de accesión se encuentran en el cuadro 4.2.

El análisis de las porciones centrales de la NCSAm1 y NCSAm2, entre los residuos 26-182, que incluyen el domino Bet v1 y que excluyen los extremos N- y e-terminales, reveló una mayor identidad (80-86%) con las NCS de P. somniferum que con las de T. flavum (50-56%). Por su parte, la similitud con las proteínas PR1 O, CSBP y MAP fue significativamente menor (Cuadro 4.3; Fig. 4.3). Más aún, tanto las NCS de A. mexicana, P. somniferum, así como la de T. flavum, presentaron un motivo G(D/N)GGXGT que ocurre en las proteínas PR10, CSBP y MAP. Esta secuencia es muy conservada en todo este grupo de proteínas, a pesar de sus funciones ampliamente divergentes (Fig. 4.2). Este motivo sugiere la presencia de una horquilla de unión a fosfato (P­Ioop), la cual es precedida de una conformación laminar ~ seguido por una helice a que funcionan como un motivo de unión del ATP/GTP (Berkner et al. 2008).

86

NCSAm.l I<CSAm-"2

""'-NCSI PtNCS"2 Ps-1~1

Tft'lCS Qf'R10

p -·~':! VIC:SeP I.'ICSEIP BvM.AP ~

NCSAm.1 NCSAI!r>-':!

PsNC$1 PsloiCS2

P.-10.1 TrNCS

CU'\R10 Ps~lO..~

V.CSBP L.JCSSP e.~ ~

NCSAm-1 NCSAnn.:2

PsNCSt PJNCS2 p~-1~1

Tl'NCS Q.PR10

P PR1~'2 VIC:SeP I,.IC$9P ~ ~

HC$Ann.1 NCSAm-2

PsNC$1 PsNCS2

p·-·~· 1TNCS Qf'R10

P.-\~ V.CSBP L.JCSBP e.~ 6I:¡MAP

~ ~ ~ • 1 •

~.~:~.~;A~L:::::~:AN~~t :::::::: :: = ==~:=:~ ::: : ~ : ~;~~~~~ = ~! : : =~ M8KLITT&~LK8MA&V18NYAMKOO&V8&RNIPKKQ8LLRK~ ···· ··ITYE~EV-QT!·S 52 M8K~ITTB~LK8MABYI8NYVIOR&8~8ARNILNKN8LVKK& ···· ·· IRYDI.EV - PT·S ~ M · ···•· ·• · ·· •••••• ·· · ···············--RY& ···-·· INEFDV-OA·S 4 MIIKM&VV • ~M -· OTINCOK I~TG P ~ INOV8TYTKVIHHELEV-~A-S ~ M·RM&VVLVVFLM · · IOT NX&RLIF-NGR~LLHR·· · VTK&&TV -- MLYHEI.EV-AA·S ~ MI• • • • • • • • • • • • • · RGHVTNEMDV QA ·S 15 M VI< & P NT • • • • • • • • • • • • • •• • - • • • • • • • • • • • • • • • • • • - - ••• OTE l. 8V • •• -lt 14 M K&PIT ··· ·· ····- ··OAEL.V · ·• · Q M M · · ····GVFNYEI'I'ErrTaVIP 15 MI· • • • • IIYI'NYETEA 8VI 15

ID UO • • AOS IWAVYSS PA PTI.I.RDVLI.PGVFEKLOV 1 E 'ILO•I VFPPG - AVPR«:¡YKE'KF 100 A0$1WAVY$SPNlPTLI.RDVLLPGVFEKLDV 1 E VI. DI VFPPG · AVPRRYKEKF 100 AOS IWÑVYSSPDI PRI.I.RDVI.I.PGVFEKLOV 1 V L 'O·I FPLG - AVPRRYKEKF 111 AOSI~VYSQPOIPRI.I.RDVI.I.PGVF.QKLOV 1 E · VI.OIVFPPG - AVPR YKEKF 1 11 AODVWAVYS&POL PRI. 1 V& •'- L PGVF"·KKI OV E VLHLVIWI Pt1G • • VP 'L .YKEKF 72 AORIWTVYSWPOLAKHLPD L~ • GAF"EKL&I 1 • 1 L OMTFVPG - &~PH&YKEKF 11a AO&VW8VIiiQSP&LOLHLPOilLP ... G F"JU(F& 1 T• 1 L IOMTFPPQ - QFPHHYREKF 108 AO&IWAVYfjiSI<DLPt!iL 1 1 • LAPGVFEKI OY 1' E 1 L'RI VIIAQG .. &PR~EKF 74 L&AC:WAVLS·KD~ITVVPKVL·PHlVKDVO lE 1 IFNn.; P V8~·-YORE&I 71 J.&ILwdJlMS-KDLNYITj:il( ·PNIVKDVICV I E IL ·L TFD.DV8PV.YQREKI 72 AARL~KAFIL&O ~DTLIPKVA·POAI88V&NIE II(KI FP&G-~P-KYVKERY 72 AARL~KAF LDG DKLYPKVA·POAI&&V&NtE 1 Kl FP&G~~F-KYVKQRY n

.. -:o ·r ,., A DNKKRLKE"fl M 1 EGG LOMGCTYY O . 1 H\1 A.KTPNSCV 1 K 'SS· 1 1 Y'QVKREYA.E.I(M 100

VI(INNEKRLKEV~M I EGGYLOMGCT&YMORIH~&KTPNSCVI SSIIY•EVKQEY ... D&M 1(10

~~: =::~~=t:~~l ~ : ~~~~t~~~g ~=g:: ~ :.:~~~~=g~: ·::: :~~~~=~~~=~=~ ~~: ~Mo;.HKRLKEVf!d 1 EGGYLEMGCT YMO&pg 1 LIC,KT~Osc:J' 1 ,.S 1 TRY·EV--E· AEKV8 1$2

LVO(NEHRLKKVOM 1 EGGYLOLGilTYYMDT 1 HVIII'!TGKOSCV 1 'KS$ii'EY,HVKPEFYK 1 V& 172 VFPIOHKNR_'i'IK V.Q bGI[jl'( DLG\oiTYYMOTI~VVATGP~SCVI 'I< 'Sii'TEYHVKI'EPAKIVK 1elll V~YOH~RRilKQ OQ I 0GGYLDMGP8LYKYTYEILPKDKNSC I~Sii'VOlO~DDKN~EA~A. 1~ iTEI'\D'&88HEI G~O~ 1 EGGYLNOGLe,Y'(KTTFKL:&&I &ECKTLVNVK 1 8YQHD8D IEEK;V11 131 E~D-VTH.IG~OW EGGYL80GL8YYKT8~0L8AIGELHTLVNVKI~YEY.HNTEE •• A 1$2

g~~g::~:;=~=~=~ : ~~~=~:gn::: ~=:: ~: ~~~~g::g~:t~: =~~~::~~==::=~~~= ~~ ~ ?~ ~

1 ' • · kL ITTI PLI(SM&&~ 1 AÑYVL • • · - KNQ&V 1 f"~EVTYEL:QV~T&AD&IWAVY88P~I T 1 215 - kL 1 TTVPL..KSM8E~ 1 ANYVL • • ·- K 'KOFRV'· • • FGIYE 1 KPIKLGL8LLLCL r 1 C • -· V 1 2011 - KL I TTEPLESMAEVI&GYVL. · • · · K:KRLO --- FGFEIKPIKLRFNLL.LCLIICL · - ·YI 220 - ~L 1 TTEPLESMA.V• 1 8GYVL • • • · KKIIILQV;.- ·J'GFE IK"K'-R~NLLL CL 1 1 CL • -· V 1 220 - ~H 1 8VE.L:VDMARA 1 8KYII QJ)NJtK·N'SAiiDP'&TC81iEOHOKkHGHLHR IWI8LFG~ • • • 1e8 - PL 1 TTGPLAAMADA 1 8KilVL - - ·- • •. . -- •• •• - li.-.K8K8N80&1 &AAJ 1 TV • - • • • 210 - PLIDT\olf>LAIM8EAIAK:W:VL ···· ·····-··· · · ENKHK88E - ·············· 1 • L.ITVOAMWGMAK 1 VOYVLD AKQ • • • ·-- • • • • • • • • • • • ·- • • • • • • • • • • 161 · I'TKT8Q8TLMY~RRL&RVL:8N · G8~··· · · ··· ··· - 1~

~~~:::~::e;rt:i~=~~~t:~:~:.;;. ::::: : ::: :::::: :: :: :::::::: ~~ RVKA.KEl!IGEXI.:Ll!IA Y L&..HJ!!UtltH • • • ·-- • • • ·-- - • • • ·.- • • • • • • • • 11!1()

2-10 1 161

·~ 158 160 160

Figura 4.2. Comparación de las secuencias de aminoácidos deducidos de la NCSAm1 y NCSAm2 con secuencias reportadas para las norcoclaurina sintasas (NCS), proteínas de patogénesis (PR1 0), proteínas con unión a citocininas (CSBP) y proteínas alergénicas Bet V1 (MAP). El recuadro indica la secuencia consenso P-loop. Las abreviaturas y la lista de accesión se encuentran en el cuadro 4.2.

87

Análisis de las secuencias de las BBE de Argemone mexicana La secuencia de la BBEAm1 mostró un marco de lectura abierto de 1665 pb, que corresponde a un polipéptido de 554 residuos con una masa molecular de 62.5 kDa. Por su parte, la BBEAm2 tiene un marco de lectura abierto de 1611 pb, que corresponde a un péptido de 536 residuos, con una masa molecular de 60.1 kDa. Se debe hacer notar que A. mexicana es la primera especie productora de ABis de la que se logran aislar dos isoformas para la BBE. Si bien en P. somniferum se han detectado al menos tres genes, aparentemente sola la (bbe1) logra producir una proteína funcional (Facchini et al. , 1996).

Las secuencias deducidas de aminoácidos para las dos BBEs de A. mexicana (BBEAm1 y BBEAm2) mostraron un 90% de identidad entre sí (Fig. 4.3). En términos generales, ambas mostraron un porcentaje de identidad significativo (72%) con las de E. californica y P. somniferum (Dittrich y Kutchan, 1991; Facchini et al., 1996) y un tanto menor (60%), con las de B. stolonifera y T. flavum (Chou y Kutchan, 1998; Samanani et al., 2005). Este porcentaje fue bajo (35 y 40%), comparado con otras flavín-oxidoreductasas (Cuadro 4.4; Fig. 4.4).

Es interesante hacer notar que ambas BBE de A. mexicana presentaron un segmento en el extremo N-terminal con una alta identidad a las secuencias equivalentes de P. somniferum, E. californica (ambas Papaveraceas), así como con las de B. stolonifera y T. flavum, que pertenecen a otras familias. Esto es de relevancia puesto que los primeros 50 residuos del extremo N-terminal de la BBE de P. somniferum son críticos para el transporte de la proteína al retículo endoplasmático y a la vacuo la (Bird y Facchini, 2001 ). Algo similar se ha sugerido para la enzima de E. californica (Kutchan et al., 1994 ). Con base en los análisis de la secuencias, un segmento de 36 aminoácidos para la BBEAm1 y de 31 para la BBEAm2 podrían representar estos péptidos de tránsito (Fig. 4.3). De igual forma, en ambas secuencias se observó un motivo NXS/T, (50-

88

53 y 45-48 para BBEAm1 y BBEAm2, respectivamente) que corresponde a un presunto sitio de N-glucosilación, similar al encontrado en las BBE de E. califomica y P. somniferum (Ditrich y Kutchan, 1991; Facchini et al., 1996; Bird y Facchini , 2001; Winkler et al., 2006). De hecho, la BBE de E. califomica al ser expresada en células de insecto, resultó glucosilada en el retículo endoplasmático, antes de ser excretada al medio (Kutchan et al., 1994 ). En este sentido, la finalidad de la glucosilación de la proteína BBE es el plegamiento correcto en el retículo endoplasmático y su probable compartamentalización (Winkler et al., 2006; 2007)

Cuadro 4.4. Porcentaje de identidad de las secuencias de aminoácidos deducidos de la BBEAm1 y BBEAm2 con secuencias reportadas para la enzima formadora del puente de la berberina (BBE) de E. californíca (Ec), P. somniferum (Ps), T. flavum {Tf), y N. tabacum (Nt), proteínas dependientes de FAD y oxidoreductasas

Proteína 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

1. BBEAm1 90 72 71 61 59 41 38 40 32 31 35 35

2. BBEAm2 71 71 31 32 36

3. EcBBE 66

4. PsBBE 60 57 42 42 33 36 36

5. BsBBE 68 43 32 34 36

6. TfBBE 42 40 43 31 35 37

7. NtBBE 46 45 31 34 38

8. OsFAD2 45 33 33 32 36

9. OsFAD1 35 37 36 39

10. AtFAD1 53 42 44

11. AtFAD2 39 40

12. CsCBDAS 45

13. NICOX

Las abreviaturas y la lista de accesión se encuentran en el cuadro 4.2.

89

~ 41° vvv ~

BBE.Am-1 ML TTVTMETKI TKNkYSSLF 111 FFFFFSVL TCALSDOI LSCL TSNGVHNYTTPSSDSNS 60 BBE.Am-2 ML IIYTMETK 1 TKNfXSSL F 1 • .... ffSYLTCALSPO 1 LSC L TSNGVHNYTTPSSOSNS 55

~ 100 1 l

BBE.Am-1 OYLRL . HLS l QN P L FEKST 1 SKPSL 1 VL PJINKEELSN'TVRCCTRGSWTI R LR 20 BBE.Am-2 OYLRL HLS QNPLFKKSTI SKPSL IVLPgNKEELSNiTVRCCTRGSWTI RLR 15

~ ~ ~ 1 . 1 * 1

BBE.Am-1 fi:SYTADTPFVL 1 OLMNLNR 1 SI O OSETAWVESGAT GELYYAI E TOS GFTAGWCPT 180 BBE.Am-2 ~YTAOTPFVLIOLMNLNRISIO OSETAWVESGAT GELYYAI E TOS GFTAGWCPT 175

~ m ~ 1 1 1

BBE.Am-1 VGSGGH 1 SGGGFGMMSRKYGLAAONVEOVI L 1 DSKGAI LDRKLMGEOVFWAVRGGGGGVW 240 BBE.Am-2 VGTGGH 1 SGGGFGMMSRKYGLAAONVEOV 1 L 1 DSNGA 1 L DRKLMGEOVFWAVRGGGGGVW 235

~ ~ ~ 1 1 1

BBE.Am-1 GAIYAWKIKLLPVPKKVTVFRV KNVNIEEASFLIHKWQYVAOELODOFTVSILGGANGN 300 BBE.Am-2 GA 1 YAWK 1 K L L PVPKKVTVFRV KNVN 1 EEASF L 1 HKWQYVADELDOOF TV 1 LGGANGN 295

m ~ ~ 1 1 1

BBE.Am-1 EVWYI FLGLHLGCKTVAKS I I DKRFPELGL 1 EEEFLEMNWGESFAYLSGLKTVKELN.NRF 360 BBE.Am-2 gAW FLGLHLGCKTV'AKSIMDKMFPELGL 1 EEEFLEMNWGESFAYLSGLKTVKELNNRF 355

BBE.Am-1 BBE.Am-2

400 420 1 1

LE ILSKEPRGF 1 !LNGF.GGKMSK 1 SNDFTPF PH 420 LEILSKEPRGFI LN GGKMSK I SNOFTPFPH415

" 0 400 400 1 1 , ..................................... ,

BBE.Am-1 Rl<GTKLMVEY 1 V'AWSKOEESKSDEFFDWLRN 1 YDYMENFVSKNPRVPYVN~ 1 OLOLGG 1 oj 480 BBE.Am-2 R,.GTKLMVEY 1 VSWSKDEESKSDEFFDWLRN 1 YDYME'~FVSKNPRVi3YVNN 1 Ol DLGG 1 o¡ 475

500 S20 '···································s;¡o , ........................................................ .l.. ..................................................... .l................ .......... 1

BBE.Atn-1¡ WSOKNSSNNA 1 E 1 ARNWGEKYFL SNY ERLI RAKTL 1 OPNNVF NHPQS.I ~PMMK'II'lNVOOE 540

BBE.Am-21_.~~.~.~.~~.~.~.~.~.! .. ~.!.~.~.~~.~~.~.r..~ .~.~ .r..~.~.~ .. ' .. ~.~ .~ .'!: .~ . .'..~.~.~.~ .! .~. ~.~.~.~.~ .! .~ PMM K N V o o E 535

Figura 4.3. Comparación de la secuencia de aminoácidos deducidos a partir de BBEAm1 y BBEAm2 de Argemone mexicana. Los aminoácidos subrayados muestran un presunto péptido señal. Los triángulos (del residuo 50 al 52) señalan el posible sitio de N-glucosilación. La caja (de 113 a 122 en BBEAm-1) indica la región del dominio de unión a FAD y los asteriscos los residuos (histidina y cisteina) de unión. La caja punteada (de 467 a 529) señala el posible dominio catalítico de la BBE.

90

BB EAm-1 BBEAm_2

EcBBE P&BBE TfBBE

B sBBE NtBBE

BBEAm-1 BBEAm_2

EcBBE PeBBE TfBBE BsSBE NtBBE

BBEAm- 1 BBEAm_2

EcBBE PeS BE TfBBE

BaBBE N tBBE

BBEAm-1 BBEAm_2

EcBBE PaBBE TfBBE

BaBBE N tBBE

BBEAm-1 BBEAm_2

EcBBE PeBBE TfBBE BeBBE NtBBE

BBEAm- 1 BBEAm_2

E c BBE PaBBE TIBBE

BaBBE NtBBE

BBEAm- 1 BB EAm_ 2

E c BBE PoS BE TIBBE

BeBBE NtBBE

BBEAm- 1 BBEAm _ 2

EcBBE PsBBE TIBBE

BeBBE NtBBE

BBEAm- 1 BBEAm _ 2

EcBBE PeBBE T IBBE BsBBE N lB BE

BBEA.m-1 BBEAm_2

E c BBE PaBBE TfBBE

BsSBE NtBBE

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Figura 4.4. Comparación de las secuencias de aminoácidos deducidos de la BBEAm1 y BBEAm2 con secuencias reportadas para la enzima formadora del puente de la berberina (BBE), proteínas dependientes de FAD y oxidoreductasas. Los recuadros indican los residuos de unión bi­covalente de FAD. Las abreviaturas y la lista de accesión se encuentran en el cuadro 4.2.

91

Recientemente se ha determinado que la BBE pertenece a una nueva familia de flavoproteínas, la cual presenta un sitio de unión bi-covalente del cofactor FAD formando un enlace 8a­histidii-6-S-cisteinii-FAD, que aumenta el potencial oxido­reductor de la enzima. Estos sitios de unión alFAD se localizan en los residuos H1o4 y e1 66, (tomando la de E. californica como referencia) embebidos en dos dominios característicos (Winkler et al., 2006; 2007). En este sentido, las secuencias SGGHSYEGLS, con residuos H en las posiciones 116 y 111, y AGWePTV, con residuos e en las posiciones 178 y 173, en BBEAm1 y BBEAm2 respectivamente, corresponden a dichos sitios de unión (Fig. 4.3). Esto confirma la naturaleza de los ADNc aislados de A. mexicana como flavín-oxidoreductasas con el enlace bi-covalente, típico de las BBE (Dittrich y Kutchan, 1991; Facchini et al., 1996; Winkler et al., 2006; 2007). Los residuos H y e de los dominios de unión al FAD son semi-conservados en otras flavoproteínas y oxidoreductasas (Fig. 4.4) y se han descubierto en otras oxidasas, como la hexosa oxidasa de Chondrus crispus (Rand et al., 2006), aclacinomicina oxidoreductasa (AknOx) de Streptomyces gali/aeus (Aiexeev et al., 2007), glucooligosacárido oxidasa (GOOX) de Acremonium strictum (Huang et al., 2005) y quito-oligosacárido oxidasa (ChitO) de Fusarium graminearum (Heuts et al., 2008). Aunque estas enzimas están involucradas en diferentes procesos metabólicos, comparten las propiedades comunes de las flavoproteínas bi-covalentes, en las que este tipo de enlace no sólo participa en la modulación del poder oxidativo del FAD, sino que favorece la estabilidad de la estructura proteica, facilita la transferencia de electrones y previene la pérdida del FAD oxidado (Leferink et al., 2008; Heuts et al., 2008; Huang et al., 2008). En la BBE, el enlace 8a-histidii-6-S-cisteinii-FAD es crítico para generar el potencial de redox necesario para llevar a cabo la transformación de la reticulina (el sustrato de la enzima; Fig. 1.3), ya que al afectarlo se observó una drástica disminución en la eficiencia catalítica de ésta (Winkler et al., 2007).

92

Además de estos dominios, cercano al extremo e-terminal, entre los residuos 467 al 529 y del 462 al 524 para BBEAm1 y BBEAm2 respectivamente, se identificaron los presuntos dominios catalíticos, de acuerdo con lo reportado en P. somniferum, E. ca/ifornica y B. stolonifera (Dittrich y Kutchan, 1991 ; Facchini et al. , 1996; Chou y Kutchan, 1998) (Fig. 4.3).

4.3.2. Análisis filogenético de los ADNc de la NCS y BBE

Con el fin de analizar las posibles relaciones evolutivas, se llevó a cabo un análisis filogenético con base en las secuencias de nucleótidos de los ADNc, considerando únicamente los marcos de lectura abierta, tanto de la NCS como de la BBE de A. mexicana y enzimas relacionadas.

El diagrama filogenético de la NCS fue desarrollado utilizando 29 secuencias. Se incluyeron las NCS de diferentes especies, así como otros tres grupos homólogos; proteínas relacionadas con patogénesis (PR1 0), proteínas de unión a citocininas (CSBP) y proteínas alergénicas Bet V1 (MAP) (Liscombe et al., 2005; Fig. 4.5). El análisis mostró una relación estrecha entre las NCSAm1 y NCSAm2 de A. mexicana con las secuencias PsNCS1 y PsNCS2 de P. somniferum, y un poco menor con TfNCS de T. flavum. Esto permitió agrupar dichas secuencias en un mismo ciado, lo que sugiriere un ancestro común. Este agrupamiento coincide con reportes previos que sugieren que las NCSs de diferentes especies forman un grupo monofilético (Samanani et al. , 2004; Liscombe et al. , 2005). Este análisis también mostró que las PR-1 O de C. japonica y de P. somniferum tuvieron una relación más cercana con el grupo de la NCS que con otras PR-1 O de diferentes especies. Cabe mencionar que el bajo soporte para el origen monofilético de la NCS (con un valor de bootstrap de 433), abre la posibilidad de topologías alternativas para el cladograma, (Liscombe et al., 2005).

93

CbMAP

'-------- AtMAP

50S

40

'---- AoPR10 LePR10

CaPR10 StPR10 AgMAP DcPR10 PcPR1

VqPR10 PcMAP

FsPR1 BpMAP BvMAP CaMAP

LICSBP VrCSBP

PsPR10-2

PsNCS1

.-------"''::.:.¡' PsNCS2 NCSAm2

TfNCS CjPR10

PsPR10-1

NCSAm1

Figura 4.5. Árbol filogenético obtenido mediante la aplicación del método neighbor-joining (método del vecino más próximo) utilizando la secuencia de nucleótidos codificantes de la NCSAm1 y NCSAm2 de A. mexicana y 29 proteínas relacionadas (las abreviaturas y la lista de accesión se encuentran en el cuadro 4.2). Los números internos indican el soporte Bootstrap de cada ciado.

Se debe hacer notar que la presunta NCS de C. japonica (CjNCS), no se agrupó con las NCS de las especies incluidas en este análisis. De hecho, esta secuencia no mostró ninguna relación significativa con los tres grupos de proteínas analizadas (Fig. 4.5). En contraste, la PR-10 de esta misma especie (CjPR1 O) se agrupó estrechamente con la NCS de T. flavum (Fig. 4.5). La secuencia de CjNCS no comparte similitud significativa con las NCS de otras especies, no obstante que tiene la actividad catalítica para la formación de (s)­norcoclaurina a partir de 4-HPAA y dopamina Minami et al.,

94

2007). Es interesante notar que CjNCS pertenece a la familia de las dioxigenasas dependientes de 2-oxoglutarato, mientras que las demás NCS aquí analizadas pertenecen a la familia de las hidro-liasas (Minami et al., 2007). En este sentido, es remarcable que dos proteínas que pertenecen a familias distintas tengan la capacidad de catalizar la misma reacción in vitro. Por su parte, la CjPR1 O, con un 65 % de identidad con la NCS de T. flavum, tiene actividad catalítica para la formación de (s)-norcoclaurina (Minami et al., 2007). De este modo, la interpretación de los resultados obtenidos con la NCS y la PR-1 O de C. japonica presentan algunas interrogantes y deben ser tomados con cautela (Minami et al., 2007; Facchini y De Luca, 2008).

El diagrama filogenético de la BBE fue desarrollado utilizando 28 secuencias. Éstas incluyeron las BBE de diferentes especies, así como diversas flavoproteínas relacionadas (Liscombe et al. , 2005; Fig. 4.6). El análisis mostró que la BBEAm-1 y BBEAm-2 presentan una relación cercana con las BBE de E. californica, P. somniferum, T. flavum y B. stolonifera, permitiendo agruparlas en un mismo ciado. Esta agrupación tuvo un soporte elevado (valor bootstrap de 1 000), sugiriendo un grupo monofilético (Liscombe et al., 2005). La relación más cercana de este grupo resultó con una presunta BBE de N. tabacum, que aun no ha sido caracterizada, y en la cual presenta un dominio de unión a flavina (Goossens et al., 2003). Un aspecto interesante de notar es que la CsTAS y la CsCBDAS (involucradas en el metabolismo secundario) de C. sativa, no están directamente relacionadas con la BBE (Liscombe et al. , 2005). Sin embargo, ambas presentan los dominios de unión al FAD, que permitirían el enlace bi­covalente, necesario para el funcionamiento correcto de la proteína, lo que sugiere un origen ancestral común con la BBE (Liscombe et al., 2005; Heuts et al. , 2008). ·

95

2C1

CsTAS CsCBDAS

AtFAD4 AtFAD1

'-------- AtFAD2 '----------AtCE

•nMir----- BsBBE '------ TfBBE

BBEAm2 BBEAm1

'----- EcBBE '------ PsBBE

L---======-- NtBBE '------------ OsFAO

'------------ CdFAD '------------ HaCOX

.----- AtFAD9 .----"'=i '---- AtFAD6

'---- AtFAD10 '------- AtFAD3

GmFAD1 GmFAD2

'------- - NICOX 1000 AtFAD7

AtFAD6 r---- AtFAD12 '----- AtFAD11

'------ AtFADS

Figura 4.6. Árbol filogenético obtenido mediante la aplicación del método neighbor-joining (método del vecino más próximo) utilizando la secuencia de nucleótidos codificantes de la BBEAm1 y BBEAm2 de A. mexicana y de 28 proteínas relacionadas (las abreviaturas y la lista de accesión se encuentran en el cuadro 4.2). Los números internos indican el soporte Bootstrap de cada ciado.

4.3.3. Redundancia génica de la NCS y BBE en Argemone mexicana

El ADN genómico de A. mexicana se digirió con diferentes enzimas y se sometió a un análisis tipo Southern blot, con el fin de establecer los posible redundancia génica de la ncs y la bbe en esta planta. Se seleccionaron las enzimas BamHI, EcoRI, Hind/11, y Kpnl, de acuerdo al análisis de restricción de las secuencias completas de los ADNcs de la NCS y BBE (Fig. 4. 7). Las sondas moleculares utilizadas para la NCS fueron, pNCSAm1-5 y pNCSAm1-3 (Fig. 4.7).

96

pNCSAml-3 pNCSAml-5 ,----------,

BamHI Eco RI 1 1

ú NCSAml L----! ' l~. --------------~~ •

~ NCSAm2

- -lSOpb

BamHl 1

pBBEAml-3

Figura 4.7. Análisis de restricción de los ADNcs de la NCS (NCSAm1 y . NCSAm2) y BBE (BBEAm1 y BBEAm2) de Argemone mexicana. Los corchetes indican los fragmentos de ADNc utilizados como sondas para el análisis tipo Southern blot.

El análisis con las sondas correspondientes a los extremos 5' y 3 ' de la NCSAm1 (Fig. 4.8) mostró bandas de hibridación para las distintas enzimas utilizadas que fueron comunes entre sí, así como algunas diferencias interesantes. Estos patrones de hibridación sugieren la presencia de un bajo número de copias. Por ejemplo, analizando detenidamente el patrón de hibridación obtenido para el ADN digerido con EcoR/, se observó la ausencia de dos bandas de alrededor de 3 y 6 kb con la sonda pNCSAm1-3, en comparación con la sonda pNCSAm1-5 (Fig. 4.8). pNCSAm1-3 contiene un fragmento de 731 pb en el extremo 3' con un sitio EcoR/, ausente en NCSAm2 (ver Fig. 4.7). De este modo, de no existir intrones en esta región, la presencia de dos copias del gen correspondiente generaría un patrón de tres bandas. Con la sonda pNCSAm1-5, de 340 pb y sin sitios de EcoRI, se detectaron cinco bandas de hibridación

97

(Fig. 4.8). Este patrón sugiere la presencia de más de una copia para este gen, ya que la sonda utilizada abarca un segmento corto (menos de 400 pb) y si bien el gen correspondiente a la NCS P. somniferum (ncs1; Acc. FJ2000359 GenBank) tiene un intrón en la región cercana al extremo 5,, éste es de solamente 160 pb. No es raro que genes para enzimas relacionadas presenten una estructura similar. Por ejemplo, dioxigenasas dependientes de 2-oxoglutarato involucradas en el metabolismo de secundario en Atropa, Catharanthus y Hyosciamus tienen la misma estructura génica en cuanto al número y posición de intrones (Kanegae et al. , 1994; Vázquez-Fiota y De Luca. , 1997). De este modo, es posible que el gen de la ncs de A. mexicana presente un intrón en la misma posición y tamaño similar que el de P. somniferum. De ser así, sería poco probable la ocurrencia de más de dos bandas de hibridación de EcoRI con una sonda que cubre una región corta.

Estos datos, junto con el aislamiento de dos ADNc de la NCS (Capítulo 3), sugieren la presencia de un número reducido de copias para este gen, posiblemente dos. En caso de ser así, el patrón de hibridación con Kpnl, que no tiene sitos de cortes en ninguna de las sondas utilizadas y que produjo una señal prominente cercana a los 12 kb y bandas de mucha menor intensidad entre los 6 y 8 kb, sugiere que los genes de la ncs podrían estar organizados en forma de grupos o tándem (Fig. 4.8). No obstante, en tanto que no se aíslen los respectivos genes, la posibilidad de que los distintos ADNc aislados correspondan a productos transcripcionales alternos, no puede descartarse. Se debe mencionar, que en T. flavum, se ha sugerido la presencia de una pequeña familia de entre tres y cinco miembros para la NCS, (Samanani and Facchini, 2002; Samanani et al., 2004). Esto es similar a lo encontrado en P. somniferum, de donde se han aislado dos ADNc, correspondientes a distintas NCS (Liscombe et al. , 2005).

98

12

7.0 6.0 5.0

3.0

2.0

1.6

1.0

0.6

0.5

Extremo 5' Extremo 3'

Figura 4.8. Análisis tipo Southern blot de la NCS de Argemone mexicana. Se utilizaron como sondas los fragmentos de ADNc correspondientes a los extremos 5' y 3' de la NCSAm1. El ADN genómico {20 !Jg) fue digerido con BamHI, EcoR/, Hind 111, y Kpn/1. Las sondas utilizadas fueron marcadas con digoxigenina. Los números de la izquierda indican el marcador molecular en kilobases (kb).

Para la bbe se emplearon como sondas las clonas pBBEAm1-5, que incluye un fragmento de 622 pb del extremo 5' y sin sitios de corte para las enzimas utilizadas, y pBBEAm1-3, que incluye un fragmento de 1253 pb del extremo 3 · (ver Fig. 4. 7). Estas sondas generaron patrones de hibridación con diferencias notables entre sí (Fig. 4.9). Así, la detección de dos bandas con la sonda 5' tanto para BamHI como Kpnl, además de la detección de cuatro y tres bandas con EcoRI y Hind/11 respectivamente sugiere la presencia de un número reducido de copias, posiblemente dos considerando que dos ADNc

99

fueron aislados (Capítulo 3) y la posible presencia de intrones (Fig. 4.9). No obstante, como se mencionó anteriormente, esto tendrá que ser confirmado mediante el aislamiento de los genes correspondientes.

Por su parte, la sonda del extremo 3, que incluye sitios Hind/11, Kpnl y EcoRI detectó, en general, un número mayor de bandas de hibridación que la sonda 5' (Fig. 4.9). Estos resultados en conjunto apoyan la presencia de al menos dos copias para el gen de la bbe. Cabe mencionar, que la intensa banda Kpnl detectada con las sonda 3' sugiere la presencia de un arreglo en tándem de estas presuntas copias. En E. californica solamente se ha detectado un gen para la bbe, correspondiente a una enzima funcional (Dittrich y Kutchan, 1991 ), mientras que en P. somniferum posiblemente exista una pequeña familia de dos o tres miembros, de los cuales solamente uno (bbe1) , correspondería a una enzima funcional (Facchini et al., 1996).

100

12

7.0 6.0 5.0

3.0

2.0

1.6

1.0

0.6

0.5

Extremos· Extremo 3'

Figura 4.9. Análisis tipo Southern blot de la BBE de Argemone mexicana. Se utilizaron como sondas los fragmentos de ADNc correspondientes a los extremos 5' y 3' de la BBEAm1. El ADN genómico (20 ¡.Jg) fue digerido con BamHI, EcoR/, Hind 111, y Kpnl. Las sondas utilizadas fueron marcadas con digoxigenina. Los números de la izquierda indican el marcador molecular en kilobases (kb).

4.3.4. Análisis de la expresión génica de la NCS y BBE en Argemone mexicana

Con el fin de estudiar la posible relación entre la expresión génica y el contenido de ABis en A. mexicana, se analizó la expresión tejido-específica de la NCS y BBE, así como el contenido de alcaloides en plantas maduras y en plántulas en desarrollo.

101

4.3.4.1 Análisis de la expresión de la NCS y BBE en Argemone mexicana

La sanguinarina y berberina son los alcaloides mayoritarios en esta planta. La sanguinarina se detectó en la raíz y en la semilla madura, en cantidades de 1.0 y 1. 7 mg g-1 de PS, respectivamente (Fig. 4.1 OA). En las cápsulas completas, sin semillas, sólo se observaron algunas trazas de sanguinarina. La berberina, por su parte, se detectó en todos los tejidos analizados, a excepción de la semilla madura, siendo el brote floral y la raíz los que mostraron mayores cantidades (2 y 3 mg . g-1 PS; respectivamente) (Fig. 4.1 OA). Estos resultados son similares a reportes previos (Lozoya y Lozoya, 1982; Willcox et al. , 2007). Un aspecto importante de resaltar es la distribución de estos alcaloides durante la maduración de la semilla, ya que en este proceso se observa un cambio de berberina a sanguinarina. La capacidad de A. mexicana para acumular sanguinarina (benzofenatridina) en dos tejidos diferentes (raíz y semilla madura) y berberina (protoberb!3JjoaLen. - .. , .., ' .- '\ .-- - --

hoja, raíz, semilla inmadura y brote floral de plantas maduras de A. mexicana. En este estudio no se incluyeron semillas maduras debido a que no se pudo obtener el ARNm.

En los diferentes tejidos, los transcritos para la NCS y 88E mostraron, en general, un patrón de expresión relacionado con la acumulación de los alcaloides. Sin embargo, también se observaron algunas diferencias (Fig. 4.1 08). La NCSAm1 se expresó en menor medida en hojas, en comparación con los demás tejidos. En contraste, la NCSAm2 se detectó con la misma intensidad en todos los tejidos analizados (Fig. 4.1 08).

Por su parte, el nivel de expresión de los genes representados por 88EAm1 fue menor en hojas, raíces y no se detectó en la semilla inmadura mientras que la BBEAm2 se detectó en todos los tejidos, con niveles bajos en raíz y semilla inmadura (Fig. 4.1 08). De esta manera, ncs y bbe se expresan diferencialmente en los tejidos, siendo abundantes en cápsula, tallo y brote floral , mientras que en hoja, raíz y semilla inmadura se detectó una expresión variable. Esto puede relacionarse con la participación de las distintas isoformas de la NCS (NCSAm1 y NCSAm2) y 88E (88EAm1 y 88EAm2) en la síntesis de alcaloides de los diferentes grupos. En este sentido, tanto la NCS y como la 88E son enzimas involucradas en la formación de intermediarios comunes para la síntesis de tanto benzofenantridinas (sanguinarina) como protoberberinas (berberina) (Sánchez-Mendoza et al., 2008; Schwarzbach y Kadereit, 1999; Fig 4.1 OA). Esto sugiere la existencia de un grado de coordinación que permite la síntesis de ambos alcaloides. En este momento, no es posible discernir si las diferentes isoformas aisladas de la NCS y la 88E participan de manera específica en la formación de alguno de los alcaloides en los diferentes tejidos de A, mexicana. No obstante, esta posibilidad existe ya que la distribución tejido específica de transcritos correspondientes a diferentes isoformas de la TYDC, SOMT y COR en P. somniferum, sugiere que puede estar relacionada con los diversos tipos de alcaloides

103

producidos en los distintos tejidos (Facchini y De Luca, 1995; Unterlinner et al. , 1999; Ounaroon et al. , 2003).

Comparando los patrones de expresión de ncs (NCSAm1 y NCSAm2) y bbe (88EAm1 y 88EAm2) de A. mexicana con los observados en T. flavum, y P. somniferum, se notan diferencias con la primera y similitudes con última. Por ejemplo, la 88E de P. somniferum se expresa principalmente en el tallo , hoja, capsula con en niveles bajos en la raíz (Facchini y Park, 2003; Sama na ni et al. , 2005,) al igual que en Argemone (Fig. 4.1 08). Por otro lado, la expresión de NCS de T. flavum es abundante en el rizoma (tallo modificado) (Huang y Kutchan, 2000), en contraste con lo que sucede en A. mexicana donde hay otros tejidos con una acumulación abundante del transcrito además del tallo (Fig. 4.1 08).

104

A

B

2 .. 5

11'1 2.0 o.

bo ti.O 1.5

E 1.0

0.5

0.0

NCSAm1

NCSAm2

BBEAm1

BBEAm2

Actlna

c=J Sanr:ulnarina

- Berberina

e T

e T

H

H

R Tejidos

R

SI

SI

d

B

B

~-- ----_____ ..... .,.., --S m

Figura 4.10. Acumulación de ABis y análisis de expresión de la NCS y BBE en plantas maduras de Argemone mexicana. A) acumulación de sanguinarina y berberina. Las barras representan las medias ± DE de tres experimentos independientes. Las letras (mayúsculas: sanguinarina; minúsculas: berberina) señalan diferencias significativas entre medias (ANOVA P < 0.001). B) expresión de mensajeros de la NCS y BBE por RT­PCR. La actina se utilizó como control de carga y amplificación. Abreviaturas: C, cápsula; T, tallo; H, hoja; R, raíz; Si, semilla inmadura; B, brote floral; Sm, semilla madura.

105

Es interesante hacer notar que en algunos casos se observaron diferencias entre el nivel de acumulación de alcaloides (Fig. 4.1 OA) y el nivel de expresión tanto ncs como de la bbe. Por ejemplo, las cápsulas, que mostraron el menor contenido de alcaloides (solamente bajas cantidades de berberina; Fig. 4.1 OA), tuvieron un alto nivel de expresión de ambos genes (Fig. 4.1 08). Por otra parte, las raíces, que acumulan la mayor cantidad de alcaloides (Fig. 4.1 OA), fue el tejido con la menor expresión de bbe (Fig. 4.1 08). De este modo, aunque la raíz parece ser el principal productor de alcaloides, es posible que los intermediarios hasta (S)­escoulerina, el producto de la 88E (Fig. 1.3), no sean formados únicamente en este tejido, sino que también se importen de otros, como sucede en P. somniferum (Steffens et al., 1985; Facchini et al. , 1996). Por otro lado, también es posible que en el estado de desarrollo en que se encontraban las raíces analizadas no fuera el de mayor expresión de estos genes (Huang y Kutchan, 2000; Facchini, 2001 ). Es importante tener presente que las rutas biosintéticas tanto de la sanguinarina, como de la berberina involucran numerosos pasos enzimáticos (alrededor de seis reacciones) que aún faltan por ser analizados (Fig. 1.3; 1 .4 ).

Los diferentes niveles de regulación (bioquímicos, moleculares y celulares) pueden afectar la síntesis de los alcaloides y explicar las diferencias observadas entre la expresión génica y la acumulación de A81s en algunos tejidos (Fig. 4.1 O). Complejos mecanismos regulatorios operan sobre la síntesis de alcaloides en las diferentes especies productoras de estos compuestos. Por ejemplo, en P. somniferum y T. flavum la NCS despliega una cooperatividad positiva en la que la unión de la dopamina facilita la unión del 4-HPAA (Samanani y Facchini, 2001, 2002). Sin embargo, estos resultados no concuerdan con el análisis estructural del sitio catalítico, por lo que es necesario un mayor estudio (llari et al. , 2008; 8erkner et al. , 2008). Por su parte, los factores ambientales y de desarrollo también pueden modificar el contenido de alcaloides. En dos cultivares de P.

106

somniferum, productores de ABis, se observó una expresión diferencial de bbe1 en los tejidos analizados (Facchini y Park, 2003).

Estas diferencias en los patrones de expresión no solo ocurren a nivel tisular, sino también celular. En T. flavum, la expresión máxima de la ncs se encuentra en el rizoma y el peciolo, pero estos tejidos no corresponden a los sitios de la actividad enzimática que se han localizado en la raíz, seguido del rizoma y por último en peciolo. Estos datos sugieren que la proteína con actividad de NCS es trasportada entre los diferentes tejidos (Samanani y Facchini , 2002). En este sentido, la NCS de T. favum presenta un péptido señal que podría funcionar como un péptido de tránsito (Samanani et al. , 2004).

La expresión y actividad de la BBE en la raíz, tallo y brotes de P. somniferum sugiere que intermediarios de la síntesis de sanguinarina pueden ser transportados desde la parte aérea a la raíz (Facchini, 2001 , Facchini y Park, 2003). De igual modo, la propia enzima puede ser transportada entre diferentes compartimentos celulares. Esto ha sido demostrado con la fusión del péptido señal de la BBE de P. somniferum con una proteína reportera, observando el trasporte de la misma al retículo endoplasmático y la vacuola (Bird y Facchi, 2001 ).

La complejidad celular involucrada en la síntesis de ABis ha quedado demostrada en los últimos años y se ha descrito que los. sitio de síntesis y el lugar de acumulación de los ABis puede variar en diferentes especies. Por ejemplo, en P. somniferum los alcaloides morfinanos y benzofenantridinas (morfina y sanguinarina) se localizan en las células laticíferas adyacentes a los tubos cribosos, mientras que los transcritos involucrados (6'0MT, CNMT, NMCH, 4'0MT, BBE, SAT, COR; Fig. 1.3) y las enzimas correspondientes se encuentran en la células acompañantes y en los tubos cribosos del floema, respectivamente (Samanani et al., 2006). Estos resultados sugieren que las proteínas con actividad enzimática son ensambladas en las células acompañantes y que posteriormente son transportadas a los tubos cribosos para la

107

síntesis de los alcaloides, que por último son acumulados en las células laticíferas (Samanani et al. , 2006). Por otro lado, en T. flavum los alcaloides de tipo protoberberina (berberina) se localizan en la endodermis de la raíz y en la corteza y medula del tallo, mientras que los transcritos para TYDC, NCS, 6'0MT, CNMT, 4 '0MT, BBE, SOMT se encuentran en la endodermis inmadura de la raíz y en la protodermis de los primordios florales del rizoma (Samanani et al., 2005).

En A. mexicana, la localización por fluorescencia de los alcaloides de tipo benzofenantridina y protoberberinas en la raíz y tallo, muestra que estos compuestos se acumulan en el periciclo y en la endodermis de la raíz, mientras que en el tallo se observan principalmente en el tejido vascular, seguido de células en la corteza y en la endodermis (Fig. S3, datos complementarios). Ahora bien, PCR in situ de los mensajeros correspondientes a la NCS (NCSAm1 y NCSAm2) y BBE (BBEAm1 y BBEAm2) sugieren que los transcritos se encuentran en el periciclo de la raíz y en floema del tejido vascular del tallo (Rubio-Piña y Vázquez-Fiota, datos en preparación). Estos resultados en conjunto sugieren que los sitios de síntesis y acumulación de alcaloides están temporal y espacialmente separados y apuntan hacia una organización que implica un transporte intra e inter-celular de intermediarios, productos y enzimas biosintéticas.

De esta manera, considerando la estrecha relación filogenética encontrada entre las enzimas biosintéticas de los ABis en las diferentes especies analizada, (Fig 4.5; 4.6), la localización de estas mismas enzimas en diferentes tipos celulares en estas especies, sugiere que las rutas biosintéticas pudieron migrar completas, pero que adquirieron características regulatorias propias en las diferentes especies (Facchini y De Luca, 2008).

Finalmente, es interesante hacer notar el alto contenido de sanguinarina en la semilla madura. La presencia de este alcaloide podría explicarse como el trasporte de la raíz hacia las partes aéreas, a través del tejido vascular. No obstante, la síntesis de este alcaloide también podría ocurrir en otros

108

tejidos, como la propia cápsula o en la semilla durante su maduración. En este sentido, trabajos previos de nuestro laboratorio han reportado la ausencia de sanguinarina en el látex y en tallos de A. mexicana (Carrillo-Pech, 2006) al igual que en dos cultivares de P. somniferum (Frick et al., 2005). De este modo, es probable que los alcaloides detectados en la semilla no hayan sido transportados desde la raíz, sino que la cápsula haya participado en su formación, para que posteriormente, se acumulen en la semilla. La presencia de niveles importantes de los transcritos de NCS y BBE en las semillas inmaduras (Fig. 4.1 0), sugiere que este tejido tiene la capacidad de participar en la síntesis, al menos parcialmente, de este alcaloide. Como alternativa, intermediarios posteriores a la acción de la BBE, podrían ser transportados de la semilla inmadura hasta la cápsula en los que se llevarían los pasos subsiguientes. Es interesante notar que las enzimas, tanto anteriores como posteriores a la acción de la BBE, (4'0MT y SAT; Fig. 1.3 y 1.4), se han inmunolocalizado en los carpelos de cápsulas de P. somniferum, lo que indica que este tejido tiene una capacidad biosintética (Weid et al., 2004).

4.3.4.2. Análisis de la expresión de los mensajeros de plántulas en desarrollo (post-emergencia)

Durante el desarrollo de plántulas de P. somniferum, ocurre un incremento en la acumulación de ABis (Huang y Kutchan, 2000; Facchini y Park, 2003). Con el fin de conocer los patrones de síntesis de alcaloides en plántulas de A. mexicana, se realizó un análisis temporal, durante 21 días de desarrollo post-emergencia de plántulas (Fig. 4.11; 4.12). Se debe mencionar que, en las condiciones ensayadas, fueron necesarias cuatro semanas antes de la emergencia de la radícula.

El análisis cromatográfico de extractos obtenidos de las plántulas completas, mostró la presencia de sanguinarina desde los primeros días después de la emergencia de las radículas. Este alcaloide se mantuvo en niveles altos, cercanos

109,

a los 3.6 mg g-1 PS durante los primeros 6 días (Fig. 4.11A). Posterior a éste, se observó una ligera disminución (3.0 mg g-1

PS) al día 15, para aumentar nuevamente. En contraste, la presencia de berberina, en niveles de 0.45 mg g-1 PS, sólo de observó hasta 18 días después del inicio del experimento (Fig. 4.11 A). La aparición de la berberina y la disminución de la sanguinarina, estuvo asociada con la elongación del hipocotilo y el desarrollo de la parte aérea. En plántulas de P. somniferum también ocurre un cambio en el patrón de acumulación de A81s durante los primeros 20 días de desarrollo (Huang y Kutchan, 2000).

Los transcritos correspondientes a las dos NCS (NCSAm1 y NCSAm2), así como de las dos 88E (88EAm1 y 88EAm2) se mantuvieron elevados durante los primeros 6 días (Fig. 4.118). Al noveno día, se observó un cambio interesante ya que solamente se pudieron detectar los transcritos correspondientes a la NCSAm2 de manera abundante (Fig. 4.118). Sin embargo, al día 12, junto con la emergencia de los cotiledones (Fig. 4.118, panel superior) nuevamente se pudieron detectar los cuatro transcritos analizados (Fig. 4.118, panel inferior). La amplificación de la actina fue utilizada como control de carga y amplificación, lo que sugiere que estos resultados no son producto de un artefacto y confirman la disminución diferencial de los transcritos detectada al noveno día (Fig. 4.118). De igual forma, se realizó la amplificación combinada de la 88EAm2 y actina, así como del gen correspondiente al ARN ribosomal 18s, corroborando estos resultados (Fig. S4, datos complementarios).

La disminución del contenido de sanguinarina entre los días 6 y 15, además del desarrollo de la parte aérea de las plántulas, puede estar asociadas con los niveles bajos de expresión de la NCS y 88E al día 9 (Fig. 4.11 ). En este sentido, la variación de la acumulación de alcaloides y los transcritos son consistentes con lo reportado en plántulas de P. somniferum (20 días después de la germinación) donde se ha demostrado que ocurren cambios en el contenido de alcaloides conforme

110

aumenta el desarrollo (Facchini y Park, 2003; Samanani et al., 2006). De igual modo, en P. somniferum, la acumulación de los transcritos precede a la presencia de enzimas biosintéticas de ABis, donde la máxima acumulación de estas se encuentra al día 7 manteniéndose hasta el día 16 (Samanani et al. , 2006).

Para profundizar estos resultados, se realizó otro análisis con plántulas en etapas más avanzadas, con los cotiledones abiertos. Para esto, las plántulas fueron separadas en radículas y parte aérea (hipocótilos y cotiledones) y se analizó la acumulación de alcaloides en ambas partes (Fig. 4.12A).

En estas etapas, se pudo detectar la acumulación de berberina, tanto en la parte aérea como en la radícula. Conforme las plántulas se desarrollaron aumentó la acumulación de los dos alcaloides analizados (Fig. 4.12A). Estos aumentos coincidieron con la expansión de los cotiledones y la formación del primer par de hojas verdaderas (Fig. 4.128). Es interesante hacer notar que, aunque la berberina se distribuyó por toda la plántula, la acumulación fue mayor en las partes aéreas. Por su parte, la sanguinarina solo se detectó en la radícula (Fig. 4.12A).

111

A 4.0

B

NCSAm1

NCSAm2

BBEAm1

BBEAm2

Actlna

c:::J s~neu in;or in~

-llerber ín ~

1Z 15

Días después de la cerminación

3 6 9 12 15

18

18 - - - - ------- -..-----·-·- - -· .

--- ----------Figura 4.11. Acumulación de ABis y análisis de expresión de la NCS y BBE después de la germinación de semillas de Argemone mexicana. A) acumulación de sanguinarina y berberina. Las barras representan las medias ± DE de tres experimentos independientes. Las letras (minúsculas: sanguinarina) señalan diferencias significativas entre medias (ANOVA P < 0.001 ). El análisis se realizó de 1 a 18 días después que la radícula emergió. B) expresión de mensajeros de la NCS y BBE por RT-PCR. La actina se utilizó como control de carga y amplificación.

112

En estas plántulas, los transcritos correspondientes a la NCS y 88E mostraron un comportamiento similar al previamente detectado (Fig. 4.11 8). Se mantuvieron elevados durante los primeros 7 días, disminuyendo al día 14, para aumentar de nuevo más tarde (Fig. 4.128). La amplificación de la actina fue utilizada como control de carga y amplificación, lo que sugiere que estos resultados no son producto de un artefacto, como se comentó anteriormente (complementarios Fig. S4 y 4.11 8). Cabe mencionar que solamente la NCSAm2 se logró detectar al día 14. De este modo, entre los transcritos analizados, solamente la NCSAm2 parece mantener sus niveles de expresión constantes, independientemente del estado de desarrollo de las plántulas (Fig. 4.11 8 y 4.128). No obstante, el posible significado fisiológico de este comportamiento aún no puede ser establecido. La síntesis de alcaloides en otras especies, como la de vindolina en plántulas en desarrollo de C. roseus muestra un comportamiento similar, ya que la actividad de la triptófano descarboxilasa (TDC) alcanza su máximo dentro de los primeros cinco días de germinación, desaparece para después volver a ser detectada, una vez que el primer par de hojas verdaderas ha emergido (Vázquez-Fiota y Miranda­Ham, 2006). Es de notar que al día 14 del análisis el primer par de hojas verdaderas está surgiendo (Fig. 4.12).

De esta manera, los resultados combinados de estos cursos temporales, sugieren que la síntesis de sanguinarina puede ocurrir completamente en la radícula, ya que este alcaloide se detectó desde muy temprano en las plántulas, antes del desarrollo de las partes aéreas (Fig. 4.11 ). Por su parte, la síntesis de berberina aparentemente requiere la participación de la parte aérea ya que solamente se pudo detectar en las plántulas una vez que los cotiledones se habían desarrollado (Fig. 4.11 y 4.12). Es interesante hacer notar que los niveles altos de sanguinarina, detectados durante estas etapas, no coinciden con lo observado en plántulas de P. somniferum, que, en fases tempranas del desarrollo, sólo acumulan bajas proporciones de este alcaloide, en comparación con los de tipo

113

morfina (Huang y Kutchan, 2000; Facchini et al., 1996, Facchini y Park., 2003). De este modo, nuestros datos sugieren que los primeros estadios de desarrollo de las plántulas de A. mexicana podrían estar dirigidos principalmente hacia la síntesis de sanguinarina, apareciendo la capacidad de síntesis de berberina en etapas tardías.

Por otro lado, también la acumulación de berberina, tanto en la parte aérea como en la radícula de las plántulas de Argemone mexicana, difiere de lo encontrado en otras Papaveraceas, ya que éstas no acumulan este alcaloide (Facchini, 2001 ). La berberina se acumula principalmente en plantas de las familias Berberidaceas y Ranunculaceas (Facchini , 2001 ). Sin embargo, los niveles de berberina y la acumulación de los transcritos de la NCS y BBE en las plantas de A. mexicana concuerdan con lo reportado para T. flavum, donde se observó la presencia de berberina y la expresión de los genes biosintéticos en toda la planta, siendo más abundantes en el rizoma (tallo modificado) (Samanani et al., 2002a; Samanani et al. , 2005).

114

A

B

4

~ 3

";' ... ... E 2

o

NCSAm1

NCSAm2

BBEAm1

BBEAm2

Actlna

4 7 14 21

4 7 14 21

1

~------- .. -· ----- -1

1 , __ .....,_ __ . __ .........,. Figura 4.12. Acumulación de ABis y análisis de expresión de la NCS y BBE en plantas en desarrollo de Argemone mexicana (post-emergencia). A) acumulación de sanguinarina y berberina. Las barras representan las medias ± DE de tres experimentos independientes. Las letras (mayúsculas: sanguinarina; minúsculas: berberina) señalan diferencias significativas entre medias (ANO VA P < 0.001 ). El análisis se realizó de 1 a 21 días después que las plántulas emergen 8) expresión de mensajeros de la NCS y BBE por RT-PCR. La actina se utilizó como control de carga y amplificación.

115

Trabajos previos de nuestro laboratorio han reportado niveles altos de berberina en el látex de A. mexicana alrededor del 6 mg g-1 PS (Carrillo-Pech, 2006). En este sentido, la localización de los ABis en el látex de las células laticíferas asociadas al tejido vascular de plantas y plántulas de P somniferum sugiere que estos alcaloides son transportados atreves del floema durante el desarrollo de la planta (Samanani et al., 2006). La localización de los alcaloides de tipo protoberberina en el haz vascular de los tallos y en el periciclo de la raíz en A. mexicana sugiere que la berberina es transportada a través del tejido vascular (Fig. S3, datos complementarios). De esta forma, es posible que la síntesis de la berberina en A. mexicana ocurra, al menos parcialmente en las partes aéreas, de donde podría movilizarse a la raíz. En este sentido, los sitios finales de síntesis y acumulación de este alcaloide en C. japónica y T. flavum pueden diferir, indicando la participación de sistemas de transporte (Yazaki et al. 2008). Más aún, los sitios de biosíntesis y de acumulación de los alcaloides de tipo protoberberina, están temporal y espacialmente separados en la raíz y el rizoma de C. japonica y T. f/avum (Fujiwara et al., 1993; Samanani et al., 2002).

4.4. CONCLUSIONES

Este estudio representa el primer análisis transcripcional y de acumulación de ABis en plantas de A. mexicana. El aislamiento y caracterización de dos isoformas tanto de la NCS como de la BBE nos sugiere familias génicas pequeñas que presentan motivos conservados con NCS y BBE de otras especies, como P. somniferum, E. californica y T. flavum. Sin embargo, la presencia de dos isoformas de la BBE de A. mexicana difiere de lo reportado en otras especies donde se describe solo una enzima funcional. La relación filogenética estrecha de la NCS y BBE con las enzimas correspondientes en especies productoras de ABis ha permitido agruparlas en un mismo ciado, sugiriendo un ancestro común.

116

El análisis de plántulas y plantas maduras mostró que las benzofenantridinas (sanguinarina) y protoberberinas (berberina) son los alcaloides mayoritarios y que se acumulan desde etapas muy tempranas. Además, se observaron cambios en el contenido de alcaloides conforme aumenta el desarrollo de la planta. Un considerable grado de coordinación de los transcritos correspondientes a las enzimas biosintéticas (NCS y BBE) y la acumulación de los alcaloides (sanguinarina y berberina) fue observado en plántulas y plantas maduras de A. mexicana. Así, la expresión de la NCS y BBE mostró una relación en general con la acumulación de los alcaloides. No obstante, también se observaron algunas discrepancias. Por ejemplo, la acumulación elevada de los alcaloides en la raíz difiere de los los niveles bajos de expresión detectados para la BBE (BBEAm1 y BBEAm2). Esto puede deberse a que existen diferentes niveles de regulación (moleculares, bioquímicos y celulares). En este sentido, la localización de las benzofenantridinas y protoberberinas, así como de los transcritos correspondientes a la NCS y BBE en distintos tipos celulares en la raíz y tallo, sugiere el transporte intra e ínter celular de intermediarios, productos y enzimas biosintéticas. Más aún, la diferencia temporal y espacial de los transcritos y alcaloides de A. mexicana indica la participación de mecanismos parcialmente conservados con respecto a otras especies (Papaveraceas y Ranunculaceas).

4.5. REFERENCIAS

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126

CAPÍTULO 5

EFECTO DEL JASMONATO DE METILO Y DEL ÁCIDO SALICÍLICO SOBRE LA EXPRESIÓN DE

LA NCS Y LA BBE EN SUSPENSIONES CELULARES DE Argemone mexicana

5.1. INTRODUCCIÓN

En su hábitat natural, las plantas frecuentemente están expuestas a condiciones que afectan su crecimiento y desarrollo. Estas condiciones pueden ser de origen biótico, impuesto por otros organismos, o abiótico, que se origina por un cambio físico o químico en el ambiente. Para responder a estas condiciones, las plantas desencadenan un amplio rango de reacciones que abarcan desde alteraciones de la expresión génica, metabolismo celular, hasta cambios en la tasa de crecimiento (Mahady et al., 1998). Entre estas respuestas, frecuentemente se incluye la activación de las rutas de biosíntesis de diversos metabolitos secundarios que pueden participar en la defensa química contra microorganismos o herbívoros (Schmeller et al., 1997). Dichas respuestas, involucran distintas líneas de acción. En algunas de éstas, todos los elementos necesarios se encuentran a nivel celular. Por ello, la aplicación de condiciones de estrés, tanto biótico como abiótico, a cultivos celulares in vitro se ha utilizado como estrategia para incrementar la producción de metabolitos secundarios. Esta estrategia se conoce como inducción.

La inducción de la biosíntesis de los alcaloides de tipo benzofenantridina se ha demostrado en cultivos celulares de Papaveraceas (P. somniferum, P. bracteatum, S. canadensis, y E. californica) los cuales acumulan sanguinarina en respuesta a la exposición a diferentes agentes, como los extractos fúngicos, ácido araquidónico y a las llamadas hormonas de estrés (lgatov et al., 1996; Schumacher et al. , 1987; Eilert et al., 1984; Gundlach et al., 1992). El proceso de inducción de la síntesis

127

de los alcaloides involucra incremento de la expresión génica y la actividad enzimática general. Así, las enzimas asociadas a microsomas, como la BBE, así como citosólicas como TYDC, NCS y DBOX son inducidas en respuesta a tratamientos específicos (Huang y Kutchan, 2000; Ziegler y Facchini, 2008). Por lo tanto, esta activación requiere de ciertos estímulos externos que deben ser transportados al interior celular. Recientemente, considerables progresos se han realizado en la identificación de proteínas involucradas en la percepción de señales, segundos mensajeros, así como de factores de transcripción involucrados en la síntesis de ABis (Li et al., 2006; Heinze et al. , 2007; Schwartze y Roos, 2008, Apuya et al. , 2008). En general, se ha establecido que la cadena de señalización de eventos relacionados con la inducción del metabolismo secundario incluyen la percepción del estímulo inicial en la membrana celular, la internalización de éste y la participación de mediadores químicos que conducen a la activación transcripcional. Entre estos mediadores se encuentran diferentes hormonas e intermediarios de cascadas de señalización bioquímica, como los jasmonatos (JAS) y el ácido salicílico (SA) (Zhao et al. , 2005). De este modo, la respuesta de defensa contra patógenos (acumulación de alcaloides) puede ser simulada mediante la administración exógena de estos compuestos, permitiendo analizar su función como señal.

Tanto el SA como los JAS han sido empleados para el análisis de diferentes procesos de regulación en la inducción de los alcaloides benzofenantridina (Facchini, 2001 ; Farber et al. , 2003 Cho et al. , 2007). Así, en los últimos años se ha logrado demostrar que la inducción de la biosíntesis de sanguinarina en cultivos de E. californica está mediada por los JAS y por la acidificación del citosol , con la participación de dos posibles rutas de señalización independientes (Roos et al., 2006). Por su parte, el SA se ha utilizado menos para inducir la síntesis de los ABis. En cultivos de E. californica produce la acumulación de sanguinarina promoviendo la actividad de las enzimas

128

biosintéticas (lgnatov et al., 1996; Cho et al., 2007), lo que sugiere podría actuar como molécula señal incrementando la expresión génica de estas enzimas. En general, la capacidad del SA para inducir la síntesis de los ABis es menor de lo reportado para los JAS, sugiriendo que estos dos compuestos actúan mediante mecanismos diferentes (Cho et al., 2008). Por su parte, la aplicación de JAS a cultivos de P. somniferum no conduce a la acumulación de sanguinarina, aunque sí activa la transcripción de algunos genes biosintéticos, proponiendo que esta molécula actúa como señal solamente para algunos de los pasos biosintéticos (Facchini et al., 1996a; 1996b ).

El objetivo de este capítulo es evaluar el efecto del jasmonato de metilo (MEJA) y del ácido salicílico (SA) sobre la síntesis de sanguinarina y la expresión génica de la norcoclaurina sintasa (NCS) y la enzima formadora def puente de la berberina (BBE) que son dos de las enzimas propuestas como puntos regulatorios para la síntesis de ABis (Fig. 1.3).

5.2 MATERIALES Y MÉTODOS

5.2.1. Material biológico

Las suspensiones celulares que se utilizaron corresponden a la línea AmMiF y fueron inducidas a partir de callos friables de hoja y se han mantenido en medio PC (Phillips y Collins, 1979), a pH 5.5, adicionado con 25 g/L de sacarosa y con 1.5 mg/L de ácido naftalénacetico (ANA) y 0,. 5 mg/L de 6-bencilaminopurina (BAP) en condiciones de cuarto de cultivo a 25°C y bajo luz continua entre 40 y 50 ¡.Jmol m·2 s·1 (lámparas fluorescentes de 39 W), con una agitación continúa de 100 rpm (Campos­Tamayo, 2002).

5.2.2. Extracción de ARN

La extracción del ARN total se realizó a partir de 1 g (PF) de células, molidas en presencia de N2 líquido, con el reactivo

129

Trizol, de acuerdo a las modificaciones publicadas por Rubio­Piña y Vázquez-Fiota, (2008).

5.2.3. Análisis de la acumulación de los transcritos para NCS y BBE por hibridación tipo northern.

El análisis tipo northern blot se realizó utilizando 15 IJg de ARN total de los diferentes tejidos y tratamientos utilizados (Rubio­Piña y Vázquez-Fiota, 2008). El ARN fue fraccionado en un gel desnaturalizante de agarosa al 1% con formaldehído al 15%, utilizando MOPS 20 mM como amortiguador (MOPS es ácido 3-(morfolino) propanosulfónico ), 50 mM acetato de sodio, 1 O mM EDTA, pH7). La separación electroforética se llevó a cabo empleando 50 V durante 4 h (Sambrook et al., 1989). Posteriormente, el ARN se transfirió por capilaridad a una membrana de Nylon N+ (Amersham) usando SSC 20X (SSC 1X es 8.7 g de citrato de sodio y 1 g de cloruro de sodio, pH 7) y se fijó a la membrana usando un Stratalinker UV Crosslinker 2400 (Stratagene, La Jolla, CA). Como sonda se utilizaron las clonas NCSAm1 (340 pb) y BBEAm1 (1260) marcadas con digoxigenina (ver Capítulo 4). El marcado de la sonda se llevó a cabo por PCR. Para la hibridación, las membranas fueron incubadas con las sondas a 42° C durante 24 h en una solución Dig easy hyb, de acuerdo a las instrucciones del proveedor (Roche Applied Science). Después de la hibridación, las membranas se lavaron dos veces en SSC 1 X con SOS 0.1% a temperatura ambiente por 5 min, y dos veces con 0.5X SSC con 0.1% SOS a 65°C por 15 m in. La detección se realizó usando el paquete Dig Juminescent Detection Kit (Roche Applied Science) según las instrucciones del fabricante.

5.2.4. Inducción de la síntesis de alcaloides en cultivos in vitro de Argemone mexicana

Estos experimentos se realizaron en dos etapas. La primera de ellas fue un análisis dosis-respuesta evaluando un tiempo fijo de 24 h para los cultivos celulares expuestos tanto a jasmonato

130

de metilo (MEJA) como ácido salicílico (SA) (ambos de Sigma­Aidrich Chemical Co). Para esto, se utilizaron cultivos de 10 días después del sub-cultivo que fueron expuestos a tratamientos con O (testigo), 100, 250 y 500 IJM de cada inductor. Los testigos recibieron los disolventes correspondientes (HzO y ETOH para SA y MEJA, respectivamente). Una vez transcurrido el tiempo del tratamiento, los cultivos fueron cosechados por filtración y almacenados a -aooc hasta su análisis. Estos experimentos permitirían definir la concentración óptima para la inducción. La segunda etapa consistió en utilizar la concentración a la cual el inductor produjo el aumento máximo en la acumulación de alcaloides. En este caso, se realizó un curso temporal aplicando dicha concentración a cultivos de la misma edad durante un periodo máximo de 120 h. Las muestras se colectaron a las O, 6, 12, 24, 48, 72, 96 y 120 h. Los cultivos fueron cosechados por filtración y almacenados a -aooc hasta su análisis.

5.2.5. Extracción, identificación y cuantificación de_ alcaloides

Los alcaloides se obtuvieron mediante una extracción ácido­base de acuerdo a la metodología descrita por Monforte­González et al., (1992), con algunas modificaciones. Brevemente, (100-200 mg) de tejido liofilizado fue homogenizado en 15 mi de metano!: HCI 5% (v/v) e incubado a 45°C, con agitación durante 2 h. Después de este tiempo el extracto fue centrifugado, tomando 500 !JI de la suspensión y evaporando a sequedad a presión reducida. El residuo se resuspendió en 100 !JI de metano l. La separación de los alcaloides se realizó mediante cromatografía de capa delgada utilizando placas de sílice ( cromatofolios de gel de sílice 60Fzs4. Merck), utilizando los diferentes sistemas reportados (Carrillo­Pech, 2006). Para la identificación de los alcaloides separados se utilizaron estándares de berberina y sanguinarina (Sigma­Aidrich Chemical Co ). La cuantificación de los alcaloides se

131

realizó por densitometría in situ sobre placas cromatográficas, utilizando el método de estándar externo y un densitómetro Shimadzu CS-930 equipado con un graficador (DR-2). Las lecturas en el densitómetro se hicieron por barrido lineal de cada carril y la concentración se determinó comparando el área del pico de las muestras contra el área de los picos obtenida aplicando concentraciones conocidas de los estándares. Los alcaloides fueron detectados por fluorescencia a una longitud de onda (,\) de 300 nm (Carrillo-Pech, 2006).

5.2.6. Análisis estadístico

Los datos del contenido de alcaloides (mg) fueron estandarizados con el peso seco del tejido vegetal extraído, utilizando el programa Microsoft Excel 2007 (Microsoft, Redmond, WA, USA). Los gráficos fueron elaborados utilizando el programa SigmaPiot v.1 O (Systat Software lnc. , San Jose, CA, USA). Se analizó la diferencia de medias de los contenidos de alcaloides entre tejidos y tratamientos mediante el análisis de varianzas (ANOVA de una vía) con la prueba de comparación de Holm-Sidak, utilizando el programa SigmaStat v. 3.1 (Systat Software lnc., San Jose, CA, USA).

5.3 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Las suspensiones celulares se obtuvieron a partir de callos friables, previamente obtenidos de hoja (Campos-Tamayo, 2002). El cultivo presentó una fase de adaptación hasta el quinto día y posteriormente se observó una ganancia de peso seco, con un crecimiento continuo y con una acumulación de sanguinarina de alrededor de 0.5 mg/g PS durante el ciclo de cultivo (Fig. 5.1 ). La capacidad de la suspensión para producir este alcaloide, sin ser expuesta a condiciones de inducción, contrasta con lo reportado para otros cultivos celulares de Papaveraceas, que solamente lo hacen en respuesta a la exposición a ciertos agentes (Eilert et al., 1986; Schumancher et al., 1987; Mahady y Beecher, 1994; Cline y Coscia, 1988).

132

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Tiempo (dlas)

Figura 5.1. Curva de crecimiento y acumulación de sanguinarina de la suspensión celular AmMiF de A mexicana durante un ciclo de cultivo.

El efecto inductivo de MEJA y SA es dependiente de la fase de crecimiento en la que se encuentra un cultivo celular. Esto quedó demostrado al cuantificar el contenido de alcaloides totales en suspensiones celulares de E. californica al ser inducidas con MEJA y SA observando que la máxima respuesta de inducción fue dada en los primeros días de la fase exponencial de crecimiento (Cho et al., 2007). Esta respuesta es similar en cultivos de Catharanthus roseus y Taxus canadensis (Ketchum et al. , 1999).

Con base en lo anterior se evaluaron los efectos de MEJA y SA sobre la acumulación de sanguinarina en suspensiones celulares de A. mexicana a los 1 O días de cultivo, que es alrededor del inicio de la fase de crecimiento exponencial (Fig. 5.1A). Para ello, se realizó un primer experimento de dosis­respuesta utilizando la línea AmMiF. Los cultivos fueron expuestos a distintas concentraciones de cada inductor (MEJA y SA) durante 24 h, tiempo al que fueron cosechados y analizados (Fig. 5.2). No se observaron cambios aparentes en el aspecto entre el testigo y los cultivos tratados con ambos inductores. En cuanto a la acumulación de alcaloides, no se detectaron aumentos significativos, sin embargo, el tratamiento de 100 ~M de MEJA produjo apenas un aumento de 20% de sanguinarina con respecto al control (Fig. 5.2A). Por su parte,

133

30

en los cultivos expuestos a las concentraciones mayores de MEJA y SA (250 y 500 !JM), el contenido de alcaloides se redujo en comparación con los testigos (Fig. 5.2).

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Figura 5.2. Acumulación de sanguinarina en suspensiones celulares de A. mexicana expuestas a jasmonato de metilo (A) y ácido salicílico (8). Las suspensiones fueron tratadas con O, 100 IJM, 250 IJM y 500 IJM de MEJA y SA durante 24 h. Las barras representan las medias ± DE de tres experimentos independientes. Las letras (minúsculas: sanguinarina) señalan diferencias significativas entre medias (ANOVA P < 0.001 ).

En cultivos de E. californica y S. canadensis se ha observado que la exposición a concentraciones de 100 1-1M de MEJA durante un curso temporal de 136 h, produce la acumulación de sanguinarina a partir de 6 h de tratamiento y continua aumentando a lo largo del experimento (Gündlach et al., 1992; Farber et al., 2003). No obstante, en estos cultivos solamente se detectaron trazas del alcaloide antes de la inducción, a diferencia de la línea AmMiF de A. mexicana, la cual tiene niveles importantes de sanguinarina en condiciones de mantenimiento. De este modo, es posible que la baja respuesta de la línea AmMiF se deba a que en ausencia de un estímulo externo, es capaz de mantener un metabolismo activo para los alcaloides.

134

Con el fin de confirmar esto, se analizaron diferentes tiempos de exposición, hasta las 120 h, utili:z;ando 100 ~M de ambos inductores (Fig. 5.3). Las condiciones fueron similares a las anteriores y se incluyeron cultivos expuestos a etanol (ETOH) y agua (H20) como testigos. En estas condiciones se observaron efectos mínimos sobre el crecimiento de los cultivos (datos no mostrados). No obstante, la exposición a 100 ~M de MEJA produjo la inducción de sanguinarina, alcanzando una acumulación máxima de 2.15 mg g·1 PS después de las 48 h (Fig. 5.3A). Estos valores son aproximadamente el doble del contenido de los cultivos, antes de ser expuestos al inductor. Estas cantidades se encuentran entre las max1mas concentraciones reportadas para cultivos inducidos de E. californica, P. somniferum y S. canadensis (Gundlach et al., 1992; Eilert et al., 1985; Mahady et al. , 1998). Por el contrario, los cultivos expuestos a 100 ~M de SA presentaron cambios en la acumulación de sanguinarina sólo después de las 72 h con respecto a los testigos (Fig. 5.3A) y en menor medida que en los cultivos expuestos a MEJA. Esto es similar a lo encontrado en cultivos de E. californica y S. canadienses (lgnatov et al. , 1996, Cho et al., 2007). El bajo nivel de inducción producido por este compuesto, sugiere que posiblemente se deba a un efecto indirecto.

135

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o 6 12 24 48 72 96

o 6 120

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111 - ----·-----....... ..,._. ...... ._... ...... ~,.... ...... ---Figura 5.3. Acumulación de sanguinarina y análisis de expresión de la NCS y BBE en suspensiones celulares de Argemone mexicana inducidas con jasmonato de metilo y ácido salicílico. A) Cuantificación de sanguinarina. Las barras representan las medias ± DE de tres experimentos independientes. Un asterisco (sanguinarina) señala diferencias significativas entre medias (ANOVA P < 0.001 ). B) expresión de mensajeros para NCS y BBE. Las suspensiones fueron tratadas con 100 1-1M de MEJA y SA durante 120 hr. Los transcritos fueron detectados por northern blot, utilizando sondas marcadas con digoxigenina. El ARN ribosomal se utilizó como control de carga.

Los niveles de los transcritos para NCS y BBE fueron consistentes con la acumulación de sanguinarina, ya que en los cultivos expuestos a MEJA se observó un aumento de éstos (Fig. 5.3). Por otro lado, ocurrió una diferencia en los patrones de expresión de estos genes. Los transcritos para la NCS mostraron su nivel máximo entre las 24 y 96 h, mientras que los de la BBE los alcanzaron desde las 6 h, para disminuir

136

posteriormente. Estos patrones son similares a los obtenidos en otros sistemas (Dittrich y Kutchan, 1991; Kutchan y Zenk, 1993), si bien no de la misma magnitud. Se observó un ligero aumento en los niveles de los transcritos de la NCS y BBE entre las 12 y 48 · h en los cultivos expuestos a S A. Este lígero aumento coincidió con el también ligero aumento en el contenido de sanguinarina a las 72 h (Fig. 5.3). Los testigos por su parte, no presentaron aumento en los transcritos, a lo largo del experimento.

En conjunto, estos resultados indican que MEJA fue capaz de producir la inducción de la síntesis de sanguinarina, causando la activación transcripcional de genes relacionados con este alcaloide. El SA por su parte, también parece tener un efecto sobre la síntesis de este alcaloide. Sin embargo, esta molécula señal parece estar involucrada principalmente con otros mecanismos de defensa, como la resistencia sistema adquirida (SAR) (Zhao et al., 2005). Por otro lado, los niveles de los transcritos detectados (NCS y BBE) en los testigos a lo largo del curso temporal, son consistentes con la acumulación de sanguinarina en los cultivos aun en condiciones de mantenimiento (Fig. 5.1; 5.3). En este sentido, la presencia de los transcritos correspondientes a enzimas biosintéticas de ABis en cultivos de A. mexicana bajo estas condiciones difiere de lo reportado en P somniferum y E. californica, donde la presencia de estos genes es nula y se requiere la aplicación de un estímulo (Haider et al., 1997; Facchini y Park 2003).

Algunos cultivos responden de manera diferencial a los tratamientos de inducción que promueven la acumulación de sanguinarina. Así, en E. californica, MEJA puede inducir la acumulación del alcaloide mientras que en P. somniferum, no lo pueden hacer, aunque éstos sí responden a los homogenados fúngicos (Farber et al., 2003, Gundlach et al., 1992; Facchini et al., 1996a; 1996b). De igual forma, en cultivos de E. californica y S. canadiensis el SA logró inducir la síntesis de ABis sin embargo, la respuesta fue menor comparada con MEJA (Cho et al. , 2007; lgnatov et al., 1996). La combinación

137

de SA y MEJA tiene un efecto sinérgico sobre la síntesis de sanguinarina en cultivos de E. californica, en los que se propone que la combinación de inductores afecta distintas rutas de señalización (Cho et al. , 2007). La combinación de resultados sugiere que los cultivos de A. mexicana conservan, al menos parcialmente, el mecanismo de inducción por MEJA. No así el mecanismo en que participa SA. La inducción de la biosíntesis de ABis en cultivos de E. californica ocurre a concentraciones de 0.2 a 1 ¡.Jg/ml extracto de levadura. Esta concentración es menor que el umbral requerido para estimular los eventos asociados a la respuesta hipersensible (Roos et al., 1999). De esta manera, dicho aumento en la síntesis de alcaloides parece relacionado con una acidificación del citosol, estableciendo dos posibles rutas de señalización que no relacionan directamente al SA (Roos et al. , 1998).

Por su parte, análisis de los promotores de la TYDC y BBE de P. somniferum y E. californica han mostrado secuencias conservadas, que son necesarias para su activación coordinada durante la inducción (Park et al., 1999; Hauschild et al. , 1998). Además, se ha descrito la existencia de un regulador transcripcional común (WRK1) que podría controlar la expresión de múltiples genes de la síntesis de berberina en cultivos de C. japonica (Kato et al., 2007). Esto podría sugerir la existencia de secuencias y factores de transcripción maestros, como ocurre para la síntesis de alcaloides del tipo monoterpén­indólicos de Catharanthus roseus (Van der fits y Memelink J, 2000). En este sentido, los factores de transcripción pueden influir en la expresión de varios genes relacionados en una ruta de síntesis aumentando el flujo hacia un metabolito determinado.

5.4. CONCLUSIONES

Los cultivos in vitro son un modelo ventajoso para el estudio de la biosíntesis de metabolitos, los cuales permiten analizar los factores que participan en una vía de señalización. El establecimiento de suspensiones celulares de A. mexicana,

138

permitieron el estudio de la producción de alcaloides de tipo benzofenantridina y de las moléculas que podrían participar como segundos mensajeros en el proceso. La línea AmMiF de células en suspensión de A. mexicana acumula sanguinarina en condiciones de mantenimiento y esto podría estar asociado con la presencia de los transcritos de la NCS y BBE. Esto difiere de lo reportado para las suspensiones de P. somniferum y E. californica, las cuales acumulan este alcaloide sólo después de haber sido inducidas.

Por su parte, los compuestos relacionados con rutas de señalización (como MEJA y SA) presentaron un efecto diferencial en la acumulación de sanguinarina y de los mensajeros analizados. Los resultados sugieren que MEJA estimula la producción de sanguinarina, lo cual fue confirmado por incremento en la expresión de los genes correspondientes a las enzimas biosintéticas NCS y BBE. Sin embargo la forma de acción de MEJA no ha sido detallada, aunque requiere la acumulación de los transcritos para la NCS y la BBE. En este sentido, aún falta por descubrir cuáles son los eventos que participan desde la percepción del estímulo en la membrana celular y los factores transcripcionales que están involucrados en la síntesis de ABis.

5.5. REFERENCIAS

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144

CAPÍTULO 6

DISCUSIÓN GENERAL Y PERSPECTIVAS

Se estima que aproximadamente el 20% de las especies de plantas superiores producen alcaloides y estos compuestos presentan una enorme diversidad estructural, a pesar de que son prácticamente derivados de un número limitado de aminoácidos (Buchanan et al., 2000). Desde el descubrimiento de la morfina en 1806, se ha establecido la estructura y actividad biológica para más de 12,000 alcaloides (Facchini, 2001 ). En términos generales, se conocen las rutas de síntesis para algunos alcaloides de relevancia, como la morfina, la nicotina y la vinblastina, entre otros. En consecuencia, muchas de las enzimas que intervienen en estos procesos han sido identificadas, aisladas, caracterizadas y en muchos casos clonadas. No obstante, muchas de estas rutas biosintéticas siguen estando incompletas y la comprensión de los mecanismos que controlan el inicio y el flujo de la biosíntesis de los alcaloides es relativamente escasa, debido a que las plantas que los producen son, en muchos casos, silvestres, y por lo tanto, de acceso limitado temporal o geográficamente. Sin embargo, en el caso de los alcaloides, muchas rutas comparten similitudes, dentro de una misma familia taxonómica (Wink, 2003). Esto permite aplicar el conocimiento que ya se tiene en una especie para el análisis en otra. Tal es el caso entre A. mexicana y P. somniferum, ya que ambas pertenecen a la familia Papaveraceas. No obstante, estas dos especies se han desarrollado en hábitats diferentes, A. mexicana es originaria de América y se considera una planta silvestre, mientras que P. somniferum es nativa del oriente medio y ha sido sujeta al mejoramiento para la producción de morfina.

A. mexicana es una planta capaz de sintetizar ABis que han sido utilizados para el tratamiento de diferentes afecciones. En las zonas rurales, su uso aún se recomienda para el tratamiento de malaria, infecciones cutáneas y dolor en general

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(Willcox et al. 2007, Sánchez-Mendoza et al. 2008). No obstante, a pesar de que se conoce gran parte de su composición química, así como los efectos farmacológicos de los alcaloides que contiene, poco se sabe del proceso que involucra el balance entre la capacidad de síntesis y degradación de los mismos (Lozoya y Lozoya, 1982). El interés de este trabajo estuvo centrado en proporcionar las bases para realizar estudios moleculares que nos permitan entender el proceso de síntesis de los ABis en una planta de importancia en la medicina tradicional mexicana, con el fin de establecer el conocimiento que nos permita proponerla como un modelo de estudio para el uso adecuado de A. mexicana como fuente de compuestos médicos.

Argemone mexicana expresa dos transcritos de NCS y BBE

La elucidación de las rutas de síntesis de los alcaloides se ha enfrentado a muchas dificultades, principalmente por la concentración baja de las enzimas, la limitada disponibilidad de sustratos o cofactores para el desarrollo de ensayos enzimáticos y porque estos compuestos no son producidos por las plantas modelo empleadas par en estudios genómicos. De esta manera, los genes que codifican para estas enzimas se aislaron a través del conocimiento previo de las secuencias de péptidos determinada a partir de las enzimas purificadas. Una estrategia alternativa, es la clonación de genes de interés basados en la homología con secuencias reportadas previamente (Hashimoto y Y amada, 2003).

Siguiendo esta estrategia, se diseñaron cebadores basados en dominios conservados para secuencias previamente reportadas, en P. somniferum, E. californica y T. f/avum, para las enzimas norcoclaurina sintasa (NCS) que sintetiza la (S)­norcoclaurina, el primer precursor central de los ABis y la enzima formadora del puente de la berberina (BBE), que cata liza la formación de ( S)-escoulerina, punto de ramificación

146

de estos alcaloides (Fig. 1.3; 3.2). El empleo de la metodología de RT-PCR utilizando ARNm de raíz, nos permitió aislar fragmentos de ADNcs de 305 y 1125 pb correspondientes a la NCS y BBE respectivamente (Fig 3.4; 3.6). Estas secuencias, tuvieron una identidad alta con las reportadas para otras especies productoras de ABis, en base a estas se diseñaron cebadores que permitieron la amplificación de los ADNcs completos (extremos 5, y 3 ') de la NCS y BBE utilizando la metodología RACE (Fig. 3. 7). Con las secuencias de A. mexicana, se lograron identificar dos isoformas de la NCS de 1035 y 927 pb llamadas NCSAm1 y NCSAm2, respectivamente. El marco de lectura abierta correspondiente es de 275 y 220 residuos (Fig. 3.9; Capitulo 4). De igual modo, se aislaron dos isoformas de la BBE de 1771 y 1718 pb denominadas BBEAm1 y BBEAm2, respectivamente. El marco de lectura abierta correspondiente es de 554 y 536 residuos (Fig. 3.11; Capítulo 4).

En estas secuencias se identificaron todas las regiones regulatorias características de las NCS y BBE reportadas (Figs. 4.1 y 4.3). Así, la comparación de la secuencia de aminoácidos de las NCS de Argemone, reveló de un 50 a 75 % de identidad con las de P. somniferum (Cuadro 4.3). De igual forma, se observó homología con proteínas relacionadas con patogénesis PR-1 O y alergénicas Bet-v1.

Por su parte, las secuencias de la BBE mostraron entre el 60 y el 75 % de identidad con las de P. somniferum, E. californica, B. stolonifera y T. f/avum (Cuadro 4.4). Más aun, de acuerdo a su característica como flavoproteínas, las BBE aisladas presentaron homología para diversas proteínas dependientes de FAD.

147

Un origen monofilético para la NCS y la BBE de Argemone mexicana

Un análisis filogenético, utilizando en cada caso más de 25 secuencias, sugirió un origen evolutivo monofilético, tanto para las NCS y BBE de A. mexicana, debido a que la topología de los ciados correlacionó con las de P. somniferum, E. californica, B. stolonifera y T. flavum (Figs. 4.5 y 4.6). Estos resultados han sido reportados por Liscombe et al. (2005) en la caracterización de secuencias de la NCS y BBE de P. somniferum y así como con los de Samanani et al (2004) en T. flavum. En ambos casos se propuso un origen ancestral común. Se debe hacer notar que las secuencias de la NCS mostraron relación con proteínas de defensa (Fig. 4.2), mientras que las BBE mostraron similitud con distintas proteínas dependientes de FAD (Fig. 4.4) lo cual sugiere que la actividad de estas dos enzimas es el resultado de la transformación de un carácter ancestral.

En este sentido, es interesante notar que el tratamiento con jasmonato de metilo en cultivos in vitro de A. mexicana promovió la acumulación de los transcritos de la NCS y BBE (Fig. 5.3), lo que sugiere que la relación entre éstas enzimas y las proteínas de defensa, no sería únicamente a nivel estructural, sino que podría incluir aspectos regulatorios. Es posible que la afinidad de algunas proteínas para interactuar con metabolitos secundarios específicos, así como con moléculas pequeñas, eventualmente haya conducido a la evolución de varias funciones, como la actividad de la NCS y BBE (Liscombe et al. , 2005). De igual forma, en el genoma de Arabidopsis thaliana se han encontrado secuencias con similitud con enzimas biosintéticas de ABis, que incluyen a la NCS, BBE y N-metiltransferasas, sugiriendo que la alteración de las rutas biosintéticas y de las enzimas que las forman, podría conducir a la inactivación o modificación de éstas (Facchini et al., 2004). Más aún, se ha propuesto la evolución de la ruta biosintética de los ABis a partir de distintas familias

148

de plantas, ya que se ha detectado la actividad de la NCS en especies que no acumulan estos alcaloides (Liscombe et al., 2005). De esta manera, se ha sugerido que mutaciones en genes que codifican para enzimas estructurales y reguladoras dio lugar a la inactivación de la vía en distintas especies. Tales cambios pudieron haber surgido como resultado de la alteración de células especializadas o por los cambios de las interacciones entre proteínas (Wink, 2003).

· Southern blots confirman que NCS y BBE forman pequeñas familias génicas

El uso de los ADNcs aislados como sondas moleculares permitió, determinar que en el genoma de A. mexicana se encuentra un número reducido de copias para tanto NCS como BBE (Fig. 4.8 y 4.9), probablemente dos en ambos casos, lo cual corresponde al número de distintas clonas aisladas (Fig. 4.1 y 4.3). Este resultado es similar a lo encontrado en P. somniferum, donde se ha identificado un número reducido de copias para el gen de la ncs y bbe (Facchini et al., 1996; Liscombe et al 2005). A diferencia de lo anterior, en E. californica y T. f/avum solamente se ha identificado una copia de cada gen (Ditrich y Kutchan, 1991; Samanani et al., 2005). Cabe mencionar que este es el primer reporte descrito de dos transcritos para la BBE que sugieren la presencia de dos genes transcripcionalmente activos en A. mexicana. Por su parte, en P. somniferum se han descrito tres secuencias genómicas que presuntamente codifican para la BBE (Facchini et al., 1996). No obstante, aparentemente sólo una de éstas es funcional. Posiblemente el proceso de selección al cual ha estado sujeta esta planta productora de morfina, ha llevado a que se mantenga sólo un gen de la bbe, lo que ha dado lugar a la inactivación de las demás isoformas redirigiendo la síntesis de los ABis hacia la síntesis del alcaloide de interés, en este caso la morfina (Fig. 1.3; 1. 5).

149

Expresión tejido específica de NCS y BBE

Uno de los objetivos de este trabajo fue la caracterización del contenido de alcaloides de la planta de A. mexicana y su relación con la expresión génica de enzimas biosintéticas (NCS y BBE). El análisis de los tejidos de plantas maduras demostró la presencia mayoritaria de dos alcaloides; sanguinarina y berberina (Fig. 4.1 O, 6.1A). La berberina se encontró presente en todos los tejidos, mientras que la sanguinarina sólo se detectó en raíz y semilla madura. La acumulación de mensajeros de la NCS y BBE mostró en general una relación con la presencia de los alcaloides (Fig. 4.1 0). Sin embargo, se pudo observar variación en los trascritos, principalmente en hoja, raíz y semilla inmadura (Fig. 4.8). Si bien existen reportes previos sobre el perfil de alcaloides de A. mexicana, se observaron diferencias cualitativas y semi-cuantitativas, que al parecer pueden estar relacionadas con las condiciones de los cultivares analizados (William y Schubert, 1961; lsrailov y Yunusov, 1986; Carrillo-Pech, 2006). En este sentido, el contenido de alcaloides de Chelidonium majus presenta variaciones que pueden ser debidas a la combinación de efecto de la luz y temperatura durante distintos días del año (Tome y Colombo, 1995). Estas variaciones podrían relacionarse con efectos sobre la síntesis y degradación de los alcaloides, más que a la traslocación. De igual modo, algunas enzimas que participan en la síntesis de alcaloides monoterpen-indólicos en Catharanthus roseus pueden ser reguladas por la luz, promoviendo cambios en la acumulación de los alcaloides (De Luca et al., 1988; De Luca y Laflamme, 2001).

150

0

Bcrbcrina

San¡uinarina

Sanguinarina

Figura 6.1. Esquema de la acumulación de alcaloides de tipo benzofenantridina (sanguinarina) y protoberberina (berberina) durante el desarrollo de plantas de Argemone mexicana. A) acumulación de berberina en todos los tejidos de la planta madura; la sanguinarina solo se detectó en la raíz y en semillas maduras. B) Posible participación del carpelo de la cápsula en la síntesis de berberina y sanguinarina durante la maduración de las semillas. C) Acumulación diferencial de los alcaloides durante la germinación y desarrollo de la parte aérea de plántulas. Las flechas indican el posible transporte de intermediarios y alcaloides en los diferentes tejidos de la plata.

Expresión de la NCS y BBE en plántulas en desarrollo

El análisis en plántulas en desarrollo y post-emergencia mostró cambios en la acumulación de alcaloides (Fig. 4.11; 4.12;

151

6.1 C). Las plántulas en desarrollo tienen la capacidad de producir sanguinarina, desde etapas muy tempranas. Sin embargo, la berberina solo fue detectada a partir del día 18, relacionándose con el desarrollo del tallo y los cotiledones (Fig. 4.11 ). Por su parte, las plántulas post-emergencia acumularon sanguinarina y berberina. El contenido de los alcaloides aumentó conforme al desarrollo de los tejidos de las plántulas (Fig. 4.12; 6.1A; 6.1C). Estos resultados se encuentran asociados con la presencia de los transcritos relacionados (NCS y BBE), los cuales se coordinan con la acumulación de los alcaloides.

La comparación entre los tejidos maduros y las plántulas permite observar que tanto la expresión de estos genes (NCS y BBE), como la acumulación de los alcaloides, se modificaron durante el desarrollo (Fig. 4.1 O; 4.11; 4.12; 6.1 ). Aunque la proporción de la planta es diferente, en general se observó un cambio en la acumulación de los ABis en ciertos tejidos. De igual modo, estudios en P. somniferum y C. roseus sugieren que la presencia de los alcaloides y la expresión de genes biosintéticos continua cambiando durante el desarrollo de las plantas (Facchini et al., 2003; Facchini y De Luca, 2008).

Los cultivos en suspensión de Argemone mexicana producen sanguinarina, pero no berberina

Finalmente, se logró desarrollar un sistema in vitro de suspensiones celulares, en los cuales se pudo identificar la presencia de sanguinarina (0.5 mg g-1 PS), pero no de berberina, la cual sí se encontró en los tejidos de la planta (Fig. 5.1 ). Esto se ha observado en cultivos celulares de P. somniferum y C. roseus, los cuales pierden la capacidad de sinterizar morfina y vindolina respectivamente (Facchini, 2001 ). De este modo, la falta de capacidad de síntesis de berberina sugiere la necesidad de algún tipo de organización celular que se pierde como resultado del cultivo in vitro. Alternativamente, esto también se podría explicar por alguna enzima con

152

participación en el flujo de intermediarios a través de la ruta de síntesis, ausente en los cultivos.

Es interesante notar que los cultivos de A. mexicana con que disponemos son capaces de acumular cantidades significativas de sanguinarina, aún en ausencia de estímulos externos, lo cual difiere de los cultivos de P. somniferum y E. ca/ifornica (Eilert, et al., 1984; Gundlach et al., 1992).

El análisis del efecto del MEJA y SA sobre la acumulación de los alcaloides y la expresión de la ncs y bbe, mostró que las suspensiones celulares de A. mexicana son susceptibles de aumentar cerca del doble del contenido inicial (2.15 mg g-1 PS) de sanguinarina, en respuesta al MEJA, no así con SA (Fig. 5.3; 6.2). Por su parte, tanto la expresión génica de la ncs y bbe aumentaron durante las primeras 72 h, presentando una correlación con el incremento del alcaloide (Fig. 5.3). No obstante, la magnitud de esta respuesta fue menor de lo reportado para cultivos inducidos de E. ca/ifornica y P. somniferum (Eilert, et al., 1984; Gundlach et al., 1992; Cho et al. , 2007). Sin embargo, las mayores cantidades detectadas de sanguinarina (2.05 mg g-1 PS) fueron similares a las encontradas en los cultivos inducidos de A. mexicana (2.15 mg g-1 PS) (Fig. 5.3).

153

--·

Inducción de las enzimas biosintéticas

de ABis

• Acumula ci ón de Sanguinarina

Figura 6.2. Modelo hipotético de la cascada de señales en respuestas a jasmonato de metilo y ácido salicílico en suspensiones celulares de Argemone mexicana. El jasmonato de metilo conduce a la activación transcripcional correspondientes a enzimas biosintéticas de sanguinarina. El ácido salicílico tiene un efecto en la expresión génica de las enzimas biosintéticas de la sanguinarina, sin embargo la magnitud del estimulo es menor, lo que sugiere que podría estar involucrado principalmente en mecanismos de defensa, como la respuesta sistémica adquirida.

Recapitulación final

Los resultados obtenidos sugieren que la síntesis de sanguinarina, ocurre principalmente en las raíces y cápsulas, ya que en ambos se detectaron tanto el alcaloide como los transcritos de NCS y BBE (Fig. 4.1 O y 6.1 ). Si bien no podemos descartar la participación de sistemas de transporte entre la raíz y la cápsula, el hecho de que este alcaloide haya estado ausente en el tallo y en el látex (Fig. 4.1 O) no apoya la

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existencia de un transporte y dan soporte a la idea de que las cápsulas tienen la capacidad de biosíntesis. Más aun, la presencia de ambos transcritos en las semillas inmaduras (Fig. 4.1 O y 6.1 B) fue consistente con la acumulación de sanguinarina durante la maduración de ésta. En este sentido, se debe mencionar que en P. somniferum se han inmunolocalizado enzimas de la síntesis de ABis en el carpelo de la cápsula (Weid et al., 2004; Bird et al., 2003; Samanani et al., 2006). Por su parte, la berberina parece ser sintetizada principalmente en la parte aérea, y posteriormente ser transportada a toda la planta, incluyendo la raíz (Fig. 6.1A). Esto puede ser sugerido, debido a que la presencia de este alcaloide solo fue evidente durante desarrollo del hipocótilo y la parte aérea de la plántula (Figs. 4.11; 4.12; y 6.1 ).

Con nuestros resultados es posible proponer, como modelo de trabajo, que la ruta de síntesis de los alcaloides en A. mexicana podrían diferir respecto a la distribución tisular encontrada de T. f/avum y P. somniferum (Samanani et al., 2005). En este sentido, la capacidad de A. mexicana de sintetizar sanguinarina desde etapas muy tempranas después de la germinación y de acumular berberina con el desarrollo de la parte aérea, difiere de estas dos especies, donde se ha encontrado que estos alcaloides se sintetizan y acumulan en distintos· tejidos (Samanani et al., 2005; 2006). Más aun, es interesante hacer notar que A. mexicana combina alcaloides presentes en Thalictrum, pero no en Papaver, como berberina; con otros presentes en Papaver y ausentes en Thalictrum, como la sanguinarina (Fig. 4.1 O; Samanani et al., 2002; Facchini et al 1996).

La identificación de distintos tipos celulares involucrados en la síntesis y acumulación de los alcaloides en plantas maduras de A. mexicana sugiere la presencia de sistemas de transporte (Fig. S3; datos complementarios y en preparación). En este sentido, la síntesis de ABis en diferentes tipos de células especializadas, tanto en P. somniferum como en T. f/avum, implican la posible migración de rutas de síntesis (Samanani et

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al. , 2006). Más aun, la separación espacial de la síntesis y acumulación de los alcaloides en estas especies indica un transporte intra e inter-celular de intermediarios, productos y enzimas biosintéticas (Ziegler y Facchini , 2008). El intercambio celular de intermediarios puede involucrar transportadores específicos, como los transportadores tipo ABC (ATP binding cassette), los cuales se encuentran ligados íntimamente con el flujo de metabolitos secundarios como terpenos y fenoles en diferentes especies (Yazaki , 2006). La participación de estos transportadores en el movimiento de alcaloides monoterpenindólicos en C. roseus y ABis en C. japonica abren las puertas para establecer un análisis más detallado en el flujo de alcaloides en A. mexicana (McCaskillet al., 1988; Shitan et al. , 2003).

Por otro lado, la complejidad de los mecanismos que controlan la síntesis de ABis necesariamente implica la operación de sistemas coordinadores en un nivel jerárquico superior. El establecimiento de dos vías de señalización independientes reguladas por JAS y el pH citosólico para la síntesis de sanguinarina en E. californica (Roas et al., 2006), dan paso a un estudio más profundo en las suspensiones de A. mexicana. De esta forma, el análisis realizado con hormonas relacionadas con mecanismos de defensa nos permitió determinar que los jasmonatos están involucrados en la síntesis de los ABis en suspensiones celulares de A. mexicana, no así, el SA que aunque tuvo un cierto efecto en la expresión génica, no presentó una verdadera respuesta de inducción, como la exposición a MEJA, sugiriendo que podría estar involucrado en otros sistemas de defensa, como la respuesta sistémica adquirida (Fig. 5.3; 6.2).

La relación entre las rutas de señalización inducidas por JAS y SA forman un sistema de defensa muy elaborado que puede estar regulado a través de genes maestros, como el factor transcripcional WRKY (Li et al. , 2006). La participación de WRKY como punto de convergencia, después de la percepción

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de un estímulo, se ha identificado en plantas de A. thaliana en las que promueve cambios en los mecanismos de defensa, mediados por JAS y SA (Li et al. , 2006). En este sentido, la participación de WRKY en la síntesis de ABis en P. somniferum, y C. japonica abre la posibilidad de su intervención en A. mexicana también (Apuya et al., 2008; Kato et al. , 2007). La identificación de factores transcripcionales, así como de elementos cis (promotores) que regulan la expresión de los genes en Argemone, permitiría establecer los procesos de regulación de la síntesis de ABis. Esto se ha demostrado en Arabidopsis y en C. roseus, donde la existencia de controles maestros coordinan la expresión de los genes involucrados de la síntesis de flavonoides (Proteínas MYB) y alcaloides terpen­indólicos (proteínas ORCA) (Gantet y Memelink, 2002).

Tomando estos datos en conjunto, es posible proponer a Argemone mexicana como un modelo versátil para el estudio de la síntesis de ABis. Podemos decir que el proceso de síntesis de alcaloides en esta planta tiene características particulares, distintas a las ya reportadas de P. somniferum y E. californica. Esto sugiere que una ruta metabólica, formada por genes ortólogos, puede estar sujeta a diferentes mecanismos regulatorios.

El entendimiento de los procesos biológicos que permiten la síntesis y acumulación de los alcaloides en las plantas ha avanzado a lo largo de la última década. Este progreso se ha visto facilitado por la disponibilidad de una impresionante colección de genes cuyos productos catalizan diferentes tipos de reacciones. Aunado a éstos, un número importante de genes reguladores, involucrados en el control de síntesis y degradación de alcaloides, se han aislado mediante acercamientos de genómica de plantas (Ziegler y Facchini, 2008).

De igual forma hemos aprendido que la biosíntesis de estos compuestos en plantas es más que una mera curiosidad metabólica. La síntesis de estos compuestos ' está regulada por la participación de diferentes tipos de células y tejidos, el grado

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de desarrollo y el medio ambiente. Muchos aspectos de la biosíntesis de alcaloides, como la compartimentación subcelular de las enzimas y la translocación intercelular de intermediarios, revelan nuevas variaciones en la complejidad del metabolismo de las plantas. La expansión de herramientas moleculares, así como las estrategias de ingeniería genética, promoverá la capacidad para identificar los reguladores asociados con el desarrollo de células que pueden acumular los alcaloides. Nuestro conocimiento de la bioquímica, biología molecular y celular también dará lugar a interesantes oportunidades para desarrollar ingemena metabólica permitiendo incrementar la producción de alcaloides con importancia farmacológica. La novedad inherente y la importancia socioeconómica de los productos obtenidos de estas plantas modificadas, permitirá fomentar un mayor interés en A. mexicana, un recurso con un gran potencial.

Perspectivas

Este trabajo representa uno de los primeros acercamientos de tipo molecular sobre la síntesis de alcaloides en Argemone mexicana, una planta de la medicina tradicional de nuestro país. La disponibilidad de las secuencias de A. mexicana permitirá abordar nuevos aspectos sobre el proceso de síntesis de ABis en esta planta. Por ejemplo, la localización en tipos celulares específicos de las distintas enzimas involucradas. No obstante, debido a que en Papaver el sitio de acumulación de los transcritos no corresponde al de las enzimas, es necesario localizar, por inmunocitoquímica, el sitio de acumulación de éstas en A. mexicana. Para ello, se deberán obtener los anticuerpos específicos. La disponibilidad de las secuencias completas de la NCS y la BBE permitirá la construcción de vectores para la expresión heteróloga, con los cuales podrán obtenerse cantidades suficiente de los antígenos. Más aún, los parámetros cinéticos, y la especificidad para los sustratos, y las posibles diferencias entre las isoformas, también podrían establecerse utilizando la proteína recombinante.

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Por otro lado, los alcaloides de A. mexicana, además de tener propiedades médicas, son causa de serias intoxicaciones debidas al consumo de sus semillas (Lozoya y Lozoya, 1 982). Debe hacerse notar que estas son fuente de aceites de buena calidad que no pueden ser empleados debido a la presencia de alcaloides que pueden ser tóxicos en altas concentraciones, como la sanguinarina. De este modo, las secuencias de la NCS y BBE nos podrían permitir la generación de plantas transgénicas en las que se reduzca o elimine compuestos con fines comerciales.

Finalmente, los cultivos in vitro han provisto de una poderosa herramienta para el estudio de los procesos involucrados en la síntesis de ABis. El avance en el entendimiento de los mecanismos de señalización implicados en la activación de la síntesis de los alcaloides en respuesta al ataque de patógenos puede proveer información invaluable para determinar la naturaleza de la relación entre la percepción del estímulo y la biosíntesis de estos compuestos.

Las herramientas moleculares y conocimientos generados en el presente estudio para la NCS y BBE de A. mexicana (Capitulo 3, 4 y 5) representan pasos importantes hacia la realización de estos objetivos.

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Figura. 51. Secuencias nucleotídicas correspondientes a los ADNcs parciales de la NCS de Argemone mexicana. Los recuadros corresponden a las secuencias de los cebadores empleados para la amplificación por RT-RCP para en análisis de la expresión génica.

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CoftMftu A.ACOGA.AACQ• AO" • TOO" T • • TATTCTTAOOTTTACAT TTAGOATGTAAAACCOTTGCGAAA TCTA.TA.A T "OA.TAA.AA "CTTCCCGGAA.TTAGGGTTA.A - - - ~ 1 1 1 1 1 T t'OA I GAAGU. Tl Tl TGOA.AA TOAA l TGGOGTGA.A. TCAT TTCCTTACTT A TCAGGA. T f AAAAACAOT T AAOGAA TTOAAbAATAGG TT TT TGAA.A..l T TOA 10M tCOA AOAAGAA Tl TTTOGAAATGAA TTOOGGTGAA TCI TTTGCTTACT T A TCAGGA. TT AA.AAACAOTT A.AGGAATTOA.A TAA T AOGTT r T TGAAA.C T TOA totS T • OA "GA.AOAA TTTT100AAA TGAA TTGGGOTGAA TC: • TlTOCTTACTTATCA.OGA. TTA"-AAA.CAGT T A.AGGAA TTGAA • AA TACO TTTTTGAA.A • TTOA

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CotMnM • AOA.GTGGGTT A TOT UA T • ATA 1 TGATC1 TOA TCTCGGAGGA.AlAGA TTOOAGT • A • AA.AAAlAGTTCTAA • AATQC • ATTGAOA TTOC • AGAAA TTOG - - ~ -1 1 1 1 1 BeE.Mit GG TCAAAAA. T A TT TTTT A TCAAA. TT A TGAACOl TT AA TT AGOOCTUAACA T TOA T TOATCCTAA. TAA JI T TT11 AA TCA. TCCACA.O,AGTA. TACCTCCAA 15tl eetAw.2 GG TOAAA.AA TA TTT T TT A. TCAAAl T A TOAA.COT TT A.A T UGGGCTAA.AACA TTOA TTGA tcC TAATA.ATA T TT JT AA TCA. TCCAC:o\l-\0 TA T ACC TC:CAA 1$15

CotMftM GG TGAAAAA TATTTTT T A TCAA.A T T A TGAACGTTT AA TT AGOOCTAA.AACA. TTOA TTGA TCCTAAT A.AT • T T TT TAA TCA. TCCACA. • AG U TACC TCCA.A - -1 1 1 1 1 ME.Am1 TOA TOAAA U TIA TAA. TGlTGA TOATOAG~AAA TT TGAAOT TACA TG1TOA TCAAOGAA.ATGTAAT TT TT TA¡.\ • • • .ITTG TAA TT TU T AAA TTA TTAT tft5 BIENn2 TGATGA.AA1 10ATAA1GTTGA1GATGAGC • TTTGA.AOTTA •TGITOATCAAGOAA.ATOTA~TTTTTT AAT ATTGTAATTTAATAA.ATTATCt;A 117t ~ TOA TGAAA T • T • ATA A. TGT TOA TGATGA.G • AA.Ao\ T T TGAAGT TACA tO• TOA TCAAGOAA.ATGT A • TT TT TT • AATT A T 1GT AA TTTAA T AAA TT A T • • •

IDO ne1 fM

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Figura. 52. Secuencias nucleotídicas correspondientes a los ADNcs parciales de la BBE de Argemone mexicana. Los recuadros corresponden a las secuencias de los cebadores empleados para la ampl ificación por RT-RCP para el análisis de la expresión génica.

166

Figura. 53. Localización de alcaloides de tipo benzofenantridinas y protoberberinas en tejido de raíz y tallo de plantas maduras de Argemone mexicana por microscopía y fluorescencia. La figura de A-D corte transversal de raíz; F-G corte transversal de tallo. B) Localización de benzofenantridinas y protoberberinas en el periciclo y endodermis de la raíz; D) localización de benzofenantridinas y protoberberinas en la endodermis de la raíz; G) localización de protoberberinas en tejido vascular, corteza y endodermis del tallo. La autofluorescencia de los alcaloides fue detectada con un grupo de filtros Zeiss Filter (Exc. BP = 365/12 nm, FT = 395 nm, Em. LP = 397 nm para protoberberinas; Exc. BP = 470/40 nm, FT = 510 nm, Em. LP = 520 nm para benzofenantridinas). La barra= 100 ¡.Jm

167

A M 1 3 6

B M 1 3 6

9 12 15 18

9 12 15 18

BBEAm2 549pb

Actina 467pb

lBS 187pb

Figura. 54. Amplificación de los transcritos correspondientes a la BBEAm1 y genes constitutivos después de la germinación de semillas de Argemone mexicana. A) Amplificación combinada de los transcritos de la BBEAm1 y actina. B) Amplificación del gen constitutivo ARNr 18s. Las flechas en blanco indican el tamaño del marcador molecular; las flechan en negro indican el gen amplificado y el tamaño esperado. El análisis se realizó con las muestras descritas en el apartado 4.3.4.2, figura 4.11 .

168

Anexo 1

Electronic Joumal of Biotechnology ISSN: 0717·3458 Q 2008 by Pontificia Universidad Católica de Valparolso Chile

OOJ · 10 V.2f)fvol1 1-is.!lue-1-fulnext~ 13

Vo1.11 No.4, lssue of October 15, 2008 ReceNed March 11. 2008 ' Accepted May 22, 2008

TECHNICAL NOTES

lsolation of functional total RNA from Argemone mexicana tissues

Jorge A. Rublo·PII\a Unidad de BioquírWc.a y BiologU. Molecular de Plww

Progranu de Posgndo en Ciertc~l y Bi.ot~logb de Planta.s Ctatto de lnYesti¡aciOO C1t11tifica de: Yuc.at3n

Calle 43 No. 130. Colouia Cbubumá deo. Hidal¡o M~ri<b. Yucat:ic, Mixico.

Fax: 999 981 3900 E·ma1l: jrubio@cicy.DlX

Felipe A. Vázquez-Fiota• Unidad ck Bioquúruca y Biotogí;a Mole-eubr de Planlas

Cmtnl dc- lD\'Hhgación C1e:utif•ca de YucMin Calle43 No. 130, ColomaChubwni de Hidalgo

Mérida 97200, Yuc.alin. Mb.ic:o Tel: 999 9<42 8330 :Fa~~: : 999 981 3900

E:·tuail: fcbpc@dcy.mx

Fla aadal suppon: Nariou:d Council for Sciew:e and Technolo¡y (CONACYT), Mt_xico.

Abbn\1aUOD.I: CT AB: bcudecyltn~thybmmoaium brotWde DEPC: diethyl pyrocarbonate PVPP: poly\inylpolypyrrol.idooe RT -PCR: ~rse trna.teripuon polyntffase cbain t'UctJOn SOS: sodium dodecyl t.ulfate

RNA tl:ft'a<'.tlon Ct·om recalc.ltrant plant tlssues ts rrequr.ntly complicat~d by tbt prtSf ll('f':. or st rondary metabollt~s. polysarchal'ldes and polyph~nob. Then com¡lonnds may co pnrfpit at~ \\ith Rl~A. ofita nnd~t1ng tt uusuttablt tor t-Uber cDNA syntbests or l•~·brt dlzat1on tu no•·tht l·n blot analysts and tberdol'tt tutu te1·lug wtth the gt nt aualysts t l:presstou In sur b tlssuts. \V~ luwe dr.vrloped au effidtnt R~A extt·auttou mttbod from A. mtxlcntrn ttssues. Tbt procedurt loclud<s lb< USt of pol)•\•lu)·JpoJyp )TrOlldout (PVPP), lo nmovt- secondary m~tabolltts, pt·ottins aud }lolyp11tnols, and a m·o-step p rrctpitation wilb LjCl, to tllmtna te poJyurcbaridf's, au d t bus tnn"f'astng Rl""A yteld. Tite quallty of tbe nsultin& RNA was t\l'aluart d sprru·opbotomt.tt1rally aud b~~ agar ost gtl tltc ll·o¡Jbonsb. l.\1o t•e.O\'tl·, th t RNA obtatned by this mttbod, could be ustd dtrutly for both RT-PCR and uo t·tbt i'D blot analysts, wlthout •uy tur tbtt' puriflratlon.

Argeurone me:ricnun (Papaveraceae). commonly known as priekly poppy is used in rural arens of Meotieo as a medicinal plant. The occl.UTeuce of diverse alkaloids, flavonoids aud fatty acids in its tissues may explain these prope11ies (Sbaukat et al. 2002; Chaug et al. 2003). In fae t, berbedne aud sanguinarine, t\\'O of tite maiu alkaloids is;olated fi:om .A.rgemoue tisúes . display significant

cytotoxic :\Jld a.nümicrobial prope11ies (Villinski et al. 2003; Beuria et al. 200S). The wide rauge of potential medicinal uses of this plant is oue of the reasons for the ~Will$ attention it is receiving. However, molecular investigations on tbis plant are limited.

A pre-requísite to conduct. sucb researcb is obfailting high quality uucleic acids. espi!<ially RNA (cardillo et al. 2006). However, this may be complicated in cettain risS\1es due to RNA susceptibility to deg.ration by RNAses. Plant tissues are cbo.racterized for a highly variable cowposition, rutd some tissttes may probe especially difficult for RNA extraction (Geuna et al. 1998). Tissues of A. . mexicana contain high ruuounts of yellow latex. which on exposure to Rir, rapidly nm.ts browu due to oxidation of pheuolic compotmds aud otber secondi\J'}' metnboHtes that interfere with any RNA e:o<trnction procedtu·e . Furthenuore. Wgh awoWlts of polysaec:harides ofteu co· p!'edpitale wíth R.>.JA, thereby affectiug the yield and quality of tite isolated RNA (\Vang et al. 2007). These substances bind to Rl"JA and render it tmsuitable for either cONA synthe~is or bybridizatiou in northeru blot analysis.

Different merhods for RNA isolalion hnve been desctibed. lu nt.'UlY C3ses: these iuvolve borh the use of detergents (CT AB, soS) and hot. phenol. or density gmdient

Thls p41per ls :t~V :t~ llable on lln• at http:l/www.ej blotechno logy.lnfoleontent/vo l11/luu..Uful l/13/

169

Rublo·Pifta, J.A. and Vhquez..floto1, F.A.

e S L R Ce

-28SrRNA

-18SrRNA

Flgure 1. Elec:trophoretlc: analysls of RHA lsolated from Arvemon• mexkano1 dssues. The arrows indicate the 28S and 185 units of rRNA. C: capsule, S: stem, l : leat1 R: root, Ce: cell culture. Total RNA samples were analyzed on an 1.5% agarose gel stained with ethidium brornide

ceutrifugariou (Logemauu et nl 1987). However the efficiency of such melhods vnries depending ou the composilion of lhe employed tissues and had been inadequate in reducing polysaccbarides contamiuation. The addi tion of acidic gnanidiniluu thiocyannte or TRizotTv (In Vin'O Life Teclurologies, Carlsbad CA) is widely employed to inhibit Rl\Ase ncliviiy (Chomczyusld and Saccbi. 1987; Valeuzuela-A,·eodar)o et al 2005). O~anic solvents ill:e phenol and chlorofom1 are utilized ro separare RNA from proreins into two different phases. Tire use of lithium cbloride to precipitare RNA at certaio coucentrations is au effective approach for selective precipitatioo. However. standard procednres that mnke use of these reagents seldomly resu1ts in RNA with enough integrily or puriry when applied ro lissues witlr high contents of latex aud sec:oodaty metabol.ites. such as those of A.. me.,icmta. FurtltellllOre. tbese procedures are frequeurly modified ro suit specific tissues and conditions. Here, we present a reproducible method for !he isolatiou of total RNA from differeut lissues of A. me.ricmra. TI1e yield and qualiry of the RNA so obtaiued were consistently hi!lh, as coufumed both by spectropbotometric nualysis aod sepRrntiou on agarose gel. and w•s suitnble for RT·PCR.

MATERlALS ANO MI!THOOS

Plant material

P1auts of -~· me.r/cana were collected from wild popnlations. '" ·apped in polyethylene bags aud kept in ice upoo transfer ro the laborntory. On arrival, plauts were. thoroughly washed with cold tap water, dissected imo leaves. stems, roots nud capsules, nud theu slored at ·SO'C uutil RNA extraction.

Solutlons requlred

Extraction buffer: 38% pheuol SRtllrated buffer (vtv), 0.8 M guauidine thiocyanare, 0.4 M

170

anunouinm flúocyauate, 0. 1 :vi sodium acerare (pH 5). 5o/o glycerol 0.1 o/o phenol red.

CWoroform: isoamylic alcohol {24: 1; v/v).

3 M aud 8 M LiCl solutious.

3 M sodilun aceta te (pH 5.2).

70%, 100% etbanol.

Pol)"oinylpolyp)'ITOlidone {PVPP).

Dietbyl p}Tocarbonate (DEPC) ·treated water.

Atl solutious were prepnred wilh DEPC· treated wnrer.

RNA extractlon protocol

Trnnsfer 1 g of frozeo tissue to a mortar containing liquid uitrogen aud 250 m~ PVPP. pulverize tl1e tissue usin!' a pestle uutil a fure powder is obtained.

Add 5 ml extrnctiou buffer nud homogeuize with cold peslle uuril rissue has thawed. Trnnsfer samples to sterile ceotrifuge tubes aud incubare at room temperarure for 10 miu.

Remove insoluble material from the bomogeuale by centriftrgatiou Rt 14.000 g for 10 miu ar room iemperanrre.

Tmnsfer the resulting supenlatam to uew sterile mbes nnd add 1 m.l of n mi.xntre chlorofom1: isonmylic alcohol (24:1}.

Shake the tube vigorously with a vot1e..x for lS sec. and incubare nt room tempet·antre for 2 miu. After

further shnkin¡¡, separare dte phases by ceotrifuging rhe mbes at 14,000 g for 10 mio at 4'C.

Transfc:r tbe aqueous phase- to a uew tt1be. and repea1 the cllJorofonn: isoamylic alcohol exrrnction.

Trarufer tite aqueo os phase to a uew nlbe. and mix with 0.625 vohunes of 8 M LiCI aod incubare ar 4°C for 3 lu-s (if RNA yield is 1ow. incubare ovemight).

Separare RNA precipitated total RNA by ceotrifugio¡¡ at 17,000 g for 30 min at 4•c. Eliminare !he supemataut. theu carefully wash the pellet, fit!.t wilh 3 mi of 3 M LiCI and titen, widt 1 ml of 70% ethauol. Centrifugo samp1es at 17,000 g at 4'C for 10 min.

Discard !he supemaraut aod dry up the pellet at room temperature. The pelle! is resuspeoded in 300 ¡t1 OEPC-water.

RNA pmified by precipitatiou once 0.1 volumes of 3 M sodüuu aceta te aud 2 volnmes of 100% ethano1 are added aod incuba red at -SO'C for 1 hr.

Centrifuge samples at 17,000 g al 4'C for 20 mio. Eliminare supematant and then wash !he pelle! twice with 1 nd 70% ethaool at -20'C.

Ory rhe pellet ar room iemperantre and suspend io SO· 100 ¡t1 OEPC· water.

(If RNA is to be used for PCR methods, perfonn a ONAse I

lsol;¡tfon of funetlonal total RNA from Argemone mexlc~n;¡ tfn uu

treaunent).

Estlmatlon of RNA quallty

Tite recovered RNA was qnautified by 00 (Lewiuso1w et ttl . 1994), by tl..ic scandard p~cdlu"C. COucaw.inncion due to

pheooVcarbohydrates or proteins was detemtined by recording the OD ratios; A¡6t/Am aud Auo/Au•. respectively. In order to verify RNA iotegricy, extrncts were subjected to 1 o/o agarose electrophoresis. Oels were stained with etltidium brootide, and \~sualized under UV light

Reverse transcrlptlon PCR

Single-stranded cONA was prepared from 2.5 1'~ total RNA using AMV reYerse traoscript:Jse lllld oligo (dD, following the mauufacrurer's instructious (lnvitrogeu). The syuthesized cONA was used for PCR in order lo estimale tite expressiou level of actin gene. Actin-specific ptimers were used F (5'CACL.O.CTACTOCTAAACOOOAAA3) and R (S'ACATCTOCTOOAACiOTOCT03 '). PCR sequence was as foUows : DNA denamring at 94'C for 3 min, followed by 35 cydes of 1 min at 94°C for ONA denanuiug, 1 min at 55•c for primer alUlealiog, aod 1 mio at 7:ZOC for extensiou. The pro¡¡ram was tenninated with a 10 min exlensioo at 720C. The amplified products were separaled on a !.So/o agnrose ¡td aud vi""'lized after ethidituu bromide stailling.

Northern blot analysls

Samples coutai.ttiug 1~ ~g total RNA were lteat deuatured. separated by electrophoresis in an 1.5% agarose gel coutaining 1 So/o fonnaldehyde. and trnnsferred by capillariry to a nylon membrane (Hybond N+, Amersbam Biosciences; Piscatay NJ) using standard procedures

Table 1. RNA. yltld from dltrerent tissues of A. m•xle• na, uslng the dtscrl btd extr ;~~c tlon proctdure.

TleltiiM oc' r8lloe Total RNA2

llaJIIFW 2601230 260/280

Capsute 2.05 1.88 155 (36)

Slem 1.89 1.94 123 (22)

Leal 1.91 1.92 126 (27)

Root 1.83 1.75 174 (57)

Cett cunures 1.87 1.70 192 (29)

'OD. Optical density. 2Average or three independent repetitions, \..,;th standard deviauon between bf'ackets.

3

171

Rublo.Pifta, J.A. and Vbquoz.flota, F.A.

a

1

1

e S L R Ce

......... -· .................. ---1

1

b

Figure 2. RT ·PCR and northern blot Nsults showlng the lntegrlty of RNA iso l ~ted . C: capsule, S: stem, L: leaf, R: root, Ce: cell culture. (a) Agarose electrophoresis anatys1s of the RT-PCR assay with actin primers. (b) Northern blot analysis of tlle actin gene expression usi09 a specific DIG-Iabele<l probes.

(Sambrook and Russel, 1989). The blot was bybridized by iucubating the membrane witb a DNA probe corresponding to tbe actiu gene labelled witb digoxigenin (Di~ easy hyb solutiou; Rocbe Applied Science, Indianapolis IN) at 42'C ovemigbt. TI1e probe was prepared usiug tlle PCR DIO Probe Synthesis kit (Roche Applied Science), following the mrumfacturer's iustructions. ..t\fter incubation, the membrane was washed tv.-i ce at room temperanue in 2X ssc with 0.1% SDS S min each, and twice with O. LX SSC with 0.1% SDS for 20 min at 65"C (20X SSC is 3 M sodiUlll cWoride with 0.3 M sodium citrate, pH 7). Hybridized probes were detected usiug the Dig Luminescent Detection kit (Roche Applied Science) and exposing membranes to chemilul.lliuescence seusitive films (Kodak Eastman. Rochester NY).

RESUL TS ANO DlSCUSSlON

Most A. mexicana tissues contain high amounts of latex, which besides being rich in polysacchatides, represen! a source of polypbenols (Chaug et al. 2003), that rapidly oxidize during gti uding. This method produced a white, water soluble &'lA precipitare wilh a significan! yield (en 150 ¡og per gram o.f fresb weight, (Table 1). OD ratios (260/230 and 2601280) were 1.9 and 1.8, rebpect.ively sug~esting Low quamities of polysaccharides, polyphenols and proteins. RNA int.egtity, as observed in agarose gels (Figtu·e 1), and yield (Table 1) were comparable to previous1y reponed methods for tissues wilh high coutents of polysacchatides and secoudary metabolites (Chao et al. 2004; Waug et al. 200~). Tbe. absence of most polysaccbarides. polypbeuols and pi~ments in tbe RNA extrncts from tissues of A. mc:ricana avoided interfereuc.es iu iwo differeni metbods employed for fue detection o.f specific u·ansclipts: nortbem blot (Figtore 2a) and semiquantitative RT-PCR (Figure 2b). Moreover, fue method can a1so be applied to A . mexicaua cell cultures, which also aJ"e ric:h in pheuols and sugars (Chang et al.

172

2003). This method was developed after uusuccessful attempls witb otber RNA isolation protocols for polysaccbaride-ricb tissues (Valeuzuela-A vendaiío et al. 200S). We noticed that tbe resulted after tissue griuding in !he presence of buffer, rapidly tumed bro\\11 perhaps, as a consequeuce of polysaccharide binding oxidized pheuol. This darkening effect was reduced but not completely avoided. adding 250 mg of PVPP per gran1 of fresb tissue. RNA precipitation with LiCl, followed by washing the resollting pellet with an etbanoi/LiClmi.xture produced uot just a cleM, wªter soluble precipitate. b1ot also siguificantly increased RNA yielding.

In conclusion, we llave developed a method for Rl'IA extractiou from tissues presenting high contents of both polysacchalides aud polyphenols, sucll as tbose from A. me:ricmw. RNA obtained by this method can be utilized for 01e detection of specific &'IA's, as showu in Figure 2. Altl!ough yields can be in1proved by precipitating Rl'IA witl! LiCl overui~t, sllorter incubation periods (3 lu'S) also resulted in good RNA recoveries, which allowed perfonning tbe extraction procedure of 8 samples withiu a 6 hrs period. It. is wortb noticing lhat, RNA yields are similar. despite tbe tissues being extracied: Jeaves. roots, stems, or capsules. This point to an importan! difference witb respect to ofuer reponed metbods, which are frequently designed for specific tissues.

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