Un vistazo a E. ColiETEC (E. coli enterotoxignico) es un tipo patognico de esta especie que agrupa cepas capaces de producir enterotoxinas proteicas termolbiles (LT) o termoestables (ST), las cuales no se ingieren preformadas ni ingresan al medio interno, sino que se forman y ejercen su accin localmente sobre la mucosa intestinal, promoviendo hipersecrecin de agua y electrolitos. La toxina lbil tiene una estructura y una funcin muy similares a la toxina de Vibrio cholerae; ST es un pequeo polipptido de mayor jerarqua como factor patognico, dado que son principalmente las cepas productoras de ST, o de LT y ST, pero no las que producen slo LT las que se asocian con alteraciones intestinales (Reis y col, 1982). ETEC se localiza sobre las clulas epiteliales del intestino delgado por medio de fimbrias proteicas de diversa composicin antignica y estructural, y all produce sus toxinas que adhieren a receptores celulares, ingresan a los epiteliocitos y modifican su funcin dando lugar a una diarrea lquida, sin fiebre ni inflamacin de la mucosa. Tanto los genes responsables de la produccin de toxinas como los que codifican las adhesinas bacterianas estn localizados sobre plsmidos transferibles, por lo cual esta variante patognica de E. coli incluye a numerosos serotipos que han sido capaces de incorporar esos componentes del genoma procariota (Tabla 4). ETEC es agente de diarrea aguda del nio en regiones pobres, y tambin de enfermedad espordica o epidmica de origen alimentario, que los microbilogos del hemisferio Norte llaman diarrea del viajero. En cualquier caso, las dosis infectantes son relativamente altas, y los vehculos habituales de infeccin son el agua y los alimentos contaminados que permiten la sobrevida y multiplicacin de los grmenes. En nuestro pas, ETEC es el virotipo de E. coli que sigue en frecuencia a EPEC como agente de diarrea aguda en los nios. No ha sido adecuadamente investigado como causante de casos o brotes de ETA. Su investigacin requiere la demostracin en las cepas de genes codificantes de toxinas (por PCR o sondas gnicas) o de las enterotoxinas por ELISA (Svennerholm y col., 1985). Ver tabla 5. EIEC (E. coli enteroinvasor) es una variante patognica comn en pases vecinos, especialmente Brasil, pero aislada pocas veces en nuestro pas pese a la vigilancia sistemtica de muchos aos. Producen infeccin por transmisin persona a persona, y tambin brotes de origen alimentario o hdrico. Se trata de cepas metablicamente muy similares a Shigella (habitualmente lactosa negativos o tardos, anaerognicos, inmviles, lisina negativos: Silva y col., 1980) poseedoras como Shigella de un gran plsmido de virulencia (Lan y col. 2001) y capaces de provocar diarrea lquida o inflamatoria, aunque en dosis infectivas significativamente mayores, del orden de 106. Pertenecen a ciertos serogrupos caractersticos, lo que junto a sus propiedades metablicas tpicas permite identificarlos (Tabla 4). Localmente hemos producido antisueros para el diagnstico de EIEC por procedimientos de aglutinacin y por Elisa dirigido a sus protenas de membrana externa caractersticas (Tabla 5). Hemos obtenido aislamientos de cepas O124 y O29, en nios con diarrea aguda.62 EAEC (E.coli enteroagregativo) es un conjunto de cepas de esta especie originalmente agrupadas por su modo peculiar de adherencia entre s y a clulas eucariotas en cultivo, segn observaciones originales de Craviotto, Scaletsky y Nataro (Mathewson y Cravioto, 1989). Esta adherencia y la colonizacin del intestino delgado por EAEC son mediadas por fimbrias codificadas en plsmidos (Tabla 4). La deteccin mediante sondas marcadas o PCR de las secuencias de estas adhesinas, y la observacin del patrn de fijacin caracterstico sobre clulas Hep-2 son los mtodos ms tiles de identificacin de estos cultivos (Tabla 5). EAEC produce una reaccin inflamatoria con formacin de mucus y segrega toxinas proteicas propias que contribuyen al dao epitelial (Okeke y Nataro, 2001). El resultado es una diarrea lquida o mucosa, con escasa fiebre o vmitos, que en muchos casos se vuelve persistente (de duracin superior a 14 das), como ha sido descrito en nios de Brasil, de Mjico y de otras regiones (Fang y col., 1995). En nuestro pas, nuestros estudios iniciales realizados con sondas marcadas con digoxigenina y ensayos de PCR desarrollados en el Laboratorio de Referencia de E. coli en Lugo, Espaa, revelan la presencia de estos grmenes en algunos casos de gastroenteritis infantil. Los datos requieren todava confirmacin y organizacin, pero muestran que el grupo microbiano merece atencin localmente. EAEC ha sido reconocido como causa tambin de "diarrea del viajero" (Adachi y col., 2001) y de brotes de enfermedad de origen alimentario (Smith y col., 1994), pero estos aspectos no han sido explorados todava en Uruguay.E. colienterotoxignicaLas ETEC colonizan la mucosa del intestino delgado por medio de pilis o fimbrias que tienen diversas formas denominadas CFA (colonization factor antigens), siendo su principal mecanismo de patogenicidad la sntesis de alguna o ambas enterotoxinas llamadas toxina termolbil (LT) y toxina termoestable (ST). Sus genes estn en un plsmido que tambin puede tener informacin gentica para los CFAs, aunque algunos genes de ST se han encontrado en transposones.6-8Las toxinas LT y ST aumentan el nivel intracelular de cAMP y cGMP respectivamente, que se encuentran en la membrana de las clulas intestinales, provocando la salida de agua y iones.9Las ETEC son importantes en lactantes, principalmente en nios menores de dos aos, y en particular durante los primeros seis meses de vida. La frecuencia de aislamiento de este grupo patgeno de E. coli en nios con diarrea es de 10 a 30%. En los nios en edad escolar y en adultos puede ser asintomtica y poco frecuenteo producir la diarrea del viajero. La enfermedad tiene un periodo de incubacin de 14 a 50 h.El cuadro clnico se caracteriza por diarrea aguda, generalmente sin sangre, sin moco, sin pus y en pocos casos se presentan fiebre y vmito. La diarrea producida por ETEC puede ser leve, breve y autolimitada pero tambin puede ser grave.2,4,10La contaminacin fecal de agua y alimentos es la principal fuente de infeccin, siendo la dosis infectiva de 108UFC (unidades formadoras de colonias). El cuadro III indica los mtodos de diagnstico.E. colienterohemorrgicaRiley describi y relacion a EHEC con brotes caracterizados por dolor abdominal, diarrea acuosa con angre y poco o nada de fiebre, cuadro al que se le llam colitis hemorrgica (CH) y que era debido a la ingestin de carne cruda o mal cocida. todos los casos fueE. colidel serotipo O157:H7. Karmali en 1983, urmico hemoltico (SUH) caracterizado por dao renal agudo, trombocitopenia y anemia hemoltica icroangioptica, precedida por diarrea con sangre, con la presencia en heces deE. coliproductora de una citotoxina con actividad en clulas Vero, por lo que se le llama verotoxina (VT), y a las cepas capaces de producirla se les denominE. coliverotoxignicas (VTEC).11La bacteria aislada de12 la asoci con casos aislados de sndrome13 Adems, se observ que la citotoxina se neutraliz con antitoxina obtenida a partir deShigella dysenteriaetipo 1, por lo que tambin se le llam shiga-like toxin o toxina semejante a shiga (SLT) o shiga toxin (STX), y a lasE. colicapaces de producirla se les da el nombre e STEC.4,14La capacidad toxignica de las cepas es necesaria para que el paciente desarrolle colitis hemorrgica y diarrea con sangre, ya que la citotoxina STX es el principal mecanismo de patogenicidad de EHEC y su sntesis est relacionada con la presencia del bacterifago STX, que est insertado en el genoma. La STX acta a nivel de sntesis de protenas ya que se une a la subunidad 60S de los ribosomas de las clulas intestinales o renales del hospedero.15En las cepas EHEC aisladas, se han encontrado las variantes STX1 y STX2 que son inmunolgicamente diferentes, de tal manera que se pueden aislar bacterias que sinteticen alguna de las toxinas o ambas.4,5,16Adems de la toxina, las EHEC tienen otros mecanismos de patogenicidad como el fenmeno de adherencia y esfacelacin (A/E), y presentan el gene cromosomal eae que codifica para la protena de membrana externa (OMP) de 94 kilodaltones (kDa), llamada intimina, cuya expresin es regulada por genes plasmdicos; el geneeaetambin se encuentra en las cepas EPEC. Otro factor de patogenicidad es el plsmido pO157, de 60 megadaltones (MDa), que codifica para la enterohemolisina.17,18Actualmente hay al menos dos clasificaciones del grupo EHEC. Una es en funcin de la presencia de sus factores de patogenicidad: a) cepas tpicas cuando tienen el fago, el plsmido de 60 MDa y presentan el fenmeno de A/E, y b) cepas atpicas, cuando no producen lesiones de A/E y pueden presentar o no el plsmido de 60 MDa.La otra clasificacin es en funcin del serotipo: a) cepasE. coliO157:H7. Este serotipo no fermenta el D-sorbitol ni la ramnosa y no produce -glocuronidasa; esta bacteria puede producir principalmente SUH y CH. E. coli O157:H7 se puede encontrar en bovinos, cabras, borregos y con menos frecuencia en cerdos y pollos; su principal reservorio es el intestino de ganado bovino.5Tambin se ha logrado recuperar de frutas y vegetales como lechuga, rbanos, alfalfa; adems en productos industrializados como mayonesa y jugos de naranja y manzana no pasteurizados, aun cuando estos alimentos tengan un pH de 3.4, condicin en la que puede sobrevivir varios das. La transmisin deE. coliO157:H7puede ser por ingerir carne cruda o mal cocida, leche bronca, agua contaminada; tambin puede ser de persona a persona o debida a los manipuladores de alimentos.19-21Hay estudios que sugieren la importancia de la mosca domstica como vector en la transmisin deE. coliO157:H7,22y b) cepas no-O157:H7 cuya frecuencia de aislamiento es cuatro veces mayor que las O157:H7.Estas cepas pueden ser sorbitol positivo, y sus serotipos son diferentes del O157:H7. Actualmente hay ms de 200 serotipos, como muestra el cuadro II. El cuadro clnico causado por las cepas no-0157 se caracteriza por diarrea acuosa con dolor abdominal y colitis hemorrgica. Las cepas no-O157 son capaces de causar brotes o casos aislados de diarrea y en ocasiones no se logra establecer la fuente de contaminacin, aunque se sabe que se pueden aislar de los mismos alimentos que las cepas de serotipo O157:H7 y tambin de carne de guajolote, ternera, pescado y mariscos.4,5El principal mecanismo de patogenicidad de las cepas EHEC no-O157:H7 es la toxina STX; tambin tienen el fenmeno de A/E y la presencia de pO157.El periodo de incubacin de EHEC es de 1 a 8 das; inicialmente produce diarrea sin sangre, con o sin vmito, dolor abdominal, fiebre, y despus de 1 a 2 das la diarrea se torna sanguinolenta y se intensifica el dolor abdominal, de una duracin de 4 a 10 das, con heces abundantemente sanguinolentas. Se cura o bien llega hasta SUH.La identificacin de EHEC se puede hacer como indica el cuadro III. Las pruebas moleculares como RFLP, hibridacin, campos pulsados, PCR y RAPD-PCR pueden detectar hasta 102UFC/0.1g de materia fecal, ademsde que permiten realizar una subtipificacin con fines epidemiolgicos de este grupo de bacterias.23-25Es importante el trabajo conjunto del laboratorio y los epidemilogos para la vigilancia y deteccin oportuna de E. coli O157:H7 para prevenir posibles brotes en Mxico, principalmente en zonas tursticas y fronterizas.E. colienteroinvasivaEl grupo EIEC yShigella sppestn relacionados gentica y bioqumicamente ya que son descarboxilasa negativas, no mviles y lactosa negativas. El mecanismo de patogenicidad de EIEC es la invasin del epitelio del colon; para ello el primer paso es la adherencia de la bacteria a las vellosidades de la mucosa requiriendo de mucinasa y adhesinas, para despus entrar por endocitosis a la clula, y posterior multiplicacin de la EIEC dentro de la clula y diseminacin a clulas sanas adyacentes.4,26La informacin gentica para este mecanismo est en loci del cromosoma y del plsmido, adems de tener la capacidad de elaborar una o ms enterotoxinas que pudieran ser importantes en la produccin de diarrea. Los genes necesarios para la invasin se encuentran en un plsmido de 140 MDa llamado pInv, que codifica para protenas, como por ejemplo las Ipa y otras que estn involucradas en el proceso de patognesis.2,27,28Los sntomas caractersticos en personas infectadas por EIEC son diarrea acuosa, con sangre y moco, pero algunos casos slo presentan diarrea, sta en ocasiones es indiferenciable de la que produce ETEC. Las cepas EIEC se asocian ms con brotes que con casos aislados, en los cuales la transmisin puede ser de persona a persona, por ingestin de alimentos y agua contaminada, convirtindose en un patgeno importante en nios mayores de seis meses.2,29El diagnstico de EIEC se hace por prueba in vivo como la de Sereny, que es la inoculacin de un cultivo puro de la bacteria en un ojo de un cobayo en el cual despus de 24 a 96 h se produce una ulceracin en el ojo, pero tambin hay mtodos inmunolgicos y moleculares como se indica en el cuadro III.30-32E. colienteropatgenaEPEC fue el primer grupo que se identific serolgicamente y se asoci con casos de diarrea en infantes, siendo la adherencia su principal factor de patogenicidad. El proceso de adherencia ntima entre la bacteria y la membrana de las clulas del epitelio intestinal, seguida de la destruccin de la microvellosidad, con polimerizacin de actina, que lleva a la alteracin del citoesqueleto en el sitio de la unin de la bacteria, debido al aumento de los niveles de calcio intracelular y de protena cinasa C, hasido denominado adherencia y esfacelamiento (A/ E). E).2,33La adherencia est mediada por pilis o fimbrias rizadas que se llaman Bfp (bundle-forming pilus) cuya informacin gentica est codificada en un plsmido de 50-70MDa denominado EAF (EPEC adherence factor) y de algunos genes cromosomales.34,35En la adherencia es necesaria la sntesis de una protena de membrana externa de 94 kDa llamada intimina, codificada por el gene cromosomaleaey que sirve como seal en A/E.2,4En ensayosin vitrolas cepas EPEC se caracterizan por formar microcolonias en el citoplasma de las clulas Hep-2 y su estudio incluye factores de patogenicidad como el efecto A/E, presencia de plsmidos y fimbrias.2,4,36Las cepas EPEC se consideran tpicas cuando tienen los geneseaepara la intimina, que participa en A/E, y el plsmido EAF que codifica para el Bfp; se dice que son atpicas cuando slo presentan los genes eae pero no el plsmido EAF.4,37EPEC puede ocasionar brotes o casos aislados de diarrea. Este grupo afecta principalmente a nios menores de seis meses y a los de dos aos. Tambin puede aislarse en adultos enfermos y sanos, principalmente cuando hay un factor predisponente como diabetes. La forma de transmisin de la enfermedad es fecal-oral por manos contaminadas de manipuladores de alimentos. Los reservorios de EPEC pueden ser nios y adultos con o sin sntomas.El cuadro clnico que produce EPEC se manifiestacon diarrea aguda, la cual puede ser leve o grave, con vmito, fiebre baja y mala absorcin.El diagnstico de EPEC incluye ensayos in vitro en cultivos celulares y mtodos moleculares como se observa en el cuadro III.E. colienteroagregativaScaletsky y Nataro encontraron cepas aisladas de pacientes con diarrea, las cuales por serologa no correspondan al grupo EPEC pero si presentaban un patrn caracterstico de adherencia diferente a EPEC y que adems eran negativas a la prueba de EAF. En estudios posteriores se encontr el fenotipo de adherencia agregativa, caracterizada por autoaglutinacin de las bacterias entre s y por ser inespecfica, porque las bacterias se adhieren a la superficie de las clulas Hep-2 y a la superficie del cubreobjetos libre de clulas Hep-2.2,4,38La adherencia a clulas Hep-2 y la hemaglutinacin de eritrocitos humanos se debe a la presencia de una fimbria o adhesina flexible llamada fimbria I de adherencia agregativa (AAF/I), codificada por el geneaggAque se encuentra en un plsmido de 60 MDa. Tambin se ha descrito la fimbria AAF/II inmunolgicamente diferente a AAF/I y que est codificada por el geneaafA; sin embargo, no todas las EAEC presentan estas fimbrias.39,40En el mecanismo de patogenicidad de EAEC estnimplicadas la bacteria y diversas molculas que ella produce; tambin se sabe que las cepas EAEC tienen la capacidad de incrementar en la mucosa la produccin y secrecin de moco que atrapa a las bacterias que se autoaglutinan en una fina pelcula en el epitelio intestinal. La produccin de moco puede estar relacionada con la capacidad de EAEC para colonizar persistentemente el intestino y causar diarrea. En el plsmido de 60 MDa de EAEC tambin se encuentran los genes que codifican para la toxina EASTI.41,42Eslava y colaboradores identificaron dos protenas de alto peso molecular de cepas EAEC, aisladas de nios que murieron de diarrea persistente. Estas proteinas fueron probadas en asa ligada de rata observndose vellosidades cortas, hemorragia y necrosis. El gene para una de estas protenas se encontr en un plsmido de 65 MDa y a la protena se le dio el nombre de Pet (plasmid-encoded toxin) la cual tiene la capacidad de producir efecto citoptico en clulas Hep-2, caracterizado por arredondamiento y desprendimiento de las clulas as como contraccin del citoesqueleto y prdida de fibras de actina. En EAEC se ha descrito tambin la protena Pic que est codificada en el genoma y que tiene actividad de proteasa.43-45El sitio blanco de dao de EAEC puede ser la mucosa del intestino grueso y delgado, con un periodo de incubacin de menos de ocho horas y puede durar hasta 18 o 20 das. Esta bacteria puede causar brotes o casos aislados de diarrea persistente. En nios puede manifestarse con diarrea lquida, de color verde, con moco, sin sangre, y que en ocasiones puede llegar a ser severa y requerir rehidratacin intravenosa. Algunas veces el cuadro clnico se presenta como diarrea con moco con o sin sangre, vmito y sin o con poca fiebre.4,46,47La prueba de referencia para el diagnstico de EAEC es la observacin de la adherencia agregativa en clulas Hep-2 de cultivos bacterianos, previamente inoculados en medio Luria e incubados en condiciones estacionarias y a 37 C. Otras pruebas de diagnstico se indican en el cuadro III.36,48,49E. colide adherencia difusaLas cepas deE. colide adherencia difusa, no forman microcolonias cuando se adhieren a clulas Hep-2 (2). Se sabe poco de su mecanismo de patogenicidad pero se ha caracterizado una fimbria de superficie, conocida como F1845, involucrada en el fenmeno de adherencia difusa.50Los genes que codifican para esta fimbria se pueden encontrar en el cromosoma o en un plsmido. El fenmeno de adherencia difusa tambin se ha asociado con una protena de membrana externa de 100 kDa, en una cepa del serotipo 0126:H27, cuyos genes se han secuenciado pero slo se han encontradoen una minora de las cepas aisladas.51Al realizar ensayosin vitroen clulas CaCo y Hep-2, las cepas DAEC tienen la capacidad de inducir la formacin de estructuras protuberantes, semejantes a dedos, las cuales confieren proteccin a las bacterias, pero la presencia de dichas estructuras no se ha demostradoin vivo.El grupo DAEC se puede aislar tanto de personas sanas como en personas con diarrea, siendo ms importante en nios de 4 a 5 aos. Los principales sntomas que se presentan son diarrea acuosa sin sangre y sin leucocitos. En el cuadro III se indican los mtodos de diagnstico. La hibridacin con sondas derivadas de un fragmento del genedaaC, que codifica para la fimbria F-1845, tambin se ha empleado para el diagnstico pero puede presentar falsos positivos, y el diagnstico empleando PCR an no se ha desarrollado.4,52Aislamiento, identificacin ycaracterizacin deE. colipatgenaPara el aislamiento, la identificacin y la caracterizacin de cepas deE. colise aplican mtodos tradicionales, mtodosin vivoein vitroy de biologa molecular; a continuacin se mencionarn los mtodos tradicionales y los de biologa molecular.1,3,4El mtodo tradicional es el aislamiento de la bacteria, tomada directamente de materia fecal o con hisopo rectal. Despus se siembra con la punta del hisopo en la parte superior de una placa de agar Mac Conkey u otro medio selectivo y, con una asa redonda de nicromel, se contina el aislamiento, sembrando por estra cruzada; despus se incuba a 37 C durante 18-24 h. Posteriormente se seleccionan de 5 a 10 colonias tpicas deE. colilactosa positivas.En muestras provenientes de casos de diarrea con sangre se deben seleccionar tambin cepas lactosa negativa que pudieran ser EIEC.