Evaluación de la proteína transmembranal ompG y ompN de E.coli como biosurfactante en la

formulación de un shampoo

LIZETH VIVIANA CÁRDENAS BARRETO

LAURA CAROLINA LÓPEZ GÓMEZ

Proyecto de grado para optar al título de Ingeniero Químico

Asesor,

ANDRÉS GONZÁLEZ BARRIOS

Ingeniero Químico, M.Sc., Ph.D

UNIVERSIDAD DE LOS ANDES

FACULTAD DE INGENIERÍA

DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA QUÍMICA

BOGOTÁ D.C

2014

Objetivo general

Evaluar la funcionalidad de las proteínas ompG y ompN de Escherichia coli K-12 como

biosurfactantes en la formulación de un shampoo.

Objetivos específicos

Concentrar las proteínas ompG y ompN.

Establecer la influencia de la cantidad de proteína ompG y ompN en las características físico-químicas propias de un shampoo.

Evaluar la detergencia y las características de la espuma del shampoo.

Evaluación de la proteína transmembranal ompG y ompN de E.coli como biosurfactante en la

formulación de un shampoo

Lizeth Cárdenas

Departamento de Ingeniería Química, Universidad de Los Andes, Bogotá D.C, Colombia

Laura Carolina López Gómez

Departamento de Ingeniería Química, Universidad de Los Andes, Bogotá D.C, Colombia

Andrés González Barrios

Departamento de Ingeniería Química, Universidad de Los Andes, Bogotá D.C, Colombia

RESUMEN:

Los biosurfactantes, compuestos anfifílicos sintetizados por bacterias, se perfilan como alternativa

ante los surfactantes derivados de la industria petroquímica gracias a su menor impacto sobre el

medio ambiente, capacidad para reducir tensión entre fases y su estabilidad ante altas

temperaturas, salinidad y pH, además de sus propiedades detergentes, emulsionantes y de

formación de espuma. Estas características los hacen atractivos para aplicaciones en la industria

farmacéutica, de alimentos, cosmética, de bioremediación, entre otras. Las proteínas

transmembranales cuentan con cadenas laterales hidrofóbicas e hidrofílicas, lo cual permite que

adquieran diferentes orientaciones en la interface entre fluidos. En el presente proyecto se

encontró que al usar las proteínas ompG y ompN como biosurfactantes en la formulación de un

shampoo, la presencia de dichas porinas no potencializa la detergencia y la cantidad de espuma

del producto cosmético, aunque por el contrario si cambia la calidad de la espuma de abierta a

cremosa. Adicionamente, se logró establecer que al aumentar la concentración de las proteínas

transmembrales, tanto la detergencia como el volumen de espuma del shampoo se incrementan.

1. INTRODUCCIÓN

En los últimos años ha aumentado el interés en los biosurfactantes debido a las ventajas asociadas

a ellos respecto a los surfactantes producidos a partir de petróleo, pues este grupo

estructuralmente diverso de surfactantes naturales se caracterizan por presentar: una menor

toxicidad, menor impacto al medio ambiente, mayor biodegradabilidad, mayor estabilidad a

temperaturas altas, actividad a altos pH y salinidad, mayor formación de espuma, mayor

capacidad para reducir tensión entre fases y tensión superficial, y pueden ser modificados

mediante ingeniería genética lo que los hace más específicos (Shete, Wadhawa, Banat, & Chopade,

2006) (Desai & Banat, 1997).

Los surfactantes son sustancias que tienen la capacidad de cambiar la tensión superficial. Estos

componentes se clasifican de acuerdo a su aplicación (Figura 1), su estructura química o sus

propiedades físicas (Wilkinson & Moore, 1990). De acuerdo a su aplicación se encuentran los

surfactantes humectadores, extensores, estabilizadores y detergentes. Los surfactantes

humectadores aumentan la propiedad de un líquido de humedecer un sólido, los surfactantes

extensores permiten un buen cubrimiento de superficies, los surfactantes estabilizadores se

dividen en emulsificantes (hacen posible la mezcla de compuestos normalmente inmiscibles) y

dispersantes (disminuyen la cohesión entre partículas semejantes evitando la floculación y

sedimentación), y por último, los surfactantes con propiedades de detergencia tienen la capacidad

de quitar suciedad (Centro Internacional de Agricultura Tropical, 1980). Por sus propiedades los

surfactantes son uno de los ingredientes principales en las formulaciones de productos como:

detergentes para el hogar, productos de cuidado personal, productos farmacéuticos y pinturas,

además de usarse en el procesamiento de alimentos y en la industria petrolera (Marchant &

Banat, 2012).

El término biosufractante hace referencia a compuestos anfifílicos producidos en superficies

celulares microbianas, los cuales cuentan con extremos hidrofóbicos e hidrofílicos que reducen

tensión superficial y tensión interfaces, característica que les confiere propiedades detergentes,

emulsionantes y de formación de espuma (Shete, Wadhawa, Banat, & Chopade, 2006). Se

clasifican de acuerdo a su composición química y su origen microbiano, encontrando así moléculas

complejas que incluyen: fosfolípidos, glicolípidos, ramnolípidos, lipopéptidos, ácidos grasos y

péptidos (Sekhon, Khanna, & Cameotra, 2012); los tensoactivos microbianos de menor peso

molecular son los glicolípidos, mientras aquellos que contienen polisacáridos y proteínas

presentan alto peso molecular (Sekhon, Khanna, & Cameotra, 2012).

Respecto a los péptidos, estos presentan una estructura composicional compleja con una cadena

de aminoácidos, una base de poliamida de longitud determinada a la cual se unen cadenas

laterales hidrofóbicas e hidrofílicas en secuencia definida, lo cual posibilita un gran número de

enlaces, por tanto adquieren diferentes orientaciones en las interfaces entre fluidos (Dexter &

Middelberg, 2008). En contraste, los surfactantes sintéticos tan solo cuentan con un extremo no

polar y uno polar que puede o no tener carga. Así pues, las características estructurales de los

péptidos resultan ventajosas sobre aquellas de los surfactantes convencionales.

Los diferentes tipos de péptidos que podrían emplearse como surfactantes se puede clasificar de

acuerdo a si son obtenidos naturalmente o por diseño (Dexter & Middelberg, 2008). Para el primer

caso, se tienen por ejemplo las proteínas producto de la expresión directa de genes que fueron

añadidos al ADN, tal es el caso de las proteínas membranales. Estas proteínas se dividen en:

helicoidales ancladas, lipoproteínas y proteínas transmembranales (OMP) (Mirus, Hahn, & Schleiff,

2010), siendo estas últimas las utilizadas en el presente proyecto.

Las proteínas OMP son el mayor constituyente de la membrana exterior de bacterias gram

negativas como Escherichia coli (E. coli), dicha membrana externa es una capa semipermeable que

regula el intercambio de solutos y nutrientes entre el interior de la célula y el ambiente externo,

así que la absorción de estas sustancias se logra gracias a la formación de canales por parte de las

proteínas OMP (Mirus, Hahn, & Schleiff, 2010). Estas proteínas se constituyen por un número

específico de láminas antiparalelas enlazadas por puentes de hidrógeno entre sí, esta estructura

presenta dos superficies, un canal interior hidrofílico y una superficie exterior con cadenas

alifáticas que pueden tener cadenas laterales aromáticas (Mirus, Hahn, & Schleiff, 2010).

Específicamente, ompG codifica un polipéptido de 301 aminoácidos con 21 aminoácidos en su

terminación amino- y fenilalnina en la terminación carboxi-, lo que facilita la absorción de azúcar

(Yildiz, Vinothkumar, Goswami, & Kuhlbrandt, 2006). Su peso molecular es de 29 kDa, pero cuando

esta proteína es sometida alta temperatura su peso cambia a 34 kDa (Subbarao & Van den Berg,

2006). A diferencia de otras proteínas transmembranales, ompG estructuralmente funciona como

un monómero compuesto por 14 láminas (Figura 2).

Por otro lado, ompN codifica un polipéptido de 356 aminoácidos, cuya masa molecular es de 39

kDa. Esta proteína está compuesta por 16 láminas β antiparalelas que unidas forman la estructura

que la caracteriza (Prilipov, Phale, Koebnik, Widmer, & Rosenbusch, 1998). Adicional a esto, su

estructura es análoga a la estructura de la proteína ompA (Figura 3) que ha sido utilizada en

trabajos anteriores como un tensioactivo. (Prilipov, Phale, Koebnik, Widmer, & Rosenbusch, 1998)

La inclusión de materiales biológicos en productos de consumo se ha llevado a cabo para múltiples

objetivos, por ejemplo: proteínas, ácidos nucleicos y polisacáridos han sido empleados en cremas

para piel, alimentos, pinturas y agentes de limpieza por su aporte de características espesantes,

acondicionadoras, emulsionantes y humectantes (Hayes, 1991). Así pues, se tiene que los

materiales biológicos también se han incorporado en productos de cuidado para el cabello y piel

del ser humano.

Como muestra de lo anterior, en la patante Personal care products containing bioemulsifiers, su

autor Michael Hayes se centra en el uso de bioemulsificantes como componentes de productos de

cuidado personal. Esto debido a que los biosurfactantes, resultan eficaces en la eliminación de la

suciedad y sebo presentes en la piel y cabello humano, además de proporcionar efectos

beneficiosos a nivel estético, higiénico y médico (Hayes, 1991). Lo anterior en virtud de

características como: alto peso molecular, estructura polimérica, estructura tridimensional y

específica, naturaleza hidrofóbica e hidrofílica, baja solubilidad en fase acuosa y estabilizante de

emulsiones, que son propias de los bioemulsificantes (Hayes, 1991). Estas características

mencionadas también son propias de los biosurfactantes, pues los bioemulsificantes son una

categoría de biosurfactantes (Karanth, Deo, & Veenanadig, 2005).

Con base en lo anterior una posible aplicación de los biosurfactantes se encuentra en un producto

de cuidado personal como lo es un shampoo. Siendo este producto aquel que remueve de la

epidermis la suciedad del cabello producida por mecanismos como: la secreción natural de grasa,

la producción de sales por la sudoración, la muerte de células, los residuos de productos

cosméticos y el polvo proveniente del medio ambiente, sin que se vea afectada la estructura

natural del cabello. La formulación típica de un shampoo la conforman: agua (~80%), surfactantes

y co-surfactantes (~10%), modificadores de viscosidad (<5%), preservativos, fragancia y color

(~2%) y aditivos (<3%) (Schueller & Romanowski, 2009). De ello, se puede definir que un shampoo

es una emulsión O/W, es decir, un sistema de 2 o más componentes inmiscibles en el cual uno de

ellos se encuentra suspendido en forma de gotas separadas (aceite) en el otro componente (agua),

recibiendo el nombre de fase dispersa el primero y el segundo de fase continúa (Schueller &

Romanowski, 2009).

En el uso específico de bioemulsionantes en bases de shampoo, estos pueden adicionarse en

concentraciones aproximadas de 0.02% a 0.5% en peso, logrando que el cabello aumente su

brillo y disminuya su estática, además de aumentar el tiempo entre intervalos en el cual debe ser

lavado (Hayes, 1991).

Con el fin de evaluar las proteínas ompG y ompN como biosurfactantes en la formulación de un

shampoo, se realizan pruebas de aplicación para dos concentraciones diferentes de cada proteína

en la formulación; de esta forma se determina si se presentan cambios en las características

propias del producto de cuidado personal, las cuales a su vez deben cumplir con los

requerimientos propios del producto.

2. METODOLOGÍA

2.1. Microorganismo y medio

2.1.1. Curvas de crecimiento

E. coli K-12 W3110/pCA24N ompG y E. coli K-12 W3110/pCA24N ompN fueron cultivados cada uno

en medio LB (10 g/L de NaCl, 15 g/L de Agar, 10 g/L de Triptona, 5g/L de Extracto de Levadura y 1

µg/mL Cloranfenicol) para luego ser incubados a una temperatura de 37°C durante 16 horas. Una

colonia de cada uno fueron aisladas para realizar preinóculos en 50 mL de medio LB (NaCl-10 g/L,

Triptona 10 g/L, Extracto de levadura 5 g/L, Cloranfenicol 50 μL) para de nuevo incubar por 16

horas a 37°C y 250 rpm. Posteriormente, se inoculó cada uno en 195 mL de medio LB al agregar

200 μL de cloranfenicol y 5 mL del respectivo preinóculo, para dejar los inóculos en shaker a 37°C y

250 rpm.

De estos inóculos se tomaron muestras de 1 ml cada 12 horas para realizar mediciones de

absorbancia en el espectrofotómetro Genesys 10 a una longitud de onda de 600 nm. Esto con el

objetivo de identificar en la curva de crecimiento las densidades ópticas a las cuales se presenta el

crecimiento exponencial y por tanto el momento en el cual se debe inducir el clon para la

sobreexpresión de las proteínas ompG y ompN.

2.1.2. Inducción con IPTG

E. coli K-12 W3110/pCA24N ompG y E. coli K-12 W3110/pCA24N ompN fueron cultivados cada uno

en medio LB (10 g/L de NaCl, 15 g/L de Agar, 10 g/L de Triptona, 5g/L de Extracto de Levadura y 1

µg/mL Cloranfenicol) para incubarlos a 37°C overnight. Del aislamiento de una colonia de cada uno

se realizó preinóculos en 50 mL de medio LB (NaCl-10 g/L, Triptona 10 g/L, Extracto de levadura 5

g/L, Cloranfenicol 50 μL) que debieron ser incubados por 16 horas a 37°C y 250 rpm. De estos

preinóculos se tomaron 5 mL de cada uno para realizar el correspondiente inoculó en 195 mL de

medio LB y 200 μL de cloranfenicol.

Una vez se realizaron los inóculos, los mismos fueron dispuestos en shaker a 37°C y 250 rpm

mientras se esperó el tiempo establecido en el inciso 2.1.1, el cual fue aproximadamente de 6-7

horas, para luego adicionar una solución de IPTG 0.2mM.

El inóculo que ya contenía la solución de IPTG, fue mantenido a 37°C y 250 rpm durante tres horas

más. Transcurrido este tiempo, las muestras fueron centrifugadas a 4500 rpm durante 15 minutos

a una temperatura de 4°C, las células fueron conservadas a 4°C. Posteriormente, el precipitado

obtenido en la centrifugación se diluyó en 500µL de Buffer #1 (pH=8.0, 50 nM Na-Phosphate, 300

nM NaCl , 0,01% Tween 20, 1% TritonX-100), esto con el fin de realizar su sonicación a una

amplitud de 37% durante 40 ciclos de 20sX40s ( 20 segundos de sonicación y 40 segundos de

reposo) manteniéndolas siempre a 4°C.

El sobrenadante obtenido después de la sonicación, fue almacenado para llevar a cabo la

purificación de las proteínas ompG y OmpN, en la cual fue necesario seguir el protocolo de

purificación presentado en el Kit Dynabeads TALON de Invitroge®, el cual consiste en una

cromatografía de afinidad cuya fase estacionaria son perlas afines a histidina y la fase móvil es una

mezcla de proteínas bacterianas, dentro de las cuales están las proteínas de interés que presentan

cola de histidina, así que se utiliza como eluyente imidazol (Buffer#3).

En un eppendorf fueron adicionados 700µL de solución dynabeads, esta fue sometida a un campo

magnético logrando que las perlas migraran hacia el magneto y se obtuviera así un líquido claro el

cual se descartaría. Luego, las perlas fueron resuspendidas en 700µL de Buffer #2(50 mM Na-

Phosphate - pH=8, 300 mM NaCl, 0.01% Tween®-20) para nuevamente someter la solución a

campo magnético y lograr que estas migraran hacia el magneto y así descartar el sobrenadante.

Las perlas fueron ahora resuspendidas en 100 µL de Buffer #2 y se les adicionaron 600 µL de

sobrenadante obtenido en la sonicación, esta solución fue dispuesta en shaker durante 10 minutos

a 4°C. Después de esto, la solución fue sometida a un campo magnético para separar las perlas y

así se descarta el sobrenadante. En dicho momento, las perlas fueron lavadas en cuatro ocasiones

con 300 µL de Buffer #2, siempre sometiendo la solución a campo magnético. Después de esto se

llevo a cabo el proceso de elusión, en donde se adicionaron 100 µL de Buffer #3 (150nM Imidazol,

50 mM Na-Phosphate - pH=8, 300 mM NaCl, 0.01% Tween ®-20) y se ubicaron las muestras en

shaker a 4°C por 5 minutos, para luego someter la solución a campo magnético y extraer el

sobrenadante con la proteína purificada. Las perlas fueron recolectadas para ser recuperadas por

medio del protocolo de reutilización del Kit el Dynabeads TALON de Invitroge®.

2.2. Electroforesis

Para comprobar la obtención de las proteínas deseadas ompG y ompN, se realizó una

electroforesis a muestras inducidas y a muestras purificadas. Esto en geles de poliacrilamida con

concentración de 10% y 12%, usando un marcador de peso molecular Bio-Rad# 161-00318.

En un beaker se mezclaron 2ml de solución de acrilamida, 1.25ml de solución 4xTrisCI/SDS pH 8.8

y 1.75 ml de H2O, a esta mezcla se adicionaron 25 µL de Persulfato de amonio 10% y antes de

servir el gel 5 µL de TEMED (agente polimerizante). Durante una hora se dejó correr el gel con un

amperaje de 150 V.

Para la fijación de las proteínas se preparó una solución que contenía 50% etanol, 10% ácido

acético y 40% H2O. En cuanto a la colocación y distinción se utilizó azul de Comassie-R y ácido

acético 10% respectivamente.

2.3. Preparación shampoo

La formulación para shampoo elegida es la PFC 124105 de Personal care products containing

bioemulsifiers (Hayes, 1991), aunque a esta fue ligeramente modificada según la disponibilidad de

las materias primas. La fórmula final empleada puede verse en el ANEXO 1 (Tabla 1 y Tabla 2),

donde se varió la concentración de biosurfactante a 0.002%w/w y 0.01%w/w.

También se prepararon un control positivo y un control negativo, donde al primero se le

reemplazó el biosurfactante original por emulsificante Tween 20® y Span 80® 0.2%, mientras al

segundo no se le agregaron dichos componentes.

Para la preparación del shampoo, en primer lugar se mezcló lauril eter sulfato de sodio, nacarante

y dietanolamida de coco, agitándolos a 70 rpm con una temperatura máxima de 50°C hasta lograr

una mezcla homogénea (Mezcla A) por 20 minutos.

En segunda instancia, el biosurfactante fue disuelto en agua desionizada. A esta solución se le

agregó ácido cítrico y cloruro de sodio hasta disolver las mismas. Las materias primas restantes

fueron agregadas a esta mezcla con agitación constante hasta lograr una mezcla homogénea

(Mezcla B).

Posteriormente, la mezcla B fue adicionada lentamente a la mezcla A mientras se mantenía una

agitación constante de 70 rpm a temperatura ambiente. Finalmente, la mezcla se dejó

homogenizar por 20 minutos más.

2.4. Análisis propiedades del shampoo

2.4.1. Detergencia

Con el fin de evaluar la efectividad del producto como agente detergente, se agregaron 25 g de

lanolina (reemplazo grasa humana) y 30 mL de cloroformo. Luego se tomaron 2 mL de esta

solución y se introdujo un corte de tela (reemplazo cabello humano) previamente pesado, se

dejaron transcurrir 2 minutos para luego sacar la tela, secarla y pesarla nuevamente. Esto para

conocer el cambio en su peso.

Posteriormente, en un tubo de ensayo se adicionaron 1 mL de muestra de shampoo y 49 mL de

H2O desionizada para en esta solución introducir un corte de tela previamente pesada, se mantuvo

una agitación constante (reemplazo agitación manos humanas). Después de 2 minutos se enjuagó

y secó la tela para pesarla.

Con la diferencia de pesos es posible calcular la cantidad de solución de lanolina que pudo ser

retirada por cada una de las muestras de shampoo, y con ello el poder detergente.

2.4.2. Cantidad y calidad de espuma

Para determinar la cantidad y calidad de espuma para cada una de las muestras de shampoo, se

adicionó 0.5 mL de agua y 0.5 mL de shampoo a un tubo de ensayo; esta mezcla se agitó

manualmente durante dos minutos manteniendo un ángulo de agitación de 70°.

Trascurrido este tiempo se realizó la medición del volumen de espuma generado. En cuanto a la

calidad de la espuma se observó el espacio entre burbujas y se realizó un registro fotográfico, para

evaluar si el espacio es amplio o nulo.

2.4.3. Propiedades físico-químicas

Con el objetivo de establecer el pH de la formulación con biosurfactante, se utilizó papel indicador

de pH.

3. RESULTADOS Y ANÁLISIS

3.1. Determinación tiempo de inducción

Para E. coli K-12 W3110/pCA24N ompG y E. coli K-12 W3110/pCA24N ompN, se obtuvo que la

inducción debe ser realizada entre la sexta y séptima hora después inocular, pues es en este

intervalo de tiempo donde la absorbancia fue de 0.7 (Figura 4 y 5). Esto se explica en que es

cuando termina la fase de latencia e inicia la fase exponencial del crecimiento, pues en la primera

fase la bacteria se encuentra en fase de adaptación al nuevo medio y no se presenta un

incremento en el número de células pero sí una gran actividad metabólica, por lo tanto sería una

carga energética muy grande realizar la inducción de una proteína. En cuanto a la segunda fase, en

ella la velocidad de crecimiento bacteriano es alta.

3.2. Concentración de proteína

En la Figura 6 y 7, se muestran los geles de poliacrilamida de la electroforesis realizada a las

muestras obtenidas tras la inducción con IPTG. Con ellos se corrobora la obtención de las

proteínas ompG y ompN, teniendo en cuenta que el marcador de peso utilizado con sus franjas 5 y

6 indica un peso de 31 kDa y 45 kDa respectivamente. Así que, se esperaba obtener bandas entre

dichas franjas pues ompG tiene un peso molecular de 34 kDa en su forma desnaturada y ompN

tiene un peso de 39 kDa en su forma natural.

En la Figura 6, el primer carril corresponde al marcador de peso, mientras en el segundo y tercer

carril se tiene el primer lavado y el último lavado de la purificación de la proteína. En el último

lavado se tiene una banda gruesa que corresponde a la proteína ompG aislada (recuadro azul

claro) que cuenta una cola de histidina.

Para la Figura 7, el marcador de peso se encuentra en el carril número 8, mientras el primer lavado

y el último están en el séptimo y segundo carril respectivamente. De forma similar, para el último

lavado se tiene una sola banda gruesa, situación que refleja que se purificó adecuadamente la

proteína ompN (recuadro azul claro) que tiene cola de histidina.

3.3. Cuantificación de proteína

Después de realizada la extracción de las proteínas ompG y ompN se cuantificó la concentración de

las mismas por medio de una prueba de espectofotometría, encontrando que la concentración

promedio obtenida para ompG fue de 0.075 mg/ml y para ompN fue de 0.105 mg/ml. Estas

concentraciones son bajas, teniendo en cuenta resultados de trabajos anteriores. Con base en lo

anterior, es posible afirmar que las proteínas se encontraban muy diluidas, esto debido a la

cantidad de buffer añadido en la purificación de las mismas.

3.4. Formulación shampoo

El control positivo fue caracterizado con el fin de: evaluar la viabilidad de la formulación con las

nuevas materias primas y conocer sus propiedades (Tabla 1). Con dicha información, fue posible

comparar las muestras que contenían proteína y así evidenciar si la presencia de biosurfactante

generaba cambios en las características del producto de cuidado personal.

3.5. Detergencia

El shampoo es un producto de cuidado personal que se caracteriza por actuar como agente de

limpieza, por este motivo fue necesario evaluar el poder de detergencia de la formulación con

proteína ompG y ompN.

Los resultados de esta prueba se presentan en la Tabla 2, donde se observa que las muestras con

proteína presentaron gran variación, pues el shampoo con ompN presento un mayor porcentaje

de limpieza con respecto a la formulación con ompG, pero a su vez un menor porcentaje que el

control negativo. Respecto a la cantidad de biosurfactante, esta generó cambios en la detergencia.

Esto teniendo en cuenta que tanto en la formulación con ompN como en la formulación con

ompG, al incrementar la cantidad de proteína se incrementa el porcentaje de detergencia.

La razón por la cual control negativo presentó un poder de detergencia, podría ser que la

formulación contiene: lauril eter sulfato de sodio, dietanolamida de coco, sodio lauroil sarcosinato

y probetaina CAPB, componentes incluidos en esta para cumplir con la función de detergencia.

Para dar más justificación a los resultados, se debe realizar un análisis de la formulación, pues un

shampoo es una mezcla con muchos componentes que incrementan la posibilidad de

interacciones físicas y químicas. Pues las formulaciones a nivel industrial, así como la trabajada en

este proyecto, presentan gran complejidad debido a la cantidad y utilidad de los ingredientes que

la conforman. Aspecto que dificulta la identificación de la influencia de un ingrediente de la

formulación sobre las características de este producto de cuidado personal (Lin, 2010). Por esta

razón no es posible concluir que la proteína este directamente relacionada con el cambio en la

detergencia del shampoo.

3.6. Calidad y cantidad de espuma

Esta prueba se desarrollo para evaluar la cantidad y las características de la espuma generada por

el shampoo que contiene proteína como biosurfactante. Esto se logró mediante la agitación

constante de una mezcla de shampoo en agua (ANEXO 2- Figura 1). Los resultados se muestran en

la Tabla 3.

La formulación propuesta para todas las muestras no se diluía fácilmente en agua, aspecto que se

cree interfirió en el desarrollo de la prueba, pues como se evidencia en la Tabla 3, la muestra con

ompG al 0.002% w/w presenta el más bajo volumen de espuma entre todas las muestras que

tenían presencia de proteína, y adicionalmente los volúmenes de espuma para todas la muestras

de shampoo con proteína son casi los mismos.

Por otro lado, se encuentra que las muestran con ompG y ompN tiene los mismos resultados en

volumen de espuma que el control negativo, mientras el control positivo generó el mayor volumen

de espuma. Por este motivo, se cree que los surfactantes utilizados a nivel industrial aumentan la

cantidad de espuma, mientras los biosurfactantes usados en el presente proyecto no cuentan con

dicha característica.

En cuanto a la calidad de la espuma, si el espacio entre burbujas es amplio se dice que tiene una

calidad abierta, por otra parte, si el espacio entre cada burbuja es casi nulo se dice que es una

espuma cremosa o cerrada; así es definida la espuma conforme a su estabilidad (Lenntech BV). En

los resultados (ANEXO 2-Figura 1) se encuentra que todas las muestras que contenían proteína

generan espuma con menor espacio entre burbujas, mientras que el control positivo y negativo

presentan espuma de tipo abierta. Por lo tanto, las proteínas no mejoran la cantidad pero si la

calidad de la espuma.

Es importante mencionar que mediante esta prueba, no se puede inferir directamente si las

proteínas ompG y ompN son responsables de la generación y características de la espuma. Sin

embargo, evaluar la calidad y cantidad de espuma de un shampoo resulta necesario, teniendo en

cuenta que una mayor cantidad de espuma genera en el consumidor una sensación de limpieza y

calidad del producto. Aspecto importante en términos del mercado para el producto de cuidado

personal, pero que no influye realmente en la efectividad como agente de limpieza.

3.7. Propiedades físico-químicas

Con el fin de conocer si los valores de pH de las muestras se ajustaban a los estándares manejados

en la producción de shampoo, se registró pH usando papel indicador puesto que la cantidad de las

muestras no era suficiente para utilizar el pHmetro.

En la Tabla 4, se reportan los valores de pH obtenidos a partir de esta prueba, donde se evidencia

que el pH de las muestras se encuentra en un rango de 6 a 8. Por otro lado, se encuentra

diferencia entre las muestras control y las muestras con proteínas; este cambio se debe a que la

proteína utilizada como biosurfactante se encuentra disuelta en Buffer #3 (Sección 2.1.3) cuyo pH

es 8, por consiguiente, el pH de la formulación se ajustó a ese valor generándose así el cambio de

esta propiedad físico-química.

Respecto a la industria cosmética, está maneja para productos de cabello un pH entre 5 y 8, es

decir, un pH casi neutro o ligeramente ácido (Hill & Kohl, 1999), esto sustentado en el pH de la piel

y del cuero cabelludo, los cuales se estiman entre 5.9 a 6.9 y en 5.5 respectivamente (Pommier).

Los resultados obtenidos para la formulación con proteína ompG y ompN (Tabla 4) se encuentran

entre este rango, por lo cual cumplen con los estándares industriales.

4. CONCLUSIONES

La presencia de las proteínas transmembranales ompG o ompN en la formulación de un shampoo,

se cree no potencializa las propiedades de detergencia y cantidad de espuma del mismo, pues se

encontró que el porcentaje de detergencia de las muestras de shampoo con proteína era similar al

del control negativo, aunque al incrementar cantidad de proteína el poder de detergencia mejora

y es mayor con la proteína ompN. Situación similar se presentó para el volumen de espuma

generada por el shampoo con proteína y el shampoo sin biosurfactante.

Sin embargo, se obtuvieron resultados positivos respecto a la calidad de la espuma, pues tanto la

espuma en el shampoo con proteína ompG como con ompN cambió de abierta a cremosa de

acuerdo a lo obtenido con el control positivo. Las proteínas al tener estructuras tridimensionales

requieren de tiempo para lograr un correcta disposición de sus secciones hidrofóbicas e

hidrofílicas, así que posiblemente mientras esto sucede se pueden presentar múltiples y

desconocidas interacciones entre los componentes de una formulación dada la complejidad de los

productos cosméticos tal como es el caso de un shampoo.

Finalmente, teniendo en cuenta que un surfactante se clasifica de acuerdo a su función, es

necesario evaluar con mayor profundidad las propiedades detergentes y espumeantes de las

proteínas ompG y ompN, con el fin de afirmar con una mayor certeza la incidencia de las proteínas

sobre las características propias de un shampoo, esto pues a mayor cantidad de proteína aumenta

tanto el poder de detergencia como la cantidad de espuma. Así que se creer que al incrementar la

concentración de biosurfactente las características del producto de cuidado personal podrían

verse mejoradas. Con base en esto, se recomienda emplear mayores concentraciones de proteína.

5. RECOMENDACIONES

Para evidenciar más claramente la influencia de las proteínas transmembranales en una

formulación cosmética se recomienda evaluar las proteínas porinas en una formulación básica,

para que así sea más sencillo identificar las causas de los posibles cambios generados en el

producto de cuidado personal.

Adicionalmente, se debe mencionar que dado que muchos productos de la industria cosmética

son incluyen surfactantes, es importante evaluar la inclusión de las proteínas transmembranales

en otros productos cosméticos.

Surfactantes

Extensores Humectadores Adherentes Estabilizadores

Emulsificantes Dispersantes

Detergentes

6. FIGURAS Y TABLAS

Figura 1. Clasificación de los surfactantes de acuerdo su aplicación (Centro Internacional de Agricultura Tropical, 1980).

Figura 2. Estructura de ompG en conformación abierta. Se muestran 14 hebras antiparalelas numeradas S1-S14 iniciando en el extremo N (azul) y terminando en extremo C (rojo) (Yildiz, Vinothkumar, Goswami, & Kuhlbrandt, 2006).

Figura 3. Estructura de la proteína ompA, que presenta una forma análoga a la proteína ompN (Pautsch & Schulz, 2000).

Figura 4. Curva de crecimiento de E. coli K-12 W3110/pCA24N ompG

con absorbancia a 600 nm.

Figura 5. Curva de crecimiento de E. coli K-12 W3110/pCA24N ompN con absorbancia a 600 nm.

0

0,5

1

1,5

2

2,5

0 2 4 6 8 10 12 14

Ab

sorb

anca

a 6

00

mn

Tiempo (hr)

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8

0 2 4 6 8 10 12 14

Ab

sorb

anci

a a

60

0m

n

Tiempo(hr)

Figura 6. Resultados electroforesis proteína ompG.

Figura 7. Resultados electroforesis proteína ompN.

Tabla 1. Propiedades físico-químicas de Control positivo y de Control negativo.

Tabla 2. Medición poder detergencia del shampoo con proteína ompG (0.002% y 0.01% w/w) y ompN (0.002% y 0.01% w/w).

Tabla 3. Medición cantidad de espuma generada por shampoo con proteína ompG (0.002% y 0.01% w/w) y ompN (0.002% y 0.01% w/w).

Tabla 4. Medición pH en shampoo con proteína ompG (0.002% y 0.01% w/w) y ompN (0.002% y 0.01% w/w) después de preparado.

Propiedades Control positivo

pH 6

Densidad [g/ml] 0.82

Viscosidad [cP] 19230

Muestra Cantidad grasa retirada [g] Porcentaje limpieza

Contro positivo 0.0071 7.78%

Control negativo 0.0053 6.23%

OmpG 0.002% w/w 0.0005 0.69%

OmpN 0.002% w/w 0.0014 1.57%

OmpG 0.01% w/w 0.0006 0.77%

OmpN 0.01% w/w 0.0057 8.48%

Muestra Volumen espuma generado [mL] Calidad espuma

Contro positivo 1 Abierta

Control negativo 0.6 Abierta

OmpG 0.002% w/w 0.3 Cremosa

OmpN 0.002% w/w 0.5 Cremosa

OmpG 0.01% w/w 0.6 Cremosa

OmpN 0.01% w/w 0.6 Cremosa

Muestra pH

Control Positivo 6

Control Negativo 5.5 a 6

OmpG 0.01 7 a 8

OmpG 0.002 7 a 8

OmpN 0.002 7 a 8

OmpN 0.01 7 a 8

7. REFERENCIAS

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con herbicodas. Cali.

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Pommier, L. Diccionario Homeopático de Urgencias . Paidotribo.

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Characterization of Two Quiescent Porin Genes,nmpC and ompN, in Echerichia coli. Journal of

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Romanowski, Beginning Cosmetic Chemistry (págs. 313-323). USA: Allured Publishing Corporation.

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outer-membrane porin OmpG in the open and closed conformation. The EMBO Journal , 25, 3702–

3713.

ANEXOS

ANEXO 1. FORMULACIÓN SHAMPOO

Tabla 1. Formulación shampoo control positivo.

Tabla 2. Formulación muestras shampoo con proteína ompG (0.002% y 0.01% w/w) y ompN (0.002% y 0.01% w/w)

Componente %w/w

Sodio lauril eter sulfato 20

Nacarante 0.5

Dietanolamida de coco 2.5

Agua 45.2

Tween 0.06

Span 0.13

Procide H-55 0.1

Acido cítrico 0.2

Cloruro de sodio 0.5

Sodio lauroil sarcosinato 5

Poliquaternium-7 1.8

Colágeno hidrolizado 4

Probetaína CAPB 20

Componente %w/w

Sodio lauril eter sulfato 20

Nacarante 0.5

Dietanolamida de coco 2.5

Agua 45.2

Biosurfactante 0.01 - 0.002

Procide H-55 0.1

Acido cítrico 0.2

Cloruro de sodio 0.5

Sodio lauroil sarcosinato 5

Poliquaternium-7 1.8

Colágeno hidrolizado 4

Probetaína CAPB 20

ANEXO 2. RESULTADOS ADICIONALES

3.6 Calidad y cantidad de espuma

Figura 1. Prueba de calidad y cantidad de espuma a muestras de control y shampoo con proteína. Esta prueba fue realizada 7 días después de preparadas las muestras y ser sometidas a condiciones ambientales normales.