Caracterización Molecular Del Fitopatógeno Moniliophthora ...
EVALUACIÓN PRELIMINAR DE MODELOS DE INFECCIÓN … · 2008-11-04 · Prueba de Duncan para...
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EVALUACIÓN PRELIMINAR DE MODELOS DE INFECCIÓN CRUZADA POR Fusarium sp., AISLADOS DE PROCESOS PATOLÓGICOS EN PLANTAS, ANIMALES Y HUMANOS
NATHALIE CAMACHO RAMÍREZ
JULIE ANDREA GIL GÓMEZ
TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito parcial para optar al título de
MICROBIÓLOGO AGRÍCOLA Y VETERINARIO y
MICROBIÓLOGO INDUSTRIAL
DIRECTOR María Ximena Rodríguez, Ph.D.
CODIRECTOR Claudia Marcela Parra Giraldo, M.Sc.
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA Y VETERINARIA CARRERA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL
Bogotá, D.C. 2008
EVALUACIÓN PRELIMINAR DE MODELOS DE INFECCIÓN CRUZADA POR Fusarium sp., AISLADOS DE PROCESOS PATOLÓGICOS EN PLANTAS, ANIMALES Y HUMANOS
NATHALIE CAMACHO RAMÍREZ
JULIE ANDREA GIL GÓMEZ
APROBADO
__________ __________ Maria Ximena Rodríguez Claudia Marcela Parra
Director Codirector __________ __________ Silvia Restrepo Melva Linares Jurado 1 Jurado 2
EVALUACIÓN PRELIMINAR DE MODELOS DE INFECCIÓN CRUZADA POR Fusarium sp., AISLADOS DE PROCESOS PATOLÓGICOS EN PLANTAS, ANIMALES Y HUMANOS
NATHALIE CAMACHO RAMÍREZ
JULIE ANDREA GIL GÓMEZ
APROBADO
__________ __________ Ingrid Schuler Janeth Arias Palacios Decana académica Directora de Carrera
NOTA DE ADVERTENCIA
Artículo 23 de la Resolución N° 13 de Julio de 1946 “La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos
por sus alumnos en sus trabajos de tesis, solo velará por que no se
publique nada contrario al dogma y a la moral católica y por que las
tesis no contengan ataques personales contra persona alguna,
antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la
justicia”
A mi Ángel de la Guarda, mi hermana por ser mi guía, compañía y
cómplice de mi vida y mis sueños.
Julie Andrea Gil Gómez
Pep, Nacito, Nereli y Pauli, gracias por su apoyo incondicional en
todas las fases de esta tesis, sin ustedes nada hubiera sido posible.
Nathalie Camacho Ramírez
v
AGRADECIMIENTOS
A nuestros padres por su apoyo incondicional y por creer siempre
en nosotras.
A Claudia Parra por abrirnos las puertas del laboratorio de
micología, por la confianza y el apoyo dado para la realización de
este trabajo.
A Maria Ximena Rodríguez por la excelente guía, con la cual se
culminó este trabajo.
A Julián Amaya y Pilar Montoya por toda la dedicación y
colaboración sin la cual este trabajo no habría culminado nunca.
A Gisela Castrillón Moreno por su asesoría en el análisis estadístico.
A Pedro Camacho y Lina Gómez por sus aportes en la redacción.
A todas las personas y amigos que de una u otra manera fueron
importantes en el desarrollo del proyecto.
vi
TABLA DE CONTENIDO
Página
Resumen xiii
Abstract xiv
1. Introducción 1
2. Marco teórico 4
2.1. Generalidades de Fusarium sp. 4
2.2. Características morfológicas de Fusarium sp. 5
2.3. Taxonomía del género Fusarium 6
2.4. Patogenicidad de Fusarium sp. 7
2.4.1. Fusarium sp., fitopatógeno 7
2.4.1.1. Tomate como especie susceptible a infección por
Fusarium sp. 10
2.4.2. Fusarium sp., patógeno humano y animal 11
2.5. Factores de virulencia 12
2.5.1. Factores de virulencia no enzimáticos 12
2.5.2. Factores de virulencia enzimáticos 14
2.5.2.1. Queratinazas 16
2.6. Hongos queratinofílicos 17
3. Justificación 19
3.1. Formulación del problema 19
3.2. Justificación 20
4. Objetivos 22
4.1. Objetivo general 22
4.2. Objetivos específicos 22
5. Materiales y métodos 23
5.1. Origen de los aislamientos de Fusarium sp. 23
vii
Página
5.2. Procesamiento de material vegetal 24
5.3. Toma y procesamiento de muestras animales 26
5.4. Realización de cultivos monospóricos 27
5.5. Identificación taxonómica de los aislamientos 28
5.6. Preservación de las cepas aisladas 29
5.6.1. Conservación de hongos en agua destilada estéril 29
5.6.2. Conservación en aceite mineral estéril 29
5.6.3. Conservación en papel filtro estéril 30
5.7. Ensayos de patogenicidad cruzada 31
5.7.1. Actividad fitopatógena 32
5.7.1.1. Preparación del inóculo 32
5.7.2. Inoculación de plántulas 33
5.7.3. Actividad patógena sobre tejido animal y humano 35
5.7.3.1. Modelo in vitro de patogenicidad animal y
humano 36
5.8. Análisis estadístico 38
6. Resultados y discusión 39
6.1. Origen de los aislamientos 39
6.2. Modelo de infección en plantas 47
6.3. Modelo de infección humano y animal 53
6.4. Fusarium sp., como modelo multihospedero 64
7. Conclusiones 66
8. Recomendaciones 68
9. Referencias 69
10. Anexos 81
viii
ÍNDICE DE TABLAS
Página
Tabla 6.1. Aislamientos de Fusarium sp. de origen
humano 39
Tabla 6.2. Procesamiento de muestras provenientes de
lesiones en animales 41
Tabla 6.3. Aislamientos a partir de material vegetal 45
Tabla 6.4.
Crecimiento en centímetros y área bajo la
curva de los aislamientos de Fusarium sp., en
ensayo fitopatógeno
50
Tabla 6.5. Prueba de Duncan para aislamientos en
ensayo fitopatógeno 51
Tabla 6.6.
Prueba cualitativa y cuantitativa de actividad
patógena de Fusarium sp. sobre tejidos
queratinizados
54
Tabla 6.7. Prueba de rango múltiple de Duncan para
tratamientos de queratina 55
Tabla 6.8.
Prueba de rango múltiple de Duncan para
agrupamiento de aislamientos según
degradación de queratina
60
Tabla 6.9. Prueba de Duncan para degradación de
queratina 62
Tabla 6.10.
Prueba de agrupamiento de Duncan de los
aislamientos en relación con la degradación
de casco
63
Tabla 6.11.
Prueba de agrupamiento de Duncan de los
aislamientos en relación con la degradación
de pelo
64
ix
Página
Tabla 6.12. Correlación de los modelos de patogenicidad 65
x
ÍNDICE DE FIGURAS
Página
Figura 5.1. Cortes transversales 25
Figura 5.2. Lavado y desinfección de cortes
transversales 25
Figura 5.3. Puntos de siembra y crecimiento de agentes
fitopatógenos 25
Figura 5.4. Desprendimiento de conidios para
suspensión 27
Figura 5.5. Cultivos monospóricos 28
Figura 5.6. Discos de Agar-Micelio para conservación
en agua destilada 29
Figura 5.7. Conservación en aceite mineral 30
Figura 5.8. Metodología conservación en papel filtro 31
Figura 5.9. Cumplimiento de los postulados de Koch en
plántulas de tomate y clavel 32
Figura 5.10. Procedimiento inoculación de plántulas 34
Figura 5.11. Re-aislamiento de cepas, prueba
fitopatógena 35
Figura 5.12. Método de peso seco 37
Figura 5.13. Montaje de medios sólidos, prueba sobre
tejido queratinizado 38
Figura 6.1. Porcentaje de frecuencia de aislamiento de
hongos en muestras de animales 44
Figura 6.2. Control negativo prueba progresión de la
enfermedad 48
Figura 6.3. Prueba de colonización de plantas de
tomate por Fusarium sp. 49
xi
Página
Figura 6.4. Actividad queratinolítica Fusarium sp. 57
xii
ÍNDICE DE ANEXOS
Página
Anexo 1 Hojas de vida de los aislamientos de Fusarium
sp. 81
Anexo 2
Unidades de área bajo la curva de las 10
réplicas del progreso de la enfermedad de los
aislamientos de Fusarium sp. en plántulas de
tomate
147
Anexo 3 Agrupamiento de Duncan de área bajo la curva
de los aislamientos de Fusarium sp. 148
Anexo 4 Agrupamiento de Duncan de réplicas en
ensayo fitopatógeno 150
Anexo 5
Análisis estadístico del comportamiento de los
aislamientos de Fusarium sp. en prueba de
degradación in vitro de tejidos queratinizados.
151
Anexo 6
Análisis estadístico de la degradación de Casco
por aislamientos de Fusarium sp. en pruebas
in vitro.
155
Anexo 7
Análisis estadístico de la degradación de pelo
por aislamientos de Fusarium sp. en pruebas
in vitro.
157
xiii
RESUMEN
Fusarium es un género de hongos de distribución universal, que se
comporta como fitopatógeno. Algunas especies del género son
queratinofílicas y queratinolíticas, confiriéndole la capacidad de
colonizar tejidos de humanos y animales, convirtiéndose así en
agentes patógenos de estos hospederos.
En la presente investigación se realizaron aislamientos de Fusarium
sp. a partir de plantas y animales, ya que, previamente, se contaba
con aislamientos en humanos. Se desarrollaron tres modelos de
infección con tres aislamientos de cada hospedero, el modelo de
infección fitopatógeno con plántulas de tomate y, los modelos de
infección animal y humano con tejidos queratinizados (casco de
vaca y pelo de humano).
Los resultados mostraron que la presencia de Fusarium sp. en
animales es mayor de lo que se encuentra reportado, y en plantas
se confirmó su frecuencia. Por otro lado, los modelos de
patogenicidad confirmaron tendencias de infección en los
hospederos originales, y al mismo tiempo demostraron la capacidad
de Fusarium sp. de colonizar otros tejidos.
Con estos modelos se buscaba establecer el estudio de las
infecciones cruzadas entre hospederos. Por esta razón se realizó un
análisis donde se observó que no había relación entre las
procedencias y que éstas se comportan de manera independiente.
Este trabajo constituye un estudio preliminar, base para poder
llegar a conclusiones sobre el comportamiento de Fusarium como
multihospedero, a partir de la evaluación del 100% de los
aislamientos obtenidos.
xiv
ABSTRACT
Fusarium is a fungal genus of universal distribution which behaves
as phytopathogen. Some species are keratinophilic and keratinolitic,
conferring the ability of human and animal tissue colonization; this
capacity makes Fusarium a human and animal pathogen.
Fusarium sp. isolates from plants and animals were collected for
this study, human isolates were recovered from previous studies.
Three infection models were developed including three isolates from
each host. Tomato plants were used for plant infection model, and
keratinized tissues (bovine hoof and human hair) for animal and
human infection models.
The results showed that Fusarium sp. occurrence in animals is
higher than reported, and isolation frequency in plants was
confirmed. The pathogenicity models confirmed infection tendency
for the original host, and at the same time proved Fusarium
capacity of colonizing different tissues.
The pathogenicity models aimed to establish host cross infections
studies. We performed an analysis which showed that there is not a
relation between isolation origins due to their independent
behavior.
This work constitutes a preliminary study, which may possible to
conclude about multihost Fusarium behavior evaluating 100% of
collected isolates.
1
1. INTRODUCCIÓN
Fusarium es un género de hongos de distribución universal.
Usualmente se encuentra como saprófito de suelo; sin embargo, se
ha reportado como parásito facultativo de numerosos hospederos
en los que se incluyen plantas, animales y humanos.
Algunas especies del género Fusarium son habitantes del suelo. Se
reconocen por su impacto económico negativo en la agricultura
mundial, ya que son agentes causales del marchitamiento vascular
y pudrición basal de una gran variedad de plantas. Por otro lado, se
ha encontrado que algunas especies de este género han emergido
como patógenos oportunistas de humanos causando enfermedades
diseminadas en pacientes inmunocomprometidos, quemados, con
heridas abiertas y en ocasiones se han reportado, también, como
agentes causales de infecciones en pacientes inmunocompetentes.
Entre las características no enzimáticas asociadas con la virulencia
de este género se destaca su amplia distribución, atribuida a su
capacidad para crecer en gran número de substratos y a su eficaz
mecanismo de dispersión. En el mismo sentido se destaca la
adherencia que le confiere la capacidad de colonizar los tejidos y la
producción de toxinas.
Adicionalmente, los complejos enzimáticos producidos por las
especies de este género constituyen un importante factor de
virulencia. Se ha identificado la capacidad de producir el complejo
de enzimas polisacaridasas que pueden alterar o degradar los
2
distintos componentes (polisacáridos) presentes en las paredes
celulares. Dentro de éstas, se destaca la producción de pectinliasas,
celulasas, arabinasas, poligaracturonidasas, entre otras.
Algunas especies del género presentan capacidad queratinofílica y
queratinolítica que les confiere la capacidad de colonizar tejidos de
humanos y animales y, de esta forma, convertirse en agentes
patógenos.
Actualmente se desconoce hasta qué punto están conservados
estos factores de virulencia en los grupos de hospederos que afecta
Fusarium. Una de las principales causas es la falta de estudios y la
ausencia de modelos que permitan el análisis simultáneo de la
virulencia en plantas y animales.
Con la finalidad de contribuir al análisis de Fusarium como un
patógeno multihospedero, se llevó a cabo este trabajo que consistió
en realizar diez aislamientos de cada hospedero a evaluar (planta,
animal y humano) y hacer pruebas de inoculación cruzada entre
nueve aislamientos (tres de cada uno de los modelos de
hospedero).
La investigación plantea tres modelos de infección para Fusarium
sp., plántulas de tomate como modelo de infección fitopatógena y,
como modelo de infección animal y humano se manejaron tejidos
queratinizados (casco de vaca y pelo respectivamente).
3
Con estos modelos se busca preestablecer el estudio de las
infecciones cruzadas entre hospederos, basado en un modelo
fúngico multihospedero.
4
2. MARCO TEÓRICO
2.1. GENERALIDADES DE Fusarium sp.
Fusarium es un género de hongos de distribución universal, ubicuos
que se caracterizan por ser hongos moniliaceos (hialinos),
filamentosos, usualmente saprófitos de suelo, asociados a materia
orgánica en descomposición e insectos (Giani, 1997; Tosti et al.,
2000; Summerell et al., 2001).
Tosti y colaboradores (2000) al igual que Summerell y
colaboradores (2001), reportan el género Fusarium como parásitos
facultativos de numerosos hospederos, en los que se incluyen
plantas, humanos y animales.
La forma perfecta (telemorfo) de Fusarium en las especies que la
presentan, pertenecen al orden Hypocreales, a los géneros Nectria,
Calonectria, Micronectriella y Gibberella, que se caracterizan porque
las ascosporas son producidas en ascocarpos en forma de peritecio.
La forma anamorfa pertenece al filo Deuteromycota o Fungi
imperfecti (hongos mitospóricos). Se describen 30 especies, de las
cuales solo a 15 se les conoce su fase telemórfica (Nelson et al.,
1983; Pardo & Durán, 1999; Summerell et al., 2001).
5
2.2. CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS DE Fusarium sp.
Las características morfológicas que permiten la identificación del
género Fusarium se determinan macroscópica y
microscópicamente. Éstas son agrupadas en características
primarias y secundarias que son utilizadas para separar las especies
en los sistemas taxonómicos existentes. Entre las características
primarias se incluyen la forma de los macroconidios, origen y forma
de los microconidios, tipo de conidióforo y por último la presencia o
ausencia de clamidiosporas (posición y número), mientras que, en
las características secundarias, se encuentran la presencia o
ausencia de esporodoquio, morfología y pigmentación de la colonia
(Nelson et al., 1994; Pardo & Durán, 1999).
Los conidios son esporas asexuales producidas por células
conidiógenas formadas por la diferenciación del extremo de la hifa.
La diversidad de estas estructuras ha permitido la utilización de
esta característica para la clasificación de los hongos (Moore,
1996). Partiendo de lo anterior, se ha determinado que la forma y
tamaño de éstos, es la característica principal para el
reconocimiento de Fusarium sp. Los macroconidios son curvados,
hialinos, pluriseptados, con una célula apical más o menos
puntiaguda y una célula basal en forma de pie que constituye la
base para la identificación. Los microconidios son producidos en el
micelio aéreo, comúnmente unicelulares, elipsoidales, fusiformes,
claviformes, piriformes o subglobosos, similares en ancho a los
macroconidios, con una base redondeada o truncada, por lo general
formando cabezuelas mucosas o cadenas basípetalas. No siempre
6
se producen los dos tipos de esporas (Moore, 1996; Alexopoulos et
al., 1996; Agrios, 2005).
El conidióforo es una parte de la hifa que soporta la célula
conidiógena, que puede ser monofiálides o polifiálides, ramificados
o simples. Las monofiálides producen conidios desde una sola
abertura y en las polifiálides surgen los conidios desde más de una
abertura en la misma célula (Booth, 1971; Carrillo, 2007).
Las colonias del género Fusarium sp. crecen rápidamente y
presentan diversos colores (blanco, rosado pálido, rojo, anaranjado,
púrpura, celeste, verde aceituna, pardo o no presentan pigmento),
aunque en el reverso de la colonia pueden presentar colores pardo
oscuro o negro. El micelio puede presentar una densidad alta o
baja, ya sea algodonoso o como un fieltro. Los pigmentos que
difunden en el agar suelen variar de color o tono con el pH.
(Summerell et al., 2001; Carrillo, 2007).
2.3. TAXONOMÍA DEL GÉNERO Fusarium sp.
El género Fusarium fue descrito por Link en 1809, como esporas
pluriseptadas fusiformes que crecen sobre estromas. Algunos años
más tarde, en 1821 el género fue validado por Fries, quien lo
incluyó en el orden Tuberculariae. Después Wollenweber y Reinking
en 1935, publicaron un trabajo sobre Fusarium. En este trabajo
estudiaron 1000 cepas de Fusarium y las organizaron en 16
secciones que contenían 65 especies, 55 variedades y 22 formas
especiales (Pardo & Durán, 1999; Summerell et al., 2001).
7
La taxonomía del género Fusarium ha sido muy complicada debido
a que las descripciones iniciales se hicieron con base en
características que varían frecuentemente según los medios que se
utilizaban. Adicionalmente, se debe considerar que este género
exhibe un importante grado de variación con respecto a la
morfología microscópica y a sus características fisiológicas, debido a
la habilidad de Fusarium para colonizar diversos hábitats ecológicos
en la mayoría de las áreas geográficas (Samson et al., 1981;
Nelson et al., 1994).
Los sistemas taxonómicos actuales independiente de la corriente
que sigan, se basan en el trabajo de Wollenweber y Reinking
(1935). Sin embargo, las clasificaciones taxonómicas más utilizadas
actualmente son la realizadas por Booth (1971) y por de Nelson y
colaboradores (1983). Este último, reúne los trabajos realizados
anteriormente por otros investigadores, selecciona lo mejor de cada
sistema y los combina de tal forma que reduce el número de
especies, variedades y formas (Samson et al., 1981; Nelson et al.,
1994; Pardo & Durán, 1999).
2.4. PATOGENICIDAD DE Fusarium sp.
2.4.1. Fusarium sp., fitopatógeno
Los hongos filamentosos constituyen un grupo de microorganismos
ubicuo y extremadamente versátil. La gran mayoría de las especies
viven como saprofitos sobre materia orgánica en descomposición;
8
sin embargo, algunas son capaces de colonizar organismos vivos y
provocar enfermedad. A pesar de tratarse de un número restringido
de especies, los patógenos fúngicos tienen un gran impacto en la
economía mundial (Agrios et al., 2005; Di Pietro & Roncero, 2005).
Según estimaciones de la FAO, la agricultura mundial pierde cada
año el 12% de su producción por daños causados por hongos
fitopatógenos, más que por cualquier otro agente (Agrios et al.,
2005; Di Pietro & Roncero, 2005).
El género Fusarium es un habitante del suelo de gran importancia
económica para la agricultura en el mundo ya que es causante del
marchitamiento vascular y pudrición basal (Monzón & Rodríguez,
2007).
Fusarium sp. se comporta como fitopatógeno al encontrar la planta
con las características apropiadas de hospedero. Este penetra las
diferentes capas de la corteza de la raíz hasta alcanzar el sistema
vascular. Una vez establecido, la colonización de la planta es
llevada a cabo rápidamente a través del xilema, que conlleva a la
sintomatología característica de marchitez (Roncero et al., 2000;
Agrios, 2005).
Algunas especies de Fusarium son patógenas de los cereales y
pueden producir micotoxinas en los granos aún antes de la cosecha.
Otras pueden crecer en el refrigerador y aquellas especies con
capacidad competitiva contribuir a la podredumbre de frutas y
hortalizas almacenadas. La persistencia de Fusarium sp. en el suelo
9
durante uno a varios años se debe, principalmente, a la presencia
de clamidosporas. Estas requieren para germinar fuentes exógenas
de nutrientes, por lo que son muy sensibles al antagonismo. Pero
su distribución casi universal indica la omnipresencia de los
microambientes específicos (Summerell, 2001; Agrios, 2005).
Las especies F. avenaceum, F. culmorum, F. graminearum, F. poae,
F. semitectum, F. sporotrichioides y F. tricinctum se encuentran en
cereales; F. nygamai, F. subglutinans y F. verticillioides en maíz; F.
thapsinum y F. chlamydosporum en sorgo; mientras que F.
nygamai y F. fujikuroi se hallan en arroz. En legumbres se observan
F. chlamydosporum y F. tumidum (Marasas, 1984; Carrillo, 2007).
F. solani se ha reportado como patógeno en varias especies
vegetales; entre éstas se encuentran: tomate, papa, pimentón,
alfalfa, berenjena, espárragos, maní, soja, apio, pimienta y fríjol
(Marasas, 1984; Carrillo, 2007). Por su parte, F. oxysporum se ha
reportado en algunos cultivos en los que se destacan: algodón,
tomate, tabaco, melón, garbanzo, plátano, caña de azúcar, clavel y
café, entre otros (Nelson et al., 1994; Agrios et al., 2005).
Se ha encontrado que algunas de las especies mencionadas con
anterioridad presentan formas especiales. Este taxón forma especial
(f. sp.) corresponde a cepas cuyas características morfológicas y de
cultivo son indistinguibles, pero muestran diferentes propiedades
fisiológicas en su habilidad para parasitar un hospedante especifico
(Booth, 1971).
10
La infección de Fusarium en clavel por Fusarium oxysporum f. sp.
dianthi (Fod), así como la infección en tomate por F. oxysporum f.
sp. lycopersici, y F. solani son las más estudiadas y se utilizan como
modelo de patogenicidad del género en plantas (Di Pietro &
Roncero, 2005).
2.4.1.1. Tomate como especie susceptible de infección por
Fusarium sp.
Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici, es un fitopatógeno de gran
importancia ya que las plantas de tomate afectadas presentan
síntomas de marchitez, clorosis y necrosis foliar como consecuencia
de la invasión de este patógeno por el sistema vascular. Los
síntomas usualmente son visibles en las hojas basales como un
amarillamiento unilateral, que posteriormente se extiende por toda
la planta. Al realizar un corte transversal o longitudinal en los tallos
enfermos o en la base de los pecíolos se observa necrosis y tinción
de los vasos del xilema. Las condiciones óptimas para el desarrollo
de esta infección son: humedad relativa alta, aire y suelo cálido así
como temperaturas que oscilen alrededor de 28ºC. (Donoso &
Montealegre, 2003; Herrera, 2005).
Fusarium solani se ha reportado como el agente causal de la
podredumbre del pie del tomate; ésta infección se reconoce porque
su síntoma principal es una lesión necrótica de color pardo en el
tejido cortical de la base que asciende en forma unilateral a lo largo
del tallo, con la consecuente defoliación. En estados avanzados de
la enfermedad se produce la destrucción de la corteza en la zona
11
basal y una constricción del tallo a lo largo de la mancha. Ocurre
una podredumbre en las raíces secundarias. Se presenta
principalmente en plantas que han alcanzado la fructificación. Al
realizar un corte longitudinal de los tallos se evidencia en la
médula, una podredumbre seca de aspecto corchoso que supera en
longitud a la mancha externa (González et al., 1998; Herrera,
2005).
2.4.2. Fusarium sp., patógeno humano y animal
Especies del género Fusarium han emergido como patógenos
oportunistas en humanos, causando enfermedades diseminadas en
pacientes inmunocomprometidos, quemados y con heridas abiertas.
Sin embargo, en ocasiones se han reportado también como agente
causal de infecciones en pacientes inmunocompetentes. De ahí que
su importancia haya crecido exponencialmente (Hennequin et al.,
1997; Mayayo, 1999).
Las especies de Fusarium más comunes que se han asociado a
patologías son: F. solani, F. oxysporum y F. verticillioides (=F.
moniliforme). Igualmente existen otras especies que afectan en
menor grado, entre las cuales están F. proliferatum, F.
subglutinans, F. aquaeductuum, F. dimerum, F. incarnatum, F.
nygamai, F. clamydosporum, F. sacchari y F. antophilum (De Hoog
et al., 2000).
La puerta de entrada de las infecciones localizadas son las
pequeñas lesiones producidas por traumatismos. Las infecciones
12
sistémicas se pueden producir por la diseminación del
microorganismo desde la puerta de entrada. En la mayoría de las
ocasiones esta diseminación está condicionada por el estado
inmunológico del huésped, aunque también se han descrito otros
factores de virulencia, como la producción de toxinas y enzimas
(Curtis, 1996; Monzón & Rodríguez, 2007).
Las patologías a las cuales se ha asociado Fusarium sp. son:
intoxicación alimentaria, intoxicación por granos, queratitis,
infecciones en la piel, micetoma, onicomicosis, otitis, infección
intranasal invasiva, absceso cerebral, endocarditis y enfermedades
diseminadas (Nelson et al., 1994; Di Pietro & Roncero, 2005).
2.5. FACTORES DE VIRULENCIA
2.5.1. Factores de virulencia no enzimáticos
Una característica asociada con la virulencia de Fusarium sp., es su
amplia distribución atribuida a la capacidad para crecer en gran
número de substratos y a su eficaz mecanismo de dispersión,
donde el viento y la lluvia son el medio más importante para su
diseminación. Se ha demostrado que el aire puede llevar los
conidios hasta 400 Km. de distancia (Agrios, 2005; Monzón &
Rodríguez, 2007).
Otro factor que presenta Fusarium sp. es la adherencia que le
confiere la capacidad de colonizar los tejidos. La relación entre
germinación y adherencia se considera una de las principales
13
causas de virulencia. Sin embargo, Druts (1993) demostró que la
germinación no siempre es prerrequisito para la adherencia. Los
receptores de las células del hospedero para las adhesinas de
algunos hongos juegan un papel importante. Este es el caso de la
fibronectina, trombina, lectinas y factor G, esenciales para que el
microorganismo se establezca en el tejido (Mitola et al., 2001).
Por otro lado su capacidad para adherirse al material plástico como
catéteres y lentes de contacto, también representa un factor de
virulencia. Esta interacción se ha determinado mediante la
observación con microscopio electrónico. El hongo se adhiere a los
catéteres, pero no invade la pared de éstos. Por el contrario, se
adhieren, penetran y proliferan dentro de los lentes de contacto
(Monzón & Rodríguez, 2007).
Dentro del género Fusarium sp. se encuentran algunas especies
productoras de toxinas que producen más de 50 sustancias tóxicas,
que pueden causar sensibilidad del tejido o necrosis hasta la
extrema inmunodeficiencia y producir efectos mutagénicos y
cancerígenos tanto en el hombre como en animales (Marasas,
1984; Di Pietro & Roncero, 2005). Las micotoxinas son metabolitos
secundarios de bajo peso molecular y termoestables. Pueden ser
producidas en los alimentos como resultado del crecimiento del
hongo; algunas requieren condiciones especiales de humedad y
temperatura para su producción (Díaz, 1997).
14
2.5.2. Factores de virulencia enzimáticos
Fusarium sp. tiene la capacidad de producir enzimas tales como
pectinliasas, celulasas, arabinasas, poligaracturonidasas, entre
otras polisacaridasas que pueden alterar o degradar distintos
polisacáridos presentes en las paredes celulares. Este complejo
enzimático constituye un importante factor de virulencia para
Fusarium, ya que le permite no solo penetrar el tejido del
hospedero al mediar la maceración tisular y la disgregación de la
estructura de la pared, sino que es un mecanismo necesario para
obtención de nutrientes (Di Pietro & Roncero, 2005).
Fusarium sp. fitopatógeno necesita atravesar las paredes celulares
de sus hospederos para proliferar en el apoplasto y tener acceso al
protoplasto. Debido a que durante el proceso infeccioso el hongo
encuentra diversas barreras estructurales tales como endodermis,
paredes vesiculares, tilosas etc., se ha establecido que la secreción
de un complejo enzimático que actua en la degradación de la pared
celular (cell wall-degrading enzymes CWDEs) es el mecanismo
principal mediante el cual se depolimeriza cada uno de los
componentes de las paredes celulares (celulosa, xilano, pectinas,
ácidos poligalacturónicos y extensinas) (Di Pietro & Roncero, 2005).
Las CWDEs son utilizadas por los patógenos durante el proceso de
infección para diferentes propósitos, tales como penetración y
ramificación dentro de los tejidos de la planta hospedera, liberación
de nutrientes o interferencia con la respuesta de defensa de la
15
planta (Guevara, 1997; Roncero et al., 2000; Di Pietro & Roncero,
2005).
Algunos hongos presentan capacidad queratinofílica y
queratinolítica como un importante factor de virulencia, ya que les
permite colonizar tejidos de humanos y animales principalmente y
de esta forma convertirse en agentes patógenos. Estudios
realizados han establecido la existencia de dos tipos de enzimas.
Aquellas que presentan actividad “endo” (actúan en los enlaces
centrales de la molécula), capaces de producir maceración y por
tanto destrucción de tejidos; mientras el otro tipo que posee
actividad “exo” (actúan en los enlaces externos de la molécula),
proporcionan nutrientes al patógeno a partir de las sustancias
pécticas de la pared del hospedero (Imai, 1991).
Las enzimas extracelulares de hongos dermatofitos y
queratinofílicos habitantes del suelo son proteasas neutras o
alcalinas. Sin embargo no se ha podido establecer una clasificación
adecuada basada en las características de las proteasas purificadas
de hongos queratinofílicos (Richardson & Edgard, 2000). Otro grupo
de enzimas secretadas por estos hongos son las lipasas y esterasas
(Roncero et al., 2000; Kunert, 2000).
La producción y secreción de enzimas proteolíticas se lleva a cabo a
través del micelio activo de hongos dermatofitos y de géneros de
hongos queratinofílicos como Fusarium sp. (Richardson & Edgard,
2000). Los hongos queratinofílicos producen un complejo de
enzimas proteolíticas (Kunert, 2000). Pueden hidrolizar muchas
16
proteínas solubles (caseína, gelatina, albúmina, hemoglobina,
mioglobina, etc.) y otras insolubles (queratina, elastina, colágeno,
fibrina, fibronectina etc.) (Imai, 1991).
Los sustratos de queratina son atacados por proteasas no
específicas, y el índice de hidrólisis que presente esta proteína
depende del contenido de cistina, ya que entre mayor es el
contenido de dicho aminoácido no esencial (queratina dura) es más
lenta su descomposición (Imai, 1991; Muhsin & Hadi, 2002).
Otro grupo de enzimas que le confieren la capacidad de virulencia a
los hongos queratinofílicos, son las lipasas y las esterasas. La
actividad de las primeras se puede determinar utilizando sustratos
como aceite de oliva y Tweens (particularmente Tween 60 y 80)
(Brash & Zaldua, 1994). Para evaluar la presencia de esterasas y
fosfolipasa A, se utiliza como sustrato la tributirina, ya que estas
enzimas intervienen en el clivaje de esta molécula. (Kunert, 1988;
Brash & Zaldua, 1994; Papini, 1996; Kunert, 2000). En un estudio
realizado por Brasch y Zaldua (1994), se determinó que las lipasas
y las fosfolipasas son producidas no sólo en los medios que
contienen lípidos, sino también en medios con queratina (pelo
humano, uñas, cascos, plumas, etc.).
2.5.2.1. Queratinasas
La queratina, una escleroproteína altamente resistente, integra la
mayor parte del material contenido en las células que forman la
epidermis de la piel de mamíferos, pelos, uñas, escamas, plumas,
17
espinas, cuernos y pezuñas de animales; también, es componente
de la lana y la matriz de los dientes (Kunert, 2000; Mitola et al.,
2001).
La degradación de la queratina, es un proceso enzimático llevado a
cabo por las queratinasas (Paveia, 1975). Puede ser evidenciada
morfológicamente sobre sustratos queratináceos a través de la
expresión de estructuras fúngicas especializadas emitidas por los
hongos que los atacan, que son básicamente algunas variaciones en
el grosor y morfología de sus hifas (Mitola et al., 2001).
La degradación de la queratina es el resultado de la acción de tres
factores ligados a la acción enzimática: desaminación (crea un
ambiente alcalino necesario para el aumento del ataque al sustrato,
sulfitolisis y ataque proteolítico), sulfitolisis (desnaturaliza el
sustrato quitando puentes de disulfuro) y proteolisis (cliva el
sustrato desnaturalizando los productos solubles) (Kunert, 1988;
Kunert, 2000).
2.6. HONGOS QUERATINOFÍLICOS
En los hábitats naturales, la Queratinolisis fúngica la ejercen
especies de hongos queratinolíticos, casi siempre acompañados por
especies queratinofílicas. Las primeras se definen como las que
presentan capacidad para destruir y/o descomponer la queratina,
mientras las segundas, las cuales ocurren con frecuencia sobre los
sustratos queratináceos, sólo son capaces de utilizar materiales
asociados a la queratina tales como el contenido intercelular,
18
sedimentos protoplasmáticos o algunos derivados de la degradación
parcial de ésta (Mathison, 1962; Kunert, 2000; Muhsin & Hadi,
2002).
Los hongos queratinolíticos más activos son los dermatofitos
(particularmente especies de Microsporum y Trichophyton) y los
relacionados con éstos (Hilmioglu-Polat et al., 2005). Aunque
también hongos no dermatofitos como Fusarium presentan una
buena actividad queratinolitica. Estos hongos, aislados del suelo
como saprófitos, digieren queratina in vitro al utilizarla como
sustrato, y como patógenos invaden tejidos in vivo. No obstante, su
morfología en la fase de crecimiento parasítico es diferente de la
exhibida en cultivo (Kunert, 2000; Muhsin & Hadi, 2002).
Muchas analogías in vitro han sido referidas al modo en como son
atacados el pelo, las pezuñas, las plumas y las uñas; se ha asociado
como factor de patogenicidad indicando que el hongo que es capaz
de colonizar estos tejidos también tiene la capacidad de
comportarse como patógeno produciendo enfermedad sobre tejidos
queratinizados (Kunert, 2000; Mitola et al., 2001; Muhsin & Hadi,
2002).
19
3. JUSTIFICACIÓN
3.1. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA
Fusarium es un género de hongos cosmopolita. Se encuentra
generalmente en el suelo y se ha reportado desde hace varios años
como patógeno de diversos cultivos de importancia económica,
tales como el del tomate y el del clavel, entre otros. Igualmente se
ha asociado a infecciones patógenas en tejidos animales, incluido el
hombre. En la literatura se citan algunas características que
facultan a Fusarium como patógeno de estos diferentes hospederos,
dentro de las que se destacan la producción de enzimas líticas que
favorecen el proceso de colonización del tejido, como queratinasas,
celulasas, proteasas y pectinasas, entre otras. Otra característica
que se destaca es la capacidad de adaptarse a diversos ambientes y
resistir condiciones de estrés, ya que produce estructuras de
resistencia como clamidosporas.
Actualmente se desconoce hasta qué punto están conservados los
mecanismos de infección en los diferentes grupos de hospedadores.
Una de las principales causas de esta falta de conocimiento es la
ausencia de modelos fúngicos que permitan el análisis simultáneo
de la virulencia en ambas clases de organismos.
De aquí surge la preocupación de la posibilidad que este género sea
capaz de producir infección cruzada y de esta manera poner en
riesgo la salud animal, humana y la producción agrícola. Aunque no
20
se ha reportado este peligro, tampoco existen publicaciones que
descarten este riesgo.
3.2. JUSTIFICACIÓN
La presente investigación comprende la primera etapa de un
proyecto que busca evaluar la capacidad que tendrían los
aislamientos de Fusarium sp. de infectar varios hospederos y
caracterizarlos enzimática y molecularmente.
Dentro de esta primera etapa se realizó el aislamiento de 30 cepas
de Fusarium sp. provenientes de procesos patológicos de plantas,
humanos y animales; y, la evaluación de la capacidad de tres cepas
de cada hospedero para producir infección cruzada entre los
mismos. Los modelos utilizados incluyen plántulas de tomate y
tejidos queratinizados (pelo humano y casco de vaca).
Teniendo en cuenta que la capacidad de evolución de los
microorganismos y su rápida capacidad para colonizar nuevos
hospederos, se planteó la necesidad de crear un proyecto donde se
evalúe esta capacidad para atacar importantes productos agrícolas
de exportación como el clavel y el tomate, entre otros, básicos para
la economía colombiana. También debe su interés a la posibilidad
de ser utilizado como controlador de cultivos ilícitos y, adicional, ser
reportado como un patógeno emergente tanto para humanos como
para animales, independiente del estado de su sistema
inmunológico.
21
Debido a que los modelos de patogenicidad cruzada permiten
establecer relaciones entre las infecciones en animales, humanos y
plantas, este proyecto aporta datos de partida, a nivel de
procedimientos y resultados para estudios de actividad enzimática,
que permitan esclarecer este tipo de relaciones y condicionamientos
para que estas se presenten.
22
4. OBJETIVOS
4.1. OBJETIVO GENERAL
Evaluar de forma preliminar la capacidad de producir infección
cruzada de cepas de Fusarium sp., aislados de procesos patológicos
de plantas, humanos y animales.
4.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
• Establecer un banco de cepas de Fusarium a partir de
dermatomicosis y queratitis en animales y marchitamiento
vascular y pudrición basal en plantas.
• Recuperar aislamientos de Fusarium provenientes de
onicomicosis en humanos para su establecimiento en el banco
de cepas.
• Desarrollar pruebas de infección cruzada de las cepas
obtenidas de Fusarium sp., provenientes de plantas, animales
y humanos, sobre plántulas de tomate y tejidos
queratinizados.
23
5. MATERIALES Y MÉTODOS
El proyecto se desarrolló en el Laboratorio de Micología de la
Facultad de Ciencias de la Pontificia Universidad Javeriana, y en el
invernadero construido en la Calle 146 Nº 54 – 57.
5.1. ORIGEN DE LOS AISLAMIENTOS DE Fusarium sp.
Los aislamientos de humanos fueron donados por el Laboratorio de
Micología de la Pontificia Universidad Javeriana. 12 de estos
provenían de lesiones de onicomicosis y se encontraban
conservados en agua destilada estéril, y un último aislamiento
provenía de una lesión de queratitis.
A partir de los frascos de conservación se tomó micelio que fue
sembrado en agar papa dextrosa (PDA). Una vez desarrollados los
hongos, se seleccionaron nueve aislamientos provenientes de
onicomicosis que cumplieran con las características de buen
desarrollo de la colonia y presencia de abundantes macro y
microconidias, y el aislamiento proveniente de queratitis.
Para la obtención de los aislamientos de lesiones en animales, se
procesaron un total de 62 muestras provenientes de lesiones que
presentaban sintomatología de infección por hongos en ojos
(opacos y con lagrimeo abundante) y piel (focos rojizos, en
ocasiones con pérdida de pelaje). Estas muestras se obtuvieron de
clínicas veterinarias urbanas o directamente en campo.
24
Los aislamientos de plantas se obtuvieron al procesar un total de 17
muestras de plantas (cinco de estas muestras fueron procesadas de
plantas de clavel, 11 solanáceas y una cucurbitácea); que
presentaban sintomatología típica de marchitamiento vascular y
pudrición basal, características de Fusarium sp.
5.2. PROCESAMIENTO MATERIAL VEGETAL
Para el aislamiento en laboratorio del patógeno presente en el
material vegetal con los síntomas característicos de Fusarium sp.,
se realizó un lavado superficial del material con agua corriente y se
realizaron 15 cortes transversales de 3-5 mm que incluyeran tejido
sano y afectado. A dichos cortes se les realizó una desinfección
superficial con agua destilada estéril por dos minutos;
posteriormente se sumergieron en hipoclorito de sodio (NaClO) al
2.6% v/v por dos minutos y por último se hicieron tres lavados en
agua destilada estéril por dos minutos (Forero, 2007).
El material vegetal fue secado con papel absorbente estéril y
finalmente se sembraron cinco cortes con inclinación aproximada de
30° por caja de Petri con PDA suplementado con cloranfenicol (50
ppm). Este procedimiento se realizó por triplicado para cada planta,
y fue incubado a temperatura ambiente (22 + 2ºC) por siete días.
Pasado este tiempo, se observaron las estructuras típicas de
Fusarium sp., y se procedió a realizar cultivos monospóricos de los
mismos (Riveros et al., 2001; Ardila & Higuera, 2005; Forero,
2007).
25
Figura 5.1. Cortes transversales
Figura 5.2. Lavado y desinfección de cortes transversales
Figura 5.3. Puntos de siembra y crecimiento de agentes fitopatógenos
26
5.3. TOMA Y PROCESAMIENTO DE MUESTRAS ANIMALES
A partir de lesiones cutáneas se tomaron muestras mediante
raspado de piel con bisturí. Después de hacer una desinfección del
área, con alcohol al 70% para remover detritus y contaminantes
secundarios. Los raspados se realizaron en el borde de las lesiones
para aumentar la probabilidad de encontrar el agente causal de la
lesión (Calado et al., 2005; Franco, 2006).
Una metodología alterna, utilizada para la obtención de muestras
de lesiones cutáneas, se realizó siguiendo el protocolo de Pulido
(2007), que consiste inicialmente en una desinfección con alcohol al
70% y la toma de la muestra con un hisopo humedecido en agua
estéril y posteriormente con un hisopo seco. Los dos hisopos se
guardaron como una sola muestra.
Para lesiones de queratitis las muestras fueron tomadas mediante
frotis del saco conjuntivo con un hisopo estéril humedecido en agua
estéril (Rosa et al., 2003; Hilmioglu-Polat et al., 2005).
Las muestras se transportaron en tubos de ensayo estériles
refrigerados y se sembraron, por triplicado, en PDA suplementado
con cloranfenicol (50 ppm) y agar Sabouraud suplementado con
cloranfenicol (50 ppm), pH 5.6 ± 0.2, y se incubaron a temperatura
ambiente por siete días, con observación macroscópica periódica. El
hongo que se presentaba en todos los puntos de siembra fue
repicado en PDA. Una vez identificado el aislamiento como
27
Fusarium sp., se procedió a la realización de cultivos monospóricos
(Rosa et al., 2003; Calado et al., 2005).
5.4. REALIZACIÓN DE CULTIVOS MONOSPÓRICOS
Los cultivos monospóricos se realizaron mediante una suspensión
de conidios en solución salina 0.85% p/v más Tween 0.1% v/v, con
una concentración mínima de 1.5 x 106 conidios/mililitro
determinada por recuento en cámara de Neubauer, a partir de la
cual se hicieron diluciones en base diez con un volumen final de
cinco mililitros con el fin de obtener una concentración de 100
esporas por mililitro, de la cual se sembraron 100 μL en superficie
en PDA con cloranfenicol (50 ppm) e incubada a 25 + 2°C.
La evaluación y selección de una espora germinada se realizó bajo
observación en estereoscopio a las 12 horas post-siembra y se dejó
incubando nuevamente durante 48 horas, tiempo en el cual el
tamaño de la colonia permitía realizar un repique a PDA.
5.4. Desprendimiento de conidios para suspensión.
28
Figura 5.5. Cultivos monospóricos.
5.5. IDENTIFICACIÓN TAXONÓMICA DE LOS
AISLAMIENTOS
La identificación taxonómica a nivel de género se llevó a cabo a
partir de los cultivos monospóricos, utilizando como base
metodologías y claves de identificación elaboradas por De Hoog y
colaboradores (2000), las cuales consideran la observación de
características microscópicas.
Las características morfológicas se determinaron por observaciones
macroscópicas de hongos filamentosos con textura algodonosa de
color blanco, crema, rosado, púrpura, salmón y morado con reverso
rosado, blanco, ámbar o morado; adicionalmente, mediante
microscopia directa con el objeto de determinar presencia de falsas
cabezas mucilaginosas, tipo de fiálides, macroconidios y presencia o
ausencia de clamidosporas de hongos desarrollados en PDA.
29
5.6. PRESERVACIÓN DE LOS AISLAMIENTOS
5.6.1. Conservación de hongos en agua destilada estéril
Los aislamientos repicados en PDA de los cultivos monospóricos,
fueron cortados en discos de seis milímetros de diámetro, utilizando
la parte posterior de pipetas Pasteur, trasladados a frascos de vidrio
con 30 mL de agua destilada estéril con tres ciclos de autoclavado
(121:15:15) para asegurar la esterilidad, sellados y almacenados a
temperatura ambiente (Bueno & Gallardo, 1998).
Figura 5.6. Discos de Agar-Micelio para conservación en agua destilada.
5.6.2. Conservación en aceite mineral estéril
El método utilizado fue el de capa de aceite mineral, que consistió
en inocular los hongos provenientes de los cultivos monospóricos ya
desarrollados en tubos que contienen agar PDA en pico de flauta,
que después de su desarrollo se cubrieron con una capa de aceite
mineral estéril (tres ciclos de autoclavado 121:15:15) y se
conservaron a temperatura ambiente (Panizo et al., 2005).
30
Figura 5.7. Conservación en aceite mineral.
5.6.3. Conservación en papel filtro estéril
Para realizar la metodología de conservación en papel, inicialmente
se cortaron cuadros de papel filtro de 1 x 1 cm que se llevaron a
esterilizar (tres ciclos de autoclavado 121:15:15). Paralelamente se
hicieron sobres en papel parafinado de 6 x 4 cm que se llevaron a
esterilizar (tres ciclos de autoclavado 121:15:15) junto con sobres
de papel bond de 8 x 5 cm.
Los cuadros de papel filtro estéril se trasladaron a medio PDA de tal
forma que el agar humedeciera el papel (21 cuadros por caja de
Petri); cada cuadro fue inoculado con el hongo a conservar
procedente del cultivo monospórico e incubado a temperatura
ambiente hasta obtener colonización del papel. Posteriormente
estos cuadros se trasladaron a cajas de Petri estériles y se secaron
a 26ºC por 15 días. Por último los cuadros de papel secos se
introdujeron en los sobres de papel parafinado estéril y estos a su
vez en los sobres de papel bond.
31
Para conservar los sobres se introdujeron en bolsas Ziploc (cada
cepa por separado) de tal forma que se permitiera la conservación
en la nevera sin afectar las propiedades físicas de los sobres de
papel por efecto de la humedad.
A. B.
C. Figura 5.8. Metodología conservación en papel filtro. A. Aislamientos crecidos en papel
filtro por 15 días; B. Traspaso cuadro de papel filtro colonizados a sobres papel
parafinado; C. Conservación sobres papel parafinado, en sobre de papel bond.
5.7. ENSAYOS DE PATOGENICIDAD CRUZADA
Para la realización de los ensayos de patogenicidad cruzada se hizo
un muestreo aleatorio sin reemplazo de tres aislamientos de cada
hospedero. El muestreo se realizó utilizando la tabla de números
aleatorios de Daniel (1997). Se evaluaron una totalidad de nueve
32
aislamientos (tres de cada hospedero) en cada uno de los ensayos
de patogenicidad.
Los aislamientos de plantas utilizados en este ensayo cumplieron
previamente con los Postulados de Koch, que consisten en la
inoculación de plántulas de tomate con los mismos, para confirmar
su capacidad patogénica y un posterior re-aislamiento confirmando
su presencia como agente causal de la enfermedad.
Figura 5.9. Cumplimiento de los postulados de Koch en plántulas de tomate y clavel.
5.7.1. Actividad fitopatógena
5.7.1.1. Preparación del inóculo
De cada cepa de Fusarium sp., originaria de cultivo monospórico, se
realizaron subcultivos en PDA que fueron incubados por siete días a
25 + 2ºC donde se observó una alta producción de conidios. La
colección de conidios se llevó a cabo por desprendimiento de la
colonia con perlas de vidrio estéril y 10 mL de solución salina
0.85% p/v más Tween 0.1% v/v, realizando movimientos
rotacionales (Astudillo & Blanco, 1999). Esta suspensión se diluyó
33
en 50 mL de solución salina estéril al 0.85% p/v pH 5.5 + 0.2 hasta
alcanzar una concentración celular de 106 conidios/mL. El recuento
fue realizado en cámara de Neubauer (Marín, 2003).
5.7.2. Inoculación de plántulas
La evaluación de actividad fitopatógena se realizó en plántulas de
tomate, variedad Chonto Santa Clara, susceptible a infección por
Fusarium sp. Las plántulas de tomate con dos pares de hojas
verdaderas, de aproximadamente 30 días post-germinación, fueron
compradas en una empresa germinadora de semillas de tomate.
Para la inoculación de las plántulas de tomate, inicialmente se
realizó un lavado al sistema radicular con agua corriente para
eliminar los residuos de sustrato; se realizaron pequeños cortes a
los ápices de las raíces y se sumergieron en el inóculo durante 30
minutos. Este procedimiento se realizó en 10 plántulas por cada
cepa a evaluar. Se utilizaron como control negativo 10 plántulas
inoculadas con solución salina 0.85% p/v estéril, para un total de
100 plántulas (Rodríguez-Molina et al., 2003).
Las plantas se mantuvieron en sustrato (suelo - cascarilla de arroz,
relación 3:1, esterilizado con tres ciclos de autoclavado,
homogenizando entre ciclos para eliminar vapores tóxicos) bajo
condiciones de invernadero a temperatura aproximada de 22°C, en
macetas individuales para cada plántula. La distribución de las
plántulas en el invernadero se hizo de forma aleatoria y la
fertilización se hizo con una formulación comercial de macro y
34
micro nutrientes (Nutriponic). La revisión de síntomas se realizó
semanalmente durante 51 días, al cabo de los cuales se realizó un
re-aislamiento de las cepas mediante la metodología de Jiménez
(2004) (Lara, 1999; Marín, 2003; Rodríguez-Molina et al., 2003).
A. B. 5.10. Procedimiento inoculación de plántulas. A. Corte de los ápices de las raíces. B.
Plántula sumergida en inoculo.
La metodología de Jiménez (2004) es un método cuantitativo que
permite valorar la progresión de la enfermedad, en tallo y raíces.
La muestra a evaluar se tomó ubicando la corona y a partir de esta
se tomaron 5 cm del tallo y 5 cm de la raíz principal. Una vez
realizado el corte de tallo y raíz principal, se efectuó un lavado con
agua corriente para eliminar residuos del sustrato y posteriormente
una desinfección del material (inmersión y agitación por un minuto
en NaClO al 2.5% v/v y tres enjuagues por dos minutos en agua
destilada estéril). Luego de secado el material vegetal en papel
filtro, previamente esterilizado en luz UV por 24 horas, se procedió
al corte en secciones de 0,5 cm y siembra en espiral, de dichas
35
secciones, en forma descendente en cajas de Petri con PDA
suplementado con cloranfenicol (50 ppm).
Los cultivos se incubaron a 22 + 2°C durante 6 días, en los cuales
se le hizo seguimiento diario para poder determinar la progresión
de la enfermedad.
A. B.
C. Figura 5.11. Re-aislamiento de cepas, prueba fitopatógena. A. desinfección de plantas. B.
cortes de tallo, corona y raíz. C. Siembra de cortes en espiral.
5.7.3. Actividad patógena sobre tejido animal y humano.
Se desarrollaron dos modelos de infección in vitro, asociados a la
degradación de queratina sobre cascos de vaca pulverizados y
cabello humano castaño cortado en secciones de un cm.
36
5.7.3.1. Modelo in vitro de patogenicidad animal y humano
Para el análisis de la degradación de queratina, a partir de los
sustratos anteriormente mencionados, se utilizó el método de
pérdida de peso, utilizado por Singh (1999 y 2002).
Las nueve cepas se sembraron utilizando como inóculo un disco de
6 mm de diámetro en 25 mL de caldo glucosa gelatina (glucosa
10g/l, gelatina 10g/l, K2HPO4 1 g/l, MgSO4*7H2O 0.5 g/l, pH 7.0)
en erlenmeyer de 150 mL con agitación constante durante 21 días.
Estos cultivos fueron tomados como control positivo de crecimiento
y producción de biomasa de cada aislamiento.
Simultáneamente, las cepas fueron sembradas en caldo glucosa-
gelatina modificado, en el cual la gelatina fue remplazada por 250
mg del sustrato (pelo ó casco) previamente esterilizado
(121:15:15). También se hizo una siembra con los sustratos en
ausencia de glucosa. La inoculación se realizó de la misma manera
que el control positivo de crecimiento y se mantuvo bajo las
mismas condiciones de incubación. Como control de peso de
queratina se realizó el montaje de erlenmeyers que contenían sales,
sustrato (pelo o casco) y sin inoculación.
Los cultivos fueron observados macroscópicamente a diario y
pasado el tiempo de incubación, se analizaron microscópicamente
para asegurar su pureza.
37
Después del tiempo de incubación, los cultivos fueron filtrados y
secados en papel filtro estéril a 80ºC por 12 horas. Posteriormente
se pesaron para obtener un peso seco total (sustrato más micelio).
A. B. 5.12. Método de peso seco. A. Filtración de incubado. B. secado a 80º C.
La degradación de queratina fue determinada mediante la
diferencia del peso seco total y la biomasa total, determinada en el
control positivo de crecimiento. Este resultado se le restó al peso
seco de la queratina no inoculada (Singh, 1999).
También se hicieron siembras en los mismos medios con adición de
agar-agar, para tener una apreciación cualitativa del crecimiento de
los aislamientos sobre el sustrato de queratina. La inoculación se
llevó a cabo de la misma manera que en los medios líquidos,
introduciendo un disco de 6 mm de diámetro en el centro de la caja
de Petri sobre el sustrato queratinizado.
38
Figura 5.13. Montaje de medios sólidos, prueba sobre tejido queratinizado.
5.8. ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Se realizó un análisis de varianza a los resultados, utilizando el
programa estadístico SAS, mediante la aplicación de la prueba de
rango múltiple de Duncan para obtener agrupaciones de las
variables analizadas.
Los resultados de la progresión de la enfermedad en plantas se
analizaron mediante la técnica de área bajo la curva y a partir de
estos resultados se realizaron los análisis anteriormente
mencionados.
A partir de los resultados de las pruebas de Duncan realizadas a los
tres modelos se realizó un análisis de correlaciones.
39
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
6.1. ORIGEN DE AISLAMIENTOS
Los aislamientos de hospedero humano se obtuvieron a partir de la
recuperación de conservaciones en agua de 12 cultivos de hongos
que provenían de onicomicosis. Se obtuvo un buen desarrollo de
diez de estos y los dos restantes crecieron con flora acompañante.
La selección de las nueve cepas a trabajar, se realizó teniendo en
cuenta el buen desarrollo de las colonias en PDA y se descartó el
aislamiento que presentó menor esporulación con respecto a los
otros. Para completar los diez aislamientos necesarios para el
desarrollo del proyecto, se obtuvo un aislamiento proveniente de
queratitis que estaba siendo utilizado en el proyecto de
investigación “Estudio in vitro de germinación de Fusarium sp. en
los materiales de lentes de contacto blandos y eficacia de las
soluciones multipropósito contra este microorganismo”. Esta cepa
se encontraba en PDA con un buen desarrollo y alta esporulación
(Tabla 6.1).
Tabla 6.1. Aislamientos de Fusarium sp. de origen humano
Número identificación Origen Lesión Organismo
aislado 201 Clínico Onicomicosis Fusarium sp. 202 Clínico Onicomicosis Fusarium sp. 203 Clínico Queratitis Fusarium sp. 204 Clínico Onicomicosis Fusarium sp. 205 Clínico Onicomicosis Fusarium sp. 206 Clínico Onicomicosis Fusarium sp. 207 Clínico Onicomicosis Fusarium sp. 208 Clínico Onicomicosis Fusarium sp. 209 Clínico Onicomicosis Fusarium sp. 210 Clínico Onicomicosis Fusarium sp.
40
Número identificación Origen Lesión Organismo
aislado 211 Clínico Onicomicosis Fusarium sp. 212 Clínico Onicomicosis Fusarium sp. 213 Clínico Onicomicosis Fusarium sp.
El porcentaje de recuperación de los aislamientos de humanos
conservados en agua, tomando las 12 muestras procesadas como el
100%, corresponde al 83%. Este porcentaje no difiere en gran
medida de los resultados obtenidos por Bueno y Gallardo (1998) y
por Panizo y colaboradores (2005), en los estudios orientados a
evaluar la viabilidad del método de conservación de cepas en agua
destilada, en los cuáles se obtuvo un porcentaje de recuperación
del 100%, debido a que ninguno presentó contaminación
bacteriana, por ácaros o por otros hongos. La razón por la cuál
durante el desarrollo del presente trabajo se obtuvo el 83% de
recuperación, se atribuye a la presencia de contaminación en dos
de las muestras, la cual puede ser relacionada a errores
experimentales en el momento de la conservación, como lo
relacionaron Panizo y colaboradores en su estudio.
El presente estudio no permite establecer ningún tipo de incidencia
y/o predilección de las patologías causadas por Fusarium sp.,
debido a que la cantidad de aislamientos es muy baja para este tipo
de estudios. Sin embargo, se logró corroborar que este género está
relacionado con patologías en humanos, como se ha venido
reportando desde hace ya dos décadas y que se puede comprobar
con el origen y la hoja de vida de estos aislamientos (Anexo 1). Y
permite confirmar que entre las patologías producidas por Fusarium
sp. en humanos, se destacan afecciones dérmicas y oftálmicas
41
relacionadas con la característica de ser hongos queratinolíticos, lo
que concuerda con lo reportado por Hennequin y colaboradores
(1997), Mayayo (1999), Kunert (2000), Garces y colaboradores
(2001).
A partir de lesiones provenientes de animales, se procesaron un
total de 62 muestras, de las cuales 24 resultaron positivas para
hongos (Tabla 6.2), y en 10 de estas se aisló Fusarium sp. Las 38
muestras restantes no se tuvieron en cuenta ya que presentaban
contaminación bacteriana o porque el cultivo no presentaba
crecimiento del mismo agente aislado en todos los puntos de
siembra.
Tabla 6.2. Procesamiento de muestras provenientes de lesiones de animales
Número identificación Origen Lesión Organismo
aislado 101 Canino Dermatitis generalizada en lomo Micelio estéril
108 Bovino Lagrimeo abundante e inflamación del párpado Fusarium sp.
111 Canino Dermatitis generalizada, extremidades anteriores Fusarium sp.
112 Canino Lesión costrosa interdigital Micelio estéril 116 Bovino Descamación de piel en lomo Micelio estéril 119 Ave Descamación en pata Dermatofito 120 Ave Descamación en pata Aspergillus sp.
121 Canino Dermatitis generalizada, lomo zona anterior Fusarium sp.
122 Bovino Lagrimeo abundante y tumor en ojo Micelio estéril
127 Bovino Descamación en pata Dermatofito
131 Canino Dermatitis en lomo, zona anterior Fusarium sp.
138 Ave Descamación pata Micelio estéril 143 Bovino Costras en hocico Scopulariopsis sp. 146 Bovino Costras en párpado Scopulariopsis sp. 152 Canino Dermatitis generalizada en lomo Aspergillus sp. 153 Canino Dermatitis cola Aspergillus sp 154 Bovino Dermatitis lomo zona media Dermatofito 155 Canino Dermatitis lomo zona posterior Fusarium sp.
42
Número identificación Origen Lesión Organismo
aislado 156 Canino Dermatitis lomo zona posterior Fusarium sp.
157 Canino Lagrimeo abundante e inflamación párpado Aspergillus sp.
159 Canino Dermatitis generalizada zona abdominal Fusarium sp.
160 Bovino Dermatitis en lomo, zona media Fusarium sp. 161 Canino Dermatitis zona media del lomo Fusarium sp. 162 Canino Dermatitis lomo zona posterior Fusarium sp.
La incidencia de los hongos en las muestras de animales analizadas
presenta un valor de 39%, el cual es relativamente bajo si se tiene
en cuenta que las infecciones por dermatofitos fueron las primeras
enfermedades infecciosas descritas y reconocidas desde el siglo
pasado, como lo menciona Mitchell (1983) en su trabajo. A partir
del reconocimiento de hongos patógenos, los estudios
histopatológicos van orientados principalmente para el diagnóstico
de micosis en patología veterinaria, como lo mencionan Pérez y
Carrasco (2000). Adicionalmente, si se tiene en cuenta que otros
organismos que afectan la dermis de animales son agentes
patógenos oportunistas (bacterias y ácaros), los resultados
obtenidos de las lesiones evaluadas se pueden correlacionar con los
estudios y reportes mencionados anteriormente. Sin embargo, es
importante resaltar que las muestras que no se identificaron como
hongos (61%), agrupan no solo a otros agentes patógenos, sino
también a los casos donde no todos los puntos de siembra
presentaban el mismo agente aislado, y aquellas muestras en
donde se presentaba carga bacteriana debido a la dificultad de
realizar una correcta desinfección en la dermis del animal. Este
último caso pudo ser un factor que imposibilitó el crecimiento
fúngico, debido a que las muestras a analizar no se sometieron a
ningún tratamiento de inmersión en antibióticos, y el medio
43
preparado fue PDA sin suplementos. Los resultados obtenidos
fueron un punto de corrección durante el desarrollo del trabajo ya
que, para realizar los repiques y purificación de los aislamientos, se
tuvo en cuenta la importancia de suplementar PDA con
cloranfenicol.
El porcentaje de aislamiento de Fusarium sp., en el total de las
muestras tomadas de animales es del 16%. No obstante, en la
Figura 6.1 se observa que la incidencia de aislamiento de Fusarium
sp. frente a otros hongos es de 41.7%, comprobando lo establecido
en varios estudios llevados a cabo en los últimos años por Andrew y
colaboradores (1998) y, Betbeze y colaboradores (2006), donde se
ha visto incrementada su relación con afecciones oftálmicas y
sistémicas principalmente. Este estudio permite demostrar la
incidencia que presenta este hongo como agente causal de micosis
superficiales (infecciones dérmicas), que se reportan con menor
frecuencia frente a otras patologías causadas por este género,
como son intoxicaciones por producción de toxinas, onicomicosis en
los cascos e infecciones sistémicas. (Oliveira et al., 2002; Ortoneda,
2003; Elligot et al., 2006).
44
Frecuencia aislamiento
20,8
41,7
16,7
12,58,3
Micelio estéril Fusarium sp. Aspergillus sp.
Dermatófitos Scopularipsis sp.
Figura 6.1. Porcentaje de frecuencia de aislamiento de hongos en muestras animales
Algunos de los patrones que se pueden establecer a partir de los
resultados obtenidos en este proyecto, permiten establecer a
Fusarium sp., como agente causal no solo de queratomicosis sino
también como patógeno frecuente que causa lesiones superficiales
en la dermis de una gran variedad de especies animales.
Igualmente permite establecer que causa infecciones con mayor
frecuencia en caninos y bovinos como lo indica la Tabla 6.2.
Adicionalmente, se comprobó lo reportado por Ortoneda (2003) y
Godoy y colaboradores (2004), quienes afirman que las patologías
causadas por Fusarium sp. son mayores en áreas tropicales y
subtropicales (clima cálido y húmedo) aumentando su incidencia en
temporadas de lluvia por las variaciones de temperatura y
humedad, condiciones que se relacionan directamente con la
capacidad de germinación de las esporas del microorganismo y de
esta forma causar patologías.
El último origen de aislamiento pertenece a especies vegetales, de
las cuales se procesaron un total de 17 muestras de plantas (diez
45
solanáceas, una cucurbitácea y seis claveles) siendo positivas 16
para Fusarium sp, como se muestra en la Tabla 6.3.
Tabla 6.3. Aislamientos a partir de material vegetal
Número identificación Origen Sintomatología Hongo aislado
301 Tomate
Marchitamiento generalizado y pudrición de haces vasculares
Fusarium sp.
302 Clavel
Marchitamiento unilateral de la planta y pudrición de haces vasculares
Fusarium sp.
303 Tomate
Marchitamiento generalizado y pudrición de haces vasculares
Fusarium sp.
304 Tomate de árbol
Marchitamiento generalizado y pudrición de haces vasculares
Fusarium sp.
305 Tomate de árbol
Marchitamiento generalizado y pudrición de haces vasculares
Fusarium sp.
306 Tomate
Marchitamiento generalizado y pudrición de haces vasculares
Fusarium sp.
307 Calabacín Marchitamiento Fusarium sp.
308 Tomate
Marchitamiento generalizado y pudrición de haces vasculares
Fusarium sp.
309 Tomate
Marchitamiento generalizado y pudrición de haces vasculares
Fusarium sp
310 Tomate
Marchitamiento generalizado y pudrición de haces vasculares
Fusarium sp
311 Tomate
Marchitamiento generalizado y pudrición de haces vasculares
Fusarium sp
46
Número identificación Origen Sintomatología Hongo aislado
312 Tomate
Marchitamiento generalizado y pudrición de haces vasculares
Fusarium sp
313 Clavel
Marchitamiento unilateral de la planta, pudrición de haces vasculares
Fusarium sp.
314 Clavel
Marchitamiento unilateral de la planta y pudrición de haces vasculares
Fusarium sp.
315 Clavel
Marchitamiento unilateral de la planta y pudrición de haces vasculares
Fusarium sp.
316 Lulo
Marchitamiento unilateral de la planta y pudrición de haces vasculares
No identificado
317 Clavel
Marchitamiento unilateral de la planta y pudrición de haces vasculares
Fusarium sp.
La Tabla 6.3 permite establecer una prevalencia del 94% de
Fusarium sp. en las muestras analizadas, confirmando la frecuencia
que tiene este patógeno en las especies investigadas (solanáceas y
clavel) y cómo puede ser aislado frecuentemente (Caracuel et al.,
2003; Ardila & Higuera, 2005). Por otro lado, esto permite
confirmar que la sintomatología que ha sido descrita por varios
autores como típica de la infección causada por este género, orienta
eficazmente a la identificación de Fusarium sp. como fitopatógeno.
A su vez, los resultados permiten ratificar la razón por la cual el
género Fusarium sp., ha sido uno de los más estudiados como
47
fitopatógeno, por su alta prevalencia en cultivos de importancia
económica y su severidad en estos hospederos (Monzón &
Rodríguez, 2007).
6.2. MODELO DE INFECCIÓN EN PLANTAS
Los inóculos de los nueve aislamientos de Fusarium sp. utilizados
en la prueba, se prepararon como suspensión de conidios en 50 mL
de solución salina 0.85% p/v más Tween 0.1% v/v, con
concentración final de 106 conidios/mL. Estas se mantuvieron a
temperatura ambiente (19 + 2°C) durante dos horas, tiempo en el
cual se preparó el material vegetal a infectar. La concentración del
inóculo fue establecida por varios autores y la han considerado
como la presión del inóculo que asegura una infección y un
desarrollo adecuado de la enfermedad, como lo reporta Larco
(2004).
Previo a las pruebas de patogenicidad cruzada de los nueve
aislamientos escogidos, se probaron los postulados de Koch para
los ocho aislamientos de Fusarium sp. obtenidos de plantas de
tomate. El procedimiento realizado fue el mismo que se describió
para la actividad fitopatógena ejecutando el re-aislamiento del
agente patógeno a los 12 días post inoculación, momento en el cual
las plantas empezaron a presentar clorosis. Como conclusión se
cumplieron correctamente los postulados de Koch, ya que todas las
cepas analizadas se re-aislaron de las plantas demostrando que
efectivamente eran los agentes etiológicos de la infección (Roy,
1997; Salas et al., 1999)
48
En las pruebas de actividad fitopatógena, se observó que las
plantas control inoculadas con solución salina estéril no presentaron
ningún síntoma, ni mostraron contaminación por hongos o bacterias
en el montaje de las secciones de tallo y raíz (Figura 6.2), resultado
que valida las pruebas realizadas y así mismo da confiabilidad a los
resultados obtenidos.
Figura 6.2. Control negativo prueba progresión de la enfermedad.
Por otro lado, las plantas inoculadas con los diferentes aislamientos,
no mostraron sintomatología significativa que permitiera evidenciar
la enfermedad. En algunas se observó clorosis y retardo de
crecimiento, pero este parámetro no se tuvo en cuenta ya que no
era generalizado en las réplicas de los montajes. La ausencia de
síntomas pudo deberse a que estos solamente aparecen cuando el
sistema vascular de los pecíolos y las hojas han sido invadidos,
fenómeno que sucede después de la colonización del tallo, como lo
afirman Rodríguez-Molina y colaboradores (2003).
49
Por lo anterior, solo se tuvo en cuenta la recuperación del hongo a
nivel de laboratorio. Como se observa en la Figura 6.3, el
crecimiento de algunas réplicas de todos los aislamientos
independiente de la procedencia, mostraron un crecimiento
discontinuo, lo que probablemente indica que los mecanismos de
defensa de la planta estaban ejerciendo resistencia ante el
patógeno bloqueando puntos de infección e inhibiendo la
germinación y el crecimiento micelial y, por ende, no desarrollaron
la sintomatología típica de la enfermedad producida por Fusarium
sp. (Rodríguez-Molina et al., 2003).
Figura 6.3. Prueba de colonización de plantas de tomate por Fusarium sp.
50
La Tabla 6.4 muestra los resultados del crecimiento de los
aislamientos de Fusarium sp. en el montaje de colonización de
tejidos de raíz y tallo. Se encuentran las medias de las diez réplicas
y el área bajo la curva de cada una. Los datos de todas las réplicas
se pueden encontrar en el Anexo 2.
Tabla 6.4. Crecimiento en centímetros y área bajo la curva, de los aislamientos de
Fusarium sp. en ensayo fitopatógeno.
Aislamiento Fusarium sp.
Día 2 (cm)
Día 4 (cm)
Día 6 (cm)
Día 8 (cm)
Área bajo la curva
156 1.7±0.9 5±1.74 6.1±1.36 7.6±1.04 62.8
111 1.5±0.82 4.5±1.22 5.6±1.35 7.7±1.31 52.9
121 2.6±1.01 5.5±2 5.9±1.3 6.1±1.01 62.6
203 1.5±0.91 5.2±0.78 5.9±1.25 7.3±1.1 61.7
206 1.6±0.7 3±1.46 6.3±1.17 7.7±1.35 55.6
210 1.8±0.9 3.8±1 6.4±0.98 7.3±1.15 58.5
303 2±0.27 5.8±1.52 6.6±1.2 7.8±0.64 68.9
308 0.6±0.72 1.5±0.63 5.8±1.67 7.1±1.41 44.5
310 1.5±0.77 5±1.11 6.9±1.18 7.9±1.16 64.3
Dentro del análisis estadístico realizado a los resultados obtenidos,
se observa que según el agrupamiento de Duncan (Anexo 3),
existen diferencias significativas entre cada uno de los días y van
en orden; es decir, que a medida que pasaban los días, el hongo
ocupaba más secciones sembradas. Esto se puede explicar por la
cantidad de inóculo que tenía cada sección de la planta; así, a
mayor inóculo, es más rápido el crecimiento del hongo, y esta
mayor concentración puede deberse a una mayor afinidad del
mismo a ciertas partes de la planta o a la actividad de los
51
mecanismos de defensa de la planta anteriormente nombrados
(Mitola et al., 2001; Larco, 2004; Quilambaqui, 2005).
Por otro lado, se realizó análisis estadístico de varianza y
comparaciones de medias entre las réplicas de cada aislamiento
(Anexo 4), mostrando que no hay diferencias significativas entre
ellas, arrojando un valor F de 0.9305, dato confirmado con la
prueba de rango múltiple de Duncan, donde todas las réplicas se
encuentran en el mismo grupo; de tal forma que el comportamiento
es el esperado.
Al realizar el mismo análisis entre los aislamientos (Tabla 6.5), los
codificados como 303 y 310 presentaron mayor actividad
fitopatógena (68.9 y 64.3 unidades de área bajo la curva
respectivamente) y se encuentran dentro del mismo grupo, como
era de esperarse, ya que provienen de plantas y no han perdido
actividad fitopatógena, fenómeno que al parecer ocurrió con el
aislamiento 308 que presentó la menor actividad fitopatógena de
todos los aislamientos (44.5 unidades de área bajo la curva). Este
comportamiento puede ser atribuido a problemas del aislamiento,
ya que también presentó la menor actividad de degradación de
queratina (Anexo 6).
Tabla 6.5. Prueba de Duncan para aislamientos en ensayo fitopatógeno
Aislamiento N Media Agrupamiento de Duncan
303 10 68.9 A
310 10 64.3 A B
156 10 62.8 A B C
121 10 62.6 A B C
52
Aislamiento N Media Agrupamiento de Duncan
203 10 61.7 A B C
210 10 58.5 A B C
206 10 55.6 B C
111 10 52.9 C D
308 10 44.5 C D
Los aislamientos provenientes de humanos y animales se
encontraron todos dentro de un mismo grupo, indicando que no hay
diferencias estadísticamente significativas en lo que se refiere a su
actividad fitopatógena. Esto puede deberse a que los tejidos que
estaban afectando en su hospedero original, tenían composición
parecida, pero dentro de esta no se encuentra celulosa, sustrato en
mayor concentración en las plantas, mostrando así que los factores
de patogenicidad pueden estar relacionados al producir
polisacaridasas permitiéndoles afectar a las plantas (Roncero et al.,
2000; Di Pietro & Roncero, 2005).
Dentro de este grupo también se puede resaltar que los
aislamientos 156 y 121, provenientes de animales, mostraron
mayor actividad fitopátogena (62.8 y 61.6 unidades de área bajo la
curva respectivamente) que los provenientes de humanos,
indicando que la conservación, los repiques y el tiempo de los
aislamientos in vitro pueden afectar la patogenicidad de los mismos
y que se debió realizar una activación enzimática previa para
estimular la producción de enzimas y así mismo su capacidad
patogénica.
53
Dentro de la agrupación obtenida, también cabe destacar que los
aislamientos 111 y 308 se encuentran en el mismo grupo y
mostraron las menores actividades fitopatógenas (52.9 y 44.5
unidades de área bajo la curva respectivamente), comportamientos
inesperados ya que el aislamiento 308 es originario de este
hospedero y los dos tienen poco tiempo de haber sido aislados;
este resultado refleja que tres aislamientos de cada hospedero son
muy pocos para este tipo de análisis y no son representativos de
las tendencias que puede tener cada grupo.
6.3. MODELO DE INFECCIÓN HUMANO Y ANIMAL
El modelo de patogenicidad utilizado fue degradación de queratina,
ya que las queratinasas son el factor de virulencia más importante
en las patologías causadas por Fusarium sp. La queratina es una
esclero-proteína que se caracteriza por presentar una alta
resistencia a la degradación. En la naturaleza, los sustratos
queratinizados pueden ser degradados por enzimas queratinolíticas
que poseen algunos microorganismos (Tosti et al., 2000; Apprich et
al., 2006), como lo demostró Fusarium sp. en el presente estudio.
Los resultados de las pruebas de actividad queratinolítica se
muestran en la Tabla 6.6. La actividad cuantitativa se muestra
como la hidrólisis de sustrato queratinizado y la actividad cualitativa
se muestra como el crecimiento micelial sobre el sustrato evaluado
(casco de vaca o pelo humano). Los controles de las pruebas no
presentaron contaminación, haciendo válidas todas las pruebas.
54
Tabla 6.6. Prueba cualitativa y cuantitativa de actividad patógena de Fusarium sp. sobre tejidos queratinizados.
Prueba cuantitativa Aislamiento
Sustrato de queratina utilizado
Glucosa Prueba cualitativa Degradación
queratina (g) Biomasa
(g)
+ CM 0,1098 Pelo
humano - CP 0,1326
+ CM 0,1785 111
Casco de
vaca - CM 0,2648
0,1006
+ CM 0,1055 Pelo
humano - CM 0,0888
+ CM 0,2188 121
Casco de
vaca - CM 0,2503
0,0491
+ CM 0,1224 Pelo
humano - CP 0,1513
+ CM 0,1905 156
Casco de
vaca - CP 0,2623
0,1036
+ CM 0,0365 Pelo
humano - CP * 0,0762
+ CM 0,1938 203
Casco de
vaca - CM 0,2244
0,0364
+ CM 0,0141 Pelo
humano - CP * 0,1618
+ CM 0,1914 206
Casco de
vaca - CM 0,1648
0,0982
+ CM 0,0515 Pelo
humano - CM * 0,1229
+ CM 0,1861 210
Casco de
vaca - CM 0,2398
0,0764
+ CM 0,0684 303 Pelo
humano - CM * 0,1247
0,0805
55
Prueba cuantitativa Aislamiento
Sustrato de queratina utilizado
Glucosa Prueba cualitativa Degradación
queratina (g) Biomasa
(g)
+ CM 0,1971 Casco de
vaca - CM 0,251
+ CM 0,1278 Pelo
humano - CP 0,1167
+ CM 0,1788 308
Casco de
vaca - CP 0,2343
0,0530
+ CM 0,0341 Pelo
humano - CP 0,0949
+ CP* 0,1492 310
Casco de
vaca - CP* 0,1988
0,0639
CM: Crecimiento Masivo; CP: Crecimiento Pobre; *: Formación de micelio vegetativo. Aislamientos 121, 111 y 156 origen animal; 203, 206 y 210 origen humano; 303, 308 y 310 origen vegetal.
Los resultados cuantitativos fueron sometidos a un análisis de
varianza (Anexo 5 y Tabla 6.7) arrojando como resultado que todos
los tratamientos son estadísticamente diferentes y por lo tanto no
son agrupables.
Tabla 6.7. Prueba de rango múltiple de Duncan para tratamientos de queratina.
Tratamiento N Media Agrupamiento
Duncan
Casco sin glucosa 27 0.23226 A
Casco con glucosa 27 0.18715 B
Pelo sin glucosa 27 0.11889 C
Pelo con glucosa 27 0.07446 D
De acuerdo con la Tabla 6.7, los resultados con valores más altos
de degradación de queratina se obtuvieron con los tratamientos de
56
casco, en primer lugar sin glucosa, seguido por el tratamiento casco
con glucosa y en tercer y cuarto lugar, los tratamientos de pelo en
el mismo orden.
Lo anterior indica que todos los aislamientos examinados tenían la
capacidad de liberar queratinasas en diferentes cantidades y
concentraciones según el sustrato que estaba utilizando como
fuente de carbono y nitrógeno para obtener los nutrientes
necesarios en su crecimiento, casco de vaca molido o pelo (Apprich
et al., 2006)
De las diferentes fuentes de carbono utilizadas (glucosa, pelo y
casco como fuentes de queratina) se observó que, en presencia de
glucosa, hay menor degradación de queratina, indicando una
inhibición de la producción de queratinasas, ya que la glucosa
representa una fuente de carbono de fácil acceso, resultado que
concuerda con los obtenidos por Singh (2002).
La Tabla 6.6, la Figura 6.4 y la prueba de rango múltiple de Duncan
(Tabla 6.7. y Anexo 5) indican claramente que cuando se utiliza
casco como fuente de queratina, existe una mayor degradación
(casco sin glucosa: media 0,232g equivalente al 92.9% del sustrato
inicial y casco con glucosa: media 0,187g equivalente al 74.85%
del sustrato inicial).
57
-0,05
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
111 121 156 203 206 210 303 308 310
AISLAMIENTOS
TO
TA
L Q
UE
RA
TIN
A D
EG
RA
DA
DA
(g
)
Pelo + glucosa Pelo Casco + glucosa Casco Figura 6.4. Actividad queratinolítica Fusarium sp.
La degradación de queratina involucra dos mecanismos muy
cercanos. Primero, penetración mecánica del sustrato por la
elongación de la hifa; este proceso es responsable del ataque
inicial; y, segundo, la degradación enzimática por las queratinasas
secretadas desde la pared celular (Singh, 1999). Esto permite
plantear que el tamaño de la partícula puede influenciar en el
proceso de colonización de los sustratos, ya que confiere mayor
superficie de contacto hifa-sustrato y este es uno de los factores
que se pueden tener en cuenta como punto de partida para
determinar una de las razones de mayor degradación en casco en
comparación con el pelo, teniendo en cuenta que el casco se
encontraba molido, mientras que el pelo estaba en trozos que
impedían una mayor superficie de contacto y obligaban al hongo a
realizar una penetración mecánica. Adicionalmente, la pulverización
del casco puede ocasionar la ruptura de los puentes bisulfuro
58
presentes en la queratina, haciéndola más asequible para el hongo
(Vignardet et al., 2001).
Otra razón que pudo influenciar el alto porcentaje de degradación
de queratina en casco es, como lo afirman Apprich y colaboradores
(2006), que la producción de queratinasas es estimulada con la
adición de diferentes fuentes de queratina al medio de cultivo y,
según la naturaleza de dicho sustrato (casco o pelo), la producción
puede variar sustancialmente.
Existe otra razón por la cual el sustrato casco se pudo haber
degradado en una alta proporción. Según Lal (1999), existe la
posibilidad que el casco posea sustratos no queratinosos de fácil
degradación para el hongo. Pero, esta teoría no pudo ser
comprobada en este estudio ya que no se realizaron análisis de
caracterización del casco, como tampoco de cambio de pH del
medio, parámetro que también es indicador de la degradación de
queratina. El complejo mecanismo de queratinolisis involucra la
acción cooperativa de sulfitolisis y un sistema proteolítico, lo que
conlleva a una consecuente liberación de nitrógeno ocasionando la
alcalinización progresiva del medio de cultivo (Singh, 2002; Di
Pietro & Roncero, 2005; Gupta & Ramnani, 2006).
Por otro lado, la Tabla 6.6, la Figura 6.4 y la prueba de rango
múltiple de Duncan (Tabla 6.7. y Anexo 5) también indican que
cuando se emplea pelo como fuente de queratina, el porcentaje de
degradación es menor (pelo sin glucosa: media 0.119 equivalente a
59
47.6% del sustrato inicial y pelo con glucosa media 0,075 g
equivalente a 29.8% del sustrato inicial).
Esta menor degradación de queratina pudo deberse a la utilización
de pelo castaño, ya que en los trabajos donde se reporta el uso de
"cebo de pelo", para evaluar actividad queratinolitica utilizando pelo
como sustrato (Ulfig, 2000; Mitola et al., 2001), afirman que debe
usarse pelo castaño claro preferiblemente, ya que la melanina,
responsable del oscurecimiento del pelo, hace que este sea más
resistente al ataque por microorganismos (Nosanchuk & Casadevall,
2003).
Otro factor que pudo influenciar el bajo porcentaje de degradación
de queratina y el crecimiento pobre que se encontró en las pruebas
cualitativas, cuando se usó pelo como sustrato, fue que el pelo
utilizado además de ser castaño, era grueso y ondulado lo que
indica un alto contenido de metionina y según la fisiología de los
hongos queratinolílticos descrita por Kunert (2000), este
aminoácido puede ser utilizado como fuente de sulfuro, pero en
caso de estar en concentraciones mayores a 1mM, es altamente
inhibitorio.
Según el ajuste del modelo del análisis de rango múltiple de
Duncan se encuentra que entre las procedencias no hay diferencias
estadísticamente significativas entre humanos y plantas, y sí las
hay para animales (Tabla 6.8, Anexo 5), aislamientos que
presentaron una mayor actividad queratinolítica tanto en
60
degradación de queratina de casco, como en degradación de
queratina de pelo.
Tabla 6.8. Prueba de rango múltiple de Duncan para agrupamiento de aislamientos según
degradación de queratina
Procedencia N Media Agrupamiento
Duncan
Animal 36 0.172975 A
Planta 36 0.147978 B
Humano 36 0.138611 B
Aunque no hubo diferencias significativas entre procedencias de
humanos y plantas, mostraron una mayor actividad queratinolítica
los aislamientos de plantas frente a los aislamientos de humanos,
resultado inesperado ya que, debido a la ausencia de queratina en
las plantas, no se espera que tengan una buena actividad
queratinolítica; porque para la actividad fitopatógena deben tener
el complejo enzimático CWDE activo, mecanismo principal mediante
el cual se depolimeriza cada uno de los componentes de las
paredes celulares (celulosa, xilano, pectinas, ácidos
poligalacturónicos y extensinas) (Di Pietro & Roncero, 2005). Estos
resultados son interesantes para próximos estudios.
Por otro lado, la poca actividad queratinolitica por parte de los
aislamientos de humanos se puede explicar por que no se realizó
una activación enzimática. Los aislamientos estaban conservados
en agua y no se tiene historial de la cantidad de repiques que
tuvieron antes de la conservación. La conservación en agua puede
tener un alto porcentaje de viabilidad pero puede ocasionar pérdida
61
de características fisiológicas como la capacidad de virulencia
(Borba et al., 1992). Este efecto que también puede ser ocasionado
por la utilización del método de transferencia seriada (repiques)
(Monaghan et al., 1999), teniendo en cuenta estas observaciones,
se debió realizar una activación enzimática. Consiste en someter al
hongo a crecer en un sustrato de composición igual o parecida al
sustrato del cual fue aislado inicialmente (tejido afectado del
hospedero), estimulando la producción de enzimas queratinolíticas
y así mismo su actividad patogénica original.
Los aislamientos procedentes de animales presentaron mayor
degradación de queratina en los dos sustratos. Se debe a que
tenían pocos repiques antes de ser utilizados; por lo tanto, estaban
expresando todas sus características patogénicas. Como el modelo
animal fue el casco, era en éste donde se esperaba mayor
actividad, pero también se encontró en el pelo. Así mismo, este
resultado puede deberse a que las principales zonas de aislamiento
estaban cubiertas de pelo, lo que indica que éste también puede
ser empleado como modelo de patogenicidad en animales.
El análisis estadístico de agrupamiento de Duncan, haciendo una
comparación de medias de todos los aislamientos, arroja tres
agrupamientos, en el primero se encuentran los aislamientos 121,
111, 156, 310, 303 y 210, de los cuales los cuatro últimos
pertenecen también al segundo grupo, junto con los aislamientos
206 y 203, y estos dos últimos a su vez pertenecen al tercer grupo
junto con el aislamiento 308 (Tabla 6.9 y Anexo 5). El orden
anterior fue dado de mayor a menor degradación de queratina,
62
indicando que los aislamientos que inician con 100 son procedentes
de animal, confirmando el agrupamiento de procedencias; los 200
son de humanos y los 300 de plantas. En estos resultados se pude
destacar que el aislamiento 308 fue significativamente diferente en
cuanto a la degradación de queratina y al comportamiento de las
procedencias, pero no afecta el agrupamiento de las mismas; por lo
tanto, no se tiene en cuenta, ya que la cantidad de aislamientos
evaluados por procedencia no es un número representativo para
poder definir una tendencia en comportamiento como patógeno
multihospedero.
Tabla 6.9. Prueba de Duncan para degradación de queratina.
Aislamiento N Media Agrupamiento de
Duncan
121 12 0.18166 A
111 12 0.17141 A
156 12 0.16586 A B
310 12 0.16430 A B
303 12 0.16030 A B
210 12 0.15008 A B C
206 12 0.13302 B C
203 12 0.13274 B C
308 12 0.1194 C
Al analizar los modelos humano y animal por separado (Tabla 6.10
y 6.11; Anexos 6 y 7) encontramos diferencias sustanciales que
permiten plantear que cada procedencia tiene una mayor capacidad
de atacar su hospedero original (111 procedente de animal
63
presentó una media de degradación de casco de 0.265 y 206
procedente de humano presentó una media de degradación de pelo
0.162). No obstante, hay que tener en cuenta las características y
la ubicación de la lesión originaria y así mismo la similitud de los
tejido evaluados, ya que el modelo humano utilizado fue pelo, pero
el 90% de los aislamientos de animales estaban en contacto directo
con este sustrato de origen animal, en tanto que el 90% de los
aislamientos procedentes de humanos fueron aislados de lesiones
de uña, tejido que se asemeja al casco en su composición y función
(Lal et al., 1999). Por lo anterior y porque se trabajan los modelos
de patogenicidad in vitro, no se puede reconocer la importancia que
tiene la función del sistema inmune de cada hospedero, siendo esta
una de las principales diferencias que puede interferir en los
modelos evaluados.
Tabla 6.10. Prueba de agrupamiento de Duncan de los aislamientos en relación con la
degradación de casco.
Aislamiento N Media Agrupamiento
de Duncan
111 3 0.26467 A
156 3 0.26233 A
303 3 0.25097 A
121 3 0.25027 A
210 3 0.23977 A
308 3 0.23427 A B
203 3 0.22437 A B
310 3 0.21543 A B
206 3 0.16480 B
64
Tabla 6.11. Prueba de agrupamiento de Duncan de los aislamientos en relación con la
degradación de pelo.
Aislamiento N Media Agrupamiento
de Duncan
206 3 0.16177 A
156 3 0.15133 A
111 3 0.13263 A B
303 3 0.12470 A B
210 3 0.12293 A B
308 3 0.11683 A B
310 3 0.09487 A B
121 3 0.08877 A B
203 3 0.04323 B
6.4. Fusarium sp., COMO MODELO MULTIHOSPEDERO
A partir de los resultados obtenidos en los tres modelos de
patogenicidad desarrollados en el presente estudio, se realizó un
análisis estadístico de correlaciones que buscaba evaluar la
capacidad multihospedera de Fusarium sp., teniendo en cuenta que
en esta prueba se toman valores cercanos a 1 y -1 como un índice
de correlación representativo. La Tabla 6.12 indica que el
comportamiento de las tres clases de procedencia es diferente y no
se correlacionan.
65
Tabla 6.12. Correlación de los modelos de patogenicidad
Queratina pelo Queratina casco Área bajo la curva (Planta)
Queratina pelo 1 Queratina casco -0,09995258 1 Área bajo la curva (Planta) 0,03037409 0,45926013 1
Aunque los resultados estadísticos del presente estudio de
correlación no indiquen un valor representativo, varios autores han
reportado a Fusarium sp., como un hongo capaz de causar
patologías en varios tejidos y comportarse como multihospedero.
Di Pietro y Roncero (2005) encontraron en su estudio que una cepa
de Fusarium procedente de tomate, F. oxysporum f.sp. lycopesici,
presentaba capacidad de infectar de manera sistémica y causar de
forma consecuente la muerte de ratones inmunodeprimidos. De la
misma forma, González y colaboradores (1998) reportaron que los
animales domésticos (perros y gatos), representan un importante
reservorio de Fusarium sp., causante de dermatomicosis en el
hombre.
Adicionalmente, los resultados de este estudio permiten observar
que todos los aislamientos independientemente de su procedencia,
mostraron capacidad de infectar los tres tejidos evaluados en
diferentes proporciones, indicando una posible capacidad
multihospedera; por lo tanto se puede concluir que el número de
aislamientos utilizados no es representativo para este tipo de
análisis estadístico.
66
7. CONCLUSIONES
De un total de 62 muestras de lesiones en animales el 16% fueron
positivas para Fusarium sp.
De las muestras de lesiones en animales analizadas
(dermatomicosis y queratitis), Fusarium mostró una alta incidencia
constituyendo el 41% de aislamiento de hongos miceliares.
Se pudo confirmar la alta frecuencia de Fusarium sp. como
fitopatógeno, obteniéndose un porcentaje de aislamiento del 94%
de las muestras analizadas.
Las pruebas de infección cruzada permitieron confirmar a Fusarium
sp. como un patógeno multihospedero , teniendo en cuenta que los
aislamientos independientemente de su procedencia, mostraron
capacidad de infectar los tres tejidos evaluados en diferentes
proporciones.
Aunque se confirmó que la capacidad de Fusarium sp. de
comportarse como patógeno multihospedero, también se concluyó
que los mayores índices de actividad patogénica se presentan sobre
el modelo de patogénesis correspondiente a su hospedero original.
Los porcentajes de degradación de sustrato queratinizado
confirman que el casco es un sustrato más fácilmente degradable.
67
Se confirma que la presencia de glucosa en el medio inhibe la
actividad queratinolítica para los dos modelos evaluados.
La definición del comportamiento de un patógeno como
multihospedero, requiere de la comparación de más de 3
aislamientos por cada tipo de hospedero, con el fin de poder
establecer tendencias en comportamiento con un soporte
estadístico significativo.
68
8. RECOMENDACIONES
• Para desarrollar estudios en patógenos con capacidad
multihospedera, es indispensable trabajar con más de tres
aislamientos de cada hospedero, ya que este número no es
representativo y no permite establecer tendencias en el
comportamiento de los aislamientos como patógenos, como quedo
demostrado en el presente estudio, que se enfocó principalmente
en el aislamiento de Fusarium sp. a partir de lesiones en animales y
a la estandarización de los ensayos de infectividad cruzada, con
solo tres aislamientos de cada tipo de hospedero.
• Se sugiere llevar a cabo reactivación de los aislamientos de
origen humano y animal, previo a los ensayos de actividad
queratinolítica, para garantizar la estimulación de la actividad
patogénica. Una alternativa para la reactivación de los aislamientos,
es hacer un cultivo en medio de sales basales con adición de
sustrato queratinizado.
• Para las pruebas que permiten medir la actividad
queratinolítica, es importante medir la variación de pH que presente
el medio, ya que éste es uno de los principales indicadores
reportados de esta actividad enzimática, ya que al tratarse de un
proceso conjunto de sulfitolisis y proteolisis, se presenta como
consecuencia la liberación de nitrógeno al medio, ocasionando su
alcalinización.
69
9. REFERENCIAS
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81
10. ANEXOS ANEXO 1. Hojas de vida de la colección de Fusarium sp
COLECCIÓN DE MICROORGANISMOS PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
Responsables: Nathalie Camacho & Julie Andrea Gil Número M 108 Microorganismo Fusarium sp.
Fuente Bovino Origen: Hisopado de lesión en ojo de vaca
Fecha de muestreo: 27 Julio de 2007
Almacenamiento
Caja de petri medio PDA suplementado con cloranfenicol
Historial Cepario desde: 10 Julio de 2007
Nivel de seguridad 1 T° Ambiente
Condiciones de crecimiento Aerobio estricto. Temperatura: 25ºC durante 5 – 15 días
Pruebas biológicas
Características morfológicas Características Macroscópicas: AGAR PDA: Colonias con crecimiento radial. Micelio algodonoso, en acumulo de apariencia seca, color hueso. REVERSO DE LA COLONIA. Color hueso inicialmente y luego se torna café, sin difusión de pigmento al agar
Características Microscópicas:
Hifas hialinas septadas, presencia de clamidosporas hialinas intercalares y terminales. Macroconidias fusiformes con tres y cuatros septos y microconidias redondas
Identificación de Peligros
Forma de Transmisión Periodo de Incubación Enfermedades que produce
Corrientes de aire / aerosoles Depende de la carga fúngica y el estado inmunológico del paciente Desconocidas
82
Medidas de Protección / Manipulación
- El personal debe usar equipo de protección normal (uso apropiado de bata, guantes, tapabocas, gorro) - Eliminación y tratamiento apropiado de desechos - Higiene personal: lavado de manos - Intervención sólo por personal, capacitado y consciente de los peligros del microorganismo.
Conservación del microorganismo
El hongo se encuentra conservado en agua destilada estéril, aceite mineral estéril y papel filtro estéril. La conservación se realizo a partir de cultivos monospóricos
Observaciones
- Número de repiques antes de realización de monospórico: 4
- Fecha de realización de monospórico: 15 septiembre 2007
- Número de repiques antes de conservación: 3
- Fecha de conservación en agua: 6 octubre 2007
- Fecha de conservación en aceite: 17 octubre 2007
- Fecha de conservación en papel: 29 octubre 2007
Características de la lesión
83
COLECCIÓN DE MICROORGANISMOS
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA Responsables: Nathalie Camacho & Julie Andrea Gil Número M 111 Microorganismo Fusarium sp.
Fuente Canino Origen: Hisopado de lesión superficial en extremidades anteriores de canino criollo.
Fecha de muestreo: 5 Julio de 2007
Almacenamiento
Caja Petri grande con agar sabouraud suplementado con cloranfenicol
Historial Cepario desde: 10 Julio de 2007
Nivel de seguridad 1 T° Ambiente
Condiciones de crecimiento Aerobio estricto. Temperatura: 25ºC durante 5 – 15 días
Pruebas biológicas
Características morfológicas Características Macroscópicas: AGAR PDA: Colonias con presencia de diámetro de 5 cm a los 5 días. Micelio algodonoso, aéreo, en acumulo, inicialmente blanco y luego se torna color hueso con pigmentaciones amarillas en la parte más superficial. Apariencia seca, correosa. REVERSO DE LA COLONIA. Color curuba.
Características Microscópicas:
Hifas septadas e hialinas, con clamidosporas intercalares, Presencia de macroconidias fusiformes, septadas.
Identificación de Peligros
Forma de Transmisión Periodo de Incubación Enfermedades que produce
Corrientes de aire / aerosoles Depende de la carga fúngica y el estado inmunológico del paciente No reportadas
84
Medidas de Protección / Manipulación
- El personal debe usar equipo de protección normal (uso apropiado de bata, guantes, tapabocas, gorro) - Eliminación y tratamiento apropiado de desechos - Higiene personal: lavado de manos - Intervención sólo por personal, capacitado y consciente de los peligros del microorganismo.
Conservación del microorganismo
El hongo se encuentra conservado en agua destilada estéril, aceite mineral estéril y papel filtro estéril. La conservación se realizo a partir de cultivos monospóricos
Observaciones
- Número de repiques antes de realización de monospórico: 4
- Fecha de realización de monospórico: 7 septiembre 2007
- Número de repiques antes de conservación: 3
- Fecha de conservación en agua: 30 octubre 2007
- Fecha de conservación en aceite: 1 octubre 2007
- Fecha de conservación en papel: 18 octubre 2007
Características de la lesión
85
COLECCIÓN DE MICROORGANISMOS
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA Responsables: Nathalie Camacho & Julie Andrea Gil Número M 121 Microorganismo Fusarium sp.
Fuente Canino Origen: Hisopado de lesión superficial en lomo, zona anterior, de canino criollo
Fecha de muestreo: 5 Julio de 2007
Almacenamiento
Caja Petri grande con agar sabouraud suplementado con cloranfenicol
Historial Cepario desde: 19 Julio de 2007
Nivel de seguridad 1 T° Ambiente
Condiciones de crecimiento Aerobio estricto. Temperatura: 25ºC durante 5 – 15 días
Pruebas biológicas
Características morfológicas Características Macroscópicas: AGAR PDA: Colonias con presencia de diámetro de 5 cm a los 5 días. Micelio algodonoso, aéreo, ampliamente esparcido de forma flocosa, blanco con pigmentaciones púrpura, más cercana en la superficie del medio de cultivo. REVERSO DE LA COLONIA. Púrpura, sin pigmento difusible al medio
Características Microscópicas:
Presencia de hifas hialinas septadas, macroconidias en forma de granitos de arroz, con tres y cuatro septos. Presencia de clamidosporas intercalares y terminales. Microconidias redondeadas.
Presencia de microconidias a partir de fiálide laterales, agrupadas en falsas. Presencia de macroconidias, septadas, curvadas.
86
Identificación de Peligros
Forma de Transmisión Periodo de Incubación Enfermedades que produce
Corrientes de aire / aerosoles Depende de la carga fúngica y el estado inmunológico del paciente No reportadas
Tratamiento
Medidas de Protección / Manipulación
- El personal debe usar equipo de protección normal (uso apropiado de bata, guantes, tapabocas, gorro) - Eliminación y tratamiento apropiado de desechos - Higiene personal: lavado de manos - Intervención sólo por personal, capacitado y consciente de los peligros del microorganismo.
Conservación del microorganismo
El hongo se encuentra conservado en agua destilada estéril, aceite mineral estéril y papel filtro estéril. La conservación se realizo a partir de cultivos monospóricos
Observaciones
- Número de repiques antes de realización de monospórico: 3
- Fecha de realización de monospórico: 7 septiembre 2007
- Número de repiques antes de conservación: 3
- Fecha de conservación en agua: 6 noviembre 2007
- Fecha de conservación en aceite: 9 octubre 2007 Fecha de conservación en papel: 18 octubre 2007
Características de la lesión
87
COLECCIÓN DE MICROORGANISMOS
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA Responsables: Nathalie Camacho & Julie Andrea Gil Número M 131 Microorganismo Fusarium sp.
Fuente Canino Origen: Raspado de lesión superficial lomo zona anterior. Canino
Fecha de muestreo: 26 de Junio de 2007
Almacenamiento
Caja Petri grande con agar sabouraud suplementado con cloranfenicol
Historial Cepario desde: 10 Julio de 2007
Nivel de seguridad 1 T° Ambiente
Condiciones de crecimiento Aerobio estricto. Temperatura: 25ºC durante 5 – 15 días
Pruebas biológicas
Características morfológicas Características Macroscópicas: AGAR PDA: Colonias con micelio algodonoso, aéreo, en acumulos, color café claro en la parte central y con borde blanco. Presenta exudados color miel. REVERSO DE LA COLONIA. Color hueso.
Características Microscópicas:
Hifas septadas anchas, hialinas, con presencia de clamidosporas intercalares y terminales.
Identificación de Peligros
Forma de Transmisión Periodo de Incubación Enfermedades que produce
Corrientes de aire / aerosoles Depende de la carga fúngica y el estado inmunológico del paciente Desconocidas.
88
Tratamiento
Medidas de Protección / Manipulación
- El personal debe usar equipo de protección normal (uso apropiado de bata, guantes, tapabocas, gorro) - Eliminación y tratamiento apropiado de desechos - Higiene personal: lavado de manos - Intervención sólo por personal, capacitado y consciente de los peligros del microorganismo.
Conservación del microorganismo
El hongo se encuentra conservado en agua destilada estéril, aceite mineral estéril y papel filtro estéril. La conservación se realizo a partir de cultivos monospóricos
Observaciones
- Número de repiques antes de realización de monospórico: 4
- Fecha de realización de monospórico: 11 septiembre 2007
- Número de repiques antes de conservación: 3
- Fecha de conservación en agua: 30 octubre de 2007
- Fecha de conservación en aceite: 1 octubre 2007
- Fecha de conservación en papel: 13 noviembre 2007
Características de la lesión
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COLECCIÓN DE MICROORGANISMOS
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA Responsables: Nathalie Camacho & Julie Andrea Gil Número M 155 Microorganismo Fusarium sp.
Fuente Canino Origen: Raspado de lesión superficial lomo zona anterior. Canino
Fecha de muestreo: 5 de Julio de 2007
Almacenamiento
Caja Petri grande con agar sabouraud suplementado con cloranfenicol
Historial Cepario desde: 10 Julio de 2007
Nivel de seguridad 1 T° Ambiente
Condiciones de crecimiento Aerobio estricto. Temperatura: 25ºC durante 5 – 15 días
Pruebas biológicas
Características morfológicas Características Macroscópicas: AGAR PDA: Colonia floculada algodonosa, color blanco con pigmento púrpura sobre la zona de la estría inicialmente. Colonias con más de 15 días toman coloración púrpura y solo en la parte externa de la colonia que presenta crecimiento radial se ve micelio algodonoso color blanco. REVERSO DE LA COLONIA. Pigmento difusible al medio color amarillo claro
Características Microscópicas:
Hifas hialinas septadas, con presencia de vesículas internamente, abundantes clamidosporas hialinas intercalares y terminales macro y microconidias.
Identificación de Peligros
Forma de Transmisión Periodo de Incubación Enfermedades que produce
Corrientes de aire / aerosoles Depende de la carga fúngica y el estado inmunológico del paciente No reportadas
90
Medidas de Protección / Manipulación
- El personal debe usar equipo de protección normal (uso apropiado de bata, guantes, tapabocas, gorro) - Eliminación y tratamiento apropiado de desechos - Higiene personal: lavado de manos - Intervención sólo por personal, capacitado y consciente de los peligros del microorganismo.
Conservación del microorganismo
El hongo se encuentra conservado en agua destilada estéril, aceite mineral estéril y papel filtro estéril. La conservación se realizo a partir de cultivos monospóricos
Observaciones
- Número de repiques antes de realización de monospórico: 3
- Fecha de realización de monospórico: 11 septiembre 2007
- Número de repiques antes de conservación: 3
- Fecha de conservación en agua: 26 octubre 2007
- Fecha de conservación en aceite: 11 octubre 2007
- Fecha de conservación en papel: 13 noviembre 2007
Característica de la lesión
91
COLECCIÓN DE MICROORGANISMOS
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA Responsables: Nathalie Camacho & Julie Andrea Gil Número M 156 Microorganismo Fusarium sp.
Fuente Canino Origen: Raspado de lesión superficial lomo zona posterior. Canino
Fecha de muestreo: 27 de Junio de 2007
Almacenamiento
Caja Petri grande con agar sabouraud suplementado con cloranfenicol
Historial Cepario desde: 10 de Julio de 2007
Nivel de seguridad 1 T° Ambiente
Condiciones de crecimiento Aerobio estricto. Temperatura: 25ºC durante 5 – 15 días
Pruebas biológicas
Características morfológicas Características Macroscópicas: En Médio PDA se desarrolla comunmente con colonias de 5cm de diámetro floculadas algodonosas a los 5 días. Color rosado intenso. La zona externa de la colonia presenta color más claro que en la zona central. REVERSO DE LA COLONIA. Color morado claro y no presenta pigmento difusible al medio.
Características Microscópicas:
Hifas hialinas septadas, con presencia de vesículas internamente, abundantes clamidosporas hialinas intercalares y terminales macro y microconidias.
Identificación de Peligros
Forma de Transmisión Periodo de Incubación Enfermedades que produce
Corrientes de aire / aerosoles Depende de la carga fúngica y el estado inmunológico del paciente No reportadas
92
Medidas de Protección / Manipulación
- El personal debe usar equipo de protección normal (uso apropiado de bata, guantes, tapabocas, gorro) - Eliminación y tratamiento apropiado de desechos - Higiene personal: lavado de manos - Intervención sólo por personal, capacitado y consciente de los peligros del microorganismo.
Conservación del microorganismo
El hongo se encuentra conservado en agua destilada estéril, aceite mineral estéril y papel filtro estéril. La conservación se realizo a partir de cultivos monospóricos
Observaciones
- Número de repiques antes de realización de monospórico: 4
- Fecha de realización de monospórico: 11 septiembre 2007
- Número de repiques antes de conservación: 3
- Fecha de conservación en agua: 26 octubre 2007
- Fecha de conservación en aceite: 11 octubre 2007
- Fecha de conservación en papel: 18 noviembre 2007
Características de la lesión
93
COLECCIÓN DE MICROORGANISMOS
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA Responsables: Nathalie Camacho & Julie Andrea Gil Número M 159 Microorganismo Fusarium sp.
Fuente Canino
Origen: Hisopado de lesión superficial en canino criollo, articulación de extremidad posterior
Fecha de muestreo: 15 Julio de 2007
Almacenamiento
Caja Petri grande con agar sabouraud suplementado con cloranfenicol
Historial Cepario desde: 19 Julio de 2007
Nivel de seguridad 1 T° Ambiente
Condiciones de crecimiento Aerobio estricto. Temperatura: 25ºC durante 5 – 15 días
Pruebas biológicas
Características morfológicas Características Macroscópicas: Colonia de crecimiento radial, con color ocre en la zona central de la colonia y bordes color vinotinto. REVERSO DE LA COLONIA. Color vinotinto con pigmento difusible al medio color ocre.
Características Microscópicas:
Hifas septadas e hialinas, con clamidosporas intercalares, Presencia de macroconidias fusiformes, septadas.
Identificación de Peligros
Forma de Transmisión Periodo de Incubación Enfermedades que produce
Corrientes de aire / aerosoles Depende de la carga fúngica y el estado inmunológico del paciente No reportadas
94
Medidas de Protección / Manipulación
- El personal debe usar equipo de protección normal (uso apropiado de bata, guantes, tapabocas, gorro) - Eliminación y tratamiento apropiado de desechos - Higiene personal: lavado de manos - Intervención sólo por personal, capacitado y consciente de los peligros del microorganismo.
Conservación del microorganismo
El hongo se encuentra conservado en agua destilada estéril, aceite mineral estéril y papel filtro estéril. La conservación se realizo a partir de cultivos monospóricos
Observaciones
- Número de repiques antes de realización de monospórico: 5
- Fecha de realización de monospórico: 11 septiembre 2007
- Número de repiques antes de conservación: 3
- Fecha de conservación en agua: 6 noviembre 2007
- Fecha de conservación en aceite: 1 octubre 2007
- Fecha de conservación en papel: 18 octubre 2007
Característica de la lesión
95
COLECCIÓN DE MICROORGANISMOS
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA Responsables: Nathalie Camacho & Julie Andrea Gil Número M 160 Microorganismo Fusarium sp.
Fuente Bovino Origen: Raspado de lesión cutánea en zona media del lomo. De bovino
Fecha de muestreo: 5 agosto de 2007
Almacenamiento
Caja Petri grande con agar sabouraud suplementado con cloranfenicol
Historial
Cepario desde: 9 agosto de 2007
Nivel de seguridad 1 T° Ambiente
Condiciones de crecimiento Aerobio estricto. Temperatura: 25ºC durante 5 – 15 días
Pruebas biológicas
Características morfológicas Características Macroscópicas: Colonia floculada algodonosa color púrpura, con presencia de acumulo, y secciones de color blanquecino inicialmente, en cultivos con más de 15 días las zonas blancas tienden a tomar color ocre.. REVERSO DE LA COLONIA. Color púrpura. Con pigmento difusible al medio color ocre.
Características Microscópicas:
Hifas septadas e hialinas, con clamidosporas intercalares, Presencia de macroconidias fusiformes, septadas.
Identificación de Peligros
Forma de Transmisión Periodo de Incubación Enfermedades que produce
Corrientes de aire / aerosoles Depende de la carga fúngica y el estado inmunológico del paciente No reportadas
96
Medidas de Protección / Manipulación
- El personal debe usar equipo de protección normal (uso apropiado de bata, guantes, tapabocas, gorro) - Eliminación y tratamiento apropiado de desechos - Higiene personal: lavado de manos - Intervención sólo por personal, capacitado y consciente de los peligros del microorganismo.
Conservación del microorganismo
El hongo se encuentra conservado en agua destilada estéril, aceite mineral estéril y papel filtro estéril. La conservación se realizo a partir de cultivos monospóricos
Observaciones
- Número de repiques antes de realización de monospórico: 3
- Fecha de realización de monospórico: 11 septiembre 2007
- Número de repiques antes de conservación: 3
- Fecha de conservación en agua: 6 noviembre 2007
- Fecha de conservación en aceite: 16 octubre 2007
- Fecha de conservación en papel: 18 octubre 2007
Característica de la lesión
97
COLECCIÓN DE MICROORGANISMOS
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA Responsables: Nathalie Camacho & Julie Andrea Gil Número M 161 Microorganismo Fusarium sp.
Fuente Canino Origen: Raspado de lesión cutánea en cola, canino raza Pitbull.
Fecha de muestreo: 5 agosto de 2007
Almacenamiento
Caja Petri grande con agar sabouraud suplementado con cloranfenicol
Historial
Cepario desde: 9 agosto de 2007
Nivel de seguridad 1 T° Ambiente
Condiciones de crecimiento Aerobio estricto. Temperatura: 25ºC durante 5 – 15 días
Pruebas biológicas
Características morfológicas Características Macroscópicas: Colonia algodonosa de crecimiento radial. Color púrpura concentrado alrededor del punto de siembra y a partir de este halo se desarrolla colonias moradas claras que alternan en secciones con zonas blancas. La zona externa de la colonia presenta un halo que rodea color púrpura. REVERSO DE LA COLONIA. Color púrpura haciendo halo alrededor del punto de siembra, y a partir de esto la colonia toma color crema. En la zona externa presenta coloración púrpura. Pigmento difusible al medio color amarillo claro
Características Microscópicas:
Hifas septadas e hialinas, con clamidosporas intercalares, Presencia de macroconidias fusiformes con 3 y 4 septos.
98
Identificación de Peligros
Forma de Transmisión Periodo de Incubación Enfermedades que produce
Corrientes de aire / aerosoles Depende de la carga fúngica y el estado inmunológico del paciente No reportadas
Medidas de Protección / Manipulación
- El personal debe usar equipo de protección normal (uso apropiado de bata, guantes, tapabocas, gorro) - Eliminación y tratamiento apropiado de desechos - Higiene personal: lavado de manos - Intervención sólo por personal, capacitado y consciente de los peligros del microorganismo.
Conservación del microorganismo
El hongo se encuentra conservado en agua destilada estéril, aceite mineral estéril y papel filtro estéril. La conservación se realizo a partir de cultivos monospóricos
Observaciones
- Número de repiques antes de realización de monospórico: 3
- Fecha de realización de monospórico: 11 septiembre 2007
- Número de repiques antes de conservación: 3
- Fecha de conservación en agua: 6 noviembre 2007
- Fecha de conservación en aceite: 16 octubre 2007
- Fecha de conservación en papel: 18 octubre 2007
Característica de la lesión
99
COLECCIÓN DE MICROORGANISMOS
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA Responsables: Nathalie Camacho & Julie Andrea Gil Número M 162 Microorganismo Fusarium sp.
Fuente Canino Origen: hHisopado de lesión cutánea en lomo superior.
Fecha de muestreo: 4 de agosto de 2007
Almacenamiento
Caja Petri grande con agar sabouraud suplementado con cloranfenicol
Historial
Cepario desde: 9 de agosto de 2007
Nivel de seguridad 1 T° Ambiente
Condiciones de crecimiento Aerobio estricto. Temperatura: 25ºC durante 5 – 15 días
Pruebas biológicas
Características morfológicas Características Macroscópicas: Colonia algodonosa floculada color blanco, y en sección de estría presenta coloración morada clara. De aspecto seco y crecimiento radial. REVERSO DE LA COLONIA. Color crema con pigmento difusible al medio amarillo claro.
Características Microscópicas:
Hifas hialinas septadas, con presencia de vesículas internamente, abundantes clamidosporas hialinas intercalares y terminales macro y microconidias.
Identificación de Peligros
Forma de Transmisión Periodo de Incubación Enfermedades que produce
Corrientes de aire / aerosoles Depende de la carga fúngica y el estado inmunológico del paciente No reportadas
100
Medidas de Protección / Manipulación
- El personal debe usar equipo de protección normal (uso apropiado de bata, guantes, tapabocas, gorro) - Eliminación y tratamiento apropiado de desechos - Higiene personal: lavado de manos - Intervención sólo por personal, capacitado y consciente de los peligros del microorganismo.
Conservación del microorganismo
El hongo se encuentra conservado en agua destilada estéril, aceite mineral estéril y papel filtro estéril. La conservación se realizo a partir de cultivos monospóricos
Observaciones
- Número de repiques antes de realización de monospórico: 5
- Fecha de realización de monospórico: 11 septiembre 2007
- Número de repiques antes de conservación: 3
- Fecha de conservación en agua: 26 octubre 2007
- Fecha de conservación en aceite: 11 octubre 2007
- Fecha de conservación en papel: 26 octubre 2007
101
COLECCIÓN DE MICROORGANISMOS
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA Responsables: Nathalie Camacho & Julie Andrea Gil Número M201 Microorganismo Fusarium sp.
Fuente Humano Origen: Onicomicosis
Fecha de recuperación: 23 Agosto de 2007
Almacenamiento
Caja de petri medio PDA suplementado con cloranfenicol
Historial Colección de Cepario de micología PUJ
Nivel de seguridad 1 T° Ambiente
Condiciones de crecimiento Aerobio estricto. Temperatura: 25ºC durante 5 – 15 días
Pruebas biológicas
Características morfológicas Características Macroscópicas: En agar PDA desarrolla colonias de crecimiento radial húmedas de color morado con micelio blanquecino tenue. Presenta coloración más concentrada alrededor del punto de siembra que no tiene un patrón radial. En la zona externa de la colonia se evidencia coloración morada muy clara haciendo un halo externo. REVERSO DE LA COLONIA. Color morado claro con pigmento difusible color amarillo claro. En el reverso se observa con mayor claridad que a partir del punto de siembra hay zonas moradas más concentradas que no tienen patrón de desarrollo radial.
Características Microscópicas:
Hifas hialinas septadas, presencia de clamidosporas hialinas intercalares y terminales. Macroconidias fusiformes septadas.
102
Identificación de Peligros
Forma de Transmisión Periodo de Incubación Enfermedades que produce
Corrientes de aire / aerosoles Depende de la carga fúngica y el estado inmunológico del paciente Onicomicosis
Medidas de Protección / Manipulación
- El personal debe usar equipo de protección normal (uso apropiado de bata, guantes, tapabocas, gorro) - Eliminación y tratamiento apropiado de desechos - Higiene personal: lavado de manos - Intervención sólo por personal, capacitado y consciente de los peligros del microorganismo.
Conservación del microorganismo
El hongo se encuentra conservado en agua destilada estéril, aceite mineral estéril y papel filtro estéril. La conservación se realizo a partir de cultivos monospóricos
Observaciones
- Número de repiques antes de realización de monospórico: 1
- Fecha de realización de monospórico: 7 septiembre 2007
- Número de repiques antes de conservación: 3
- Fecha de conservación en agua: 6 noviembre 2007
- Fecha de conservación en aceite: 6 noviembre 2007
- Fecha de conservación en papel: 21 Enero 2008
103
COLECCIÓN DE MICROORGANISMOS
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA Responsables: Nathalie Camacho & Julie Andrea Gil Número M202 Microorganismo Fusarium sp.
Fuente Humano Origen: Onicomicosis
Fecha de recuperación: 23 Agosto de 2007
Almacenamiento
Caja de petri medio PDA suplementado con cloranfenicol
Historial Colección de Cepario de micología PUJ
Nivel de seguridad 1 T° Ambiente
Condiciones de crecimiento Aerobio estricto. Temperatura: 25ºC durante 5 – 15 días
Pruebas biológicas
Características morfológicas Características Macroscópicas: En agar PDA desarrolla colonias moradas muy claras de crecimiento restringido, pero no sigue un patrón de crecimiento radial. La colonia es floculada algodonosa, aunque el micelio no es abundante. La zona externa de la colonia presenta desarrollo de hifas color crema. REVERSO DE LA COLONIA. Color morado claro, y se evidencia con mayor facilidad que el desarrollo de la colonia no sigue patrón radial. No presenta pigmento difusible.
Características Microscópicas:
Hifas hialinas septadas, con clamidosporas intercalares hialinas principalmente. Las macroconidias son fusiformes y septadas.
Identificación de Peligros
Forma de Transmisión Periodo de Incubación Enfermedades que produce
Corrientes de aire / aerosoles Depende de la carga fúngica y el estado inmunológico del paciente Onicomicosis
104
Medidas de Protección / Manipulación
- El personal debe usar equipo de protección normal (uso apropiado de bata, guantes, tapabocas, gorro) - Eliminación y tratamiento apropiado de desechos - Higiene personal: lavado de manos - Intervención sólo por personal, capacitado y consciente de los peligros del microorganismo.
Conservación del microorganismo
El hongo se encuentra conservado en agua destilada estéril, aceite mineral estéril y papel filtro estéril. La conservación se realizo a partir de cultivos monospóricos
Observaciones
- Número de repiques antes de realización de monospórico: 1
- Fecha de realización de monospórico: 10 septiembre 2007
- Número de repiques antes de conservación: 3
- Fecha de conservación en agua: 6 noviembre 2007
- Fecha de conservación en aceite: 11 octubre 2007
- Fecha de conservación en papel: 26 octubre 2007
105
COLECCIÓN DE MICROORGANISMOS
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA Responsables: Nathalie Camacho & Julie Andrea Gil Número M203 Microorganismo Fusarium sp.
Fuente Humano Origen: Queratitis
Fecha de recuperación: 31 Agosto de 2007
Almacenamiento
Caja de petri medio PDA suplementado con cloranfenicol
Historial Colección de Cepario de micología PUJ
Nivel de seguridad 1 T° Ambiente
Condiciones de crecimiento Aerobio estricto. Temperatura: 25ºC durante 5 – 15 días
Pruebas biológicas
Características morfológicas Características Macroscópicas: En agar PDA se desarrollan colonia de crecimiento irregular color crema, con secciones que toman color blanco y otras secciones de color morado tenue. Floculadas algodonosas. REVERSO DE LA COLONIA. Color morado y blanco de aparición irregular ya que no presentan un patrón de desarrollo radial. Sin difusión de pigmento al medio
Características Microscópicas:
Hifas hialinas septadas, presencia de clamidosporas hialinas intercalares y terminales. Macroconidias fusiformes con dos y tres septos.
Identificación de Peligros
Forma de Transmisión Periodo de Incubación Enfermedades que produce
Corrientes de aire / aerosoles Depende de la carga fúngica y el estado inmunológico del paciente Queratitis
106
Medidas de Protección / Manipulación
- El personal debe usar equipo de protección normal (uso apropiado de bata, guantes, tapabocas, gorro) - Eliminación y tratamiento apropiado de desechos - Higiene personal: lavado de manos - Intervención sólo por personal, capacitado y consciente de los peligros del microorganismo.
Conservación del microorganismo
El hongo se encuentra conservado en agua destilada estéril, aceite mineral estéril y papel filtro estéril. La conservación se realizo a partir de cultivos monospóricos
Observaciones
- Número de repiques antes de realización de monospórico: 1
- Fecha de realización de monospórico: 10 septiembre 2007
- Número de repiques antes de conservación: 3
- Fecha de conservación en agua: 26 octubre 2007
- Fecha de conservación en aceite: 10 diciembre 2007
- Fecha de conservación en papel: 18 octubre 2007
107
COLECCIÓN DE MICROORGANISMOS
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA Responsables: Nathalie Camacho & Julie Andrea Gil Número M204 Microorganismo Fusarium sp.
Fuente Humano Origen: Onicomicosis
Fecha de recuperación: 23 Agosto de 2007
Almacenamiento
Caja de petri medio PDA suplementado con cloranfenicol
Historial Colección de Cepario de micología PUJ
Nivel de seguridad 1 T° Ambiente
Condiciones de crecimiento Aerobio estricto. Temperatura: 25ºC durante 5 – 15 días
Pruebas biológicas
Características morfológicas Características Macroscópicas: En Agar PDA: Colonias con crecimiento radial. Aspecto húmedo de las colonias color púrpura. Zona externa de la colonia presenta color más tenue y se evidencia el desarrollo micelial algodonoso muy tenue. REVERSO DE LA COLONIA. Color morado con zona externa de la colonia hacia una tonalidad rosada. No hay evidencia de difusión de pigmento.
Características Microscópicas:
Hifas hialinas septadas, presencia. Macroconidias fusiformes septadas y microconidias redondas
Identificación de Peligros
Forma de Transmisión Periodo de Incubación Enfermedades que produce
Corrientes de aire / aerosoles Depende de la carga fúngica y el estado inmunológico del paciente Onicomicosis
108
Medidas de Protección / Manipulación
- El personal debe usar equipo de protección normal (uso apropiado de bata, guantes, tapabocas, gorro) - Eliminación y tratamiento apropiado de desechos - Higiene personal: lavado de manos - Intervención sólo por personal, capacitado y consciente de los peligros del microorganismo.
Conservación del microorganismo
El hongo se encuentra conservado en agua destilada estéril, aceite mineral estéril y papel filtro estéril. La conservación se realizo a partir de cultivos monospóricos
Observaciones
- Número de repiques antes de realización de monospórico: 1
- Fecha de realización de monospórico: 10 septiembre 2007
- Número de repiques antes de conservación: 3
- Fecha de conservación en agua: 30 octubre 2007
- Fecha de conservación en aceite: 1 octubre 2007
- Fecha de conservación en papel: 18 octubre de 2007
109
COLECCIÓN DE MICROORGANISMOS
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA Responsables: Nathalie Camacho & Julie Andrea Gil Número M205 Microorganismo Fusarium sp.
Fuente Humano Origen: Onicomicosis
Fecha de recuperación: 23 Agosto de 2007
Almacenamiento
Caja de petri medio PDA suplementado con cloranfenicol
Historial Colección de Cepario de micología PUJ
Nivel de seguridad 1 T° Ambiente
Condiciones de crecimiento Aerobio estricto. Temperatura: 25ºC durante 5 – 15 días
Pruebas biológicas
Características morfológicas Características Macroscópicas: En PDA las colonias se desarrollán tomando un aspecto seco y la zona de la estría toma coloración blanca en el centro y pigmentación morada en la zona externa. Sin embargo la colonia en general presenta color crema y es de aspecto floculada algodonoso. Desarrollo irregular de la colonia. REVERSO DE LA COLONIA. Color morado claro en la zona de la estría, y hueso en el resto de la colonia.
Características Microscópicas:
Hifas hialinas septadas, clamidosporas hialinas intercalares y terminales. Macroconidias fusiformes septadas y microconidias redondas
Identificación de Peligros
Forma de Transmisión Periodo de Incubación Enfermedades que produce
Corrientes de aire / aerosoles Depende de la carga fúngica y el estado inmunológico del paciente Onicomicosis
110
Medidas de Protección / Manipulación
- El personal debe usar equipo de protección normal (uso apropiado de bata, guantes, tapabocas, gorro) - Eliminación y tratamiento apropiado de desechos - Higiene personal: lavado de manos - Intervención sólo por personal, capacitado y consciente de los peligros del microorganismo.
Conservación del microorganismo
El hongo se encuentra conservado en agua destilada estéril, aceite mineral estéril y papel filtro estéril. La conservación se realizo a partir de cultivos monospóricos
Observaciones
- Número de repiques antes de realización de monospórico: 1
- Fecha de realización de monospórico: 10 septiembre 2007
- Número de repiques antes de conservación: 2
- Fecha de conservación en agua: 6 noviembre 2007
- Fecha de conservación en aceite: 1 octubre 2007
- Fecha de conservación en papel: 26 octubre de 2007
111
COLECCIÓN DE MICROORGANISMOS
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA Responsables: Nathalie Camacho & Julie Andrea Gil Número M206 Microorganismo Fusarium sp.
Fuente Humano Origen: Onicomicosis
Fecha de recuperación: 23 Agosto de 2007
Almacenamiento
Caja de petri medio PDA suplementado con cloranfenicol
Historial Colección de Cepario de micología PUJ
Nivel de seguridad 1 T° Ambiente
Condiciones de crecimiento Aerobio estricto. Temperatura: 25ºC durante 5 – 15 días
Pruebas biológicas
Características morfológicas Características Macroscópicas: En agar PDA crecen colonias de aspecto húmedo de crecimiento irregular, color crema con zonas de pigmentación púrpuras especialmente alrededor del punto de siembra. REVERSO DE LA COLONIA. Color morado alrededor del punto de siembra y crema en el rededor, sin difusión de pigmento al medio.
Características Microscópicas:
Hifas hialinas septadas, presencia de clamidosporas hialinas intercalares y terminales. Macroconidias fusiformes con tres y cuatros septos y microconidias ovaladas
Identificación de Peligros
Forma de Transmisión Periodo de Incubación Enfermedades que produce
Corrientes de aire / aerosoles Depende de la carga fúngica y el estado inmunológico del paciente Onicomicosis
112
Medidas de Protección / Manipulación
- El personal debe usar equipo de protección normal (uso apropiado de bata, guantes, tapabocas, gorro) - Eliminación y tratamiento apropiado de desechos - Higiene personal: lavado de manos - Intervención sólo por personal, capacitado y consciente de los peligros del microorganismo.
Conservación del microorganismo
El hongo se encuentra conservado en agua destilada estéril, aceite mineral estéril y papel filtro estéril. La conservación se realizo a partir de cultivos monospóricos
Observaciones
- Número de repiques antes de realización de monospórico: 1
- Fecha de realización de monospórico: 10 septiembre
- Número de repiques antes de conservación: 2
- Fecha de conservación en agua: 26 octubre 2007
- Fecha de conservación en aceite: 11 octubre 2007
- Fecha de conservación en papel: 18 octubre 2007
113
COLECCIÓN DE MICROORGANISMOS
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA Responsables: Nathalie Camacho & Julie Andrea Gil Número M207 Microorganismo Fusarium sp.
Fuente Humano Origen: Onicomicosis
Fecha de recuperación: 23 Agosto de 2007
Almacenamiento
Caja de petri medio PDA suplementado con cloranfenicol
Historial Colección de Cepario de micología PUJ
Nivel de seguridad 1 T° Ambiente
Condiciones de crecimiento Aerobio estricto. Temperatura: 25ºC durante 5 – 15 días
Pruebas biológicas
Características morfológicas Características Macroscópicas: Sobre PDA desarrolla colonias algodonosas con micelio tenue color morado claro. De aspecto húmedo en algunas zonas y crecimiento que sigue un patrón de desarrollo radial. La zona externa de la colonia toma coloración hueso. REVERSO DE LA COLONIA. Color morado claro, y en zona externa de la colonia presenta color hueso. No presenta difusión de pigmento al medio
Características Microscópicas:
Hifas hialinas septadas, presencia de clamidosporas hialinas intercalares y terminales. Macroconidias fusiformes septadas y microconidias redondas
Identificación de Peligros
Forma de Transmisión Periodo de Incubación Enfermedades que produce
Corrientes de aire / aerosoles Depende de la carga fúngica y el estado inmunológico del paciente Onicomicosis
114
Medidas de Protección / Manipulación
- El personal debe usar equipo de protección normal (uso apropiado de bata, guantes, tapabocas, gorro) - Eliminación y tratamiento apropiado de desechos - Higiene personal: lavado de manos - Intervención sólo por personal, capacitado y consciente de los peligros del microorganismo.
Conservación del microorganismo
El hongo se encuentra conservado en agua destilada estéril, aceite mineral estéril y papel filtro estéril. La conservación se realizo a partir de cultivos monospóricos
Observaciones
- Número de repiques antes de realización de monospórico: 1
- Fecha de realización de monospórico: 10 septiembre 2007
- Número de repiques antes de conservación: 2
- Fecha de conservación en agua: 6 noviembre 2007
- Fecha de conservación en aceite: 1 octubre 2007
- Fecha de conservación en papel: 20 noviembre 2007
115
COLECCIÓN DE MICROORGANISMOS
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA Responsables: Nathalie Camacho & Julie Andrea Gil Número M208 Microorganismo Fusarium sp.
Fuente Humano Origen: Onicomicosis
Fecha de recuperación: 23 Agosto de 2007
Almacenamiento
Caja de petri medio PDA suplementado con cloranfenicol
Historial Colección de Cepario de micología PUJ
Nivel de seguridad 1 T° Ambiente
Condiciones de crecimiento Aerobio estricto. Temperatura: 25ºC durante 5 – 15 días
Pruebas biológicas
Características morfológicas Características Macroscópicas: Sobre PDA se desarrollan colonias floculadas algodonosas blancas con zonas de pigmentación color morado claro de desarrollo irregular. REVERSO DE LA COLONIA. Color morado en zona de estría y hueso alrededor de las mismas. No hay pigmento difusible al medio
Características Microscópicas:
Hifas hialinas septadas, presencia de clamidosporas hialinas intercalares y terminales. Macroconidias fusiformes con tres y cuatros septos y microconidias redondas
Identificación de Peligros
Forma de Transmisión Periodo de Incubación Enfermedades que produce
Corrientes de aire / aerosoles Depende de la carga fúngica y el estado inmunológico del paciente Onicomicosis
116
Medidas de Protección / Manipulación
- El personal debe usar equipo de protección normal (uso apropiado de bata, guantes, tapabocas, gorro) - Eliminación y tratamiento apropiado de desechos - Higiene personal: lavado de manos - Intervención sólo por personal, capacitado y consciente de los peligros del microorganismo.
Conservación del microorganismo
El hongo se encuentra conservado en agua destilada estéril, aceite mineral estéril y papel filtro estéril. La conservación se realizo a partir de cultivos monospóricos
Observaciones
- Número de repiques antes de realización de monospórico: 1
- Fecha de realización de monospórico: 10 septiembre 2007
- Número de repiques antes de conservación: 3
- Fecha de conservación en agua: 26 octubre 2007
- Fecha de conservación en aceite: 11 octubre 2007
- Fecha de conservación en papel: 26 octubre 2007
117
COLECCIÓN DE MICROORGANISMOS
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA Responsables: Nathalie Camacho & Julie Andrea Gil Número M209 Microorganismo Fusarium sp.
Fuente Humano Origen: Onicomicosis
Fecha de recuperación: 23 Agosto de 2007
Almacenamiento
Caja de petri medio PDA suplementado con cloranfenicol
Historial Colección de Cepario de micología PUJ
Nivel de seguridad 1 T° Ambiente
Condiciones de crecimiento Aerobio estricto. Temperatura: 25ºC durante 5 – 15 días
Pruebas biológicas
Características morfológicas Características Macroscópicas: En agar PDA las colonias son de color blanco algodonosas y en zona alrededor del punto de siembra presenta tonalidad rosada. REVERSO DE LA COLONIA. El punto de siembra toma tonalidad morada sn embargo el revés de la colonia es color hueso.
Características Microscópicas:
Hifas hialinas septadas, presencia de clamidosporas hialinas intercalares y terminales. Macroconidias fusiformes con tres y cuatros septos y microconidias redondas
Identificación de Peligros
Forma de Transmisión Periodo de Incubación Enfermedades que produce
Corrientes de aire / aerosoles Depende de la carga fúngica y el estado inmunológico del paciente Onicomicosis
118
Medidas de Protección / Manipulación
- El personal debe usar equipo de protección normal (uso apropiado de bata, guantes, tapabocas, gorro) - Eliminación y tratamiento apropiado de desechos - Higiene personal: lavado de manos - Intervención sólo por personal, capacitado y consciente de los peligros del microorganismo.
Conservación del microorganismo
El hongo se encuentra conservado en agua destilada estéril, aceite mineral estéril y papel filtro estéril. La conservación se realizo a partir de cultivos monospóricos
Observaciones
- Número de repiques antes de realización de monospórico: 1
- Fecha de realización de monospórico: 10 septiembre
- Número de repiques antes de conservación: 3
- Fecha de conservación en agua: 30 octubre 2007
- Fecha de conservación en aceite: 11 octubre 2007
- Fecha de conservación en papel: 26 octubre 2007
119
COLECCIÓN DE MICROORGANISMOS
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA Responsables: Nathalie Camacho & Julie Andrea Gil Número M210 Microorganismo Fusarium sp.
Fuente Humano Origen: Onicomicosis
Fecha de recuperación: 23 Agosto de 2007
Almacenamiento
Caja de petri medio PDA suplementado con cloranfenicol
Historial Colección de Cepario de micología PUJ
Nivel de seguridad 1 T° Ambiente
Condiciones de crecimiento Aerobio estricto. Temperatura: 25ºC durante 5 – 15 días
Pruebas biológicas
Características morfológicas Características Macroscópicas: En agar PDA se observan colonia de crecimiento radial. Micelio de aspecto húmedo con zonas blanquecinas en su mayoría y alguna secciones se tornan de color morado. REVERSO DE LA COLONIA. Color morado tenue, con mayor tendencia hacia el blanco. Sin difusión de pigmento al agar
Características Microscópicas:
Hifas hialinas septadas, presencia de clamidosporas hialinas intercalares y terminales. Macroconidias fusiformes con dos y tres septos.
Identificación de Peligros
Forma de Transmisión Periodo de Incubación Enfermedades que produce
Corrientes de aire / aerosoles Depende de la carga fúngica y el estado inmunológico del paciente Onicomicosis
120
Medidas de Protección / Manipulación
- El personal debe usar equipo de protección normal (uso apropiado de bata, guantes, tapabocas, gorro) - Eliminación y tratamiento apropiado de desechos - Higiene personal: lavado de manos - Intervención sólo por personal, capacitado y consciente de los peligros del microorganismo.
Conservación del microorganismo
El hongo se encuentra conservado en agua destilada estéril, aceite mineral estéril y papel filtro estéril. La conservación se realizo a partir de cultivos monospóricos
Observaciones
- Número de repiques antes de realización de monospórico: 1
- Fecha de realización de monospórico: 10 septiembre 2007
- Número de repiques antes de conservación: 2
- Fecha de conservación en agua: 26 octubre 2007
- Fecha de conservación en aceite: 1 octubre 2007
- Fecha de conservación en papel: 26 octubre 2007
121
COLECCIÓN DE MICROORGANISMOS PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA Responsables: Nathalie Camacho & Julie Andrea Gil Número M301 Microorganismo Fusarium sp.
Fuente Vegetal Origen: Haces vasculares planta de tomate
Fecha de muestreo: 6 Agosto de 2007
Almacenamiento
Caja de petri medio PDA suplementado con cloranfenicol
Historial
Cepario desde: 9 Agosto de 2007
Nivel de seguridad 1 T° Ambiente
Condiciones de crecimiento Aerobio estricto. Temperatura: 25ºC durante 5 – 15 días
Pruebas biológicas
Características morfológicas Características Macroscópicas: En agar PDA presenta colonias con crecimiento radial. Micelio floculado algodonoso, salmón claro y en ocasiones y zonas de color blanco. REVERSO DE LA COLONIA. Color hueso, sin difusión de pigmento al agar
Características Microscópicas:
Hifas hialinas septadas, presencia de clamidosporas hialinas intercalares y terminales. Macroconidias fusiformes con tres y cuatros septos y microconidias ovaladas.
Identificación de Peligros
Forma de Transmisión Periodo de Incubación Enfermedades que produce
Corrientes de aire / aerosoles Depende de la carga fúngica y el estado inmunológico del paciente Desconocidas
122
Medidas de Protección / Manipulación
- El personal debe usar equipo de protección normal (uso apropiado de bata, guantes, tapabocas, gorro) - Eliminación y tratamiento apropiado de desechos - Higiene personal: lavado de manos - Intervención sólo por personal, capacitado y consciente de los peligros del microorganismo.
Conservación del microorganismo
El hongo se encuentra conservado en aceite mineral estéril. La conservación se realizo a partir de cultivos monospóricos
Observaciones
- Número de repiques antes de realización de monospórico: 2
- Fecha de realización de monospórico: 11 septiembre 2007
- Número de repiques antes de conservación: 2
- Fecha de conservación en agua: 26 octubre 2007
- Fecha de conservación en aceite: 1 octubre 2007
- Fecha de conservación en papel: 26 octubre de 2007
123
COLECCIÓN DE MICROORGANISMOS
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA Responsables: Nathalie Camacho & Julie Andrea Gil Número M302 Microorganismo Fusarium sp.
Fuente Vegetal Origen: Haces vasculares planta de clavel
Fecha de muestreo: 24 Agosto de 2007
Almacenamiento
Caja de petri medio PDA suplementado con cloranfenicol
Historial
Cepario desde: 27 Agosto de 2007
Nivel de seguridad 1 T° Ambiente
Condiciones de crecimiento Aerobio estricto. Temperatura: 25ºC durante 5 – 15 días
Pruebas biológicas
Características morfológicas Características Macroscópicas: Colonias en PDA algodonosas con floculo. Color morado oscuro en punto de siembra y morado claro alrededor de dicho punto. Algunas zonas presentan color blanco. Desarrollo radial REVERSO DE LA COLONIA. Color morado y en zona externa de la colonia se observa un halo con cimentaciones color hueso y café. No hay difusión de pigmento al medio.
Características Microscópicas:
Hifas hialinas septadas, presencia de clamidosporas hialinas intercalares y terminales. Macroconidias fusiformes con tres y cuatros septos y microconidias ovaladas que semejan granos de arroz.
Identificación de Peligros
Forma de Transmisión Periodo de Incubación Enfermedades que produce
Corrientes de aire / aerosoles Depende de la carga fúngica y el estado inmunológico del paciente Desconocidas
124
Medidas de Protección / Manipulación
- El personal debe usar equipo de protección normal (uso apropiado de bata, guantes, tapabocas, gorro) - Eliminación y tratamiento apropiado de desechos - Higiene personal: lavado de manos - Intervención sólo por personal, capacitado y consciente de los peligros del microorganismo.
Conservación del microorganismo
El hongo se encuentra conservado en agua destilada estéril, aceite mineral estéril y papel filtro estéril. La conservación se realizo a partir de cultivos monospóricos
Observaciones
- Número de repiques antes de realización de monospórico: 1
- Fecha de realización de monospórico: 7 septiembre 2007
- Número de repiques antes de conservación: 2
- Fecha de conservación en agua: 30 octubre 2007
- Fecha de conservación en aceite: 1 octubre 2007
- Fecha de conservación en papel: 26 octubre 2007
125
COLECCIÓN DE MICROORGANISMOS
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA Responsables: Nathalie Camacho & Julie Andrea Gil Número M303 Microorganismo Fusarium sp.
Fuente Vegetal Origen: Haces vasculares planta de tomate
Fecha de muestreo: 6 Agosto de 2007
Almacenamiento
Caja de petri medio PDA suplementado con cloranfenicol
Historial
Cepario desde: 9 Agosto de 2007
Nivel de seguridad 1 T° Ambiente
Condiciones de crecimiento Aerobio estricto. Temperatura: 25ºC durante 5 – 15 días
Pruebas biológicas
Características morfológicas Características Macroscópicas: Las colonias sobre agar PDA se desarrollan presentando crecimiento radial. Micelio algodonoso blanco, REVERSO DE LA COLONIA. Color crema con tendencia hacía el blanco. Sin difusión de pigmento al agar
Características Microscópicas:
Hifas hialinas septadas, con presencia de cadenas de clamidosporas hialinas, y presencia de las mismas en posición intercalar. Macroconidias fusiformes con cuatro septos y microconidias redondas
Identificación de Peligros
Forma de Transmisión Periodo de Incubación Enfermedades que produce
Corrientes de aire / aerosoles Depende de la carga fúngica y el estado inmunológico del paciente Desconocidas
126
Medidas de Protección / Manipulación
- El personal debe usar equipo de protección normal (uso apropiado de bata, guantes, tapabocas, gorro) - Eliminación y tratamiento apropiado de desechos - Higiene personal: lavado de manos - Intervención sólo por personal, capacitado y consciente de los peligros del microorganismo.
Conservación del microorganismo
El hongo se encuentra conservado en agua destilada estéril, aceite mineral estéril y papel filtro estéril. La conservación se realizo a partir de cultivos monospóricos
Observaciones
- Número de repiques antes de realización de monospórico: 2
- Fecha de realización de monospórico: 7 septiembre 2007
- Número de repiques antes de conservación: 2
- Fecha de conservación en agua: 26 octubre 2007
- Fecha de conservación en aceite: 1 octubre 2007
- Fecha de conservación en papel: 21 Enero 2008
127
COLECCIÓN DE MICROORGANISMOS
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA Responsables: Nathalie Camacho & Julie Andrea Gil Número M305 Microorganismo Fusarium sp.
Fuente Vegetal Origen: Haces vasculares planta de tomate
Fecha de muestreo: 18 Agosto de 2007
Almacenamiento
Caja de petri medio PDA suplementado con cloranfenicol
Historial
Cepario desde: 27 Agosto de 2007
Nivel de seguridad 1 T° Ambiente
Condiciones de crecimiento Aerobio estricto. Temperatura: 25ºC durante 5 – 15 días
Pruebas biológicas
Características morfológicas Características Macroscópicas: En PDA presenta colonias algodonosas blancas con un tenue color morado. Presenta desarrollo radial. REVERSO DE LA COLONIA. Color hueso, y en zonas del punto de siembra toma coloración púrpura y alrededor de estas se torna un hacia una tonalidad rosácea.
Características Microscópicas:
Hifas hialinas septadas, presencia de clamidosporas hialinas intercalares y terminales. Macroconidias fusiformes con tres y cuatros septos y microconidias redondas
Identificación de Peligros
Forma de Transmisión Periodo de Incubación Enfermedades que produce
Corrientes de aire / aerosoles Depende de la carga fúngica y el estado inmunológico del paciente Desconocidas
128
Medidas de Protección / Manipulación
- El personal debe usar equipo de protección normal (uso apropiado de bata, guantes, tapabocas, gorro) - Eliminación y tratamiento apropiado de desechos - Higiene personal: lavado de manos - Intervención sólo por personal, capacitado y consciente de los peligros del microorganismo.
Conservación del microorganismo
El hongo se encuentra conservado en agua destilada estéril, aceite mineral estéril y papel filtro estéril. La conservación se realizo a partir de cultivos monospóricos
Observaciones
- Número de repiques antes de realización de monospórico: 1
- Fecha de realización de monospórico: 11 septiembre 2007
- Número de repiques antes de conservación: 2
- Fecha de conservación en agua: 26 octubre 2007
- Fecha de conservación en aceite: 10 diciembre 2007
- Fecha de conservación en papel: 18 octubre 2007
129
COLECCIÓN DE MICROORGANISMOS
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA Responsables: Nathalie Camacho & Julie Andrea Gil Número M308 Microorganismo Fusarium sp.
Fuente Vegetal Origen: Haces vasculares planta de tomate
Fecha de muestreo: 25 Agosto de 2007
Almacenamiento
Caja de petri medio PDA suplementado con cloranfenicol
Historial
Cepario desde: 29 Agosto de 2007
Nivel de seguridad 1 T° Ambiente
Condiciones de crecimiento Aerobio estricto. Temperatura: 25ºC durante 5 – 15 días
Pruebas biológicas
Características morfológicas Características Macroscópicas: En PDA se desarrollan colonias color morado algodonosas floculadas. De crecimiento radial. De aspecto seco. REVERSO DE LA COLONIA. Color púrpura con pigmento difusible al medio color ocre.
Características Microscópicas:
Hifas hialinas septadas, presencia de clamidosporas hialinas intercalares y terminales. Macroconidias fusiformes con tres y cuatros septos y microconidias redondas
Identificación de Peligros
Forma de Transmisión Periodo de Incubación Enfermedades que produce
Corrientes de aire / aerosoles Depende de la carga fúngica y el estado inmunológico del paciente Desconocidas
130
Medidas de Protección / Manipulación
- El personal debe usar equipo de protección normal (uso apropiado de bata, guantes, tapabocas, gorro) - Eliminación y tratamiento apropiado de desechos - Higiene personal: lavado de manos - Intervención sólo por personal, capacitado y consciente de los peligros del microorganismo.
Conservación del microorganismo
El hongo se encuentra conservado en agua destilada estéril, aceite mineral estéril y papel filtro estéril. La conservación se realizo a partir de cultivos monospóricos
Observaciones
- Número de repiques antes de realización de monospórico: 1
- Fecha de realización de monospórico: 11 septiembre 2007
- Número de repiques antes de conservación: 1
- Fecha de conservación en agua: 6 noviembre 2007
- Fecha de conservación en aceite: 1 octubre 2007
- Fecha de conservación en papel: 26 octubre 2007
131
COLECCIÓN DE MICROORGANISMOS
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA Responsables: Nathalie Camacho & Julie Andrea Gil Número M309 Microorganismo Fusarium sp.
Fuente Vegetal Origen: Haces vasculares planta de tomate
Fecha de muestreo: 25 Agosto de 2007
Almacenamiento
Caja de petri medio PDA suplementado con cloranfenicol
Historial
Cepario desde: 29 Agosto de 2007
Nivel de seguridad 1 T° Ambiente
Condiciones de crecimiento Aerobio estricto. Temperatura: 25ºC durante 5 – 15 días
Pruebas biológicas
Características morfológicas Características Macroscópicas: En PDA presenta colonias blancas con un poco de pigmento morado claro en zona central. Micelio algodonoso floculado. Crecimiento irregular REVERSO DE LA COLONIA. Color hueso y en punto de siembra color morado. No hay difusión de pigmento.
Características Microscópicas:
Hifas hialinas septadas, presencia de clamidosporas hialinas intercalares y terminales. Macroconidias fusiformes con tres y cuatros septos y microconidias redondas
Identificación de Peligros
Forma de Transmisión Periodo de Incubación Enfermedades que produce
Corrientes de aire / aerosoles Depende de la carga fúngica y el estado inmunológico del paciente Desconocidas
132
Medidas de Protección / Manipulación
- El personal debe usar equipo de protección normal (uso apropiado de bata, guantes, tapabocas, gorro) - Eliminación y tratamiento apropiado de desechos - Higiene personal: lavado de manos - Intervención sólo por personal, capacitado y consciente de los peligros del microorganismo.
Conservación del microorganismo
El hongo se encuentra conservado en agua destilada estéril, aceite mineral estéril y papel filtro estéril. La conservación se realizo a partir de cultivos monospóricos
Observaciones
- Número de repiques antes de realización de monospórico: 1
- Fecha de realización de monospórico: 11 septiembre 2007
- Número de repiques antes de conservación: 2
- Fecha de conservación en agua: 30 octubre 2007
- Fecha de conservación en aceite: 1 octubre 2007
- Fecha de conservación en papel: 20 noviembre 2007
133
COLECCIÓN DE MICROORGANISMOS
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA Responsables: Nathalie Camacho & Julie Andrea Gil Número M310 Microorganismo Fusarium sp.
Fuente Vegetal Origen: Haces vasculares planta de tomate
Fecha de muestreo: 25 Agosto de 2007
Almacenamiento
Caja de petri medio PDA suplementado con cloranfenicol
Historial
Cepario desde: 29 Agosto de 2007
Nivel de seguridad 1 T° Ambiente
Condiciones de crecimiento Aerobio estricto. Temperatura: 25ºC durante 5 – 15 días
Pruebas biológicas
Características morfológicas Características Macroscópicas: PDA colonias de aspecto húmedo color morado solo en punto de siembra, no hay evidencia clara del micelio. REVERSO DE LA COLONIA. Color amarillo debido al pigmento difusible y en punto de siembra se observa color morado muy tenue. Características Microscópicas:
Hifas hialinas septadas, presencia de clamidosporas hialinas intercalares y terminales. Macroconidias fusiformes con tres y cuatros septos y microconidias redondas
Identificación de Peligros
Forma de Transmisión Periodo de Incubación Enfermedades que produce
Corrientes de aire / aerosoles Depende de la carga fúngica y el estado inmunológico del paciente Desconocidas
134
Medidas de Protección / Manipulación
- El personal debe usar equipo de protección normal (uso apropiado de bata, guantes, tapabocas, gorro) - Eliminación y tratamiento apropiado de desechos - Higiene personal: lavado de manos - Intervención sólo por personal, capacitado y consciente de los peligros del microorganismo.
Conservación del microorganismo
El hongo se encuentra conservado en agua destilada estéril, aceite mineral estéril y papel filtro estéril. La conservación se realizo a partir de cultivos monospóricos
Observaciones
- Número de repiques antes de realización de monospórico: 1
- Fecha de realización de monospórico: 13 septiembre 2007
- Número de repiques antes de conservación: 2
- Fecha de conservación en agua: 26 octubre 2007
- Fecha de conservación en aceite: 1 octubre 2007
- Fecha de conservación en papel: 31 enero 2008
135
COLECCIÓN DE MICROORGANISMOS
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA Responsables: Nathalie Camacho & Julie Andrea Gil Número M311 Microorganismo Fusarium sp.
Fuente Vegetal Origen: Haces vasculares planta de tomate
Fecha de muestreo: 14 septiembre de 2007
Almacenamiento
Caja de petri medio PDA suplementado con cloranfenicol
Historial
Cepario desde: 17 septiembre de 2007
Nivel de seguridad 1 T° Ambiente
Condiciones de crecimiento Aerobio estricto. Temperatura: 25ºC durante 5 – 15 días
Pruebas biológicas
Características morfológicas Características Macroscópicas: En PDA colonia con acumulo de aspecto húmedo color hueso y en algunas zonas presenta pigmentación púrpura. En zona externa presenta se observa la parte algodonosa de la colonia. REVERSO DE LA COLONIA. Color hueso,, sin difusión de pigmento al agar
Características Microscópicas:
Hifas hialinas septadas, presencia de clamidosporas hialinas intercalares y terminales. Macroconidias fusiformes con tres y cuatros septos y microconidias redondas
Identificación de Peligros
Forma de Transmisión Periodo de Incubación Enfermedades que produce
Corrientes de aire / aerosoles Depende de la carga fúngica y el estado inmunológico del paciente Desconocidas
136
Medidas de Protección / Manipulación
- El personal debe usar equipo de protección normal (uso apropiado de bata, guantes, tapabocas, gorro) - Eliminación y tratamiento apropiado de desechos - Higiene personal: lavado de manos - Intervención sólo por personal, capacitado y consciente de los peligros del microorganismo.
Conservación del microorganismo
El hongo se encuentra conservado en agua destilada estéril, aceite mineral estéril y papel filtro estéril. La conservación se realizo a partir de cultivos monospóricos
Observaciones
- Número de repiques antes de realización de monospórico: 1
- Fecha de realización de monospórico: 1 octubre 2007
- Número de repiques antes de conservación: 2
- Fecha de conservación en agua: 10 diciembre 2007
- Fecha de conservación en aceite: 11 octubre 2007
- Fecha de conservación en papel: 20 noviembre 2007
137
COLECCIÓN DE MICROORGANISMOS
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA Responsables: Nathalie Camacho & Julie Andrea Gil Número M312 Microorganismo Fusarium sp.
Fuente Vegetal Origen: Haces vasculares planta de tomate
Fecha de muestreo: 14 septiembre de 2007
Almacenamiento
Caja de petri medio PDA suplementado con cloranfenicol
Historial
Cepario desde: 17 septiembre de 2007
Nivel de seguridad 1 T° Ambiente
Condiciones de crecimiento Aerobio estricto. Temperatura: 25ºC durante 5 – 15 días
Pruebas biológicas
Características morfológicas Características Macroscópicas: PDA colonias de aspecto húmedo color morado solo en punto de siembra, no hay evidencia clara del micelio. REVERSO DE LA COLONIA. Color amarillo debido al pigmento difusible y en punto de siembra se observa color morado muy tenue.
Características Microscópicas:
Hifas hialinas septadas, presencia de clamidosporas hialinas intercalares y terminales. Macroconidias fusiformes con tres y cuatros septos y microconidias redondas
Identificación de Peligros
Forma de Transmisión Periodo de Incubación Enfermedades que produce
Corrientes de aire / aerosoles Depende de la carga fúngica y el estado inmunológico del paciente Desconocidas
138
Medidas de Protección / Manipulación
- El personal debe usar equipo de protección normal (uso apropiado de bata, guantes, tapabocas, gorro) - Eliminación y tratamiento apropiado de desechos - Higiene personal: lavado de manos - Intervención sólo por personal, capacitado y consciente de los peligros del microorganismo.
Conservación del microorganismo
El hongo se encuentra conservado en agua destilada estéril, aceite mineral estéril y papel filtro estéril. La conservación se realizo a partir de cultivos monospóricos
Observaciones
- Número de repiques antes de realización de monospórico: 1
- Fecha de realización de monospórico: 1 octubre 2007
- Número de repiques antes de conservación: 2
- Fecha de conservación en agua: 10 diciembre 2007
- Fecha de conservación en aceite: 11 octubre 2007
- Fecha de conservación en papel: 31 Enero 2008
139
COLECCIÓN DE MICROORGANISMOS
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA Responsables: Nathalie Camacho & Julie Andrea Gil Número M313 Microorganismo Fusarium sp.
Fuente Vegetal Origen: Haces vasculares planta de clavel
Fecha de muestreo: 13 octubre de 2007
Almacenamiento
Caja de petri medio PDA suplementado con cloranfenicol
Historial
Cepario desde: 16 octubre de 2007
Nivel de seguridad 1 T° Ambiente
Condiciones de crecimiento Aerobio estricto. Temperatura: 25ºC durante 5 – 15 días
Pruebas biológicas
Características morfológicas Características Macroscópicas: AGAR SABOURAUD: Colonias con crecimiento radial. Micelio algodonoso, color blanco REVERSO DE LA COLONIA. Color rosado hueso inicialmente y luego se torna café, sin difusión de pigmento al agar
Características Microscópicas:
Hifas hialinas septadas, presencia de clamidosporas hialinas intercalares y terminales. Macroconidias fusiformes con tres y cuatros septos y microconidias redondas
Identificación de Peligros
Forma de Transmisión Periodo de Incubación Enfermedades que produce
Corrientes de aire / aerosoles Depende de la carga fúngica y el estado inmunológico del paciente Desconocidas
140
Medidas de Protección / Manipulación
- El personal debe usar equipo de protección normal (uso apropiado de bata, guantes, tapabocas, gorro) - Eliminación y tratamiento apropiado de desechos - Higiene personal: lavado de manos - Intervención sólo por personal, capacitado y consciente de los peligros del microorganismo.
Conservación del microorganismo
El hongo se encuentra conservado en agua destilada estéril, aceite mineral estéril y papel filtro estéril. La conservación se realizo a partir de cultivos monospóricos
Observaciones
- Número de repiques antes de realización de monospórico: 1
- Fecha de realización de monospórico: 30 octubre 2007
- Número de repiques antes de conservación: 2
- Fecha de conservación en agua: 10 diciembre 2007
- Fecha de conservación en aceite: - Fecha de conservación en papel: 20
noviembre 2007
141
COLECCIÓN DE MICROORGANISMOS
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA Responsables: Nathalie Camacho & Julie Andrea Gil Número M314 Microorganismo Fusarium sp.
Fuente Vegetal Origen: Haces vasculares planta de clavel
Fecha de muestreo: 23 noviembre de 2007
Almacenamiento
Caja de petri medio PDA suplementado con cloranfenicol
Historial
Cepario desde: 26 noviembre de 2007
Nivel de seguridad 1 T° Ambiente
Condiciones de crecimiento Aerobio estricto. Temperatura: 25ºC durante 5 – 15 días
Pruebas biológicas
Características morfológicas Características Macroscópicas: AGAR SABOURAUD: Colonias con crecimiento radial. Micelio algodonoso floculado, color blanco, con pigmento morado. Zonas color caramelo en la superficie con aspecto húmedo. REVERSO DE LA COLONIA. Color rosado, sin difusión de pigmento al agar
Características Microscópicas:
Hifas hialinas septadas, presencia de clamidosporas hialinas intercalares y terminales. Macroconidias fusiformes con tres y cuatros septos y microconidias redondas
Identificación de Peligros
Forma de Transmisión Periodo de Incubación Enfermedades que produce
Corrientes de aire / aerosoles Depende de la carga fúngica y el estado inmunológico del paciente Desconocidas
142
Medidas de Protección / Manipulación
- El personal debe usar equipo de protección normal (uso apropiado de bata, guantes, tapabocas, gorro) - Eliminación y tratamiento apropiado de desechos - Higiene personal: lavado de manos - Intervención sólo por personal, capacitado y consciente de los peligros del microorganismo.
Conservación del microorganismo
El hongo se encuentra conservado en agua destilada estéril, aceite mineral estéril y papel filtro estéril. La conservación se realizo a partir de cultivos monospóricos
Observaciones
- Número de repiques antes de realización de monospórico: 2
- Fecha de realización de monospórico: 12 enero 2008
- Número de repiques antes de conservación: 2
- Fecha de conservación en agua: 5 Febrero 2008
143
COLECCIÓN DE MICROORGANISMOS
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA Responsables: Nathalie Camacho & Julie Andrea Gil Número M315 Microorganismo Fusarium sp.
Fuente Vegetal Origen: Haces vasculares planta de clavel
Fecha de muestreo: 23 noviembre de 2007
Almacenamiento
Caja de petri medio PDA suplementado con cloranfenicol
Historial
Cepario desde: 26 noviembre de 2007
Nivel de seguridad 1 T° Ambiente
Condiciones de crecimiento Aerobio estricto. Temperatura: 25ºC durante 5 – 15 días
Pruebas biológicas
Características morfológicas Características Macroscópicas: AGAR SABOURAUD: Colonias con crecimiento radial. Micelio algodonoso, de apariencia húmeda, color rosada. REVERSO DE LA COLONIA. Color rosado
Características Microscópicas:
Hifas hialinas septadas, presencia de clamidosporas hialinas intercalares y terminales. Macroconidias fusiformes con tres y cuatros septos y microconidias redondas
Identificación de Peligros
Forma de Transmisión Periodo de Incubación Enfermedades que produce
Corrientes de aire / aerosoles Depende de la carga fúngica y el estado inmunológico del paciente Desconocidas
144
Medidas de Protección / Manipulación
- El personal debe usar equipo de protección normal (uso apropiado de bata, guantes, tapabocas, gorro) - Eliminación y tratamiento apropiado de desechos - Higiene personal: lavado de manos - Intervención sólo por personal, capacitado y consciente de los peligros del microorganismo.
Conservación del microorganismo
El hongo se encuentra conservado en agua destilada estéril, aceite mineral estéril y papel filtro estéril. La conservación se realizo a partir de cultivos monospóricos
Observaciones
- Número de repiques antes de realización de monospórico: 2
- Fecha de realización de monospórico: 12 enero 2008
- Número de repiques antes de conservación: 1
- Fecha de conservación en agua: 5 febrero 2008
145
COLECCIÓN DE MICROORGANISMOS
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA Responsables: Nathalie Camacho & Julie Andrea Gil Número M317 Microorganismo Fusarium sp.
Fuente Vegetal Origen: Haces vasculares planta de clavel
Fecha de muestreo: 23 noviembre de 2007
Almacenamiento
Caja de petri medio PDA suplementado con cloranfenicol
Historial
Cepario desde: 26 noviembre de 2007
Nivel de seguridad 1 T° Ambiente
Condiciones de crecimiento Aerobio estricto. Temperatura: 25ºC durante 5 – 15 días
Pruebas biológicas
Características morfológicas Características Macroscópicas: AGAR SABOURAUD: Colonias con crecimiento radial. Micelio floculado algodonoso, color blanco REVERSO DE LA COLONIA. Color morado en punto de siembra y blanco alrededor, sin difusión de pigmento.
Características Microscópicas:
Hifas hialinas septadas, presencia de clamidosporas hialinas intercalares y terminales. Macroconidias fusiformes con tres y cuatros septos y microconidias redondas
Identificación de Peligros
Forma de Transmisión Periodo de Incubación Enfermedades que produce
Corrientes de aire / aerosoles Depende de la carga fúngica y el estado inmunológico del paciente Desconocidas
146
Medidas de Protección / Manipulación
- El personal debe usar equipo de protección normal (uso apropiado de bata, guantes, tapabocas, gorro) - Eliminación y tratamiento apropiado de desechos - Higiene personal: lavado de manos - Intervención sólo por personal, capacitado y consciente de los peligros del microorganismo.
Conservación del microorganismo
El hongo se encuentra conservado en agua destilada estéril, aceite mineral estéril y papel filtro estéril. La conservación se realizo a partir de cultivos monospóricos
Observaciones
- Número de repiques antes de realización de monospórico: 2
- Fecha de realización de monospórico: 12 enero 2008
- Número de repiques antes de conservación: 1
- Fecha de conservación en agua: 5 Febrero 2008
147
ANEXO 2.
Unidades de área bajo la curva de las 10 réplicas del
progreso de la enfermedad de los aislamientos de Fusarium
sp. en plántulas de tomate.
Aislamiento Réplica Área Aislamiento Réplica Área Aislamiento Réplica Área
1 0 1 55 1 77 2 53 2 64 2 61 3 52 3 61 3 80 4 71 4 60 4 71 5 59 5 65 5 58 6 62 6 62 6 58 7 61 7 60 7 57 8 55 8 69 8 75 9 63 9 51 9 84
111
10 53
203
10 70
303
10 68 1 68 1 60 1 59 2 78 2 53 2 44 3 40 3 51 3 37 4 65 4 65 4 44 5 62 5 64 5 44 6 60 6 58 6 52 7 45 7 60 7 46 8 66 8 49 8 33 9 80 9 48 9 51
121
10 62
206
10 48
308
10 35 1 73 1 66 1 70 2 59 2 49 2 73 3 53 3 54 3 68 4 46 4 60 4 61 5 57 5 62 5 56 6 52 6 55 6 60 7 72 7 67 7 56 8 72 8 54 8 61 9 76 9 59 9 65
156
10 68
210
10 59
310
10 73
148
ANEXO 3.
Análisis de varianza y agrupamiento de Duncan de
evaluación de aislamientos de Fusarium sp. en modelo
fitopatógeno (área bajo la curva en prueba de colonización
de raíz y tallo)
Análisis de varianza
Ajuste de un modelo para verificar si las variables aislamiento y
réplica tienen efecto sobre el comportamiento de la variable área.
Variable dependiente: Área Suma de Cuadrado de
Fuente DF cuadrados la media F-Valor Pr > F
Modelo 17 4615.40000 271.49412 2.36 0.0062
Error 72 8283.88889 115.05401
Total correcto 89 12899.28889
R-cuadrado Coeficiente Variación Raíz MSE Área Media
0.357803 18.15286 10.72632 59.08889
Cuadrado de
Fuente DF Tipo I SS la media F-Valor Pr > F
Aislamiento 8 4199.888889 524.986111 4.56 0.0002
Réplica 9 415.511111 46.167901 0.40 0.9305
149
Prueba de rango múltiple de Duncan
Para realizar las comparaciones de medias de las áreas se utiliza la
prueba del rango múltiple de Duncan.
Medias con la misma letra no son significativamente diferentes
Alfa 0.05
Número de medias 2 3 4 5 6 7 8 9 Rango crítico 9.22 9.70 10.02 10.26 10.44 10.58 10.70 10.80
Aislamiento N Media Agrupamiento de Duncan
303 10 68.900 A
310 10 64.300 A B
156 10 62.800 A B C
121 10 62.600 A B C
203 10 61.700 A B C
210 10 58.500 A B C
206 10 55.600 B C
111 10 52.900 C D
308 10 44.500 C D
150
ANEXO 4.
Agrupamiento de Duncan de evaluación de aislamientos de
Fusarium sp. en modelo fitopatógeno (promedio de réplicas
de área bajo la curva en prueba de colonización de raíz y
tallo)
Las comparaciones de medias por replicas se realizan para
comprobar que esta variable no explica el comportamiento del área.
Para esto se utiliza la prueba del rango múltiple de Duncan.
Medias con la misma letra no son significativamente diferentes
Alfa 0.05
Réplica N Media Agrupamiento de Duncan
9 9 64.111 A
4 9 60.333 A
10 9 59.556 A
2 9 59.333 A
8 9 59.333 A
1 9 58.667 A
5 9 58.556 A
7 9 58.222 A
6 9 57.667 A
3 9 55.111 A
151
ANEXO 5.
Análisis de varianza y agrupamiento de Duncan de
evaluación de aislamientos de Fusarium sp. en prueba de
degradación in vitro de tejidos queratinizados.
Ajuste de un modelo donde se observa que variables explican el
comportamiento de la variable Queratina.
Variable dependiente: QUERATINA Suma de Cuadrado de
Fuente DF cuadrados la media F-Valor Pr > F
Modelo 11 0.44065714 0.04005974 23.66 <0.0001
Error 96 0.16256221 0.00169336
Total correcto 107 0.60321935
R-cuadrado Coeficiente Variación Raíz MSE KERA Media
0.730509 26.86269 0.041150 0.153188
Cuadrado de
Fuente DF Tipo I SS la media F-Valor Pr > F
Aislamiento 8 0.04159392 0.00519924 3.07 0.0040
Procedencia 0 0.00000000 . . .
Tratamiento 3 0.39906322 0.13302107 78.55 <0.0001
La variable Procedencia no tiene ningún efecto en el modelo.
152
Para realizar las comparaciones de medias se utiliza la prueba del
rango múltiple de Duncan, la cual agrupa lo que se desee comparar
dependiendo si son estadísticamente diferentes o no.
Medias con la misma letra no son significativamente diferentes
Alfa 0.05
Aislamiento N Media Agrupamiento de Duncan
121 12 0.18166 A
111 12 0.17141 A
156 12 0.16586 A B
310 12 0.16439 A B
303 12 0.16030 A B
210 12 0.15008 A B C
206 12 0.13302 B C
203 12 0.13274 B C
308 12 0.11924 C
153
Comparación entre procedencias, determinar si hay diferencia
significativa dependiendo de la procedencia del aislamiento de
Fusarium sp., sobre la degradación de queratina, mediante la
prueba de rango múltiple de Duncan.
Medias con la misma letra no son significativamente diferentes.
Alfa 0.05
Procedencia N Media Agrupamiento Duncan
Animal 36 0.172975 A
Planta 36 0.147978 B
Humano 36 0.138611 B
154
Comparación entre tratamientos del modelo de infección de tejido
queratinizado in vitro (pelo de humano y casco de vaca en ausencia
y presencia de glucosa). Para esta prueba se utiliza la prueba del
rango múltiple de Duncan.
Tratamientos del modelo de infección en tejido queratinizado
Tratamiento Codificación
Pelo en presencia de glucosa P+G
Pelo en ausencia de glucosa P*
Casco en presencia de glucosa C+G
Casco en ausencia de glucosa C*
Medias con la misma letra no son significativamente diferentes
Alfa 0.05 Tratamiento N Media Agrupamiento Duncan
C* 27 0.23226 A
C+G 27 0.18715 B
P* 27 0.11889 C
P+G 27 0.07446 D
Nota: La prueba del rango múltiple de Duncan, controla el índice de error
comparisonwise de tipo I, no el índice de error experimentwise.
155
ANEXO 6.
Análisis de varianza y agrupamiento de Duncan de
evaluación de aislamientos de Fusarium sp. en prueba de
degradación in vitro de tejidos queratinizados – casco –
modelo animal.
Ajuste de un modelo donde se observa que variables explican el
comportamiento de la variable Degradación de Casco.
Variable dependiente: DEGRADACIÓN CASCO Suma de Cuadrado de
Fuente DF cuadrados la media F-Valor Pr > F
Modelo 10 0.03817874 0.00381787 2.55 0.0464
Error 16 0.02399797 0.00149987
Total correcto 26 0.06217671
R-cuadrado Coeficiente Variación Raíz MSE D. Casco Media
0.614036 16.54370 0.038728 0.234096
Cuadrado de
Fuente DF Tipo I SS la media F-Valor Pr > F
Aislamiento 8 0.02266530 0.00283316 1.89 0.1328
Réplica 2 0.01551345 0.00775672 5.17 0.0185
La variable Aislamiento parece no tener ningún efecto en los
resultados de la variable Degradación de Casco. Sin embargo, se
realiza comparación de medias utilizando la prueba del rango
múltiple de Duncan.
156
Medias con la misma letra no son significativamente diferentes
Alfa 0.05 Aislamiento N Media Agrupamiento de Duncan
111 3 0.26467 A
156 3 0.26233 A
303 3 0.25097 A
121 3 0.25027 A
210 3 0.23977 A
308 3 0.23427 A B
203 3 0.22437 A B
310 3 0.21543 A B
206 3 0.16480 B
Nota: La prueba del rango múltiple de Duncan, controla el índice de error
comparisonwise de tipo I, no el índice de error experimentwise.
157
ANEXO 7.
Análisis de varianza y agrupamiento de Duncan de
evaluación de aislamientos de Fusarium sp. en prueba de
degradación in vitro de tejidos queratinizados – pelo –
modelo humano.
Ajuste de un modelo donde se observa que variables explican el
comportamiento de la variable Degradación de Pelo.
Variable dependiente: DEGRADACIÓN PELO Suma de Cuadrado de
Fuente DF cuadrados la media F-Valor Pr > F
Modelo 10 0.04447874 0.00444787 1.97 0.1089
Error 16 0.03608344 0.00225521
Total correcto 26 0.08056218
R-cuadrado Coeficiente Variación Raíz MSE D. pelo Media
0.552104 41.21258 0.047489 0.115230
Cuadrado de
Fuente DF Tipo I SS la media F-Valor Pr > F
Aislamiento 8 0.03066622 0.00383328 1.70 0.1744
Réplica 2 0.01381252 0.00690626 3-06 0.0748
La variable Aislamiento no es significativa; sin embargo, se realiza
comparación de medias, utilizando la prueba del rango múltiple de
Duncan.
158
Medias con la misma letra no son significativamente diferentes Alfa 0.05 Aislamiento N Media Agrupamiento de Duncan
206 3 0.16177 A
156 3 0.15133 A
111 3 0.13263 A B
303 3 0.12470 A B
210 3 0.12293 A B
308 3 0.11683 A B
310 3 0.09487 A B
121 3 0.08877 A B
203 3 0.04323 B
Nota: La prueba del rango múltiple de Duncan, controla el índice de error
comparisonwise de tipo I, no el índice de error experimentwise.
EVALUACIÓN PRELIMINAR DE MODELOS DE INFECCIÓN CRUZADA POR Fusarium sp., AISLADOS DE PROCESOS PATOLÓGICOS EN PLANTAS, ANIMALES Y HUMANOS
N. Camacho, J.A. Gil. Pontificia Universidad Javeriana. Facultad de Ciencias. Microbiologia Industrial, Microbiologia Agrícola y
Veterinaria
Fusarium es un género de hongos de distribución universal, que se comporta como fitopatógeno. Algunas especies del género son queratinofílicas y queratinolíticas, confiriéndole la capacidad de colonizar tejidos de humanos y animales, convirtiéndose así en agentes patógenos de estos hospederos. En la presente investigación se realizaron aislamientos de Fusarium sp. a partir de plantas y animales, ya que se contaba con aislamientos de humanos. Se desarrollaron tres modelos de infección con tres aislamientos de cada hospedero, el modelo de infección fitopatógeno con plántulas de tomate y, los modelos de infección animal y humano con tejidos queratinizados (casco de vaca y pelo de humano). Los resultados mostraron que la presencia de Fusarium sp. en animales es mayor de lo que se encuentra reportado, y en plantas se confirmó su frecuencia. Por otro lado, los modelos de patogenicidad confirmaron tendencias de infección en los hospederos originales, y al mismo tiempo demostraron la capacidad de Fusarium sp. de colonizar otros tejidos. Con estos modelos se buscaba establecer el estudio de las infecciones cruzadas entre hospederos, por esta razón se realizó un análisis de donde se observó que no habían relaciones entre las procedencias y que estas se comportan de manera independiente. Este trabajo constituye un estudio preliminar, base para poder llegar a conclusiones sobre el comportamiento de Fusarium como multihospedero, a partir de la evaluación del 100% de los aislamientos obtenidos. Fusarium is a fungal genus of universal distribution which behaves as phytopathogen. Some species are keratinophilic and keratinolitic, conferring the ability of human and animal tissue colonization; this capacity makes Fusarium a human and animal pathogen. Fusarium sp. isolates from plants and animals were collected for this study, human isolates were recovered from previous studies. Three infection models were developed including three isolates from each host. Tomato plants were used for plant infection model, and keratinized tissues (bovine hoof and human hair) for animal and human infection models. The results showed that Fusarium sp. occurrence in animals is higher than reported, and isolation frequency in plants was confirmed. The pathogenicity models confirmed infection tendency for the original host, and at the same time proved Fusarium capacity of colonizing different tissues. The pathogenicity models aimed to establish host cross infections studies. We performed an analysis which showed that there is not relation between isolation origins due to their independent behavior. This work constitutes a preliminary study, which may possible to conclude about multihost Fusarium behavior evaluating 100% of collected isolates. __________________________________________________________________________________________
Fusarium es un género de hongos de distribución universal. Usualmente se encuentra como saprófito de suelo; sin embargo, se ha reportado como parásito facultativo de numerosos hospederos en los que se incluyen plantas, animales y humanos. (Giani, 1997; Tosti et al., 2000; Summerell et al., 2001). Algunas especies del género Fusarium son habitantes del suelo, se reconocen por su importancia económica para la agricultura en el mundo ya que son agentes causales del marchitamiento vascular y pudrición basal de una gran variedad de plantas. Por otro lado, se ha encontrado que algunas especies de este género han emergido como patógenos oportunistas de humanos causando enfermedades diseminadas en pacientes inmunocomprometidos, quemados, con heridas abiertas y en ocasiones se han reportado, también, como agentes causales de infecciones en pacientes inmunocompetentes. (Agrios et al., 1997; Hennequin et al., 1997; Mayayo, 1999; Di Pietro & Roncero, 2005; Monzón & Rodríguez, 2007). Entre las características no enzimáticas asociadas con la virulencia de este género se destaca su amplia distribución, atribuida a su capacidad para crecer en gran número de substratos y a su eficaz mecanismo de dispersión. En el mismo sentido se destaca la adherencia que le confiere la capacidad de colonizar los tejidos y la producción de toxinas. (Marasas, 1984; Agrios, 1997; Díaz, 1997; Mitola et al., 2001; Di Pietro & Roncero, 2005; Monzón & Rodríguez, 2007) Adicionalmente, los complejos enzimáticos producidos por las especies de este género constituyen un importante factor de virulencia. Se ha identificado la capacidad de producir el complejo de enzimas polisacaridasas que pueden alterar o degradar los distintos componentes (polisacáridos) presentes en las paredes celulares. Dentro de estas, se destaca la producción de pectinliasas, celulasas, arabinasas,
poligaracturonidasas, entre otras. (Guevara, 1997; Roncero et al., 2000; Di Pietro & Roncero, 2005). Algunas especies del género presentan capacidad queratinofílica y queratinolítica que les confiere la capacidad de colonizar tejidos de humanos y animales y, de esta forma, convertirse en agentes patógenos. (Imai, 1991) Actualmente se desconoce hasta qué punto están conservados estos factores de virulencia en los grupos de hospederos que afecta Fusarium. Una de las principales causas es la falta de estudios y la ausencia de modelos que permitan el análisis simultáneo de la virulencia en plantas y animales. Con la finalidad de contribuir al análisis de Fusarium como un patógeno multihospedero, se llevo a cabo este trabajo que consistió en realizar diez aislamientos de cada hospedero a evaluar (planta, animal y humano) y hacer pruebas de inoculación cruzada entre nueve aislamientos (tres de cada uno de los modelos de hospedero). La investigación plantea tres modelos de infección para Fusarium sp., plántulas de tomate como modelo de infección fitopatógena y, como modelo de infección animal y humano se manejaron tejidos queratinizados (casco de vaca y pelo respectivamente). MATERIALES Y METODOS El proyecto se desarrolló en el Laboratorio de Micología de la facultad de Ciencias de la Pontificia Universidad Javeriana, y en el invernadero construido en la Calle 146 Nº 54 – 57. ORIGEN DE LOS AISLAMIENTOS DE Fusarium sp. Los aislamientos de humanos fueron donados por el Laboratorio de Micología de la Pontificia Universidad Javeriana, 12 de estos provenían de lesiones de onicomicosis y se encontraban conservados en agua destilada estéril, y un último aislamiento provenía de una lesión de queratitis.
2
Para la obtención de los aislamientos de lesiones en animales, se procesaron un total de 62 muestras provenientes de lesiones de individuos que presentaban sintomatología de infección por hongos en ojos (opacos y con lagrimeo abundante) y piel (focos rojizos, en ocasiones con pérdida de pelaje). Estas muestras se obtuvieron de clínicas veterinarias urbanas o directamente en campo. Los aislamientos de plantas se obtuvieron al procesar un total de 17 muestras de plantas (cinco de estas muestras fueron procesadas de plantas de clavel, 11 solanáceas y una cucurbitácea); que presentaban sintomatología típica de marchites vascular y pudrición basal, características de Fusarium sp. Procesamiento material vegetal Para el aislamiento en laboratorio del patógeno presente en el material vegetal con los síntomas característicos de Fusarium sp., se realizó un lavado superficial del material y se realizaron cortes transversales de 3-5 mm. A dichos cortes se les realizó una desinfección superficial con agua destilada estéril e hipoclorito de sodio (NaClO) al 2.6% v/v por dos minutos (Forero, 2007). El material vegetal fue secado y posteriormente se sembrado e incubado por siete días a T ambiente en medio PDA suplementado con cloranfenicol (50 ppm), procedimiento que se realizó por triplicado. Pasado este tiempo se observaron las estructuras típicas de Fusarium sp., y se procedió a realizar cultivos monospóricos de los mismos (Riveros et al., 2001; Ardila & Higuera, 2005; Forero, 2007). Toma y procesamiento de muestras animales A partir de lesiones cutáneas se tomaron muestras, mediante el raspado de piel con bisturí, después de hacer una desinfección del área con alcohol al 70%. (Calado et al., 2005; Franco, 2006). Al mismo tiempo se realizo una metodología alterna, utilizada para la obtención de muestras de lesiones cutáneas, se realizó siguiendo el protocolo de Pulido (2007), que consiste inicialmente en una desinfección y la toma de la muestra con un hisopo humedecido en agua estéril y posteriormente con un hisopo seco. Para lesiones de queratitis las muestras fueron tomadas mediante frotis del saco conjuntivo con un hisopo estéril humedecido en agua estéril (Rosa et al., 2003; Hilmioglu-Polat et al., 2005). Las muestras se trasportaron en tubos de ensayo estériles refrigerados y se sembraron, por triplicado, en PDA suplementado con cloranfenicol (50 ppm) y se incubaron a temperatura ambiente por siete días, con observación macroscópica periódica. El hongo que se presentaba en todos los puntos de siembra fue repicado en PDA. Una vez identificado el aislamiento como Fusarium sp., se procedió a la realización de cultivos monospóricos (Rosa et al., 2003; Calado et al., 2005). Cultivos monospóricos Los cultivos monospóricos se realizaron mediante una suspensión de conidios en solución salina 0.85% p/v más Tween 0.1% v/v, con una concentración mínima de 1.5 x 106 conidios/mililitro; a partir de la cual se hicieron diluciones con el fin de obtener una concentración de 100 esporas por mililitro, la cual se sembró en superficie en PDA con cloranfenicol (50 ppm) e incubada a 25 + 2°C. La evaluación y selección de una espora germinada se realizó bajo observación en estereoscopio a las 12 horas post-siembra y se dejó incubando nuevamente durante
48 horas tiempo en el cual el tamaño de la colonia permitía realizar un repique a PDA. Identificación taxonómica de los aislamientos La identificación taxonómica a nivel de género se llevó a cabo a partir de los cultivos monospóricos, utilizando como base metodologías y claves de identificación elaboradas por De Hoog y colaboradores (2000) las cuales consideran la observación de características microscópicas. Conservación de los aislamientos
• Conservación de hongos en agua destilada estéril.
Los aislamientos repicados en PDA de los cultivos monospóricos, fueron cortados en discos de seis milímetros de diámetro, y trasladados a frascos de vidrio con 30 mL de agua destilada estéril, sellados y almacenados a temperatura ambiente (Bueno & Gallardo, 1998).
• Conservación en aceite mineral estéril El método utilizado consistió cubrir con una capa de aceite mineral estéril all hongo crecido en tubos de agar PDA en pico de flauta y se conservaron a temperatura ambiente (Panizo et al., 2005).
• Conservación en papel filtro estéril Inicialmente se tenían cuadros de papel filtro de 1 x 1 cm, sobres en papel parafinado de 6 x 4 cm y sobres de papel bond de 8 x 5 cm estériles. Los cuadros de papel filtro estéril se trasladaron a medio PDA, cada cuadro fue inoculado con el hongo a conservar e incubado a temperatura ambiente hasta obtener colonización del papel. Posteriormente se trasladaron a cajas de Petri estériles y se secaron a 26ºC por 15 días. Por último los cuadros de papel secos se introdujeron en los sobres de papel parafinado estéril y estos a su vez en los sobres de papel bond. Estos sobres se conservaron a temperatura de refrigeración dentro de bolsas Ziploc ENSAYOS DE PATOGENICIDAD CRUZADA Para la realización de los ensayos de patogenicidad cruzada se hizo un muestreo aleatorio sin reemplazo de tres aislamientos de cada hospedero (Daniel, 1997). Se evaluaron una totalidad de nueve aislamientos en cada uno de los ensayos de patogenicidad. Los aislamientos de plantas utilizados en este ensayo cumplieron previamente con los Postulados de Koch. Actividad fitopatógena Preparación del inóculo De cada cepa de Fusarium sp., originaria de cultivo monospórico, se realizaron subcultivos. La colección de conidios se llevó a cabo por desprendimiento de la colonia con perlas de vidrio y solución salina 0.85% p/v más Tween 0.1% v/v (Astudillo & Blanco, 1999), esta suspensión se diluyó en solución salina estéril al 0.85% p/v pH 5.5 + 0.2 hasta alcanzar una concentración celular de 106 conidios/mL (Marín, 2003). Inoculación de plántulas La evaluación de actividad fitopatógena se realizó en plántulas de tomate con dos pares de hojas verdaderas variedad Chonto Santa Clara compradas en una empresa germinadora de semillas de tomate. Para la inoculación de las plántulas de tomate, inicialmente se realizó un lavado al sistema radicular y, las cuales fueron heridas con pequeños cortes a los ápices de las raíces y se sumergieron en el inóculo durante 30 minutos. Este procedimiento se realizó en 10 plántulas por cada cepa a evaluar. Se utilizaron como control negativo 10 plántulas inoculadas con solución salina 0.85% p/v estéril (Rodríguez-Molina et al., 2003).
3
Las plantas se mantuvieron en sustrato (suelo-cascarilla de arroz 3:1 estéril, bajo condiciones de invernadero a temperatura aproximada de 22°C, en macetas individuales con fertilización comercial. La distribución de las plántulas en el invernadero se hizo de forma aleatoria. La revisión de síntomas se realizó semanalmente durante 51 días, al cabo de los cuales se realizó un re-aislamiento de las cepas mediante la metodología de Jiménez (2004). (Lara, 1999; Marín, 2003; Rodríguez-Molina et al., 2003). La metodología de Jiménez (2004) es un método cuantitativo que permite valorar la progresión de la enfermedad. La muestra a evaluar se tomó ubicando la corona y a partir de esta se tomaron 5 cm del tallo y 5 cm de la raíz principal. Una vez realizado el corte de tallo y raíz principal se efectuó un lavado y desinfección con agua y hipoclorito de sodio 2.5% v/v. Luego de secado el material vegetal, se procedió al corte en secciones de 0,5 cm y siembra en espiral, de dichas secciones, en forma descendente en cajas de Petri con PDA suplementado con cloranfenicol (50 ppm). Los cultivos se incubaron a 22 + 2°C durante 8 días, en los cuales se le hizo seguimiento diario para poder determinar la progresión de la enfermedad. Actividad patógena sobre tejido animal y humano. Se desarrollaron dos modelos de infección in vitro, asociados a la degradación de queratina sobre cascos de vaca pulverizados y cabello humano castaño cortado en secciones de un cm. Modelo in vitro de patogenicidad animal y humano Para el análisis de la degradación de queratina, a partir de los sustratos anteriormente mencionados, se utilizó el método de pérdida de peso, utilizado por Singh (1999 y 2002). Las nueve cepas se sembraron utilizando como inóculo un disco de 6 mm de diámetro en 25 mL de caldo glucosa gelatina (glucosa 10g/l, gelatina 10g/l, K2HPO4 1 g/l, MgSO4*7H2O 0.5 g/l, pH 7.0) en erlenmeyer de 150 mL con agitación constante durante 21 días. Estos cultivos fueron tomados como control positivo de crecimiento y producción de biomasa de cada aislamiento. Simultáneamente, las cepas fueron sembradas en caldo glucosa-gelatina modificado, en el cual la gelatina fue remplazada por 250 mg del sustrato (pelo ó casco). También se hizo una siembra con los sustratos en ausencia de glucosa. La inoculación se realizó de la misma manera que el control positivo de crecimiento y se mantuvo bajo las mismas condiciones de incubación. Como control de peso de queratina se realizó el montaje de erlenmeyers que contenían sales, sustrato (pelo o casco) y sin inoculación. Los cultivos fueron observados macroscópicamente a diario, y pasado el tiempo de incubación se analizaron microscópicamente para asegurar su pureza. Después del tiempo de incubación, los cultivos fueron filtrados y secados en papel filtro estéril a 80ºC por 12 horas. Posteriormente se pesaron para obtener un peso seco total (sustrato más micelio). La degradación de queratina fue determinada mediante la diferencia del peso seco total y la biomasa total, determinada en el control positivo de crecimiento. Este resultado se le restó al peso seco de la queratina no inoculada (Singh, 1999). También se hicieron siembras en los mismos medios con adición de agar-agar, para tener una apreciación cualitativa del crecimiento de los aislamientos sobre el sustrato de queratina. La inoculación se llevó a cabo de
la misma manera que en los medios líquidos, introduciendo un disco de 6 mm de diámetro en el centro de la caja de Petri sobre el sustrato queratinizado. ANÁLISIS ESTADÍSTICO Se realizó un análisis de varianza a los resultados, utilizando el programa estadístico SAS, mediante la aplicación de la prueba de rango múltiple de Duncan para obtener agrupaciones de las variables analizadas. Los resultados de la progresión de la enfermedad en plantas se analizaron mediante la técnica de área bajo la curva y a partir de estos resultados se realizaron los análisis anteriormente mencionados. A partir de los resultados de las pruebas de Duncan realizadas a los tres modelos se realizó un análisis de correlaciones. RESULTADOS Y DISCUSION ORIGEN DE AISLAMIENTOS Los aislamientos de hospedero humano se obtuvieron a partir de la recuperación de conservaciones en agua de 12 cultivos de hongos que provenían de onicomicosis. Se obtuvo un buen desarrollo de diez de estos y los dos restantes crecieron con flora acompañante. La selección de las nueve cepas a trabajar, se realizó teniendo en cuenta el buen desarrollo de las colonias en PDA y se descartó el aislamiento que presentó menor esporulación con respecto a los otros. Para completar los diez aislamientos necesarios para el desarrollo del proyecto, se obtuvo un aislamiento proveniente de queratitis que estaba siendo utilizado en el proyecto de investigación “Estudio in vitro de germinación de Fusarium sp. en los materiales de lentes de contacto blandos y eficacia de las soluciones multipropósito contra este microorganismo”. Esta cepa se encontraba en PDA con un buen desarrollo y alta esporulación El porcentaje de recuperación de los aislamientos de humanos conservados en agua, tomando las 12 muestras procesadas como el 100%, corresponde al 83%. Este porcentaje no difiere en gran medida de los resultados obtenidos por Bueno y Gallardo (1998) y por Panizo y colaboradores (2005), en los estudios orientados a evaluar la viabilidad del método de conservación de cepas en agua destilada, en los cuáles se obtuvo un porcentaje de recuperación del 100%, debido a que ninguno presentó contaminación bacteriana, por ácaros o por otros hongos. La razón por la cuál durante el desarrollo del presente trabajo se obtuvo el 83% de recuperación, se atribuye a la presencia de contaminación en dos de las muestras, la cual puede ser relacionada a errores experimentales en el momento de la conservación, como lo relacionaron Panizo y colaboradores en su estudio. El presente estudio no permite establecer ningún tipo de prevalencia y/o predilección de las patologías causadas por Fusarium sp., debido a que la cantidad de aislamientos es muy baja para este tipo de estudios. Sin embargo, se logró corroborar que este género está relacionado con patologías en humanos, como se ha venido reportando desde hace ya dos décadas y que se puede comprobar con el origen y la hoja de vida de estos aislamientos. Y permite confirmar que entre las patologías producidas por Fusarium sp. en humanos, se destacan afecciones dérmicas y oftálmicas relacionadas con la característica de ser hongos queratinolíticos, lo que concuerda con lo reportado por Hennequin y colaboradores (1997), Mayayo (1999), Kunert (2000), Garcés y colaboradores (2001). A partir de lesiones provenientes de animales, se procesaron un total de 62 muestras, de las cuales 24
4
resultaron positivas para hongos (Tabla 1), y en 10 de estas se aisló Fusarium sp. Las 38 muestras restantes no se tuvieron en cuenta ya que presentaban contaminación bacteriana o porque el cultivo no presentaba crecimiento del mismo agente aislado en todos los puntos de siembra. Tabla 1. Procesamiento de muestras provenientes de lesiones de animales
Nº identificación
Origen Lesión Organismo
aislado
101 Canino Dermatitis generalizada en lomo
Micelio estéril
108 Bovino Lagrimeo abundante e inflamación del párpado
Fusarium sp.
111 Canino Dermatitis generalizada, extremidades anteriores
Fusarium sp.
112 Canino Lesión costrosa interdigital
Micelio estéril
116 Bovino Descamación de piel en lomo
Micelio estéril
119 Ave Descamación en pata Dermatofito
120 Ave Descamación en pata Aspergillus sp.
121 Canino Dermatitis generalizada, lomo zona anterior
Fusarium sp.
122 Bovino Lagrimeo abundante y tumor en ojo
Micelio estéril
127 Bovino Descamación en pata Dermatofito
131 Canino Dermatitis en lomo, zona anterior
Fusarium sp.
138 Ave Descamación pata Micelio estéril
143 Bovino Costras en hocico Scopulariopsis sp.
146 Bovino Costras en párpado Scopulariopsis sp.
152 Canino Dermatitis generalizada en lomo
Aspergillus sp.
153 Canino Dermatitis cola Aspergillus sp
154 Bovino Dermatitis lomo zona media Dermatofito
155 Canino Dermatitis lomo zona posterior
Fusarium sp.
156 Canino Dermatitis lomo zona posterior
Fusarium sp.
157 Canino Lagrimeo abundante e inflamación párpado
Aspergillus sp.
159 Canino Dermatitis generalizada zona abdominal
Fusarium sp.
160 Bovino Dermatitis en lomo, zona media
Fusarium sp.
161 Canino Dermatitis zona media del lomo
Fusarium sp.
162 Canino Dermatitis lomo zona posterior
Fusarium sp.
La prevalencia de los hongos en las muestras de animales analizadas presenta un valor de 39%, el cual es relativamente bajo si se tiene en cuenta que las infecciones por dermatofitos fueron las primeras enfermedades infecciosas descritas y reconocidas desde el siglo pasado, como lo menciona Mitchell (1983) en su trabajo. A partir del reconocimiento de hongos patógenos, los estudios histopatológicos van orientados principalmente para el diagnóstico de micosis en patología veterinaria, como lo mencionan Pérez y Carrasco (2000). Adicionalmente, si se tiene en cuenta que otros organismos que afectan la dermis de animales son agentes patógenos oportunistas (bacterias y ácaros), los resultados obtenidos de las lesiones evaluadas se pueden correlacionar con los estudios y reportes mencionados anteriormente. Sin embargo, es importante resaltar que las muestras que no se identificaron como hongos (61%), agrupan no solo a otros agentes patógenos, sino también a los casos donde no todos los puntos de siembra presentaban el mismo agente aislado, y aquellas muestras en donde se presentaba carga bacteriana debido a la dificultad de realizar una correcta
desinfección en la dermis del animal. Este último caso pudo ser un factor que imposibilitó el crecimiento fúngico, debido a que las muestras a analizar no se sometieron a ningún tratamiento de inmersión en antibióticos, y el medio preparado fue PDA sin suplementos. Los resultados obtenidos fueron un punto de corrección durante el desarrollo del trabajo ya que, para realizar los repiques y purificación de los aislamientos, se tuvo en cuenta la importancia de suplementar PDA con cloranfenicol. El porcentaje de aislamiento de Fusarium sp., en el total de las muestras tomadas de animales es del 16%. No obstante, en la Figura 6.1 se observa que la incidencia de aislamiento de Fusarium sp. frente a otros hongos es de 41.7%, comprobando lo establecido en varios estudios llevados a cabo en los últimos años por Andrew y colaboradores (1998) y, Betbeze y colaboradores (2006), donde se ha visto incrementada su relación con afecciones oftálmicas y sistémicas principalmente. Este estudio permite demostrar la incidencia que presenta este hongo como agente causal de micosis superficiales (infecciones dérmicas), que se reportan con menor frecuencia frente a otras patologías causadas por este género, como son intoxicaciones por producción de toxinas, onicomicosis en los cascos e infecciones sistémicas. (Oliveira et al., 2002; Ortoneda, 2003; Elligot et al., 2006).
Frecuencia aislamiento
20,8
41,7
16,7
12,58,3
Micelio estéril Fusarium sp. Aspergillus sp.
Dermatófitos Scopularipsis sp.
Figura 1. Porcentaje de frecuencia de aislamiento de hongos en muestras animales Algunos de los patrones que se pueden establecer a partir de los resultados obtenidos en este proyecto, permiten establecer a Fusarium sp., como agente causal no solo de queratomicosis sino también como patógeno frecuente que causa lesiones superficiales en la dermis de una gran variedad de especies animales. Igualmente permite establecer que causa infecciones con mayor frecuencia en caninos y bovinos como lo indica la Tabla 6.2. Adicionalmente, se comprobó lo reportado por Ortoneda (2003) y Godoy y colaboradores (2004), quienes afirman que las patologías causadas por Fusarium sp. son mayores en áreas tropicales y subtropicales (clima cálido y húmedo) aumentando su incidencia en temporadas de lluvia por las variaciones de temperatura y humedad, condiciones que se relacionan directamente con la capacidad de germinación de las esporas del microorganismo y de esta forma causar patologías. El último origen de aislamiento pertenece a especies vegetales, de las cuales se procesaron un total de 17 muestras de plantas (diez solanáceas, una cucurbitácea y seis claveles) siendo positivas 16 para Fusarium sp, como se muestra en la Tabla 2. Tabla 2. Aislamientos a partir de material vegetal
5
Nº identificación
Origen Sintomatología Hongo aislado
301 Tomate Marchites generalizada y pudrición de haces vasculares
Fusarium sp.
302 Clavel Marchites unilateral de la planta y pudrición de haces vasculares
Fusarium sp.
303 Tomate Marchites generalizada y pudrición de haces vasculares
Fusarium sp.
304 Tomate de árbol
Marchites generalizada y pudrición de haces vasculares
Fusarium sp.
305 Tomate de árbol
Marchites generalizada y pudrición de haces vasculares
Fusarium sp.
306 Tomate Marchites generalizada y pudrición de haces vasculares
Fusarium sp.
307 Calabacín Marchites Fusarium
sp.
308 Tomate Marchites generalizada y pudrición de haces vasculares
Fusarium sp.
309 Tomate Marchites generalizada y pudrición de haces vasculares
Fusarium sp
310 Tomate Marchites generalizada y pudrición de haces vasculares
Fusarium sp
311 Tomate Marchites generalizada y pudrición de haces vasculares
Fusarium sp
312 Tomate Marchites generalizada y pudrición de haces vasculares
Fusarium sp
313 Clavel Marchites unilateral de la planta, pudrición de haces vasculares
Fusarium sp.
314 Clavel Marchites unilateral de la planta y pudrición de haces vasculares
Fusarium sp.
315 Clavel Marchites unilateral de la planta y pudrición de haces vasculares
Fusarium sp.
316 Lulo Marchites unilateral de la planta y pudrición de haces vasculares
No identificado
317 Clavel Marchites unilateral de la planta y pudrición de haces vasculares
Fusarium sp.
La Tabla2 permite establecer una prevalencia del 94% de Fusarium sp. en las muestras analizadas, confirmando la frecuencia que tiene este patógeno en las especies investigadas (solanáceas y clavel) y cómo puede ser aislado frecuentemente (Caracuel et al., 2003; Ardila & Higuera, 2005). Por otro lado, esto permite confirmar que la sintomatología que ha sido descrita por varios autores como típica de la infección causada por este género, orienta eficazmente a la identificación de Fusarium sp. como fitopatógeno. A su vez, los resultados permiten ratificar la razón por la cual el género Fusarium sp., ha sido uno de los más estudiados como fitopatógeno, por su alta prevalencia en cultivos de importancia económica y su severidad en estos hospederos (Monzón & Rodríguez, 2007). MODELO DE INFECCIÓN EN PLANTAS Los inóculos de los nueve aislamientos de Fusarium sp. utilizados en la prueba, se prepararon como suspensión de conidios en 50 mL de solución salina 0.85% p/v más Tween 0.1% v/v, con concentración final de 106 conidios/mL. Estas se mantuvieron a temperatura ambiente (19 + 2°C) durante dos horas, tiempo en el cual se preparó el material vegetal a infectar. La concentración del inóculo fue establecida por varios autores y la han considerado como la presión del inóculo
que asegura una infección y un desarrollo adecuado de la enfermedad, como lo reporta Larco (2004). Previo a las pruebas de patogenicidad cruzada de los nueve aislamientos escogidos, se probaron los postulados de Koch para los ocho aislamientos de Fusarium sp. obtenidos de plantas de tomate. El procedimiento realizado fue el mismo que se describió para la actividad fitopatógena ejecutando el re-aislamiento del agente patógeno a los 12 días post inoculación, momento en el cual las plantas empezaron a presentar clorosis. Como conclusión se cumplieron correctamente los postulados de Koch, ya que todas las cepas analizadas se re-aislaron de las plantas demostrando que efectivamente eran los agentes etiológicos de la infección (Roy, 1997; Salas et al., 1999) En las pruebas de actividad fitopatógena, se observó que las plantas control inoculadas con solución salina estéril no presentaron ningún síntoma, ni mostraron contaminación por hongos o bacterias en el montaje de las secciones de tallo y raíz, resultado que valida las pruebas realizadas y así mismo da confiabilidad a los resultados obtenidos. Por otro lado, las plantas inoculadas con los diferentes aislamientos, no mostraron sintomatología significativa que permitiera evidenciar la enfermedad. En algunas se observó clorosis y retardo de crecimiento, pero este parámetro no se tuvo en cuenta ya que no era generalizado en las réplicas de los montajes. La ausencia de síntomas pudo deberse a que estos solamente aparecen cuando el sistema vascular de los pecíolos y las hojas han sido invadidos, fenómeno que sucede después de la colonización del tallo, como lo afirman Rodríguez-Molina y colaboradores (2003). Por lo anterior, solo se tuvo en cuenta la recuperación del hongo a nivel de laboratorio. Como se observa en la Figura 6.3, el crecimiento de algunas réplicas de todos los aislamientos independiente de la procedencia, mostraron un crecimiento discontinuo, lo que probablemente indica que los mecanismos de defensa de la planta estaban ejerciendo resistencia ante el patógeno bloqueando puntos de infección e inhibiendo la germinación y el crecimiento micelial y, por ende, no desarrollaron la sintomatología típica de la enfermedad producida por Fusarium sp. (Rodríguez-Molina et al., 2003). La Tabla 3 muestra los resultados del crecimiento de los aislamientos de Fusarium sp. en el montaje de colonización de tejidos de raíz y tallo. Se encuentran las medias de las diez réplicas y el área bajo la curva de cada una. Tabla 3. Crecimiento en centímetros y área bajo la curva, de los aislamientos de Fusarium sp. en ensayo fitopatógeno.
Aislamiento Fusarium sp.
Día 2 (cm)
Día 4 (cm)
Día 6 (cm)
Día 8 (cm)
Área bajo la curva
156 1.7±0.9 5±1.74 6.1±1.36
7.6±1.04
62.8
111 1.5±0.82
4.5±1.22
5.6±1.35
7.7±1.31
52.9
121 2.6±1.01
5.5±2 5.9±1.3
6.1±1.01
62.6
203 1.5±0.91
5.2±0.78
5.9±1.25
7.3±1.1
61.7
206 1.6±0.7 3±1.46 6.3±1.17
7.7±1.35
55.6
210 1.8±0.9 3.8±1 6.4±0.98
7.3±1.15
58.5
303 2±0.27 5.8±1. 6.6±1. 7.8± 68.9
6
Aislamiento Fusarium sp.
Día 2 (cm)
Día 4 (cm)
Día 6 (cm)
Día 8 (cm)
Área bajo la curva
52 2 0.64 308 0.6±0.7
2 1.5±0.63
5.8±1.67
7.1±1.41
44.5
310 1.5±0.77
5±1.11 6.9±1.18
7.9±1.16
64.3
Dentro del análisis estadístico realizado a los resultados obtenidos, se observa que según el agrupamiento de Duncan, existen diferencias significativas entre cada uno de los días y van en orden; es decir, que a medida que pasaban los días, el hongo ocupaba más secciones sembradas. Esto se puede explicar por la cantidad de inóculo que tenía cada sección de la planta; así, a mayor inóculo, es más rápido el crecimiento del hongo, y esta mayor concentración puede deberse a una mayor afinidad del mismo a ciertas partes de la planta o a la actividad de los mecanismos de defensa de la planta anteriormente nombrados (Mitola et al., 2001; Larco, 2004; Quilambaqui, 2005). Por otro lado se realizó análisis estadístico de varianza y comparaciones de medias entre las réplicas de cada aislamiento, mostrando que no hay diferencias significativas entre ellas, arrojando un valor F de 0.9305, dato confirmado con la prueba de rango múltiple de Duncan donde todas las replicas se encuentran en el mimo grupo; de tal forma que el comportamiento es el esperado. Al realizar el mismo análisis entre los aislamientos (Tabla 4), encontramos que los codificados como 303 y 310 presentaron mayor actividad fitopatógena (68.9 y 64.3 unidades de área bajo la curva respectivamente) y se encuentran dentro del mismo grupo, como era de esperarse, ya que provienen de plantas y no han perdido actividad fitopatógena, fenómeno que al parecer ocurrió con el aislamiento 308 que presentó la menor actividad fitopatógena de todos los aislamientos (44.5 unidades de área bajo la curva). Este comportamiento puede ser atribuido a problemas del aislamiento, ya que también presentó la menor actividad de degradación de queratina Tabla 4 Prueba de Duncan para aislamientos en ensayo fitopatógeno
Aislamiento N Media Agrupamiento de Duncan
303 10 68.9 A 310 10 64.3 A B 156 10 62.8 A B C 121 10 62.6 A B C 203 10 61.7 A B C 210 10 58.5 A B C 206 10 55.6 B C 111 10 52.9 C D 308 10 44.5 C D
Alfa 0.05 P valor = 0.0002 Los aislamientos provenientes de humanos y animales se encontraron todos dentro de un mismo grupo, indicando que no hay diferencias estadísticamente significativas en lo que se refiere a su actividad fitopatógena. Esto puede deberse a que los tejidos que estaban afectando en su hospedero original, tenían composición parecida, pero dentro de esta no se encuentra celulosa, sustrato en mayor concentración en las plantas, mostrando así que los factores de patogenicidad pueden estar relacionados al producir polisacaridasas permitiéndoles afectar a las plantas (Roncero et al., 2000; Di Pietro & Roncero, 2005).
Dentro de este grupo también se puede resaltar que los aislamientos 156 y 121, provenientes de animales, mostraron mayor actividad fitopátogena (62.8 y 61.6 unidades de área bajo la curva respectivamente) que los provenientes de humanos, indicando que la conservación, los repiques y el tiempo de los aislamientos in vitro pueden afectar la patogenicidad de los mismos y que se debió realizar una activación enzimática previa para estimular la producción de enzimas y así mismo su capacidad patogénica. Dentro de la agrupación obtenida, también cabe destacar que los aislamientos 111 y 308 se encuentran en el mismo grupo y mostraron las menores actividades fitopatógenas (52.9 y 44.5 unidades de área bajo la curva respectivamente), comportamientos inesperados ya que el aislamiento 308 es originario de este hospedero y los dos tienen poco tiempo de haber sido aislados; este resultado refleja que tres aislamientos de cada hospedero son muy pocos para este tipo de análisis y no son representativos de las tendencias que puede tener cada grupo. Modelo de infección humano y animal El modelo de patogenicidad utilizado fue degradación de queratina, ya que las queratinasas son el factor de virulencia más importante en las patologías causadas por Fusarium sp. La queratina es una esclero-proteína que se caracteriza por presentar una alta resistencia a la degradación. En la naturaleza, los sustratos queratinizados pueden ser degradados por enzimas queratinolíticas que poseen algunos microorganismos (Tosti et al., 2000; Apprich et al., 2006), como lo demostró Fusarium sp. en el presente estudio. Los resultados de las pruebas de actividad queratinolítica se muestran en la Tabla 5. La actividad cuantitativa se muestra como la hidrólisis de sustrato queratinizado y la actividad cualitativa se muestra como el crecimiento micelial sobre el sustrato evaluado (casco de vaca o pelo humano). Los controles de las pruebas no presentaron contaminación, haciendo válidas todas las pruebas. Tabla 5. Prueba cualitativa y cuantitativa de actividad patógena de Fusarium sp. sobre tejidos queratinizados.
Prueba cuantitativa Aisl
amiento
Sustrato de queratina utilizado
Glucosa
Prueba cualitativa
Degradación queratina (g)
Biomasa (g)
+ CM 0,1098 Pelo humano - CP 0,1326
+ CM 0,1785 111
Casco de vaca - CM 0,2648
0,1006
+ CM 0,1055 Pelo humano - CM 0,0888
+ CM 0,2188 121
Casco de vaca - CM 0,2503
0,0491
+ CM 0,1224 Pelo humano - CP 0,1513
+ CM 0,1905 156
Casco de vaca - CP 0,2623
0,1036
+ CM 0,0365 Pelo humano - CP * 0,0762
203
Casco + CM 0,1938
0,0364
7
Prueba cuantitativa Aisl
amiento
Sustrato de queratina utilizado
Glucosa
Prueba cualitativa
Degradación queratina (g)
Biomasa (g)
de vaca - CM 0,2244
+ CM 0,0141 Pelo humano - CP * 0,1618
+ CM 0,1914 206
Casco de vaca - CM 0,1648
0,0982
+ CM 0,0515 Pelo humano - CM * 0,1229
+ CM 0,1861 210
Casco de vaca - CM 0,2398
0,0764
+ CM 0,0684 Pelo humano - CM * 0,1247
+ CM 0,1971 303
Casco de vaca - CM 0,251
0,0805
+ CM 0,1278 Pelo humano - CP 0,1167
+ CM 0,1788 308
Casco de vaca - CP 0,2343
0,0530
+ CM 0,0341 Pelo humano - CP 0,0949
+ CP* 0,1492 310
Casco de vaca - CP* 0,1988
0,0639
CM: Crecimiento Masivo; CP: Crecimiento Pobre; *: Formación de micelio vegetativo. Aislamientos 121, 111 y 156 origen animal; 203, 206 y 210 origen humano; 303, 308 y 310 origen vegetal. Los resultados cuantitativos fueron sometidos a un análisis de varianza Tabla 6. arrojando como resultado que todos tratamientos son estadísticamente diferentes y por lo tanto no son agrupables. Tabla 6. Prueba de rango múltiple de Duncan para tratamientos de queratina.
Tratamiento N Media Agrupamiento Duncan
Casco sin glucosa 27 0.23226 A Casco con glucosa 27 0.18715 B Pelo sin glucosa 27 0.11889 C Pelo con glucosa 27 0.07446 D
Alfa 0.05 P valor = 0.0040 De acuerdo con la Tabla 6 los resultados con valores más altos de degradación de queratina se obtuvieron con los tratamientos de casco, en primer lugar sin glucosa, seguido por el tratamiento casco con glucosa y en tercer y cuarto Lo anterior indica que todos los aislamientos examinados tenían la capacidad de liberar queratinasas en diferentes cantidades y concentraciones según el sustrato que estaba utilizando como fuente de carbono y nitrógeno para obtener los nutrientes necesarios en su crecimiento, casco de vaca molido o pelo (Apprich et al., 2006) De las diferentes fuentes de carbono utilizadas (glucosa, pelo y casco como fuentes de queratina) se observó que, en presencia de glucosa, hay menor degradación de queratina, indicando una inhibición de la producción de queratinasas, ya que la glucosa representa una fuente de
carbono de fácil acceso, resultado que concuerda con los obtenidos por Singh (2002). La Tabla 5, la tabla 6 y la Figura 2 indican claramente que cuando se utiliza casco como fuente de queratina existe una mayor degradación (casco sin glucosa: media 0,23226g equivalente al 92.9% del sustrato inicial y casco con glucosa: media 0,18715g equivalente al 74.85% del sustrato inicial).
-0,05
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
111 121 156 203 206 210 303 308 310
AISLAMIENTOS
TO
TA
L Q
UER
AT
INA
DE
GR
AD
AD
A
(g)
Pelo + glucosa Pelo Casco + glucosa Casco Figura 2. Actividad queratinolítica Fusarium sp. La degradación de queratina involucra dos mecanismos muy cercanos. Primero, penetración mecánica del sustrato por la elongación de la hifa; este proceso es responsable del ataque inicial; y, segundo, la degradación enzimática por las queratinasas secretadas desde la pared celular (Singh, 1999). Esto permite plantear que el tamaño de la partícula puede influenciar en el proceso de colonización de los sustratos, ya que confiere mayor superficie de contacto hifa-sustrato y este es uno de los factores que se pueden tener en cuenta como punto de partida para determinar una de las razones de mayor degradación en casco en comparación con el pelo, teniendo en cuenta que el casco se encontraba molido, mientras que el pelo estaba en trozos que impedían una mayor superficie de contacto y obligaban al hongo a realizar una penetración mecánica. Adicionalmente, la pulverización del casco puede ocasionar la ruptura de los puentes bisulfuro presentes en la queratina, haciéndola más asequible para el hongo (Vignardet et al., 2001). Otra razón que pudo influenciar el alto porcentaje de degradación de queratina en casco es, como lo afirman Apprich y colaboradores (2006), que la producción de queratinasas es estimulada con la adición de diferentes fuentes de queratina al medio de cultivo y, según la naturaleza de dicho sustrato (casco o pelo), la producción puede variar sustancialmente. Existe otra razón por la cual el sustrato casco se pudo haber degradado en una alta proporción. Según Lal (1999), existe la posibilidad que el casco posea sustratos no queratinosos de fácil degradación para el hongo. Pero, esta teoría no pudo ser comprobada en este estudio ya que no se realizaron análisis de caracterización del casco, como tampoco de cambio de pH del medio, parámetro que también es indicador de la degradación de queratina. El complejo mecanismo de queratinolisis involucra la acción cooperativa de sulfitolisis y un sistema proteolítico, lo que conlleva a una consecuente liberación de nitrógeno ocasionando la alcalinización progresiva del medio de cultivo (Singh, 2002; Di Pietro & Roncero, 2005; Gupta & Ramnani, 2006). Por otro lado, la Tabla 5 la Figura 2 y la prueba de rango múltiple de Duncan (Tabla 6) también indican que cuando se emplea pelo como fuente de queratina, el porcentaje de degradación es menor (pelo sin glucosa:
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media 0.119 equivalente a 47.6% del sustrato inicial y pelo con glucosa media 0,075 g equivalente a 29.8% del sustrato inicial). Esta menor degradación de queratina pudo deberse a la utilización de pelo castaño, ya que en los trabajos donde se reporta el uso de "cebo de pelo", para evaluar actividad queratinolitica utilizando pelo como sustrato (Ulfig, 2000; Mitola et al., 2001), afirman que debe usarse pelo castaño claro preferiblemente, ya que la melanina, responsable del oscurecimiento del pelo, hace que este sea más resistente al ataque por microorganismos (Nosanchuk & Casadevall, 2003). Otro factor que pudo influenciar el bajo porcentaje de degradación de queratina y el crecimiento pobre que se encontró en las pruebas cualitativas, cuando se usó pelo como sustrato, fue que el pelo utilizado además de ser castaño, era grueso y ondulado lo que indica un alto contenido de metionina y según la fisiología de los hongos queratinolílticos descrita por Kunert (2000), este aminoácido puede ser utilizado como fuente de sulfuro, pero en caso de estar en concentraciones mayores a 1mM, es altamente inhibitorio. Según el ajuste del modelo del análisis de rango múltiple de Duncan se encuentra que entre las procedencias no hay diferencias estadísticamente significativas entre humanos y plantas, y sí las hay para animales, aislamientos que presentaron una mayor actividad queratinolítica tanto en degradación de queratina de casco, como en degradación de queratina de pelo. Tabla 7. Prueba de rango múltiple de Duncan para agrupamiento de aislamientos según degradación de queratina
Procedencia N Media Agrupamiento Duncan
Animal 36 0.172975 A Planta 36 0.147978 B Humano 36 0.138611 B
Alfa 0.05 P valor = 0.0040 Aunque no hubo diferencias significativas entre procedencias de humanos y plantas, mostraron una mayor actividad queratinolítica los aislamientos de plantas frente a los aislamientos de humanos, resultado inesperado ya que, debido a la ausencia de queratina en las plantas, no se espera que tengan una buena actividad queratinolítica; porque para la actividad fitopatógena deben tener el complejo enzimático CWDE activo, mecanismo principal mediante el cual se depolimeriza cada uno de los componentes de las paredes celulares (celulosa, xilano, pectinas, ácidos poligalacturónicos y extensinas) (Di Pietro & Roncero, 2005). Estos resultados son interesantes para próximos estudios. Por otro lado, la poca actividad queratinolitica por parte de los aislamientos de humanos se puede explicar por que no se realizó una activación enzimática. Los aislamientos estaban conservados en agua y no se tiene historial de la cantidad de repiques que tuvieron antes de la conservación. La conservación en agua puede tener un alto porcentaje de viabilidad pero puede ocasionar pérdida de características fisiológicas como la capacidad de virulencia (Borba et al., 1992). Este efecto que también puede ser ocasionado por la utilización del método de transferencia seriada (repiques) (Monaghan et al., 1999), teniendo en cuenta estas observaciones, se debió realizar una activación enzimática. Consiste en someter al hongo a crecer en un sustrato de composición igual o parecida al sustrato del cual fue aislado inicialmente (tejido afectado del hospedero), estimulando la producción de enzimas queratinolíticas y así mismo su actividad patogénica original.
Los aislamientos procedentes de animales presentaron mayor degradación de queratina en los dos sustratos. Se debe a que tenían pocos repiques antes de ser utilizados; por lo tanto, estaban expresando todas sus características patogénicas. Como el modelo animal fue el casco, era en éste donde se esperaba mayor actividad, pero también se encontró en el pelo. Así mismo, este resultado puede deberse a que las principales zonas de aislamiento estaban cubiertas de pelo, lo que indica que éste también puede ser empleado como modelo de patogenicidad en animales. El análisis estadístico de agrupamiento de Duncan, haciendo una comparación de medias de todos los aislamientos, arroja tres agrupamientos, en el primero se encuentran los aislamientos 121, 111, 156, 310, 303 y 210, de los cuales los cuatro últimos pertenecen también al segundo grupo, junto con los aislamientos 206 y 203, y estos dos últimos a su vez pertenecen al tercer grupo junto con el aislamiento 308 (Tabla 8). El orden anterior fue dado de mayor a menor degradación de queratina, indicando que los aislamientos que inician con 100 son procedentes de animal, confirmando el agrupamiento de procedencias; los 200 son de humanos y los 300 de plantas. En estos resultados se pude destacar que el aislamiento 308 fue significativamente diferente en cuanto a la degradación de queratina y al comportamiento de las procedencias, pero no afecta el agrupamiento de las mismas; por lo tanto, no se tiene en cuenta, ya que la cantidad de aislamientos evaluados por procedencia no es un número representativo para poder definir una tendencia en comportamiento como patógeno multihospedero. Tabla 8. Prueba de Duncan para degradación de queratina.
Aislamiento N Media Agrupamiento de Duncan
121 12 0.18166 A
111 12 0.17141 A
156 12 0.16586 A B
310 12 0.16430 A B
303 12 0.16030 A B
210 12 0.15008 A B C
206 12 0.13302 B C
203 12 0.13274 B C
308 12 0.1194 C
Alfa 0.05 P valor = 0.004 Al analizar los modelos humano y animal por separado (Tabla 9 y 10) encontramos diferencias sustanciales que permiten plantear que cada procedencia tiene una mayor capacidad de atacar su hospedero original (111 procedente de animal presentó una media de degradación de casco de 0.265 y 206 procedente de humano presentó una media de degradación de pelo 0.162). No obstante, hay que tener en cuenta las características y la ubicación de la lesión originaria y así mismo la similitud de los tejido evaluados, ya que el modelo humano utilizado fue pelo, pero el 90% de los aislamientos de animales estaban en contacto directo con este sustrato de origen animal, en tanto que el 90% de los aislamientos procedentes de humanos fueron aislados de lesiones de uña, tejido que se asemeja al casco en su composición y función (Lal et al., 1999). Por lo anterior y porque se trabajan los modelos de patogenicidad in vitro, no se puede reconocer la importancia que tiene la función del sistema inmune de cada hospedero, siendo esta una de las principales diferencias que puede interferir en los modelos evaluados.
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Tabla 9. Prueba de agrupamiento de Duncan de los aislamientos en relación con la degradación de casco.
Aislamiento N Media Agrupamiento de Duncan
111 3 0.26467 A 156 3 0.26233 A 303 3 0.25097 A 121 3 0.25027 A 210 3 0.23977 A 308 3 0.23427 A B 203 3 0.22437 A B 310 3 0.21543 A B 206 3 0.16480 B
Alfa 0.05 P valor = 0.1328 Tabla 10. Prueba de agrupamiento de Duncan de los aislamientos en relación con la degradación de pelo.
Aislamiento N Media Agrupamiento de Duncan
206 3 0.16177 A 156 3 0.15133 A 111 3 0.13263 A B 303 3 0.12470 A B 210 3 0.12293 A B 308 3 0.11683 A B 310 3 0.09487 A B 121 3 0.08877 A B 203 3 0.04323 B
Alfa 0.05 P valor = 0,1744 Fusarium sp., COMO MODELO MULTIHOSPEDERO A partir de los resultados obtenidos en los tres modelos de patogenicidad desarrollados en el presente estudio, se realizó un análisis estadístico de correlaciones que buscaba evaluar la capacidad multihospedera de Fusarium sp., teniendo en cuenta que en esta prueba se toman valores cercanos a 1 y -1 como un índice de correlación representativo. La Tabla 10 indica que el comportamiento de las tres clases de procedencia es diferente y no se correlacionan. Tabla 10. Correlación de los modelos de patogenicidad
Queratina pelo
Queratina casco
Área bajo la curva (Planta)
Queratina pelo 1
Queratina casco
-0,09995258 1
Área bajo la curva (Planta)
0,03037409 0,45926013 1
Aunque los resultados estadísticos del presente estudio de correlación no indiquen un valor representativo, varios autores han reportado a Fusarium sp., como un hongo capaz de causar patologías en varios tejidos y comportarse como multihospedero. Di Pietro y Roncero (2005) encontraron en su estudio que una cepa de Fusarium procedente de tomate, F. oxysporum f.sp. lycopesici, presentaba capacidad de infectar de manera sistémica y causar de forma consecuente la muerte de ratones inmunodeprimidos. De la misma forma, González y colaboradores (1998) reportaron que los animales domésticos (perros y gatos), representan un importante reservorio de Fusarium sp., causante de dermatomicosis en el hombre. Adicionalmente, los resultados de este estudio permiten observar que todos los aislamientos independientemente de su procedencia, mostraron capacidad de infectar los
tres tejidos evaluados en diferentes proporciones, indicando una posible capacidad multihospedera; por lo tanto se puede concluir que el número de aislamientos utilizados no es representativo para este tipo de análisis estadístico. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS Agrios GN. 2005. Plant pathology. 5th Edition. Elsevier Academic. Amsterdam. Andrew SE, Brooks DE, Smith PJ, Gelatt KN, Chmielewski NT, Whittaker CJ. 1998. Equine ulcerative keratomycosis: visual outcome and ocular survival in 39 cases (1987-1996). Equine Veterinary Journal, 30(2): 109 – 116. Apprich V, Spergser J, Rosengarten R, Stanek C. 2006. In vitro degradation of equine keratin by dermatophytes and other keratinophilic fungi. Veterinary Microbiology, 114: 352 – 358. Ardila H, Higuera BL. 2005. Inducción diferencial de Polifenoloxidasa y β-1,3.Glucanasa en clavel (Dianthus caryophyllus) durante la infección por Fusarium oxysporum f. sp. dianthi raza 2. Acta Biológica Colombiana, 10 (2): 61 – 74. Astudillo MC, Blanco B. 1999. Establecimiento de los parámetros para producción semi-industrial del hongo Trichoderma harzianum, utilizado en control biológico. Tesis de pregrado para optar al título de Microbiólogo Industrial. Pontificia Universidad Javeriana. Facultad de Ciencias. Departamento de Microbiología. Bogotá, Colombia. Betbeze CM, Wu CC, Krohne SG, Stiles J. 2006. In vitro fungistatic and fungicidal activities of silver sulfadiazine and natamycin on pathogenic fungi isolated from horses with keratomycosis. American Journal of Veterinary Research, 67: 1788 – 1793. Bueno L, Gallardo R. 1998. Preservación de hongos filamentosos en agua destilada estéril. Revista Iberoamericana de Micología, 15: 166 – 168. Calado NB, Sousa F Jr., Gómez NO, Cardoso FR, Zaror LC, Milan EP. 2005. Fusarium nail and skin infection: a report of eight cases from Natal, Brazil. Mycopathologia, 161 (1): 27 – 31. Caracuel Z, Roncero MIG, Espeso EA, González-Verdejo CI, García-Maceira FI, Di Pietro A. 2003. The pH signalling transcription factor PacC controls virulence in the plant pathogen Fusarium oxysporum. Molecular Microbiology, 48 (3): 765 – 779. Daniel W. 1997. Bioestadística: base para el análisis de las ciencias de la salud. Tercera edición. Editorial Limusa: Grupo Noriega Editores. Madrid. De Hoog GS, Guarro J, Gene J, Figueras MJ. 2000. Atlas of clinical fungi. Centraalbureau voor Shimmelculteres. Utrecht. Díaz G. 1997. Micotoxinas y micotoxicosis en salud humana y animal. Veterinaria al día, 2(1): 28–34; 2(3): 3–8 Di Pietro A, Roncero MIG. 2005. Temas de actualidad: Fusarium oxysporum: un modelo para el análisis de la patogénesis fúngica en plantas y humanos. Actualidad Sem, 37: 6–13. Elligott CR, Wilkie DA, Kuonen VJ, Bras ID, Neihaus A. 2006. Primary Aspergillus and Fusarium keratitis in a Holstein cow. Veterinary Ophthalmology, 9 (3): 175 – 178. Forero MC. 2007. Manual de laboratorio, Fitopatología. Facultad de Ciencias. Departamento de Microbiología. Pontificia Universidad Javeriana. Bogotá, Colombia. Franco M. 2006. Manual de prácticas de laboratorio, Micología. Facultad de Ciencias. Departamento de Microbiología. Pontificia Universidad Javeriana. Bogotá, Colombia. Garcés de Granada E, Orozco de Amézqita M, Bautista GR, Valencia H. 2001. Fusarium oxysporum el hongo que nos falta conocer. Acta Biológica Colombiana, 6 (1): 30 – 33.
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