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Evaluación del desarrollo embrionario de ovocitosbovinos madurados y fecundados in vitroobtenidos a partir de hembras mestizas

Evaluation of embryonic development of bovine oocytesin vitro matured and fertilized obtained

from crossbred females

F.J. Báez Contreras1, J.A. Landinez Aponte1, H.J. Hernández Fonseca2 yP.C. Villamediana Monreal*1.

1Laboratorio de Citogenética, Departamento de Biología, FacultadExperimental de Ciencias, Universidad del Zulia. Maracaibo,Venezuela.2Laboratorio de Fecundación In Vitro, Unidad de Investigación deBiotecnología Animal (UNIBIO), Facultad de Ciencias Veterinarias,Universidad del Zulia. Maracaibo, Venezuela.

Resumen

El objetivo de este trabajo fue evaluar el desarrollo, calidad y condicionesde cultivo de embriones bovinos producidos in vitro (PIV). Para ello, se recupe-raron los ovarios de hembras mestizas sacrificadas en un matadero comercial.Fueron seleccionados los ovocitos con al menos una capa de células del cumulusy citoplasma homogéneo, para luego ser madurados, fecundados y cultivados invitro. Tras 48 horas post-inseminación (hpi) se determinó la tasa de divisiónembrionaria y a los 7 días de cultivo se valoró el porcentaje de blastocistos. Ungrupo de embriones continuaron en cultivo hasta el día 8 para evaluar las con-diciones de cultivo sobre el número y calidad de blastómeras. Todos los embrio-nes fueron sometidos a una doble tinción diferencial con Hoechst 33342 (10µg.mL-1)+ ioduro de propidio (IP) (10 µg.mL-1) para determinar el total deblastómeras (azules), consideradas intactas, e identificar las que mostraronmembrana alterada (rojas). El porcentaje de división embrionaria a las 48 hpifue de 62,61%. A los 7 d de cultivo (8d pi), el números de blastocistos fue de 76,equivalente al 18,18%. Se encontraron diferencias estadísticamente significa-tivas (P<0,05) en el número total de células con membrana normal (103,6±9;112,2±13,5) y positivas a IP (4,05±2,3; 9,8±6,2) a los 7 y 8 d de cultivo, respecti-

Recibido el 18-7-2009 Aceptado el 9-3-2010*1Autor de correspondencia e-mail: patriciavillamediana@cantv.net

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vamente. La calidad de los embriones PIV valorada mediante la tinción dife-rencial demostró que la mayoría de las blastómeras no mostró alteración demembrana. Es el primer reporte que se realiza sobre PIV de embriones bovinospara la región zuliana.Palabras clave: blastocisto, bovinos, in vitro, calidad embrionaria.

Abstract

The aim of this study was to evaluate the development, quality and cultureconditions of IVP bovine embryos. Ovaries of crossbred females collected in acommercial slaughterhouse were transported to the laboratory. Oocytes withat least one layer of cumulus cells and homogeneous cytoplasm were selected,and then matured, fertilized and cultured in vitro. After 48 h post-insemination(pih) the cleavage rate and blastocysts rate at day 7 after pi was determined. Agroup of embryos remained in culture until day 8 to evaluate the cultureconditions on the number and quality of blastomeres. All embryos were subjectedto a double differential staining with Hoechst 33342 (10 mg.mL-1) + propidiumiodide (PI) (10 mg.mL-1) to determine the total number of blastomeres (blue),intacts or with altered cell membrane (red). The cleavage rate after 48 pih was62.61%. Whereas after day 7 of cultivation (8d pi), the number of blastocystwas 76, equivalent to 18.18%. Differences were statistically significant (P<0.05)in the total number of cells with normal membrane (103.6±9; 112.2±13.5) andpositive IP (4.05±2.3; 9.8±6.2) for 7d and 8d of culture, respectively. The qualityof IVP embryos measured by double staining demonstrate that most of theblastomeres no alteration cell membrane. This is the first report that for donein vitro production (IVP) of bovine embryos from the Zulian region.Key words: blastocyst, bovine, in vitro, embryo quality.

Introducción

En las últimas décadas se hanrealizado considerables esfuerzos enponer a punto los procedimientos demaduración (De Wit y Kruip, 2001),fecundación (Sagirkaya et al., 2007)y cultivo in vitro (MIV-FIV-CIV) parala PIV de embriones bovinos (Pereiraet al., 2005). La aplicación a gran es-cala de estas biotecnologíasreproductivas puede representar unamejora notable de los recursos gana-deros al permitir obtener animalescon mejores características de impor-

Introduction

Remarkable efforts have beencarried out last decades with thepurpose of improving the maturation(De Wit and Kruip, 2001), fecundation(Sagirkaya et al., 2007) and in vitroculture procedures (MIV-FIV-CIV) forthe IVP of bovine embryos (Pereira etal., 2005). The high scale applicationof these reproductive biotechnologiescan represent an improvement oflivestock resources because theypermit to obtain animals with bettercharacteristics of economic

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tancia económica, resolviendo de ma-nera importante el problema de la dis-ponibilidad de alimentos, la conserva-ción y salvaguarda de la variabilidadgenética.

Cada vez es más evidente la im-portancia del componente racial sobrelos eventos fisiológicos del embrión ylos gametos que le dan origen, y dadala importancia de la ganadería mes-tiza en el país, a causa de las limita-ciones del tipo ambiental y en buscade animales más productivos y renta-bles en estos ambientes tropicales; sehace prioritario caracterizar la in-fluencia de dicho componente sobre lacapacidad de desarrollo de ovocitosbovinos provenientes de hembrasmestizas.

Los ovocitos recuperados de ova-rios recogidos en matadero se han con-vertido en una fuente ampliamenteusada para las biotecnologíasreproductivas entre las que se inclu-yen además de la producción in vitrode embriones, el clonaje y latransgenia. El establecimiento de pro-gramas de PIV de embriones bovinostiene un gran potencial como métodopara obtener un elevado número deembriones en el mismo estadio de de-sarrollo, tanto para su utilización co-mercial como para estudios básicos(Lonergan y Fair, 2008).

A pesar de haber superado mu-chas de las dificultades que se presen-taron en sus inicios, y de que muchoslaboratorios han sido capaces de pro-ducir eficientemente embriones invitro (Meirelles et al., 2004), estos pre-sentan un desarrollo y calidad másbajos que los obtenidos in vivo. Exis-ten muchos factores que pueden in-terferir en el desarrollo normal del

importance, solving the feedingavailability problem, the conservationand safeguard of genetic variability.

Any time is more evident theimportance of race component onphysiological events of embryo andgametes gives origin to them, and dueto the importance of crossbreedlivestock in country, becauseenvironmental limitations and alsolooking for more productive andprofitable animals in these tropicalenvironments; it is very important tocharacterize the influence of thiscomponent on capacity of bovineovocytes development coming fromcrossbreeds females.

Ovocytes taken from ovariescollected in slaughterhouse hasbecome on a widely used source forreproductive biotechnologies thatincludes besides of in vitro productionof embryos, cloning and transgenics.The establishment of IVP programsof bovine embryos has a high potentialas a method to obtain a high numberof embryos in the same developmentstage, as well commercial use as basicstudies (Lonergan and Fair, 2008).

Despite to exceed many ofdifficulties showed at the beginning,and many laboratories have beencapable of producing in vitro embryosin an efficient way (Meirelles et al.,2004), these shows a lowerdevelopment and quality than thoseobtained in vivo. There are manyfactors that interfere on normaldevelopment of embryo, just likecultivation conditions that becomes indetention of cleavage and blocking offour or fifth cellular cycle (Warzychet al., 2007) or in the appearance ofblastocysts with altered membranes

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embrión, como lo son las condicionesde cultivo, que se traduce en la deten-ción de la división embrionaria y elbloqueo del cuarto o quinto ciclo celu-lar (Warzych et al., 2007) o en la apa-rición de blastómeras con membranasalteadas (Pomar et al., 2005). Estafalla está directamente relacionadacon la competencia para el desarrollode los embriones en estadio deblastocisto, y no está limitada a losbovinos sino que también persiste enhumanos (Chenoweth, 2007).

El desarrollo in vitro de embrio-nes ha supuesto una fuente constan-te de dificultad, particularmente enlos embriones producidos por MIV/FIV. Es difícil determinar si el desa-rrollo deficiente de los embriones esdebido directamente a las condicionesde cultivo subóptimas o si es el resul-tado de una reducción de la compe-tencia para el desarrollo de losovocitos madurados y fecundados invitro, ya que parece ser que existenfactores moleculares, celulares y/ogenéticos, intrínsecos al ovocitos y/oembrión, que poseerían un papel mu-cho más significativo en la determi-nación del potencial de desarrollo quelas condiciones de cultivo (Wang et al.,2005; Lonergan, 2006). En muchassituaciones, una reducción en la com-petencia para el desarrollo y/o condi-ciones subóptimas de cultivo se com-binan para producir un retraso en losembriones, anormalidades en el desa-rrollo y una reducción de la viabili-dad (Lonergan et al., 2003; Zhang etal., 2009).

Los factores críticos para lasobrevivencia de los embriones bovi-nos son varios y entre ellos se encuen-tran: la temperatura, luminosidad y

(Pomar et al., 2005). This failure isdirectly related to the competence forembryos development in blastocyststage, and it is not limited to bovinebut also it is possible to be found inhumans (Chenoweth, 2007).

The in vitro embryosdevelopment supposes a constantdifficulty source, particularly inembryos produced by MIV/FIV. It isdifficult to determine if deficientembryos development is due to thesub-optimum cultivation conditions orit is the result of a reduction ofcompetence for ovocytes developmentof mature and in vitro fertilized sincemolecular and/or genetics could beinvolved, intrinsic to ovocyte and/orto the embryo, that shows asignificant role in determination ofdevelopment potential in comparisonto cultivation conditions (Wang et al.,2005; Lonergan, 2006). In manysituations, a reduction in competencefor development and/or cultivationsub-optimum conditions are combinedin order to produce a delay onembryos, abnormalities indevelopment and a reduction ofviability (Lonergan et al., 2003; Zhanget al., 2009).

The critical factors for survivalof bovine embryos are several andamong them it is possible to find:temperature, luminosity and gaseousatmosphere (Corrêa et al., 2008). Lasttwo decades, substantialimprovements about embryocultivation medium has beenregistered, based on formulation ofideal concentration of ions, cationsand metabolic substrates need fordevelopment of pre-implantedembryos (Gilchrist and Thompson,

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atmósfera gaseosa (Corrêa et al.,2008). Se han registrado mejorassubstanciales de los medios de culti-vo de embriones en las dos últimasdécadas, basándose en la formulaciónde la concentración idónea de iones,cationes y sustratos metabólicos ne-cesarios para el desarrollo de embrio-nes preimplantacionales (Gilchrist yThompson, 2007). La capacidad de losembriones para desarrollarse en unmedio en particular no es necesaria-mente un indicativo de la preferenciadel ambiente, en cambio, puede sersimplemente el reflejo de su capaci-dad para tolerar condiciones artificia-les (Duque et al., 2003). Aunque losembriones bovinos pueden ser culti-vados in vitro en un medio simple bajocondiciones definidas, lasuplementación con suero o albúmi-na sérica bovina (BSA) han demostra-do ejercer un efecto beneficioso sobreel desarrollo embrionario.

La literatura concerniente a lacalidad de los embriones bovinos cadavez es más abundante (Sirard et al.,2006). Típicamente, los embrionesPIV poseen un citoplasma más oscu-ro y menor densidad como consecuen-cia de un alto contenido de lípidos, unazona pelúcida más frágil, diferenciasen el metabolismo y una alta inciden-cia en las alteraciones cromosómicas,así como diferencias a nivelultraestructural que explicarían lascaracterísticas anteriormente nom-bradas (Lonergan, 2006). Frecuente-mente el éxito del sistema de cultivosuele ser medido en función de la tasade división embrionaria (Shoukir etal., 1997), del número de embrionesque alcanzan el estadio de blastocistos(Mucci et al., 2006), ya que esta fase

2007). The embryos capacity to bedeveloped in particular medium is notnecessarily a sample of environmentalpreference, in contrast, could besimply reflect of its capacity totolerate artificial conditions (Duqueet al., 2003). Even though bovineembryos can be in vitro cultivated ina simple medium under definedconditions, the supplementation withserum or serum bovine albumin (BSA)has proved a beneficial effect oncleavage development.

The literature related to thequality of bovine embryos is moreabundant any time (Sirard et al.,2006). Typically, the IVP embryoshave a darker cytoplasm and lowerdensity as a consequence a high lipidscontent, a more fragile pellucida area,differences in metabolism and a highincidence on chromosomalalterations, likewise differences atultra-structural level that wouldexplain those previously namedcharacteristics (Lonergan, 2006).Frequently, the successful ofcultivation system is usuallymeasured respect to the embryocleavage rate (Shoukir et al., 1997),of embryo number reachingblastocysts stage (Mucci et al., 2006),since phase represent the first visibleindicator of divergence developmentof two different cellular lines, thetrophectoderm (TE) and the internalcellular mass (ICM) (Cesari et al.,2006).

The IVP embryos shown areduced viability, the pregnancy ratesfollowed by transference are generallylow, there is high fetal losses, manycongenital abnormalities, thephenomenon called syndrome of giant

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representa el primer indicador visi-ble de la divergencia en el desarrollode dos líneas celulares distintas, eltrofoectodermo (TE) y la masa celu-lar interna (MCI) (Cesari et al., 2006).

Los embriones PIV presentanuna viabilidad reducida, las tasas depreñez seguida de la transferencia songeneralmente bajas, existen altas pér-didas fetales, muchas anormalidadescongénitas, el fenómeno llamado sín-drome del becerro gigante, entre otros(Lonergan y Fair, 2008). Las causasde estos trastornos aún permanecensin descifrarse, pero entre las diferen-cias más estudiadas están una altafrecuencia de mixoploidías, célulaspoliploides entre las células diploidesde los blastocistos producidos in vitro(72-96%) comparado con losblastocistos producidos in vivo (25%),anomalías detectadas mediante aná-lisis con hibridación in situ fluores-cente (FISH) (Jakobsen et al., 2006).

Cada vez es más frecuente el usode tinciones diferenciales para deter-minar la calidad de los blastocistos,con la tinción y cuantificación del nú-mero de blastómeras: TE y MCI (Limet al., 2007). La prueba de apoptosises la de mayor frecuencia, en la quedestacan: la fragmentación del DNA(TUNEL, Terminal deoxynucleotidiltransferase dUTP Nick and labeling),seguida del análisis de condensaciónde la cromatina, y ploidía (tinción conGiemsa 4%), en busca de embrioneshaploides (n), diploides (2n),poliploides (>3n) (Wang et al., 2008).El objetivo de este trabajo fue evaluarel efecto de las condiciones de cultivoempleadas para la PIV de embrionesbovinos obtenidos a partir de hembrasmestizas sobre el porcentaje de

calf, among others (Lonergan andFair, 2008). Cells of this disorders arestill not decipher, but between themore studied differences are a highfrequency of mixoploid, polyploid cellsamong diploid cells of blastocystsproduced in vitro (72-96%) comparedto blastocysts produced in vivo (25%),anomalies detected through analysiswith in situ fluorescent hybridization(FISH) (Jakobsen et al., 2006).

Nowadays, the use of differentialdyes is more frequent in order to de-termine blastocysts quality, with dyeand quantification of number ofblastomeres: TE and ICM (Lim et al.,2007). Apoptosis test is the morefrequent: DNA fragmentation (TU-NEL, Terminal deoxynucleotidiltransferase dUTP Nick and labeling),followed by analysis of chromatincondensation, and ploidy (Giemsadying 4%), looking for haploid (n),diploid (2n), and polyploid embryos(>3n) (Wang et al., 2008). The purposeof this research was to evaluate theeffect of cultivation conditions used forIVP of bovine embryos obtained fromcrossbreed females on blastocystspercentage and the number andquality of blastomeres through the useof double differential dye.

Materials and methods

Obtaining and selection ofoocytes: Slaughtered cow ovarieswere collected and moved to thelaboratory in PBS + gentamicin (50mg.L-1) ay 35-37°C on isothermicrecipient. Once in laboratory, theovaries were three times washedusing PBS + gentamicin (50 mg.L-1)at 35-37°C. The cumulus-ovocyte

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blastocistos y el número y calidad deblastómeras mediante el empleo de ladoble tinción diferencial.

Materiales y métodos

Obtención y selección de losovocitos: se recogieron ovarios de va-cas sacrificadas en matadero comer-cial y transportados al laboratorio enPBS + gentamicina (50 mg.L-1) a 35-37°C en recipientes isotérmicos. Unavez en el laboratorio, los ovarios fue-ron lavados tres veces con PBS +gentamicina (50 mg.L-1) a 35-37°C.Los complejos cumulus-ovocito(COC´s) fueron recuperados median-te la técnica de slicing, que consisteen cortar sucesivamente la superficiedel ovario con una hoja de bisturí enuna placa de petri conteniendo medioTCM-199 (M2520, Sigma) suplemen-tado con 2.2 mg.mL-1 NaHCO3, 50mg.L-1 gentamicina (G1397, Sigma) y11.1 mg.L-1 de heparina (H9399,Sigma), liberándose así ovocitos pro-venientes de folículos de cualquiertamaño. Fueron seleccionados, bajoun microscopio estereoscópico aque-llos COC´s con mayor tamaño, al me-nos una capa completa de células delcumulus compacto y citoplasma ho-mogéneo.

Maduración in vitro deovocitos: el medio de maduración fueel TCM-199 (31.100-027, Gibco) suple-mentado con 275 mg.L-1 de piruvatosódico (815990, Fluka), 50 mg.L-1 degentamicina (G1397, Sigma), 146mg.L-1 de L-glutamina (G-5763,Sigma), 10 µg.mL-1 de LH (Profasi®),1 µg.mL-1 de 17b-estradiol (E-2758,Sigma) y 10% de suero fetal bovino(FBS). Los COC´s fueron cultivados

(COC´s) complexes were recoveredthrough slicing technique, thatconsist on the successive count of theovary surface with a scalpel blade ina Petri dish having TCM-199 medium(M2520, Sigma) supplemented with2.2 mg.mL-1 NaHCO3, 50 mg.L-1

gentamicin (G1397, Sigma) and 11.1mg.L-1 heparin (H9399, Sigma),releasing this way ovocytes comingfrom any size follicles. Those COC´sweight higher size were selected byusing electroscopic microscope, atleast a total layer of cells from the to-tal cumulus and homogeneouscytoplasm.

In vitro maturation ofoocytes: the medium was TCM-199(31.100-027, Gibco) supplementedwith 275 mg.L-1 of sodium pyruvate(815990, Fluka), 50 mg.L-1 gentamicin(G1397, Sigma), 146 mg.L-1 of L-glutamine (G-5763, Sigma), 10 µg.mL-

1 of LH (Profasi®), 1 µg.mL-1 of 17b-stradiol (E-2758. Sigma) and 10% ofbovine fetal serum (FBS). COC´s werecultivated in groups of 12 in microdrops of 50 µL medium covered withmineral oil (M8410, Sigma) during 24hours to 38.5ºC in an atmosphere with5% CO2 in humidity air saturated(Marquant et al., 1989). A sample wastaken to value the meioticprogression. The ovocytes weredenudated from cumulus cells bymechanical agitation and after fixedon methanol: acetic acid (3:1) during48 h at least. They were died withaceto-orceína at 1.1%, being evaluatedunder optical microscope (OlympusCX31, Japón) (400X), and later, theywere classified according to themeiotic stage reached: matures(MII+CP, TeloI) and immature

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en grupos de 12 en microgotas de 50µl de medio cubiertas con aceite mi-neral (M8410, Sigma) durante 24 ho-ras a 38.5ºC en una atmósfera con 5%CO2 en aire saturado de humedad(Marquant et al., 1989). Se tomó unamuestra para valorar la progresiónmeiótica. Los ovocitos fueron denuda-dos de las células del cumulus poragitación mecánica y fijados en unamezcla de metanol: ácido-acético (3:1)durante al menos 48 h. se tiñeron conaceto-orceína al 1.1% evaluando bajomicroscopio óptico (Olympus CX31,Japón) (400X), clasificándolos segúnel estadio meiótico alcanzado: madu-ros (MII+CP, TeloI) e inmaduros(anafase I, metafase I, condensacióncromosómica y en VG). Aquellos queno pudieron ser incluidos en los gru-pos anteriores fueron consideradoscomo degenerados.

Fecundación in vitro: losCOC´s madurados fueron lavados dosveces en el medio TL-Semen, para lue-go ser trasladados en grupos de 25 aplacas con gotas de 100 mL de medioTL-IVF (suplementado con 6 mg.mL-1

de BSA, libre de ácidos grasos, SigmaA6003, 30 µg.mL-1 de heparina(H3149, Sigma) y penicilamina,hipotaurina y epinefrina (PHE), cu-biertas con aceite mineral. Para laselección de los espermatozoides seutilizó semen congelado de toros deprobada fertilidad. Una vez descon-geladas las pajuelas (a 37ºC x 30 se-gundos) se centrifugaron a 300 xgdurante 5 minutos en medio TL-Se-men, se descartó el sobrenadante y elpellet de espermatozoides fué lavadonuevamente centrifugado en medioTL-Semen a 300 xg por 5 minutos. Sedescartó el sobrenadante y se deter-

(anaphase I, metaphase I,chromosomal condensation and inVG). Those cannot be included onprevious groups were considered asdegenerated.

In vitro fertilization: COC´smature were twice in TL-Semenmedium, for after be moved in groupsof 25 toward dishes with drops of 100mL of TL-IVF medium (supplementedwith 6 mg.mL-1 of BSA, fatty acidsfree, Sigma A6003, 30 µg.mL-1 ofheparin (H3149, Sigma) andpenicilamine, hypotaurine andepinephrine (PHE), covered with mi-neral oil. Frozen sperm from fertilebulls was used to selectspermatozoids. Frozen-thawed semenstraw (at 37ºC x 30 seconds) werecentrifuged to 300 xg during 5 min onTL-Semen medium, the supernatantwas discarded and the spermatozoidspellet was again washed centrifugedon TL-Semen medium to 300 xgduring 5 min. The supernatant wasdiscarded and sperm concentrationwas determined with a Neubauercamera for after be diluted on TL-IVFmedium until reaching aconcentration of 10x104

spermatozoids by micro-drop of TL-IVF. Gametes were cultivated during18h at 38.5ºC on atmosphere with 5%of CO2 in moisture saturated air. Asample of assumed zygotes was takenat 18 pih and it was processed justlike ovocytes, to value the FIV ratefollowing the classification describedby Martino et al. (1996).

In vitro embryos culture:Separation of cells from cumulus wasdone 18h after fecundation andspermatozoids adhered to the surfaceof assumed zygotes through

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minó la concentración espermáticacon una cámara de Neubauer paraluego ser diluidos en medio TL-IVFhasta alcanzar una concentración de10x104 espermatozoides pormicrogota de TL-IVF. Los gametosfueron cultivados durante 18h, a38.5ºC en una atmósfera con 5% deCO2 en aire saturado de humedad. Alas 18 hpi se tomó una muestra de lospresuntos cigotos y fueron procesadosal igual que los ovocitos, para valorarla tasa de FIV, siguiendo la clasifica-ción descrita por Martino et al. (1996).

Cultivo in vitro de embrio-nes: a 18h después la fecundación seprocedió a la separación de las célulasdel cumulus y los espermatozoides ad-heridos a la superficie de los presun-tos cigotos mediante agitación mecá-nica en medio TL-Semen. Una vez li-bres o con al menos una capa de célu-las del cumulus, los presuntos cigotosfueron lavados dos veces en el mismomedio y fueron depositados, en grupode 25, en gotas de 100 mL medio SOF(suplementado con 5 mg.mL-1 de BSA,EFAF, A6003, Sigma, 20ml de EAA,10 mL de NEAA, 10 mL de L-Glutamina y 2,5% de SFB), cubiertascon aceite mineral e incubados 38.5ºC,5% de CO2 y aire saturado de hume-dad durante 7 días (8d pi) y recambiode medio SOF fresco al tercer y quin-to día de cultivo.

Evaluación de la división ydesarrollo embrionario: la tasa dedivisión embrionaria se evaluó a las48h pi, tomándose en cuenta para elloel total de embriones de 2 o más célu-las obtenidos en relación al total deovocitos puestos a fecundar. Tras 7 y8d de cultivo (8 y 9d pi, respectiva-mente), todos los embriones fueron

mechanical agitation on TL-Semenmedium. Once free or at least a cellslayer from cumulus, the assumedzygotes were twice washed in thesame medium were deposited on agroup of 25, in drops of 100 mL SOFmedium (supplemented with 5mg.mL-1 of BSA, EFAF, A6003,Sigma, 20 mL of EAA, 10 mL ofNEAA, 10 mL of L-Glutamine and2.5% of SFB), covered with mineraloil and incubated at 38.5ºC, 5% of CO2and moisture saturated air during 7days (8d pi) and rechange of fresh SOFmedium on third and fifth cultivationday.

Evaluation of division andembryo development: the cleavagerate was evaluated at 48h pi, takinginto account the total of embryos of 2or more cells obtained in relation tothe total of ovocytes were fertilized,after 7 and 8 cultivation days (8 and9d pi, respectively). All the embryoswere observed under stereoscopicmicroscope (Olympus, SZX12, Japan)and blastocysts were put apart fromthe rest of embryos, to avoid confusionduring valuation of cleavagedevelopment. A double fluorescentdying was used (Hoechst 33342 +iodine propidium) with the purpose ofdetermining the total number ofcleavage cells with altered cellmembrane. Methodology described byMucci et al. (2006) was used. Embryoswere incubated at 38.5ºC during 15min on SOF medium supplementedwith 10 mg.mL-1 iodine propidiumfixed to 70% during 5 min, and thenmoved on absolute ethanol + 10mg.mL-1 bisbenzimide (Hoechst33342, Sigma) during 5 min more atenvironmental temperature. They

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observados bajo microscopioestereoscópico (Olympus, SZX12, Ja-pón) y los blastocistos se separaron delresto de los embriones, para evitarconfusión durante la valoración deldesarrollo embrionario. Se utilizó unadoble tinción fluorescente (Hoechst33342 + ioduro de propidio) con el pro-pósito de determinar el número totalde células embrionarias y el númerode células con membrana celular al-terada. La metodología utilizada fuela descrita por Mucci et al. (2006). Losembriones fueron incubados a 38.5ºCpor 1 5 minutos en medio SOF suple-mentado con 10 mg.mL-1 ioduro depropidio, fijados en etanol al 70% por5 minutos, y luego transferidos enetanol absoluto + 10 mg.mL-1

bisbenzimide (Hoechst 33342, Sigma)por otros 5 minutos a temperaturaambiente. Se pasaron a una gota deaceite de inmersión (Olympus, Japón)sobre un portaobjeto y cubiertos concubreobjeto para ser sellados con es-malte de uñas. Las láminas fueronvaloradas bajo un microscopio de fluo-rescencia (Olympus, BX41, Japón) confiltros para visualizar ambastinciones. Las células teñidas con IP(color rojo) fueron consideradas conmembrana alterada, mientras que lasteñidas con Hoechst 33342 (color azul)fueron consideradas intactas.

Análisis Estadístico: fueronrealizadas cinco repeticiones. Elconteo de células embrionarias alte-radas y normales se analizaron conun ANOVA del paquete estadísticoSAS® y las medias fueron compara-das usando el test de Tukey. Las dife-rencias entre las frecuencias se con-sideraron significativas para valoresde P menores a 0,05.

were moved into a drop of immersionoil (Olympus, Japan) over a slide andthey were sailed with nail varnish.Layers were valued under afluorescent microscope (Olympus,BX41, Japan) with filters to visualizeboth dying. The cells dyed with IP (redcolor) were considered with alteredmembrane, whereas those dyed withHoechst 33342 (blue color) wereconsidered as untouched.

Statistical analysis: Fivereplications were accomplished. Thealtered and normal cleavage cellscount was analyzed with ANOVA ofstatistical program SAS® and meanswere compared using the Tukey test.Differences between frequencies wereconsidered significant foe P valueslower than 0.05.

Results and discussion

A total of 802 ovocytes wereevaluated in this research. Thematuring percentage obtained was68.85% (table 1), a superior result incomparison to those obtained byRodríguez et al. (2004) and Báez et al.(2008) on similar conditions and usingovaries from slaughtered crossbredsfemale. A rate of 7.1% of ovocytesnormally fecundated was observed at18 pih, with a percentage of 12.2%abnormal penetrations (table 2). After48 pih the embryo division rate was62.61%. 44.93% corresponded toembryos of 4 cells, followed by 17.39%of 2 cells and 0.3% for the stage of 8cells. At 7 days cultivation (8 d pi),the number of embryos obtained was160, distributed as follows, 37embryos of 2-4 cells representing8.85%, 12 of 8-16 cells with 2.87%, 34

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Resultados y discusión

Un total de 802 ovocitos fueronevaluados en este trabajo. El porcen-taje de maduración obtenido fue de68,85% (cuadro 1), resultado superiora los obtenidos por Rodríguez et al.(2004) y Báez et al. (2008) bajo condi-ciones similares y empleando los ova-rios de hembras mestizas sacrificadasen matadero. A las 18 hpi se observóun una tasa de 57,1% de ovocitos nor-malmente fecundados, con un porcen-taje de 12.2% de penetraciones anor-males (cuadro 2). Tras 48 hpi la tasade división embrionaria fue de62,61%. El 44,93% correspondieron aembriones de 4 células, seguido de un17,39% de 2 células y de 0,3% para elestadio de 8 células. A los 7 días decultivo (8 d pi), el número de embrio-nes obtenidos fue de 160, distribuidoscomo sigue, 37 embriones de 2-4 célu-las representando un 8,85%, 12 de 8-16 células con un 2,87%, 34 mórulasalcanzando un 8,13%, 76 blastocistosequivalente al 18,18% (figura 1) y 1blastocisto eclosionado, representan-do un 0,24%. De los 77 blastocistosproducidos, setenta y seis fueron fija-dos y teñidos con la doble tinción di-ferencial para evaluar el número ycalidad de las blastómeras. Sólo 34embriones lograron valorarse, 17 co-rrespondieron al día siete de cultivo(8 d pi) y 17 al día 8 de cultivo (9 d pi).En el cuadro 3 se muestra la distri-bución del número y calidad deblastómeras, después del análisis conla tinción diferencial, tras 7 y 8 díasde cultivo. En los embriones cultiva-dos por 8 días el número de célulasnormales y con membrana alteradaresultó más alto (P<0,05) que el conteo

morula reaching 8.13%, 76 blastocystsequivalent to 18,18% (figure 1) and 1hatched blastocyst, representing0.24%. From 77 blastocysts produced,76 were fixed and dyed with doubledifferential dying to evaluate theumber and quality of blastomeres.Only 34 embryos were valued, 17 co-rresponded to day 7 (8 d pi) and 17 today 8 of cultivation (9 d pi).Distribution of number and quality ofblastomeres is shown in table 3, afteranalysis with differential dying, after7 and 8 days of cultivation. In thoseembryos cultivated during 8 days thenumber of normal cells and withaltered membrane was higher(P<0.05) than count for embryos with7 days of cultivation. The percentageof blastocysts just like the totalnumber of blastomeres at 7 days ofcultivation, obtained in this researchwere similar to those obtained by Asa-da et al. (2002), Sugiyama et al.(2003), Pomar et al. (2005), Morató etal. (2008), Wang et al. (2008), withaverage of 23% of blastocysts and 105from total of blastomeres at 7 days ofcultivation.

There are several authors thatuse IP dying to value the effects ofequines (Tharasanit et al., 2006) andbovines (Pomar et al., 2005; Mucci etal., 2006; Cesari et al., 2006; Lim etal., 2007) embryos vitrifying,increasing this way those researchesvaluating the cleavage selfpreservation, measured by theintegrity of membrane through vitaldying, using only one or thecombination of several fluorochromesin fresh or cryo preserved bovineembryos in vitro and in vivo produced.In this research, in relation to the

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para los embriones con 7 días de cul-tivo. El porcentaje de blastocistos aligual que el número total deblastómeras a los 7 días de cultivo,obtenidas en el presente trabajo fue-ron similares a los obtenidos por Asa-da et al. (2002), Sugiyama et al.(2003), Pomar et al. (2005), Morató etal. (2008), Wang et al. (2008), con pro-medio de 23% de blastocistos y de 105de total de blastómeras a los 7 díasde cultivo.

Figura 1. Blastocistos bovinos PIV de 7d de cultivo.

Figure 1. Bovine blastocystes IVP of 7d cultivation.

number of blastomeres positive to IP,a mean of 4.04±2.3 was found forembryos of 7 days of cultivation whichwas significant higher (P<0.05) whencompared to embryos keep oncultivation until day 8 (9.88±6.2) (fi-gure 2). In Kaidi et al. (1999) research,they report that embryos of control,subject of double dying (IP + Hoechst33342), shown a proportion of cellsdyed with IP of 0.1±1.8, and in thegroup of embryos treated with

Cuadro 3. Número y calidad de blastómeras de embriones PIV.

Table 3. Number and quality of PIV embryo blastomers.

Días No. Embriones Total No. No. de células No. célulasde cultivo teñidos Células con membrana con membrana

normal alterada

7 17 107,7±8,8 103,6± 9,0b 4,05±2,3b

8 17 122,1±12,2 112,2±13,5a 9,8±6,2a

(%) a,b: valores en la misma columna con diferentes superíndices difieren significativamente(P<0,05).

Báez Contreras et al.

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Son varios los autores que em-plean la tinción con IP para valorarlos efectos de la vitrificación en em-briones equinos (Tharasanit et al.,2006) y bovinos (Pomar et al., 2005;Mucci et al., 2006; Cesari et al., 2006;Lim et al., 2007), siendo cada vez más,los trabajos que valoran lasobrevivencia embrionaria, medidapor la integridad de la membrana através de la tinción vital, empleandouno o la combinación de variosfluorocromos en embriones bovinosfrescos o criopreservados producidosin vitro e in vivo. En este trabajo, encuanto al número de blastómeras po-sitivas a IP, se encontró una mediade 4,04±2,3 para los embriones de 7días de cultivo, la cual resultósignificativamente mayor (P<0,05) alcompararla con los embriones que si-guieron en cultivo hasta el día 8(9,88±6,2) (figura 2). En el trabajo rea-

Figura 2. Evaluación de la calidad embrionaria (7 días de cultivo)(1000X). Grupo control: (a) Blastocisto de 96 células, b)blastocisto con células normales (azules) y células alteradas(rojas).

Figure 2. Evaluation of embryonnaire quality (7 cultivation days)(1000X). Control group: (a) Blastocyst of 96 cells, b) blastocystwith normal cells (blues) and altered cells (reds).

different cryo protectors theproportions oscillate between 1.5±1.8and 31.7±1.7, when they were subjectof different concentrations of galactose,concluding that the alteration ofmembrane appears when embryos areexposed to an osmotic shock caused byhigh concentrations of cryo protector,in a 1200 mOsm solution. Mucci et al.(2006), shown a mean of 2±0.5 (1.8%)cells with altered membrane for thecontrol, whereas for vitrified embryosappears values until 42.7±1.9 (42.8%),showing that only is caused by thedamage from N2L frozen and to thetoxic effect of cryo protector solutions.

Mori et al. (2006), noticed that5% of blastomeres, from group ofuntreated embryos, showedmembrane alteration, using IP +Hoechst 33342, that represent an ave-rage of 6 cells, indicating that thistype of alteration can be consequence

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lizado por Kaidi et al. (1999), repor-tan que los embriones del grupo con-trol, sometidos a la doble tinción (IP+ Hoechst 33342), muestran una pro-porción de células teñidas con IP de0,1±1,8, y en el grupo de embrionestratados con diferentescrioprotectores las proporciones osci-lan entre 1,5±1,8 y 31,7±1,7, cuandofueron sometidos a diferentes concen-traciones de galactosa, concluyendoque la alteración de las membranaaparecía cuando los embriones sonexpuestos a un shock osmótico propi-ciado por las altas concentraciones delcrioprotector, en una solución de 1200mOsm. Mucci et al. (2006), muestranuna media de 2±0,5 (1,8%) células conmembrana alterada para el grupocontrol, mientras que para los embrio-nes vitrificados aparecen valores dehasta 42,7±1,9 (42,8%), indicando queesto se debe al daño causado por lacongelación en N2L y al efecto tóxicode las soluciones crioprotectoras.

En el trabajo realizado por Moriet al. (2006), observaron que en el 5%de las blastómeras, del grupo de em-briones que no fueron sometidos a nin-gún tratamiento, mostraron altera-ción de membrana, utilizando IP +Hoechst 33342, lo que se traduce enun promedio de 6 células, manifestan-do que este tipo de alteración puedeser consecuencia de un daño o trau-ma celular, característico del desor-den en la estructura celular, que ini-cia con un hinchamiento como resul-tado de los cambios de permeabilidady que culmina con la ruptura de lamembrana.

En la valoración realizada porPomar et al. (2005), donde compara-ron la integridad de la membrana de

of a cell damage, characteristic ofdisorder in cell structure, beginningwith a blowing as a result ofpermeability changes and finish withbreaking of membrane.

In the valuation carried out byPomar et al. (2005), where theycompared the integrity of bovineembryos membrane in vivo and in vitroproduced and in fresh valued, theyfound a proportion of: 1.2±7.5 and4.5±7.5, respectively. This result wassimilar to that obtained in thisresearch. Authors says that celldamage percentage caused byblastocyst (based on results ofmembrane integrity and DNAfragmentation) was lower in embryosin vivo produced, compared with thosein Vitro produced, being concludedthat differences due to the source ofblastocysts obtaining are low, showingthe IVP technique of bovine embryosand taking into account that theappearance of cells with alteredmembrane reflect cultivationconditions, therefore, this double dyingcan be used like criterion for theanalysis of cultivation conditions,blastocysts quality test, becauseincludes total of blastomeres count andalso reveal cryo preservation effects.

Conclusions

The bovine ovocytes taken fromcrossbred female can be used for IVPof bovine embryos. Double differentialdying revealed most of blastomeres ofIVP bovine embryos did not showmembrane alteration and thesubsequent cultivation could increasethe number of blastomeres positive toIP. The incorporation of this type of

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embriones bovinos producidos in vivoe in vitro valorados en fresco, arroja-ron una proporción de: 1,2±7,5 y4,5±7,5, respectivamente. Este resul-tado fue similar a los obtenidos en esteestudio. Los autores indican que elporcentaje de daño celular porblastocisto (basándose en los resulta-dos de integridad de membrana y frag-mentación del DNA) fue más baja enlos embriones producidos in vivo, com-parados con los producidos in vitro,concluyendo que las diferencias debi-das a la fuente de obtención de losblastocistos es baja, evidenciando lapuesta a punto de la técnica de PIV deembriones bovinos y como la apariciónde células con membrana celular alte-rada es indicativo de las condicionesde cultivo, por lo que esta doble tinciónpuede ser utilizada como criterio parael análisis de las condiciones de culti-vo, prueba de calidad de blastocistos,ya que incluye el conteo del total deblastómeras y además revelar los efec-tos de la criopreservación.

Conclusiones

Los ovocitos bovinos provenien-tes de hembras mestizas pueden serutilizados para la PIV de embrionesbovinos. La doble tinción diferencialreveló que la mayoría de lasblastómeras de los embriones bovinosPIV no mostraron alteración de mem-brana y que el cultivo subsecuentepodría aumentar el número deblastómeras positivas a IP. Se reco-mienda la incorporación de este tipode tinción en los protocolos emplea-dos en los laboratorios de FIV paraevaluar las condiciones de cultivo so-bre la calidad embrionaria.

Agradecimientos

Los autores expresan su agrade-cimiento al Consejo de DesarrolloCientífico y Humanístico (CONDES)de la Universidad del Zulia por elfinanciamiento otorgado para la rea-lización de este trabajo.

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End of english version

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Acknowledgement

Authors are grateful for thesupport of the Consejo de DesarrolloCientífico y Humanístico (CONDES),Universidad del Zulia, by thefinancing of this research.

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