Evaluación in vitro de actividad antitumoral de … · El fundamento del método de reducción de...

Parra Forero D.

1

Evaluación in vitro de actividad antitumoral de compuestos de origen natural y sintético

sobre líneas celulares neoplásicas humanas.

Diana Alejandra Parra1, Fabio Ancízar Aristizabal

2

1Grupo de investigación de Farmacogenética del cáncer. Departamento de Farmacia. Facultad

de ciencias. Universidad Nacional de Colombia.

[email protected]

2

Doctor en Ciencias Biológicas. Grupo de investigación de Farmacogenética del cáncer.

Departamento de Farmacia. Facultad de ciencias. Universidad Nacional de Colombia.

[email protected]

RESUMEN

El cáncer es una de las principales causas de muerte en el mundo, razón por lo que se siguen

buscando nuevas opciones para su tratamiento. La evaluación de actividad citotóxica in vitro en

células tumorales humanas, se emplea como tamizaje de productos de diferente origen con miras

a detectar moléculas con potencial actividad antitumoral, siendo un componente importante de

estudios de fase preclínica para la selección y desarrollo de nuevos fármacos antitumorales. En

este estudio se evaluaron 48 productos de origen sintético (37) y natural (11), ensayados en tres

concentraciones distintas dependiendo de su origen: 1, 5 y 10µM para compuestos sintéticos y 6,

18 y 54µg/ml para productos de origen natural. Adicionalmente a un grupo de compuestos se les

evaluó a seis concentraciones: 0.1, 1, 5, 10, 50 y 100 µM para observar actividad citotóxica

diferencial. Los productos se ensayaron sobre cinco líneas tumorales humanas: PC-3, MDA-

MB231, HT-29, A549 y Hep G2 empleando una metodología fluorométrica fundamentada en la

reducción del colorante Resazurina para la valoración de la citotoxicidad; además se evaluó la

recuperación celular, con el fin de hacer una aproximación real al efecto de los tratamientos:

Evaluación in vitro de actividad antitumoral

citotóxico o citostático. Se encontraron compuestos con actividad citotóxica promisoria, que

sugieren su potencial uso quimioterapéutico.

Palabras Claves: Actividad citotóxica in vitro – Antitumorales – Resazurina - Recuperación

celular

ABSTRACT

Cancer is a leading cause of death in the world, why are still looking for new options for

treatment. The in vitro cytotoxic activity evaluation in human tumor cell lines, used as screening

products from different origin with antitumor activity, remains an important component of

preclinical studies for the selection and development of new antitumor drugs. In this study, we

evaluated 48 products of synthetic origin (37) and natural (11), tested at three different

concentrations according their origin: 1, 5 and 10μM for synthetic compounds and 6, 18 and

54μg/ml for products of natural origin. In addition, a group of compounds were evaluated at six

concentrations: 0.1, 1, 5, 10, 50 and 100μM to observe differential cytotoxic activity. The

products were tested on five human tumor cell lines: PC-3, MDA-MB231, HT-29, A549 and

Hep-G2 using a fluorometric method based on the reduction of resazurin dye for the assessment

of cytotoxicity, also evaluated cellular recovery in order to make an approach to the treatment

effect: cytotoxic or cytostatic. We found promising compounds with cytotoxic activity,

suggesting its potential chemotherapeutic use.

Keywords: In vitro cytotoxic activity - Antitumor - Resazurin - Recovery cell

Parra Forero D.

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INTRODUCCIÓN

El cáncer es una de las primeras causas de muertes en el mundo, 10.9 millones de personas son

diagnosticadas de cáncer cada año y se estima que hay 24.6 millones de personas que han

recibido el diagnóstico de cáncer en los últimos cinco años (1). Los tumores más comunes a nivel

mundial son el de pulmón (1.35 millones), mama (1.15 millones) y el colorrectal (1 millón); sin

embargo los que generan más mortalidad en orden de mayor a menor son el cáncer de pulmón, el

de estómago y el de hígado (2), datos que no difieren mucho de los reportados en Colombia,

donde también el cáncer de próstata ocupa un lugar relevante (3,4).

Después de años de constante descubrimiento y desarrollo, en la actualidad se cuenta con una

gran variedad de fármacos quimioterapéuticos, que han sido ampliamente utilizados. Sin

embargo, estas terapias se caracterizan por ser costosas, tener efectos secundarios no deseados (5)

y en casos reales generan tumores resistentes en los pacientes, donde estos tratamientos tienen

una efectividad limitada; es por todo esto, que se genera la necesidad de seguir buscando nuevas

opciones para el tratamiento del cáncer, dentro del quehacer investigativo farmacéutico.

En esa exhaustiva búsqueda de nuevas moléculas prototipo o cabezas de serie, se han sintetizado

nuevos compuestos y también se han aislado productos de origen natural. Los compuestos

semisintético y sintéticos con actividad antitumoral se han generado de modificaciones químicas

o síntesis química completa de compuestos de origen natural que se han logrado aislar, purificar y

han demostrado ser citotóxicos (6). La química medicinal inorgánica se ha convertido en un

campo creciente de investigación con numerosas aplicaciones en muchas ramas de la medicina

(7) y desde tiempos remotos ha permitido obtener compuestos sintéticos con un papel esencial en

el tratamiento del cáncer, como por ejemplo los derivados de platino (cisplatino) y así mismo ha


permitido la investigación y el desarrollo de nuevos compuestos sintéticos, es el caso de los

compuestos de coordinación, de los cuales algunos poseen promisoria actividad antitumoral (8).

En cuanto a los compuestos de origen natural, es importante resaltar que la medicina tradicional

ha sido una fuente reveladora de nuevas moléculas en el descubrimiento moderno de fármacos

antitumorales (9), es así como para el tratamiento de cáncer se utilizan derivados del taxol,

algunos derivados semisintéticos de los alcaloides de la vinca, derivados de la podofilotoxina,

entre otros (10). Se conoce, que las terapias que incluyen el uso de productos naturales, pueden

reducir efectos colaterales que se observan con los actuales antitumorales (11). Por todo lo

anterior es importante promover en Colombia la bioprospección para el descubrimiento de

nuevos fármacos antitumorales, aprovechando la gran diversidad biológica que posee y que es

considerada como fuente potencial de productos farmacológicamente activos, y conociendo que

a pesar de los esfuerzos de encontrar moléculas activas que minimicen los efectos secundarios, la

tasa de éxito se ha mantenido muy baja.

Los ensayos de evaluación de la actividad citotóxica in vitro, empleando líneas celulares

derivadas de neoplasias humanas, se han convertido en una de las principales herramientas de

apoyo para realizar esos procesos de bioprospección, y al ser un modelo experimental in vitro, es

una alternativa al empleo de animales de laboratorio que ha permitido en los últimos años la

búsqueda de nuevos principios activos, siendo una técnica sensible y sencilla, que genera

resultados reproducibles y validos, adaptable a un alto número de muestras de distinto origen

(12,13), que permite reducir tiempo, costos de investigación y costos éticos relacionados con el

uso de animales de laboratorio, por otra parte son útiles para diferentes tipos de estudios

relacionados con mecanismos celulares y moleculares (14,15). En este tipo de ensayos las líneas

celulares tumorales son expuestas a la sustancia por un periodo determinado de tiempo, se evalúa

Parra Forero D.

5

la viabilidad celular y la capacidad citotóxica de los agentes estudiados y esa capacidad es

interpretada como un indicativo de potencial anticáncer in vivo (10). La citotoxicidad indica el

potencial que un agente tiene para causar el daño celular, este dependerá de la concentración y

del tiempo de exposición en las células. La intensidad de este efecto compromete la viabilidad

celular por perturbación metabólica o integridad estructural, causando muerte celular, ó por

integridad reproductiva, inhibiendo división celular (16).

Este estudio realizó la evaluación de la actividad citotóxica de compuestos de origen natural y

sintético, con núcleos químicos distintos, empleando un panel de líneas celulares tumorales

humanas, seleccionado con el fin de que representara los tumores más comunes y que permitiera

de acuerdo a esto, realizar un adecuado tamizaje de los posibles agentes antitumorales. El panel

de líneas celulares estaba constituido por A549, MDA-MB231, HT-29, Hep-G2 y PC-3 que

fueron proporcionadas por el grupo de Farmacogenética del Cáncer de la Universidad Nacional

de Colombia provenientes de la American Type Culture Collection (ATCC) (17). La valoración

de la viabilidad celular se realizó empleando el método fluorométrico de la reducción de la

resazurina o alamarBlue, que se caracteriza por ser un método simple, rápido, eficiente, seguro,

sensible y costo-efectivo (18), características que no poseían los métodos que anteriormente se

utilizaban para tal fin, como el método de la tinción con sulforodamida B (SRB), el método de la

reducción del bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5 difeniltetrazolio (MTT) o el método que

emplea 51

Cr radioactivo (19). El fundamento del método de reducción de la resazurina, es que al

ser la resazurina metabolizada por células viables, genera un metabolito altamente fluorescente

conocido como ―resorufina‖ permitiendo la detección del crecimiento celular por

espectrofotometría o fluorometría (20). Una de las ventajas de utilizar resazurina es que las

células que son usadas con este colorante pueden ser utilizadas para otros experimentos, puesto


que el colorante no es toxico para las células (18), aprovechando esta característica, en este

estudio fue posible evaluar la recuperación de la viabilidad celular luego de las 48 horas después

de los tratamientos, con el fin de realizar una aproximación del efecto del compuesto: citostático

o citotóxico, y en algunos casos ayudo a observar el efecto antiproliferativo que poseen algunos

compuestos.

Los productos de origen natural evaluados fueron extractos y fracciones de tomate de árbol y

extractos crudos de diferentes fuentes y especies naturales: mora, uva, motilon, gulupa madura y

coral. De acuerdo a la naturaleza química de los compuestos sintéticos evaluados, se dividieron

en cuatro subgrupos: compuestos de coordinación, derivados quinoidales, derivados de

benzamidas y análogos de purinas. En este estudio se encontró que la mayoría de compuestos de

origen natural evaluados no poseían actividad citotóxica en las concentraciones evaluadas, por el

contrario algunos de los compuestos sintéticos poseían un perfil de citotoxicidad promisorio. Los

resultados de este estudio sugieren que los compuestos sintéticos como derivados quinónicos y

compuestos de coordinación con ion plata, núcleos químicos de fenantrolina y salicilato, se sigan

evaluando puesto que poseen una actividad citotóxica interesante y pueden llegar a ser

moléculas prototipo o cabezas de serie de nuevos fármacos antitumorales, abriendo nuevas

perspectivas de tratamiento para esta patología de alto impacto social y económico.

METODOLOGÍA.

Cultivos Celulares: Se emplearon cinco líneas de diferente origen tumoral humano, de

crecimiento adherente en monocapa: carcinoma de pulmón (A549), adenocarcinoma de mama

(MDA—MB231), adenocarcinoma colorrectal (HT-29), carcinoma hepatocelular (Hep-G2) y

Parra Forero D.

7

carcinoma de próstata (PC-3), todas obtenidas de la American Type Culture Collection (ATCC).

Las cinco líneas se mantuvieron en Dulbecco’s Modified Eagle’s médium/ Ham’s Nutrient

Mixture F-12 (DMEM) (Sigma), suplementado con 10% de Suero Fetal Bovino (FBS)

(Microgen), gentamicina 50 µg/mL (Genfar) en frascos de cultivo celular de 75 y 150cm2

de área,

a 37°C, en atmósfera con 5% de CO2 y 100% de humedad relativa. Se cambiaba el medio a las

células al menos tres veces a la semana.

Valoraciones de actividad citotóxica: Las células en crecimiento exponencial, con un 90% de

confluencia, se lavaron con solución de fosfatos (PBS) y posteriormente se trataron con una

solución de tripsina 0,025%-EDTA 0,03% durante 5 minutos a 37°C, para obtener una

suspensión celular que se contó en cámara de Neubauer, empleando el método de exclusión del

colorante azul de trypan. Las células fueron inoculadas en placas de 96 pozos con fondo plano en

las densidades celulares previamente establecidas por el Grupo Farmacogenética del Cancer de la

Universidad Nacional de Colombia (21, 22, 23, 24, 25, 26): MDA—MB231, PC-3 y Hep-G2:

1,0x104; HT-29: 2x10

4; y A549: 5x10

3 células por pozo. Las placas se preincubaron por 24 h para

permitir adherencia de las células en los pozos, luego se adicionaron los tratamiento (DMEM mas

compuestos) en las concentraciones establecidas, con sus respectivas replicas, incubando por un

periodo de 48 h. Además, se dejaron pozos con células mas medio de cultivo, como controles de

crecimiento, y pozos sin células, pero con tratamiento como blancos.

Para evaluar el efecto citotóxico del compuesto, se empleó el método fluorométrico indirecto de

reducción de Resazurina (18,19,20). El tratamiento fue retirado y se reemplazó por 100µL/pozo

de una solución de resazurina en una concentración final de 10% v/v a partir de una solución

inicial de 44 µM y se incubó por 4 horas a 37ºC. Posteriormente se leyó por fluorometría la


formación de resorufina (producto de la reducción de la resazurina por las células viables),

empleando un filtro de excitación de longitud de onda de 530nm y un filtro de emisión de 590 nm

en un lector de placas TECAN GENios. Se calcularon los porcentajes de supervivencia relativa a

las células control de crecimiento y se construyeron curvas de porcentaje de supervivencia en

función del logaritmo de la concentración.

Valoración de la Recuperación celular: Cuando los tratamientos mostraron alguna reducción

de la supervivencia, dado que la rezasurina no tiene efectos tóxicos importante sobre las células

su uso permite monitorear la recuperación de las líneas celulares luego de 48 horas de la

exposición al tratamiento, para observar si se trata de una acción citostática o citotóxica. Después

de la Lectura de la valoración de la citotoxicidad en el lector de placas, se retiró el medio con la

rezasurina y se reemplazó por 100µL/pozo de DMEM suplementado únicamente con gentamicina

50µg/mL, incubando por un periodo de 48 h. Posteriormente se siguió el procedimiento

anteriormente descrito para evaluar el efecto citotóxico, leyendo en el lector de placas TECAN

GENios y obtener las curvas de porcentaje de supervivencia en función del logaritmo de la

concentración.

Tratamientos: Como molécula patrón se empleó la Doxorubicina HCl (Ebewe Pharma), debido

a su actividad citotóxica y que ha sido empleado en trabajos previos del grupo de investigación

de Farmacogenética del Cáncer, del Departamento de Farmacia de la Universidad Nacional de

Colombia como control positivo en los estudios de valoración citotóxica (21,22). Se preparó una

solución stock de los 48 compuestos usando dimetilsulfóxido (DMSO) cuya concentración final

fue de 10.000µM para los compuestos sintéticos y 5400µg/ml para compuestos de origen natural.

Al momento de ser adicionadas a las células se prepararon diluciones en medio de cultivo

Parra Forero D.

9

(DMEM). Cada uno de los tratamientos se evaluó en 3 diluciones seriadas, 10, 5 y 1µM para

compuestos sinteticos y 54, 18 y 6 μg/mL para productos de origen natural. Los compuestos de

coordinación evaluados se ensayaron en 6 concentraciones seriadas 100, 50,10,5, 1, y 0.1 µM.

La concentración final de DMSO no fue mayor a 0,1% v/v, para evitar la interferencia de este

solvente en los resultados. Se evaluó el efecto del DMSO en MEM, como control negativo.

Análisis estadísticos: Las diferencias significativas fueron determinadas usando un análisis de

varianza (ANOVA), Se consideró un p<0,05 como significativo. Los resultados se presentan

como % de supervivencia ± ESM (Error Estandar de la media). Los valores de IC50

(concentración de compuesto que causa el 50% de reducción de la viabilidad celular) en los casos

que podía ser calculada, fueron obtenidos de una regresión no linear usando GraphPad 5.0-Prism

software. Los controles y tratamientos se evaluaron por triplicado para cada concentración y se

realizó al menos una repetición del ensayo. Los valores de IC50 se expresaron en µM ± ESM

(Error estándar de la media).

RESULTADOS

Los resultados muestran los porcentajes de supervivencia de los compuestos que fueron activos

en cada línea celular utilizando una matriz que relaciona las líneas celulares con los subgrupos

químicos, especificando también el origen de los subgrupos: sintético o de origen natural

Adicionalmente se presenta una tabla con los datos de la Concentración Inhibitoria 50 (CI50)


Na

tura

leza

qu

ímic

a

Có

dig

o

En

say

o Líneas celulares tumorales humanas

MDA-MB231 Hep-G2

10 µM 5 µM 1 µM 10 µM 5 µM 1 µM

Qu

ino

na

s (S

inté

tica

s)

RC2 Ct

44,50% ± 1,82% 50,12% ± 6,08% 71,37% ± 10,54%

Rc NR NR NR

RC3 Ct 39,39% ± 2,47% 48,97% ± 2,64% 54,89% ± 1,04%

Rc NR NR NR

RC4 Ct 38,47% ± 11,22% 43,18% ± 2,08% 68,05% ± 2,16%

Rc NR NR NR

RC5 Ct 16,66% ± 1,51% 24,93% ± 0,54% 40,56% ± 3,61%

Rc NR NR NR

RC6 Ct 58,64% ± 4,59% 84,22% ± 5,34% 95,89% ± 2,80%

Rc NR NR -

RC7 Ct 0,96% ± 4,59% 65,24% ± 5,58% 98,65% ± 1,88% 38,77% ± 2,53% 59,66% ± 0,27% 98,66% ± 4,52%

Rc NR NR - NR NR -

RC8 Ct 65,08% ± 1,75% 98,43% ± 1,85% 100,57% ± 2,22% 49,63% ± 6,56% 63,01% ± 2,58% 72,28% ± 1,13%

Rc NR - - NR NR NR

RC10 Ct 8,39% ± 0,64% 45,91% ± 2,18% 108,57% ± 2,56% 32,08% ± 1,06% 47,08% ± 2,06% 86,29% ± 4,42%

Rc NR NR - NR NR -

RC12 Ct 43,91% ± 9,99% 94,13% ± 3,50% 102,74% ± 2,12% 37,72% ± 0,80% 45,18% ± 0,55% 92,37% ± 2,13%

Rc NR - - NR NR -

RC13 Ct -2,36% ± 4,72% 67,04% ± 2,51% 101,65% ± 2,83% 4,22% ± 0,17% 14,42% ± 1,27% 45,36% ± 2,58%

Rc NR NR - NR NR NR

RC15 Ct 71,93% ± 4,56% 94,72% ± 2,46% 103,50% ± 1,98% 15,39% ± 0,37% 26,09% ± 1,37% 48,22% ± 1,15%

Rc NR - - NR NR NR

RC16 Ct 70,08% ± 1,88% 84,33% ± 1,75% 105,11% ± 1,93%

Tabla I. Porcentajes de Supervivencia y resultados de la Recuperación Celular de los compuestos evaluados que

presentaron actividad citotóxica sobre las líneas celulares MDA-MB231 y Hep-G2

Parra Forero D.

11

Rc NR NR -

RC17 Ct 83,35% ± 2,41% 101,72% ± 1,73% 102,93% ± 1,35%

Rc NR - -

RC18 Ct 7,90% ± 0,67% 77,70% ± 2,99% 98,56% ± 2,84% 39,95% ± 0,81% 52,50% ± 2,32% 89,89% ± 6,05%

Rc NR NR - NR NR -

RC19 Ct 14,97% ± 0,56% 77,89% ± 2,18% 95,23% ± 2,32% 9,67% ± 0,92% 18,02% ± 0,38% 58,69% ± 0,84%

Rc NR NR - NR NR NR

RC20 Ct 18,10% ± 2,22% 64,60% ± 3,66% 108,31% ± 1,86% 6,68% ± 0,27% 27,61% ± 1,29% 42,21% ± 1,53%

Rc NR NR - NR NR NR

RI1 Ct

37,23% ± 1,42% 59,68% ± 2,84% 64,91% ± 1,97%

Rc NR NR NR

RI2 Ct 38,19% ± 2,22% 48,83% ± 3,68% 64,72% ± 9,84%

Rc NR NR NR

P5* Ct 77,78% ± 5,37% 89,13% ± 2,46% 111,06% ± 3,83%

Rc ND - -

Pu

rin

as

(sin

teti

cas)

MH4a

Ct

36,66% ± 4,02% 41,63% ± 3,48% 64,29% ± 8,09%

Rc R R R

54µg/mL 18µg/mL 6 µg/mL 54µg/mL 18µg/mL 6 µg/mL

Ex

tra

cto

s y

Fra

ccio

nes

Ta1 Ct

24,82% ± 1,53% 39,38% ± 8,37% 57,97% ± 4,51%

Rc NR R R

Tr 1 Ct 59,76% ± 5,69% 76,07% ± 0,31% 123,25% ± 12,55%

Rc NR R -

Porcentaje de supervivencia promedio de por lo menos 6 determinaciones ± ESM. Los valores negativos se aproximan a porcentajes de

supervivencia iguales a cero. CONVENCIONES: Ct- Ensayo de Citotoxicidad; Rc-Ensayo de Recuperación; R: Presenta recuperación 48 horas

después del tratamiento; NR: No presenta recuperación 48 horas después del tratamiento; ND: Recuperación no determinada (-) No aplica

recuperación. (*) No presento Actividad citotóxica, Presento efecto hormético


Natu

rale

za

qu

ímic

a

Cód

igo

En

sayo Líneas celulares tumorales humanas

HT-29 PC-3

10 µM 5 µM 1 µM 10 µM

5 µM 1 µM

Qu

inon

as

(Sin

téti

cas)

RC5 Ct 63,09% ± 2,01% 90,23 ± 0,38% 101,28% ± 2,03%

Rc NR - -

RC7 Ct 67,36% ± 0,29% 104,59% ± 2,66% 102,20% ± 1,90% 74,63% ± 9,13% 95,32% ± 1,39% 94,32% ± 1,07%

Rc NR - - NR - -

RC10 Ct 53,13% ± 4,81% 99,40% ± 2,05% 108,14% ± 4,84% 27,86% ± 3,02% 99,66% ± 0,82% 98,00% ± 0,82%

Rc NR - - NR - -

RC13 Ct 65,59% ± 7,85% 101,04% ± 2,19% 100,86% ± 2,26% 14,94% ± 4,20% 70,47% ± 1,35% 106,33% ± 1,64%

Rc NR - - NR NR -

RC15 Ct 64,95% ± 3,46% 99,72% ± 5,60% 111,85% ± 2,52%

Rc NR - -

RC18 Ct 74,99% ± 1,72% 97,13% ± 3,90% 94,94% ± 2,11% 68,48% ± 9,05% 96,02% ± 5,15% 100,15% ± 6,18%

Rc NR - - NR - -

RC19 Ct 13,35% ± 4,82% 24,84% ± 8,69% 106,10% ± 2,55% -1,46% ± 0,60% 0,13% ± 0,55% 39,43% ± 1,21%

Rc NR NR - NR NR NR

RC20 Ct 23,50% ± 0,49% 71,09% ± 1,41% 119,46% ± 3,40% 12,21% ± 3,49% 131,62% ±

14,

38% 234,12% ± 36,81%

Rc NR NR - NR NR -



después del tratamiento; NR: No presenta recuperación 48 horas después del tratamiento; ND: Recuperación no determinada. (-) No aplica

recuperación

Tabla II. Porcentajes de Supervivencia y resultados de la Recuperación Celular de los compuestos evaluados que

presentaron actividad citotóxica sobre las líneas celulares HT-29 y PC-3

Parra Forero D.

13

Natu

rale

za

qu

ímic

a

Cód

igo

En

sayo Línea celular tumoral humana

A-549

10 µM 5 µM 1 µM Q

uin

on

as

(Sin

teti

cas)

RC2

Ct 47,85% ± 3,90% 75,51% ± 4,93% 96,30% ± 7,23%

Rc NR NR -

RC3 Ct 39,76% ± 5,23% 65,47% ± 2,72% 92,34% ± 2,59%

Rc NR NR -

RC4 Ct 80,69% ± 1,15% 96,79% ± 3,76% 104,41% ± 2,79%

Rc NR NR -

RC5 Ct 39,99% ± 4,64% 72,89% ± 1,84% 112,57% ± 2,02%

Rc NR NR -

RC6 Ct 69,60% ± 0,03% 70,85% ± 3,86% 93,75% ± 1,77%

Rc NR NR -

RC7 Ct 11,27% ± 1,55% 62,46% ± 10,15% 98,38% ± 4,81%

Rc NR NR -

RC10 Ct -3,72% ± 0,52% 53,34% ± 19,74% 104,10% ± 5,87%

Rc NR NR -

RC12 Ct 57,76% ± 2,05% 99,64% ± 3,86% 104,29% ± 6,96%

Rc NR NR -

RC13 Ct 13,08% ± 1,52% 27,00% ± 3,00% 93,90% ± 7,43%

Rc NR NR -

RC15 Ct 60,03% ± 2,24% 93,73% ± 3,74% 109,91% ± 7,51%

Rc NR - -

RC16 Ct 74,04% ± 5,81% 79,50% ± 1,36% 97,91% ± 2,94%

Tabla III. Porcentajes de Supervivencia y resultados de la Recuperación Celular de los compuestos evaluados que

presentaron actividad citotóxica sobre la línea celular A-549


Rc NR NR -

RC17 Ct 7,14% ± 1,63% 59,69% ± 4,98% 99,98% ± 2,06%

Rc NR NR -

RC18 Ct 24,85% ± 0,27% 69,17% ± 3,86% 77,90% ± 0,75%

Rc NR NR -

RC19 Ct -2,13% ± 0,35% 10,29% ± 2,36% 22,92% ± 2,50%

Rc NR NR NR

RC20 Ct -3,36% ± 0,11% 40,77% ± 1,49% 108,22% ± 6,84%

Rc NR NR

RI2 Ct 79,17% ± 0,93% 81,30% ± 1,06% 102,84% ± 1,83%

Rc NR NR -

P2* Ct 70,65% ± 7,24% 94,52% ± 5,34% 105,37% ± 11,70%

Rc NR NR -

P4* Rc 77,05% ± 2,60% 95,70% ± 6,64% 94,36% ± 6,74%

NR NR -

P5* Ct 83,57% ± 1,26% 88,67% ± 2,53% 113,63% ± 5,03%

Rc NR NR -



después del tratamiento; NR: No presenta recuperación 48 horas después del tratamiento; ND: Recuperación no determinada. (-) No aplica

recuperación. (*) No presento Actividad citotóxica, Presento efecto hormetico

Parra Forero D.

15

Lín

ea

Cel

ula

r

Có

dig

o

En

say

o

Concentraciones Evaluadas- Compuestos de Coordinación

100 µM 50 µM 10 µM 5 µM 1 µM 0,1 µM

MD

A-M

B2

31

D Ct (-)2,17%± 0,95% (-)1,82%± 0,57% 43,53%± 0,86% 76,2%± 6,71% 93,36%± 4,93% 97,66%± 5,07%

Rc NR NR NR - - -

D-1 Ct 28,49%± 0,51% 74,73%± 12,00% 85,21%± 7,68% 107,6%± 5,55% 101,04%± 1,59% 104,26%± 4,71%

Rc R R R - - -

D-2 Ct 28,65%± 1,73% 35,7%± 4,83% 90,77%± 3,56% 88,13%± 6,17% 104,65%± 4,52% 123,85%± 4,65%

Rc R R R - - -

D-3 Ct 27,15%± 3,12% 38,68%± 9,88% 48,39%± 6,85% 77,78%± 4,93% 87,82%± 0,96% 89,93%± 2,80%

Rc R R R - - -

D-4 Ct 20,05%± 2,16% 72,88%± 3,89% 71,35%± 7,56% 77,55%± 8,44% 79,56%± 3,92% 92,69%± 3,32%

Rc R R R - - -

D-5 Ct (-)0,66%± 0,02% (-)0,53%± 0,04% 88,86%± 2,51% 101,95%± 0,90% 103,54%± 1,31% 120,37%± 1,88%

Rc NR NR - - - -

Hep

-G2

D

Ct (-)0,28%± 0,15% (-)0,67%± 0,04% (-)0,21%± 0,10% 7,71%± 0,56% 109,73%± 3,31% 107,63%± 1,61%

Rc NR NR NR NR NR -

HT

-29

D Ct (-)1,24%± 0,13% (-)1,01%± 0,17% 89,11%± 2,83% 107,51%± 3,03% 105,76%± 2,50% 103,13%± 2,20%

Rc NR NR NR - - -

D-2 Ct 27,71%± 1,52% 58,84%± 4,90% 108,74%± 1,08% 109,53%± 2,18% 109,29%± 2,24% 126,37%± 2,60%

Rc R R - - - -

D-3 Ct 76,87%± 3,09% 82,65%± 6,59% 96,75%± 6,00% 98,64%± 3,28% 102,02%± 3,17% 105,71%± 3,52%

Rc NR R - - - -

D-4 Ct 17,16%± 2,76% 83,92%± 10,66% 119,57%± 3,75% 118,36%± 4,10% 115,16%± 3,54% 136,3%± 4,66%

Rc R R - - - -

D-5 Ct (-)0,67%± 0,04% (-)0,60%± 0,06% 112,72%± 0,65% 111,02%± 0,98% 111,73%± 0,23% 128,55%± 0,94%

Rc NR NR - - - -

PC

-3

D Ct (-)1,12%± 0,12% (-)0,62%± 0,24% 17,6%± 5,59% 99,13%± 5,49% 104,04%± 3,45% 102,52%± 3,44%

Rc NR NR NR - - -

Tabla VI. Porcentajes de Supervivencia y resultados de la Recuperación Celular de los compuestos de coordinación y

el control positivo Doxorrubicina en las cinco líneas tumorales humanas.


D-2 Ct 0,36%± 0,16% 30,67%± 4,18% 121,14%± 8,19% 122,28%± 8,29% 128,72%± 10,81% 140,36%± 11,08%

Rc R R - - - -

D-4 Ct (-) 0,090%± 0,06% 46,31%± 1,28% 112,32%± 1,20% 112,91%± 1,14% 113%± 1,12% 123,11%± 1,36%

Rc R R - - - -

D-5 Ct (-)0,570%± 0,02% 106,07%± 2,47% 104,37%± 1,06% 101,37%± 0,92% 102%± 0,91% 116,41%± 2,93%

Rc NR - - - -

A-5

49

D Ct 2,18%± 2,36% 5,94%± 4,26% 7,11%± 4,54% 72,49%± 7,21% 85,63%± 8,78% 100,49%± 6,95%

Rc NR NR NR NR - -

D-2 Ct 18,08%± 1,29% 67,02%± 2,44% 87,97%± 4,15% 83,06%± 3,43% 94,26%± 3,23% 111,64%± 4,15%

Rc R R - - - -

D-3 Ct 88,19%± 0,94% 95,28%± 0,75% 102,69%± 0,88% 101,16%± 0,61% 103,82%± 0,54% 101,47%± 0,16%

Rc NR NR - - - -

D-4 Ct 43,5%± 1,68% 65,04%± 1,76% 86,75%± 1,13% 83,81%± 0,65% 92,94%± 0,38% 106,83%± 1,82%

Rc NR NR NR - - -

D-5 Ct (-)0,62%± 0,03% (-)0,05%± 0,05% 101,15%± 0,80% 99,89%± 0,61% 101,79%± 0,64% 118,34%± 1,14%

Rc NR NR - - - -

Linea

Celular

En

sayo

Concentraciones Evaluadas- Doxorrubicina (Control positivo)

100 µM 50 µM 10 µM 5 µM 1 µM 0,1 µM

MDA-MB231 Ct 3,53%± 0,170% 7,91%± 0,53% 6,79%± 1,03% 12,16%± 0,56% 31,42%± 1,98% 89,06%± 5,26%

Rc NR NR NR NR NR -

HT-29 Ct 0%± 0,33% 0,83%± 0,18% 4,66%± 1,09% 19,02%± 0,38% 83,42%± 1,20% 94,98%± 1,36%

Rc NR NR NR NR - -

PC-3 Ct 20,83%± 0,77% 35,22%± 1,48% 55,64%± 1,22% 54,33%± 3,29% 86,44%± 1,93% 100,02%± 1,65%

Rc NR NR NR NR - -

A-549 Ct 28,16%± 0,91% 37,7%± 1,57% 44,69%± 1,91% 38,06%± 1,07% 80,62%± 1,35% 101,59%± 1,72%

Rc NR NR NR NR - -

Hep-G2 Ct 0%± 0,11% 20,73%± 3,13% 34,43%± 3,67% 42,46%± 3,36% 94,13%± 4,21% 107,28%± 3,12%

Rc NR NR NR NR - -



después del tratamiento; NR: No presenta recuperación 48 horas después del tratamiento; ND: Recuperación no determinada (-) No aplica

recuperación

Parra Forero D.

17

CI50 ± ESM (Error Estándar de la media), n=6, determinados empleando el método de

resazurina para las cinco líneas celulares. a) µg/mL. b) Control Positivo. El signo (<) indica que

el valor de CI50 no es alcanzado en el rango de concentraciones de la valoración. Convenciones:

Q- Quinona; AP-Análogo de Purina; E- Extracto; C- Compuesto de Coordinación.

Código -

Nat .

química

CI 50 (µM)

Línea celular MDA-

MB231

Hep-G2 HT-29

PC-3 A-549

RC2 - Q 4,21 ± 0,06 9,64 ± 0,02

RC3- Q 4,03 ± 0,02 8,06 ± 1,19

RC4- Q 3,8 ± 0,05

RC5- Q < 1 5,93 ± 0,27

RC7- Q 5,52 ± 0,94 6,85 ± 0,02 8,82 ± 0,76

RC8- Q 7,11 ± 0,03

RC10- Q 4,64 ± 0,36 4,44 ± 0,03 10,51 ± 0,41 8,44 ± 0,32 4,62 ± 2,78

RC11- Q

RC12- Q 10,1 ± 0,26 3,73 ± 0,01

RC13- Q 5,93 ± 0,27 < 1 7,16 ± 0,08 2,48 ± 0,54

RC17- Q 5,8 ± 0,29

RC18- Q 4,43 ± 0,60 5,57 ± 0,03 8,05 ± 0,11

RC19- Q 6,7 ± 0,10 1,31 ± 0,05 2,89 ± 0,93 < 1 < 1

RC20- Q 6,43 ± 0,28 < 1 7,07 ± 0,08 9,04 ± 0,08 9,32 ± 0,11

RI1- Q 6,59 ± 0,02

RI2- Q 6,13 ± 0,05

MH4 a - AP 3,03 ± 0,58

Tr1-E 16,76a ±

0,05a

D - C 9,28 ± 1,07 2,57 ± 0,02 22,28 ± 1,58 6,84 ± 0,05 4,94 ± 1,02

D1 - C 74,68 ± 2,26 ND

D2- C 33,27 ± 8,56 ND 63,35 ± 2,49 41 ± 0,81 62,33 ± 3,61

D3- C 18,57 ± 8,41 ND

D4- C 60,67 ± 0,89 ND 69,84 ± 5,56 49,58 ± 1,92 80,76 ± 1,97

D5 - C 22,08 ± 0,52 ND 28,34 ± 0,18 65,37 ± 1,93 24,98 ± 0,17

Doxorrubicinab 0,48 ± 0,06 4,88 ± 0,04 2,12 ± 0,02 8,44 ± 0,05 4,2 ± 0,03

Tabla V. Resultados de citotoxicidad expresados en valores de Concentración

Inhibitoria 50 (IC50)


Código Línea Celular

MDA-MB231 HEP-G2 HT-29 PC3 A549

RC5a

X

RC10a X

X

RC13 a

X

RC15 a

X

X

RC16 a X

RC19 a

X

RC20 a X

X X X

P2 a

X

P5 a X

X

TR1b

X

Dc

X

D2c X ND X

X

D3c

ND X

D4c

ND X X X

D5c X ND X X X

DOXOc

X

Se considero efecto hormético cuando % supervivencia ≥ 105,00% en la menor concentración

evaluada: a). 1µM. b) 6 µg/mL. c) 0,1 µM. ND: No determinada

DISCUSIÓN

Sobre las cinco líneas celulares se utilizó el agente antineoplasico Doxorrubicina HCl como

control positivo de citotoxicidad, encontrando un descenso en el porcentaje de supervivencia

proporcional al aumento de la concentración (Tabla IV), todas las líneas celulares mostraron ser

sensibles al compuesto antitumoral con valores de CI50 dentro del intervalo de 0,48 a 8,44µM

(Tabla V), indicando la adecuada sensibilidad de las líneas celulares a productos xenobióticos, y

por tanto ser un adecuado control positivo para este tipo de valoraciones. A pesar de que se ha

reportado resistencia en líneas celulares tumorales de mama por parte de doxorrubicina (27) la

línea más sensible en este estudio fue MDA-MB231 con una CI50 de 0,48 µM (480 nM), dato

que no difiere de lo reportado por otros autores (28) con CI50 dentro del orden de 343.3nM.

Tabla VI. Compuestos que presentaron hórmesis en el panel de

líneas celulares evaluadas

Parra Forero D.

19

Como control negativo de actividad citotóxica se empleó el control de crecimiento celular

(células con medio DMEM F-12) en todos los ensayos. Además del control Positivo y negativo,

se utilizó el DMSO como control interno de viabilidad celular, ya que fue el vehículo para

preparar las soluciones Stock de los compuestos evaluados en este estudio; se aseguró que la

concentración en el ensayo no sobrepasara el 0,01% en ninguna de las concentraciones evaluadas,

puesto que ha concentraciones mayores puede resultar citotóxico. Se encontró en este estudio que

a esa concentración, el DMSO no interfería en la actividad observada para los compuestos

ensayados.

Los resultados muestran, bajo las condiciones de ensayo que los derivados de compuestos de

coordinación presentaron actividad citotóxica dosis dependiente. Se evaluaron en total seis

compuestos de coordinación y se conoce la estructura de únicamente cuatro: D, D3, D4 y D5

(Figura I), se sospecha que los otros dos, D1 y D2, son el mismo compuesto D4, que posee una

ruta sintética y forma cristalina diferente (D1) y un patrón de hidratación distinto, que al parecer

es la forma deshidratada (D2) (29). Se observa que la línea celular más sensible a este tipo de

compuestos, es la línea celular MDA-MB231 (Tabla V), donde todos los compuestos presentaron

actividad.

Los eventos responsables de la reducción de la viabilidad celular de esta clase de compuestos aun

no han sido establecidos por completo, al parecer perturban el funcionamiento de una amplia

variedad de sistemas biológicos (30), inhiben la síntesis de ADN en una relación dosis

dependiente, que no parece estar mediada a través de Intercalación (31) al contrario de lo que

ocurre con el control positivo. Estos complejos además alteran la función mitocondrial al inducir

el stress oxidativo incluyendo la retracción del citoplasma, la fragmentación nuclear (32).


Figura I. Estructura química de los compuestos de coordinación de plata y

de cobre evaluados.

El compuesto D: [Ag(phen)2]SalH, (Figura I) es un nuevo complejo de plata con ligandos

salicilato y 1,10-fenantrolina ambos de actividades biológicas comprobadas, tanto analgésica

como antifúngica, respectivamente (33, 34), diseñado con el objeto de obtener un compuesto de

mayor biodisponibilidad conociendo que los principales inconvenientes de los complejos de

plata, son su baja solubilidad en medio acuoso y el efecto de cargas eléctricas sobre los ligandos.

Los resultados para este compuesto (D) indican una promisoria actividad antitumoral, como lo

reflejan los valores de IC50 (Tabla V) que en la mayoría de líneas celulares fue de una magnitud

similar al control positivo doxorrubicina. Todo el panel de células tumorales humanas fue

sensible a este compuesto, siendo las líneas más sensibles: Hep G2, A549 y PC-3; y la más

resistente HT-29, lo que sugiere una relativa selectividad de citotoxicidad en el panel de células

evaluado. En comparación con los otros compuestos de coordinación, se aprecia una actividad

citotóxica diferencial (Figura 2) entre los compuestos con ion acomplejante de plata y de cobre.

Parra Forero D.

21

Se observa que los compuestos más activos en todas las líneas, son los que poseen plata en su

estructura D y D5, [Ag(Phen)2]SalH y [Ag2(SalH)2] respectivamente, siendo más potente el

compuesto nuevo [Ag(Phen)2]SalH, por tener valores de CI50 de magnitud similar al control

positivo doxorrubicina, que puede ser indicativo de la importancia de la presencia del núcleo

fenantrolina (Phen) para la actividad citotóxica. Esta hipótesis pudo corroborarse haciendo la

comparación entre D3 y D4, [Cu(sal)(Phen)] y [Cu(SalH)2(H2O)2] respectivamente, en donde se

observa mayor actividad citotóxica en el complejo de cobre que contiene fenantrolina. Además,

es posible que exista una relación molar del núcleo de fenantrolina en la actividad, puesto que la

relación molar del fenantrolina de D respecto a D3 es 2 a 1. En cuanto a la influencia del ion

complejante sobre la actividad, en primer lugar se compararon los compuestos que no poseían el

anillo de fenantrolina D4 y D5, cada uno complejado con iones diferentes encontrando que el

compuesto que contiene el ion plata D5 genera mayor actividad citotóxica respecto al que posee

cobre D4. De igual manera se realizó la comparación entre los compuestos que poseían el núcleo

fenantrolina D y D3, llegando a la misma conclusión. Lo anterior sugiere que la promisoria

actividad del nuevo compuesto [Ag(Phen)2]SalH es debida tanto a la presencia del ion Plata,

como del núcleo químico fenantrolina en la estructura. El incremento de la actividad por la

presencia del ion plata puede deberse a la carga neta del complejo, conllevando a un aumento en

la biodisponibilidad del núcleo [Ag(phen)2]+ que le permite interaccionar de una manera efectiva

con la membrana para ingresar más fácilmente a la célula. Por otro lado la adición de fenantrolina

podría generar una mayor interacción tipo hidrofobica entre el policiclo y las bases del ácido

nucleíco del DNA, partiendo del supuesto de que el mecanismo de acción sea por una interacción

con el ADN.


Figura II. Porcentaje de viabilidad celular de los compuestos de coordinación, para las cinco líneas celulares tumorales. Valores

expresados como Promedio ± ESM, de dos experimentos independientes por triplicado. (*) Significativamente diferente respecto al

control de viabilidad DMSO (P<0,05)

Parra Forero D.

23

La evaluación de la recuperación celular para el compuesto D, luego de las 48 horas de retirar el

tratamiento se refleja una disminución de supervivencia celular para las líneas celulares. Esto nos

sugiere que la acción del compuesto evaluado es citotóxica y no citostática, porque las células no

pudieron recuperarse en el tiempo posterior al tratamiento.

Se observó un efecto proliferativo significativo (% de supervivencia superiores al 105%) a

concentraciones bajas para el compuesto D3- [Cu(sal)(Phen)] en las líneas celulares PC-3 y HT-

29, y para el compuesto D5 [Ag2(SalH)2] en todas las líneas evaluadas (Tabla VI). Este fenómeno

es posible explicarlo a través del efecto hormético o hormesis descrito por varios autores (35, 36)

como un patrón de dosis-respuesta a algunos productos químicos tóxicos observado en distintos

tipos celulares, caracterizado por una estimulación de la proliferación a dosis bajas y una

inhibición a dosis altas, su mecanismo molecular aún no está claro y aún no se ha establecido si

es un fenómeno universal que afecta a todos los tipos de células(37), este efecto ha sido

relacionado con proliferación celular y por lo tanto está implicado en la carcinogénesis (38).

Los derivados quinoidales fueron otro grupo de compuestos evaluados que presentaron una

promisoria actividad citotóxica, representaban la mitad de los compuestos evaluados en este

trabajo. La información sobre las estructuras de los compuestos evaluados fue limitada por la

entidad que los suministró, por lo que se realizó un análisis general con la información otorgada.

Existen muchas clases de quinonas dependiendo de la complejidad de la estructura básica, siendo

de menor a mayor complejidad: benzoquinonas, naftoquinonas y antraquinonas, en esta

investigación se evaluaron naftoquinonas y derivados (Figura III). Desde hace ya más de tres

décadas se conoce el potencial antitumoral de este tipo de compuestos es así como varios agentes

quimioterapéuticos contra el cáncer utilizados en la actualidad poseen ese núcleo, entre ellos la


doxorrubicina (39), el control positivo de este estudio. A pesar de su amplia investigación aun no

se ha encontrado el mecanismo de toxicidad, pero existen dos propuestas una está relacionada

con la habilidad de la porción quinónica de la molécula de aceptar electrones para formar un

anión radical o una especie dianionica, que estimulan intracelularmente la producción de

radicales libres y especies reactivas de oxigeno y como resultado del estrés oxidativo se dañan

membranas proteínas, y también el ADN, de esta manera puede conllevar a la apoptosis; la

segunda propuesta se basa en la capacidad de interactuar con el ADN y alquilarlo (40,41). Las

Naftoquinonas y sus derivados se siguen estudiando por todas las actividades biológicas que se

han descubierto: actividad antibacteriana, antifúngica, antitumoral, actividad antimalarica y

antioxidante (42, 43, 44, 45).

Figura III. Estructura química de naftoquinonas y derivados evaluados. A). Naftoquinonas

sustituidas. B). Furano naftoquinonas. C). Pirrol naftoquinonas

En este estudio se evaluaron 24 derivados de naftoquinonas, 10 naftoquinonas sustituidas, 11

furano naftoquinonas, y 3 pirrol naftoquinonas. Luego de la valoración citotóxica bajo las

condiciones experimentales se encontraron 16 compuestos con actividad promisoria, con CI50

dentro de un rango de 1,31 µM a 10 µM, la mayoría menores a 5 µM (Tabla V), y en algunos

Parra Forero D.

25

casos se reporta menor a 1 µM, siendo las líneas celulares más sensibles: Hep-G2, A549 y MDA-

MB231 resultados que confirman lo reportado por otros autores (40, 45, 46, 47) sugiriendo una

relativa selectividad de estos compuestos. Por otro lado, las líneas tumorales más resistentes del

panel fueron PC-3 y HT-29.

El grupo de las pirrol naftoquinonas (Figura III. C.) solo presentaron actividad en la línea celular

carcinoma hepatocelular (Hep-G2) donde fue sensible a dos de los tres derivados, siendo

compuestos promisorios por su alta selectividad, que in vivo posiblemente pueda disminuir la

incidencia de efectos secundarios observados en compuestos que no son tan selectivos y aún se

utilizan en terapéutica. El grupo responsable de la actividad es el núcleo naftoquinonico (48), se

reporta que tanto 1,2- y 1,4-naftoquinonas fusionadas con un anillo furano o pirano incrementan

en muchos casos la citotoxicidad en células tumorales (49). Una de las líneas celulares más

utilizadas en estudios de biotransformación es Hep G2, porque expresa enzimas activas como

CYP1A, CYP3A4 y UGT involucradas en el metabolismo de varios xenobióticos (50); no se

descarta el hecho de que las pirrol naftoquinonas sean bioactivadas por las enzimas de HepG2

para ejercer su actividad antitumoral, hipótesis que se basa en que estos compuestos no fueron

activos en el resto del panel celular y se reporta que varias quinonas necesitan de bioactivación

para ejercer su actividad (51,52)

Los resultados obtenidos bajo las condiciones experimentales para el grupo de naftoquinonas

sustituidas (Figura IV) muestran que las líneas más sensibles fueron Hep G2 y A549. El

compuesto RC8 presentó actividad en Hep G2 únicamente, por lo que probablemente también

requiera bioactivación. Se observa una actividad citotóxica diferencial para las naftoquinonas

sustituidas en las posiciones 2 y 3 (RC3, RC8 y RC10) y que contienen en su estructura un éter


ciclico o epóxido fusionado (RC2 y RC5) (Figura V). Estos compuestos sugieren la importancia

en actividad citotóxica de los compuestos di o mono sustituidos en posiciones 2 y 3, como se ha

reportado para el lapachol (40), que pueden actuar como liberadores de electrones y como

consecuencia, la capacidad de enlace de hidrógeno es mayor y permite que el compuesto se una

con más fuerza a su lugar de acción. (53). El orden de actividad fue RC10>RC3>RC8, lleva a

pensar que la presencia de átomos de carbono en los sustituyentes puede dar lugar a perdida de la

actividad, recordando que debe haber un balance hidrofilico-hidrofobico para una adecuada

actividad, es así como se ha reportado que el exceso sustituyentes alquilo, diez o más átomos de

carbono da lugar a la pérdida de actividad en estos compuestos (54). RC5 y RC2 fueron más

activos que los anteriores, por lo tanto el epóxido puede influir en un aumento de la actividad.

Figura IV. Estructura química de naftoquinonas sustituidas evaluadas.

Parra Forero D.

27

Los derivados naftoquinonicos 5 y/o 8 sustituidos (P1, P3, P4 y P5) y sin sustituir (P2), en

general no presentaron actividad en el panel de líneas evaluadas, por lo que se sugiere que la

actividad de la naftoquinonas, se suprime cuando son sustituidas en esta posiciones sin importar

los grupos químicos que hagan la sustitución. Se ha reportado que para análogos del compuesto

sin sustituir P2, del 8 hidroxilado P3, y del 3 alquilado P4, no presentan actividad citotóxica

sobre carcinoma Walter 256, (48) sin embargo, se ha reportado actividad antitumoral para 5-8

dihidroxisustituidos (53)

0

50

100

***

***

***

***

***

***

***

***

***

***

***

***

***

***

** RC3

RC8

RC10

RC2

RC5

DMSO 10 5 1 10 5 1

Concentration (M)

Via

bil

idad

Celu

lar

(P

orc

en

taje

)

Figura V. Porcentaje de viabilidad celular de naftoquinonas que presentaron actividad en la línea

celular Hep G2. Valores expresados como Promedio ± ESM, de dos experimentos independientes

por triplicado. (*) Significativamente diferente respecto al control (P<0,05)

El grupo más potente de las naftoquinas, fue el de las furanonaftoquinonas (Figura VI), al

obtener valores más bajos aproximados de CI50 que los anteriores grupos, en algunos casos

menores a 1 µM como en los compuestos RC18 y RC19. En general todas las líneas fueron

sensibles a este grupo de compuestos, se ha reportado actividad para análogos de

furanonaftoquinonas en A549 y PC3 (44). Los compuestos de este grupo que presentaron menor

actividad fueron RC12, RC15 y RC16 donde a la concentración más alta el % de supervivencia


Figura VI. Estructura química de Furano naftoquinonas sustituidas evaluadas.

estaba alrededor del 60%. Esto sugiere que las 1, 4 Furanonaftoquinonas mono sustituidas con

anillos aromático, o con grupos esteres pierden actividad (Figura VII). Se observó que RC15 fue

activa para un mayor número de líneas celulares respecto a RC16 y RC12, por lo que se deduce

que el anillo aromático presente en estos últimos compuestos puede darle una actividad selectiva,

que se ha reportado también para otros análogos (55) Sin embargo pasa lo contrario con las 1,2

furanonaftoquinonas, en donde no se observa tanta selectividad con la presencia del anillo

aromático (RC13), y si se observa con la sustitución alquílica (RC18). En cuanto a los

compuestos di sustituidos RC4, RC6 y RC17, el compuesto con menor actividad fue RC6 quizás

por un inadecuado balance hidrófilo-hidrófobo como se había descrito anteriormente, ya que los

dos sustituyentes son alquenos y alcanos. No es posible establecer una comparación diferencial

Parra Forero D.

29

entre RC4 y RC17 porque fueron activos en líneas celulares distintas, sin embargo es evidente

que los compuestos mono sustituidos o sin sustituir son más activos que los di sustituidos, es el

caso de RC19 y RC20 que presentaron una actividad citotóxica promisoria, RC19 fue más

potente que RC20, inclusive en algunas líneas más potente que el control positivo de

doxorrubicina, sugiriendo que un grupo polar en esta posición en el anillo furano puede aumentar

considerablemente la actividad, así como se ha reportado para otros derivados (54). Sin embargo

estos compuestos (así como varias quinonas evaluadas en este estudio) presentan en varias líneas

el efecto de hormesis en la concentración de 1µM, por lo que posiblemente sean carcinogénicas

(Tabla VI) algunas ya han sido reportadas mutagénicas (56)

0

50

100

***

******

***

***

******

***

***

RC12

RC19

RC20

RC13

RC18

Concentración (M)

Via

bil

idad

Celu

lar

(P

orc

en

taje

)

Figura V. Porcentaje de viabilidad celular de furanonaftoquinonas que presentaron actividad en

la línea celular MDA-MB231. Valores expresados como Promedio ± ESM, de dos experimentos

independientes por triplicado. (*) Significativamente diferente respecto al control (P<0,05)

Los resultados de recuperación celular para los tratamientos con quinonas, en general, muestran

que ninguna de las células (de las cinco líneas tumorales) se recuperó luego de un tiempo de


recuperación de 48 horas posterior al tratamiento, reafirmando lo reportado (39) sobre el

mecanismo citocida de las quinonas.

Para los productos naturales ensayados, en general, ninguno de los extractos o fracciones mostró

actividad citotóxica significativa para las líneas de células cancerosas. Los productos de tomate

de árbol Ta1 y Tr1 mostraron moderados efectos citotóxicos en Hep G2, mostrando selectividad

en esa línea, sin embargo pueden requerir bioactivación, en tanto que sus fracciones no fueron

activas. Se observó el efecto de hormesis En Tr1 en la concentración mas baja ensayada. (Tabla

V)

Figura VI. Estructura química de Furano naftoquinonas sustituidas evaluadas.

Parra Forero D.

31

Los resultados muestran, que bajo las condiciones de ensayo tanto los derivados de benzamidas,

como los análogos de purinas no presentaron actividad citotóxica en el panel de líneas tumorales

ensayadas

Esta investigación y sus resultados resaltan la importancia de continuar con este tipo de estudios

de tamizaje para encontrar nuevas moléculas con potencial actividad antitumoral, es necesario

que posteriormente se sigan con estudios que evalúen el mecanismo de acción para los productos

con actividad citotóxica promisoria, para darle continuidad a la búsqueda de nuevos principios

activos. Se logro asociar el tipo de valoraciones in vitro junto con análogos estructurales de un

mismo compuesto permiten hacer una aproximación al grupo farmacofórico responsable de la

actividad antitumoral, como el caso de los compuestos de coordinación de plata, fenantrolina y

salicilato.

A los compuestos que presentaron el efecto hormético, resultaría interesante realizar los estudios

para detectar productos con potencial carcinogenicidad, utilizando ensayos como el de

genotoxicidad in vitro utilizando células de linfoma de ratón, para comprobar si se tratan de

compuestos genotóxicos, de ser así, las valoraciones de citotoxicidad en concentraciones bajas

podrían ser una aproximación de genotoxicidad. Así mismo es importante realizar el ensayo de

genotoxicidad para los compuestos con actividad promisoria como un paso más hacia la

búsqueda de nuevos fármacos antitumorales, puesto que este tipo de ensayos hace parte de la

batería de ensayos pre-requisito para la aprobación de nuevos medicamentos.

Se recomienda ensayar los compuestos en líneas celulares normales como Fibroblastos, ensayo

que permitirá determinar la selectividad de los compuestos hacia las células tumorales y no hacia

tejidos normales, mediante el cálculo del índice de selectividad.


Gracias a la nutrigenómica, en la actualidad se sabe que existen compuestos de origen natural que

han sido asociados a efectos citoprotectores y anticarcinogénicos. Se recomienda para los

productos naturales evaluados realizar estudios de citoprotección, puesto que no se observaron

efectos citotóxicos en este estudio y posiblemente posean efectos citoprotectores, que prevengan

un proceso carcinogénico. También son importantes realizar los estudios de los mecanismos

moleculares por los cuales estos componentes pueden ejercer sus efectos citoprotectores

AGRADECIMIENTOS

Al Profesor Fabio Aristizabal por haberme dado la oportunidad y la confianza de realizar esta

investigación. Al grupo de investigación de Farmacogenética del Cáncer del Departamento de

Farmacia de la Universidad Nacional de Colombia y a Yanet Cecilia Ocampo por su constante

apoyo en el desarrollo de este trabajo. Al grupo de investigación de Productos Naturales

Vegetales del Departamento de Química de la Universidad Nacional de Colombia, al Grupo de

Ensayos Biológicos de la Universidad de Cartagena, a los químicos Daniel Moyano, Liz Murcia

y Martin Estrada por el suministro de los compuestos para la evaluación.

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