Expoquimia 2011: Forum Biotech - JM Mulet
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Biotecnología para hacer frente al cambio climático: la búsqueda
de variedades tolerantes a sequía, frío y salinidad,
Barcelona 16-11-2011José Miguel Mulet
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¿Que es el estrés para una planta?
•• Es Es difdifíícilcil de de definirdefinir a a nivelnivel general, general, puestopuesto queque lo lo queque puedepuede resultarresultar estrestrééss parapara unauna plantaplanta parapara otraotra puedepuede queque no lo sea.no lo sea.
•• UnaUna definicidefinicióónn parapara salirsalir del del pasopaso de de estrestrééss biolbiolóógicogico serserííaa: : ““factor o factor o condicicondicióónn adversaadversa queque inhibeinhibe el el funcionamientofuncionamiento normal de un normal de un sistemasistema biolbiolóógicogico ((plantaplanta))””
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¿Por qué nos estresa que las plantas se estresen?
• La población mundial es de 7.000 millones y creciendo.• El estrés abiótico es el mayor factor limitante para la
productividad agrícola.• El estrés abiótico produce pérdidas de cientos de
millones de euros cada año debido a bajadas de producción o pérdida de cosechas.
• El crecimiento de la población ha acentuado los factores de estrés existentes (básicamente metales pesados y salinidad… quizás cambio climático).
¿Por que nos estresa que las plantas se estresen?
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Históricamente la sequía ha sido más definitivo para el fin de una civilización que las guerras o las
epidemias
Existen más casos documentados como la civilización Maya, los indios pueblo,la mesopotamia primitiva o la antigua camboya.
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Imágenes tomadas en Tempe (Arizona, USA), que muestran el efecto de vaias décadas de irrigación (Gentileza del Dr. Roberto Gaxiola)
La sequía y la salinidad son problemas actuales tanto en países desarrollados como en países en desarrollo
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La Mejora Clásica se ha demostrado muy buena para el aumento de la productividad, pero limitada en tolerancia a condiciones ambientales adversas
Trigo tradicional:Bajo radio grano/paja
Trigo de la revolución verde:Alto radio grano/pajaNorman Borlaug (2009)Premio Nobel de la Paz
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La cuestión es: ¿Qué gen elegir para hacer plantas tolerantes?
O dicho de otra manera: ¿Por qué no hay todavía plantas
tolerantes a estrés abiótico en el mercado?
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Para aplicar ingeniería genética es preciso conocer el efecto a nivel celular… y elegir
un gen
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Estrategias basadas en conocimiento previo
•• GeneticaGenetica reversareversa: : –– PartiendoPartiendo de de datosdatos obtenidosobtenidos del del genomagenoma clonarclonar genes con genes con unauna
funcifuncióónn determinadadeterminada y/oy/o construirconstruir lineaslineas modificandomodificando la la expresiexpresióónn del gen del gen queque nosnos interesainteresa..
•• GenGenóómicamica funcionalfuncional: : –– EstudiarEstudiar queque genes se genes se expresanexpresan o se o se reprimenreprimen en en determinadasdeterminadas
condicionescondiciones de de estrestrééss y a y a partirpartir de de estosestos datosdatos modificarmodificar la la expresiexpresióónn de genes de de genes de relevanciarelevancia..
•• IngenierIngenierííaa GenGenééticatica::–– TransformarTransformar unauna plantaplanta con un gen de con un gen de otrootro organismoorganismo de de
probadaprobada funcionalidadfuncionalidad en en determinadodeterminado estrestrééss..
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Así es como representamos una ruta de respuesta
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Tolerancia a estrés
Factores negativos
Factorespositivos
Cuello de botella
Unico gen que dará tolerancia por sobrexpresión
Pérdida de Función
redundancia
Pero realmente se parece a esto
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Un ejemplo: Optimizar la síntesis de osmolitos para tolerancia a sequía
• La síntesis de osmolitos es una estrategia generalizada para retener el potencial osmótico dentro de la célula.
• El problema es que no es una respuesta conservada, y cada organismo parece que ha encontrado su solución particular… lo que dificulta el diseño de estrategias…
• Las diferentes estrategias han fracasado (incluso después de haber funcionado bien en el laboratorio).
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El Yield Penalty, un indeseado efecto secundario
Theor Appl Genet. 2007 Jun;115(1):35-46. Epub 2007 Apr 11.Over-expression of a LEA gene in rice improves drought resistance under the field conditions.Xiao B, Huang Y, Tang N, Xiong L.
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Un gen puede dar tolerancia por sobreexpresión por:
• Mejorar la respuesta a estrés (señalización).
• Mejorar la respuesta a estrés (defensa).• Ser una diana molecular del estrés.• Regular negativamente un factor negativo.• Ser un factor negativo (la mutación daría
tolerancia).
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¿Por qué no cambiamos la estrategia?
•• El El trucotruco eses cambiarcambiar la la afirmaciafirmacióónn: : ““esteeste gen gen queque conozcoconozco funcionarfuncionaráá”” porpor : : ””voyvoy a a buscarbuscar genes genes queque funcionenfuncionen, , aunqueaunque no no los los conozcaconozca””, ergo: , ergo: hacerhacer un un screening.screening.
•• El El problemaproblema eses: : ¿¿CCóómomo??
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La levadura como instrumento para buscar genes
Overexpression libraries
Yeast genomic fragments+
Yeast multicopy plasmid
Saccharomyces cerevisiae
Selection for salt toleranceNaCl orLiCl medium
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setting energization
ATPADP + Pi
H+
Pma1
K+
Trk1
+++---
Li+, Na+Polyaminesn+
Aminoglycosidesn+
??
?
ΔΨ
K+ starvationNa+ stress
Osmotic stress
Hal4,5 Hal1CN
Acid stress
Alkalinestress
Ppz1.Hal3Glucose metabolism
YCK1,2Ptk2
Plasma membrane
Este sistema nos permitió descifrar la homeostasis de iones en levadura
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35S::HAL1 control
10 days with150 mM NaCl
20 days with150 mM NaCl
THE YEAST HAL1 GENE IMPROVES SALT TOLERANCE IN TOMATO(cultivar P73; Gisbert et al., Plant Physiol. 123 (2000) 393- 402; collaboration with the groupof Vicente Moreno)
… and in water melon(Ellul et al., 2003,Theor. Appl. Genet.107: 462-469)
Y también alguna aplicación en plantas
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Ya que la levadura funciona muy bien para encontrar genes de
levadura…•• ……PorPor queque no no buscarbuscar genes de genes de plantasplantas??
•• VentajasVentajas::•• Es un Es un procesoproceso rráápidopido y y baratobarato..•• En En pocopoco tiempotiempo se se puedepuede hacerhacer un un escrutinioescrutinio exhaustivoexhaustivo..
•• InconvenientesInconvenientes::•• No No todostodos los los cDNAcDNA se se expresanexpresan bienbien en los en los sistemassistemas
heterheteróólogoslogos ((problemasproblemas con el con el codoncodon usage).usage).•• MuchasMuchas rutasrutas no no estestáánn conservadasconservadas..•• SueleSuele salirsalir un un sesgosesgo haciahacia moleculasmoleculas efectorasefectoras, , pocaspocas
seseññalizadorasalizadoras, y , y poqupoquíísimassimas proteproteíínasnas de de membranamembrana..
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La levadura como instrumento para buscar genes
Overexpression libraries
Plant cDNAs+
Yeast multicopy plasmidwith strong promoter
Saccharomyces cerevisiae
Selection for salt toleranceNaCl orLiCl medium
![Page 21: Expoquimia 2011: Forum Biotech - JM Mulet](https://reader034.fdocumento.com/reader034/viewer/2022052505/5563b54cd8b42ad83c8b492c/html5/thumbnails/21.jpg)
Genes de halotolerancia de la planta modelo Arabidopsis thaliana encontrados por sobreexpresión en levadura(Forment et al., 2002, Plant J. 30:511-519; collaboration with the group of Oscar Vicente )
Name Times isolated Mechanism of action
RCY1 3 K/T-type cyclin fused to an RS-domaintypical of splicing proteins
SRL1 3 RS-domain typical of splicing proteins
AtU1A 1 U1A protein of the spliceosomal U1-snRNP
TECHNICAL DATAYeast strain G19 (ena1-4::HIS3)Library of F. Lacroute (Plant J. 1992, 2: 417-422): Arabidopsis seedlings grown in vitroMinimal medium with 25 mM LiCl and 0.4 mM methionine750.000 transformants tested
![Page 22: Expoquimia 2011: Forum Biotech - JM Mulet](https://reader034.fdocumento.com/reader034/viewer/2022052505/5563b54cd8b42ad83c8b492c/html5/thumbnails/22.jpg)
OVEREXPRESSION OF SRL1 CONFERSSALT TOLERANCE TO TRANSGENIC ARABIDOPSIS PLANTS
In vitro germination
3-weeks old plantstreated for 20 d with200 mM NaCl
aborted siliques
normal siliques
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AAAAAAAAAA
AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
AAAAAAAAAA
AAAAAAAAAA
mRNA
Beta vulgaris cv. DITA
Xho I
Eco RIEco RI
Eco RI
Xho IXho I
cDNA
Yeast/E. coli plasmidpYPGE15
cDNA
S. cerevisiae (ena1-4 nha1)
Escrutinio de genes de remolacha capaces de dar tolerancia a salinidad. (Col. Con Roc Ros, U. de Valencia)
![Page 24: Expoquimia 2011: Forum Biotech - JM Mulet](https://reader034.fdocumento.com/reader034/viewer/2022052505/5563b54cd8b42ad83c8b492c/html5/thumbnails/24.jpg)
Genes de remolacha obtenidos en el escrutinio de tolerancia a salinidad
Clone Number of Predicted function Motifstimes isolated
BvSATO1 6 RNA binding protein RGG and RE/D BvSATO2 1 Homologous to BvSATO1BvSATO3 1 RNA binding protein P-rich and Zn-fingerBvSATO4 1 RNA binding protein RBDBvSATO5 1 RNA binding protein BvSATO6 1 RNA binding protein RBDBvU2AFsnRNP 3 RNA binding protein RBD and Zn-fingerBvSATO7 1 No homologiesBvCK2a 1 Protein kinase CK2BvURA4 2 Dihydroorotase (uracil biosynthesis)BveIF-1A 3 Translation initiation factor
![Page 25: Expoquimia 2011: Forum Biotech - JM Mulet](https://reader034.fdocumento.com/reader034/viewer/2022052505/5563b54cd8b42ad83c8b492c/html5/thumbnails/25.jpg)
35S::BvSATO1 control
35 days growth withwithout stress
35 days growth with50 mM NaCl
![Page 26: Expoquimia 2011: Forum Biotech - JM Mulet](https://reader034.fdocumento.com/reader034/viewer/2022052505/5563b54cd8b42ad83c8b492c/html5/thumbnails/26.jpg)
PATENT TITLE: Protection against environmental toxicity through manipulation of the processing of messenger RNA precursors
Inventors : O. Vicente-Meana, M. Roldan-Medina, R. Serrano-Salom, J. J. Forment,M. A. Naranjo-Olivero, R. Ros Palau, R. Khanonou
Priority date: 19 April 2000Filing date : 19 April 2001PCT publication date: 01 November 2001(transferred to Crop Design, now part of BASF)
AN EXAMPLE OF A PATENT TOO SPECIFIC
Because 8 years later an RNA binding protein provided drought tolerance in corn:News release, Monsanto (St. Louis, USA) and BASF (Ludwigshafen, Germany), June 9, 2009Monsanto, BASF scientists disclose discovery of gene conferring droughttolerance in corn plants: bacterial cspB gene encoding an RNA binding protein
Gene provides yield stabiltyduring periods of inadequatewater supply
Control plants
![Page 27: Expoquimia 2011: Forum Biotech - JM Mulet](https://reader034.fdocumento.com/reader034/viewer/2022052505/5563b54cd8b42ad83c8b492c/html5/thumbnails/27.jpg)
AAAAAAAAAA
AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
AAAAAAAAAA
AAAAAAAAAA
mRNA
Beta vulgaris cv. DITA
Xho I
Eco RIEco RI
Eco RI
Xho IXho I
cDNA
Yeast/E. coli plasmidpYPGE15
cDNA
S. cerevisiae (gpd1)
Escrutinio de genes de remolacha capaces de dar tolerancia a sequía.
![Page 28: Expoquimia 2011: Forum Biotech - JM Mulet](https://reader034.fdocumento.com/reader034/viewer/2022052505/5563b54cd8b42ad83c8b492c/html5/thumbnails/28.jpg)
Resultados del escrutinio en sequía
cDNAs identificados en 1.7 M de Sorbitol
YPD XERO1 Serine O-Acetyltransferase
XERO2 Type II Plant Haemoglobin
SD XERO3 Ascorbate Peroxidase 3
No incluidos en la patenteIncluidos en la patente
![Page 29: Expoquimia 2011: Forum Biotech - JM Mulet](https://reader034.fdocumento.com/reader034/viewer/2022052505/5563b54cd8b42ad83c8b492c/html5/thumbnails/29.jpg)
HomoserineHomoserineAcetil-CoA
O-acetylhomoserineO-acetylhomoserine
HomocysteineHomocysteine
cystathioninecystathionine
CysteineCysteine
[MET2]
[STR4]
[STR1/CYS3]
CoA
S2-
Serine
[MET15]
SerineSerine
CysteineCysteine
O-acetylserineO-acetylserine
S2-
XERO1Acetil-CoA
CoA
¿Por que da tolerancia un gen que no está conservado?
Recientemente se ha demostrado que este gen puede ser clave para el desarrollo de estrategias de fitorremediación(Freeman et al… Plant Cell, 2004; BMC 2007)
![Page 30: Expoquimia 2011: Forum Biotech - JM Mulet](https://reader034.fdocumento.com/reader034/viewer/2022052505/5563b54cd8b42ad83c8b492c/html5/thumbnails/30.jpg)
Actualmente tenemos arroz que sobreexpresa este gen
Y hemos empezado una colaboración con Carmina Gisbert (COMAV, Valencia) para sobreexpresar XERO1-3 en tomate y berengena
![Page 31: Expoquimia 2011: Forum Biotech - JM Mulet](https://reader034.fdocumento.com/reader034/viewer/2022052505/5563b54cd8b42ad83c8b492c/html5/thumbnails/31.jpg)
AAAAAAAAAA
AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
AAAAAAAAAA
AAAAAAAAAA
mRNA
Beta vulgaris cv. DITA
Xho I
Eco RIEco RI
Eco RI
Xho IXho I
cDNA
Yeast/E. coli plasmidpYPGE15
cDNA
S. cerevisiae (wt)
Escrutinio de genes de remolacha capaces de dar tolerancia a frío.
![Page 32: Expoquimia 2011: Forum Biotech - JM Mulet](https://reader034.fdocumento.com/reader034/viewer/2022052505/5563b54cd8b42ad83c8b492c/html5/thumbnails/32.jpg)
Resultados del escrutinio en frío
cDNAs identificados a 10 ºCYPD CRIO1 (8) ScDID1 / AtSNF7 / CHMP4 / VPS32
CRIO2 (2) Homólogo de CRIO1
CRIO3 (4) ScDID2 / AtVPS46/CHMP1
CRIO4 (1) PDR16 / SEC14SD CRIO5 (1) Proteína “Ring Finger”
CRIO6 (1) Proteína intrínseca de tonoplasto
SDCOLD1 (2) Cadena corta de la rubisco
SDCOLD5 (1) Proteína de unión a clorofila
![Page 33: Expoquimia 2011: Forum Biotech - JM Mulet](https://reader034.fdocumento.com/reader034/viewer/2022052505/5563b54cd8b42ad83c8b492c/html5/thumbnails/33.jpg)
CRIO1,2 localizan en el MVB en células vegetales
![Page 34: Expoquimia 2011: Forum Biotech - JM Mulet](https://reader034.fdocumento.com/reader034/viewer/2022052505/5563b54cd8b42ad83c8b492c/html5/thumbnails/34.jpg)
N. Of branches/plant
0
1
2
3
4
wt L3 L8 L9
Crecimiento de las plantas RD29A::CRIO2 a 10 ºC
0% 25% 50% 75% 100%
wt
Line 3
Line 8
Line 9
VegetativeBoltingInflorescence Floral
N. Of Flowers/plant
0
2
4
6
wt L3 L8 L9
hypocotyl length
0
2,5
5
7,5
10
wt L3 L8 L9
![Page 35: Expoquimia 2011: Forum Biotech - JM Mulet](https://reader034.fdocumento.com/reader034/viewer/2022052505/5563b54cd8b42ad83c8b492c/html5/thumbnails/35.jpg)
La levadura funciona bien
Pero no es una planta
![Page 36: Expoquimia 2011: Forum Biotech - JM Mulet](https://reader034.fdocumento.com/reader034/viewer/2022052505/5563b54cd8b42ad83c8b492c/html5/thumbnails/36.jpg)
Buscar genes de plantas en plantas
•• VentajasVentajas::•• TrabajanTrabajan ““In situIn situ””, , porpor lo lo queque evitasevitas el el sesgosesgo de los de los
sistemassistemas heterheteróólogoslogos contra contra laslas proteproteíínasnas de de membranamembrana o o laslas proteproteíínasnas reguladorasreguladoras..
•• Las Las variedadesvariedades obtenidasobtenidas puedenpueden ser de ser de utilidadutilidad immediataimmediata. .
•• DesventajasDesventajas::•• SistemaSistema carocaro y lento. y lento. RequiereRequiere unauna infraestructurainfraestructura
complicadacomplicada..
![Page 37: Expoquimia 2011: Forum Biotech - JM Mulet](https://reader034.fdocumento.com/reader034/viewer/2022052505/5563b54cd8b42ad83c8b492c/html5/thumbnails/37.jpg)
Primera aproximación: Colecciones de mutantes no marcadas (ganancia o pérdida de función)
Sodium transportersSOS1 (extrussion in roots)HKT1 (phloem loading in shoots
and xylem retrieving in roots)Regulators
SOS2-SOS3 (Ca-PK)SAL1 (PAP and inositol polyphosphatase)ABA (ABA2, ABA3, ABI4)
AntioxidantsCatalase
General metabolismSOS4 (pyridoxal kinase)SOS5 (arabinogalactan protein)
Calcium signalingABA signaling
H2 O2 detoxification
Defects in fundamental processescompromise adaptation to diffferent stresses
Problemas: No identifica factores limitantes, Proyectos muy largos y caros
![Page 38: Expoquimia 2011: Forum Biotech - JM Mulet](https://reader034.fdocumento.com/reader034/viewer/2022052505/5563b54cd8b42ad83c8b492c/html5/thumbnails/38.jpg)
Las colecciones marcadas: Una especie de solución para encontrar genes de tolerancia
Activador Transcripcional
T-DNA
RB LB
• Activation tagging: Activation tagging: ConstrucciConstruccióónn con con cuatrocuatro copiascopias en tandem del en tandem del promotorpromotor del 35S. En del 35S. En funcifuncióónn del del sitiositio de de inserciinsercióónn puedepuede ocasionarocasionar la la sobreexpresisobreexpresióónn de un gen.de un gen.
•• El El problemaproblema eses queque a a vecesveces se se consigueconsigue la la sobreexpresisobreexpresióónn de de unauna copiacopia truncadatruncada o la o la sobrexpresisobrexpresióónn de un de un antisentidoantisentido..
![Page 39: Expoquimia 2011: Forum Biotech - JM Mulet](https://reader034.fdocumento.com/reader034/viewer/2022052505/5563b54cd8b42ad83c8b492c/html5/thumbnails/39.jpg)
A dominant mutation conferring pleiotropic tolerance to toxic cations
Alejandro et al. (2007) EMBO J. 26: 3203-3215(tesis doctoral de Santiago Alejandro; colaboración con los grupos dePedro L. Rodriguez y José A. Fernández)
![Page 40: Expoquimia 2011: Forum Biotech - JM Mulet](https://reader034.fdocumento.com/reader034/viewer/2022052505/5563b54cd8b42ad83c8b492c/html5/thumbnails/40.jpg)
Y ahora que?
• Los genes SATO, CRIO1-5 y XERO2 han sido introducidos en maíz, colza, soja y algodón y están actualmente en evaluación en campo.
• …Quizás algún día tengamos plantas tolerantes con genes que encontramos en el laboratorio de Valencia
![Page 41: Expoquimia 2011: Forum Biotech - JM Mulet](https://reader034.fdocumento.com/reader034/viewer/2022052505/5563b54cd8b42ad83c8b492c/html5/thumbnails/41.jpg)
¡¡¡Gracias por la vuestra atención!!!• Si teneis ganas de más: ( @jmmulet)
• www.losproductosnaturales.com
![Page 42: Expoquimia 2011: Forum Biotech - JM Mulet](https://reader034.fdocumento.com/reader034/viewer/2022052505/5563b54cd8b42ad83c8b492c/html5/thumbnails/42.jpg)