EXPRESIÓN DE EXPANSINAS Y CRECIMIENTO DE LAS CÉLULAS …

Profesor Patrocinante. Dr. Daniel Calderini R. Instituto de Producción y Sanidad Vegetal. Facultad de Ciencias Agrarias. Profesor Co-Patrocinante. Dr. Ricardo Riegel S. Instituto de Producción y Sanidad Vegetal. Facultad de Ciencias Agrarias.

EXPRESIÓN DE EXPANSINAS Y CRECIMIENTO DE LAS CÉLULAS DEL PERICARPIO DURANTE EL LLENADO DE

GRANOS EN TRIGO. IMPORTANCIA DE ESTOS PROCESOS PARA LA DETERMINACIÓN DEL PESO FINAL DE GRANO

Tesis de Grado presentada como parte de los requisitos para optar al grado de Licenciado en Bioquímica y Título Profesional de Bioquímico.

JAIME FELIPE HERRERA PAREDES VALDIVIA-CHILE

2011

A todos los que imaginan,

sueñan y desean ser mejores,

para mejorar a los demás.

AGRADECIMIENTOS

Muchas y preciosas personas me han beneficiado con su tiempo, paciencia y sus

experiencias de vida personal y profesional, para guiarme en mi formación.

Gracias al el Dr. Daniel Calderini R. por haberme aceptado en su proyecto de

investigación, su grupo de trabajo y por sobre todo aceptar el desafió de incorporar una

persona alejada de su formación profesional y área de investigación, otorgándome su

paciencia y conocimientos. También debo agradecer al Dr. Ricardo Riegel S., por

darme su confianza para incorporarme a su laboratorio y utilizarlo para el desarrollo del

proyecto. Junto a lo anterior, agradecer al equipo de trabajo del Dr. D. Calderini, por su

amabilidad y alegría, haciendo grato la estadía en el laboratorio, especialmente a

Carolina Lizana, por facilitarme el entendimiento de la fisiología vegetal con la mayor

amabilidad, paciencia y alegría.

Doy Gracias a mi madre, María Paredes, por darme la oportunidad de decidir mi

futuro, junto con su cariño y apoyo incondicional.

Esta tesis fue financiada por los aportes otorgados por Fondo de Desarrollo

Científico y Tecnológico (proyecto FONDECYT 1040125) y Proyecto de Cooperación

Internacional del Fondo de Desarrollo Científico y Tecnológico (proyecto FONDECYT

7060267).

I

ÍNDICE DE CONTENIDOS

Pagina

1.0 RESUMEN 1

1.1 SUMMARY 2

2.0 INTRODUCCIÓN 3

2.1 Importancia y necesidades futuras de trigo. 3

2.2 Crecimiento de la producción de trigo. 4

2.3 Factores que determinan el rendimiento del trigo. 5

2.3.1 Determinantes del número de granos. 7

2.3.2 Determinantes del peso de los granos. 8

2.4 Células del pericarpio. 11

2.5 Expansinas. 12

2.5.1 Estructura de la pared vegetal. 13

2.5.2 Extensión celular. 16

2.5.3 Mecanismo de acción de las expansinas. 17

2.5.4 Función y localización de las expansinas. 18

2.6 Extensión celular y expresión de expansinas en trigo. 19

2.7 Implicancia de las células del pericarpio y de las expansinas en el

crecimiento y rendimiento de los granos de trigo. 20

2.8 Hipótesis y objetivos. 21

2.8.1 Hipótesis. 21

2.8.2 Objetivo general. 21

2.8.3 Objetivos específicos. 21

II

3.0 MATERIALES Y MÉTODOS 22

3.1 Materiales. 22

3.1.1 Material biológico. 22

3.1.2 Reactivos. 22

3.1.3 Instrumentos. 24

3.2 Métodos. 25

3.2.1 Antecedentes de cultivo. 25

3.2.2 Selección de muestras. 27

3.2.3 Medición y análisis de los componentes fisiológicos del grano. 27

3.2.4 Tinción y conteo de células endospermáticas. 30

3.2.5 Dimensiones de las células del pericarpio externo y células

cruzadas. 31

3.2.6 Extracción de RNA total. 31

3.2.7 Cuantificación de RNA total mediante espectrofotometría. 32

3.2.8 Síntesis de cDNA total. 33

3.2.9 Reacción de la polimerasa en cadena (PCR). 34

3.2.10 Visualización de los productos amplificados. 36

3.2.11 Reamplificaron y secuenciación de DNA. 36

4.0 RESULTADOS 37

4.1 Peso de los granos de Bacanora y Kambara a cosecha. 37

4.2 Dimensiones de los granos de Bacanora y Kambara a cosecha. 39

4.3.1 Dinámicas de acumulación de peso de los granos de Bacanora y

Kambara. 45

III

4.3.2 Dinámicas de acumulación de contenido hídrico de los granos de

Bacanora y Kambara. 49

4.3.3 Dinámicas de aumento de volumen de los granos de Bacanora y

Kambara. 53

4.4 Dinámicas de crecimiento de largo, alto y ancho de los granos de


4.4.1 Dinámicas de elongación de los granos de Bacanora y Kambara. 56

4.4.2 Dinámica de alto y ancho de los granos de Bacanora y Kambara. 59

4.5 Dinámicas del número de células del endosperma de los granos

de Bacanora y Kambara. 60

4.6 Extensión de las células del pericarpio de los granos 2 y 3 de


4.6.1 Extensión de las células del pericarpio externo de los granos 2 y 3


4.6.2 Dinámicas de la extensión de las células del pericarpio externo de

los granos 2 y 3 de los genotipo Bacanora y Kambara. 69

4.6.3 Similitud entre las dinámicas de extensión longitudinal de las

células del pericarpio externo y la elongación de los granos 2 y 3


4.6.4 Similitud entre las dinámicas de extensión del ancho de las células

del pericarpio externo y el crecimiento del ancho de los granos 2 y

3 de Bacanora y Kambara. 75

IV

4.6.5 Extensión de las células cruzadas de los granos 2 y 3 de Bacanora

y Kambara. 77

4.6.6 Similitud entre las dinámicas de extensión de las células cruzadas

y el crecimiento del ancho de los granos 2 y 3 de Bacanora y

Kambara. 81

4.7 Expresión de expansinas en los granos 2 y 3 de los genotipos


4.7.1 Niveles de expresión de las 6 expansinas en los granos 2 y 3 de

los genotipos Bacanora y Kambara. 86

4.7.2 Dinámicas de expresión de las 6 expansinas en los granos 2 y 3

de los genotipos Bacanora y Kambara. 89

4.7.3 Dinámicas de expresión de expansinas, de elongación y

acumulación de contenido hídrico de los granos 2 y 3 de los

genotipos Bacanora y Kambara. 91

5.0 DISCUSIÓN 93

6.0 CONCLUSIONES 101

7.0 CONSIDERACIONES 103

8.0 BIBLIOGRAFÍA 104

V

ÍNDICE DE FIGURAS

Pagina

Figura 1: Factores que determinan y asocian al rendimiento de los granos

trigo. 6

Figura 2: Evolución del peso, contenido hídrico y elongación de los

granos. 10

Figura 3: Modelos estructurales de la pared celular vegetal en corte

frontal y lateral. 15

Figura 4: Distribución de las parcelas en el experimento. 26

Figura 5: Asociación entre el peso y largo alcanzado por los granos. 40

Figura 6: Asociación entre el peso y volumen alcanzado por los granos. 41

Figura 7: Dinámicas peso seco, contenido hídrico y volumen de los

granos de Bacanora. 43

Figura 8: Dinámicas peso seco, contenido hídrico y volumen de los

granos de Kambara. 44

Figura 9: Asociación entre el peso de los granos a cosecha y la tasa de

acumulación de materia seca. 47

Figura 10: Asociación entre el peso y el máximo contenido hídrico. 51

Figura 11: Asociación entre el máximo contenido hídrico y la tasa de

acumulación de agua. 52

Figura 12: Dinámicas de largo, alto y ancho de los granos de Bacanora. 54

Figura 13: Dinámicas de largo, alto y ancho de los granos de Kambara. 55

VI

Figura 14: Asociación entre la máxima elongación de los granos y el

máximo contenido hídrico. 58

Figura 15: Dinámicas del número de células del endosperma. 61

Figura 16: Asociación entre el peso y el número de células

endospermáticas de los granos. 63

Figura 17: Asociación entre la tasa de división celular y el máximo número

de células del endosperma. 64

Figura 18: Crecimiento de las células del pericarpio externo de los granos

2 y 3 de Bacanora. 66

Figura 19: Crecimiento de las células del pericarpio externo de los granos

2 y 3 de Kambara. 67

Figura 20: Dinámicas de extensión de las células del pericarpio externo. 70

Figura 21: Dinámicas de extensión celular y del largo de los granos de

Bacanora. 73

Figura 22: Dinámicas de extensión celular y del largo de los granos de

Kambara. 74

Figura 23: Dinámicas del ancho celular y ancho de los granos. 76

Figura 24: Crecimiento de las células cruzadas de los granos 2 y 3 de

Bacanora. 78

Figura 25: Crecimiento de las células cruzadas de los granos 2 y 3 de

Kambara. 79

Figura 26: Dinámicas del largo de las células cruzadas y ancho de los

granos. 82

VII

Figura 27: Peso molecular de las 6 expansinas, 18S y controles negativos. 84

Figura 28: Expresión de las expansinas en los granos 2 y 3 de Bacanora. 87

Figura 29: Expresión de las expansinas en los granos 2 y 3 de Kambara. 88

Figura 30: Dinámica de expresión de las expansinas de Bacanora y

Kambara. 90

Figura 31: Dinámicas de expresión de expansinas, elongación de los

granos y contenido hídrico de los granos. 92

VIII

ÍNDICE DE TABLAS

Pagina

Tabla I: Secuencia de los oligonucleótidos y productos de PCR

generados desde la amplificación de los cDNA de los genes

estudiados. 35

Tabla II: Peso y dimensiones alcanzadas por las 4 posiciones de grano

de los genotipos Bacanora y Kambara a cosecha. 38

Tabla III: Determinantes de la acumulación de peso de las 4 posiciones

de grano de los genotipos Bacanora y Kambara. 46

Tabla IV: Determinantes de la acumulación de contenido hídrico de las 4

posiciones de grano de los genotipos Bacanora y Kambara. 50

Tabla V: Determinantes de la elongación de las 4 posiciones de grano de

los genotipos Bacanora y Kambara. 57

Tabla VI: Determinantes de las células endospermáticas de las 4

posiciones de grano de los genotipos Bacanora y Kambara. 62

Tabla VII: Variación de tamaño de las células del pericarpio externo de los

granos 2 y 3 de los genotipos Bacanora y Kambara. 68

Tabla VIII: Determinantes de la extensión de las células del pericarpio de

los granos 2 y 3 de los genotipo Bacanora y Kambara. 71

Tabla IX: Variación de tamaño de las células cruzadas de los granos 2 y

3 de los genotipo Bacanora y Kambara. 80

Tabla X: Productos de PCR reamplificados e identidad con otras

expansinas previamente descritas. 85

IX

ÍNDICE DE ABREVIATURAS

Bac : Bacanora

CH : Contenido hídrico

CPE : Células del pericarpio externo

DDA : Días después de antesis o días desde antesis.

E EXP : Expresión de expansinas

EC : Extensión celular

EXLA : Expansin like A

EXLA : Expansin like B

EXPA : expansina

EXPB : expansina

FAA : Fijador Fenol/Aceto/Alcohólico

G2As : Group-2 pollens allergens

GH45 : Glucosido transferasa 45

Gr : Grano

Kam : Kambara

LG : Largo de grano

PG : Peso de grano

PS : Peso seco

SB : Tampón Sodio/Borato

TBE : Tampón Tris/Borato/EDTA

VG . Volumen de grano

X

Vol : Volumen

XTHs : Xyloglucanoendotransglicosilasa/hidrolasa

1

1.0 RESUMEN

El consumo de alimentos y biocombustibles presionaran una mayor producción

de trigo. Aumentar el rendimiento en base al peso de los granos es considerado una

posible solución. El peso está determinado por la tasa y tiempo de llenado de los

granos, pero se han asociado otros rasgos de peso, agua y tamaño. Adicionalmente, se

incorpora la expresión de expansinas (proteínas responsables de la extensión de la

pared celular) y el crecimiento de las células del pericarpio. Éstas estarían vinculadas al

crecimiento de la pared de las células del pericarpio, la elongación del grano y peso

final. Se estudió las dinámicas asociadas al crecimiento de los granos y comparó con la

expresión de expansinas, dinámicas de crecimiento de las células del pericarpio externo

(CPE) y cruzadas (CC). Los granos de dos cultivares de peso contrastante (Bacanora y

Kambara), fueron analizados desde antesis a madurez fisiológica en las dinámicas de

peso, contenido hídrico, células endospermáticas, dimensiones (alto, ancho y largo),

CPE y CC. Paralelamente se semicuantificó la expresión de 6 expansinas bajo RT-PCR

en los granos 2 y 3. El largo de las CPE y CC del grano 2 de Bacanora creció en

función del tiempo de 41,28 m a 155,15 m y 44,20 m a 126,56 m, en Kambara

creció de 30,26 m a 170,43 m y 30,37 m a 127,71 m. Las dinámicas de largo de las

CPE y CC fueron semejantes a las dinámicas de largo y ancho de los granos. La

expresión de expansinas no presentó diferencias significativa entre los genotipos y

posición de grano. La máxima expresión se presentó antes de 10 días desde antesis y

decayó en función del tiempo. Los granos de trigo tienen la mayor expresión de

expansinas en los períodos de activa acumulación de agua, elongación de las CPE y de

los granos, su expresión diminuye una vez definido el tamaño de grano.

2

1.1 SUMMARY

Food consumption and bio-fuels will pressure a higher wheat production. To

increase the performance based on the weight of the grains is considered a possible

solution. The weight is determined by the rate and duration of grain filling, but additional

features of weight, water and size have been asociated. In adition to this, the expresión

of expansins (proteins responsible for the extension of cell wall) and pericarp cell growth

has been incorporated. These would be linked to pericarp cell wall growth, grain

elongation and final weight. The dynamics asociated with grain growth were studied and

compared with expression of expansins, dynamics of external pericarp cell (CPE) and

crossed cells (CC) growth. The grains from two cultivars of contrasting weight (Bacanora

y Kambara), were analized from anthesis to physiologic maturity in dynamics of weight,

water content endospermatic cells, dimensions (height, width and lenght), CPE and CC.

In parallel the expression of 6 expansines were quantified by RT-PCR in grains 2 and 3.

The lenght of CPE and CC of grain 2 from Bacanora grew as a function of time from

41,28 m a 155,15 m and 44,20 m to 126,56 m; in Kambara it grew from 30,26 m

to 170,43 m and 30,37 m to 127,71 m. The dynamics of length of CPE and CC were

similar to those of lenght and width of grains. Expansins expression did not showed a

significant difference between genotypes and position of grain. The maximum

expression was showed before day 10 from anthesis and decreased as a function of

time. The wheat grains have the higher expression of expansins in periods of active

water acccumulation, and CPE and grain elongation. Their expression decreases once

the grain size is defined.

3

2.0 INTRODUCCIÓN

2.1 Importancia y necesidades futuras de trigo.

El trigo (Triticum aestivum L.) aporta un quinto del requerimiento calórico global

(Reynolds et al. 2009), y su productividad es de suma importancia para satisfacer las

futuras demandas. Por ello, desarrollar estrategias en su mejora genética constituye un

objetivo en la investigación de trigo.

Los progresos agronómicos y genéticos aumentaron la producción de trigo

(Reynolds et al., 2007; Evenson y Gollin, 2003), pero una serie de factores impulsan e

impulsarían una mayor demanda. La misma, no sería superada por las ganancias

genéticas y productivas anuales (Rosegrant y Cline, 2003; Sherman et al., 2005;

Fischer y Edmeades, 2010; Miralles y Slafer, 2007).

El continuo aumento de la población (> 8.500 millones de personas, 2030), el

mayor desarrollo económico, longevidad y expectativas de vida, aumentarían el

consumo calórico alimenticio per cápita (Rosegrant y Cline, 2003; FAO, 2002).

Los factores climáticos (Neelin et al. 2006; Bate et al., 2007) y ambientales

(Berman et al., 2005; Montgomery, 2007) condicionan la producción de trigo. El cambio

climático afectará negativamente la producción, impactando en la duración de las

etapas ontogénicas, la mayor probabilidad de déficit hídrico (Richards, 1992; Trethowan

et al., 2002), aumento en la salinidad de los suelos (Isla et al., 2003), eventos de shock

térmicos, reestructuración de las áreas de cultivo y otros (Reynolds et al., 1998).

Adicionalmente, se requerirá utilizar territorios del cordón tropical y subtropical (FAO,

2002), considerados poco aptos para el cultivo de trigo y de alto impacto ambiental.

4

La utilización del trigo como fuente de biocombustibles (grano: 66 GJ ha-1a-1;

planta completa: 72 GJ ha-1a-1; Shewry, 2009, Murphy y Power, 2008), establecerá una

competencia en su uso, sea para alimentación o generación de energía.

Los anteriores factores presionarán un mayor consumo de trigo, estimándose

una producción superior a 882 millones de t a-1 para el año 2020 (Cassman, 1999).

Considerando que se producen 605 millones de t a-1 de trigo en 214 millones de

hectáreas (FAOSTAT, 2007), las mismas que han tendido a estabilizarse e incluso

disminuir en los últimos 15 años, hace imperioso incrementar el rendimiento medio

mundial de 2,5 a más de 4,5 t ha-1 (Byrnes y Bumb, 1998; Rajaram, 2001), para evitar

los problemas de escasez alimentaria a futuro (Reynolds et al., 2009).

2.2 Crecimiento de la producción de trigo.

En la primera mitad del siglo XX, la producción de trigo creció por la introducción

de nuevas áreas de cultivo (Calderini y Slafer, 1998). En la segunda mitad aumentó

sostenidamente por mejoras en su manejo (Cassman, 1999), factores socio-

económicos globales (Calderini et al., 1998), y en gran medida al incremento del

rendimiento por la introducción de los genes del enanismo. Estos genes disminuyeron la

altura de planta, aumentando el número de granos y las hicieron menos propensas a

pérdidas por tendedura (Loss y Siddique, 1994; Calderini et al., 1995; Evans et al. 1999;

Rajaram, 2001). Lo anterior permitió duplicar la producción de trigo, sin embargo, desde

finales de los años 80 la ganancia por rendimiento anual ha sido menor (Fischer y

Edmeades, 2010).

5

Los genotipos actuales de trigo pueden alcanzar índices de cosecha próximos al

50% (Calderini et al., 1995), cercano al índice de cosecha máximo teórico calculado del

62% (Austin et al., 1980). Esto restringe las posibilidades de continuar incrementando el

rendimiento y la producción como se hizo en el pasado. Requiriendo profundizar los

conocimientos fisiológicos y genéticos involucrados en la determinación del número y

peso de los granos (Reynolds et al., 2009; Calderini et al., 1999a; 2001; Calderini y

Reynolds, 2000; Ugarte et al., 2007), para generar nuevas estrategias que posibiliten el

aumento del rendimiento del cultivo (Reynolds et al., 2001; Monneveux et al., 2003).

La combinación de mejoras agronómicas y fisiológicas, junto con la aplicación de

técnicas biotecnológicas, serán necesarias para resolver los desafíos actuales y futuros

del cultivo de trigo (Reynolds et al., 2009; Rajaram, 2001).

2.3 Factores que determinan el rendimiento del trigo.

El rendimiento del trigo, es el resultado de la interacción entre el número y peso

de los granos (Figura 1), y ambos responden a determinantes fisiológicos y genéticos

(Satorre et al., 2003; Evans y Fischer, 1999). La mejora genética permitió aumentar el

número de granos por unidad de superficie, pero con una disminución del peso medio

de los mismos, producto de los nuevos granos de menor peso potencial, ubicados en

las posiciones más distales de la espiga (Miralles y Slafer, 1995). Por otro lado, la

disminución del peso no sería debido a una limitación de importancia en la fuente de

asimilados (Satorre et al., 2003), lo que respalda las propuestas de incrementar el

rendimiento, a través del aumento del (I) número de granos (Calderini et al., 1999), (II)

el peso potencial de los mismos, o (III) ambos.

6

Figura 1: Factores que determinan y asocian al rendimiento de los granos trigo.

Componentes que determinan el número de granos de la espiga. Adicionalmente, los

determinantes fisiológicos y caracteres a los cuales se les ha asociado un afecto sobre

el peso de los granos (figura adaptada de Satorre et al., 2003).

7

2.3.1 Determinantes del número de granos.

El número de granos por unidad de superficie es el componente de mayor

asociación con el rendimiento del trigo (Figura 1; Demotes-Mainard y Jeuffroy, 2004;

Calderini et al., 1995), siendo afectado por el número de espigas, espiguillas y granos

dentro de las mismas (Reynolds et al., 2009). Este último está fuertemente

condicionado por el período entre 20 días previos a antesis y antesis (Fischer, 1985), en

dicho momento se establece el número de granos por espiguilla (Satorre et al., 2003).

Por ello, las condiciones de crecimiento durante este período modifican el número final

de granos del cultivo (Satorre et al., 2003).

La radiación absorbida por la planta afecta la tasa de crecimiento y acumulación

de asimilados previo a antesis (Slafer et al., 1990). Una alta producción de asimilados

resulta en una mayor partición a estructuras reproductivas (espigas), favoreciendo un

mayor número de flores fértiles y futuros granos (Miralles et al. 1998). La temperatura

afecta negativamente el número de granos, debido a que acelera la tasa de desarrollo,

reduciendo el número de flores fértiles y consecutivamente el número final de granos

(Satorre et al., 2003). Entre los factores agronómicos que pueden influenciar el número

de granos, está la fertilidad del suelo y la densidad de siembra (Satorre et al., 2003).

Para aumentar el número de granos se ha sugerido como estrategia, extender

los períodos de desarrollo de las espigas, aumentar la partición de asimilados a las

estructuras reproductivas y/o la disminución o inhibición de las estructuras no

reproductivas (Reynolds et al., 2009).

8

2.3.2 Determinantes del peso de los granos.

El peso de los granos está menos asociado con el rendimiento del cultivo

(Fischer, 1985), pero es el responsable de la acumulación de biomasa tras haberse

establecido el número de granos (Miralles et al., 2000; Satorre et al., 2003; Calderini et

al., 1999a). Los principales determinantes del peso son la tasa de llenado de grano y el

tiempo de de acumulación de asimilados (Egli, 1981). Paralelamente, se han asociado

una serie de caracteres que afectarían al peso de los granos, como los determinantes

de la acumulación de materia seca, el peso de los carpelos florales al momento de

antesis, el número de células del endosperma, el contenido hídrico máximo alcanzado

por los granos (Saini y Westgate, 2000) y el largo de los mismos (Figura 1). Aun así,

son poco conocidos los determinantes que controlan el peso potencial de los granos,

por ello se requiere de una mayor investigación sobre las bases fisiológicas que

controlan estos caracteres (Calderini et al., 1999b; Calderini et al., 2001).

Los trabajos recientes demuestran que cualquier perturbación en los 15 días

previos a la antesis afectan el peso de los granos (Calderini et al., 1999a, b). Dicho

período coincide con el crecimiento de los carpelos florales, cuyo peso en antesis está

asociado con el peso potencial de los granos (Calderini et al., 1999a; Calderini y

Reynolds, 2000, Satorre et al., 2003).

El desarrollo y acumulación de asimilados al interior de los granos, está vinculado

teóricamente al peso potencial de los granos (fuerza de los destinos). Esta acumulación

sigue una dinámica de crecimiento sigmoidea, con una etapa inicial de baja

acumulación de asimilados (fase lag), seguida de una etapa de rápida acumulación

9

(fase lineal), y finaliza en madurez fisiológica con la estabilización del peso de grano

(Figura 2; Calderini et al., 1997; Reymolds et al., 2001; Borras et al., 2004).

Paralelamente, desde antesis se produce un aumento en el número de células

endospermáticas, estas células son las responsables de contener los asimilados

sintetizados por la planta, y a su número se le atribuye una correlación positiva con el

peso final de los granos (Brocklehuerst, 1977; Gleadow et al., 1982).

La dinámica de acumulación de agua en los granos se inicia de forma acelerada

durante un período aproximado de 15 días, le sigue una segunda etapa sin variación del

contenido hídrico (plateau hídrico) y finaliza con una pérdida rápida de agua (Figura 2).

Este último período se encuentra próximo a la madurez fisiológica del grano (Stone et

al., 1995; Calderini et al., 2000; Wardlaw et al., 1995). Junto a la paridad de algunos

eventos entre las dinámicas de peso y acumulación de agua, se ha descrito una

asociación entre el máximo contenido hídrico y el peso de los granos (Schnyder y

Baum, 1992; Calderini et al., 2000).

Desde antesis hasta aproximadamente los 20 días después de antesis (DDA),

los granos presentan un crecimiento acelerado en sentido longitudinal, a contar de este

momento los granos detiene su elongación (Figura 2). Paralelamente, el grano crece en

las dimensiones de alto y ancho hasta madurez fisiológica. El resultado de la extensión

de cada una de las dimensiones del grano, genera el espacio (volumen) que contendrá

los asimilados. A este volumen se le ha asociado con el peso final de los granos (Millet

y Pinthus, 1984).

10

Bota

DDA

-20 0 20 40 60

Pe

so

(m

g)

y C

. H

ídri

co

(m

g)

0

20

40

60

80

-20 0 20 40 60

La

rgo

de

gra

no

(m

m)

0

2

4

6

8

PS

CH

Largo

Fase IIIFase I Fase II

Fase I Fase IVFase II Fase III

Fase II Fase I

Peso

C. Hídrico

Largo

Figura 2: Evolución del peso, contenido hídrico y elongación de los granos. Área

superior, dinámicas de acumulación de peso seco (PS; círculos llenos), acumulación de

contenido hídrico (CH; círculos vacíos) y elongación (Largo; triángulos llenos) de los

granos de trigo. Parte inferior, fases de la dinámica de acumulación de peso (Fase I = F.

lag; Fase II = F. lineal; Fase III = M. fisiológica), contenido hídrico (Fase I = acumulación

de agua; Fase II = plateau hídrico; Fase III = perdida de agua; Fase IV = contenido

hídrico a cosecha) y elongación de los granos (Fase I = elongación del grano; Fase II =

largo estable; figura adaptada de Satorre et al., 2003).

11

2.4 Células del pericarpio.

El grano de trigo está envuelto por el pericarpio, esta estructura está formada por

una serie de capas celulares estructuralmente diferenciadas. La epidermis e hipodermis

(pericarpio externo), presenta células alargadas en sentido longitudinal al grano. La

capa intermedia presenta las células cruzadas, que se alargan en sentido transversal al

grano (Carole et al., 2003). Las referencias actuales, solo indican que el tamaño de las

células del pericarpio no son afectadas por los alelos de enanismo, encontrándose

diferencias en el número de las mismas (Miralles et al., 1998).

La orientación y crecimiento de las células del pericarpio externo (CPE) y las

células cruzadas (CC), podrían jugar un rol clave en el largo y ancho de los granos,

determinado el volumen, forma (Yang et al., 2009; Gegas et al., 2010) y peso de los

mismos. A la vez, el tamaño de estas puede ser afectado por unas proteínas capaces

de modular la extensión de la pared celular llamadas Expansinas.

12

2.5 Expansinas.

A comienzos de los años 90, se aisló una proteína desde el tejido vegetal en

crecimiento, capaz de restaurar el crecimiento ácido de la pared celular de las plantas,

atribuyéndole una naturaleza bioquímica a la extensión de la pared celular. Esta

proteína y posterior familia proteica se les denominaron “Expansinas” (McQueen-Mason

y Cosgrove, 1995; Cosgrove, 1989).

Se han identificado cuatro familias de expansinas (Kende et al., 2004), las y

expansinas (EXPA y EXPB) con actividad experimental (Cosgrove, 1997, McQueen-

Mason et al., 1992), y las expansin like (EXLA y EXLB) por homología de secuencia

(Sampedro y Cosgrove, 2005). Las y expansinas presenta una similitud en tamaño

(~25-28 kDa) y secuencia (20 y 40%), diferenciándose en que las EXPA presentan un

motivo de N-glicosilación, y las EXPB presentan una larga inserción y una deleción

vecina al dominio 1 (Sampedro y Cosgrove, 2005). Los análisis de secuencia muestran

2 dominios altamente conservados, el dominio 1 presenta homología con glucósido

transferasa (GH45), pero sin actividad (McQueen-Mason et al., 1995; Cosgrove, 1997;

2000), y el dominio 2 no presenta homología con otras proteínas. La alta cantidad de

residuos aromáticos y polares hace presumir que este dominio es capaz de formar

puentes con los polisacáridos de la pared (Cosgrove 1997; Barre y Rougé, 2002).

Paralelamente, se ha descubierto homología parcial con el grupo 2 de los polen

alérgenos de las gramíneas-G2As y expansinas de otras especies como bacterias,

nematodos y moluscos (Sampedro y Cosgrove, 2005).

13

2.5.1 Estructura de la pared vegetal.

La pared primaria es la responsable de los cambios fisicoquímicos del desarrollo

celular (McCann et al., 1990; Cosgrove, 1999), está compuesta por una red de

polisacáridos de alto peso molecular de celulosa (30%), hemicelulosa (30%) y pectinas

(35%; Fujino et al., 2000), embebidos en una matriz hidratada de otros polisacáridos,

glicoproteínas (1-5%) y otras sustancias como ligninas, suberina y cutina (Carpita, 1996,

Somerville et al., 2004), cuya relación varía dentro de la misma pared, entre tejidos y

etapas del desarrollo (Sampedro y Cosgrove, 2005). La pared presenta entre 75 a 80%

de agua, formando un hidrogel relativamente denso y variable, que permite la extensión

celular (Lin et al., 1991). Esto la hace sensible a los fenómenos de deshidratación

(Edelmann, 1995), y jugar un rol determinante en la inhibición del crecimiento en

períodos de estrés hídrico (Chaze y Neumann, 1994).

La celulosa se organiza en paquetes lineales de 3 a 10 nm de diámetro y sobre 7

m de extensión, estabilizadas por puentes hidrogeno inter e intra-cadena (Saxena y

Brown, 2005). Las hemicelulosas (xiloglucanos y xilanos) se encuentran asociadas con

las microfibras de celulosa y están compuestas por largas fibras de celulosa o xilosa,

con ramificaciones menores de mucosa, galactosa o arabinosa (Rose, 2003). Las

pectinas se encuentran hidratadas y unidas a la superficie de la celulosa, y su

gelificación permite controlar la flexibilidad, porosidad (Vincken et al., 2003) o limitar la

extensión de la pared mediante la interacción con iones de calcio (Fry, 2004).

Según los modelos estructurales, las microfibras de celulosa y la matriz están

organizadas como dos redes independientes. Una red de pectinas de carácter funcional

y una red de celulosa-hemicelulosa de carácter estructural, determinando la forma,

14

dimension y expansión celular (Rose, 2003). El modelo “Tethered network” (Figura 3a),

propone que las microfibras de celulosa estarían ligadas en forma no covalente,

mediante largas cadenas de xiloglucanos, mientras que las pectinas y proteínas

constituirían una malla independiente y coexistente con la red de celulosa-xiloglucano

(Carpita y Gibeaut, 1993; Cosgrove et al., 1997; 2001; McCann et al., 1990; Nishitani,

1998). El modelo “Multicoat” propone que las microfibras de celulosa están inmersas y

recubiertas por capas de polisacáridos de la matriz, las pectinas rellenarían los espacios

y las uniones entre las redes, a través de enlaces no covalentes entre los diferentes

polisacáridos (Figura 3b). Ambos modelos de organización de la pared celular están

lejos de ser ratificados, ya que existen organizaciones dentro de las paredes aún más

complejas (Cosgrove, 1999; 2001).

La síntesis de la pared se realiza a través de 2 vías paralelas, la primera sintetiza

celulosa mediante un complejo enzimático transmembrana (Rosetta), la cual deposita

las fibras directamente sobre la pared (Schrick et al., 2004; Doblin et al., 2002). La

segunda vía sintetiza la mayoría de los componentes de la matriz, ellos son sintetizados

en el aparato de Golgi y transportados a la pared celular (Fry, 2004; Scheible y Pauly,

2004; Lerouxel et al., 2006), dicha matriz es posiblemente unida por una serie de

glicoproteínas (Rose, 2003).

15

Figura 3: Modelos estructurales de la pared celular vegetal en corte frontal y

lateral. Constitución y organización estructural de los diferentes componentes de la

pared vegetal de los modelos de Multicoat y Tethered network (figura adaptada de

Cosgrove, 2001).

16

2.5.2 Extensión celular.

La capacidad de extensión y reorganización de la pared celular de las plantas

está influenciada por estímulos ambientales como la luz, la gravedad, la anoxia, el

estrés hídrico u hormonas. Para ello, la pared transita de un estado rígido a uno

viscoelástico o relajado (Cosgrove, 2005), mediante una acidificación de la pared por

las ATPasa H+ de la membrana (Bibikova et al., 1998) y modificaciones bioquímicas de

sus componentes. Todo ello produce una relajación (stress relaxation) y posterior

ablandamiento de la pared (wall loosening). Paralelamente, desde el interior celular se

genera una presión de turgencia que impulsa a las paredes y desliza sus polímeros (cell

wall creep), provocando la extensión celular. Una vez finalizada la extensión de la

pared, ésta sufre un proceso de reconstrucción de las fibras de celulosa, junto a la

incorporación de una nueva matriz de polisacáridos (Sampedro y Cosgrove, 2005;

Marga et al., 2005).

Los avances bioquímicos y bioinformáticos han identificado 4 agentes putativos

responsables del ablandamiento de la pared. Las expansinas son consideradas como

agente primario por su capacidad de ablandar y extender la pared. Los

xyloglucanoendotransglicosilasa/hidrolasa (XTHs), los radicales hidroxilos y las endo-

(1,4)- -glucanasas son considerados agentes secundarios, porque solo modifican los

componentes de la pared, sin generar extensión (Rose, 2003; Sanpedro y Cosgrove,

2005).

Los radicales hidroxilos y peroxidasas de pared, hipotéticamente cortarían y

removerían los átomos de hidrógenos de las cadenas de polisacáridos (Fry, 2004;

Liszkay et al., 2003). Las endoglucanasas son visualizadas en las regiones no

17

cristalinas de celulosa, y tienen la capacidad de hidrolizar las uniones internas de las

cadenas glucosídicas, necesaria para la reorganización y síntesis de glucanos (Inouhe y

Nevins, 1998; Cosgrove, 1999; Ohmiya et al., 2000). Finalmente las XTHs, presentan

alta expresión en regiones de formación, elongación, post-elongación y remodelación

de pared (cortar y unir xiloglucanos), permitiendo la reestructuración o biosíntesis de la

misma (Fry, 2004; Antosiewicz et al., 1997; Chanliaud et al., 2004; McQueen-Mason et

al., 1993; Cosgrove, 1997; 1999; Darley et al., 2001; Saladié et al., 2006).

2.5.3 Mecanismo de acción de las expansinas.

Se desconoce el mecanismo como las expansinas ablandan y extienden la

pared, sin embargo, los primeros trabajos han sugerido que las expansinas debilitarían

los enlaces entre los polímeros de la matriz y de la superficie de la celulosa (Cosgrove,

2000a; 2000b; Darley et al., 2001). Las expansinas no generan un debilitamiento

progresivo de la pared, ni siquiera modifican la mecánica y la estructura de la misma, a

diferencia de las enzimas hidrolíticas o transglicosilasa (McQueen-Mason et al., 1993;

1995; Cosgrove, 1997). Se presume que pueden debilitar las uniones no covalentes

entre los glucanos, ya que pueden debilitar el papel de celulosa pura (red de glucanos

unidos por enlaces puente hidrogeno) o membranas artificiales de celulosa-xiloglucano,

sin mostrar acción hidrolítica (McQueen-Mason y Cosgrove, 1994). Los resultados

sugieren que las expansinas actuarían sobre los microfibras de celulosa y

secundariamente sobre los puentes de xiloglucanos, pero son insensibles a otros

polisacáridos.

18

A pesar de la homología de las expansinas con algunas endoglucanasas

(Tatusova y Madden, 1999), éstas actúan de forma diferente, ya que las primeras lo

realizan en forma inmediata, generando una relajación de la pared sin afectar su

mecánica, mientras que las endoglucanasas requieren de un tiempo mínimo de acción

(Yuan et al., 2001). Lo anterior ha sugerido que las expansinas abrirían la red celulosa-

xiloglucanos, generando la extensión inmediata de la pared, para una posterior acción

de las endoglucanasas (Cosgrove et al., 2002).

2.5.4 Función y localización de las expansinas.

La activación y expresión de los genes de expansinas se les ha asociado al

crecimiento y extensión celular (Vreegurg et al., 2005). Además se le ha descrito en

maduración de frutos, formación de xilemas (Gray-Mitsumune et al., 2004), germinación

de semillas (Chen y Bradford, 2000), emergencia de hojas (Belfield et al., 2005),

penetración de polen (Pezzotti et al., 2002) y especialmente en tejidos en crecimiento

(Rienhardt et al., 1998). A nivel celular, se mantienen acumuladas en el citoplasma,

pero principalmente distribuidas en la pared, acentuándose en estratos y puntos

específicos (Belestrini et al., 2005; Cosgrove et al., 2002). La sobreexpresión de

expansinas, genera un crecimiento precoz de primordios foliares, modifica la filotaxis del

meristema apical, provocando un crecimiento mayor y anormal de los tejidos vegetales

(Pien et al., 2001, Cosgrove et al., 2002; Cho y Cosgrove, 2000). La supresión génica

mediante sondas antisentido, ha podido reducir e inhibir el crecimiento de algunos

vegetales, mientras que en otros les ha otorgar una mayor resistencia mecánica de los

mismos (Cho y Cosgrove, 2000).

19

2.6 Extensión celular y expresión de expansinas en trigo.

La pared celular de trigo y otras monocotiledóneas es de tipo II, baja en pectinas

y xiloglucanos (< 2%), pero altas en xilanos (Carpita et al., 2001; Rose, 2003; Sanpedro

y Cosgrove, 2005). Según el modelo propuesto, los -glucanos y

glucuronoarabinoxilano cumplirían el rol de porosidad y de unión de las microfibras de

celulosa, ya que su presencia es dependiente del estado de desarrollo celular (Kim et

al., 2000) y sufren de degradación post-elongación celular (Carpita et al., 2001).

En trigo se han aislado expansinas desde el coleoptilo, con una máxima actividad

de elongación celular entre pH 4,0 y 4,5. Dicha actividad se ha visto inducida por

ditioteitrol (DTT), iones de magnesio y potasio, pero inhibida por iones de aluminio, zinc

y calcio 10 mM, al cual se le atribuye estimular la rigidez de la pared celular (Hepler,

2005; Gao et al., 2008). Los estudios de la expresión génica de expansinas en trigo han

permitido aislar y caracterizar una serie de 18 y expansinas (Lin et al., 2005), las

que han aumentado en estudios posteriores. Paralelamente se ha demostrado que las

expansinas poseen distintos niveles de expresión génica y proteica en diferentes

tejidos, órganos, etapas del desarrollo y tratamientos (Gao et al., 2008, Lizana et al.,

2010). En el caso de las 18 expansinas estudiadas en los granos de trigo, éstas

mostraron una variación en la expresión génica según el crecimiento del grano, donde

algunas se expresaron en forma constitutiva y otras sufrieron aumento o disminución de

su expresión (Lin et al., 2005).

20

2.7 Implicancia de las células del pericarpio y de las expansinas en el

crecimiento y rendimiento de los granos de trigo.

La urgencia de encontrar una posible solución a los problemas de escasez

alimenticia de hoy y a futuro, hace necesario conocer más íntimamente las diferentes

componentes fisiológicas envueltas en el desarrollo y crecimiento de los granos de trigo.

Por ello, conocer los caracteres implicados en la acumulación de materia seca y de

agua al interior de los granos, el crecimiento de los mismos, el número de células

endospermáticas, la extensión de las células del pericarpio y la expresión de

expansinas, resultan clave para comprender los determinantes del peso final de los

granos, y poder contribuir a su incremento en los programas de mejora genética del

cultivo, a través de herramientas para su manipulación.

De acuerdo a los antecedentes entregados, esta tesis plantea que existe una

relación entre las dinámicas de agua, el crecimiento de las células del pericarpio y la

expresión de 6 expansinas. Para ello, se estudiarán las variables que intervienen en el

crecimiento de los granos de 2 cultivares (Bacanora y Kambara) contrastante en su

peso de grano, y se les relacionará con las dinámicas de crecimiento de las células del

pericarpio, y la expresión de expansinas en diferentes períodos del llenado de los

mismos.

21

2.8 Hipótesis y objetivos.

2.8.1 Hipótesis.

El peso final de los granos de trigo está asociado con el tamaño de las células

del pericarpio, y las dinámicas de elongación de los mismos se relacionan en el tiempo

con la expresión de expansinas.

2.8.2 Objetivo general.

Estudiar las dinámicas de crecimiento de grano de trigo, junto con la extensión

de las células del pericarpio y expresión de expansinas, para mejorar el entendimiento

de las bases fisiológicas, celulares y moleculares involucradas en la determinación del

peso potencial de los granos.

2.8.3 Objetivos específicos.

Analizar las dinámicas de la materia seca y contenido hídrico de granos en

crecimiento de 2 cultivares de trigo con diferente peso potencial de los granos.

Evaluar las relaciones entre las distintas variables a explorar, para identificar los

caracteres más asociados con el peso final de los granos.

Analizar el efecto genotípico y de posición de grano dentro de la espiga sobre las

variables del grano a estudiar.

Estudiar las dinámicas dimensionales de los granos 2 y 3 de los mismos cultivos

y relacionarlas con las dinámicas de extensión de las células del pericarpio y los

niveles de expresión de mRNA de 6 expansinas.

Identificar la secuencia génica de las 6 expansinas estudiadas.

22

3.0 MATERIALES Y MÉTODOS

3.1 Materiales.

3.1.1 Material biológico.

El estudio utilizo el material biológico de dos cultivares de trigo primaveral

(Bacanora = Bac y Kambara = Kam) de alto contraste en el peso final de los granos.

Ambos cultivares han sido liberados por Centro Internacional de Mejoramiento de Maíz

y Trigo (CIMMYT).

3.1.2 Reactivos.

MWG-Biotech: Síntesis de partidores.

Invitrogen: Set de desoxinucleótidos trifosfato (dNTPs, 100 mM), inhibidor de

ribonucleasas (RNaseOUT, 40 U/μl), transcriptasa reversa M-MLV (Moloney

Murine Leukemia Virus, 200 U/ l), DTT (0,1 M), reactivo de extracción de RNA

de plantas (PureLink Plant RNA Reagent), partidores óligo dT [Oligo(dT)20

Primer], agarosa (Ultrapure).

Sigma-Aldrich Co.: enzima celulasa (Cellulase from Aspergillus Níger), alfa-

amilasa (α-Amylase from Bacillus licheniformis Type XII-A, saline solution, 500-

1,000 units/mg protein (biuret) y Verde de metilo ~ 85%.

Merck & Co. Inc.: Acetato de calcio, ácido cítrico, fosfato de sodio dibasico,

acetato de sodio, fucsina básica, isopropanol, meta-bisulfito, carbón activo.

Fermentas: Taq DNA Polymerase (recombinant), marcador de peso molecular

(Gene Ruler 50 pb DNA Ladder).

23

Winkler: Etanol, ácido acético glacial, formaldehído, agua RNasa Free.

Vetec: Cloroformo, ácido bórico, hidróxido de sodio.

J.T. Baker: Cloruro de sodio, etanol.

Life Technology: Bromuro de etidio (GibcoBRL).

24

3.1.3 Instrumentos.

Agitador magnético, Glassco.

Cámara de Neubauer, Brand.

Balanza Analítica Excelente plus, Mettler Toledo.

Espectrofotómetro NanoDrop ND-1000, Thermo Scientific.

Freezer -70ºC MRF 401/86, Electrolux Medical Refrigeration.

Centrífuga Heraeus Christ, Heraeus Instrument.

Centrífuga refrigerada Biofuge Fresco, Heraeus Instrument.

Microondas, LG MS2047C.

Microscópio Axiolab, Carl Zeiss.

Pie de metro.

Block termoregulado Accu Block, Labnet International Inc.

Cámara digital L700, Samsung.

pHmetro, Extech Instruments.

Refrigerador y congelador ElectroCool, LG.

Congelador -20ºC FE 26, Electron.

Set de Micropipetas, Rainin.

Termociclador PTC-100TM, JM Research inc.

Termociclador PX2 Thermal Cycler, Thermo Electron Corporation.

Transiluminador, Vilber Lourmat.

Cámara de electroforesis y fuente de poder Mupid EX, Intelligent Power Supply.

Estufa termoregulada, Binder.

25

3.2 Métodos.

3.2.1 Antecedentes de cultivo.

El experimento se realizó en condiciones de campo en el fundo Santa Rosa (39º

47' 18"S, 73º 14' 5"O) de la Universidad Austral de Chile. La siembra fue el 1 de

Septiembre del 2006 y las parcelas se dispusieron bajo un diseño en bloque

completamente aleatorizado con 3 repeticiones (Figura 4), orientadas Norte-Sur. Cada

parcela presentó una densidad de siembra de 350 plantas m-2, distribuidas en 7 hileras

de 2 m de largo y espaciadas cada 15 cm.

La acidez del suelo fue controlada mediante la aplicación de cal, previo a la

siembra (4,0 t ha-1). Las parcelas se fertilizaron con N, P y K (350 Kg ha-1 KNO3, 300 Kg

ha-1 P2O5 y 120 Kg ha-1 KO2). Éstas se mantuvieron libres de enfermedades y plagas

mediante la aplicación de fungicida a las semillas (Priori: Azoxystrobin 25% p/v, 1,5 L

ha-1) e insecticida (Karate: Lambdacihalotrina 5% p/v, 150 ml ha-1) en caso de ataque

de pulgones. Las malezas se controlaron mediante remoción manual. Paralelamente,

las precipitaciones se complementaron con riego periódico para evitar posibles

deficiencias hídricas.

26

Figura 4: Distribución de las parcelas en el experimento. Diseño, orientación y

distribución de las parcelas. Donde Kam = Genotipo Kambara; Bac = Genotipo

Bacanora; R1-R2-R3 = Repeticiones; N = Norte.

2,0 m

0,9 m

7,0 m

7,0

m

1,0 m

1,0 m N

Kam R1

Kam R2

Kam R3

Bac R1

Bac R2

Bac R3

27

3.2.2 Selección de muestras.

El ciclo de cultivo y sus etapas fisiológicas fueron registrados mediante la escala

propuestas por Zadoks et al., (1974). El muestreo de los granos se realizó cada 2 o 3

días, entre los estados de bota-madurez fisiológica y antesis-madurez fisiológica.

Las muestras para expansinas se extrajeron desde bota a madurez fisiológica,

para ello se seleccionaron los granos 2 y 3 de las 4 espiguillas centrales de 4 espigas

de cada una de las parcelas, se congelaron con nitrógeno líquido y conservaron en un

congelador a -70 ºC.

Las muestras para el análisis de dimensiones de grano, células del pericarpio y

conteo de células del endosperma, se colectaron desde antesis hasta madurez

fisiológica. Se seleccionaron 6 espigas por parcela, 2 para el análisis de dimensiones, y

4 se conservaron en fijador FAA (etanol: ác. acético: agua destilada: formaldehído,

10:1:7:2) para análisis de células del pericarpio y del endosperma.

Alcanzada la madurez fisiológica del cultivo (cosecha), se colectaron 10 espigas

de cada una de las parcelas y se registraron las dimensiones físicas.

3.2.3 Medición y análisis de los componentes fisiológicos del grano.

A las 4 posiciones de granos presentes en las 2 espiguillas centrales de 2

espigas seleccionadas, se le registro el largo, alto y ancho mediante pie de metro. Se

registró el peso fresco de cada una de las posiciones de grano con una balanza

analítica de precisión y posteriormente se registró el peso seco de los mismo, tras 48 h

a 65 ºC en una estufa termoregulada. Este proceso se repitió con las muestras de

cosecha.

28

La variación del peso y las dimensiones fueron analizados bajos el programa

TBL (Table curve 2D v2.0.3 release note) respecto a los DDA. Posteriormente sus

resultantes fueron analizados estadísticamente bajo un análisis de varianza de múltiples

factores (p < 0,05; Fischer) con el programa STADISTICA 8.0.

Las dinámicas de peso, de elongación de los granos y extensión de las células

del pericarpio se adaptaron a un modelo hiperbólico. Los máximos valores, tiempos y

tasas de crecimiento se estimaron mediante un modelo lineal sujeto a 2 ecuaciones (1 y

2) con un punto de quiebre, descrito por Calderini et al., 1999b.

1. PG, LG, EC = a + bx si (x ≤ c)

2. PG, LG, EC = a + bx + bc si (x > c)

PG = Peso de grano (mg).

LG = Largo de grano (mm).

EC = Extensión celular ( m).

a = Intercepto con eje x (mg, mm y m).

b = Tasa de llenado de grano (mg d-1).

b = Tasa de elongación del grano (mm d-1).

b = Tasa de extensión celular ( m d-1).

c = Duración del llenado de grano o madurez fisiología (d).

c = Duración de la elongación de grano (d).

c = Duración de la extensión celular (d).

29

El contenido hídrico de los granos describe una curva parabólica, representada

como un modelo trilineal (ecuaciones 3, 4 y 5), semejante al modelo de Pepler et al.,

(2005). Éste fue adaptado y optimizado para TBL (Jandell, 1991), para describir los

datos de máximo contenido hídrico, la tasa acumulación de agua, duración de la

acumulación de agua, duración del contenido hídrico estable (plateau hídrico), máxima

duración del contenido hídrico estable y tasa de perdida de contenido hídrico. Este

modelo se adaptó para describir la tasa de división de las células endospermáticas y

número de células endospermáticas.

3. CH = d + ex si (x ≤ f)

4. CH = d + ef si (x > f)

5. CH = d + g(x – h) si (x ≥ h

CH = Contenido hídrico (mg).

d = Origen en eje x.

e = Tasa de acumulación de agua (mg d-1).

f = Duración de la acumulación de agua (d).

h = Máxima duración del plateau hídrico (d).

g = Tasa de perdida de agua (mm d-1).

x = Tiempo final después de antesis (d).

30

Para el cálculo del volumen del grano del grano, se consideró similar a un

elipsoide, y se determinó mediante la ecuación 6 (Miralles et al. 1998).

6. VG = 4/3 πabc

VG = Volumen de Grano

π = 3,1416

a = Largo

b = Ancho

c = Alto

3.2.4 Tinción y conteo de células endospermáticas.

La tinción de las células del endosperma del grano de trigo se realizó mediante

una modificación del método de Rijven y Wardlaw, (1966). Desde antesis, 2 granos de

cada una de las posiciones de las 2 espiguillas centrales de las espigas conservadas en

FAA, se fijaron con una solución de etanol-ácido acético (3:1) durante la noche. Se

separó y pesó el endosperma con balanza analítica. La muestra se depositó en

microtubos de 1,5 ml, se suspendió con 1,0 ml de agua destilada e incubó durante 10

minutos a 60 ºC. El endosperma tratado se tiñó con una solución de 0,3 ml de reactivo

de SCHIFF (Fucsina básica 1g, HCl 1N, Na2S2O5 1g) durante 1 hora en oscuridad. Se

lavó con agua destilada hasta eliminar totalmente el reactivo de tinción. El endosperma

lavado se digirió con 0,5 ml de tampon citrato-fosfato pH 5,0 y celulosina al 1% durante

2 horas a 40 ºC. Se maceró y centrifugó a 3.000 x g durante 20 minutos, se resuspendió

31

e incubó por 3 horas a 25 ºC con 1,75 ml de acetato de calcio 12,6 mM, 0,25 ml de

acetato de sodio 0,5 mM (pH 4,8) y 2.000 U/ml de -amilasa. La muestra teñida se

observó bajo microscopio, y contaron sus núcleos mediante cámara de neubauer.

3.2.5 Dimensiones de las células del pericarpio externo y células cruzadas.

La dimensión del largo y ancho de las CPE y células cruzadas se realizó bajo

microscopio, mediante tinción con verde de metilo (verde de metilo 1% p/v; etano- ác.

acético 99:1). Desde antesis, 2 granos de la posición 2 y 3 de las espiguillas centrales

de las espigas conservadas en FAA, se les realizó un corte en la región dorsal del

grano, se separó la capa de CPE y la capa de células cruzadas. Ambas capas fueron

bañadas con una gota de verde de metilo durante 1 minuto y lavadas con agua

destilada. Las capas teñidas se emplazaron en un portaobjeto graduado y se

visualizaron bajo microscopio a un aumento de 10X. Se capturó su imagen mediante

cámara fotográfica digital, se procesaron mediante el programa AxioVision (AxioVs40 V

4.8.1.0), y analizaron mediante el programa Excel 2003 y Stadistica 8.0.

Las muestras utilizadas para la medición del largo de las CPE fueron desde 5 a

29 DDA, con intervalos de 2 a 3 días, mientras que las mediciones para ancho de las

CPE y células cruzadas se realizaron a 5, 7, 13 y 29 DDA en Bacanora, y a los 3, 5, 13

y 27 DDA en Kambara.

3.2.6 Extracción de RNA total.

El RNA total se extrajo mediante el método descrito por el kit de extracción

PureLink Plant Reagent (Invitrogen). Para ello, los 4 granos seleccionados desde las

32

espiguillas centrales de 2 espigas de trigo, se recolectaron en un microtubos de 1,5 ml y

pulverizadon con nitrógeno liquido. A los granos triturados se le incorporó 1,0 ml de

reactivo PureLink Plan Reagent, se agitó vigorosamente y mantuvo a temperatura

ambiente por 5 minutos en forma horizontal. Se centrifugó a 12.000 x g por 2 minutos a

temperatura ambiente y transfirió el sobrenadante a un microtubo de 1,5 ml libre de

RNAsa. Se adicionó 0,2 ml de NaCl 5,0 M frío, mezcló ligeramente, se incorporó 1,2 ml

de cloroformo frío y se homogenizó mediante inversión de los tubos durante 3 minutos.

La solución se centrifugó a 12.000 x g durante 10 minutos a 4 ºC, se transfirió 0,35 ml

de la fase acuosa a un tubo de 1,5 ml libre de RNAsa, y se precipitó el RNA con 1,0 ml

de alcohol isopropílico. La muestra se incubó durante 10 minutos a temperatura

ambiente y luego se centrifugó a 12.000 x g por 10 minutos a 4 ºC. Se eliminó el

sobrenadante y se lavó el precipitado con 500 μl de alcohol etílico frío (75%). Se mezcló

suavemente, y centrifugó a 12.000 x g por 1 minutos a 4 ºC. El sobrenadante fue

removido cuidadosamente, y se dejó secar brevemente el precipitado hasta que se

evaporó todo el alcohol. Finalmente se resuspendió el sedimento con 30 μl de agua

libre de nucleasas. En los casos de presentar una solubilidad parcial del sedimento, se

re-centrifugó a 12.000 x g por 1 minutos a 4 ºC y se colectó el sobrenadante. Las

muestras purificadas de RNA se guardaron a -70 ºC.

3.2.7 Cuantificación de RNA total mediante espectrofotometría.

La cuantificación del RNA total se realizó mediante espectrofotometría, para lo

cual se midió la absorbancia a 260 nm a 2 l de muestra. Además, se determinó la

pureza del RNA, midiendo la absorbancia a 280 nm y calculando la razón A260/A280

33

(valor que debe ser superior a 1,8). La concentración aproximada de la muestra se

calculó utilizando la relación de 1 unidad de absorbancia a 260 nm que equivale a 40

µg/ml de RNA, mediante el programa informático ND-1000 v3.1.0 (NanoDrop

Technologies Inc).

3.2.8 Síntesis de cDNA total.

La RT-PCR se realizó siguiendo el procedimiento establecido por el kit-MLV

reverse Transcriptase (Invitrogen), utilizando una mezcla de oligonucleotidos poli-dT,

capaces de unirse a la cola poli a del mRNA. Para ello, se preparó en un tubo de 200 l

una solución con 7,5 μg de RNA total de cada muestra, 1,5 l del mix de dNTP (15

mM), 1,5 l de oligo dT12-18 (0,75 µg) y agua libre de nucleasas, hasta completar un

volumen de 18 l. La mezcla se incubó 5 minutos a 65 ºC y se transfirió inmediatamente

a hielo durante 2 minutos. Tras ello, se le incorporó 6 l de tampón de reacción (Tris-

HCl 75 mM, KCl 112,5 mM, MgCl2 4,5 mM, pH 8,3), 3 l de DTT 15,0 mM, 1,5 l (60

U/ l) de inhibidor de ribonucleasa recombinante (RNAsaOUT) y 1,5 l (300 U/ l) de

transcriptasa reversa (M-MLV), completando un volumen total de 30 μl. La solución

completa, se incubó 50 minutos a 37 ºC y 15 minutos a 70 ºC. El cDNA sintetizado fue

almacenado a -20 ºC para su posterior amplificación por PCR. Como control negativo

se realizó una RT-PCR siguiendo todos los pasos previamente descritos, reemplazando

el RNA por agua destilada.

34

3.2.9 Reacción de la polimerasa en cadena (PCR).

Se realizó como una reacción de PCR convencional, que utilizó como templado

el cDNA del procedimiento descrito anteriormente (3.2.8). Para ello, a un tubo estéril se

le incorporó 1,0 µl de templado, 0,5 l de cada uno de los partidores específicos (Tabla

I; 0,2 M), 0,5 l de dNTP (0,5 M), 2,5 l de tampón taq 10X, 1,5 l de MgCl2 (1,5

M), 0,125 l (0,3 U/ l) Taq polimerasa recombinante y 18,375 l agua libre de

nucleasas hasta completar un volumen de 25 l. Todas las mezcla fueron llevadas a un

termociclador, usando el programa: denaturación inicial a 94 ºC por 3 minutos, seguido

de 25 ciclos, cada uno compuesto por una denaturación a 94 ºC por 45 segundos,

apareamiento a 50 ºC por 45 segundos y extensión a 72 ºC por 45 segundos. Por

último, se realizó una extensión final a 72 ºC por 3 minutos. El producto de PCR fue

almacenado a -20 ºC, para una posterior visualización mediante electroforesis. Como

control negativo se utilizó un tubo que contenía todo lo anterior más agua como

templado (C- PCR), el segundo control negativo contenía todo lo anterior más el control

negativo de la transcripción reversa como templado (C- RT-PCR).

35

Tabla I: Secuencia de los oligonucleótidos y productos de PCR generados

desde la amplificación de los cDNA de los genes estudiados.

Gen Sentido / Antisentido Nº acceso

GenBank

Tamaño

producto (pb)

pTaExpA4 5'-AACTTCTGCCCGTCGAACTA-3'

5'-CCCTTCATGGTGAACCTCAT-3' AY543530 188

pTaExpA5 5'-ACCACATCCACACACGAGAG-3'

5'-CCACCAGCTCGAAGTAGTCC-3' AY543531 151

pTaExpA6a 5'-GTGCAACCCTCCTCGACAC-3'

5'-GGTCCCCTTCACCGACAT-3' AY543532 220

pTaExpA6b 5'-GCAACCCTCCCCGCGTC-3'


pTaExpA6c 5'-CAATCCTCCCCGCGAAC-3'


pTaExpA8 5'-ACTACGCACTCCCCAACAAC-3'

5'-AGAGCTCAAGTCACCGATGC-3' AY543534 156

18s rRNA 5'-GTGACGGGTGACGGAGAATT-3'

5'-GACACTAATGCGCCCGGTAT-3'

Tabla adaptada de Lizana et al, 2010.

36

3.2.10 Visualización de los productos amplificados.

La migración electroforética del DNA se llevó a cabo en geles de agarosa al 2%.

Para ello, se fundió 0,8 g de agarosa en un volumen de 40 ml de tampón SB 1X (0,5nM

NaOH ajustado con ácido borico a pH 8,5). La solución se enfrió hasta ~ 55 ºC y añadió

2 l de bromuro de etidio (0,5 mg/ml). Se cargó en el gel 6 l de producto de PCR, junto

a 1,0 l de tampón de carga (TBE 6X, azul de bromofenol 0,03%, xilen cianol 0,03% y

glicerol 60 %), y paralelamente 1,5 g de estándar de peso molecular de 50 pb. La

corrida de electroforesis se llevo a cabo en tampón SB 1X, a un voltaje de 135v durante

20 minutos. La visualización de los productos de PCR y estándar se realizó sobre un

trans-iluminador de luz ultravioleta, desde la cual se capturó una imagen con cámara

fotográfica digital, mediante un sistema adaptado por el laboratorio. El producto

amplificado fue semi-cuantificado respecto a una concentración del estándar de peso

molecular, utilizando los programas Gel-Pro Analyzer 3.1 y Labimage 3.4.

3.2.11 Reamplificaron y secuenciación de DNA.

Se llevó a cabo utilizando el mismo proceso de amplificación descrito en

(métodos 3.2.9), utilizando como templado el producto de PCR diluido a una razón de

1:1.000 con agua destilada. El producto de la reamplificación fue secuenciado mediante

3730xl DNA analyzer (Macrogen, Corea). Las secuencias obtenidas fueron corregidas

mediante Chromas Lite 2.01 y Geneious Pro 4.7.6., y comparadas con el programa de

búsqueda NCBI blast y Geneious Pro 4.7.6.

37

4.0 RESULTADOS

4.1 Peso de los granos de Bacanora y Kambara a cosecha.

El peso de los granos de Bacanora y Kambara fluctuó entre 36 y 66 mg, siendo

afectado por el genotipo (p < 0,05) y la posición del grano (p < 0,05). Los granos de

Kambara fueron en promedio un 14% más pesados que los de Bacanora. Al mismo

tiempo, los granos de la posición 2 de ambos genotipos alcanzaron los mayores pesos,

seguidos por los granos 1, 3 y finalmente los granos 4. El máximo peso de grano lo

obtuvo el grano 2 de Kambara, mientras que el mínimo lo alcanzó el grano 4 del mismo

genotipo (Tabla II).

38

Tabla II: Peso y dimensiones alcanzadas por las 4 posiciones de grano de los

genotipos Bacanora y Kambara a cosecha.

Caracter

Genotipo

Posición de grano

Grano 1 Grano 2 Grano 3 Grano 4

Peso (mg)

Bac 51,61c ± 1,00 56,34bc ± 1,39 51,59c ± 1,20 37,40d ± 1,83

Kam 61,47ab ± 2,00 66,22a ± 2,51 57,79bc ± 2,45 36,35d ± 3,46

Ancho (mm)

Bac 3,99ab ± 0,10 3,75bc ± 0,07 3,83ab ± 0,03 3,41cd ± 0,06

Kam 4,03ab ± 0,13 4,19a ± 0,23 4,00ab ± 0,12 3,38d ± 0,14

Alto (mm)

Bac 2,98cd ± 0,04 3,36b ± 0,01 3,02cb ± 0,02 2,73e ± 0,02

Kam 3,61a ± 0,05 3,64a ± 0,08 3,10c ± 0,05 2,88de ± 0,08

Volumen (mm3)

Bac 42,00d ± 0,99 46,69c ± 0,91 43,14d ± 0,71 31,41e ± 0,81

Kam 56,97abc ± 3,24 62,98a ± 4,97 50,30bc ± 2,61 33,94e ± 2,70

Largo (mm)

Bac 6,913d ± 0,01 7,09cd ± 0,01 7,13c ± 0,03 6,44f ± 0,04

Kam 7,46b ± 0,10 7,87a ± 0,09 7,75a ± 0,08 6,65e ± 0,09

39

4.2 Dimensiones de los granos de Bacanora y Kambara a cosecha.

El largo, ancho y alto de los granos a cosecha fueron afectados por el genotipo

(alto y ancho p < 0,001; ancho p < 0,05), alcanzando mayores dimensiones los granos

de Kambara. La posición de grano afectó las dimensiones (p < 0,001), los granos 2 de

ambos genotipos alcanzar las mayores dimensiones, seguidos de los granos 3, 1 y

finalmente los granos 4. El grano 2 de Kambara alcanzó los máximos altos, anchos y

largos, mientras que el grano 4 de Bacanora presentó las menores dimensiones, a

excepción del ancho, el cual fue registrado por el grano 4 de Kambara (Tabla II).

El largo de los granos fluctuó entre 6,4 y 7,9 mm. Los granos de Kambara fueron

en promedio un 7,0% más largos que los de Bacanora. El alto y ancho presentaron

diferencias entre genotipo y posición de forma semejantes al largo, dependiendo de la

dimensión en estudio y la posición de grano en comparación (Tabla II).

El volumen calculado siguió un comportamiento similar al de las dimensiones,

siendo afectado por el genotipo (p < 0,001) y la posición (p < 0,001). Lo anterior permitió

que los granos de Kambara fueran un 18,5% más voluminoso que los granos de

Bacanora (Tabla II).

El largo y volumen alcanzado por los granos a cosecha, mostraron una fuerte y

positiva asociación con el peso alcanzado por los mismos, independientemente del

genotipo y la posición de grano considerada (Figuras 5 y 6).

40

Largo de grano (mm)

0 2 4 6 8 10

Peso

de g

ran

o (

mg

)

0

20

40

60

80

Bac

kam

y = 19,39x - 86,54

R2 = 0,84

p < 0,01

Figura 5: Asociación entre el peso y largo alcanzado por los granos. Relación entre

el peso y el largo de los granos (Gr1, Gr2, Gr3 y Gr4) de Bacanora (Bac; círculos llenos)

y Kambara (Kam; círculos vacíos) alcanzados a cosecha. Se advierte la recta de

regresión, sensibilidad (R2), la probabilidad (p) y el error estándar de las medias (barras

verticales y horizontales).

41

Volumen de grano (mm3)

0 20 40 60 80

Peso

de g

ran

o (

mg

)

0

20

40

60

80

Bac

Kam

y = 0,96x + 8,24

R2 = 0,93

p < 0,001

Figura 6: Asociación entre el peso y volumen alcanzado por los granos. Relación

entre el peso y el volumen de los granos (Gr1, Gr2, Gr3 y Gr4) de Bacanora (Bac;

círculos llenos) y Kambara (Kam; círculos vacíos) alcanzados a cosecha. Se advierte la

recta de regresión, sensibilidad (R2), la probabilidad (p) y el error estándar de las

medias (barras verticales y horizontales).

42

4.3 Dinámicas de acumulación de peso, contenido hídrico y volumen de los

granos de Bacanora y Kambara.

A contar de antesis, las 4 posiciones de granos de ambos genotipos aumentaron

progresivamente de volumen, materia seca y agua. Estos 3 caracteres siguieron

dinámicas propias, semejantes entre genotipos y posiciones de grano, pero diferentes

en sus valores máximos, tiempos y tasas (Figuras 7 y 8).

43

Días despues de antesis

0 10 20 30 40 50 60 70

0

20

40

60

80

0 10 20 30 40 50 60 70

P S

ec

o (

mg

), C

Híd

ric

o (

mg

) y V

olu

me

n (

mm

3)

0

20

40

60

80PS

CH

Vol

a b

c d

Figura 7: Dinámicas peso seco, contenido hídrico y volumen de los granos de

Bacanora. Acumulación de peso seco (PS; círculos llenos), acumulación de contenido

hídrico (CH; círculos vacíos) y aumento de volumen (Vol; triángulos llenos) de los

granos los granos 1 (a), 2 (b), 3 (c) y 4 (d) de Bacanora desde antesis a cosecha. Las

barras verticales representan el error estándar de las medias.

44

P S

ec

o (

mg

), C

Híd

rico

(m

g)

y V

olu

men

(m

m3

)

0

20

40

60

80

100

120 PS

CH

Vol


0 10 20 30 40 50 60 70

0

20

40

60

80

100

120

0 10 20 30 40 50 60 70

a b

c d

Figura 8: Dinámicas peso seco, contenido hídrico y volumen de los granos de

Kambara. Acumulación de peso seco (PS; círculos llenos), acumulación de contenido

hídrico (CH; círculos vacíos) y aumento de volumen (Vol; triángulos llenos) de los

granos los granos 1 (a), 2 (b), 3 (c) y 4 (d) de Kambara desde antesis a cosecha. Las


45

4.3.1 Dinámicas de acumulación de peso de los granos de Bacanora y Kambara.

La acumulación de peso de los granos siguió un crecimiento sigmoideo. La fase

lag perduró bajo los 10 DDA en Bacanora (Figura 7) y sobre los 15 DDA en Kambara

(Figura 8), este período se extendió a medida que los granos se alejan del raquis. La

fase lineal se mantuvo hasta aproximadamente los 45 DDA en Bacanora y sobre los 50

DDA en Kambara. Una vez alcanzada la madurez fisiológica, los granos cesaron su

acumulación de asimilados, manteniéndose estables hasta cosecha (Figuras 7 y 8).

El análisis de la dinámica del peso, determinó que los granos de Kambara

alcanzaron mayores pesos y tasas de acumulación de materia seca que los granos de

Bacanora (p < 0,001). El efecto de la posición de grano (p < 0,001), generó que los

granos 2 de ambos genotipos alcanzaran las mayores tasas y pesos, seguidos de los

granos 1, 3 y 4 respectivamente (Tabla III).

El peso máximo y la tasa de acumulación fluctuaron entre 38,70 y 68,90 mg y

1,00 a 1,90 mg d-1 respectivamente. El efecto genotipo-posición permitió que los granos

de Kambara fueran en promedio un 13,6% más pesado, y un 24% más veloces en

acumulación de asimilados (Tabla III). La regresión lineal entre el peso de los granos a

cosecha y la tasa de acumulación de materia seca mostró una asociación positiva entre

ambas variables (Figura 9).

46

Tabla III: Determinantes de la acumulación de peso de las 4 posiciones de grano

de los genotipos Bacanora y Kambara.

Caracter

Genotipo

Posición de grano


Peso máximo de grano (mg)

Bac 53,10d ± 1,12 58,46c ± 1,44 53,49d ± 1,02 38,72f ± 1,24

Kam 64,67b ± 0,58 68,86a ± 1,64 60,46c ± 1,45 43,02e ± 1,69

Duración de fase lag (d)

Bac 5,37d ± 0,47 6,83c ± 0,34 8,23b ± 0,40 9,84a ± 0,29

Kam 8,25b ± 0,39 8,65ab ± 0,37 9,70a ± 0,52 9,85a ± 0,56

Duración de fase exponencial (d)

Bac 39,94a ± 1,64 38,95a ± 1,69 37,94ab ± 1,04 36,16ab ± 1,06

Kam 36,91ab ± 0,16 36,82ab ± 1,45 34,25b ± 0,71 35,65ab ± 2,64

Madurez fisiológica (d)

Bac 45,65ab ± 0,16 45,96ab ± 0,96 46,00ab ± 0,56 47,07a ± 1,73

Kam 43,93ab ± 1,18 44,99ab ± 1,27 43,08b ± 1,70 42,41b ± 1,73

Tasa de acumulación de materia seca (mg d-1)

Bac 1,32c ± 0,02 1,50b ± 0,01 1,42bc ± 0,01 1,04d ± 0,03

Kam 1,80a ± 0,03 1,88a ± 0,08 1,83a ± 0,04 1,45b ± 0,06

47

Tasa de acumulación de materia seca (mg d-1

)

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0

Peso

de g

ran

o(m

g)

0

20

40

60

80

Bac

Kam

y = 30,21x + 6,11

R2 = 0,66

p < 0,05

Figura 9: Asociación entre el peso de los granos a cosecha y la tasa de

acumulación de materia seca. Relación entre el peso alcanzado por los granos (Gr1,

Gr2, Gr3 y Gr4) de Bacanora (Bac; círculos llenos) y Kambara (Kam; círculos vacíos),

ante la tasa de acumulación de materia seca de los mismos. Se advierte la recta de



48

El genotipo afectó el tiempo de las 3 etapas de acumulación de materia seca

(fase lineal y plateau hídrico p < 0,05; fase lag p < 0,001), mientras que la posición de

grano solo afectó la fase lag (p < 0,001). La fase lag perduró entre 5 a 10 DDA en

Bacanora y entre 8 a 10 DDA en Kambara, y en ambos genotipos la duración del la fase

lag se extendió a medida que el grano se alejaba del raquis (Tabla III). En la fase lineal,

los granos de Bacanora crecieron aceleradamente por más de 36 días, llegando hasta

40 días de crecimiento (Gr4), mientras que los granos de Kambara no superaron los 37

días de crecimiento lineal (Tabla III). A pesar de no existir una ratificación

estadísticamente concluyente, se apreció que, a medida que los granos se alejaban del

raquis tenían un menor tiempo de crecimiento exponencial. Finalmente, los granos de

Bacanora alcanzaron madurez fisiológica a contar de los 43 DDA, mientras que los

granos de Kambara 2 días después (Tabla III).

49

4.3.2 Dinámicas de acumulación de contenido hídrico de los granos de Bacanora

y Kambara.

Los granos de Bacanora acumularon agua entre 20 y 25 DDA (Figura 7),

mientras los granos de Kambara sobre los 25 DDA (Figura 8). Todos los granos se

mantuvieron en el plateau hídrico hasta aproximadamente los 45 DDA, momento

coincidente con la madurez fisiológica, y desde el cual se registró una pérdida abrupta

del contenido hídrico (Figuras 7 y 8).

El análisis de las dinámicas determinó que el MCH fluctuó entre 50,0 y 54,5 mg, y

la tasa de acumulación de agua entre 1,15 y 2,00 mg d-1. La primera fue afectada por el

genotipo (p < 0,001) y la posición de grano (p < 0,001), mientras que la segunda solo

por la posición de grano (p < 0,001). Los granos de Kambara acumularon un 22% más

de agua (MCH) que los granos de Bacanora (Tabla IV). En ambos caracteres los granos

2 alcanzaron los mayores valores, seguidos por los granos 1, 3 y 4 (Tabla IV). El peso

logrado por los granos a cosecha puede ser explicado por el MCH alcanzado por los

mismos (Figura 10), de forma independiente del genotipo y la posición de grano. Una

relación similar se observó entre el MCH y la tasa de acumulación de agua (Figura 11).

En promedio, los granos de Bacanora alcanzaron el MCH 5 días antes que

Kambara (p < 0,001). El tiempo se extendió a medida que los granos se alejaban del

raquis (p < 0,001). El plateau hídrico perduró 23 días en los granos de Bacanora y 17

días en los de Kambara (p < 0,01; Tabla IV). Este período finalizó a los 45,5 DDA,

tiempo compartido por todas las posiciones de grano de ambos genotipos, y fue

próximo a madurez fisiológica.

50

Tabla IV: Determinantes de la acumulación de contenido hídrico de las 4

posiciones de grano de los genotipos Bacanora y Kambara.

Caracter

Genotipo

Posición de grano


Máximo contenido hídrico (mg)

Bac 38,61d ± 0,56 43,34c ± 0,63 38,40d ± 0,74 25,56f ± 0,89

Kam 52,53a ± 1,39 54,48a ± 0,64 48,89b ± 0,55 31,86e ± 0,75

Duración de la acumulación de agua (d)

Bac 20,51c ± 0,80 21,55c ± 0,14 22,50c ± 1,28 22,56c ± 1,22

Kam 25,68b ± 1,01 25,68b ± 0,72 27,60ab ± 0,81 28,56a ± 0,52

Duración del plateau hídrico (d)

Bac 23,63a ± 0,76 23,14a ± 2,05 21,82ab ± 1,12 22,58ab ± 0,52

Kam 19,42ab ± 3,80 17,24ab ± 3,94 16,74ab ± 2,06 16,03b ± 1,47

Duración máxima del plateau hídrico (d)

Bac 44,14a ± 0,72 44,68a ± 2,12 44,32a ± 1,19 45,13a ± 0,76

Kam 45,01a ± 2,98 42,92a ± 4,38 44,34a ± 1,84 44,59a ± 1,57

Tasa de acumulación de agua (mg d-1)

Bac 1,82b ± 0,07 2,02ab ± 0,06 1,89b ± 0,10 1,33c ± 0,03

Kam 1,98ab ± 0,06 2,12a ± 0,11 1,82b ± 0,07 1,17c ± 0,02

51

Máximo Contenido Hídrico (mg)

0 10 20 30 40 50 60

Pe

so

de

gra

no

(m

g)

0

20

40

60

80

Bac

Kam

y = 1,02x + 9,91

R2 = 0,92

p < 0,001

Figura 10: Asociación entre el peso y el máximo contenido hídrico. Relación entre

el peso alcanzado por los granos (Gr1, Gr2, Gr3 y Gr4) de Bacanora (Bac; círculos

llenos) y Kambara (Kam; círculos vacíos) a cosecha, ante el máximo contenido hídrico

(MCH) alcanzado por los mismos. Se advierte la recta de regresión, sensibilidad (R2), la

probabilidad (p) y el error estándar de las medias (barras verticales y horizontales).

52

Tasa de acumulación de agua (mg d-1

)

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5

Máxim

o C

on

ten

ido

Híd

rico

(m

g)

0

10

20

30

40

50

60

Bac

Kam

y = 25,01x - 2,58

R2 = 0,70

p < 0,01

Figura 11: Asociación entre el máximo contenido hídrico y la tasa de acumulación

de agua. Relación entre el máximo contenido hídrico (MCH) alcanzado por los granos

(Gr1, Gr2, Gr3 y Gr4) de Bacanora (Bac; círculos llenos) y Kambara (Kam; círculos

vacíos), ante la tasa de acumulación de agua de los mismos. Se advierte la recta de



53

4.3.3 Dinámicas de aumento de volumen de los granos de Bacanora y Kambara.

En los primeros DDA, el volumen de los granos se incrementó en forma

semejante a la acumulación de agua. Después siguieron una evolución más lenta a

medida que se aproximaban a madurez fisiológica (45,5 DDA), momento desde el cual

disminuyó el volumen. Los granos fueron capaces de aumentar su volumen desde

menos de 10 mm3 (5 DDA) hasta más de 110 mm3 (Kam Gr2) o cerca de 90 mm3 (Bac

Gr2). Los volúmenes máximos alcanzados dependieron del genotipo y la posición de de

los granos (Figuras 7 y 8).

4.4 Dinámicas de crecimiento de largo, alto y ancho de los granos de Bacanora

y Kambara.

A contar de antesis, los granos crecieron en largo, alto y ancho, sobresaliendo el

alto a las otras dimensiones. Todos los granos siguieron dinámicas semejantes,

diferenciándose en los determinantes que los afectaron (Figuras 12 y 13).

54

La

rgo

(m

m),

Alt

o (

mm

) y A

nc

ho

(m

m)

0

2

4

6

8

Largo

Alto

Ancho


0 10 20 30 40 50 60 70

0

2

4

6

8

0 10 20 30 40 50 60 70

a b

c d

Figura 12: Dinámicas de largo, alto y ancho de los granos de Bacanora. Variación

de las dimensiones de largo (círculos llenos), alto (círculos vacíos) y ancho (triángulos

llenos) de los granos 1 (a), 2 (b), 3 (c) y 4 (d) de Bacanora desde antesis a cosecha.

Las barras verticales representan el error estándar de las medias.

55

Larg

o (

mm

), A

lto

(m

m)

y A

nch

o (

mm

)

0

2

4

6

8

Largo

Alto

Ancho


0 10 20 30 40 50 60 70

0

2

4

6

8

0 10 20 30 40 50 60 70

a b

c d

Figura 13: Dinámicas de largo, alto y ancho de los granos de Kambara. Variación

de las dimensiones de largo (círculos llenos), alto (círculos vacíos) y ancho (triángulos

llenos) de los granos 1 (a), 2 (b), 3 (c) y 4 (d) de Kambara desde antesis a cosecha. Las


56

4.4.1 Dinámicas de elongación de los granos de Bacanora y Kambara.

Los granos se alargaron aceleradamente hasta aproximadamente 15 DDA,

momento desde el cual se mantuvieron en forma estable hasta madurez fisiológica (~45

DDA). Con posterioridad a la madurez los granos mostraron una leve reducción en el

largo (Figuras 12 y 13).

El análisis de las dinámicas determinó que los granos alcanzaran una elongación

máxima entre 6,7 y 8,4 mm, dependiendo del efecto genotipo-posición (p < 0,001). Los

granos de Kambara fueron un 9,3% más largos que los de Bacanora. Las posiciones de

grano 2 alcanzaron la mayor longitud en contraparte a los granos 4 (Tabla V). El largo

máximo alcanzado por los granos presento una fuerte asociación con el MCH,

independientemente del genotipo y la posición (Figura 14).

A contar de los 15 DDA los granos de Bacanora detuvieron su elongación

acelerada, mientras que los Kambara fue a contar de los 20 DDA (p < 0,001; Tabla V).

En ambos genotipos el tiempo de elongación se hizo mayor a medida que los granos se

alejaban del raquis (p < 0,05). Los granos de Bacanora y Kambara demoraran 2 y 4,3

días en finalizar su proceso de elongación (Tabla V). En promedio, la tasa de

elongación de los granos fue un 12% mayor en Bacanora (Tabla V), siendo este rasgo

afectado principalmente por el genotipo (p < 0,01).

57

Tabla V: Determinantes de la elongación de las 4 posiciones de grano de los

genotipos Bacanora y Kambara.

Caracter

Genotipo

Posición de grano


Máxima elongación del grano (mm)

Bac 7,31de ± 0,02 7,57c ± 0,06 7,41cd ± 0,07 6,72f ± 0,05

Kam 8,08b ± 0,09 8,43a ± 0,07 8,32a ± 0,06 7,20e ± 0,01

Duración de la elongación (d-1)

Bac 15,42d ± 0,74 16,68cd ± 0,95 18,37bc ± 0,49 19,74ab ± 1,21

Kam 20,00ab ± 0,97 20,59a ± 1,09 21,48a ± 0,71 22,00a ± 1,14

Tasa de elongación (mm d-1)

Bac 0,30a ± 0,01 0,30a ± 0,02 0,31a ± 0,01 0,29ab ± 0,01

Kam 0,24c ± 0,01 0,27abc ± 0,01 0,28abc ± 0,01 0,25bc ± 0,02

58

Máximo Contenido Hídrico (mg)

0 10 20 30 40 50 60Má

xim

a e

lon

ga

ció

n d

e g

ran

o (

mm

)

0

2

4

6

8

Bac

Kam

y = 0,06x + 5,26

R2 = 0,93

p < 0,001

Figura 14: Asociación entre la máxima elongación de los granos y el máximo

contenido hídrico. Relación entre el máximo contenido hídrico alcanzado por los

granos (Gr1, Gr2, Gr3 y Gr4) de Bacanora (Bac; círculos llenos) y Kambara (Kam;

círculos vacíos), ante la máxima elongación alcanzada por los mismos. Se advierte la

recta de regresión, sensibilidad (R2), la probabilidad (p) y el error estándar de las

medias (barras verticales y horizontales).

59

4.4.2 Dinámica de alto y ancho de los granos de Bacanora y Kambara.

Antes de los 5 DDA el alto y ancho de los granos de ambos genotipos no

superaba los 2 mm. Ambas dimensiones siguieron una dinámica de crecimiento

semejante, diferenciándose en las magnitudes de sus dimensiones. Este crecimiento,

permitió alcanzar un alto y ancho máximo cercano a los 4 mm y 5 mm respectivamente.

Estos valores fueron alcanzados cerca de madurez fisiológica (~45 DDA), momento

desde el cual experimentaran un reducción en sus dimensiones. Las 2 dimensiones

presentaron variaciones según el genotipo y la posición de grano (Figuras 12 y 13).

60

4.5 Dinámicas del número de células del endosperma de los granos de

Bacanora y Kambara.

Una mínima o nula presencia de células del endosperma se registró en los

granos durante los primeros DDA (< 5 DDA). Desde esa fecha, se apreció una

significativa división celular, sobrepasando las 150.000 células por grano a los 18 DDA,

momento desde el cual se registró una disminución en su número (Figuras 15a y 15b).

El genotipo (p < 0,05) y la posición de grano (p < 0,001) provocaron que el

número de células del endosperma fluctuara entre 150.000 y 280.000. Los granos de

Bacanora alcanzaran un mayor número de células. Al mismo tiempo, en ambos

genotipos el número de células del endosperma disminuyó a medida que el grano se

ajaba del raquis (Tabla VI). La regresión lineal entre el peso de los granos a cosecha y

el máximo número de células del endosperma mostró una asociación positiva, pero de

baja sensibilidad (p = 0,06; Figura 16).

Tanto el tiempo en alcanzar el máximo número de células, como la tasa de

división celular fueron afectadas por el genotipo (p < 0,01) y la posición de grano (p <

0,001). Por ello, los granos de Bacanora alcanzaron el máximo número de células

endospermáticas 3 días antes que los de Kambara (18,2 DDA). Este tiempo se amplió a

medida que los granos se ajaban del raquis (Tabla VI). Las tasas de división celular

siguieron un comportamiento semejante al rasgo previamente analizado, y al mismo

tiempo presentaron una asociación positiva ante el máximo número de células del

endosperma (p < 0,001; Tabla VI y Figura 17).

61

Nº

de c

élu

las d

el

en

do

sp

erm

a (

10

3)

0

50

100

150

200

250

300Gr1

Gr2

Gr3

Gr4


0 5 10 15 20 25

0

50

100

150

200

250

300

a

b

Figura 15: Dinámicas del número de células del endosperma. Variación en el

número de células del endosperma de los granos 1 (Gr1; círculos llenos), 2 (Gr2;

círculos vacíos), 3 (Gr3; triángulos llenos) y 4 (Gr4; triángulos vacíos) de Bacanora (a) y

Kambara (b) desde antesis hasta 25 días después de antesis. Las barras verticales

representan el error estándar de las medias.

62

Tabla VI: Determinantes de las células endospermáticas de las 4 posiciones de

grano de los genotipos Bacanora y Kambara.

Caracter

Genotipo

Posición de grano


Máximo número de células (Nº cel)

Bac 277.996a ± 17.389 256.786

ab ± 14.723 273.042

a ± 10.302 219.257

b ± 15.182

Kam 275.211a ± 29.420 246.277

ab ± 17.753 238.247

ab ± 42.127 158.094

c ± 26.495

Tasa de división celular (Nº cel d-1)

Bac 25.900a ± 308 21.662

abc ± 1.325 22.460

ab ± 2.060 17.058

c ± 921

Kam 21.324abc

± 717 17.064c ± 3.648 20.527

b ± 1.068 10.764

d ± 1.429

Duración de la división celular (d)

Bac 15,29d ± 0,04 16,96

cd ± 0,42 18,88

bc ± 0,22 19,91

ab ± 0,62

Kam 18,19bc

± 0,84 19,43ab

± 0,48 18,90bc

± 0,78 21,24a ± 1,18

63

Nº células endospermáticas (10

3)

0 50 100 150 200 250 300 350

Pe

so

de

gra

no

(m

g)

0

20

40

60

80

Bac

Kam

y = 1,8x10-4

+ 8,05

R2 = 0,46

p = 0,06

Figura 16: Asociación entre el peso y el número de células endospermáticas de

los granos. Relación entre el peso alcanzado por los granos (Gr1, Gr2, Gr3 y Gr4) de

Bacanora (Bac) y Kambara (Kam) a cosecha, ante el máximo número de células del

endosperma de los mismos. Se advierte la recta de regresión, sensibilidad (R2), la

probabilidad (p) y el error estándar de las medias (barras verticales y horizontales).

64

Tasa de division celular (10

3cel d

-1)

0 5 10 15 20 25 30

Nº

cé

lula

s e

nd

osp

erm

áti

cas

(10

3)

0

50

100

150

200

250

300

350

Bac

Kam

y = 8,09x + 84641,30

R2 = 0,86

p < 0,001

Figura 17: Asociación entre la tasa de división celular y el máximo número de

células del endosperma. Relación entre la máxima tasa de división celular de los

granos (Gr1, Gr2, Gr3 y Gr4) de Bacanora (Bac) y Kambara (Kam), ante el máximo

número de células del endosperma alcanzado por llos mismos. Se advierte la recta de



65

4.6 Extensión de las células del pericarpio de los granos 2 y 3 de Bacanora y

Kambara.

4.6.1 Extensión de las células del pericarpio externo de los granos 2 y 3 de

Bacanora y Kambara.

Antes de los 5 DDA, las CPE de los granos 2 y 3 presentaron largos y anchos

dispares, ambas dimensiones mostraron un crecimiento continuo en función del tiempo,

haciéndose más amplias sus diferencias en tamaño (Figuras 18 y 19). Cerca de antesis,

el largo de las CPE no superó los 40 m y el ancho fue menor a 14 m (Tabla VII). A los

29 DDA, las células de Bacanora ampliaron el largo y ancho a 150 m y 28 m,

respectivamente. Las células de Kambara sobrepasaron los 170 m de largo y 25 m

de ancho (Tabla VII). El crecimiento continuo de las células las llevó a duplicar su ancho

y extender su largo hasta más de 8 veces el tamaño inicial.

66

Figura 18: Crecimiento de las células del pericarpio externo de los granos 2 y 3 de

Bacanora. Variación de tamaño de las células del pericarpio externo de los granos 2 (a,

b y c) y 3 (d, e y f) de Bacanora, a diferente días después de antesis (5, 13 y 29 DDA).

Las células se tiñeron con verde de metilo, se indica el ancho (flecha negra) y largo

(flecha roja) de las paredes celulares. El tamaño de referencia es de 50 m, y la imagen

de 27 DDA fue reducida (2:1) para una mejor visualización de las células.

Bac Gr2

50 µm 50 µm50 µm

5 13 29

DDA

50 µm 50 µm

Bac Gr3

5 13 29

DDA

a b c

d e f

67

Figura 19: Crecimiento de las células del pericarpio externo de los granos 2 y 3 de

Kambara. Variación de tamaño de las células del pericarpio externo de los granos 2 (a,

b y c) y 3 (d, e y f) de Kambara, a diferente días después de antesis (3, 13 y 27 DDA).

Las células se tiñeron con verde de metilo, se indica el ancho (flecha negra) y largo

(flecha roja) de las paredes celulares. El tamaño de referencia es de 50 m, y la imagen

de 27 DDA fue reducida (2:1) para una mejor visualización de las células.

Kam Gr2

3 13 27

DDA

Kam Gr3

3 13 27

DDA

50 µm 50 µm 50 µm

50 µm50 µm 50 µm

a b c

d e f

68

Tabla VII: Variación de tamaño de las células del pericarpio externo de los granos

2 y 3 de los genotipos Bacanora y Kambara.

Posición de grano

Caracter

Genotipo

Grano 2 Grano 3

Tamaño inicial Tamaño final Tamaño inicial Tamaño final

Largo células pericarpio ( m)

Bac 41,28a ± 6,54 155,12ª1 ± 4,42 25,61ab ± 1,52 158,71ª1 ± 6,12

Kam 30,26ab ± 7,99 170,43ª1 ± 7,85 20,27b ± 4,34 164,60ª1 ± 2,23

Ancho células pericarpio ( m)

Bac 12,74ª2 ± 0,66 29,78ª3 ± 1,45 12,49ª2 ± 0,58 27,42ab3 ± 0,38

Kam 13,60ª2 ± 2,07 26,02b3 ± 1,20 11,94ª2 ± 0,68 25,28b3 ± 0,25

69

4.6.2 Dinámicas de la extensión de las células del pericarpio externo de los

granos 2 y 3 de los genotipo Bacanora y Kambara.

Las CPE de los granos 2 y 3 de Bacanora se extendieron longitudinalmente

hasta aproximadamente 20 DDA (Figura 20a) y las células de Kambara superaron dicho

periodo (Figura 20b). Desde ese momento, las células detuvieron su extensión y

mantuvieron valores constantes. Las 2 posiciones de grano siguieron dinámicas de

crecimiento semejantes, alcanzando el mismo tamaño, tasa y tiempo de extensión de

sus células (Figuras 20a y 20b).

El análisis de las dinámicas de las CPE, determinó que el largo máximo

alcanzado por las células de Bacanora fue de 150 m, mientras que las células de

Kambara fueron 20 m más largas (Tabla VIII). Las CPE de Kambara se extendieron

hasta los 25,5 DDA, mientras que las de Bacanora hasta los 15 DDA. La tasa de

extensión celular fluctuó entre 6,2 y 10,7 m d-1, siendo superior en Bacanora (Tabla

VIII). Estos 3 determinantes de la extensión de las CPE fueron afectados por el

genotipo (p <0,001), pero presentaron escasas o nulas diferencias entre las 2

posiciones de grano.

70


0 10 20 30 40

0

40

80

120

160

200 b

La

rgo

cé

lula

s p

eri

ca

rpio

ex

tern

o (

m)

0

40

80

120

160

200 Gr2

Gr3 a

Figura 20: Dinámicas de extensión de las células del pericarpio externo. Variación

del largo de las células del pericarpio de los granos 2 (Gr2; círculos llenos) y 3 (Gr3;

círculos vacíos) de Bacanora (a) y Kambara (b) desde antesis hasta 35 días después de

antesis. Las barras verticales representan el error estándar de las medias.

71

Tabla VIII: Determinantes de la extensión de las células del pericarpio de los

granos 2 y 3 de los genotipo Bacanora y Kambara.

Caracter

Genotipo

Posición de grano

Grano 2 Grano 3

Máxima extensión celular ( m)

Bac 148,87b ± 2,62 143,34b ± 2,82

Kam 172,80a ± 3,29 171,94a ± 2,50

Duración de la extensión celular (d)

Bac 15,66b ± 0,34 15,24b ± 0,70

Kam 25,55a ± 0,46 26,43a ± 1,35

Tasa de extensión celular ( m d-1)

Bac 9,17b ± 0,25 10,70b ± 1,03

Kam 6,43a ± 0,46 6,27a ± 0,30

72

4.6.3 Similitud entre las dinámicas de extensión longitudinal de las células del

pericarpio externo y la elongación de los granos 2 y 3 de Bacanora y

Kambara.

Las dinámicas de extensión de las CPE de los granos 2 y 3 de Bacanora,

siguieron un patrón de crecimiento longitudinal idéntico a la elongación de los mismos

granos, alargándose aceleradamente hasta aproximadamente los 15 DDA, continuando

con una menor variación de tamaño a medida que se acercaron a las máximas

dimensiones (20 DDA). Desde esa fecha los granos y células se mantuvieron en forma

constante (Figuras 21a y 21b).

En Kambara se repitió la similitud entre las dinámicas de elongación de los

granos y la extensión de las CPE. Ambas siguieron un aumento continuo de tamaño

desde antesis hasta aproximadamente 25 DDA, momento a partir del cual detuvieron su

extensión (Figuras 22a y 22b).

La variación de elongación de los granos y de extensión de las CPE, desde

antesis a los máximos fue mayor a nivel celular, este caracter generó que las tasas de

extensión celular sean más abruptas que las de elongación de los mismos granos

(Figuras 21a, 21b, 22a y 22b).

73

La

rgo

de

cé

lula

s d

el

pe

ric

arp

io e

xte

rno

(m

)

0

50

100

150

200

La

rgo

de

gra

no

(m

m)

0

2

4

6

8

10Largo CPE

Largo Gr

a


0 10 20 30 40

0

50

100

150

200

0

2

4

6

8

10b

Figura 21: Dinámicas de extensión celular y del largo de los granos de Bacanora.

Variación en el largo de las células del pericarpio externo (Largo CPE; círculos llenos)

de los granos 2 (a) y 3 (b) de Bacanora ante el largo de grano (círculos vacíos) de los

mismos. Las líneas verticales corresponden al error estándar de las medias.

74

La

rgo

de

cé

lula

s d

el

pe

ric

arp

io e

xte

rno

(m

)

0

50

100

150

200

La

rgo

de

gra

no

(m

m)

0

2

4

6

8

10Largo CPE

Largo Gr

a


0 10 20 30 40

0

50

100

150

200

0

2

4

6

8

10b

Figura 22: Dinámicas de extensión celular y del largo de los granos de Kambara.

Variación en el largo de las células del pericarpio externo (Largo CPE; círculos llenos)

de los granos 2 (a) y 3 (b) de Kambara ante el largo de grano (círculos vacíos) de los

mismos. Las líneas verticales corresponden al error estándar de las medias.

75

4.6.4 Similitud entre las dinámicas de extensión del ancho de las células del

pericarpio externo y el crecimiento del ancho de los granos 2 y 3 de

Bacanora y Kambara.

En los granos 2 y 3 de ambos genotipos, las CPE extendieron su ancho en forma

progresiva, siguiendo una dinámica de crecimiento relativamente semejante al

crecimiento del ancho de los mismos granos. Los granos de Bacanora mostraron una

leve superioridad en el ancho de las CPE, pero no es estadísticamente concluyente

(Figuras 23a y 23b).

76


0 10 20 30 40 50 60

0

10

20

30

40

0

2

4

6

An

ch

o d

e c

élu

las d

el

peri

carp

io e

xte

rno

(m

)

0

10

20

30

40

An

ch

o d

e g

ran

o (

mm

)

0

2

4

6

Ancho CPE Gr2

Ancho CPE Gr3

Ancho Gr2

Ancho Gr3

a

b

Figura 23: Dinámicas del ancho celular y ancho de los granos. Comparación entre

las dinámicas de crecimiento del ancho de los granos 2 (círculos llenos) y 3 (círculos

vacíos) de Bacanora (a) y Kambara (b) ante el crecimiento del ancho de las células del

pericarpio externo de los mismos granos (CPE Gr2: gris oscuro; CPE Gr3: gris claro).

Las líneas verticales corresponden al error estándar de las medias.

77

4.6.5 Extensión de las células cruzadas de los granos 2 y 3 de Bacanora y

Kambara.

Próximo a antesis (< 5 DDA), las dimensiones de las células cruzadas de los

granos 2 y 3 de ambos genotipos fueron menores a 40 m de largo y 7 m de ancho,

siendo levemente mayores las dimensiones de las células de Bacanora (Figuras 24 y

25). Tras 27 DDA, las células cruzadas alcanzaron tamaños superiores a 110 m y 16

m de ancho (Tabla IX). Este crecimiento permitió a las células de los granos de

Bacanora duplicar su ancho y triplicar su largo, mientras que las células de Kambara

superaron esas diferencias de tamaño (Tabla IX).

78

Figura 24: Crecimiento de las células cruzadas de los granos 2 y 3 de Bacanora.

Variación de tamaño de las células cruzadas de los granos 2 (a, b y c) y 3 (d, e y f) de

Bacanora, a diferente días después de antesis (5, 13 y 29 DDA). Las células se tiñeron

con verde de metilo, se indica el ancho (flecha negra) y largo (flecha roja) de las

paredes celulares. El tamaño de referencia es de 50 m, y la imagen de 27 DDA fue

reducida (2:1) para una mejor visualización de las células.

Bac Gr2

5 13 29

DDA

Bac Gr3

5 13 29

DDA

50 µm 50 µm 50 µm

50 µm 50 µm 50 µm

a b c

d e f

79

Figura 25: Crecimiento de las células cruzadas de los granos 2 y 3 de Kambara.

Variación de tamaño de las células cruzadas de los granos 2 (a, b y c) y 3 (d, e y f) de

Kambara, a diferente días después de antesis (3, 13 y 27 DDA). Las células se tiñeron

con verde de metilo, se indica el ancho (flecha negra) y largo (flecha roja) de las

paredes celulares. El tamaño de referencia es de 50 m, y la imagen de 27 DDA fue

reducida (2:1) para una mejor visualización de las células.

Kam Gr2

3 13 27

DDA

Kam Gr3

3 13 27

DDA

50 µm 50 µm50 µm

50 µm 50 µm 50 µm

a b c

d e f

80

Tabla IX: Variación de tamaño de las células cruzadas de los granos 2 y 3 de los

genotipo Bacanora y Kambara.

Posición de Grano

Caracter

Genotipo

Grano 2 Grano 3

Tamaño inicial Tamaño final Tamaño inicial Tamaño final

Largo células cruzadas ( m)

Bac 44,20ª2 ± 3,26 126,56ab3 ± 7,88 38,08ab2 ± 2,20 109,29bc3 ± 5,71

Kam 30,37bc2 ± 4,00 127,71ª3 ± 4,43 26,09c2 ± 3,28 98,19c3 ± 1,17

Ancho células cruzadas ( m)

Bac 8,08a ± 0,46 18,49ª1 ± 2,80 7,17ab ± 0,22 14,48ª1 ± 0,40

Kam 6,42b ± 0,15 16,37ª1 ± 0,44 6,33b ± 0,40 15,79ª1 ± 0,50

81

4.6.6 Similitud entre las dinámicas de extensión de las células cruzadas y el

crecimiento del ancho de los granos 2 y 3 de Bacanora y Kambara.

Las células cruzadas de los granos 2 y 3 de ambos genotipos, crecieron en

forma progresiva en función del tiempo, tanto en ancho como en largo (transversal al

grano). Esta última presentó una dinámica relativamente semejante al crecimiento del

ancho de los mismos granos (Figuras 26a y 26b). Este caracter mostró una baja

diferencia a nivel de genotipo y posición de grano.

82

La

rgo

cé

lula

s c

ruza

da

s (

m)

0

20

40

60

80

100

120

140

160

An

ch

o d

e g

ran

o (

mm

)

0

2

4

6

Largo CC Gr2

Largo CC Gr3

Ancho Gr2

Ancho Gr3

a


0 10 20 30 40 50 60

0

20

40

60

80

100

120

140

160

0

2

4

6b

Figura 26: Dinámicas del largo de las células cruzadas y ancho de los granos.

Comparación entre la variación del largo de las células cruzadas (CC) de los granos 2

(círculos llenos) y 3 (círculos vacíos) de Bacanora (a) y Kambara (b), ante la dinámica

de ancho de los mismos (CC Gr2: gris oscuro; CC Gr3: gris claro). Las líneas verticales

corresponden al error estándar de las medias.

83

4.7 Expresión de expansinas en los granos 2 y 3 de los genotipos Bacanora y

Kambara.

El tamaño de los productos de las 6 expansinas, fueron similares a los productos

planteados teóricamente (Tabla I; Figura 27). El control positivo 18S se expresó en

forma constitutiva. Los controles negativos de RT-PCR y PCR confirmaron la ausencia

de RNA y DNA contaminante en las preparaciones (Figura 27).

La reamplificación (materiales y métodos 3.2.11), secuenciación (Macrogen,

Corea) y análisis (Geneious Pro 4.7.6. y ClustalX) de los productos de PCR de 4

expansinas (pTaExpA6c, pTaExpA4, pTaExpA5 y pTaExpA8), confirmó su relación e

identidad con otras expansinas previamente descritas (BLASTn). La pTaExpA6c

presentó un 94% de identidad con la familia de expansinas A6, la pTaExpA4 tuvo un

91% de identidad con la expansinas A4, la pTaExpA5 reveló una identidad del 100%

con las A4 y finalmente la pTaExpA8 presentó una identidad del 96% con las

expansinas de trigo A8 (Tabla X).

84

Figura 27: Peso molecular de las 6 expansinas, 18S y controles negativos. Peso

molecular de los productos de PCR de las 6 expansinas (Tabla I) estudiadas, del control

positivo (18S) y de los controles negativos (PCR y RT-PCR). Se indica el peso

molecular del estándar de 50 pb y el peso molecular de los productos de PCR (M).

85

Tabla X: Productos de PCR reamplificados e identidad con otras expansinas

previamente descritas.

Expansinas pb Nº de

Acceso

Gen

expansinas Identidad

pTaExpA6c 182 AY543532 TaExpA6 94%

pTaExpA4 148 AY543530 TaExpA4 91%

pTaExpA5 74 FN556067 TaExpA5 100%

pTaExpA8 97 AY543534 TaExpA8 96%

86

4.7.1 Niveles de expresión de las 6 expansinas en los granos 2 y 3 de los


Los máximos niveles de expresión de las 6 expansinas se registraron en los

primeros DDA, estos disminuyeron en función del tiempo. Este comportamiento fue

relativamente semejante en los 2 genotipos y granos (Figuras 28a, 28b, 29a y 29b).

Individualmente, el grano 2 de Bacanora presentó las mayores expresiones de

expansinas a los 6 y 11 DDA, con una escasa variación entre ambas fechas. Desde los

18 DDA, las 6 expansinas declinaron su expresión. A los 26 y 34 DDA las expansinas

presentaron su menor expresión, con escasa diferencias entre ellas (Figura 26a).

En el grano 3 de Bacanora, las 6 expansinas declinaron su expresión a medida

que transcurrían los DDA, pero esta disminución varió de acuerdo a la repetición y

expansina estudiada. Por ejemplo, la pTaExpA5 (R1) prolongó la máxima expresión

hasta los 18 DDA, mientras que las restantes siguieron una dinámica semejante a las

del grano 2 (Figura 28b). En la repetición 2 (R2), las 6 expansinas mantuvieron una alta

expresión hasta los 18 DDA, posteriormente declinaron la expresión en forma abrupta

(Figura 28b). Finalmente, la repetición 3 (R3), advirtió una paulatina disminución en

expresión de las expansinas a medida que aumentaban los DDA (Figura 28b).

La expresión de las 6 expansinas en los granos 2 y 3 de Kambara, siguieron un

comportamiento semejante al de los granos de Bacanora. A los 4, 9 e inclusive 16 DDA,

presentaron la mayor expresión, seguido de una disminución de las mismas. Un caso

particular lo presentó la repetición 2 (R2) en ambos granos, donde a los 4 DDA registró

una baja expresión, la cual aumentó en las siguientes mediciones (9 y 16 DDA) y

posteriormente volvió a disminuir (Figuras 29a y 29b).

87

Figura 28: Expresión de las expansinas en los granos 2 y 3 de Bacanora.

Expresión de las 6 expansinas (pTaExpA6a, pTaExpA6b, pTaExpA6c, pTaExpA4,

pTaExpA5 y pTaExpA8) y control positivo (18S) en los granos 2 (a) y 3 (b) de Bacanora.

Se registran las 3 repeticiones de cultivo (R1, R2 y R3) y los distintos DDA (6, 11, 18, 26

y 34) en que se realizó la amplificación.

a

b

88

Figura 29: Expresión de las expansinas en los granos 2 y 3 de Kambara. Expresión

de las 6 expansinas (pTaExpA6a, pTaExpA6b, pTaExpA6c, pTaExpA4, pTaExpA5 y

pTaExpA8) y control positivo (18S) en los granos 2 (a) y 3 (b) de Kambara. Se registran

las 3 repeticiones de cultivo (R1, R2 y R3) y los distintos DDA (6, 11, 18, 26 y 34) en

que se realizó la amplificación.

a

b

89

4.7.2 Dinámicas de expresión de las 6 expansinas en los granos 2 y 3 de los


La semicuantificación y posterior normalización de los productos de PCR, reveló

que la expresión del control positivo 18S se mantuvo en forma constitutiva y semejante

en cada una de las repeticiones (Figuras 30a, 30b, 30c y 30d). La expresión de las 6

expansinas en ambos genotipos mostró un decaimiento sigmoideo en función del

tiempo (DDA). Las 2 fechas más cercanas a antesis presentaron la mayor expresión de

las expansinas. Con posterioridad (> 18 DDA), se registró una disminución en la

expresión de las 6 expansinas, haciéndose menor a medida que transcurrían los días,

donde las 2 últimas fechas de muestreo presentaron menor expresión (26 DDA y 34

DDA). Los granos 3 de ambos genotipos siguieron una dinámica semejante, pero más

distendida en el tiempo. A nivel de genotipo, los granos de Bacanora registraron una

menor expresión de expansinas en las ultimas fechas de análisis (Figuras 30b y 30d).

90


0 10 20 30

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

0 10 20 30

Exp

resio

n d

e e

xp

an

sin

as(%

rela

tivo

)

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

pTaExpA6a

pTaExpA6b

pTaExpA6c

pTaExpA4

pTaExpA5

pTaExpA8

18S

a b

c d

Figura 30: Dinámica de expresión de las expansinas de Bacanora y Kambara.

Variación en la expresión de las 6 expansinas (pTaExpA6a: círculos llenos, pTaExpA6b.

círculos vacíos, pTaExpA6c: triángulos llenos, pTaExpA4: triángulos vacíos, pTaExpA5:

cuadrados llenos y pTaExpA8: cuadrados vacíos) y el control positivo (18S: rombos

llenos) a diferentes DDA de los granos 2 y 3 de Bacanora (a y b) y Kambara (c y d). Los

gráficos muestra el promedio del decaimiento en porcentaje relativo de las distintas

expansinas y el error estándar de la media. La línea continua representa el promedio

del decaimiento de la expresión de las expansinas.

91

4.7.3 Dinámicas de expresión de expansinas, de elongación y acumulación de

contenido hídrico de los granos 2 y 3 de los genotipos Bacanora y

Kambara.

En promedio, hasta los 11 DDA los granos 2 de ambos genotipos presentaron la

máxima expresión de expansinas, momento paralelo a una fuerte acumulación de agua

al interior de los granos, y un acelerado alargamiento de los granos y células del

pericarpio. A contar de los 16 y 18 DDA diminuyó la expresión de las expansinas, al

igual que la tasa de alargamiento de los granos, mientras se mantenía la acelerada

acumulación de agua. Finalmente, las expansinas tuvieron su menor expresión después

de 24 y 26 DDA, momentos en los cuales los granos habían detenido su elongación y el

contenido hídrico se mantenía estable (Figuras 31a y 31c).

En los granos 3 de ambos genotipos, la máxima expresión se extendió

levemente hasta los 16 y 18 DDA, período en que los granos aún se encontraban en

activo alargamiento y captación de agua. Posteriormente, la expresión de expansinas

disminuyó progresivamente, mostrando su menor expresión a los 32 y 34 DDA,

momento en la cual los granos cesaron su alargamiento y el contenido hídrico se

mantenía estable (Figuras 31b y 31d).

92

La

rgo

de

gra

no

, c

on

ten

ido

hid

ric

o,

ex

pre

sio

n d

e e

xp

an

sin

as

(%

re

lati

vo

)

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

E Exp

Largo Gr

CH

a

0 10 20 30 40

d


0 10 20 30 40

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0c

b

Figura 31: Dinámicas de expresión de expansinas, elongación de los granos y

contenido hídrico de los granos. Comparación entre el promedio de las dinámicas de

expresión de las expansinas (E Exp: círculos llenos y línea continua), las dinámicas de

elongación (largo Gr: círculos vacíos y línea discontinua) y de acumulación de agua

(CH: cuadrados llenos y línea punteada) de los granos 2 y 3 de Bacanora (a y b) y

Kambara (c y d) desde antesis a 50 DDA. Se ilustran las curvas representativas de las

diferentes dinámicas.

93

5.0 DISCUSIÓN

Los dos genotipos (Bacanora y Kambara) estudiados confirmaron sus diferencias

de peso (inferido de Rajaram, 2005), a la vez presentaron diferencias en las dinámicas

de crecimientos y caracteres que las diferencian (Miralles y Slafer, 1995). Esto potencia

a los genotipos estudiados como buenos modelos de análisis comparativo de trigo.

Constantemente los granos de las posiciones 1, 2 y 3 de Kambara superaron a los de

Bacanora en peso, volumen, largo, alto y ancho, además de los determinantes de la

elongación y contenido hídrico, entre otros. Los granos 4 de ambos genotipos

presentaron dinámicas y determinantes de crecimiento más retrasadas, erráticas y de

menor valoración, provocando una proximidad estadística entre ambos genotipos (Tabla

II, III, IV y otras).

Las mayores dimensiones, contenidos hídricos y tasas crecimiento logrados por

los granos de la posición 2, le permitieron alcanzar mayores volúmenes y pesos de

grano (Saini y Wesgate, 2000). Los granos 1 y 3 siguieron dinámicas de crecimiento

menores a las del grano 2, pero relativamente semejante entre ellos. El grano 4

presento las menores valoraciones a excepción del tiempo. Estos resultados

concuerdan con trabajos anteriores (Saini y Westgate, 2000; Calderini y Reynolds,

2000; Wardlaw et al., 1995).

El rango de peso alcanzado por los granos a cosecha (36,0 a 66,5 mg), es mayor

al reportado por los estudios de trigo con períodos de llenado extendidos (39-59 mg;

Dimmock y Gooding, 2002). El peso de los granos registró una alta correlación con el

volumen (Figura 6; Saini y Wesgate, 2000), el MCH (Figura 10; Saini y Wesgate, 2000)

94

y la tasa de acumulación de materia seca (Figura 9) de los mismos. Estas asociaciones

explican que el peso de los granos no solo fue efecto de la tasa de llenado, sino que

tienen una íntima asociación con el volumen y el contenido hídrico.

La dinámica de peso de los granos desde antesis a madurez fisiológica, describió

una curva de crecimiento sigmoideo (Satorre et al., 2003). El período de lento

crecimiento (Fase lag) fue mayor en los granos de Kambara (Tabla III, Figuras 7 y 8).

Los granos de Kambara se mantuvieron en crecimiento exponencial bajo 45 días, los

granos de Bacanora extendieron esta etapa 2 días. El menor tiempo de fase

exponencial y el mayor peso alcanzado por los granos de Kambara, determinó que la

diferencia de peso entre ambos genotipos y posiciones de grano, es producto de la tasa

de acumulación de materia seca, en lugar de la duración del llenado (Sofield et al.,

1977; Miralles y Slafer, 1995).

Las dinámicas de contenido hídrico siguieron curvas parabólicas desde antesis a

cosecha (Figuras 7 y 8). Los granos de Bacanora acumularon agua hasta

aproximadamente 20 DDA, los granos de Kambara extendieron este periodo en 5 días

(Tabla IV), sobrepasando lo predicho por Sofield et al., (1977) que estimaba este

período entre 14 y 21 DDA. La extensión de este período fue principalmente

consecuencia de las menores temperaturas, que afectaron las dinámicas hídricas del

crecimiento de los granos (Sofield et al., 1977). La tasa de acumulación de agua fue

indiferente entre los genotipos (Pepler et al., 2005), pero sí entre posiciones de grano.

El período de plateau hídrico (Sofield et al., 1977), culminó a los 44 DDA (Tabla IV), sin

discriminación de genotipo ni de posición de grano, siendo ligeramente anterior a

madurez fisiológica (Figuras 7 y 8) y no en forma conjunta como lo establece Sofield et

95

al., (1977), Schnyder y Baum, (1992) y Pepler et al., (2005). Considerando que las tasas

de acumulación de agua son similares y que los granos de Kambara alcanzaron

mayores contenidos hídricos (Tabla IV), sostiene que el principal agente de variación en

el MCH fue el tiempo. La variación de los determinantes que afectan las dinámicas de

agua y la paridad temporal con las dinámicas de peso, sostienen su vinculación con el

llenado de grano (Sofield et al., 1977; Schnyder y Baum, 1992; Pepler et al., 2005).

La dinámica del número de células endospermáticas fue semejante a la descrita

por Gleadow et al., (1982). Aunque los granos de Kambara presentaron mayores

tiempos de división celular, no fueron suficientes para alcanzar el máximo número de

células. Este atributo fue afectado principalmente por la tasa de división, existiendo una

fuerte correlación entre ambas variables (tasa de división celular vs máximo número de

células del endosperma). Por otra parte, la relación entre el peso final de los granos y el

máximo número de células del endosperma presentó una asociación débil (R2 = 0,46),

por lo que este atributo no jugó un papel importante en la determinación del peso de los

granos, como ha sido indicado en estudios previos (Brocklehurst, 1977; Borrás et al.,

2004). Considerando que el tiempo de división celular estuvo entre los períodos de

máxima elongación de los granos y máxima tasa de acumulación de agua, la dinámica

del número de células del endosperma estaría direccionada inicialmente a la división

celular y posteriormente a la acumulación de asimilados.

La acelerada elongación de los granos en los primeros DDA, permitió que estos

alcancen longitudes entre 6,70 y 8,50 mm (Tabla V), los que presentaron una fuerte

asociación con el peso final de los mismos (Figura 5). La dinámica de elongación de los

granos responde fuertemente a una curva hiperbólica (Tashiro y Wardlow, 1990) y no a

96

las sigmoides adaptadas para entender las dinámicas del peso seco y la acumulación

de contenido hídrico (Calderini et al., 1999b). Aunque la tasa de elongación de los

granos favoreció a Bacanora, la diferencia de tiempo entre ambos cultivares en alcanzar

la estabilización del largo, permitió a los granos de Kambara alcanzar mayores

longitudes. El tiempo en que los granos lograron su máxima longitud, cubre las

dinámicas de células endospermáticas (Lizana et al., 2009; Philippe et al., 2006),

coincide con los primeros días de la fase exponencial del llenado de grano y es anterior

a que los granos alcancen el MCH, advierte que el largo de loas granos se establece en

forma temprana, y de forma independiente a los otros caracteres que afectan el peso de

los granos. Ésto hace más cercana la hipótesis, de que el peso de los granos está

fuertemente determinada por el crecimiento del pericarpio (Calderini et al., 1999a, b;

Calderini y Reynolds, 2000).

El examen microscópico de las CPE de los granos 2 y 3 de ambos genotipos,

revelaron que estas extendieron sus dimensiones de largo y ancho en función del

tiempo (Figuras 18 y 19). Inicialmente las células fueron compactas y regulares, pero a

medida que avanzó el crecimiento de los granos, derivaron a células altamente

contrastantes en su largo y ancho (Tabla VII, Figura 18 y 19). El alargamiento de las

CPE describió una curva hiperbólica semejante a las de elongación de los granos

(Figura 20), siguiendo una acelerada extensión en los primeros DDA, la cual detuvieron

y se mantuvieron en forma constante a contar los 15 DDA. Lo anterior permitió que el

largo de las células creciera de 20 m (3-5 DDA) a más de 150 m (> 15 DDA; Tabla

VIII). Comparativamente, no existieron diferencias en tamaño, tasa y tiempo de

extensión entre las 2 posiciones de grano, pero a nivel de genotipo, las células de

97

Kambara alcanzaron una mayor extensión celular por efecto del tiempo (Tabla VIII). El

bajo número de granos analizados, no permitió establecer si las máximas extensiones

celulares están correlacionadas con la tasa o tiempo de extensión, pero un examen

preliminar arrojó que la máxima extensión de las CPE estuvo fuertemente asociada con

el largo de los granos (datos no mostrados).

El examen comparativo entre las dinámicas de elongación de los granos y de

extensión de sus células, mostró una alta similitud entre ambas dinámicas, siendo

sumamente coincidentes en el tiempo en que ambas dinámicas detuvieron su

crecimiento (Figuras 21 y 22). Considerando los resultados de la extensión de las

células del pericarpio, la elongación de los granos y la incidencia del peso de los

carpelos florales sobre el peso final de los mismos (Calderini et al., 1999b), soportan la

hipótesis que el peso de los granos está fuertemente afectado por el crecimiento del

pericarpio.

Las dinámicas del volumen, ancho y alto de los granos se mantuvieron en

crecimiento hasta madurez fisiológica (45 DDA) y desde el cual contrajeron sus

dimensiones (Tashiro y Wardlaw, 1990; Pepler et al., 2005). La diferencia de tiempo que

determinan del largo y las otras dimensiones del grano, advertirían que el largo de

grano tendría una mayor implicancia en la determinación del peso que el ancho y alto

de los mismos.

A pesar del bajo número de datos analizados para describir el ancho de las CPE

y el largo de las células cruzadas, en ambos tipos celulares se aprecio una extensión de

sus dimensiones en función del tiempo (Tablas VII y IX). Las células cruzadas

transitaron de células compactas y regulares, a células de fuerte contraste entre su

98

ancho y largo (Figuras 24, 25 y 26). Tanto el ancho de las CPE y al largo de las células

cruzadas siguieron una dinámica de crecimiento relativamente semejante al crecimiento

del ancho de los granos (Figuras 23 y 26), transformando este carácter en un buen

candidato de analisis futuros.

De acuerdo a lo descrito por Miralles et al., 1998, a los 15 DDA el largo y ancho

de las células del pericarpio no variarían según las diferentes o nula presencia de genes

del enanismo, atribuyendo que el genotipo no incide en el tamaño de las células del

pericarpio, y que los diferentes tamaños de grano sería efecto del número de células.

En este estudio se estableció que el largo de las CPE de Kambara fue mayor a las de

Bacanora, mientras que el ancho de las CPE y largo de las células cruzadas favorece a

los granos de Bacanora. Las diferencias entre los anchos de las CPE y largo de las

células cruzadas no pudieron ser resueltas aún, ya que la medición de sus células está

inmersa en las dinámicas de crecimiento del ancho de los granos, a diferencia del largo

de las CPE, que cubre completamente la dinámica de elongación de los granos.

La disparidad entre las dinámicas de elongación de los granos 2 y 3 de ambos

genotipos (Figura no mostrada), fue por efecto de su genotipo y las condiciones de

crecimiento (Miralles et al. 1998), hecho que se repitió en el llenado de grano. Esto da

pie a que su elongación fue afectada por la variación de contenido hídrico, los

determinantes de la elongación de los granos, extensión de sus células del pericarpio o

un factor molecular que interceda entre ambos rasgos. Ante lo ultimo, se ha descrito

una fluctuante expresión de transcritos en diferentes etapas del crecimiento del grano

(Laudencia-Chingcuanco et al., 2007) y entre ellas se encontrarían las expansinas.

99

Por la amplitud cromosómica del trigo, Liu et al., (2007), se ha estimado al menos

30 expansinas. Algunas se les ha descrito expresión en diferentes estructuras y etapas

de desarrollo del trigo, al igual que en diferentes etapas de crecimiento del grano (Lin et

al., 2005; Lizana et al., 2009). El RT-PCR de las 6 expansinas analizadas, describieron

niveles de expresión similares en los granos 2 y 3, al igual que en las 3 repeticiones de

ambos genotipos. En los primeros DDA expresaron altos niveles de transcritos, los que

se hicieron menores en función del tiempo (Figuras 28, 29 y 30). Este comportamiento

que presentaron las 6 expansinas en estudio, advirtiendo un solapamiento en su función

biológica (Lin et al., 2005). Los granos 2 de ambos genotipos presentaron su mayor

nivel de expresión ente 4 y 11 DDA (Figuras 30 y 31), momento en el cual los granos

estaban en su mayor período de elongación y acumulación de agua (Figuras 30 y 31),

semejante a la alta expresión descrita en tallos en elongación (anteras y filamentos del

tallo; Liu et al., 2007). A contar del los 16 DDA, los granos presentaron una disminución

en el nivel de expresión de las 6 expansinas (Figuras 30 y 31), momento próximo a la

máxima elongación de grano y en paralelo al ingreso de agua en los granos (Figura 31).

Tras 24 DDA, los niveles de expresión de las 6 expansinas se encontraron en su menor

e inclusive nula expresión (Figuras 28 y 29), período coincidente con fin de la

elongación de los granos y contenido hídrico estable (Figura 31). En los granos 3 de

ambos genotipos, la alta expresión de las 6 expansinas se extendió hasta los 16 DDA,

continuando con una disminución de sus niveles de expresión. Este comportamiento se

vio repetido en sus repeticiones (Figuras 28 y 29). Cabe destacar que la secuencia de

estas expansinas exhibieron una alta similitud con las expansinas previamente descritas

en las bases de datos (Tabla X), y que sus niveles de expresión fueron propios de cada

100

expansinas, del genotipo, la posición de grano y la repetición (Lin et al., 2005; Lizana et

al., 2009).

Dinámicamente la expresión de las expansinas siguió un decaimiento sigmoideo,

el cual se vio extendido en los granos 3 (Figura 30). Su dinámica de decaimiento se

presentó distante a las dinámicas de llenado de grano, pero inmersas en los períodos

de mayor crecimiento de las células del pericarpio, elongación de los granos y

acumulación de agua (Figura 31). Lo anterior advierte que la expresión y traducción de

expansinas, jugarían un papel importante en el crecimiento de los granos, facilitando la

extensión de las paredes de las células del pericarpio, elongación del pericarpio y de los

granos, y que estos adquieran los volúmenes de grano necesarios para contener una

mayor cantidad de asimilados.

101

6.0 CONCLUSIONES

Los granos de Kambara alcanzaron mayores pesos, largos y volumen en

cosecha respecto a los granos de Bacanora, a la vez presentaron mayores valoraciones

de CHM, extensiones de las CPE y células cruzadas.

En ambos genotipos, los granos 2 alcanzaron los máximos valores de los

distintos caracteres estudiados, les continuaron los granos 1, 3 y finalmente el grano 4.

El tiempo que los granos requirieron para desarrollar sus los diferentes

caracteres aumentó a medida que el grano se alejaban del raquis.

Los granos de Bacanora presentaron el máximo número de células

endospermáticas y una mayor tasa de división celular que los granos de Kambara, pero

la fuerte variación estadística las convierte en un mal candidato para el análisis del peso

de los granos, por ello se hace necesario implementar modificaciones o reestablecer los

criterios para su medición.

La elongación de los granos se detuvo a contar de los 15 DDA en Bacanora y

sobre los 20 DDA en Kambara. El alto, ancho y volumen crecieron hasta madurez

fisiológica.

Las CPE y células cruzadas extendieron su ancho y largo a medida que

transcurrió el llenado de grano, derivando de células pequeñas, regulares y compactas,

a células sumamente contrastantes en sus dimensiones de largo y ancho. La variación

de tamaño de las células fue dependiente del genotipo, pero indiferente de la posición

de grano (Gr2 y Gr3).

102

Las CPE siguieron una dinámica de extensión idéntica a la elongación de los

granos, presentando tiempo de crecimiento semejante. El ancho de las CPE y largo de

las células cruzadas presentaron un crecimiento relativamente semejante al crecimiento

transversal de los granos.

El presente estudio confirma que las 6 expansinas previamente descritas,

pertenecen a la familia A4, A5, A6 y A8 de las expansinas, todas ellas presentaron una

expresión relativamente semejante a nivel de genotipo, repetición y posición de grano.

La máxima expresión de las 6 expansinas se desarrolló antes de los 10 DDA,

seguido de una disminución de la misma a medida que aumentaban los DDA. La

expresión de estas expansinas mostró una dinámica de decaimiento sigmoideo.

La mayor expresión de expansinas fue coincidente con los períodos de activa

elongación de los granos, acumulación de agua y extensión de las CPE. Los menores

niveles de expresión se presentaron cuando los granos ya habían finalizado la

elongación, la extensión de sus células y el contenido hídrico se mantenía estable.

103

7.0 CONSIDERACIONES

Las innovaciones y respuestas logradas con esta investigación permiten

complementar la hipótesis planteada por Calderini et al., (1998), en ella se establece

que el peso potencial de los granos está condicionado por el crecimiento del pericarpio.

Para ello sería necesario profundizar las dinámicas CPE a las 4 posiciones de grano,

extender el período de análisis desde antesis hasta madurez fisiológica, utilizar otros

genotipos y diferentes años de cultivo. Paralelamente sería conveniente seguir las

dinámicas de peso y contenido hídrico de las 2 capas de células del pericarpio

estudiadas y complementarlas con el análisis de expresión de expansinas a nivel de

transcritos y proteínas.

104

8.0 BIBLIOGRAFÍA

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