Expresion en Levaduras 2014-VBlancato.pdf
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EXPRESIÓN DE PROTEÍNAS EN
LEVADURAS
Dr. Víctor Blancato
Producción de proteínas
recombinantes en células eucariotas
Problemas que suelen a parecer cuando
proteínas eucarióticas son expresadas en células procariotas
inestables
sin actividad biológica
contaminantes procarioticos
Sistemas de expresión eucariotas
Para eliminar estos problemas se han desarrollado sistemas de expresión eucariotas
Necesidad de que tengan idénticas propiedades a la proteína natural: bioquímicas, biofísicas y funcionales
Especialmente importantes para proteínas
terapéuticas
Ventajas de producción de proteínas
recombinantes a gran escala en levaduras
utilización de cepas modificadas en su pared celular que permiten una fácil y eficiente liberación del producto intracelular
se puede acoplar a procedimientos de purificación en un solo paso
las levaduras son sistemas idóneos para mimetizar
funcionalmente a las células humanas
Sistemas de expresión eucariotas
Cual es la diferencia?
Modificaciones post-traduccionales de la mayoría
de las proteínas eucariotas no pueden ser llevadas
a cabo en células procariotas
Modificaciones post-traduccionales
Formación de uniones disulfuro correctas
Clivaje proteolítico del precursor inactivo
Glicosilación, agregado de residuos de azúcar
Modificación de aminoácidos:
fosforilación
acetilación
agregado de grupos sulfato
agregado de ácidos grasos
Sistemas de expresión en levaduras:
Ventajas
Organismo unicelular
Bien caracterizadas genética y fisiológicamente
Promotores fuertes disponibles
Eucariotas, ocurren modificaciones post-
traduccionales
Segregan algunas proteínas
No patógeno
Otras ventajas de la expresión en levaduras
Expresión de proteínas que solo expresan como cuerpos de inclusión insolubles en bacterias
Plegamiento correcto
La falta de contaminación por endotoxinas (producción de vacunas o drogas terapéuticas)
Desventajas ----- hiperglicosilación
Saccharomyces cerevisiae S288c
Primer genoma eucariota secuenciado (600
laboratorios) en 1997
Schizosaccharomyces pombe, 2002
Posee 16 cromosomas
12.01 millones de pb, 6275 genes
¾ de los ORFs identificados
DNA nuclear haploide solo 3,5 veces el de E. coli
Ventajas del uso de levaduras
Conservación de procesos celulares respecto
a otros eucariotas (Transcripción, traducción splicing, modif PT, etc.)
Organismo GRAS
Cultivo simple, económico y rápido (90 min td)
Contiene organelas como otros eucariotas
Modifica mRNA similar a otros eucariotas
Glucose 2 Pyr
2 CO2
2 Ethanol 2 Acetaldehyde
2ADP 2ATP
2NAD+ 2 NADH Fermentation
Medios para levaduras Pueden ser crecidas en medios líquidos o sólidos
Crecen en medio mínimo con glucosa, nitrógeno, fosforo y trazas de metales
Fuentes alternativas de carbono: rafinosa, maltosa, fructosa, galactosa
Galactosa se utiliza para inducir la transcripción de secuencias fusionadas al promotor Gal
Clonado en Levaduras
La era de la genetica molecular en levaduras comenzó en 1978,
cuando S. cerevisiae fue transformada con DNA heterólogo.
Hay muchos protocolos de transformación pero son como mínimo
tres órdenes de magnitud menos eficientes que los de E. coli.
El clonado y preparación de plásmidos de levaduras es muy
ineficiente
Entonces para el clonado en levadura se utiliza E. coli como
sistema de produccion:
Los plásmidos se construyen in vitro
Los plásmidos son transformados en E. coli y se confirma la construcción
Se producen los plasmidos en bacteria....
....y luego se transforman en levadura
Se trabaja con vectores shuttle levadura - E. coli
Por otro lado, las levaduras tienen un sistema muy eficiente de
recombinacion que se utiliza para el clonado
pUC18
2686 bp
APr
ALPHAP(BLA)
P(LAC)
ORI
Ava I (435)
BamH I (430)
Eco R I (451)
Hin d III (400)
Pst I (416)
Sma I (437)
Xma I (435)
Apa LI (178)
Apa LI (1121)
Apa LI (2367)
Vectores de levaduras
Replicación en E. coli y levaduras
Dos tipos de genes de selección
E. coli antibioticos
Levaduras genes involucrados en vías no biosintéticas
Marcadores de selección en
levadura
TRPl codifica la N-(5 'fosforri bosil) a ntranilato
isomerasa (síntesis de triptofano y metabolismo de la glutamina)
URA3 codifica Orotidine - 5 '- fosfato descarboxilasa (proteína de 267 aminoácidos que participa
en la biosíntesis de uracilo)
LEU2 codifica la beta isopropil malato
deshidrogenasa (cataliza la tercera etapa en la biosíntesis de leucina)
LVS2 codifica para una alfa-ami noadipato
reductasa (paso esencial en la biosíntesis de lisina)
HIS3 codifica la imidazol glicerolfosfato
deshidratasa (involucrada en la síntesis de histidina)
Vectores shuttle Levadura-E. coli
Plasmidos integrativos
(YIp) consisten de:
La estrructura de plasmidos de E. coli
vector como pBR322, pUC19, pBLUESCRIPT
Marcadores de selección de levaduras: URA3, HIS3, TRP1, LEU2
Pero carecen de origen de replicacion
para levaduras
Por lo tanto, se propagan solo por integración en el genoma
YIp5
5541bp
URA3
PMB1
Ava I (2541)
Bam H I (379)
Cla I (28)
Eco R I (2)
Hin d III (33)
Nco I (1867)
Sma I (2543)
Xma I (2541)
Pst I (1644)
Pst I (4795)
Apa LI (3473)
Apa LI (3971)
Apa LI (5217)
Amp-resistance
Tet-resistance
YIp5: pBR322 plus the URA3 gene
Vector shuttle E. coli - levadura
Los plásmidos replicativos
episomales (YEp) consisten
de:
La estrructura de plasmidos de E. coli vector
como pBR322, pUC19, pBLUESCRIPT
Marcadores de selección de levaduras: URA3, HIS3, TRP1, LEU2
Y poseen el origen de replicación del plásmido 2micron de levaduras
Entonces, se propagan relativamente estables a un alto número de copias, gralmente 20-50 por célula
YEp24: pBR322 plus the URA3 gene, plus 2micron origin
YEp24
7769bp
URA3
PMB1
2micron ORI
Bam H I (3785)
Cla I (2268)
Nco I (2705)
Sma I (3381)
Xma I (3379)
Eco R I (2)
Eco R I (2242)
Apa LI (7445)
Ava I (1391)
Ava I (3379)
Ava I (4835)
Hin d III (106)
Hin d III (2273)
Hin d III (3439)
Pst I (2001)
Pst I (2482)
Pst I (7023)
Amp-resistance
Tet-resistance
Los plasmidos replicativos
centroméricos (YCp) consisten de:
La estrructura de plasmidos de E. coli vector como
pBR322, pUC19, pBLUESCRIPT
Marcadores de selección de levaduras: URA3, HIS3, TRP1,
LEU2
Y poseen un origen de replicación
cromosomal para levaduras (ARS, for autonomously replicating sequence)
Poseen un centrómero CEN de un
cromosoma de levadura
Se propagan de forma estable a un
bajo número de copias, por lo general uno por célula.
Amp-resistance
Tet-resistance
YCp50 7950bp URA3
POLY
CEN4
ARS1
POLY
PMB1
Bam H I (379)
Cla I (28)
Eco R I (2)
Hin d III (33)
Nco I (1867)
Sma I (2543)
Xma I (2541)
Ava I (2541)
Ava I (4703)
Pst I (1644)
Pst I (7204)
Apa LI (7626)
YCp50: pBR322 plus the URA3 gene,
plus CEN4, plus ARS1
Vector shuttle E. coli - levadura
Promotores de levaduras
Promotor Condición
Acid phosphatase PHOS lnducible
Alcohol dehydrogenase I ADH I
Constitutivo
Alcohol dehydrogenase II ADH II lnducible
Galctokinase GAL 1 lnducible
Metallothionein Cup 1 lnducible
Phosphoglycerate kinase PGK Constitutivo
Triose Phosphate isomerase TPI Constitutivo
La mayoría de vectores de expresión actuales tienen promotores
inducibles, como los de shock térmico, o el GAL 1 y el GAL10 que se
inducen 1000 veces en presencia de galactosa.
Métodos artificiales para introducir
ADN exógeno en levaduras:
Electroporación
Obtención de protoplastos en medio hipertónico y mezclándolos con el ADN en presencia de una sustancia fusogénica como el polietilenglicol (PEG)
Tratamiento de células completas con sales de
litio, seguido de mezcla con PEG y ADN, con choque térmico para estimular la transformación
Sistemas de expresión en
levaduras:
Desventajas
Inestabilidad de plásmidos en gran escala
Vectores episomales
Superglicosilación de glicoproteínas
100 o más residuos manosa versus 8-13
puede alterar la actividad de la proteína
Proteínas secretadas quedan atrapadas en periplasma (entre la membrana y la pared
celular)
se usan señales peptídicas
Soluciones a los problemas en
sistemas de expresión en levaduras
Levaduras modificadas genéticamente para llevar a cabo glicosilación igual a humanos
Science Vol 301, p1244-1246 (29 Aug 2003)
Deleción de genes de glicosilación de levaduras
Agregado de genes de glicosilación de humanos
Soluciones a los problemas en
sistemas de expresión en levaduras
Usar otro tipo de levaduras
Pichia pastoris
Hansenula polymorpha
No solo Saccharomyces cerevisiae
Usar otros eucariotas
Células de insectos
Cultivos de células de mamíferos
Pichia pastoris Expression
system: Ventajas
Puede utilizar metanol como fuente de carbono en ausencia de glucosa.
Utiliza el promotor AOX1 (alcohol oxidasa)
Las proteínas producidas suelen ser plegadas correctamente y secretadas en el medio.
Bastante fáciles de crecer en un frasco con agitación y manipuladas genéticamente
Son GRAS
Capaz de expresar un alto nivel de proteínas heterólogas
La existencia de una señal de secreción para una fácil purificación del sobrenadante.
Ventajas de Pichia pastoris sobre
Saccharomyces cerevisiae
El gen de alcohol oxidasa (AOX1) es inducible por metanol
El metanol es la fuente de carbono e inductor
AOX1 : gen altamente regulado que se reprime en ausencia de metanol
evita los efectos tóxicos de la expresión de proteínas heterólogas hasta que la expresión es inducida por el metanol.
Pichia puede crecer hasta densidades mayores que S.
cerevisiae (150 g / litro)
Mayor rendimiento reportado en Pichia (12 g/L para el fragmento de la toxina tetánica C)
Puede utilizar también promotor GAP (gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa), un promotor constitutivo con crecimiento en glucosa, glicerol o metanol.
Otros promotores: AOX2, FLD (formaldehído deshidrogenasa), ICL 1 (Isocitrato liasa)
Posibilidad de utilizar métodos estándar de S. cerevisiae
para su manipulación genética.
Otras ventajas
Metabolismo preferentemente respiratorio, lo que permite grandes densidades celulares
Mejores modificaciones postraduccionales que S. cerevisiae: procesamiento proteolítico, glicosilación y formación de puentes disulfuro
Grandes rendimientos de proteína (mayor que
baculovirus y mamífero)
Altos niveles de secreción de proteína heteróloga casi sin secreción de proteínas nativas
Fácilmente escalable en industria y mas barato y rápido que los sistemas de eucariotas superiores.
Modificaciones post-traduccionales:
S. cerevisiae vs. Pichia
Pichia no hiperglicosila
Polisacáridos tipo manosa
S. cerevisiae agrega 50-150 residuos de manosa y Pichia agrega 8- 14 residuos de manosa (+ cortos que S. cerevisiae)
Pichia hace poca O-glicosilación
S. cerevisiae termina en alfa-1,3 glucanos (alta actividad antigénica)
Pichia no termina en alfa-1,3,y por ello, poseen mayor
similitud con proteínas humanas
Proteínas expresadas en
Pichia
Proteinas expresadas en
Pichia
Producción de proteínas
recombinantes en Pichia pastoris
Quimosina recombinante: clonado del gen de la quimosina bovina en Pichia. Se usa en la coagulación de la caseína, en la obtención de quesos.
Hormona de crecimiento humana (E. coli y levaduras)
Vacuna contra la Hepatitis
Limitaciones del sistema de
expresión en Pichia pastoris
El metanol que se necesita para la inducción implica riesgo por su toxicidad y puede no ser adecuado para producir proteínas alimentarias. Se necesitan promotores fuertes no inducibles por metanol
Promotor del gen de la gliceraldehído-3-fosfato
deshidrogenasa (GAP). Alto nivel constitutivo de expresión
en glucosa o glicerol. Desventaja: constitutivo.
Promotor del gen FLD1 de P. pastoris, codifica para la
glutatión deshidrogenasa dependiente de formaldehído.
Se puede inducir por metanol o metilamina (una fuente
inocua de N) en medios con glucosa. Los niveles
inducidos de expresión con este promotor son parecidos a
los del gen AOX1 en metanol.
Se necesitan promotores de expresión moderada:
El gen PEX8, que codifica una proteína de biogénesis del
peroxisoma. Bajo nivel de expresión con glucosa, y se induce
moderadamente (unas 10 veces) cuando las células se pasan
a metanol.
El gen YPT1: confiere expresión baja pero constitutiva en
glucosa, metanol o manitol.
Carencia de mas genes marcadores para seleccionar los recombinantes.
Hasta hace poco, solo se disponía de HIS4, ARG4 y Sh ble
(resistencia a zeocina). Ahora hay otros marcadores: ADE1,
URA3.
Pichia methanolica Expression System
designed for high-level production of recombinant proteins
•posttranslational modifications offered by eukaryotic hosts
•strong AUG1 promoter for rapid, high-level protein expression
•Transcription from the AUG1 promoter is tightly repressed in medium
containing glucose or glycerol as a carbon source
•When cells are shifted to medium with methanol as the sole carbon source,
transcription is rapidly induced to very high levels (better than P. pastoris)
• suitable for high-level production of toxic recombinant proteins
•pMET vectors offer the following features:
Strong AUG1 promoter for high-level, tightly-regulated expression
alpha -factor signal sequence for secretion
C-terminal V5 epitope (detection with an Anti-V5 Antibody) and (6xHis)
tag
gene for auxotrophic selection on drop-out medium
3 reading frames relative to the C-terminal fusion tag
3 reading frames relative to the secretion signal sequence.
EXPRESIÓN DE PROTEÍNAS EN
LEVADURAS
Dr. Víctor Blancato